CN101301310A - 褐藻多糖硫酸酯在预防和治疗帕金森病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了褐藻多糖硫酸酯在预防和治疗帕金森病中的新用途。通过离体帕金森病(PD)细胞模型实验和在体动物模型实验表明，褐藻多糖硫酸酯对PD细胞模型和动物模型的DA能神经元有一定的神经保护效应，可用于预防和治疗帕金森病。本发明所述褐藻多糖硫酸酯可以是从海带、墨角藻、泡叶藻、昆布或绳藻等褐藻中提取得到的天然多糖提取物，也可以是经任何方法将褐藻多糖硫酸酯通过降解而制得的低分子量硫酸多糖或寡糖类物质。

Description

褐藻多糖硫酸酯在预防和治疗帕金森病中的用途

技术领域

本发明涉及褐藻多糖硫酸酯在治疗神经系统疾病中的一种新用途，尤其涉及褐藻多糖硫酸酯在预防和治疗帕金森病方面的用途，属于生物医学领域。

背景技术

褐藻多糖硫酸酯是含有岩藻糖的一类硫酸化多糖，存在于褐藻中，首先由Kylin在1913年用稀酸从掌状海带中提取出来。Kylin将提取物水解后分离出L-岩藻糖，他将这种多糖命名为fucoidin，现根据多糖的命名原则一般定名为fucoidan，中文名称为墨角藻多糖、岩藻多糖、岩藻聚糖、岩藻聚糖硫酸酯、褐藻糖胶或褐藻多糖硫酸酯。现在人们对褐藻多糖硫酸酯的组成有较为清晰的了解，它是一类化学组成和结构非常复杂的多糖，以岩藻糖和硫酸基为主，随着藻的种类不同还含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。

褐藻多糖硫酸酯化学结构非常复杂，不同褐藻中分离到的褐藻多糖硫酸酯其结构有很大差异。到目前为止，对来源于墨角藻(Fucus vesiculosus)和泡叶藻(Ascophyllum nodosum)的褐藻多糖硫酸酯的结构研究最多，墨角藻褐藻多糖硫酸酯主要以α(1→3)糖苷键连接，硫酸化主要发生在C₄位。对泡叶藻褐藻多糖硫酸酯的多项研究都表明其中存在大量的α(1→3)和α(1→4)糖苷键。此外还有几种褐藻褐藻多糖硫酸酯的结构被报道。昆布(Ecklonia kurome)褐藻多糖硫酸酯主要为α(1→3)连接，硫酸化在C₄位。来源于枝管藻(Cladosiphon okamuranus)和绳藻(Chorda filum)的褐藻多糖硫酸酯主链均为α(1→3)的岩藻糖，硫酸化在C₄位，而且，二者均有少量的2-O-乙酰化。关于海带褐藻多糖硫酸酯的结构，多数的研究资料表明海带褐藻多糖硫酸酯主要是以α-(1→3)连接的L-岩藻糖组成，硫酸化发生在C₄或C₂位，而且研究显示存在部分(1→2)连接的L-岩藻糖作为侧链。当然分子中还存在半乳糖、木糖、鼠李糖等单糖，半乳糖可能参与了主链的组成，而木糖、鼠李糖等是以侧链的形式存在。

褐藻多糖硫酸酯已被发现具有多种生物学活性，目前已经公开报道的活性包括褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗补体活化、抗氧化、抗辐射、抑制腹水瘤等活性。但尚未有文献表明褐藻多糖硫酸酯在预防和治疗帕金森病方面的用途。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是多发于中老年期的一种常见的神经系统退行性疾病，病人多出现震颤、肌肉僵直、运动迟缓等症状(张成，等.1995)。PD的主要病理学改变为中脑黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元慢性进行性死亡，导致纹状体DA含量显著减少。因此，补充DA的前体-左旋多巴(L-DOPA)可以缓解PD的症状。但L-DOPA本身不能延缓DA能神经元的进一步坏死，远期疗效无法令人满意，且可能出现症状波动、运动障碍等严重副作用，因此，人们一直试图找到一种可以延缓DA能神经元的变性坏死，对DA能神经元有营养保护作用的药物。最新资料表明，中国有170万PD患者，其中55岁以上的人群发病率为1～2％，估计每年新增PD病人约20万人。随着世界人口老龄化进程的加剧，PD病人的数量不断增长，已经成为日益严重的社会问题，使得全世界对其给予众多的关注，PD的治疗药物研究成为老年医学领域中的一个重要课题。

发明内容

本发明目的之一是提供褐藻多糖硫酸酯的一种新用途，即在预防和治疗帕金森病中的用途。

本发明所述的褐藻多糖硫酸酯可以是从任何一种或多种褐藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯，例如，可以来源于海带(Laminaria japonica)(包括人工养殖的海带)，也可以是来源于其它褐藻，例如马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻等的一种或多种。作为一种优选的方案，优选来源于海带中的褐藻多糖硫酸酯，即海带褐藻多糖硫酸酯(海带褐藻多糖硫酸酯：主要由岩藻糖、半乳糖组成的硫酸多糖，其中岩藻糖含量为31％，硫酸基含量为32％，平均分子量为180KD)。

为达到更好的治疗效果，本发明所述的褐藻多糖硫酸酯的分子量优选为2kD-1000kD，更优选为3KD～30KD，最优选为5KD～20KD。

褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是褐藻类海藻特有的化学组分，是褐藻类海藻细胞间的产物，是一种水溶性杂聚糖，它的主要组分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，其次还伴随有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸及蛋白质、K、Na、Ca、Mg等金属离子，不管它的分子组分和结构多复杂，它的结构特征是1，2-联结的聚α-L-吡喃褐藻糖，而硫酸酯主要是在C-4位的羟基上。所以不论是从何种褐藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯，其主要成分相同，基本结构相同，都具有相同的药理功效，即，都可用于预防和治疗帕金森病。

从褐藻中提取褐藻多糖硫酸酯的方法为本领域现有技术(请参考：中国专利授权公告号CN1044607C)，作为一种优选的方法，可参考本申请实施例从海带中提取褐藻多糖硫酸酯的方法；此外，褐藻多糖硫酸酯也可从商业途径购买得到(例如，山东日照洁晶海洋生物技术开发有限公司生产并出售褐藻多糖硫酸酯，其商品名称是“岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)”，该产品以海带为原料所提取得到，主要由含硫酸基岩藻糖(Fucose)组成，其次还伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、糖醛酸等，其主要有效成份是α-L-岩藻糖-4-硫酸酯；另外，上海元吉化工有限公司也有售，其商品名称是“褐藻多糖硫酸酯”)。

此外，本发明中所述的褐藻多糖硫酸酯还包括将褐藻多糖硫酸酯通过降解制备得到的低分子量硫酸多糖和寡糖类物质。

本发明人通过大量的离体帕金森病细胞模型实验和在体动物金森病模型实验，发现褐藻多糖硫酸酯对PD细胞模型和动物模型的DA能神经元有一定的神经保护效应，初步推测，褐藻多糖硫酸酯具有降低中脑脂质过氧化反应，提高抗氧化系统活性等功效。

本发明目之二是提供一种能够预防和治疗帕金森病的药物组合物，该药物组合物包含治疗上有效量的褐藻多糖硫酸酯和至少一种药学上可接受的辅料或载体，所述辅料或载体可以是：淀粉、氯化钠、微晶纤维素、山梨酸和/或甘露醇等。

该组合物的给药方式可以是但不限于经静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、局部注射等方式给药，其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、凝胶剂、贴片、膏剂等，其中优选注射液、冻干粉针剂、片剂和胶囊剂。本领域技术人员根据现有技术以及制剂领域的公知常识可以方便地制备出所需剂型。

本发明具有以下优点：

1.安全性高，可长期服用。在目前阶段，帕金森病通常是不可逆的神经退行性疾病，病因复杂。为了保持患者病情不继续恶化，病人用药周期较长。褐藻多糖硫酸酯作为来源于食用海藻的一种天然海洋多糖产物，其高安全性可以保证病人长期用药的需要。经急性毒性试验证明褐藻多糖硫酸酯安全性非常高，毒副作用小(Li，N.，et al.Toxicological evaluation of fucoidan extracted from Laminaria japonica inWistar rats，2004；徐祖洪等，褐藻多糖硫酸酯在制备治肾衰病药品中的应用，中国专利授权公告号CN1069523C)。

2.使用效果好。褐藻多糖硫酸酯优选来源于食用海藻海带，其它食用褐藻如裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、马尾藻等也是褐藻多糖硫酸酯的制备原料。可以用于神经系统疾病如帕金森病和老年性痴呆的治疗。

根据小鼠有效剂量和小鼠与人的体表折算系数换算，褐藻多糖硫酸酯用于治疗帕金森病临床患者的参考用量为8.75～17.5毫克/70公斤/日。

附图说明

图1不同浓度褐藻多糖硫酸酯对6-OHDA诱导MN9D细胞损伤形态学改变的影响；

A.空白对照；B.50μM 6-OHDA；C.Fucoidan 0.1mg/ml+50μM 6-OHDA；D.Fucoidan 1.0mg/ml+50μM 6-OHDA。

图2不同浓度褐藻多糖硫酸酯对6-OHDA诱导MN9D细胞损伤细胞活力的影响。

图3不同浓度褐藻多糖硫酸酯对6-OHDA诱导MN9D细胞损伤LDH释放量的影响。

图4不同浓度褐藻多糖硫酸酯对MPP⁺诱导MN9D细胞损伤形态学改变的影响；

A.空白对照；B.50μM MPP⁺；C.Fucoidan 0.1mg/ml+50μM MPP⁺；D.Fucoidan 1.0mg/ml+50μM MPP⁺。

图5不同浓度褐藻多糖硫酸酯对MPP⁺诱导MN9D细胞损伤细胞活力的影响。

图6不同浓度褐藻多糖硫酸酯对MPP⁺诱导MN9D细胞损伤LDH释放量的影响。

图7不同浓度褐藻多糖硫酸酯对6-OHDA诱导MN9D细胞内氧化应激水平的影响；

A.空白对照；B.50μM 6-OHDA；C.Fucoidan 0.1mg/ml+50μM 6-OHDA；D.Fucoidan 1.0mg/ml+50μM 6-OHDA。

图8不同浓度褐藻多糖硫酸酯对MPP⁺诱导MN9D细胞内氧化应激水平的影响；

A.空白对照；B.50μM MPP⁺；C.Fucoidan 0.1mg/ml+50μM MPP⁺；；D.Fucoidan 1.0mg/ml+50μM MPP⁺。

图9不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠60分钟总活动距离的影响；

图10不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠60分钟平均运动速度的影响；

图11不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠60分钟每次活动平均运动距离的影响；

图12不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠黑质致密部TH免疫阳性神经元数目的影响；

A：saline；B：MPTP；C：fucoidan25mg/kg+MPTP，40x；D，E and F为左图相应区域的放大图200x。

图13不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠腹侧中脑TH蛋白表达的影响。

图14不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠纹状体TH蛋白表达的影响。

图15不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠纹状体DA含量的影响。

图16不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠纹状体DOPAC含量的影响。

图17不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠纹状体HVA含量的影响。

图18不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠纹状体(DOPAC+HVA)/DA比值的影响。

图19褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠纹状体MPP⁺含量的影响。

图20不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠腹侧中脑丙二醛(MDA)含量的影响。

图21不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠腹侧中脑超氧化物岐化酶(SOD)活性的影响。

图22不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠腹侧中脑谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-px)活性的影响。

图23不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠腹侧中脑过氧化氢酶(catalase)活性的影响。

图24不同剂量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP小鼠腹侧中脑总抗氧化能力(TAOC)的影响。

图25不同剂量褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠60分钟总活动距离的影响。

图26不同剂量褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠60分钟平均运动速度的影响。

图27不同剂量褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠60分钟每次活动平均运动距离的影响。

图28不同剂量褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠15分钟运动轨迹图的影响；

A.saline；B.MPTP；C.Fucoidan50mg/kgl+MPTP；D.Fucoidan 100mg/kg+MPTP。

图29不同剂量褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠纹状体多巴胺(DA)含量的影响。

图30不同剂量褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠纹状体二羟苯乙酸(DOPAC)含量的影响。

图31不同剂量褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠纹状体高香草酸(HVA)含量的影响。

图32不同剂量褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠纹状体(DOPAC+HVA)/DA比值的影响。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。这里想要指出的是，下面的具体实施方式仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。

实施例1海带褐藻多糖硫酸酯的制备

将海带粉碎后添加蒸馏水沸水提取，提取液以硅藻土助滤过滤，滤液先以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析一天，将透析液浓缩，加乙醇至浓度为75％沉淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl₂存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶，滤液透析、浓缩后75％乙醇沉淀，干燥后即得到纯化的褐藻多糖硫酸酯。经过分析，海带褐藻多糖硫酸酯主要是由岩藻糖、半乳糖组成的硫酸多糖。其中岩藻糖含量为31％，硫酸基含量为32％。平均分子量为180KD。

实施例2低分子量海带褐藻多糖硫酸酯F1的制备

取海带褐藻多糖硫酸酯50g配成1.5％的水溶液，在该溶液中加入30mM抗坏血酸和30mM过氧化氢，常温反应2小时。将该反应液用截留分子量为3600Da的透析袋分别在自来水和蒸馏水透析，之后浓缩，冻干。得到低分子量褐藻多糖硫酸酯样品F1。对F1进行化学分析结果表明岩藻糖含量为30％，硫酸基含量为31％，平均分子量为7KD。

实施例3褐藻多糖硫酸酯注射剂的制备

取实施例1所制备的褐藻多糖硫酸酯100g，加入注射用水1000ml，甘露醇100g，调PH值至7.0，分装，冷冻干燥。

实施例4褐藻多糖硫酸酯片剂的制备

取实施例2所制备的低分子量海带褐藻多糖硫酸酯50g，加入微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，混合，加入适量水，制软材，制粒，干燥。粒子加入交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁，混合，压片，每片含海带褐藻多糖硫酸酯100mg。

试验例1褐藻多糖硫酸酯拮抗6-OHDA的神经毒性

选用小鼠多巴胺(dopamine，DA)能神经前体细胞系MN9D细胞(由Novartis公司Bastian Hengerer博士赠送)，以DA能神经毒素6-OHDA为工具药建立帕金森病细胞模型。

MN9D细胞在含10％新生牛血清的DMEM/F12培养基中培养传代，按1×10⁵/孔和1×10⁴/孔的密度分别接种于24孔和96孔细胞培养板，稳定24小时后，更换新鲜培养基时加入不同浓度的(0.01～1mg/ml)褐藻多糖硫酸酯(实施例1所制备的海带褐藻多糖硫酸酯)预孵育1小时后再加入50μM的DA能神经毒素6-OHDA，空白对照组加入等体积的生理盐水，继续孵育24小时后，倒置相差显微镜下观察细胞形态，MTT法鉴定细胞活力，同时测定细胞培养上清中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)释放量评定细胞损伤率。实验发现，50μM 6-OHDA作用24小时，细胞形态变圆，胞体变小，突起变短或消失(图1)，细胞活力明显下降(图2)，细胞培养上清中LDH释放量明显增加(图3)，与空白对照组相比有统计学意义；用0.1～1mg/ml的褐藻多糖硫酸酯预处理可以明显提高细胞活力，减少细胞培养上清中LDH释放量，与6-OHDA处理组相比较差异有显著性，说明褐藻多糖硫酸酯可以有效对抗6-OHDA所致MN9D细胞的损伤。

试验例2褐藻多糖硫酸酯拮抗MPP⁺的神经毒性

选用小鼠多巴胺能神经前体细胞系MN9D细胞(由Novartis公司Bastian Hengerer博士赠送)，以DA能神经毒素MPP⁺为工具药建立帕金森病细胞模型。

MN9D细胞在含10％新生牛血清的DMEM/F12培养基中培养传代，按1×10⁵/孔1×10⁴/孔的密度接种于24孔和96孔细胞培养板，稳定24小时后，更换新鲜培养基时加入不同浓度(0.1～1mg/ml)的褐藻多糖硫酸酯(实施例2所制备的低分子量海带褐藻多糖硫酸酯F1)预孵育1小时后加入50μM的DA能神经毒素MPP⁺，空白对照组加入等体积的生理盐水，继续孵育36小时后，倒置相差显微镜下观察细胞形态，MTT法鉴定细胞活力，LDH释放法测定细胞损伤率。实验发现，50μM MPP⁺作用36小时后，细胞变圆，胞体变小，突起变短或消失(图4)，细胞活力明显下降(图5)，细胞培养上清中LDH释放量明显增加(图6)，与空白对照组相比有统计学意义；用0.1～1mg/ml的褐藻多糖硫酸酯预处理可以明显提高细胞活力，减少细胞培养上清中LDH释放量，与MPP⁺处理组相比较差异有显著性，说明褐藻多糖硫酸酯可以有效对抗MPP⁺所致MN9D细胞的损伤。

试验例3褐藻多糖硫酸酯拮抗6-OHDA和MPP⁺所致的氧化应激水平增高

DCF-DA是一种可通过细胞膜的荧光色素，进入细胞后经酯酶脱去二酯，与活性氧作用生成DCF，后者不能透过细胞膜，在488nm激发光下发出绿色荧光，可以用荧光显微镜观察细胞内氧化应激状况。

MN9D细胞在含10％新生牛血清的DMEM/F12培养基中培养传代，按1×10⁵/孔的密度接种于24孔细胞培养板，稳定24小时后，更换新鲜培养基时加入不同浓度(0.1～1mg/ml)的褐藻多糖硫酸酯(实施例1所制备的海带褐藻多糖硫酸酯)预孵育1小时后再加入50μM的DA能神经毒素6-OHDA或MPP⁺，空白对照组加入等体积的生理盐水，继续孵育8小时或12小时后，1μg/ml的DCF-DA孵育15分钟，荧光显微镜观察细胞内氧化应激情况。可见6-OHDA或MPP⁺处理后细胞内荧光强度明显高于空白对照组(图7，图8)，说明6-OHDA或MPP⁺的神经毒性作用与增加细胞内氧自由基的产生有关，但用0.1～1mg/ml的褐藻多糖硫酸酯预处理后细胞内荧光强度低于单纯6-OHDA或MPP⁺处理组，提示褐藻多糖硫酸酯的神经保护效应与降低细胞内氧化应激水平有关。

试验例4褐藻多糖硫酸酯腹腔注射给药保护多巴胺能神经元的在体研究

MPTP是一种脂溶性的神经毒素，全身给药可迅速透过血脑屏障，在脑内经胶质细胞内的B型单胺氧化酶作用转化成其活性形式MPP⁺后，被DA神经元上的DA转运体特异性摄取，通过抑制线粒体呼吸链复合体I和氧化应激选择性地损伤黑质致密部的DA能神经元，导致纹状体内DA含量明显减少，是目前应用最为广泛的帕金森病动物模型。

选用8～10周龄的雄性C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华动物繁殖中心)，按15mg/kg体重腹腔注射MPTP，每2小时一次，连续注射4次，空白对照组注射等量的生理盐水(NS)可使纹状体中DA含量的降低达到90％以上。将动物分为4组：(1)NS+NS组；(2)NS+MPTP组；(3)褐藻多糖硫酸酯(实施例2所制备的低分子量海带褐藻多糖硫酸酯F1)12.5mg/kg+MPTP组；(4)褐藻多糖硫酸酯(实施例2所制备的低分子量海带褐藻多糖硫酸酯F1)25mg/kg+MPTP组。

在MPTP损毁的前一周开始腹腔注射褐藻多糖硫酸酯或NS；造模当天腹腔注射褐藻多糖硫酸酯或NS后1小时开始腹腔注射MPTP或NS；再继续每天一次腹腔注射褐藻多糖硫酸酯或NS一周，完成行为学测试后处死动物，分别对黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫阳性神经元、纹状体DA及其代谢产物含量、腹侧中脑脂质过氧化物含量和抗氧化系统进行检测，结果如下：

1.褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著改善MPTP小鼠的行为

应用Truscan动物活动监测系统连续记录小鼠自主活动，记录时间为60分钟，用随机软件对各项运动指标进行分析，结果表明，MPTP小鼠在相同时间内的总活动距离、平均运动速度和每次活动的平均移动距离均显著低于NS对照组，但褐藻多糖硫酸酯腹腔注射组小鼠的上述运动指标均有好转，其中25mg/kg褐藻多糖硫酸酯组每次活动的平均移动距离结果具有统计学意义(图9、图10、图11)，结果提示褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以减轻MPTP所致小鼠的运动障碍。

2.褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著增加MPTP小鼠黑质致密部TH免疫阳性神经元的数量

TH是DA合成的限速酶，存在于DA能神经元的胞浆内，通过TH免疫组化染色法，可以鉴定DA能神经元，并观察DA能神经元形态和数量的改变。TH免疫组化显示，腹腔注射MPTP后，黑质致密部的DA能神经元大量死亡(图12B，12E)，与NS组(图12A，12D)相比TH免疫阳性神经元的数目明显减少；褐藻多糖硫酸酯25mg/kg组(图12C，12E)黑质致密部的TH阳性细胞形态基本正常，结构完整，数目明显多于MPTP组。

3.褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著对抗MPTP引起的小鼠腹侧中脑和纹状体TH蛋白表达减少

用蛋白裂解液分别提取小鼠腹侧中脑和纹状体蛋白，用Western蛋白免疫印迹法检测其TH蛋白表达量，结果发现：腹腔注射MPTP后，小鼠腹侧中脑和纹状体TH蛋白表达较NS对照组明显减少，而12.5mg/kg和25mg/kg褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著对抗MPTP引起的腹侧中脑和纹状体TH蛋白表达减少(图13，图14)。

4.褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著提高MPTP小鼠纹状体内DA和DOPAC的含量

用高效液相-电化学法(HPLC-ECD)对小鼠纹状体中DA及其代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)的含量进行了检测，并对DA、DOPAC、HVA含量和(HVA+DOPAC)/DA的比值进行了计算及统计学分析。

结果发现，25mg/kg剂量组的褐藻多糖硫酸酯能使MPTP小鼠纹状体中DA和DOPAC的含量显著地增高(图15、图16)，HVA含量无明显变化(图17)；同时，(HVA+DOPAC)/DA的比值为所有组中最低(图18)。HVA和DOPAC是DA在脑内的最终代谢产物，(HVA+DOPAC)/DA比值升高，说明DA的代谢速率增快，代谢产物生成增多，多见于DA能神经元不完全损伤时。褐藻多糖硫酸酯能使(HVA+DOPAC)/DA的比值降低，说明其能减缓MPTP损伤鼠DA能神经元中的DA代谢更新速率，从而有效地保护了神经元的存活，对MPTP导致的PD小鼠模型中脑DA能神经元的损伤具有一定的保护作用。

5.褐藻多糖硫酸酯保护MPTP小鼠DA能神经元的相关机制研究

5.1.褐藻多糖硫酸酯腹腔注射对MPTP代谢的影响

最后一次注射MPTP后2小时，用高效液相-紫外检测法对小鼠纹状体MPTP代谢产物MPP⁺含量进行检测，结果发现，25mg/kg褐藻多糖硫酸酯腹腔注射组纹状体MPP⁺含量与单独注射MPTP组没有明显区别，说明褐藻多糖硫酸酯不影响MPTP的代谢(图19)。

5.2.褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著降低MPTP小鼠腹侧中脑的丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量

在正常脑组织，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，如超氧阴离子基团、过氧化氢、羟基和过氧化亚硝基阴离子，与内源性酶[超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)、过氧化氢酶(catalase)等抗氧化防御体系保持平衡。既往研究表明，遗传、环境、老化等多种因素作用可以导致PD患者脑内的这种平衡状态被破坏，过多的自由基攻击生物膜、蛋白质和DNA等生物大分子产生损伤效应；动物实验研究也支持氧化应激参与了DA能神经元变性、死亡的启动和进展过程，因此针对氧化应激的抗氧化药物的研发是PD治疗学的研究热点。

脂质过氧化产物MDA含量测定是反映组织的氧化应激水平的常用指标。在最后一次注射MPTP后48小时，用MDA试剂盒对MPTP小鼠腹侧中脑组织匀浆上清中的MDA含量进行测定发现，MPTP小鼠腹侧中脑MDA的含量显著增高，是生理盐水对照组的152.35％，而12.5mg/kg和50mg/kg褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著降低MPTP小鼠腹侧中脑MDA的含量，结果具有统计学意义(图20)。

5.3.褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著提高MPTP小鼠腹侧中脑的抗氧化酶的含量

在最后一次注射MPTP后48小时，用SOD、GSH-px、Catalase和总抗氧化能力(total antioxidant capability，TAOC)测定试剂盒分别对MPTP小鼠腹侧中脑组织匀浆上清中的SOD、GSH-px、Catalase含量和TAOC进行测定发现，MPTP小鼠腹侧中脑SOD、GSH-px、Catalase含量和TAOC与生理盐水对照组相比显著降低，而12.5mg/kg和50mg/kg褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以显著增加MPTP小鼠腹侧中脑SOD、GSH-px、Catalase含量和TAOC，结果具有统计学意义(图21，图22，图23，图24)。

试验例5褐藻多糖硫酸酯灌胃给药对MPTP小鼠DA能神经元的保护作用观察

为了给将来方便临床用药提供依据，继续观察了褐藻多糖硫酸酯灌胃对MPTP小鼠行为学和纹状体DA及其代谢产物DOPAC的影响。

选用8～10周龄的雄性C57BL/6J小鼠，按15mg/kg体重腹腔注射MPTP，每2小时一次，连续注射4次，可使纹状体中DA含量的降低达到90％以上，空白对照组给予等体积NS。将动物分为4组：(1)NS+NS组；(2)NS+MPTP组；(3)褐藻多糖硫酸酯(实施例2所制备的低分子量海带褐藻多糖硫酸酯F1)50mg/kg灌胃+MPTP组；(4)褐藻多糖硫酸酯(实施例2所制备的低分子量海带褐藻多糖硫酸酯F1)100mg/kg灌胃+MPTP组。

在MPTP损毁的前一周开始灌胃褐藻多糖硫酸酯或NS；造模当天灌胃褐藻多糖硫酸酯或NS后1小时开始腹腔注射MPTP或NS；再继续每天一次灌胃褐藻多糖硫酸酯或NS一周后，完成行为学测试后处死动物，对纹状体DA及其代谢产物含量进行检测，结果如下：

1.褐藻多糖硫酸酯灌胃可以显著改善MPTP小鼠的行为

应用Truscan动物活动监测系统连续记录小鼠自主活动，记录时间为60分钟，用随机软件对各项运动指标进行分析，结果表明，MPTP小鼠在相同时间内的总活动距离、平均运动速度和每次活动的平均移动距离均显著低于生理盐水对照组，但100mg/kg褐藻多糖硫酸酯灌胃15天组小鼠的上述运动指标均明显好转，结果具有统计学意义(图25、图26、图27)。图28为各组小鼠15分钟的运动轨迹图，结果提示褐藻多糖硫酸酯灌胃可以减轻MPTP小鼠的运动减少和运动迟缓。

2.褐藻多糖硫酸酯灌胃可以显著提高MPTP小鼠纹状体内DA和DOPAC的含量

用高效液相-电化学法(HPLC-ECD)对小鼠纹状体中DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量进行了检测，并对DA、DOPAC和HVA的含量及(HVA+DOPAC)/DA的比值进行了计算及统计学分析。

分析发现100mg/kg的褐藻多糖硫酸酯能使MPTP小鼠纹状体中DA和DOPAC的含量显著地增高，HVA含量无明显变化；同时，(HVA+DOPAC)/DA的比值为所有组中最低(图29，图30，图31，图32)。

通过以上离体细胞实验和在体动物实验，发现褐藻多糖硫酸酯对PD细胞模型和动物模型的DA能神经元有一定的神经保护效应，推测其机制可能与褐藻多糖硫酸酯的降低中脑脂质过氧化反应、提高抗氧化系统活性有关。

Claims (10)

1、褐藻多糖硫酸酯在制备预防和治疗帕金森病药物中的用途。

2、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯的主要组分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，还含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca和Mg。

3、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯从以下褐藻中的一种或多种中提取得到：海带、马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻、墨角藻。

4、根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的褐藻多糖硫酸酯是从海带中提取得到的海带褐藻多糖硫酸酯。

5、根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的海带褐藻多糖硫酸酯主要是由岩藻糖和半乳糖组成，其中岩藻糖含量为31％，硫酸基含量为32％，平均分子量为180KD。

6、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的褐藻多糖硫酸酯还包括将褐藻多糖硫酸酯通过降解而制备得到的低分子量硫酸多糖或寡糖类物质。

7、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的褐藻多糖硫酸酯的分子量为2kD-1000Kd。

8、根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的褐藻多糖硫酸酯的分子量是3KD～30KD。

9、根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的褐藻多糖硫酸酯的分子量是5KD～20KD。

10、一种药物组合物，该药物组合物包含治疗上有效量的褐藻多糖硫酸酯和至少一种药学上可接受的辅料或载体。

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