CN101940588A - 苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用，其特征在于1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖起神经保护作用，能够对抗神经毒素6-羟基多巴胺和高铁诱导的细胞损伤；减轻6-羟基多巴胺或高铁诱导的细胞内活性氧物质的产生。苯甲酰化褐藻多糖为天然褐藻多糖经苯甲酰化后获得，天然褐藻多糖来源于海带或马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布等其它褐藻，来源丰富，安全性高，对神经毒素和高铁诱导的细胞损伤有保护作用。本发明对于开发成为一种新型的国家I类抗PD天然新药具有重要的应用价值。
Description
技术领域：
本发明涉及苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用，尤其是涉及苯甲酰化褐藻多糖在治疗帕金森病中能够对抗神经毒素和高铁对多巴胺能神经元的毒性作用的应用。属医药技术领域。
背景技术：
随着世界人口老龄化进程的加剧，神经退行性疾病已成为严重危害人类健康的疾病之一。帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是发病率仅次于老年痴呆的第二大神经退行性疾病，病理特征为脑内黑质区多巴胺能神经元的选择性死亡和纹状体多巴胺含量的显著减少。PD的发病原因至今仍未研究清楚，黑质区高铁是多巴胺能神经元死亡的一个重要原因。PD不仅会影响病人的生活质量，而且会给家庭和社会造成巨大的精神和经济负担。左旋多巴是治疗PD的经典药物，通过补充多巴胺的前体可以缓解PD的症状。然而长期应用左旋多巴后大部分患者会出现多动症、疗效波动和开关现象。因此，人们一直致力于从分子、细胞和整体水平上，多层次、多角度研究PD的发病机理，以寻求更为安全有效的预防和治疗PD的药物及方法。海洋是地球上资源最丰富的领域，开发海洋药物，研究海洋天然产物越来越受到重视，而海洋物质提取物及其衍生物在开发防治PD及发挥神经保护作用方面也将具有不可估量的社会和经济效益。
褐藻多糖是含有岩藻糖的一类多糖，存在于褐藻中，首先由Kylin在1913年用稀酸从掌状海带中提取出来。此外，褐藻多糖还可以由墨角藻、泡叶藻、昆布或绳藻等褐藻中提取得到。褐藻多糖已被发现具有多种生物学活性，包括抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗补体活化、抗氧化、抗辐射、抑制腹水瘤等活性。苯甲酰化褐藻多糖(PF)是由褐藻多糖经苯甲酰化反应获得，主要由岩藻糖、半乳糖等单糖组成，还含有硫酸基和邻苯二甲酸基，结构式如下所示：
本发明人从事天然活性物质防治PD的综合开发利用研究，长期研究和大量试验结果表明，苯甲酰化褐藻多糖作为结构明确的天然活性水溶性物质，安全性高，来源丰富，足以其作为药物开发的新靶点。目前尚未有文献报导苯甲酰化褐藻多糖在PD防治中的作用及其应用。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，针对传统的抗PD药物普遍存在一些不良反应，严重地限制了其应用和推广等缺点，旨在提供一种苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明的苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用，其特征在于苯甲酰化褐藻多糖起神经保护作用，能够对抗神经毒素和高铁诱导的细胞损伤：
1.1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖与神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)共孵育MES23.5多巴胺能细胞24h后，可以明显减轻6-OHDA诱导的细胞存活率的下降；
2.1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖与神经毒素6-OHDA共孵育MES23.5多巴胺能细胞24h后，可以明显减轻6-OHDA诱导的细胞内活性氧物质的产生；
3.1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖与1mmol/L铁共孵育MES23.5多巴胺能细胞4h后，可以完全阻断高铁诱导的细胞存活率的下降；
4.1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖与1mmol/L铁共孵育MES23.5多巴胺能细胞4h后，可以完全阻断高铁诱导的细胞内活性氧物质的产生。
本发明所述的苯甲酰化褐藻多糖为天然褐藻多糖经苯甲酰化后获得，天然褐藻多糖可以来源于海带，也可以是其它褐藻包括马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻等，优选来源于海带。
本发明人通过长期研究和大量试验发现，苯甲酰化褐藻多糖具有明显的神经保护作用，在体外实验中证实苯甲酰化褐藻多糖能够保护MES23.5多巴胺能细胞免受神经毒素6-OHDA和高铁的损伤，其保护作用与抗活性氧物质生成有关。同时苯甲酰化褐藻多糖作为来源于食用海藻的一种天然海洋多糖衍生物，通过在体外的细胞毒性实验，证实其发挥作用的浓度无任何毒副作用，其高安全性可以保证病人长期用药的需要。因此，苯甲酰化褐藻多糖作为结构明确的天然海洋活性物质，毒性低，安全性好，能够对抗神经毒素和高铁的毒性，故在治疗PD和神经保护方面有良好的应用前景和巨大的新药开发价值。本发明对于开发成为一种新型的国家I类抗PD天然新药具有重要的应用前景和实际价值。
附图说明：
图1为苯甲酰化褐藻多糖的IR谱图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1：苯甲酰化褐藻多糖(PF)的制备
1、PF的合成
称取2g天然褐藻多糖(来源于海带)溶于80ml甲酰胺中，在80℃下搅拌30min，将20g邻苯二甲酸酐溶于含质量百分比1％N-溴代丁二酰亚胺(NBS)的100ml甲酰胺中，滴加到褐藻多糖溶液中，反应6h；反应结束后，将反应液倒出，用85％的酒精沉淀，95％酒精洗涤沉淀1-2次，将沉淀溶于100-200ml蒸馏水中，3600道尔顿(Da)透析袋自来水透析2天，蒸馏水透析1天，浓缩冻干，记为PF。由红外(IR)谱图检测苯甲酰化是否成功。
2、邻苯二甲酸基含量测定
邻苯二甲酸盐标准曲线制作：准确秤取邻苯二甲酸50mg，用饱和NaOH配制成10ml溶液，分别取3、2、1.6、1.2、0.8、0.4ml标准溶液用饱和NaOH稀释到5ml，289nm处测定吸光度。
PF的水解：将0.1g样品溶于10ml水中，滴加到90ml饱和NaOH中，70-80℃反应4h。取反应后溶液在289nm处测定吸光度。
3、PF的化学组成和IR谱图
PF样品的化学组成如表1，IR谱图如图1所示。红外谱图与原来相比出现了1726cm-1的C＝O吸收峰和1410cm-1的苯环振动的特征峰。
表1.PF的化学组成分析
实施例2：PF能够对抗神经毒素6-OHDA的毒性作用
1、MTT测定细胞存活率
取对数生长期的MES23.5多巴胺能细胞(美国休斯敦贝勒医学院乐卫东教授惠赠)，吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×105个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。贴壁后加入用Dulbecco’s modification ofEagle’s medium/F12(DMEM/F12)培养液(Gibco公司)溶解的PF(1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/ml)与6-OHDA(100μmol/L)共培养24h。然后每孔加入5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)20μl，37℃培养箱中培养4h。弃上清后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200μl，自动酶标读数仪(R-T-2100C，深圳雷杜公司)比 色(主波长573nm，次波长630nm)，测定其吸光度值，并计算各组MES23.5细胞的存活率。
细胞存活率＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
上述MTT测定结果提示(表2)，当只加入6-OHDA时，细胞的存活率明显下降，而用PF(1mg/ml)与6-OHDA共孵育时，可以明显抑制细胞存活率的下降，与6-OHDA单独作用组相比有统计学意义。其他低浓度组没有明显变化：0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/mlPF没有明显的抑制细胞存活率下降的作用。表明1mg/ml PF可以对神经毒素损伤的MES23.5细胞有明显的保护作用。
表2. 1mg/ml PF对细胞存活率的影响
Cell viability
Control 1.000±0.04
6-OHDA(100μmol/L) 0.603±0.032*
PF(1mg/ml)+6-OHDA 0.806±0.033*#
PF(0.1mg/ml)+6-OHDA 0.667±0.039*
PF(0.01mg/ml)+6-OHDA 0.648±0.026*
PF(0.001mg/ml)+6-OHDA 0.64±0.04*
*P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with 6-OHDA.
2、细胞内活性氧物质(ROS)的测定
细胞按上述处理后加入荧光染料2，7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(H2DCF-DA，终浓度为5μmol/L)37℃避光负载30min；用N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES，20mmol/L HEPES，150mmol/L NaCl，pH＝7.4)缓冲液洗3次后再用1ml重悬。用流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)以激发波长488nm，发射波长523nm测定，CELLQuest Pro分析系统分析每组细胞H2DCF-DA的荧光强度来表示细胞内ROS的生成情况，数据以与对照组的百分比来表示。结果提示(表3)，100μmol/L 6-OHDA处理细胞后，细胞内ROS生成明显增加，PF(1mg/ml)与6-OHDA共孵育可以明显降低细胞内ROS水平，与6-OHDA单独作用组相比有统计学意义。
表3. 1mg/ml PF对细胞内ROS生成的影响
ROS(％of Control)
Control 100±0.00
6-OHDA(100μmol/L) 170.54±5.29*
PF(1mg/ml)+6-OHDA 112.06±2.74*#
*P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with 6-OHDA
实施例3：PF能够对抗高铁的毒性作用
1、MTT测定细胞存活率
取对数生长期的MES23.5多巴胺能细胞吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×105个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。贴壁后加入PF(1mg/ml)与铁(1mmol/L)共培养24h。然后每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃培养箱中培养4h。弃上清后每孔加入DMSO 200μl，自动酶标读数仪比色(主波长573nm，次波长630nm)，测定其吸光度值，并计算各组MES23.5细胞的存活率。
细胞存活率＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
上述MTT测定结果提示(表4)，当只加入1mmol/L铁时，细胞的存活率明显下降，而用PF(1mg/ml)与铁离子共孵育时，可以完全阻断高铁诱导的细胞存活率的下降。
表4. 1mg/ml PF对细胞存活率的影响
Cell viability
Control 1.000±0.02
Iron(1mmol/L) 0.86±0.034*
PF(1mg/ml)+iron 0.97±0.039#
*P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with 6-OHDA.
2、细胞内活性氧物质(ROS)的测定
细胞按上述处理后加入荧光染料H2DCF-DA(终浓度为5μmol/L)37℃避光负载30min；用HEPES缓冲液洗3次后再用1ml重悬。用流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)以激发波长488nm，发射波长523nm测定，CELLQuest Pro分析系统分析每组细胞H2DCF-DA的荧光强度来表示细胞内ROS的生成情况，数据以与对照组的百分比来表示。结果提示，1mmol/L铁处理细胞后，细胞内ROS生成明显增加，PF(1mg/ml)与铁共孵育可以完全阻断细胞内ROS的生成(表5)。
表5. 1mg/ml PF对细胞内ROS生成的影响
ROS(％of Control)
Control 100±0.00
Iron(1mmol/L) 150.16±2.99*
PF(1mg/ml)+iron 91.14±8.47#
*P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with iron
实施例4：PF的体外毒性实验
取对数生长期的MES23.5细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×105个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞融合度达到70-80％后换用无血清培养基及药物处理。加入不同浓度的PF(1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/ml)，孵育MES23.5细胞24h后，阴性对照组只用无血清培养 基替换，每个浓度设6个复孔。培养结束前4h，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃培养箱中培养4h。弃上清后每孔加入DMSO 200μl，自动酶标读数仪比色(主波长573nm，次波长630nm)，测定其吸光度值，并计算各组MES23.5细胞的存活率。
细胞存活率＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
结果提示(表6)，不同浓度PF处理组细胞存活率与对照组相比没有统计学意义。表明实验所用浓度的PF没有表现出细胞毒性作用。
表6.不同浓度PF对细胞存活率的影响
通过以上实验表明，PF对MES23.5多巴胺能细胞发挥神经保护作用。可以明显减轻神经毒素6-OHDA和高铁诱导的细胞存活率的下降，明显减轻细胞内活性氧物质的生成，具有神经保护及抗氧化应激的作用。
Claims (3)
1.一种苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用，其特征在于苯甲酰化褐藻多糖起神经保护作用，能够对抗神经毒素和高铁诱导的细胞损伤：1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖与神经毒素6-羟基多巴胺共孵育MES23.5多巴胺能细胞24小时后，减轻6-羟基多巴胺诱导的细胞存活率的下降；1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖与神经毒素6-羟基多巴胺共孵育MES23.5多巴胺能细胞24小时后，减轻6-羟基多巴胺诱导的细胞内活性氧物质的产生；1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖与1mmol/L铁共孵育MES23.5多巴胺能细胞4小时后，完全阻断高铁诱导的细胞存活率的下降；1mg/ml苯甲酰化褐藻多糖与1mmol/L铁共孵育MES23.5多巴胺能细胞4小时后，完全阻断高铁诱导的细胞内活性氧物质的产生。
2.根据权利要求1所述的苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用，其特征在于苯甲酰化褐藻多糖为天然褐藻多糖经苯甲酰化后获得：称取2g天然褐藻多糖溶于80ml甲酰胺中，在80℃下搅拌30分钟，将20g邻苯二甲酸酐溶于含质量百分比1％N-溴代丁二酰亚胺的100ml甲酰胺中，滴加到褐藻多糖溶液中，反应6小时；反应结束后，将反应液倒出，用85％的酒精沉淀，95％酒精洗涤沉淀1-2次，将沉淀溶于100-200ml蒸馏水中，3600道尔顿透析袋自来水透析2天，蒸馏水透析1天，浓缩冻干，得到苯甲酰化褐藻多糖。
3.根据权利要求2所述的苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用，其特征在于天然褐藻多糖来源于海带或其它褐藻：马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻。
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