KR100808115B1

KR100808115B1 - 심층수를 이용한 스피룰리나 배지제조방법

Info

Publication number: KR100808115B1
Application number: KR1020060119102A
Authority: KR
Inventors: 이현용; 김철희; 김효성; 권민철; 송영규; 배근중
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2006-11-29
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2008-02-29

Abstract

심층수는 극지방에서 차가운 얼음을 만난 해수가 온도와 염분의 농도차이로 수직침강하여 바다의 밑바닥을 따라 단 한차례의 대기와 접촉하는 일 없이 수천년동안 지구를 흐르는 해수이다. 바다는 대기와 달라 수심 200미터만 들어가면 아무리 깨끗한 바다라 하더라도 태양빛이 전혀 도달하지 못하는 암흑의 상태가 되는데, 이 상태에서 1년에 1~2미터를 움직이는 것에 불과한 매우 느린 속도로 지구를 한 바퀴 도는 데에는 약 4,000년이 걸린다고 한다. 이러한 심층수는 해수가 도달하지 않기 때문에 광합성 작용이 전혀 일어나지 않아 바다의 영양 물질을 소비하는 식물 플랑크톤이 존재할 수 없기 때문에 영양물질이 풍부한 상태가 된다. 대순환형 해양심층수는 평균 3,000미터의 심해를 흐르며, 이는 300기압의 고압상태를 의미하여 이러한 속에서 해수중의 물질이 완전히 분해되어 100여가지에 달하는 미량 미네랄이 균형잡힌 밸런스로 포함되는 것이다. 칼슘이나 마그네슘 등 세포의 활성화를 촉진시키는 풍부한 천연 미네랄의 저장소가 되는 것이다.

본 발명은 이러한 심층수를 이용하여 심층수에 포함되어 있을지도 모르는 불순물을 제거하기 위해 4℃에서 일주일동안 불순물을 침전시켜 제거하고, 이를 다시 필터를 통하여 정제함으로서 고순도의 심층수를 이용하여 기존의 스피룰리나 전용배지를 개선하고 스피룰리나의 생육을 촉진하여 대량생산이 가능하도록 하는 배양 방법에 관한 것으로 심층수의 첨가 농도에 따른 효과를 측정함으로서 알맞은 심층수 첨가 배양 조건을 확립하였으며 전용배지와의 혼합 시 생기는 침전을 방지하여 균주 획득를 용이하게 하는 것이다. 또한 심층수를 첨가함으로서 스피룰리나 전용배지를 만들 때의 혼합되는 물질들을 줄여 작업을 간편하게 할 수 있는 장점을 가지고 있으며 심층수에 포함되어 있는 여러 유효 성분에 의해 스피룰리나의 생존기간을 늘리며 성장 속도를 촉진하는 효과를 나타내고 있어 대형화 공정과 옥외배양공정에 효율적으로 활용할 수 있다.

Description

심층수를 이용한 스피룰리나 배지제조방법{The method of preparing spirulina medium using deep water}

도 1은 스피룰리나 전용배지와 10%, 30%, 50% 심층수를 혼합한 수정배지에서의 스피룰리나 생육비교도이다.

본 발명은 스피룰리나를 심층수를 이용하여 배양하는데 있어서, 기존의 스피룰리나 전용배지를 개선하여 생존기간을 늘리고 생육을 촉진하여 대량생산에 적합한 배지의 제조방법에 관한 것이다.

스피룰리나는 식물성 플랑크톤류의 25,000가지 해조류 중 사람에게 가장 유익한, 길이 0.3~0.5㎜, 폭 5~8㎛의 청남조류 원핵다세포 미생물로, 염분과 알카리성이 높은 열대지방의 호수에서 번식하는 미세조류의 일종이다. 스피룰리나는 주로 아프리카, 멕시코 등지에서 수온이 37~42℃, 수소이온농도 pH 8~11, 알칼리의 짠호수(염도 30~40%)에서 자생한다. 스피룰리나는 시아노박테리아(cyanobacteria)에 속 하는 미세조류의 일종으로 양질의 단백질을 다량 함유하고 있고, 상대적으로 지질이나 탄수화물의 함량이 적다. 그밖에 항산화활성이 있는 베타카로틴이나 피코시아닌 등과 같은 식용색소를 다량 함유하고 있고, 다양한 종류의 비타민, 무기질, 섬유질 등을 풍부하게 함유하고 있으며 그 이용효율도 높아 인류의 중요한 식량자원이 되며 건강식품으로서 인류의 건강에 기여하고 있다. 이러한 스피룰리나 만을 장기간 단독으로 먹어도 편식의 우려가 없는 균형 잡힌 영양소 조성을 가지고 있어서 완전식품이라 말하기도 한다. 현재는 인공적인 배양기술이 확립되어 있어서 식품 규격의 제품이 공급되고 있어서 건강식품으로서의 평가가 날로 높아지고 있다. 또한, 스피룰리나는 고알칼리로 인체의 체질 개선에도 놀라운 효과가 있으며, 특히 소화흡수율, 소화촉진작용이 우수하며, 배양수확이 용이하다. 하기 표 1은 스피룰리나의 성분표이다.

표 1.

아미노산 (55~70%)	비타민	미네랄	색소	지질 (3~9%)	당질 (7~20%)	항산화제	강알칼리
로이신, 메치오닌, 티로신, 발린, 글리신, 세린, 히스티딘 등	베타카로틴, 비타민 B complex, 비타민 E, 나이아신, 엽산, 비오틴 등	칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 철, 아연, 게르마늄 등	클로로필 a, 카로티노이드, 피코시아닌 등	리놀산, 리놀렌산, 팔미틴산, 오레인산 등	글리코겐, 만노스, 키시로스 등	SOD(super oxide dismutase) 110,000단위	알칼리 농도 50°

일반적으로는 심층수는 수심 200미터 이하의 해수를 말하며, 햇빛이 닿지 않으므로 광합성이 일어나지 않아 무기영양염을 많이 포함하며 오랜 세월을 거쳐 숙 성된 해수로서 필수미량원소와 다양한 미네랄이 균형있게 포함되어 있다. 이러한 사실이 밝혀지면서 최근 세계 각국에서 심층수를 이용한 연구 개발이 활발히 진행되고 있으며, 특히 일본에서는 심층수를 원료로 한 제품으로서 화장품, 음료, 두부 등이 출시되어 대규모 시장을 형성하고 있다. 우리나라에서는 최근 심층수를 원료로 한 화장품과 음료수가 출시되어 있으나, 아직 심층수를 이용하려는 연구는 진행 중에 있다.

위와 같은 스피룰리나의 장점을 산업화하고자 대량생산을 꾀하고 있으며 이를 위하여 빠른 성장을 요하는 배지가 필요하다. 스피룰리나를 배양하는데 다른 조류의 배양조건에 비해 몇 가지 어려운 점이 있다. 35‰의 고염과 강알칼리에서 최적의 성장을 나타내기 때문에 이러한 조건들을 맞춰줘야 한다는 것이 가장 어려운 일이다. 또한 심층수를 이용한 스피룰리나의 배양 시 기존의 배양방법으로 키운 것에 비하여 더욱 높은 생리활성을 갖고 있으나 전용배지에 비하여 생산성이 낮은 단점이 있다.

또한, 스피룰리나 전용배지에 심층수를 단순혼합할 때 침전물이 생기는 문제점이 있는 것이다. 침전물이 생기면 빛투과가 떨어져 생육이 부진하며, 원심분리할 때 미세조류가 침전물과 섞이는 문제점이 있게 된다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 심층수를 이용하였을 때 나타나는 높은 생리활성을 유지시키며 스피룰리나 전용배 지보다 빠른 성장속도를 내게 하는 새로운 배지를 만들어 대량화에 적합하게 하는 것으로, 스피룰리나 전용배지에서 침전물의 원인이 되는 제일인산칼륨과 탄산나트륨을 제외하고 부족해진 탄소원의 공급을 위해 탄산수소나트륨을 추가하여 기존의 전용배지를 수정하고, 이 수정된 배지에 심층수를 10% 섞어 제조함으로써 문제점을 해결할 수 있는 것이다.

1. 심층수를 일주일동안 4℃에서 침전시킨 후 0.2um 필터로 정제하여 더욱 청정한 상태를 만드는 1단계,

2. 기존의 스피룰리나 전용배지에서 심층수와의 단순 혼합 시 생기는 침전물을 막기 위하여 침전의 원인이 되는 물질을 제외하는 2단계,

3. 성장 촉진를 유지하기 위한 부족해진 탄소원을 첨가하는 3단계,

상기와 같은 3단계의 과정을 포함하는 것을 특징으로 하여 침전물이 생기지 않게 하여 균주 획득시 불편함을 해소하며 스피룰리나 고유의 청남색을 유지하되 생존기간이 길고 성장속도를 촉진하는 스피룰리나 대량화 생산에 적합한 배지를 제공하는 것이다.

본 발명은 스피룰리나 전용배지인 우텍스 제공 Sprulina platensis(LB2340) 전용배지(이하 "스피룰리나 전용배지"라 함)에서 침전물의 원인이 되는 제일인산칼 륨과 탄산나트륨을 제외하고, 부족해진 탄소원의 공급을 위해 탄산수소나트륨을 5g을 추가하여 기존의 전용배지를 수정한 후, 이 수정된 배지에 고순도로 정제된 심층수를 10% 섞어 제조되는 것을 특징으로 하는 스피룰리나 배양 배지 제조방법에 관한 것이다. 고순도로 정제된 심층수는 심층수를 일주일동안 40℃에서 침전시킨 후 0.2㎛ 필터로 정제하여 더욱 청정한 상태로 만드는 것이다.

스피룰리나 전용배지 제조방법은 표 2에 나타나 있다.

표 2.

우텍스 제공 Spirulina platensis ( LB2340 ) 전용배지 제조방법

조제 : 오토클레이브를 할 때 침전을 방지하기 위하여 다음의 2개 용액으로 구분하여 만든다.

A 용액

증류수 500mL 당

탄산수소나트륨	13.61 g
탄산나트륨	4.03 g
제일인산칼륨	0.50 g

B 용액

증류수 500ml 당

질산나트륨	2.50 g
황산칼륨	1.00 g
염화나트륨	1.00 g
황산마그네슘	0.20 g
염화칼슘	0.04 g
PIV 미량금속용액	6 mL
chu 미세영양용액	1 mL
비타민 B₁₂ (1.5mg/ 100mL 증류수)	1 mL

용액 A와 B는 따로 오토클레이브를 하고 식힌 다음에 섞는다.

※ 참조(PIV 미량금속용액, chu 미세영양금속 조제법)

0.750g의 EDTA나트륨을 충분히 녹인 1L 증류수 당

PIV 미량금속용액

염화철	97 mg
염화망간	41 mg
염화아연	5 mg
염화카르보닐	2 mg
몰리브덴산나트륨	4 mg

오토클레이브한 증류수 1L 당

Chu 미세영양용액

EDTA나트륨	50 mg
붕산	618 mg
황산구리	19.6 mg
황산아연	44 mg
염화카르보닐	20 mg
염화망간	12.6 mg
몰리브덴산나트륨	12.6 mg

즉, 본 발명에서는 통상의 스피룰리나 전용 배양액에 있어서, 고순도로 정제된 심층수를 10%, 30%, 50%의 농도로 첨가하여 배양한 후 생존성과 균주 성장속도를 살펴 최적의 배양액 제조 조건을 확립하며 또한 단순 혼합 시 생기는 침전물의 제거와 이를 통해 소실될지 모르는 배지의 영양분을 없애지 않는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구체적인 실시 예는 다음과 같다.

실시예 1. 침전물의 생성 유무를 확인

심층수에 NaHCO₃, Na₂CO₃, K₂HPO₄ ,NaNO₃, K₂SO₄, NaCl, MgSO₄. ₇H₂O, CaCl₂. 2H₂O, PIV metal solution, Chu micronutrient solution를 혼합하여 침전물의 유무를 판단하였다.

실시예 2. 스피룰리나 전용 배양액에서만 배양한 스피룰리나

1)배양액 : 상기한 표 2에 따라 스피룰리나 전용배지를 제조 하였다.

2)배양조건 : 초기에는 250ml 플라스크에서 배양용적을 100ml로 하여 배지에 적응된 생존 스피룰리나만을 분리하여 500ml 플라스크를 거쳐 최종 5L의 jar에 배양하였으며 추가적 영양공급을 하지 않는 진탕 회분배양을 하였다. 32℃, 초기 pH 9.08, 3Klux의 광도의 빛을 연속 조사하였다. 이 배양 방법을 대조군(control)으로 하였다.

3)생육측정 : 흡광도계를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였으며 건조 균체량은 배양조에서 매일 20ml를 취해 0.45um 크기의 여과지로 여과하여 증류수로 2회 세척한 다음 105℃ 건조기에서 6시간 건조하고 탈습기에서 측정한 후 비교하였 다.

4)생존기간 : 매일 측정된 생육측정 결과를 종합하여 생육곡선 그래프를 그려 비교 하였다.

실시예 3. 심층수를 10% 포함하여 배양한 스피룰리나

1)배양액 : 표 2의 스피룰리나 전용배지 제조방법에서 A용액 제조시 침전물의 원인이 되는 탄산나트륨과 제일인산칼륨을 제외하고 부족해진 탄소원의 공급을 위해 탄산수소나트륨을 A 용액 제조시 5g을 추가하여 기존의 전용배지를 수정하였으며 이 수정된 배지에 심층수를 10% 섞어 제조하였다. 이때 심층수는 심층수를 일주일동안 4℃에서 침전시킨 후 0.2㎛ 필터로 정제하여 사용한다.

2)배양조건 : 초기에는 250ml 플라스크에서 배양용적을 100ml로 하여 배지에 적응된 생존 스피룰리나만을 분리하여 500ml 플라스크를 거쳐 최종 5L의 jar에 배양하였으며 추가적 영양공급을 하지 않는 진탕 회분배양을 하였다. 32℃, 초기 pH 9.08, 3Klux의 광도의 빛을 연속 조사하였다. 이 배양 방법을 실험군으로 하였다.

3)생육측정 : 흡광도계를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였으며 건조 균체량은 배양조에서 매일 20ml를 취해 0.45um 크기의 여과지로 여과하여 증류수로 2회 세척한 다음 105℃ 건조기에서 6시간 건조하고 흡습기에서 측정한 후 비교하였다.

실시예 4. 심층수를 30% 포함하여 배양한 스피룰리나

1)배양액 : 표 2의 스피룰리나 전용배지 제조방법에서 A용액 제조시 침전물의 원인이 되는 제일인산칼륨과 탄산나트륨을 제외하고 부족해진 탄소원의 공급을 위해 탄산수소나트륨을 5g을 추가하여 기존의 전용배지를 수정하였으며 이 수정된 배지에 심층수를 30% 섞어 제조하였다. 이때 심층수는 심층수를 일주일동안 4℃에서 침전시킨후 0.2㎛ 필터로 정제하여 사용한다.

3)생육측정 : 흡광도계를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였으며 건조 균체량은 배양조에서 매일 20ml를 취해 0.45um 크기의 여과지로 여과하여 증류수로 2회 세척한 다음 105℃ dry oven에서 6시간 건조하고 흡습기에서 측정한 후 비교하였다.

실시예 5. 심층수를 50% 포함하여 배양한 스피룰리나 및 그 추출물

1)배양액 : 표 2의 스피룰리나 전용배지 제조방법에서 A용액 제조시 침전물의 원인이 되는 제일인산칼륨과 탄산나트륨을 제외하고 부족해진 탄소원의 공급을 위해 탄산수소나트륨을 5g을 추가하여 기존의 전용배지를 수정하였으며 이 수정된 배지에 필터를 통해 정제된 심층수를 50% 섞어 제조하였다. 이때 심층수는 심층수를 일주일동안 4℃에서 침전시킨후 0.2㎛ 필터로 정제하여 사용한다.

2)배양조건 : 초기에는 250ml 플라스크에서 배양용적을 100ml로 하여 배지에 적응된 생존 스피룰리나만을 분리하여 500ml 플라스크를 거쳐 최종 5L의 jar에 배양하였으며 추가적 영양공급을 하지 않는 진탕 회분배양을 하였다. 32℃, 초기 pH 9.08의 조건을 맞춰주고 3Klux의 광도의 빛을 연속 조사하였다. 이 배양 방법을 실험군으로 하였다.

3)생육측정 : Spectrophotometer를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였으며 건조 균체량당 흡광도를 측정하고 표준 곡선표를 작성하였다. 건조중체량은 배양조에서 매일 20ml를 취해 0.45um 크기의 여과지로 여과하여 증류수로 2회 세척한 다음 105℃ 건조기에서 6시간 건조하고 흡습기에서 측정한 후 비교하였다.

표 3. 심층수와 스피룰리나 전용배지 성분 혼합시 침전물 생성 유무

전용배지 성분	침전물 생성 유무
탄산수소나트륨	없음
탄산나트륨	생성
제일인산칼륨	생성
질산나트륨	없음
황산칼륨	없음
염화나트륨	없음
황산마그네슘	없음
염화칼슘	없음
PIV 미량금속용액	없음
chu 미세영양용액	없음

표 3에 나타나듯이, 스피룰리나 전용배지에 심층수를 혼할할때 Na₂CO₃, K₂HPO₄ 두성분이 침전물이 생기는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 배양배지는 스피룰리나 전용배지에서 심층수와 혼합할때 침전물의 생성 요인이 되는 두가지 성분 탄산나트륨과 제일인산칼륨을 제외하고 혼합하여 침전물이 생기지 않는 용액을 조제하며, 이들을 제외함으로써 탄소원이 부족하여 생장에 영향을 미칠 수 있으므로 탄소원의 공급을 위해 탄산수소나트륨을 기존 배지에 비하여 1L당 5g을 추가해 주어야 한다.

도 1에 따르면, 심층수를 섞어주었을 경우 그렇지 않은 기존의 배지에 비하여 생존기간이 뚜렷이 증가하였다. 또한 10% 심층수를 첨가한 개선배지의 경우 성장 속도가 촉진되어 기존의 배지에서보다 빠른 성장을 나타내었으며 생존기간도 현격하게 늘어나 대수기를 유지시키는 효과가 나타났다.

본 발명에 따르는 스피룰리나 배양배지 제조방법에 의하면, 첫째로 고 순도의 심층수와 높은 pH, 고염도등으로 스피룰리나 단일 배양이 가능하며, 둘째로 10% 심층수 혼합의 경우 특유의 청남색을 유지하는 범위에서 생존기간 및 균체 성장 속도등이 기존에 전용배지에 비하여 늘어나며, 셋째로 단순혼합시 생기는 침전물을 완전 제거하여 균체 획득을 현격하게 줄일 수 있다. 넷째로 심층수를 활용하여 기존의 전용배지 조제를 단순하게 하여 편하게 할 수 있고 마지막으로 초기 적은 변 형배지로부터 서서히 배양용적을 늘려가는 방법으로 배지 변경시 발생할 수 있는 세포의 손상을 적게 할 수 있다.

Claims

스피룰리나 전용배지 제조방법에 있어서, 증류수 500㎖당 탄산수소나트륨 13.61g, 탄산나트륨 4.03g, 제일인산칼륨 0.50g을 넣는 A용액 제조과정에서 탄산나트륨과 제일인산칼륨을 넣지 않고, 탄산수소나트륨 5g을 추가하여 제조된 배지를 제조한 후, 이 수정된 배지에 일주일동안 40℃에서 침전시킨 후 0.2㎛ 필터로 정제한 심층수를 10% 섞어 제조되는 것을 특징으로 하는 스피룰리나 배양배지 제조방법.