CN101724091B - 活性羧甲基茯苓多糖及其生产工艺和应用 - Google Patents
活性羧甲基茯苓多糖及其生产工艺和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及活性羧甲基茯苓多糖的工业化生产工艺,先将茯苓菌核进行超微粉碎,得到茯苓超微粉,然后用食用酒精常温浸提,过滤得滤饼;然后以醇水体积比为15~10∶1的水和乙醇混合物为介质,滤饼与氯乙酸和过量的氢氧化钠反应,得到具有抗肿瘤活性羧甲基茯苓多糖。本发明所得的产物羧甲基茯苓多糖纯度高、水溶性良好、分子量和羧甲基取代度适中且具有明显抗肿瘤活性。所述的活性羧甲基茯苓多糖可用于制备抗肿瘤药物或保健食品。本发明制备路线经济环保,适于工业化大生产。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤高分子多糖领域,尤其涉及作为生物反应调节剂的中等羧甲基取代度的羧甲基茯苓多糖及其低成本生产工艺方法和应用。
背景技术
寻找通用、有效的抗癌药物与方法是医学及其相关领域研究的热点。国内外大量研究证明,中药多糖具有很强的免疫调节和抗肿瘤作用。茯苓多糖(Pachyman)为多孔菌科植物茯苓(Poria cocos)的干燥菌核的主要组成和活性成分(含量高达93%以上),其结构为带少量(1→6)支链的(1→3)-β-D-葡聚糖。具有很好的生物相容性,低毒性,生物降解性及可食用性等天然多糖的天然优势。我国茯苓历史悠久,资源丰富。尤其是在湖北省罗田县被国家命名为“中国茯苓之乡”,年产量居全国第一。茯苓被列为国家食品药品监督管理局规定的药食兼用资源之一。目前对茯苓多糖的应用研究的热点是其抗肿瘤活性方面。但是,未经结构修饰的茯苓多糖不具备抗肿瘤活性,必须对其进行适当的降解,衍生化才可发挥药理活性。
羧甲基茯苓多糖为是茯苓最重要的深加工产物。中外学者对羧甲基茯苓多糖的理化性质、生理活性、毒理及临床进行了较深入的研究,结果发现:羧甲基茯苓多糖具有明显抗肿瘤,调节机体免疫功能,保肝降酶,间接抗病毒,诱生和促诱生干扰素和白细胞调节素,抗免疫抑制剂,减轻放射副反应,健胃安神,降血糖,抗衰老等生理活性。将其开发成一种新型的抗肿瘤、免疫增强药物,前景将十分广阔。Hamuro等的实验表明,活性茯苓多糖对不同种属的小鼠体内S-180肉瘤抑制率达到了90%以上,对小鼠艾氏腹水瘤(EAC)和MM-102癌的抑制率也达到40%和79%。我国张莉娜等的实验也证明其显著的抗肿瘤活性。研究表明CMP可广泛用于恶性肿瘤放化疗的辅助治疗,显著增强恶性肿瘤患者的免疫功能,减少和消除放化疗的副反应,增强患者体质,提高患者的生活质量与延长寿命。
目前茯苓多糖可行的提取工艺主要是沸水浸提法和碱提醇沉法。沸水法提取率极低,浸提时间长且后处理工作量大,经煎煮后茯苓有效活性物质的所得率不过1%,而且过高的提取温度也会破坏多糖的结构和活性;碱提醇沉法需要低温操作和较浓的碱液,并且后处理较困难、操作费时且需要消耗大量的乙醇、丙酮等有机溶剂;此外,多糖本身高分子量、难溶性、粘度和长链结构等物理特性也会导致活性羧甲基茯苓多糖的制备工序复杂,反应体系粘度大、多糖易结块而难于处理,产物难以分离。上述缺点导致了羧甲基茯苓多糖的生产成本高、污染环境且不易精制,难以实现其大规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有明显抗肿瘤药理活性的羧甲基茯苓多糖及其低成本工业化生产工艺和用途,该工艺适应大规模工业化生产。
本发明提供的技术方案是:一种活性羧甲基茯苓多糖的工业化生产工艺,先将茯苓菌核进行超微粉碎,得到茯苓超微粉,然后用食用酒精常温浸提,过滤得滤饼;然后以醇水体积比为15~10∶1的水和乙醇混合物为介质,滤饼与氯乙酸和过量的氢氧化钠反应,得到具有抗肿瘤活性羧甲基茯苓多糖。
所述的氢氧化钠分两次加入,在加入氯乙酸之前先加入滤饼质量的1%-5%的氢氧化钠;在加入氯乙酸之后,再加入滤饼质量的1%-5%的氢氧化钠。
所述以醇水体积比例为15~10∶1的水和乙醇混合物为介质,滤饼与氯乙酸和过量的氢氧化钠反应是指:在滤饼中加入2-5倍滤饼质量的乙醇与水的混合物,搅拌均匀后,加入滤饼质量的1%-5%的氢氧化钠,室温下搅拌、碱化40-120分钟,加入滤饼质量的15%-20%的氯乙酸,室温搅拌10-20分钟后再加入滤饼质量的1%-5%的氢氧化钠,在40-55℃下醚化反应6-10小时,然后中和、过滤、洗涤、烘干。
上述茯苓超微粉的粒径为0.2-10μm。
所述浸提用食用酒精的量为茯苓超微粉重量的20-50倍;浸提时间为24-48小时。
本发明所得到具有抗肿瘤的活性羧甲基茯苓多糖产物的平均分子量为20.0×104-80.1×104,-CH2COOH取代度为0.162-0.92。
本发明所述活性羧甲基茯苓多糖是通过上述生产工艺制备而成的。
本发明所述的活性羧甲基茯苓多糖可用于制备抗肿瘤药物或保健食品。
本发明可采用气流粉碎机首先对干燥的茯苓菌核进行超细粉碎,得到粒径为0.2-10μm且粒度分布均匀的茯苓超微粉。此步骤将大大提高后续茯苓多糖的浸出率。
本发明茯苓超微粉经食用酒精浸提。过滤得到的滤液可作为茯苓浸膏原料或茯苓酒的原料。
本发明将经过上述纯化后的茯苓多糖进一步衍生化制备一系列水溶性和活性更好的茯苓多糖羧甲基化衍生物。最终产物的溶解性、抗肿瘤活性、生物降解性和生物相容性将大大提高。
本发明反应原理和方程式如下:
此外,针对原有茯苓多糖衍生化工艺存在着制备工序复杂,反应体系粘度大、多糖易结块等难于处理,产物难以分离,需要消耗大量的有机溶剂,成本高且污染环境的缺点,本发明进行如下改进:
①在碱化过程中茯苓多糖容易结块,在实验室靠加速搅拌防止结块,而在工业化生产中搅拌转速是固定的,无法实现加速搅拌。我们发现,结块与体系中含水量有关,含水量越大,结块现象越严重;但是,实验研究发现,在反应体系中适量的水也是有必要的(本发明权利要求醇水体积比为15~10∶1),对于醚化效率起到催化作用。因此,控制体系中醇水的比例是关键。
②溶剂的选择:传统工艺用的溶剂是异丙醇。异丙醇毒性较高,价格高,不易回收,致使衍生物成本过高。而用乙醇作溶剂从原料处理开始到产品合成都能完成,便于生产管理。
③碱化方式的改进:传统的茯苓多糖衍生物制备工艺多采用一次碱化法。由于NaOH一次性加入到体系内,反应初期体系内碱性很强,副反应程度较大,原料氯乙酸的利用率只有40%,加之异丙醇价格较贵,因此优化活性茯苓多糖的制备条件,以降低成本,提高收率和纯度成为实验的关键技术。我们初步的实验结果表明,以乙醇和少量的水作为溶剂,采用两次加碱法可大幅度地降低成本,并可获得取代度适中、水溶性好的茯苓多糖衍生物。
1)羧甲基茯苓多糖产物的表征。
采用红外和核磁对其进行结构确认;酸碱滴定法和元素分析法结合测定羧甲基的取代度;采用凝胶色谱和光散射法连用测定其重均分子量分布。
本发明所提供的羧甲基茯苓多糖的低成本工业化生产工艺,通过工艺条件的优化,控制系统用水量,合理回收并循环利用溶剂,大大减少工艺过程,降低生产成本。每吨CMP可节约酒精和丙酮20吨,能耗降低75%,实现工业化生产。
此外,重要的是,我们前期体、内外药理实验研究均证明,我们发明所制备的活性茯苓多糖具有明显的抗肿瘤活性,对人卵巢癌细胞A2780和OVCAR3都有明显生长抑制活性并诱导细胞发生凋亡。且其良好的水溶性可显著改善产品的生物利用度。前期药理毒理实验表明,产品安全、有效,无任何不良反应。
具体实施方式
实施例一
1,羧甲基茯苓多糖的制备
在20g茯苓菌核过80目筛,气流粉碎机粉碎至平均粒度为0.2-10μm,得到茯苓超微粉;将茯苓多糖超微粉中20-50倍体积的食用酒精,在常温下浸提48小时,充分除去茯苓原料中的三萜类物质等主要杂质,滤液作为茯苓浸膏原料、茯苓酒原料。滤饼待用。
将滤饼充分捣碎,在滤饼中加入2倍茯苓多糖质量的蒸馏水和乙醇混合物(醇水比例为10∶1),搅拌均匀后,加入茯苓多糖质量的1%的氢氧化钠,室温下搅拌、碱化40分钟,加入茯苓多糖质量的15%的氯乙酸,室温搅拌10分钟后再加入茯苓多糖质量的1%的氢氧化钠,在45℃下醚化反应6小时,然后用1mol/L的稀盐酸,将反应产物中和至pH值为5~6,过滤,用80%(质量分数)乙醇洗涤,在50℃下干燥得到平均分子量为20.2×104、-CH2COOH取代度为0.162的羧甲基茯苓多糖。所得白色的羧甲基茯苓多糖粉末经检验后包装出厂。
2,产物的结构确认和质量检验
产物羧甲基茯苓多糖白色,均匀粉末,无臭无味。
理化限量指标
多糖含量%(W) ≥60 60.55,81.66
水分% ≤10 6.3
重金属限量指标
砷(As)mg/kg ≤2 1.67 GB/T 5009.11-2003
铅(Pb)mg/kg ≤1 0.79 GB/T 5009.12-2003
汞(Hg)mg/kg ≤0.2 0.005 GB/T 5009.17-2003
微生物限量指标
菌落总数(fu/g) ≤1000 <10 GB/T 4789.2-2003
大肠菌群 ≤30 <3 GB/T 4789.3-2003
霉菌 ≤50 0 GB/T 4789.15-2003
沙门氏菌 不得检出 未检出 GB/T 4789.4-2003
志贺氏菌 不得检出 未检出 GB/T 4789.5-2003
金黄葡萄球菌 不得检出 未检出 GB/T 4789.10-2003
红外核磁表征:
红外光谱数据:
CMP的IR谱图中可看到除了具有3420,1250,1650cm-1多糖特征吸收峰及890cm-1β-吡喃糖特征吸收峰外,1620,1340cm-1表明-COOH和-CH2-基团的存在。
核磁数据如下:
在产物的13C NMR谱图中,主信号峰分别归属为:103.7ppm(C-1),85.3ppm(C-3)、76.8ppm(C-5)、74.4ppm(C-2)、69.4ppm(C-4)和61.9ppm(C-6)。其中部分C-6信号峰从61.9位移至71.0ppm(C-6s),及C-5信号峰从76.8位移至75.5ppm(C-5′),说明羧甲基衍生化发生在C-6位轻基,其取代度相对较高。
产物的水溶性测试:
精确称取产物1g于20ml蒸馏水中,搅拌溶解,观察其溶解性。5分钟以内发现产物全部溶解,且溶液颜色澄清。
3,产物的抗肿瘤活性测试:
3.1.流式细胞仪检测羧甲基茯苓多糖作用A2780细胞后的细胞凋亡
细胞长至对数生长期,用0.25%胰酶消化成单细胞悬液,按浓度2×106/ml接种6孔板中,置37℃,5%CO2培养箱培养24h,吸除原培养液,分别加入IC30、IC60、IC90浓度的羧甲基茯苓多糖RPMI1640培养液培养48h,用0.25%胰酶消化成单细胞悬液,离心,吸去上清液,PBS液洗2次,用1×Binding Buffer将细胞调整至1×106/ml浓度,取100μl转至流式专用试管,加入5μl FITC(异硫氰酸荧光素,Fluorescein Isothiocyanate)-Annexin V(浓度1mg/ml,1×Binding Buffer稀释),混匀细胞,避光孵育15min,加入10μl PI(浓度250μg/ml)溶液,再加入400μl 1×Binding Buffer,1小时之内上机检测。同时染对照管和补偿设置管,即未染色的裸细胞,单染FITC-Annexin V的管和单染PI的管。
3.2.流式细胞仪检测羧甲基茯苓多糖对各细胞的细胞周期的影响
细胞长至对数生长期,用0.25%胰酶消化成单细胞悬液,按浓度2×106/ml接种6孔板中,置37℃,5% CO2培养箱培养24h,吸除原培养液,分别加入IC60浓度的羧甲基茯苓多糖RPMI1640培养液和对照液分别培养24,48,72h。用0.25%胰酶消化成单细胞悬液,4℃离心1000rpm,5min,吸去上清液,PBS液洗2次,将细胞悬液转入EP管中,离心1000rpm,5min,去上清,一滴一滴加入冷(-20℃)乙醇(终浓度70%)固定细胞,并且一边加入固定剂一边振荡,防止形成细胞团,4℃固定过夜(固定的细胞可以保存一段时间),离心除去乙醇,PBS洗1次,去上清。将细胞数调整到1×106/ml,加入250μg/ml的RNA酶(含0.1% TritonX-100),50μg/ml碘化丙啶(Propidium Iodide,PI,终浓度),4℃暗处放置30min。将样品放入FCM的样品室,用激发波长488nm测定。
结论:采用体外培养人卵巢癌细胞的方法,考察了羧甲基茯苓多糖对人卵巢癌细胞A2780生长抑制活性,用流式细胞仪检测了经处理后细胞的细胞凋亡和细胞周期的分布。该肿瘤细胞的增生都明显受到抑制,且呈时间和剂量依赖性;不同浓度的羧甲基茯苓多糖都能诱导A2780细胞发生凋亡,且都呈剂量依赖性。
4,产物的药理毒理学初步评价:
用HUH7细胞考察不同浓度的羧甲基茯苓多糖的细胞毒性。细胞复苏传代后,细胞计数,用DMEM培养液调整细胞浓度1×104cells/ml,以1000cells/well置于96孔培养板中,每个试样复种6孔,在5% CO2,37℃标准环境下,用含10%小牛血清的DMEM培养液孵育,24h后进行实验。用DMEM培养液调整ECH-CMP的浓度梯度并加入每孔,置细胞恒温培养箱中继续培养。72h后,取出培养板,观察细胞形态。每孔加入20μl的MTT液,4h后,倒出原液,用PBS清洗两遍后加入DMSO(100μl/孔),室温15~20min,振荡培养板均匀染色,570mm波长检测光吸收值(OD),取6孔平均,按下列公式计算细胞相对增殖百分率(Relative cell viability)。
结论:制备的产物羧甲基茯苓多糖无明显的细胞毒性。经过我们合成出的产物处理过的HUH7细胞生长状态正常,细胞形态没有发生任何改变。本实验确证了产物的安全无毒。
Claims (3)
1.一种活性羧甲基茯苓多糖的工业化生产工艺,其特征在于:先将茯苓菌核进行超微粉碎,得到粒径为0.2-10μm的茯苓超微粉,然后用食用酒精常温浸提,过滤得滤饼;然后以醇水体积比为15~10∶1的水和乙醇混合物为介质,滤饼与氯乙酸和过量的氢氧化钠反应,得到具有抗肿瘤活性羧甲基茯苓多糖;所述的氢氧化钠分两次加入,在加入氯乙酸之前先加入滤饼质量的1%-5%的氢氧化钠;在加入氯乙酸之后,再加入滤饼质量的1%-5%的氢氧化钠;所述以醇水体积比例为15~10∶1的水和乙醇混合物为介质,滤饼与氯乙酸和过量的氢氧化钠反应是指:在滤饼中加入2-5倍滤饼质量的乙醇与水的混合物,搅拌均匀后,加入滤饼质量的1%-5%的氢氧化钠,室温下搅拌、碱化40-120分钟,加入滤饼质量的15%-20%的氯乙酸,室温搅拌10-20分钟后再加入滤饼质量的1%-5%的氢氧化钠,在40-55℃下醚化反应6-10小时,然后中和、过滤、洗涤、烘干。
2.根据权利要求1所述的生产工艺,其特征在于:所述浸提用食用酒精的量为茯苓超微粉重量的20-50倍;浸提时间为24-48小时。
3.根据权利要求1或2所述生产工艺,其特征在于:所得到的具有抗肿瘤活性羧甲基茯苓多糖产物的平均分子量为20.0×104-80.1×104,-CH2COOH取代度为0.162-0.92。
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