JP4294326B2 - 魚介類の感染予防及び／又は治療剤 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、魚介類のウイルス又は病原性細菌等による感染を予防及び／又は治療する薬剤、これを含有する飼料及びこれを投与することによる魚介類の養殖方法に関する。
背景技術
クルマエビやブリ、マダイ、ヒラメ等の養殖場では、魚介類が高い密度で飼育されている為、病気が発生する事が多い。病気の原因は、病原性細菌、ウイルス、寄生虫等による感染が主であり、これに対して様々な対策が講じられている。
感染症の中でも、数年前から台湾や中国、東南アジアで急激に流行し始めたエビ類を死滅させるウイルス感染症（ＰＲＤＶ：Ｐｅｎａｅｉｄ Ｒｏｄ−Ｓｈａｐｅｄ ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓ）は、輸入業者によって日本にも伝播し、深刻な被害を発生させている。また、ブリのイリドウイルス感染症や連鎖球菌症等も発生頻度の高い感染症として重篤な被害をもたらしている。
これらの感染症に対しては、これまで抗生物質や免疫活性物質等を投与するなどの対抗手段が講じられている。しかしながら、抗生物質を投与する場合、養魚等への残留が懸念され、またその効果は必ずしも満足できるものではなかった。
一方、最近になって、多糖類の魚類感染に対する効果も知られるようになっており、例えば、特開平０２−２１８６５号公報には、キノコ等から得られる水溶性グルカンが魚類の感染症の予防・治療効果を有する事が開示されている。一方、ＷＯ９８／４２２０４号公報には、硫酸化多糖類がウイルス感染の予防・治療効果を有する事が開示されている。
しかしながら、このように魚介類の養殖場等における感染を予防・治療する試みは多種なされているものの、未だ被害の発生は減少しておらず、より効果の高い新たな予防・治療剤が要望されている。
また、抗生物質やフコイダン等の硫酸化多糖を大量に含有するモズクは、高価なものが多く、養殖用飼料用としては、コストの面で困難が生じる事が多かった。
従って、本発明の目的は、ウイルス感染や細菌感染に対する優れた予防・治療効果を有するとともに、廉価で安全性の高い魚介類の感染予防及び／又は治療剤を提供することにある。
発明の開示
かかる事情を鑑み鋭意研究した結果、本発明者等は、トロロコンブ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｍａｘｉｍａ）、ジャイアントケルプ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）等がウイルス、病原性細菌による魚介類の感染の予防及び／又は治療に有効であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、トロロコンブ属藻類、カジメ属褐藻類、ジャイアントケルプ、アスコフィラム属藻類及びこれらの抽出物から選ばれる１種又は２種以上の成分を含有することを特徴とする、魚介類の感染予防及び／又は治療剤を提供するものである。
また、本発明は、当該感染予防及び／又は治療剤を含有する魚介類の養殖用飼料を提供するものである。
更に、本発明は当該感染予防及び／又は治療剤又は当該飼料を投与することを特徴とする魚介類の養殖方法を提供するものである。
更に、本発明は、トロロコンブ属藻類、カジメ属褐藻類、ジャイアントケルプ、アスコフィラム属褐藻類及びそれらの抽出物から選ばれる１種又は２種以上の成分の有効量を投与することを特徴とする魚介類感染症の予防及び／又は治療方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられるトロロコンブとは、北海道の釧路・根室等の道東地方に多く繁殖するトロロコンブ属の褐藻であり、粘質に富んだ長さ１〜５ｍ、幅１０ｃｍ程の細長い帯状、或いは板状の葉を有しており、その表面に複雑な雲文様の凹凸が認められる。藻体には、カリウムやナトリウム、ビタミンＡ、ヨード、アルギン酸等の栄養素を含むことが知られている。
本発明に用いるトロロコンブ属藻類としては、例えばトロロコンブ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）、ガゴメ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｇｙｒａｔａ）等が挙げられ、いずれも好適に使用できる。
カジメとは、関東以南の太平洋岸の岩礁地帯に群生するカジメ属の褐藻であり、細長い茎の上部に板状或いは帯状の中央葉を有し、その左右に羽を広げたような側葉が認められる。藻体はマンニット、ヨード、アルギン酸等の栄養素に富み、これらの製造原料としても使用されている。
本発明に用いるカジメ属褐藻類としては、例えばカジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｍａｘｉｍａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）等が挙げられ、いずれも好適に使用できる。
本発明に用いるジャイアントケルプとは、北アメリカのカリフォルニア沿岸の岩礁地帯に生育するコンブ目の褐藻であり、細長い茎に多数の側葉をつけ、数十メートルにまで成長することが知られている。藻体にはカルシウムやビタミンＢ１、ヨード、アルギン酸等の栄養素を含むことが知られている。
アスコフィラム属藻類とは、北欧の海岸沿いに多く繁殖するヒバマタ属の褐藻であり、ベタイン類、オーキシン、サイトカイニン、アブシジン酸、多糖類、オリゴ糖、ミネラル、ビタミン類、アミノ酸等の栄養素を含み、特にアルギン酸の含有量の高い海藻として知られている。
本発明に用いるアスコフィラム属藻類としては、例えばアスコフィラム・ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）が挙げられる。
上記の海藻類は、そのまま、もしくは粉砕等したものを用いてもよく、或いは水、親水溶媒、又はこれらの混液によって抽出されたものを用いる事も出来る。抽出温度や時間はそれぞれの海藻に適したものを選択すればよく、例えば低温或いは室温で数日間浸潤させても、加熱して数分から数時間で抽出してもよい。このようにして得られた抽出物は、そのまま使用する事ができ、或いは効果を損なわない範囲で精製処理等を行ってもよい。
本発明の感染予防及び／又は治療剤には、前記海藻類又はその抽出物に加えて更にフコイダンを含有せしめるのがより好ましい。フコイダンとは、主としてフコースからなる分子量数十万前後の硫酸化多糖類であって、褐藻類のモズク、ウミウチワ、マコンブ、ワカメ、コンブ、アミジグサ等に豊富に含有されており人体に無害のものである。
本発明で用いるフコイダンとしては、フコイダンを含有する褐藻類を粉砕等したものを用いてもよく、適当な方法を用いて抽出、精製されたものを用いてもよい。抽出に用いる海藻としては特に限定するものではないが、費用等の点から、モズクあるいはオキナワモズクが好ましい。抽出方法としては、通常用いられる方法であれば特に限定されるものではないが、酸抽出や熱水抽出等が挙げられる。また、海藻から抽出された高分子のものを、例えば弱酸処理等による加水分解によって、低分子化もしくはオリゴ糖化させてから用いてもよい。
本発明の感染予防・治療剤には、更にバチルス・パミルス又はバチルス・レンタスに属する細菌を含有せしめるのがより好ましい。本発明で用いるバチルス・パミルス、又はバチルス・レンタスに属する細菌としては、特に、ＷＯ９８／０４５４０２に開示されたバチルス・パミルスＡ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８０）、バチルス・レンタスＡ−２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７８）、バチルス・レンタスＡ−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７９）、バチルス・パミルスＡ−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８１）から選ばれる１種又は２種以上を用いることが好ましい。
本発明の感染予防及び／又は治療剤は、そのまま投与することができるが、通常魚介類の養殖に用いられる飼料原料に混合、又は配合して用いてもよい。飼料に混合、又は配合する量としては、魚介類や養殖方法にあわせて適宜決定すればよいが、例えば１０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ程度、更に５０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ程度、特に１００ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ配合するのが好ましい。本発明の感染予防及び／又は治療剤を含有する飼料の給餌量は、１日に魚介類の体重の３％程度がよい。
一方、フコイダンの配合量も魚介類の種類等にあわせて適宜決定すればよく、通常、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度、特に６０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ配合するのが好ましい。
バチルス・パミルス、又はバチルス・レンタスに属する細菌の投与形態としては、菌体を通常の増殖用培地、例えば、乾燥ブイヨン等で増殖させたものをそのまま投与してもよく、当該培養液から遠心分離、静置して上清を除く等して回収した菌体を投与してもよい。また、菌体は澱粉、スキムミルク等の賦形剤とともに凍結乾燥したものを用いてもよい。更に、培養後の菌体を担体に担持させたものを投与してもよい。ここで用いる担体は特に限定されないが、ゼオライト、麦飯石、活性炭、火成岩、サンゴ石等が菌体の保持能の点で好ましく、特にゼオライトがコストの面から好ましい。
上記海藻類、フコイダン、及びバチルス属細菌は各々を別個に投与することができる。すなわち、上記海藻類をそのまま、或いは抽出物を直接給餌して、別途フコイダンをそのまま、又はこれを含む海藻類や抽出乾燥物を投与してもよい。一方、上記バチルス属細菌の培養液又は遠心分離等の分離手段により、該培養液から回収した菌体をそのまま、もしくは担体に担持して別途投与してもよい。
また、これらは通常魚介類の養殖に用いられる飼育原料に混合又は配合して用いてもよい。飼料に混合又は配合する量としては、魚介類や養殖方法により異なるが、上記海藻類の配合量は一般的に感染予防のためには、通常１日に魚介類１ｋｇあたり１０ｍｇ〜５００ｍｇ程度、更に５０ｍｇ〜３００ｍｇ程度、特に１００ｍｇ〜２００ｍｇ投与されるよう設定すればよい。また、フコイダンの配合量は通常１日に魚介類１ｋｇあたり５０ｍｇ〜１００ｍｇ程度、特に６０ｍｇ〜８０ｍｇ投与されるよう設定すればよい。一方、上記バチルス属細菌の配合量も魚介類の種類等に合せ適宜決定すればよく、通常、１×１０５〜１×１０９ｃｆｕ／ｇ−飼料、特に１×１０６〜１×１０８ｃｆｕ／ｇ−飼料に設定すると、養魚の歩留まり、コスト面、作業性等の点から好ましい。これらを含有する飼料の給餌量は、１日に魚介類の体重の３％程度が良い。
本発明の感染予防・治療剤を適用し得る魚介類としては、特に限定されず、淡水魚として、ウナギ、コイ、ニジマス、アユ、ティラピア、フナ等、海水魚として、ブリ、タイ、ギンザケ、マアジ、ヒラメ、カレイ、クロソイ、トラフグ、カンパチ等、無脊椎動物としてクルマエビ、ウシエビ（ブラックタイガー）、ホワイトシュリンプ、コウライエビ、カザミ等が挙げられる。また適用できる感染症としては、イリドウイルス、ビルナウイルス、ＰＲＤＶ等のウイルス感染症、ビブリオ、シュードモナス、連鎖球菌、類結節症等の細菌感染症が挙げられる。中でも、ＰＲＤＶに対する効果が高く好ましい。
実施例
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 海藻の調製方法
海藻（トロコンブ、カジメ、アスコフィラム・ノドサム、ジャイアントケルプ）としては、塩蔵されたものを用いた。各海藻をホモジナイズし、その湿重量と同量の水に懸濁させ塩抜きを行った。さらに藻体１ｋｇ当たり１リットルの割合で水に懸濁し、１００℃で２時間加熱し、その後室温で静置して抽出した。ガーゼにて藻体を濾別し、その濾液を遠心分離した（９，０００ｒｐｍ、６０分）。更にその上清を乾燥させて、各海藻抽出物を粉末として得た。
実施例２ フコイダンの調製方法
原料には塩蔵されたオキナワモズクを用いた。オキナワモズクをその湿重量と同量の水に懸濁させ塩抜きを行った後、塩酸水溶液を加えてｐＨ３に調整した。本懸濁液を１００℃、１０分間加熱し、フコイダンを抽出させた。さらに、遠心分離機を用いて７，０００Ｇで不溶分を除去し、分画分子量６，０００の限外濾過膜を用いて、ｐＨ３で回分加水濾過を繰り返すことで、分子量６，０００以下の低分子画分を除去した。そして、水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを５．５〜６．０の範囲に調整した。このフコイダンを主成分とする濃縮液を噴霧によって乾燥し、湿藻体１ｋｇに対し５ｇのフコイダン画分の粉末を得た。この粉末を以下「フコイダン（Ｆ１５）」という。
実施例３
実施例１で得たトロロコンブ、カジメ、アスコフィラム及びジャイアントケルプの粉末化抽出物（マリンサイエンス社製）を用いてそれらの効果を検討した。これらの粉末化抽出物を、それぞれ「トロロコンブ（Ｘ−２４０）」、「カジメ（Ｘ−２４１）」、「アスコフィラム（Ｘ−２４３）」及び「ジャイアントケルプ（Ｘ−２４２）」という。
（供試クルマエビ）三井農林から入手した平均体重８ｇのものを用い、試験開始まで一週間予備飼育した後、試験に供した。
（飼育方法）０．６ｍ×０．４ｍ×０．３ｍの水槽に底面濾過装置を取り付け、エアレーションを十分に施して飼育した。
（供試尾数）対照区、及び試料投与区に各々２０尾のクルマエビを供した。飼料給餌は夕方定刻に行い、給餌率はエビの体重あたり２％とした。
（飼料）対照区には、通常飼料（エビアン協和製）を使用した。試験区１（トロロコンブ投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりトロロコンブ６０ｍｇ（ＸＦ−２４０）投与となるように添加配合し、成形して使用した。試験区２（カジメ投与区）には通常飼料に加えて、１日にクルマエビ１ｋｇあたりカジメ６０ｍｇ（ＸＦ−２４１）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区３（ジャイアントケルプ投与区）には通常飼料に加えて、１日にクルマエビ１ｋｇあたりジャイアントケルプ６０ｍｇ（ＸＦ−２４２）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区４（アスコフィルム投与区）には通常飼料に加えて、１日にクルマエビ１ｋｇあたりアスコフィルム６０ｍｇ（ＸＦ−２４３）投与となるように添加混合し、成形して使用した。
（試験方法）それぞれの飼料を１７日間連続給餌した。飼料給餌開始後８日目にウイルス（ＰＲＤＶ）に感染させ、攻撃後１０日目の生存率を求めた。感染方法はウイルスに感染したクルマエビの頭胸甲を滅菌海水中でホモジナイズ後高速遠心分離し、得られた上澄みを海水に約８０００倍希釈となるように懸濁した。この液中にクルマエビを入れ、２時間エアレーションをしながら浸漬し感染させた。飼育期間中の水温は２３℃とした。また、実験期間中に斃死したクルマエビはＰＣＲ法を用いてウイルスの検出を試み、当該ウイルスによる斃死であることを確認した。
感染後の生存率を図１に示す。
図１に示したように、海藻を投与する事で、クルマエビのＰＲＤＶによる死亡を有効に阻止でき、特にトロロコンブ及びアスコフィラムの死亡阻止効果が高かった。
実施例４
トロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプとフコイダンとの併用効果を検討した。
供試クルマエビ、飼育方法、及び試験方法は実施例３と同様に行った。
（供試尾数）対照区、及び試料投与区に各々２０尾のクルマエビを供した。飼料給餌は夕方定刻に行い、給餌率はエビの体重あたり２％とした。
（飼料）対照区には、通常飼料（エビアン協和製）を使用した。試験区１〜試験区４は実施例３と同様の飼料を使用した。試験区５（トロロコンブ、フコイダン併用投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びトロロコンブを１００ｍｇ（ＸＦ−２４０）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区６（カジメ、フコイダン併用投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びカジメを１００ｍｇ（ＸＦ−２４１）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区７（ジャイアントケルプ、フコイダン併用投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びジャイアントケルプを１００ｍｇ（ＸＦ−２４２）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区８（アスコフィラム、フコイダン併用投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びアスコフィラムを１００ｍｇ（ＸＦ−２４３）投与となるように添加混合し、成形して使用した。
図２及び３に示した通り、トロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプを投与することにより、クルマエビのＰＲＤＶによる死亡を有効に阻止できた。また、通常では効果を示さない１日あたりの投与量であるフコイダン１５ｍｇ／ｋｇとトロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプを併用することで、ＰＲＤＶによる死亡阻止効果が増強されることが確認された。
実施例５
トロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプとフコイダン及びバチルス・パミルスとの併用効果を検討した。
供試クルマエビ、飼育方法、及び試験方法は実施例３と同様に行った。
（供試尾数）対照区、及び試料投与区に各々２０尾のクルマエビを供した。試料給餌は夕方定刻に行い、給餌率はエビの体重あたり２％とした。
（飼料）対照区には、通常飼料（エビアン協和製）を使用した。試験区１（バチルス投与区）には通常飼料に加えて、飼料１ｇあたりバチルス・パルミスＡ−１株を１０６個（バチルス）添加混合し、成形して使用した。試験区２（トロロコンブ、フコイダン、バチルス併用投与区）には通常飼料に、飼料１ｇあたりバチルス・パミルスＡ−１株を１０６個（以下、「バチルス・パミルス（Ｂ）」という、並びに１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びトロロコンブを１００ｍｇ（ＸＦ−２４０）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区３（カジメ、フコイダン、バチルス併用投与区）には通常飼料に、飼料１ｇあたりバチルス・パミルスを１０６個（Ｂ）、並びに１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びカジメを１００ｍｇ（ＸＦ−２４１）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区４（ジャイアントケルプ、フコイダンバチルス併用投与区）には通常飼料に、飼料１ｇあたりバチルス・パルミスを１０６個（Ｂ）、並びに１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びジャイアントケルプを１００ｍｇ（ＸＦ−２４２）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区５（アスコフィラム、フコイダンバチルス併用投与区）には通常飼料に、飼料１ｇあたりバチルス・パルミスを１０６個（Ｂ）、並びに１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びアスコフィラムを１００ｍｇ（ＸＦ−２４３）投与となるように添加混合し、成形して使用した。
図４に示した通り、通常では効果を示さない１日あたりの投与量であるフコイダン１５ｍｇ／ｋｇとバチルス・パルミス及びトロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプを併用することで、ＰＲＤＶによる死亡阻止効果がより顕著に増強されることが確認された。
実施例６
ホワイトシュリンプを用いてアスコフィラム・ノドサム及びフコイダン併用投与の効果を確認した。
（供試エビ）ホワイトシュリンプの稚エビ（ポストラーバ１５日令）を供試した。
（飼育方法）１０，０００ｍ２の素掘りエビ養殖池３面を用いた。
（供試尾数）対照区、フコイダン投与区及び試料投与区に各々８０，０００尾のホワイトシュリンプを供した。各試験区において、飼料の量は、ホワイトシュリンプが発育するに従ってより適宜増加させ、総給餌率はエビ体重あたり２〜２０％とした。しかし、フコイダン添加飼料及びフコイダン、アスコフィラム併用添加飼料（試料）の給餌率はエビ体重あたり２％とし、総給餌率から不足する分は通常飼料を与えた。
（飼料）対照区には、通常飼料（ＮＡＳＡ社製）を使用した。試験区１（フコイダン投与区）には、通常飼料に、１日にホワイトシュリンプ１ｋｇあたりフコイダン６０ｍｇ／ｋｇ（Ｆ１５）投与となるように添加配合し、成形して２％給餌となるように使用した。不足する分は通常飼料を使用した。試験区２（飼料投与区）には、通常飼料に１日にホワイトシュリンプ１ｋｇあたりフコイダン１５ｍｇ／ｋｇ（Ｆ１５）及びアスコフィラム１００ｍｇ（ＸＦ−２４３）投与となるように添加配合し、成形して２％給餌となるように使用した。不足する分は通常飼料を使用した。
（試験方法）それぞれの飼料を８９日間連続給餌した。ＰＲＤＶの自然感染による減耗を観察した。試験期間中に斃死したホワイトシュリンプはＰＣＲ法を用いてウィルスの検出を試み、当該ウィルスが主因となる斃死であることを確認した。
飼育試験終了時の生存率を表１に示す。
表１に示したように、通常では効果を示さない１日あたりの投与量であるフコイダン１５ｍｇ／ｋｇとアスコフィラムを併用することで、１日にフコイダン６０ｍｇ／ｋｇ投与したのと同等のＰＲＤＶによる死亡阻止効果が得られた。
産業上の利用可能性
本発明の予防及び／又は治療剤を用いれば、魚介類のウイルスや細菌による感染、特にＰＲＤＶ感染を有効に予防及び／又は治療することができる。また、この予防及び／又は治療剤は魚介類の養殖時の飼料に配合して用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、各種海藻抽出物のＰＲＤＶ感染に対する効果を示す図である。
図２は、各種海藻抽出物のＰＲＤＶ感染に対する効果を示す図である。
図３は、各種海藻抽出物とフコイダンの併用効果を示す図である。
図４は、各種海藻抽出物とフコイダン、及びバチルス・パミルスの併用効果を示す図である。
本発明は、魚介類のウイルス又は病原性細菌等による感染を予防及び／又は治療する薬剤、これを含有する飼料及びこれを投与することによる魚介類の養殖方法に関する。
背景技術
クルマエビやブリ、マダイ、ヒラメ等の養殖場では、魚介類が高い密度で飼育されている為、病気が発生する事が多い。病気の原因は、病原性細菌、ウイルス、寄生虫等による感染が主であり、これに対して様々な対策が講じられている。
感染症の中でも、数年前から台湾や中国、東南アジアで急激に流行し始めたエビ類を死滅させるウイルス感染症（ＰＲＤＶ：Ｐｅｎａｅｉｄ Ｒｏｄ−Ｓｈａｐｅｄ ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓ）は、輸入業者によって日本にも伝播し、深刻な被害を発生させている。また、ブリのイリドウイルス感染症や連鎖球菌症等も発生頻度の高い感染症として重篤な被害をもたらしている。
これらの感染症に対しては、これまで抗生物質や免疫活性物質等を投与するなどの対抗手段が講じられている。しかしながら、抗生物質を投与する場合、養魚等への残留が懸念され、またその効果は必ずしも満足できるものではなかった。
一方、最近になって、多糖類の魚類感染に対する効果も知られるようになっており、例えば、特開平０２−２１８６５号公報には、キノコ等から得られる水溶性グルカンが魚類の感染症の予防・治療効果を有する事が開示されている。一方、ＷＯ９８／４２２０４号公報には、硫酸化多糖類がウイルス感染の予防・治療効果を有する事が開示されている。
しかしながら、このように魚介類の養殖場等における感染を予防・治療する試みは多種なされているものの、未だ被害の発生は減少しておらず、より効果の高い新たな予防・治療剤が要望されている。
また、抗生物質やフコイダン等の硫酸化多糖を大量に含有するモズクは、高価なものが多く、養殖用飼料用としては、コストの面で困難が生じる事が多かった。
従って、本発明の目的は、ウイルス感染や細菌感染に対する優れた予防・治療効果を有するとともに、廉価で安全性の高い魚介類の感染予防及び／又は治療剤を提供することにある。
発明の開示
かかる事情を鑑み鋭意研究した結果、本発明者等は、トロロコンブ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｍａｘｉｍａ）、ジャイアントケルプ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）等がウイルス、病原性細菌による魚介類の感染の予防及び／又は治療に有効であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、トロロコンブ属藻類、カジメ属褐藻類、ジャイアントケルプ、アスコフィラム属藻類及びこれらの抽出物から選ばれる１種又は２種以上の成分を含有することを特徴とする、魚介類の感染予防及び／又は治療剤を提供するものである。
また、本発明は、当該感染予防及び／又は治療剤を含有する魚介類の養殖用飼料を提供するものである。
更に、本発明は当該感染予防及び／又は治療剤又は当該飼料を投与することを特徴とする魚介類の養殖方法を提供するものである。
更に、本発明は、トロロコンブ属藻類、カジメ属褐藻類、ジャイアントケルプ、アスコフィラム属褐藻類及びそれらの抽出物から選ばれる１種又は２種以上の成分の有効量を投与することを特徴とする魚介類感染症の予防及び／又は治療方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられるトロロコンブとは、北海道の釧路・根室等の道東地方に多く繁殖するトロロコンブ属の褐藻であり、粘質に富んだ長さ１〜５ｍ、幅１０ｃｍ程の細長い帯状、或いは板状の葉を有しており、その表面に複雑な雲文様の凹凸が認められる。藻体には、カリウムやナトリウム、ビタミンＡ、ヨード、アルギン酸等の栄養素を含むことが知られている。
本発明に用いるトロロコンブ属藻類としては、例えばトロロコンブ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）、ガゴメ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｇｙｒａｔａ）等が挙げられ、いずれも好適に使用できる。
カジメとは、関東以南の太平洋岸の岩礁地帯に群生するカジメ属の褐藻であり、細長い茎の上部に板状或いは帯状の中央葉を有し、その左右に羽を広げたような側葉が認められる。藻体はマンニット、ヨード、アルギン酸等の栄養素に富み、これらの製造原料としても使用されている。
本発明に用いるカジメ属褐藻類としては、例えばカジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｍａｘｉｍａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）等が挙げられ、いずれも好適に使用できる。
本発明に用いるジャイアントケルプとは、北アメリカのカリフォルニア沿岸の岩礁地帯に生育するコンブ目の褐藻であり、細長い茎に多数の側葉をつけ、数十メートルにまで成長することが知られている。藻体にはカルシウムやビタミンＢ１、ヨード、アルギン酸等の栄養素を含むことが知られている。
アスコフィラム属藻類とは、北欧の海岸沿いに多く繁殖するヒバマタ属の褐藻であり、ベタイン類、オーキシン、サイトカイニン、アブシジン酸、多糖類、オリゴ糖、ミネラル、ビタミン類、アミノ酸等の栄養素を含み、特にアルギン酸の含有量の高い海藻として知られている。
本発明に用いるアスコフィラム属藻類としては、例えばアスコフィラム・ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）が挙げられる。
上記の海藻類は、そのまま、もしくは粉砕等したものを用いてもよく、或いは水、親水溶媒、又はこれらの混液によって抽出されたものを用いる事も出来る。抽出温度や時間はそれぞれの海藻に適したものを選択すればよく、例えば低温或いは室温で数日間浸潤させても、加熱して数分から数時間で抽出してもよい。このようにして得られた抽出物は、そのまま使用する事ができ、或いは効果を損なわない範囲で精製処理等を行ってもよい。
本発明の感染予防及び／又は治療剤には、前記海藻類又はその抽出物に加えて更にフコイダンを含有せしめるのがより好ましい。フコイダンとは、主としてフコースからなる分子量数十万前後の硫酸化多糖類であって、褐藻類のモズク、ウミウチワ、マコンブ、ワカメ、コンブ、アミジグサ等に豊富に含有されており人体に無害のものである。
本発明で用いるフコイダンとしては、フコイダンを含有する褐藻類を粉砕等したものを用いてもよく、適当な方法を用いて抽出、精製されたものを用いてもよい。抽出に用いる海藻としては特に限定するものではないが、費用等の点から、モズクあるいはオキナワモズクが好ましい。抽出方法としては、通常用いられる方法であれば特に限定されるものではないが、酸抽出や熱水抽出等が挙げられる。また、海藻から抽出された高分子のものを、例えば弱酸処理等による加水分解によって、低分子化もしくはオリゴ糖化させてから用いてもよい。
本発明の感染予防・治療剤には、更にバチルス・パミルス又はバチルス・レンタスに属する細菌を含有せしめるのがより好ましい。本発明で用いるバチルス・パミルス、又はバチルス・レンタスに属する細菌としては、特に、ＷＯ９８／０４５４０２に開示されたバチルス・パミルスＡ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８０）、バチルス・レンタスＡ−２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７８）、バチルス・レンタスＡ−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７９）、バチルス・パミルスＡ−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８１）から選ばれる１種又は２種以上を用いることが好ましい。
本発明の感染予防及び／又は治療剤は、そのまま投与することができるが、通常魚介類の養殖に用いられる飼料原料に混合、又は配合して用いてもよい。飼料に混合、又は配合する量としては、魚介類や養殖方法にあわせて適宜決定すればよいが、例えば１０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ程度、更に５０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ程度、特に１００ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ配合するのが好ましい。本発明の感染予防及び／又は治療剤を含有する飼料の給餌量は、１日に魚介類の体重の３％程度がよい。
一方、フコイダンの配合量も魚介類の種類等にあわせて適宜決定すればよく、通常、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度、特に６０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ配合するのが好ましい。
バチルス・パミルス、又はバチルス・レンタスに属する細菌の投与形態としては、菌体を通常の増殖用培地、例えば、乾燥ブイヨン等で増殖させたものをそのまま投与してもよく、当該培養液から遠心分離、静置して上清を除く等して回収した菌体を投与してもよい。また、菌体は澱粉、スキムミルク等の賦形剤とともに凍結乾燥したものを用いてもよい。更に、培養後の菌体を担体に担持させたものを投与してもよい。ここで用いる担体は特に限定されないが、ゼオライト、麦飯石、活性炭、火成岩、サンゴ石等が菌体の保持能の点で好ましく、特にゼオライトがコストの面から好ましい。
上記海藻類、フコイダン、及びバチルス属細菌は各々を別個に投与することができる。すなわち、上記海藻類をそのまま、或いは抽出物を直接給餌して、別途フコイダンをそのまま、又はこれを含む海藻類や抽出乾燥物を投与してもよい。一方、上記バチルス属細菌の培養液又は遠心分離等の分離手段により、該培養液から回収した菌体をそのまま、もしくは担体に担持して別途投与してもよい。
また、これらは通常魚介類の養殖に用いられる飼育原料に混合又は配合して用いてもよい。飼料に混合又は配合する量としては、魚介類や養殖方法により異なるが、上記海藻類の配合量は一般的に感染予防のためには、通常１日に魚介類１ｋｇあたり１０ｍｇ〜５００ｍｇ程度、更に５０ｍｇ〜３００ｍｇ程度、特に１００ｍｇ〜２００ｍｇ投与されるよう設定すればよい。また、フコイダンの配合量は通常１日に魚介類１ｋｇあたり５０ｍｇ〜１００ｍｇ程度、特に６０ｍｇ〜８０ｍｇ投与されるよう設定すればよい。一方、上記バチルス属細菌の配合量も魚介類の種類等に合せ適宜決定すればよく、通常、１×１０５〜１×１０９ｃｆｕ／ｇ−飼料、特に１×１０６〜１×１０８ｃｆｕ／ｇ−飼料に設定すると、養魚の歩留まり、コスト面、作業性等の点から好ましい。これらを含有する飼料の給餌量は、１日に魚介類の体重の３％程度が良い。
本発明の感染予防・治療剤を適用し得る魚介類としては、特に限定されず、淡水魚として、ウナギ、コイ、ニジマス、アユ、ティラピア、フナ等、海水魚として、ブリ、タイ、ギンザケ、マアジ、ヒラメ、カレイ、クロソイ、トラフグ、カンパチ等、無脊椎動物としてクルマエビ、ウシエビ（ブラックタイガー）、ホワイトシュリンプ、コウライエビ、カザミ等が挙げられる。また適用できる感染症としては、イリドウイルス、ビルナウイルス、ＰＲＤＶ等のウイルス感染症、ビブリオ、シュードモナス、連鎖球菌、類結節症等の細菌感染症が挙げられる。中でも、ＰＲＤＶに対する効果が高く好ましい。
実施例
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 海藻の調製方法
海藻（トロコンブ、カジメ、アスコフィラム・ノドサム、ジャイアントケルプ）としては、塩蔵されたものを用いた。各海藻をホモジナイズし、その湿重量と同量の水に懸濁させ塩抜きを行った。さらに藻体１ｋｇ当たり１リットルの割合で水に懸濁し、１００℃で２時間加熱し、その後室温で静置して抽出した。ガーゼにて藻体を濾別し、その濾液を遠心分離した（９，０００ｒｐｍ、６０分）。更にその上清を乾燥させて、各海藻抽出物を粉末として得た。
実施例２ フコイダンの調製方法
原料には塩蔵されたオキナワモズクを用いた。オキナワモズクをその湿重量と同量の水に懸濁させ塩抜きを行った後、塩酸水溶液を加えてｐＨ３に調整した。本懸濁液を１００℃、１０分間加熱し、フコイダンを抽出させた。さらに、遠心分離機を用いて７，０００Ｇで不溶分を除去し、分画分子量６，０００の限外濾過膜を用いて、ｐＨ３で回分加水濾過を繰り返すことで、分子量６，０００以下の低分子画分を除去した。そして、水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを５．５〜６．０の範囲に調整した。このフコイダンを主成分とする濃縮液を噴霧によって乾燥し、湿藻体１ｋｇに対し５ｇのフコイダン画分の粉末を得た。この粉末を以下「フコイダン（Ｆ１５）」という。
実施例３
実施例１で得たトロロコンブ、カジメ、アスコフィラム及びジャイアントケルプの粉末化抽出物（マリンサイエンス社製）を用いてそれらの効果を検討した。これらの粉末化抽出物を、それぞれ「トロロコンブ（Ｘ−２４０）」、「カジメ（Ｘ−２４１）」、「アスコフィラム（Ｘ−２４３）」及び「ジャイアントケルプ（Ｘ−２４２）」という。
（供試クルマエビ）三井農林から入手した平均体重８ｇのものを用い、試験開始まで一週間予備飼育した後、試験に供した。
（飼育方法）０．６ｍ×０．４ｍ×０．３ｍの水槽に底面濾過装置を取り付け、エアレーションを十分に施して飼育した。
（供試尾数）対照区、及び試料投与区に各々２０尾のクルマエビを供した。飼料給餌は夕方定刻に行い、給餌率はエビの体重あたり２％とした。
（飼料）対照区には、通常飼料（エビアン協和製）を使用した。試験区１（トロロコンブ投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりトロロコンブ６０ｍｇ（ＸＦ−２４０）投与となるように添加配合し、成形して使用した。試験区２（カジメ投与区）には通常飼料に加えて、１日にクルマエビ１ｋｇあたりカジメ６０ｍｇ（ＸＦ−２４１）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区３（ジャイアントケルプ投与区）には通常飼料に加えて、１日にクルマエビ１ｋｇあたりジャイアントケルプ６０ｍｇ（ＸＦ−２４２）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区４（アスコフィルム投与区）には通常飼料に加えて、１日にクルマエビ１ｋｇあたりアスコフィルム６０ｍｇ（ＸＦ−２４３）投与となるように添加混合し、成形して使用した。
（試験方法）それぞれの飼料を１７日間連続給餌した。飼料給餌開始後８日目にウイルス（ＰＲＤＶ）に感染させ、攻撃後１０日目の生存率を求めた。感染方法はウイルスに感染したクルマエビの頭胸甲を滅菌海水中でホモジナイズ後高速遠心分離し、得られた上澄みを海水に約８０００倍希釈となるように懸濁した。この液中にクルマエビを入れ、２時間エアレーションをしながら浸漬し感染させた。飼育期間中の水温は２３℃とした。また、実験期間中に斃死したクルマエビはＰＣＲ法を用いてウイルスの検出を試み、当該ウイルスによる斃死であることを確認した。
感染後の生存率を図１に示す。
図１に示したように、海藻を投与する事で、クルマエビのＰＲＤＶによる死亡を有効に阻止でき、特にトロロコンブ及びアスコフィラムの死亡阻止効果が高かった。
実施例４
トロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプとフコイダンとの併用効果を検討した。
供試クルマエビ、飼育方法、及び試験方法は実施例３と同様に行った。
（供試尾数）対照区、及び試料投与区に各々２０尾のクルマエビを供した。飼料給餌は夕方定刻に行い、給餌率はエビの体重あたり２％とした。
（飼料）対照区には、通常飼料（エビアン協和製）を使用した。試験区１〜試験区４は実施例３と同様の飼料を使用した。試験区５（トロロコンブ、フコイダン併用投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びトロロコンブを１００ｍｇ（ＸＦ−２４０）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区６（カジメ、フコイダン併用投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びカジメを１００ｍｇ（ＸＦ−２４１）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区７（ジャイアントケルプ、フコイダン併用投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びジャイアントケルプを１００ｍｇ（ＸＦ−２４２）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区８（アスコフィラム、フコイダン併用投与区）には通常飼料に、１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びアスコフィラムを１００ｍｇ（ＸＦ−２４３）投与となるように添加混合し、成形して使用した。
図２及び３に示した通り、トロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプを投与することにより、クルマエビのＰＲＤＶによる死亡を有効に阻止できた。また、通常では効果を示さない１日あたりの投与量であるフコイダン１５ｍｇ／ｋｇとトロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプを併用することで、ＰＲＤＶによる死亡阻止効果が増強されることが確認された。
実施例５
トロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプとフコイダン及びバチルス・パミルスとの併用効果を検討した。
供試クルマエビ、飼育方法、及び試験方法は実施例３と同様に行った。
（供試尾数）対照区、及び試料投与区に各々２０尾のクルマエビを供した。試料給餌は夕方定刻に行い、給餌率はエビの体重あたり２％とした。
（飼料）対照区には、通常飼料（エビアン協和製）を使用した。試験区１（バチルス投与区）には通常飼料に加えて、飼料１ｇあたりバチルス・パルミスＡ−１株を１０６個（バチルス）添加混合し、成形して使用した。試験区２（トロロコンブ、フコイダン、バチルス併用投与区）には通常飼料に、飼料１ｇあたりバチルス・パミルスＡ−１株を１０６個（以下、「バチルス・パミルス（Ｂ）」という、並びに１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びトロロコンブを１００ｍｇ（ＸＦ−２４０）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区３（カジメ、フコイダン、バチルス併用投与区）には通常飼料に、飼料１ｇあたりバチルス・パミルスを１０６個（Ｂ）、並びに１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びカジメを１００ｍｇ（ＸＦ−２４１）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区４（ジャイアントケルプ、フコイダンバチルス併用投与区）には通常飼料に、飼料１ｇあたりバチルス・パルミスを１０６個（Ｂ）、並びに１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びジャイアントケルプを１００ｍｇ（ＸＦ−２４２）投与となるように添加混合し、成形して使用した。試験区５（アスコフィラム、フコイダンバチルス併用投与区）には通常飼料に、飼料１ｇあたりバチルス・パルミスを１０６個（Ｂ）、並びに１日にクルマエビ１ｋｇあたりフコイダンを１５ｍｇ（Ｆ１５）及びアスコフィラムを１００ｍｇ（ＸＦ−２４３）投与となるように添加混合し、成形して使用した。
図４に示した通り、通常では効果を示さない１日あたりの投与量であるフコイダン１５ｍｇ／ｋｇとバチルス・パルミス及びトロロコンブ、カジメ、アスコフィラムあるいはジャイアントケルプを併用することで、ＰＲＤＶによる死亡阻止効果がより顕著に増強されることが確認された。
実施例６
ホワイトシュリンプを用いてアスコフィラム・ノドサム及びフコイダン併用投与の効果を確認した。
（供試エビ）ホワイトシュリンプの稚エビ（ポストラーバ１５日令）を供試した。
（飼育方法）１０，０００ｍ２の素掘りエビ養殖池３面を用いた。
（供試尾数）対照区、フコイダン投与区及び試料投与区に各々８０，０００尾のホワイトシュリンプを供した。各試験区において、飼料の量は、ホワイトシュリンプが発育するに従ってより適宜増加させ、総給餌率はエビ体重あたり２〜２０％とした。しかし、フコイダン添加飼料及びフコイダン、アスコフィラム併用添加飼料（試料）の給餌率はエビ体重あたり２％とし、総給餌率から不足する分は通常飼料を与えた。
（飼料）対照区には、通常飼料（ＮＡＳＡ社製）を使用した。試験区１（フコイダン投与区）には、通常飼料に、１日にホワイトシュリンプ１ｋｇあたりフコイダン６０ｍｇ／ｋｇ（Ｆ１５）投与となるように添加配合し、成形して２％給餌となるように使用した。不足する分は通常飼料を使用した。試験区２（飼料投与区）には、通常飼料に１日にホワイトシュリンプ１ｋｇあたりフコイダン１５ｍｇ／ｋｇ（Ｆ１５）及びアスコフィラム１００ｍｇ（ＸＦ−２４３）投与となるように添加配合し、成形して２％給餌となるように使用した。不足する分は通常飼料を使用した。
（試験方法）それぞれの飼料を８９日間連続給餌した。ＰＲＤＶの自然感染による減耗を観察した。試験期間中に斃死したホワイトシュリンプはＰＣＲ法を用いてウィルスの検出を試み、当該ウィルスが主因となる斃死であることを確認した。
飼育試験終了時の生存率を表１に示す。
産業上の利用可能性
本発明の予防及び／又は治療剤を用いれば、魚介類のウイルスや細菌による感染、特にＰＲＤＶ感染を有効に予防及び／又は治療することができる。また、この予防及び／又は治療剤は魚介類の養殖時の飼料に配合して用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、各種海藻抽出物のＰＲＤＶ感染に対する効果を示す図である。
図２は、各種海藻抽出物のＰＲＤＶ感染に対する効果を示す図である。
図３は、各種海藻抽出物とフコイダンの併用効果を示す図である。
図４は、各種海藻抽出物とフコイダン、及びバチルス・パミルスの併用効果を示す図である。
Claims (4)
- アスコフィラム属藻類及びこれらの抽出物から選ばれる１種又は２種以上の成分と、フコイダンと、バチルス・パミルス又はバチルス・レンタスに属する細菌とを含有することを特徴とする、魚介類のウイルス感染予防及び／又は治療剤。
- フコイダンがモズクあるいはオキナワモズク由来である請求項１記載の魚介類のウイルス感染予防及び／又は治療剤。
- アスコフィラム属藻類及びこれらの抽出物から選ばれる１種又は２種以上の成分の有効量と、フコイダンの有効量と、バチルス・パミルス又はバチルス・レンタスに属する細菌の有効量とを投与することを特徴とする、魚介類ウイルス感染症の予防及び／又は治療方法。
- フコイダンがモズクあるいはオキナワモズク由来である請求項３記載の魚介類ウイルス感染症の予防及び／又は治療方法。
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