WO2021230252A1 - 魚介類の免疫を賦活させる組成物及びその方法 - Google Patents

魚介類の免疫を賦活させる組成物及びその方法 Download PDF

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shellfish
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圭輔 木本
啓亮 吉井
直哉 村瀬
百合子 山▲崎▼
直久 増尾
享 小西
健一 阿孫
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三菱商事ライフサイエンス株式会社
大分県
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Definitions

  • the present invention provides a material for activating immunity inexpensively and promptly by administering RNA or blending it with a feed or a vaccine and administering it to fish and shellfish.
  • farmed fish are infected with fish diseases such as viral infections, bacterial diseases, and fungal diseases and die in large numbers, and infectious diseases spread to fish and shellfish cultivated in the same area. I'm having a problem.
  • polysaccharides As the immunostimulant for fish and shellfish, polysaccharides, peptidoglycan, lipopolysaccharide, peptide, chitin / chitosan, lactic acid bacteria, vitamins, polyphenols and the like are administered to fish and shellfish as immunostimulatory substances.
  • polysaccharides ⁇ -1,3-1,6-D-glucan produced by aureopasidium (Patent Document 1).
  • a lactic acid bacterium is an infection protective agent for fish and shellfish, which comprises a dead cell of Lactobacillus plantarum or a processed product thereof (Patent Document 2).
  • the nucleic acid-related components of the present invention include an immunostimulatory method for fish and shellfish containing 5'-nucleotides (Patent Document 3), an immunostimulator for fish or shellfish with a composition containing inosine (Patent Document 4), and the like. Introduced.
  • the present invention provides a method for activating immunity to fish and shellfish inexpensively and promptly. Further, according to the present invention, unlike polysaccharides, which are not suitable as a feed material for aquaculture of fish and shellfish due to a decrease in feed efficiency caused by continuous administration of a conventional immunostimulator, continuous administration is possible and feed efficiency is improved. It is also provided as a feed material for aquaculture of fish and shellfish.
  • yeast extract containing RNA can be fed or compounded with feed or vaccine to activate immunity inexpensively and promptly. I found it.
  • the present invention provides a method for activating immunity of fish and shellfish having the following characteristics.
  • RNA-containing immunostimulant for fish and shellfish (2) An immunostimulatory agent for fish and shellfish, wherein the RNA of the above (1) is a yeast extract containing RNA or a yeast cell containing RNA.
  • a method for activating the immunity of fish and shellfish which comprises administering the immunostimulant for fish and shellfish according to the above (1) or (2).
  • a method for activating the immunity of fish and shellfish which comprises administering the immunostimulatory agent for fish and shellfish according to the above (1) or (2) in combination with a vaccine.
  • a method for promoting the growth of fish and shellfish which comprises blending the immunostimulant for fish and shellfish according to the above (1) or (2) with a feed and administering the same.
  • the immunostimulatory agent for fish and shellfish of the present invention can effectively prevent diseases of fish and shellfish such as infection by viruses and bacteria, and can be administered together with an antigen such as a vaccine to obtain a vaccine.
  • the effect can be enhanced, and the production efficiency of fish and shellfish can be improved.
  • the immunostimulant for fish and shellfish of the present invention is administered to fish and shellfish such as cultured fish.
  • the method for activating the immunity of fish and shellfish by administration of the product of the present invention is not particularly limited, and a composition containing RNA is administered.
  • RNA can be administered by blending it with other materials in a premix, by blending it with feed, or by blending it with a vaccine. This makes it possible to activate the immunity of fish and shellfish inexpensively and quickly.
  • the present invention can be used as an adjuvant when it is administered in combination with a vaccine.
  • the method for administering RNA to fish and shellfish is not particularly limited. Usually, the method used in aquaculture may be used.
  • RNA is derived from yeast
  • a method of directly injecting yeast extract containing RNA into the body with a syringe or the like a method of immersing fish and shellfish in an aqueous solution in which the yeast extract is dispersed or dissolved, a feed or a vaccine. Examples thereof include a method of orally administering the yeast in a mixed manner.
  • RNA used in the present invention is arbitrary. Although commercially available RNA can be used, it can also be produced by culturing a microorganism or the like and recovering RNA from the culture. Furthermore, it can be obtained from agricultural products, livestock products, and marine products. A particularly preferable RNA is to use yeast or yeast extract from the viewpoint of availability and the like.
  • RNA in the present invention to fish and shellfish is not particularly limited as long as it can activate immunity, and the form and concentration of RNA to be administered, the type of fish and shellfish, the weight of fish, and the like are taken into consideration. It can be adjusted as appropriate.
  • the immunostimulation for fish and shellfish of the present invention is made so that 1.2 times or more of the amount of RNA administered in aquaculture can be ingested. Administer the drug.
  • the immunostimulant for fish and shellfish of the present invention is preferably administered so that it can be ingested 1.5 times or more, more preferably 2 times or more.
  • the method of determining the RNA intake is arbitrary, but for example, the RNA content contained in a normal diet is determined by measurement or the like. Next, the minimum feeding rate is set to 1% (1 kg of fish eats 10 g of feed), and the amount of RNA ingested by fish and shellfish from the feed is determined.
  • RNA can be administered so as to be 1.2 times or more, preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more the determined amount. More specifically, when the RNA content in the feed is set to 0.3% by weight and the minimum feeding rate is 1% (1 kg of fish eats 10 g of feed), the RNA content in 10 g is 0.03 g. ..
  • the fish and shellfish of the present invention so that the amount of RNA is 1.2 times or more (0.036 g or more), preferably 1.5 times or more (0.045 g or more), and more preferably twice (0.06 g or more). Administer an immunostimulant.
  • the immunostimulant for fish and shellfish of the present invention may be administered in batches of the above doses once a day, or may be divided into a plurality of doses. When a plurality of doses are administered per day, it is effective and economically preferable that the total dose of the yeast extract is within the above-mentioned daily dose range.
  • the fish and shellfish in the present invention are not particularly limited, and may be any of freshwater fish, saltwater fish, and crustaceans. Further, it may be either farmed fish or ornamental fish. Specific examples include eels, koi, nigiri, ayu, tirapia, funa, and goldfish.
  • Saltwater fish include bluefin tuna, yellowtail, Thailand, amberjack, striped jack, ginkgo, amberjack, flounder, curry, black soy, and trough. , Amberjack, etc.
  • salmon, trout and the like can be mentioned as belonging to both freshwater fish and saltwater fish.
  • crustaceans include prawns, whiteleg shrimp, black tiger prawns, giant tiger prawns, and Chinese white shrimp.
  • the method for producing RNA of the present invention is not particularly limited as described above.
  • the yeast extract When the yeast extract is obtained from RNA, it can be produced by a conventional method of yeast extract, and there is no particular limitation. It is desirable to adopt a production method that can contain RNA in yeast extract as high as possible. Further, as a yeast extract containing a high amount of RNA, a commercially available "Yeast Megumi” (Mitsubishi Corporation Life Science Co., Ltd.) can be used.
  • the RNA content in the yeast extract is arbitrary, but from the viewpoint of production efficiency of the immunostimulator for fish and shellfish, it is preferable to use a yeast extract containing 10% by mass or more, preferably 20% by mass or more of RNA in the yeast extract. ..
  • RNA-containing yeast extract or the RNA-containing yeast cell one that is not subjected to RNA decomposition treatment is used.
  • the RNA decomposition treatment includes treatment with a nucleic acid-degrading enzyme such as nuclease, heat treatment, and the like.
  • a bacterial cell residue after extracting the yeast extract or the like can also be used.
  • the yeast to be used it is desirable to use yeast that is usually used as edible yeast. Specifically, it is torula yeast, brewer's yeast, baker's yeast, etc., and the cell residue thereof can be used. A large amount of bacterial cell residue is produced as a by-product with the production of yeast extract as a seasoning and other useful components, and the present invention can effectively utilize the yeast bacterial cell residue, so that cost and waste reduction can be achieved. But it is extremely advantageous. In addition, because it is produced industrially, there is less risk of supply insecurity, price fluctuations, and quality fluctuations compared to natural products.
  • the yeast cell residue of the present invention is a yeast extract or useful by extracting yeast with one or more of hot water, acid / alkaline solution, industrial enzyme, autolysis, mechanical crushing, etc. It is a residue after removing the components.
  • "GL yeast” manufactured by Kojin Life Science Co., Ltd. can be mentioned. Such residues are generally composed mainly of RNA, glucan, mannan, protein and lipid.
  • yeast cells are obtained by the method adopted in the production of yeast extract.
  • the RNA content in the yeast cells is arbitrary, but as described above, it is desirable that the RNA content is 1.0% by mass or more, preferably 6.0% by mass or more. Even when the yeast residue is used, it is desirable to use one having an RNA content of 1.0% by mass or more, preferably 6.0% by mass or more per dried cell. Particularly preferably, it is 25% by mass or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 55% by mass or less.
  • yeast cells the RNA content in the yeast cells is arbitrary, but is preferably 1.0% by mass or more, preferably 6.0% by mass or more.
  • the yeast residue is also used, it is optional as in the case of yeast cells, but it is desirable that the residue is 1.0% by mass or more, preferably 6.0% by mass or more.
  • Water is added to the yeast cell or the yeast cell residue to prepare a cell suspension having a concentration of 5 to 20% by mass based on the dry cell weight.
  • a step of washing the cells may be provided.
  • the specific washing method may be a general cell washing method.
  • the bacterial cell suspension is centrifuged to obtain a yeast cell residue, and water is added again to obtain a bacterial cell having a concentration of 5 to 20% by weight.
  • the prepared bacterial cell suspension is adjusted to pH 4.0 or higher, preferably pH 7.0 to 8.0.
  • Hot water or cell wall lysifying enzyme is added to this cell suspension to extract RNA.
  • ⁇ -glucanase “Tunicase FN” manufactured by Amano Enzyme
  • ⁇ -glucanase “Denateam GEL” manufactured by Nagasechemtex
  • ⁇ -glucanase “Gilrace BRX” manufactured by DSM Japan
  • Tunicase FN is preferable.
  • the reaction is carried out at 30 ° C. or higher, preferably 35 to 65 ° C., more preferably 40 to 50 ° C.
  • the reaction time is 2 to 7 hours, preferably 3 to 4 hours, although the enzymatic reaction is carried out.
  • the time of the enzyme reaction can be appropriately adjusted according to the amount of the cell wall lytic enzyme added and the yeast residue of the raw material.
  • the enzyme reaction is insufficient due to too little enzyme addition or too short reaction time, and conversely, when the enzyme reaction proceeds too much due to too much enzyme addition or too long reaction time. In either case, the RNA content is below the specified content and the effect is inadequate.
  • the enzyme reaction is inactivated by heat treatment at 90 ° C. for 10 minutes or longer.
  • a soluble extract containing RNA is obtained by solid-liquid separation.
  • solid-liquid separation in this case, general centrifugal separation, cross-flow type microfiltration, filter filtration, or the like can be used.
  • the obtained extract can be used as it is as the material of the present invention, or it can be used as a dry powder.
  • RNA content measurement method A yeast extract sample dissolved in ultrapure water was used as a measurement sample and measured by an HPLC method. Asahipak HPLC column GS-320H was used as the column, and 0.1 M sodium phosphate buffer was used as the eluent. The detection wavelength was 260 nm.
  • yeast blessing manufactured by Kojin Life Science Co., Ltd.
  • yeast extract NT yeast extracts derived from torula yeast. Table 1 shows the amount of nucleic acid contained in these yeast extracts. The blessing of yeast is expressed as RNA content, and yeast extract NT is the total amount of 5'-sodium adenylate, 5'-sodium guanylate, 5'-sodium cytidilate, and 5'-sodium uridylate (7-hydrate). The difference between the two products is the yeast extract containing RNA and 5'-nucleotides, which are degradation products of RNA.
  • Example 1 An administration test was carried out by supplying an aqueous solution prepared by dissolving each yeast extract in water so that the yeast extract content was 0.2% with respect to the solid feed.
  • the target fish of the administration test yellowtail fry with an average body weight of about 170 g, was divided into 150 fish in each test group in a 3 m square seawater cage and continuously bred.
  • the solid feed was administered for 5 days in a satiety state in each test group, and the feed stop cycle was repeated 4 times for 2 days.
  • the spleens of 3 juveniles of Buri to which the solid feed containing each yeast extract and the solid feed not containing each yeast extract were administered were administered on the 0th, 1st, 3rd, 7th, 14th, and 28th days before administration.
  • RNA was extracted from the spleen, changes in the expression of cytokines IL-1 ⁇ , IL-8, and TNF ⁇ were compared by real-time PCR.
  • the results of expression fluctuations of each cytokine are shown in FIG.
  • the breeding results after 4 cycles of administration (1 month later) are shown in FIG.
  • the RNA content in the solid feed used is 0.2% by weight.
  • RNAlater solution dispensed into the Eppendorf tube
  • freezer a freezer at -80 ° C. .. This was melted at room temperature prior to RNA extraction, one piece was added to 500 ⁇ l RNAiso plus dispensed into an Eppendorf tube, ground completely with a power masher and incubated at room temperature for 5 minutes. After that, about 20% of the liquid amount was added, and the mixture was shaken vigorously up and down, stirred until uniform, and incubated at room temperature for 5 minutes.
  • RNA extracted and purified from tissue pieces was diluted with RNase Free water to 100 ng / ⁇ l as a template, and reverse transcription was performed with the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit to obtain cDNA.
  • IL-1 ⁇ , IL-8, and TNF ⁇ which are cytokines of mRNA extracted from the spleen of the test group to which the yeast extract "Yeast Blessing" was administered, and which are particularly responsible for promoting the proliferation of immune system cells.
  • Yeast extract NT after 14 days did not show any enhancement of immune function.

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Abstract

【課題】　本発明は、魚介類に対して安価に且つ速やかに免疫を賦活させる方法を提供する。また、本発明は、従来の免疫賦活剤の連続投与によって起こる飼料効率の低下で魚介類の養殖飼料素材としては適さなかった多糖類などとは違い、連続投与が可能で且つ飼料効率を高めることが可能な魚介類の養殖飼料素材としての提供でもある。 【解決手段】 RNAを含有する酵母エキスを給与する、もしくは飼料やワクチンに配合して投与することにより、安価に且つ速やかに免疫を賦活させることを見出し本発明を完成した。

Description

魚介類の免疫を賦活させる組成物及びその方法
本発明は、RNAを投与、もしくは飼料又はワクチンに配合して魚介類へ投与させ、安価に且つ速やかに免疫を賦活させる素材を提供するものである。
魚介類の養殖現場において、養殖魚がウイルス性感染症、細菌病、真菌病等の魚病に感染して大量死することや、同じ地区で養殖している魚介類に感染症が蔓延するなどの問題が起きている。
近年では、これらの魚病や感染防止を目的に抗生物質やワクチン等の薬剤や免疫機能を高める免疫賦活剤や栄養剤などの使用が見られる。しかし、地球温暖化をはじめとする養殖環境の変化や抗菌性物質に対する耐性を持ったウイルスや細菌によって新たな魚病も散見され、新種のワクチンや免疫賦活剤などの開発が急がれている。
魚介類の免疫賦活剤には、多糖類、ペプチドグリカン、リポ多糖類、ペプチド、キチン・キトサン、乳酸菌、ビタミン類、ポリフェノール等が免疫賦活物質として魚介類に投与されている。多糖類では、オーレオパシジウムが産生するβ―１，３－１，６－D－グルカン（特許文献１）。乳酸菌では、ラクトバチルス・プランタラムの死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤（特許文献２）。本発明の核酸関連成分では、５’－ヌクレオチド類を含む魚介類の免疫賦活方法（特許文献３）、イノシンを含有する組成物で魚類もしくは甲殻類用の免疫賦活剤（特許文献４）などが紹介されている。
これら先行技術文献の素材には、速効性を提案する免疫賦活効果を持つ素材は無く、免疫を賦活させるために数日間の投与を必要とする。また、β―グルカンなどの多糖類においては、１週間以上の連続投与によって魚体への負担が大きくなり、免疫の低下や飼育成績の低下に働くこともある。
特開２００６－２６２８７７ ＷＯ２００４／０８４９２２ 特開２０１３－０６６３９９ 特開２０１５－１４２５６６
　本発明は、魚介類に対して安価に且つ速やかに免疫を賦活させる方法を提供する。また、本発明は、従来の免疫賦活剤の連続投与によって起こる飼料効率の低下で魚介類の養殖飼料素材としては適さなかった多糖類などとは違い、連続投与が可能で且つ飼料効率を高めることが可能な魚介類の養殖飼料素材としての提供でもある。
本発明者らは、上記課題の解決につき鋭意研究の結果、ＲＮＡを含有する酵母エキスを給与する、もしくは飼料やワクチンに配合して投与することにより、安価に且つ速やかに免疫を賦活させることを見出した。
すなわち本発明は、下記の特徴を有する魚介類の免疫を賦活させる方法を提供するものである。
（１）RNAを含有する魚介類用免疫賦活剤、
（２）前記（１）のRNAがRNAを含有する酵母エキス又はRNAを含有する酵母菌体である魚介用免疫賦活剤、
（３）前記（１）又は（２）の魚介類用免疫賦活剤を投与することを特徴とする、魚介類の免疫を賦活させる方法、
（４）前記（１）又は（２）の魚介類用免疫賦活剤をワクチンに配合して投与することを特徴とする魚介類の免疫を賦活させる方法、
（５）前記（１）又は（２）の魚介類用免疫賦活剤を飼料に配合して投与することを特徴とする魚介類の成長を促進する方法、
（６）前記（１）又は（２）の魚介用免疫賦活剤を含む魚介用飼料、
にかかるものである。
　本発明の魚介類用免疫賦活剤は、魚介類をウイルスや細菌等による感染をはじめとする魚介類の病気を効果的に予防することが出来るとともにワクチンなどの抗原と共に投与することで、ワクチンの効果を増強出来、さらに、魚介類の生産効率を向上できる。
サイトカイン遺伝子群の発現変動 実施例における飼育成績
本発明の魚介類用免疫賦活剤を例えば養殖魚などの魚介類に投与する。本発明品の投与によって、魚介類の免疫を賦活させる方法は特に限定するものではなく、ＲＮＡを含有する組成物を投与する。ＲＮＡは、他の素材とプレミックスに配合して投与する、飼料に配合して投与する、又はワクチンに配合して投与する方法などを採用することができる。これにより、安価で且つ速やかに魚介類の免疫を賦活させることが可能となる。特にワクチンに配合して投与する際には、本発明は、アジュバントとして利用することができる。
本発明において魚介類にRNAを投与する方法は特に限定するものではない。通常、養殖で利用されている方法で良い。ＲＮＡを酵母由来とする場合には、ＲＮＡを含有する酵母エキスをシリンジ等で直接体内に注入する方法、当該酵母エキスを分散又は溶解した水溶液に魚介類を浸漬させて摂取させる方法、飼料又はワクチンに混合させて経口投与する方法、等が挙げられる。
本発明において用いられるＲＮＡの由来は任意である。市販されているＲＮＡを利用することができるが、微生物等を培養し、培養物からＲＮＡを回収することで製造することもできる。さらには、農産物、畜産物、水産物から得ることもできる。特に好ましいＲＮＡは、入手性等の観点から、酵母又は酵母エキスを用いることである。
本発明におけるRNAの魚介類への投与量は、免疫を賦活できる量であれば特に限定するものではなく、投与されるＲＮＡの形態や濃度、魚介類の種類や魚体重等を考慮して、適宜調整することができる。
通常、養殖されている魚介類は、飼料等からＲＮＡを摂取しており、本発明では、養殖において投与されていたＲＮＡ量の１．２倍以上を摂取できるよう本発明の魚介類用免疫賦活剤を投与する。好ましくは、１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上摂取できるよう本発明の魚介類用免疫賦活剤を投与する。ＲＮＡの摂取量の決め方は任意であるが、例えば、通常の餌に含まれるＲＮＡ含量を計測等により決定する。次に、最低給餌率１％（１ｋｇの魚が１０ｇの餌を食べる）と設定し、魚介類が飼料から摂取するＲＮＡ量を決定する。当該決定量の１．２倍以上、好ましくは、１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上となるようにRNAを投与できるよう魚介類用免疫賦活剤を投与する。
　さらに具体的には、飼料中のＲＮＡ含量が０．３重量％、最低給餌率１％（１ｋｇの魚が１０ｇの餌を食べる）と設定した場合、１０ｇ中のＲＮＡ含量は０．０３ｇとなる。当該ＲＮＡ量の１．２倍以上（０．０３６ｇ以上）、好ましくは、１．５倍以上（０．０４５ｇ以上）、さらに好ましくは２倍（０．０６ｇ以上）となるよう本願発明の魚介類用免疫賦活剤を投与する。
本発明品魚介類用免疫賦活剤の投与は、上述の投与量を1日に１回にまとめて投与しても良く、複数回に分けて行ってもよい。１日に複数回投与を行う場合は、当該酵母エキス投与量の合計が、上述１日あたりの投与量の範囲内となることが効果的にも経済的にも好ましい。
本発明における魚介類としては、特に限定するものではなく、淡水魚、海水魚、甲殻類のいずれであってもよい。また、養殖魚類、観賞魚類のいずれであってもよい。具体的には、ウナギ、コイ、ニジマス、アユ、ティラピア、フナ、金魚類等が挙げられ、海水魚としては、クロマグロ、ブリ、タイ、ヒラマサ、シマアジ、ギンザケ、マアジ、ヒラメ、カレイ、クロソイ、トラフグ、カンパチ等が挙げられる。また、淡水魚及び海水魚のいずれにも属するものとして、サケ・マス類等が挙げられる。甲殻類としては、クルマエビ、バナメイエビ、ブラックタイガー、ウシエビ、コウライエビ等が挙げられる。
本発明のＲＮＡの製造方法は、前述のように特に制限はない。ＲＮＡ由来として酵母エキスを持ちる場合は、酵母エキスの常法により製造することができ、特に制限はない。酵母エキス中のＲＮＡをできるだけ高含有できる製造方法を採用することが望ましい。また、ＲＮＡを高含有する酵母エキスとして、市販されている「酵母の恵」（三菱商事ライフサイエンス社）を利用することができる。酵母エキス中のＲＮＡ含量は任意であるが、魚介類用免疫賦活剤の製造効率の観点から、酵母エキス中にＲＮＡを１０質量％以上、好ましくは２０質量％以上含む酵母エキスを用いることが好ましい。本発明でＲＮＡ含有酵母エキス又はＲＮＡ含有酵母菌体としては、ＲＮＡの分解処理をしないものを使用する。ＲＮＡ分解処理とは、ヌクレアーゼ等の核酸分解酵素処理、熱処理等である。
　本発明の酵母エキスの原料としては、通常の酵母エキスの原料として使用される酵母のほかに、酵母エキスなどを抽出した後の菌体残渣も用いることが出来る。使用する酵母は、通常食用酵母として利用されている酵母を使用することが望ましい。具体的には、トルラ酵母又はビール酵母、パン酵母などであり、またその菌体残渣を利用することができる。菌体残渣は、調味料である酵母エキスや他の有用成分の生産に伴って大量に副生しており、本発明はその酵母菌体残渣を有効利用できるため、コスト、廃棄物削減の点でも、極めて有利である。また、工業的に生産するため天然物と比較して、供給不安、価格変動、品質変動のリスクも少ない。
本発明の酵母菌体残渣とは、酵母に熱水、酸・アルカリ性溶液、工業用酵素、自己消化、機械的破砕等のいずれか一つ以上を用いて抽出処理することにより、酵母エキスまたは有用成分を抜いた後の残渣である。例えば、興人ライフサイエンス（株）製の「ＧＬ酵母」が挙げられる。このような残渣は一般的に、RNA、グルカン、マンナン、蛋白質、脂質を主要な成分とするものである。
本発明の魚介類の免疫を賦活させる酵母エキスを製造する方法は、酵母エキスの製造で採用される方法で酵母菌体を得る。酵母菌体中のRNA含量は、任意であるが、前述のように１．０質量％以上望ましくは６．０質量％以上含有することが望ましい。酵母菌体残渣を利用する場合も、乾燥菌体当たりのＲＮＡ含量が１．０％質量以上望ましくは６．０質量％以上含有するものを利用することが望ましい。特に好ましくは２５質量％以上である。上限は特に限定されるものではないが、５５質量％ 以下であることが好ましい。酵母菌体を使用する場合は、酵母菌体中のRNA含量は、任意であるが、１．０質量％以上望ましくは６．０質量％以上含有することが望ましい。酵母菌体残渣を利用する場合も、酵母菌体と同様に任意であるが、１．０質量％以上望ましくは６．０質量％以上含有することが望ましい。
この酵母菌体又は酵母菌体残渣に水を加えて、乾燥菌体重量で５～２０重量％濃度の菌体懸濁液を調製する。必要であれば、菌体洗浄する工程を設けても良い。具体的な洗浄方法は、一般的な菌体洗浄方法で良く、例えば、菌体懸濁液を遠心分離して酵母菌体残渣を取得し、再度水を加えて５～２０重量％濃度の菌体懸濁液を調製する。調製した菌体懸濁液をｐＨ４．０以上、望ましくはｐＨ７．０～８．０に調整する。
この菌体懸濁液に、熱水又は、細胞壁溶解酵素を添加してＲＮＡの抽出を行う。細胞壁溶解酵素を具体的に記載すると、セルロサイマイクロビウム属のβグルカナーゼ「ツニカーゼＦＮ」（天野エンザイム社製）とストレプトマイセス属由来のβグルカナーゼ「デナチームＧＥＬ」（ナガセケムテックス社製）、タラロマイセス属由来のβグルカナーゼ「Ｇｉｌｔｒａｓｅ　ＢＲＸ」（ＤＳＭジャパン社製）等があり、中でも「ツニカーゼＦＮ」が望ましい。
細胞壁溶解酵素の添加後、３０℃以上、望ましくは３５～６５℃、より望ましくは４０～５０℃で反応させる。反応時間は、２～７時間、望ましくは３～４時間酵素反応させるが、
酵素反応の時間は細胞壁溶解酵素の添加量及び原料の酵母残渣に応じて、適宜調整できる。酵素添加量が少なすぎるか反応時間が短すぎることにより、酵素反応が不十分な場合、反対に、酵素添加量が多すぎるか反応時間が長すぎることにより、酵素反応が進みすぎた場合の、どちらの場合も、ＲＮＡ含量が規定の含量を下回り効果が不十分なものとなる。酵素反応後に９０℃、１０分間以上の加熱処理などにより酵素を失活させる。
次いで、固液分離によりＲＮＡを含む可溶性のエキスを取得する。この場合の固液分離は、一般的な遠心分離又はクロスフロー型の精密濾過、フィルターろ過などを利用することが出来る。得られたエキスをそのまま本発明の素材として使用することもでき、または乾燥粉末にして、使用することもできる。
＜RNA含量測定方法＞
酵母エキスサンプルを超純水に溶解したものを測定サンプルとし、HPLC法にて測定した。カラムはAsahipak HPLC column GS-320Hを用い、溶離液は0.1Mリン酸ナトリウムバッファーを用いた。検出波長は260nmとした。
次に実施例を示し本発明について記載するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下に記載する本実施例においては、「酵母の恵み」（興人ライフサイエンス社製） 、及び「酵母エキスNT」（興人ライフサイエンス社製）を用いた。これらはいずれもトルラ酵母由来の酵母エキスである。これらの酵母エキスに含有されている核酸量について表１に示す。なお、酵母の恵みはＲＮＡ含量として表記し、酵母エキスＮＴは５’－アデニル酸ナトリウムと５’－グアニル酸ナトリウムと５’－シチジル酸ナトリウムと５’－ウリジル酸ナトリウムの合計量（７水和物として計算）を表記し、２製品の違いは、ＲＮＡとＲＮＡの分解物である５’－ヌクレオチドを含有する酵母エキスである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例１＞　
それぞれの酵母エキスを水に溶解した水溶液を固形飼料に対して酵母エキスが０．２％になるように給水させて投与試験を行った。
投与試験の対象魚である平均体重約１７０ｇのブリ稚魚を３ｍ四方の海水面生簀内に各試験区１５０尾になるように投与前日に区割りし継続飼育した。
固形飼料は各試験区ともに飽食状態で５日間投与し２日間餌止めのサイクルを４回繰り返した。
それぞれの酵母エキスを含む固形飼料と含まない固形飼料を投与したブリ稚魚各３尾の脾臓を投与前０日目、１日目、３日目、７日目、１４日目、２８日目に摘出し、脾臓からトータルRNAを抽出した後にリアルタイムPCRでサイトカインであるＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＴＮＦαの発現変動を比較した。各サイトカインの発現変動の結果を図１に示す。また、投与４サイクル後（１カ月後）の飼育成績を図２に示す。使用した固形飼料中のRNA含量は、０．２重量％である。
＜トータルＲＮＡの保管と抽出方法＞
ブリ稚魚より摘出した脾臓を約2 mm角に細断し、エッペンドルフチューブに分注したRNAlater溶液内に浸漬させ、約５℃前後の冷蔵庫内で12時間保管後、-80℃の冷凍庫で保管した。これをRNA抽出前に室温で溶かし、1片をエッペンドルフチューブに分注した  500 μ l　RNAiso plusに加え、パワーマッシャーにより完全にすりつぶし、室温で5分インキュベートした。その後クロロホルムを液量の約20％添加し、上下に激しく振って均一になるまで攪拌し、室温で5分インキュベートした。これを13,000 rpmで約10分遠心分離し、上清を新しいエッペンドルフチューブに回収し、イソプロパノールを回収量の約60％加え、上下に攪拌し、室温で10分インキュベートした。
以上の手順で得られたRNA粗抽出液をQIAGEN RNeasyMinikitで精製し、ナノドロップでRNA濃度と純度を確認した。
〈cDNA合成とリアルタイムPCR〉
組織片から抽出、精製したRNAをRNase Free水を加えて100 ng/μlに希釈したものをテンプレートとし、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kitで逆転写し、cDNAを得た。これを10倍希釈したものをテンプレートとし、BioRADのSsoAdvanced universal SYBR GreenでリアルタイムPCRを実施した。なお、全試験についてハウスキーピング遺伝子としてEF-1αの発現量を同時に解析し、これによって各サイトカイン遺伝子の発現量を補正した。更に、対照区での各サイトカイン遺伝子の発現を1とした時の日毎の相対遺伝子発現を図１に示した。
図１の結果から、当該酵母エキスである「酵母の恵み」を投与した試験区の脾臓から抽出したｍＲＮＡの各サイトカインであり特に免疫系細胞の増殖促進をつかさどるＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＴＮＦαの発現が投与直後からプラスに変動し、徐々に低下するものの投与１４日後まで有意的に免疫機能が働いていることが示されている。１４日後の酵母エキスNTは、免疫機能の増進は見られなかった。
　また、図２の結果から、投与4サイクル後（１カ月後）の飼育成績は、当該酵母エキス、酵母エキスＮＴ飼料効率（飼料効率（%）＝１００　×　増えた体重（湿重）÷　食べた餌の量（乾重））が対照区より高い結果となった。
　上記の結果から、本発明は投与直後から免疫を賦活させる方法に加え、飼料効率が高く、成長を促進することができる魚介類の経済的優位な養殖方法を提供することができる。

Claims (6)

  1. RNAを含有する魚介類用免疫賦活剤。
  2. 請求項１のRNAがRNAを含有する酵母エキス又はRNAを含有する酵母菌体である魚介用免疫賦活剤。
  3. 請求項１又は２の魚介類用免疫賦活剤を投与することを特徴とする、魚介類の免疫を賦活させる方法。
  4. 請求項１又は２の魚介類用免疫賦活剤をワクチンに配合して投与することを特徴とする魚介類の免疫を賦活させる方法。
  5. 請求項１又は２の魚介類用免疫賦活剤を飼料に配合して投与することを特徴とする魚介類の成長を促進する方法。
  6. 請求項１又は２記載の魚介用免疫賦活剤を含む魚介用飼料。
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