KR101088442B1 - 감태발효 사료첨가물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사료 첨가물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료에 관한 것으로서, 특히, 감태의 발효를 이용한 사료 첨가물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료에 관한 것으로서, 감태발효체를 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 감태발효 사료첨가물 및 이의 제조방법, 감태발효체를 주성분으로 포함하는 감태발효 사료첨가물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 등을 제공한다.

감태가공부산물, 감태발효 사료첨가제, 사료.

Description

감태발효 사료첨가물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료{Fermented Feed additives using Ecklonia cava and the method of producting it, feed comprising it}

본 발명은 사료 첨가물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료에 관한 것으로서, 특히, 감태의 발효를 이용한 사료 첨가물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료에 관한 것이다.

감태는 갈조식물의 다시마목 미역과 식물로서 우리나라에서는 주로 제주 연안 수심 10m 이내에 서식하고 있다. 감태는 거의 식용되지 않고 전복 및 소라 먹이로 주로 이용되고, 극히 일부만 알긴산 원료 등 한정된 용도로 사용되어 왔다.

최근, 감태에 많이 들어 있는 폴리페놀 물질인 플로로타닌(phlorotannin)이 항산화, 항고혈압, 혈전생성저해 및 항암 활성이 우수한 것으로 알려짐에 따라 기능성 식품 및 의약품의 중요 소재로 부각되고 있다.

제주도 소재 아쿠아그린텍(주)에서는 감태를 원료로 하여 식품에 사용할 수 있는 효소인 감태효소 추출물를 얻기 위하여 감태를 가수분해 한 후 막분리하여 대량생산이 가능한 기술을 개발한 바 있다. 이렇게 제조한 감태효소 추출물은 항산화, 항암, 항염증 등 다양한 생리활성을 갖는 것으로 보고되고 있다. 또한, (주)라이브캠에서는 감태를 유기용매로 추출하여 해양 폴리페놀인 씨놀(Seanol)을 제품화하는 데 성공하였다.

관련업계에 따르면, 제주도에서 폴리페놀 물질 등을 추출하기 위하여 가공 처리되는 감태는 2006년을 기준으로 약 600톤이었으며, 2008년에는 약 1,000톤 이상이 될 것으로 추정하고 있다. 이에, 가공 중에 발생되는 약 30% 이상의 감태가공부산물에 대한 효율적인 활용대책이 필요하다.

그러나, 현재까지 감태가공부산물의 활용방안이 강구되지 않아 대부분 버려지고 있어 환경적인 측면에서도 문제가 되고 있다.

한편, 국내 양식 산업은 크게 성장하고 있으나, 양식 중 발생하는 어류의 질병이 양식 산업 발전을 저해하는 결정적인 요인으로 작용하고 있다. 국내 양식 산업은 적은 수면적에 과다한 어류를 양식하는 고밀도 사육을 하고 있어, 세균성 질병에 의한 발병 빈도가 높으며, 질병 예방을 위해 사용되는 항생제의 오·남용과 단기간 성장을 위한 사료의 과다 투입으로 인하여 병원체의 내성증강과 수질오염이 심화되고, 이에 따라 질병 발생이 늘어나는 악순환이 계속되고 있다.

따라서, 영양원 확충 공급에 의한 사료효율을 향상되고, 면역성이 우수하여 질병예방에 도움이 되며, 사료비의 절감효과가 있는 사료첨가제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

또, 최근 전복을 육상수조에서 고밀도로 양성하는 곳이 계속 증가되는 등 양식 방법이 다양해지고 있으며, 양식용 전복 먹이로 해조류가 주로 사용되고 있다. 그러나 해조류는 공급이 불안정한 등의 문제점이 잠재되어 있기 때문에 이를 대체할 수 있는 고품질의 경제적인 배합사료의 보급이 시급하다. 전복 배합사료에 해조류를 첨가하여 효능을 비교한 결과가 일부 있으나, 전복의 사료가 될 수 있는 해조류 부산물을 이용한 연구는 전무한 실정이다.

본 발명은 영양원 확충 공급에 의한 사료효율을 향상되고, 면역성이 우수하여 질병예방에 도움이 되는 감태발효체를 주성분으로 포함하는 사료첨가제, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료를 제공하려는 것이다.

또, 감태 특히, 폴리페놀 물질 등을 추출하는 등의 가공을 통하여 발생되는 감태가공부산물을 활용함으로서 사료비의 절감효과가 우수한 감태발효 사료첨가제, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료를 제공하려는 것이다.

본 발명의 일구현예에 따른 감태발효 사료첨가물은 감태발효체를 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또, 본 발명의 일구현예에 따른 사료는 감태발효체를 주성분으로 포함하는 감태발효 사료첨가물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기에서, 감태발효체는 감태 또는 폴리페놀 물질 등을 추출하는 가공을 통하여 발생되는 감태가공부산물을 발효시켜 제조된 것을 말한다.

즉, 본 발명은 감태의 항산화 활성 등의 생리 기능성을 더욱 향상시키기 위하여 감태 또는 감태가공부산물을 발효시켜 제조된 감태발효체를 사료첨가물로 사용함으로서, 가축 또는 양식 어류의 면역세포 증식효과 및 세균에 대한 항균 효과 등을 향상시킬 수 있으며, 특히 넙치 또는 전복 등의 양어용 사료의 사료첨가물로 사용됨으로서 넙치 또는 전복 등의 양어류의 성장률 및 생존율 등을 향상시킬 수 있는 것이다.

미생물을 이용한 발효기술은 식품, 의약품 및 화장품 산업 등의 다양한 분야에서 응용되고 있는데, 발효에 의하여 단백질 및 탄수화물 등의 고분자 물질이 저분자화됨으로서 생체 흡수율이 높아지고, 기존 성분과 다른 유용한 성분의 생성으로 인하여 생리 기능성이 증가하며, 유해 미생물의 살균 효과도 나타나 제품의 저 장성도 높아지는 것으로 알려져 있으며, 본 발명자들은 감태 또는 감태가공부산물에 이와 같은 원리를 적용하여 본 발명에 이르게 된 것이다.

본 발명의 일구현예에 따른 사료는 감태발효체를 주성분으로 포함하는 감태발효 사료첨가물을 전체사료 중량을 기준으로 2 내지 10 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 감태발효체를 주성분으로 포함하는 감태발효 사료첨가물을 전체사료 중량을 기준으로 2 중량% 이상 포함함으로서 면역세포 증식효과 및 세균에 대한 항균 효과 등을 더욱 효과적으로 향상시킬 수가 있으며, 10 중량% 이하로 포함함으로서 사료체 감태발효체를 주성분으로 포함하는 감태발효 사료첨가물 이외의 단백질 또는 탄수화물 등을 제공하는 물질의 포함 함량을 일정 함량 이상으로 포함하여 고른 영양소를 공급할 수 있는 사료를 제공할 수 있는 것이다.

본 발명의 일구현예에 따른 감태발효 사료첨가제의 제조방법은 감태 또는 감태가공부산물을 준비하는 공정과; 상기 준비된 감태 또는 감태가공부산물을 건조하는 공정과; 상기 건조된 감태 또는 감태가공부산물을 분쇄하여 감태분말을 제조하는 공정과; 상기 감태분말에 발효균 및 물을 첨가하는 공정과; 상기 발효균 및 물이 첨가된 감태분말을 발효하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

즉, 감태 바람직하게는 감태가공부산물을 준비하여, 이를 건조하고, 분쇄하여 분말상의 감태분말을 먼저 제조한다. 이 때, 건조 및 분쇄하는 공정은 통상의 일반적인 방법으로 실시할 수 있으며, 분말의 입자 크기 등은 사료의 용도 즉, 가축의 종류 또는 양식 어종의 종류 특성에 알맞도록 조절할 수 있다.

감태분말을 제조한 후에는 감태분말에 발효균 및 물을 첨가한다. 이 때, 발효균은 감태분말을 발효시킬 수 있는 미생물 또는 미생물군으로 선택하면 된다. 또, 감태분말의 발효를 보다 효율적으로 하기 위하여서는 약 80 내지 100℃의 고온에서 발효시키는 것이 바람직하며, 이 때, 약 80 내지 100℃의 고온에서 내성을 가지는 고온내성 발효균으로 발효시키는 것이 바람직하다. 특히, 발효균은 고온내성 발효균으로서 바실러스(Bacilus)속에 속하는 발효균을 일종 이상 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 바실러스(Bacilus)속에 속하는 발효균을 일종 이상 포함하는 고온내성 발효균은 탄수화물 및 단백질 등의 성분에 대하여 분해능이 매우 우수하다.

또, 감태분말에 발효균 및 물을 첨가하는 공정에서 첨가되는 발효균 또는 고온내성 발효균은 감태분말에 대하여 4.0×10^-5 중량% 이상 첨가됨으로서 감태분말의 발효 효율을 향상시킬 수 있다.

또, 감태분말에 발효균 및 물을 첨가하는 공정에서 첨가되는 물은 감태분말 및 발효균을 포함하는 고형분의 함수율이 60 내지 70%가 되도록 첨가됨으로서 감태분말의 발효효율을 향상시킬 수 있다.

또, 상기 발효균 및 물이 첨가된 감태분말을 발효하는 공정에서 발효 온도는 80 ~ 100℃로 함으로서 잡균을 사멸하고 고온 발효균만이 남아서 발효를 진행하여 발효 효율을 향상시킬 수 있다.

또, 상기 발효균 및 물이 첨가된 감태분말을 발효하는 공정에서 발효 시간은 5 내지 7시간으로 함으로서 감태분말의 발효 효율을 극대화하여 감태의 항산화 활성 등의 생리 기능성을 더욱 향상시킬 수 있는 것이다.

이로써, 본 발명은 영양원 확충 공급에 의한 사료효율을 향상되고, 면역성이 우수하여 질병예방에 도움이 되는 감태발효체를 주성분으로 포함하는 사료첨가제, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료를 제공하였다.

또, 감태 특히, 폴리페놀 물질 등을 추출하는 등의 가공을 통하여 발생되는 감태가공부산물을 활용함으로서 사료비의 절감효과가 우수한 감태발효 사료첨가제, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 사료를 제공하였다.

특히, 이러한 감태발효 사료첨가제를 첨가한 양어용 사료는 넙치 및 전복 등의 사육에 적용하면, 넙치 및 전복의 성장을 촉진하고 면역력이 우수한 수산물을 양식할 수 있도록 해준다. 즉, 감태발효 사료첨가물을 감태가공부산물은 세포실험에서 우수한 항산화 및 면역증진 효과를 나타내고, 어병세균에 대하여 항균 효과도 뛰어난 사료첨가제로서, 감태발효 사료첨가물을 첨가한 사료를 어류 사육에 적용하면 어류 체중의 증가와 함께 면역력을 높여 어병 예방에도 도움을 주어 폐사율을 낮출 수 있다.

이하, 본 발명의 내용에 대하여 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

<실시예 1 - 감태발효 사료첨가제>

본 발명의 감태발효 사료첨가제에 대한 실시예 1로서 감태발효 사료첨가제의 일제조예는 도 1과 같은 공정에 의하여 제조되었다.

즉, 아쿠아그린텍(주)에서 감태 효소 추출물을 제조할 때 발생하는 감태가공부산물 30kg을 준비하여, 고속고온건조기(오카도라, 일본)에 넣고, 120℃에서 100 분간 건조시킨 다음, 100㎛ mesh로 분말화하였으며, 발효공정에 사용하였다.

이 때, 발효 공정에 사용된 발효 장치는 고온속성발효장치(BF-30, 미쯔비시, 일본)이며, 발효에 첨가되는 발효균은 바실러스(Bacillus)속에 속하는 발효균을 일종이상 포함하는 고온내성 발효균으로 하였으며, 그 주요 성분 및 함량은 하기 표 1과 같다.

그리고, 감태분말 20kq을 기준으로 발효균을 1g, 즉, 5×10^-5 중량%를 혼합하였으며, 감태분말 및 발효균의 고형분 함수율이 약 60%가 정도 되도록 물을 10L 첨가한 후. 상기 고온속성발효장치의 내부 온도가 90℃가 될 때 발효공정을 시작하였다. 발효 시간은 약 6시간으로 하여 제조하였다.

상기와 같이 감태가공부산물을 이용하여 발효 제조된 본 발명의 실시예 1인 감태발효 사료첨가물을 이용하여 항산화 활성, T세포(면역세포)의 증식효과 및 해양 어병세균에 대한 항균 효과를 실험하였다.

<실험예 1> 감태발효 사료첨가물의 항산화 활성

감태발효 사료첨가물의 항산화 활성은 생물체에 유해한 활성산소의 소거능으로 측정하였다. 즉, DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능, 히드록실(Hydroxyl) 라디칼 소거능, 알킬(Alkyl) 라디칼 소거능, 슈퍼옥사이드 음이온(Superoxede anion) 라디칼 소거능으로 평가하였다.

산소는 생물체내의 소화 및 에너지 생성 등 여러 대사 과정에 관여하고 생물의 생존에 가장 필수적인 물질이지만, 반응성이 매우 큰 활성산소로 전환되면 생체에 좋지 않은 영향을 미친다. 활성산소는 단백질 및 불포화지방산 등과 결합하여 과산화지질을 생성하고, DNA 및 RNA 등에 손상을 일으키며, 생체막의 손상과 면역력의 약화시켜 성인병 등 각종질병과 노화를 유발시킨다.

또한, 활성산소종의 주를 이루는 자유라디칼은 불안정하고 체내의 다른 물질과 급속히 반응함으로서 세포 손상 및 질병을 유발시키는 원인이 되기도 한다. 생체 내 활성산소의 밸런스가 이루어지지 않으면 불포화지방산이 산화되어 급성세포 손상 등을 일으킴으로서 노화는 물론 암, 파킨스병 및 알츠하이머병 등을 유발시키게 된다

상기의 각종 시험을 위하여 감태발효 사료첨가물 및 대조예로서 미발효 감태분말 각각 1g에 물 100ml를 첨가한 다음 상온에서 24시간 교반 후 여액을 농축하여 상기의 각종 시험에 사용하였으며, 그 결과는 도 2와 같다. 이 때, 감태발효 사료첨가물은 발효 감태가공부산물로, 미발효 감태분말은 미발효 감태가공부산물로 표시하였으며, 이하의 실험에서도 같이 표시하였다.

도 2에서 나타낸 바와 같이 발효 및 미발효 감태가공부산물 모두 활성산소 라디칼 소거활성이 우수하였으며, 이는 감태에 다량 함유되어 있는 폴리페놀 성분을 중심으로 다당류 등 기타성분들의 복합작용에 의한 영향으로 추측된다.

특히 발효 감태가공부산물은 미발효 감태가공부산물 보다 모든 라디칼 소거 활성이 더 우수하여 면역증강용 양식 사료 첨가제로서 긍정적인 소재로 평가될 수 있다.

<실험예 2> 감태발효 사료첨가물의 T 세포(면역세포) 증식효과

T 세포는 흉선에서 유래하는 림프구로 기억능력에 관여하며, B세포에 정보를 제공하여 항체 생성을 도울 뿐만 아니라 세포의 면역에 주된 역할을 한다. 세포가 자라서 분열을 하려면 DNA의 합성이 필수적인데, 이 때 티미딘(Thymidine)이 필요하다. 방사능을 띤 티미딘을 넣어주게 되면 T 세포의 성장을 위해 3H-티미딘을 많이 포함하게 되고, 세포가 이러한 방사능동위원소를 얼마나 포함하느냐에 따라 그 세포의 성장여부를 판단할 수 있다.

도 3은 발효 감태가공부산물의 T 세포 증식효과를 나타낸 것으로, 발효 여부에 관계없이 감태가공부산물은 세포 증식 효과가 있었고, 특히 발효공정을 거친 발효 감태가공부산물의 T 세포 증식효과는 미발효 감태가공부산물의 T 세포 증식 보다 2배 이상 높게 나타났다.

이러한 결과는 감태가공부산물의 발효 공정을 통하여 저분자화 된 성분이 세포내로 침투하여 반응을 했거나, 발효에 의하여 세포신호전달을 강하게 한 것으로 생각되며, 상기 항산화 활성의 결과와 연계하여 발효 감태가공부산물은 면역증강용 사료첨가제로서 활용도가 높을 것으로 기대된다.

<실험예 3> 감태발효 사료첨가제의 세포보호 및 DNA 손상억제 효과

과산화수소에 의해 손상을 받은 세포에 대한 생존율은 일반적으로 MTT법으로 측정하고 있는데, 이 방법은 살아있는 세포의 경우 노란색의 수용성 MTT 시약이 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의해 자주색으로 환원되는 것을 이용하여 흡광도를 측정함으로써 알아보는 것이다.

도 4는 발효 감태가공부산물의 과산화수소 처리된 손상 세포의 생존율 증진효과를 나타낸 것으로, 세포 생존률은 농도 의존적으로 증가하였고, 특히 100㎍/㎖의 농도에서 발효 감태가공부산물의 세포 생존률은 미발효 감태가공부산물 보다 20% 이상 높게 나타나 발효에 의하여 세포 보호효과가 증가하였다는 것을 의미한다.

도 5는 발효 감태가공부산물의 세포 보호효과를 현미경을 통하여 관찰한 사진으로, 과산화수소를 첨가하지 않은 (A)의 경우에는 세포의 형태가 뚜렷하고 타원형의 모양을 하고 있지만, 과산화수소만 첨가시킨 (B)의 경우에는 세포의 형태가 많이 깨져서 사멸소체(Apoptotic body)가 많이 보이고 있으며, 세포의 형태 또한 뚜렷하지 않았다.

하지만 미발효 감태가공부산물과 발효 감태가공부산물을 과산화수소와 함께 첨가시킨 (C)와 (D)의 경우에는 과산화수소를 첨가하지 않았던 (A)에서와 마찬가지로 뚜렷한 세포의 형태를 확인할 수 있었고, 특히 발효 감태가공부산물을 첨가한 (D)의 경우는 세포 손상을 거의 입지 않았다는 것을 알 수 있다.

천연물의 유전 독성 억제 효과를 알아보는 방법으로서 세포 DNA의 손상을 측정하는 방법이 최근 널리 쓰이고 있다. 생체내에서 자유 라디칼과 항산화 물질간의 균형이 깨져 자유 라디칼 생성이 항산화 물질 보다 많아지면 신체는 산화적 스트레스를 받고, 그 결과 DNA와 같은 민감한 생체분자는 손상되어 결국은 퇴행성 만성질환으로 발전될 가능성이 높아진다. 특히, 활성산화물질이 과도하게 존재할 때 이들은 더욱 파괴적이고 비가역적인 DNA 손상을 일으키며, 이것이 원인이 되어 돌연변이를 초래하고 더 나아가 암으로까지 발전할 수 있는 것이다.

세포의 DNA 손상을 측정하는 방법으로 코멧 시험법(Comet assay)을 이용하여 발효 감태가공부산물의 DNA 손상 억제 효과를 분석하였다. 이 방법의 이론은 근본적으로 분자량에 따라 그 이동속도가 반비례되는 전기영동의 원리에 기초하고 있다. 즉, DNA 손상을 입은 세포를 용해시켜 핵만 남긴 후 전기영동을 하게 되면 DNA 분자량의 크기가 작을수록 핵으로부터 멀리 이동하기 때문에 손상되어 잘려진 DNA 가닥이 많을수록 혜성 꼬리처럼 긴 모양이 생긴다.

도 6a는 세포의 꼬리 길이(Tail movement)를 측정하여 DNA 손상 억제 효과를 나타낸 것으로, 발효 감태가공부산물과 미발효 감태가공부산물 모두 첨가된 농도에 의존하여 세포손상 억제효과가 높게 나타났으며, DNA 손상 정도를 나타내는 꼬리 길이도 짧았다. 특히 발효 감태가공부산물은 미발효 감태 가공부산물 보다 세포 및 DNA 손상억제 효과가 더 우수하였음을 알 수 있다.

또한, 도 6b는 미발효 감태가공부산물 및 발효 감태가공부산물의 세포 DNA의 보호효과를 형광현미경을 통하여 관찰한 결과로서, 정상세포 (A)는 원형의 형태를 유지하고 있지만, 과산화수소만 첨가한 세포 (B)는 DNA 손상을 많이 입어 혜성 꼬리처럼 긴 모양이 생긴다. 미발효 감태가공부산물과 발효 감태가공부산물을 과산화수소와 함께 첨가한 (C)와 (D)는 과산화수소만 첨가한 (B) 보다 세포 꼬리 길이가 길지 않았고, 특히 발효 감태가공부산물이 첨가된 (D)는 미발효 감태 가공부산물 첨가된 (C)보다 세포 꼬리가 짧은 것을 확인하였다.

이상의 결과로부터, 발효 감태가공부산물은 세포보호 효과가 우수하고, DNA의 손상을 최대한 억제시킴으로서 어느 정도 유전독성을 방지할 수 있다는 것을 알 수 있다.

<실험예 4> 감태발효 사료첨가물의 해양 어병세균에 대한 항균 효과

국내 양식산업은 크게 성장하고 있으나, 양식 중 발생하는 어류의 질병이 양식 산업의 발전을 저해하는 결정적인 요인으로 작용하고 있다. 국내 양식산업은 적은 수면적에 과다한 어류를 양식하는 고밀도 사육을 하고 있어 세균성 질병에 의한 발병빈도가 높으며, 질병예방을 위해 사용되는 항생제의 오·남용과 단기간 성장을 위하여 사료의 과다 투입으로 병원체의 내성증강과 수질오염을 초래하고 있으며, 이에 의하여 질병 발생이라는 악순환이 계속되고 있다. 따라서, 해양 어병세균에 대한 항균효과가 우수한 사료가 개발되면 양식어종의 세균성 질병을 예방할 수 있을 뿐만 아니라 항생제의 남용도 줄일 수 있어 생산성도 향상되고, 궁극적으로 친환경 양식산업 육성이 가능하게 될 것이다.

표 2는 페이퍼 디스크(Paper disc)법으로 넙치 연쇄구균증의 주요 원인균인 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)와 비브리오증의 원인균인 비브리오 앙귈라럼(Vibrio anguillarum)에 대한 발효 감태가공부산물의 항균 활성을 나타낸 것으로, 디스크당 5mg/㎖의 미발효 감태가공부산물 및 발효 감태가공부산물을 처리한 결과, 미발효 감태가공부산물은 항균 효과가 전혀 나타나지 않았으나, 발효 감태가공부산물은 항균 효과를 나타내었다.

	디스크 억제환 크기(mm)
	미발효 감태 가공 부산물	발효 감태 가공 부산물
스트렙토코커스 이니에 (Streptococcus iniae)	-	10
비브리오 앙귈라럼 (Vibrio anguillarum)	-	10.5

도 7은 상기 발효 감태가공부산물의 항균 효과를 사진으로 나타낸 것으로서, 항균활성이 있는 경우, 디스크 주위에 균이 증식되지 않는 것을 보여준다.

이상의 결과로부터, 발효 감태가공부산물은 어류의 질병예방 및 항생제 사용을 저감시킬 수 있는 기능성 사료첨가제로 유용할 것으로 판단된다.

상기와 같이 감태가공부산물을 이용하여 발효 제조된 본 발명의 실시예 1인 감태발효 사료첨가물을 이용하여 항산화 활성, T세포(면역세포)의 증식효과 및 해양 어병세균에 대한 항균 효과를 실험한 결과, 미발효 감태가공부산물보다 그 효능이 매우 우수함을 알 수 있다.

본 발명의 감태발효 사료첨가물을 포함하는 사료의 급이에 의한 양식어 사육시 영향을 알아보기 위하여 양식 넙치용 및 까막전복용 사료에 대한 실시예를 각각 제조하여 그 효능을 시험하였다.

통계분석

넙치 및 전복 사육실험 데이터는 통계프로그램인 SPSS(vesion 10)을 사용하여 분석하였다. 수치는 평균치±표준오차(SE)로 나타내었다. 각 군별 유의성 검정을 위하여 one-way 분산분석(ANOVA)을 수행하였다.

<실시예 2 내지 4 및 비교예 1>

먼저, 양식 넙치 급이용 사료는 본 발명의 실시예 1의 감태발효 사료첨가물을 각각 2 중량%, 4 중량% 및 6 중량% 첨가시켜 실시예 2 내지 4를 제조하였으며, 감태발효 사료첨가물을 포함하지 않는 기초사료(Control)를 비교예로 하였으며, 표 3은 실시예 2 내지 4 및 비교예 2의 조성표이다.

함량 : 중량%
성분	비교예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4
White FM	56.0	56.0	56.0	56.0
대두박	6.6	6.6	6.6	6.6
콘 글루텐밀	4.4	4.4	4.4	4.4
밀가루	15.8	15.8	15.8	15.8
효모	2.2	2.2	2.2	2.2
복합 미네랄	1.0	1.0	1.0	1.0
복합 비타민	1.0	1.0	1.0	1.0
오징어 간유	6.0	6.0	6.0	6.0
CMC	1.0	1.0	1.0	1.0
셀루로오즈	6.0	4.0	2.0	0
실시예 1의 감태발효 사료첨가물	0	2.0	4.0	6.0
합계	100	100	100	100

실시예 2 내지 4에 첨가되는 감태발효 사료첨가물은 분말형태로 상기 표 3과 같은 성분 및 함량으로 기초사료에 첨가되었으며, 실시예 2 내지 4 및 비교예 1을 이용한 사료제조 방법은 먼저 분말형태의 사료원을 잘 섞은 다음, 사료원 총 중량에 대하여 약 30%의 물을 첨가하여 반죽 형태로 제조하였다. 반죽한 사료는 소형 쵸파기(SMC-12, Korea)를 이용하여 직경 3.0mm로 뽑아낸 다음 동결건조한 후 알맞은 크기로 분쇄하였다. 제조된 사료는 넙치에 급이하기 전까지 -20℃ 저온 냉동고에 보관하였다.

넙치는 제주특별자치도내 양식장에서 구입하여 제주대학교 해양과 환경연구소로 수송되었으며, 실험환경에 적응시키기 위해 약 2주간 순차시켰다. 예비사육 후 사료 공급 실험은 3회 반복으로 수행하였다. 사육수는 여과해수 1~2L/min의 유수량이 공급되도록 조절하였고, 모든 실험수조에 용존산소 유지와 원활한 사육수 순환을 위해 에어스톤을 설치하였다. 사육넙치의 최초 무게는 70± 5g이었으며, 실험사육은 12주 동안 수행하였다.

표 4는 넙치의 성장 및 생존율에 미치는 영향을 나타낸 것으로서, 감태발효 사료첨가물이 첨가된 실시예 2 내지 4의 사료 급이구에서 감태발효 사료첨가물이 첨가되지 않은 비교예 1의 사료 급이구보다 어체중 증가율이 높았고, 감태발효 사료첨가물의 첨가량이 많을수록 어체중 증가율이 약간씩 감소하는 경향을 보였다.

사료효율은 실시예 3 및 실시예 4를 급이한 대조구가 비교예 1을 급이한 대조구보다 높았음을 보여주며, 생존율은 실시예 2 내지 실시예 4를 급이한 대조구가 비교예 1을 급이한 대조구에 비하여 같거나 높았다.

	어체중 증가율(%)1	사료효율(%)2	생존율(%)
비교예 1	315.35± 6.01	140.69± 1.33	98
실시예 2	335.97± 5.50	138.70± 1.77	100
실시예 3	332.93± 4.07	151.57± 1.89	100
실시예 4	317.68± 6.66	144.56± 2.00	98
1어체중 증가율(%) = (최종 어체중- 최초 어체중/최초 어체중)×100 2 사료효율 = (어체중 증가량/섭취사료량)×100 * p<0.05

표 4와 같은 결과는 감태발효 사료첨가물을 포함하는 사료가 양식어의 체중 증가 및 생존율을 향상시킬 수 있는 것을 보인 것이다.

어류의 혈액성분은 영양, 건강상태 및 스트레스 정도를 분석하는 데 사용되고 있으며, 사료의 필수영양소 결핍이나 그 어종이 처해있는 서식환경 및 성장에 따라서도 변화된다고 알려져 있다(Garrido 등, 1990 ; Siddiqui, 1977).

표 5는 발효 감태가공부산물이 첨가된 사료의 급이에 의한 양식 넙치의 혈액내 생화학적 성분 변화를 나타낸 것으로서, 그 결과를 상세히 살펴보면 혈액내 AST(Aspeartate aminotransferase=GOT)는 발효 실시예 2 내지 4의 사료 급이구에서 비교예 1의 사료 급이구 보다 유의적 낮았으며, 감태발효 사료첨가물의 첨가량에 비례하여 낮아지는 경향을 나타내었다.

고밀도 콜레스테롤은 감태발효 사료첨가물의 첨가량에 의존하여 유의적으로 높았으며, 헤모글로빈은 실시예 2 내지 4의 사료 급이구 모두가 비교예 1의 사료 급이구 보다 유의적으로 높은 값을 나타내었다.

	AST (U/L)	고밀도 콜레스테롤 (mg/dL)	헤모글로빈 (g/dL)
비교예 1	289.50± 9.88	126.00± 9.21	0.26± 0.01
실시예 2	222.50± 8.88*	147.00± 11.21*	0.56± 0.01*
실시예 3	216.75± 9.07*	149.20± 10.79*	0.49± 0.01*
실시예 4	215.50± 4.80*	155.50± 12.20*	0.46± 0.02*
* p<0.05

AST (GOT)는 주로 심장과 간에 존재하는 효소로 신장, 골격근육에도 소량 존재하고 이 조직들이 각종 질병에 의해 파괴되면 혈액으로 유출되어 증가한다고 알려져 있으며, 고밀도 콜레스테롤은 말초혈관의 불필요한 콜레스테롤을 간으로 운반해 주는 좋은 콜레스테롤로 동맥경화를 지연시킨다고 보고되어 있다. 또한 헤모글로빈은 적혈구 속에 들어 있는 혈색소로 산소를 운반하는 역할로 헤모글로빈양이 부족하면 빈혈 등을 유발할 수 있다.

따라서 감태발효 사료첨가물을 포함하는 사료를 넙치에 섭취시키면 생리학적 기능을 강화시킨다는 것을 알 수 있다.

어류의 면역증진효과를 알아보는 대표적인 실험이 식세포의 호흡급증 활성 및 라이소자임 활성이다. 호흡급증이란 식세포가 식작용을 하는 동안 혹은 다른 물질들에 의해서 자극받았을 때 산소 소비량이 증가함과 동시에 O₂ ^-, OH^-, H₂O₂와 같은 산소라디칼(reactive oxygen intermediates, ROIs)을 다량으로 방출하는 현상을 말하며, 이러한 ROIs는 병원체를 죽이는데 매우 중요한 역할을 한다(Siwicki, 1994).

도 8은 감태발효 사료첨가물이 첨가된 실시예 2 내지 4 및 비교예 1의 사료의 급이에 의한 넙치의 호흡 급증 활성을 나타낸 것으로, 식세포의 호흡급증활성은 Secombes(1990) 방법에 따라 분석하였는데, 비교예 1의 사료 급이구 보다 실시예 2 내지 4의 사료 급이구에서 높은 값을 나타내었으며, 특히 감태발효 사료첨가물이 2% 및 4% 첨가된 실시예 3 및 실시예 4의 사료 급이구는 감태발효 사료첨가물이 첨가되지 않은 비교예 1의 사료 급이구와 비교하여 식세포의 호흡급증활성이 유의적으로 높았다.

또한 라이소자임은 세균벽의 아세틸뮤람산(N-acetylmuramic acid)과 아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine) 사이의 베타-1,4결합을 분리하여 세균을 사멸시키는 효소로 그람양성균에 대한 항체 및 보체 활성을 증가시켜주고, 식세포의 식작용을 증가시킨다고 보고되어 있다(Canfield 등, 1974).

도 9는 실시예 2 내지 4 및 비교예 1의 사료의 급이에 의한 넙치의 혈청 라이소자임 활성을 나타낸 것으로서, 식세포 호흡급증 활성 결과와 마찬가지로 라이소자임 활성도 실시예 2 내지 4의 사료 급이구에서 비교예 1의 사료 급이구 보다 유의적으로 높은 값을 나타내었다.

이상의 결과로부터 감태발효 사료첨가을 포함하는 사료를 급이하면 넙치의 면역력을 높여 어병을 억제할 수 있을 것임을 알 수 있다.

<실시예 5 내지 7 및 비교예 2>

다음으로, 까막전복의 급이용 사료는 본 발명의 실시예 1의 감태발효 사료첨가물을 각각 2 중량%, 4 중량% 및 6 중량% 첨가시켜 실시예 5 내지 7을 제조하였으며, 감태발효 사료첨가물을 포함하지 않는 기초사료를 비교예 2로 하였으며, 표 6은 실시예 5 내지 7 및 비교예 2의 조성표이다.

즉, 주요 단백질원으로 카제인을 사용하였으며, 탄수화물원으로는 덱스트린을, 지질원으로는 어유와 콩기름을 이용하여 조절하였으며, 탄수화물의 조성을 조절하기 위하여 밀가루를 첨가하였다.

함량 : 중량%
성분	비교예 2	실시예 5	실시예 6	실시예 7
어분	15.5	15.5	15.5	15.5
덱스트린	25.0	25.0	25.0	25.0
밀가루	6.5	4.5	2.5	0.5
카제인	20.0	20.0	20.0	20.0
알긴산 나트륨	23.0	23.0	23.0	23.0
미네랄	4.0	4.0	4.0	4.0
비타민	2.0	2.0	2.0	2.0
콜린	0.5	0.5	0.5	0.5
콩기름	1.5	1.5	1.5	1.5
어유	2.0	2.0	2.0	2.0
실시예 1의 감태발효 사료첨가물	0	2.0	4.0	6.0
합계	100	100	100	100

실험에 사용된 까막전복은 제주특별자치도 제주시 부근 양식장에서 구입하여 사용하였다. 까막전복의 경우 평균 각장 3.8±0.2cm, 각폭 2.5±0.2cm, 전중량 6.4±0.1g인 개체를 사용하였다. 실험 전복은 미리 18±0.3℃에서 1주 동안 사육하며 순치시킨 후 순환여과가 가능한 수조를 제작하여 사육하였다. 이때 염분은 약 33.5‰을 유지하였고, PVC 파이프(Φ 20cm, L 20cm)를 세로로 절단한 은신처(Shelter)를 넣어서 공기를 공급하였다. 예비사육기간에 먹이는 생미역을 전복체중의 2%를 공급하였으며, 실험 수조마다 80마리의 까막전복을 넣어 실험하였고, 사료를 공급한 직후를 0주로 정하여 0, 1, 2, 3, 4, 8 및 12주째에 각각 3마리의 까막전복으로부터 혈구와 아가미 조직, 간 부위를 채취하여 -70℃로 보관하면서 분석에 사용하였다.

표 7은 실시예 5 내지 7 및 비교예 2의 사료의 급이에 의한 까막전복의 생존율을 나타낸 것으로, 사육 2주까지 100%의 생존율을 보이다가 3주째에 비교예 2의 사료를 급이한 대조구와 실시예 5의 사료의 급이구에서 폐사한 개체가 발생하였으며, 실시예 6 및 7의 사료 급이구에서는 사육기간 동안 전혀 폐사가 일어나지 않았다.

사육 기간(주)	비교예 2	실시예 5	실시예 6	실시예 7
0	100	100	100	100
1	100	100	100	100
2	100	100	100	100
3	94	94	100	100
4	94	94	100	100
8	94	94	100	100
12	92	92	100	100

도 10은 실시예 5 내지 7 및 비교예 2의 사료의 급이에 의한 까막전복의 성장율을 성장 기울기로 나타낸 것으로서, 비교예 2 사료의 급이구 보다 실시예 5 내지 7 사료의 급이구에서 기울기의 값이 높았으며, 특히 감태발효 사료첨가물이 2% 첨가된 실시예 5 사료의 급이구(y=0.2981x+6.3299)에서 가장 높은 성장 기울기를 나타내었다.

이상의 결과로 본 발명의 감태발효 사료첨가물을 포함하는 사료를 전복의 사육용 사료로 사용하면 전복의 성장을 촉진할 수 있음을 알 수 있다.

림프구는 백혈구의 일종으로서 면역기능을 담당하는 세포이다. 림프구는 골수 내에서 조혈간세포로부터 만들어져 림프아구(芽球)가 되고 성숙하여 B림프구로, 일부는 흉선을 통해서 T림프구가 되며 순환계 및 2차 림프계 조직에 분포한다. B림프구는 필요에 따라 형질세포 등의 분비세포로 변화해서 면역글로불린(항체글로불린)을 분비하여 침입하는 항원에 대항하며, T림프구는 투베르쿨린반응과 같은 지연형 알레르기 반응, 이식면역, 목표가 되는 세포를 공격하는 작용을 하며, 동시에 B림프구의 조절 기능도 가진다. 생체에 유해한 항원물질이 침입하면 림프구는 분열하여 수를 늘려 가면서 T림프구와 B림프구의 협력으로 항원물질을 무해한 것으로 한다.

표 8은 실시예 5 내지 7 및 비교예 2의 사료의 급이에 의한 까막전복의 혈림프구수의 변화를 나타낸 것으로서, 까막전복 사육기간 중에 비교예 2의 사료 급이구에 비하여 실시예 5 내지 7의 사료 급이구에서 대체로 혈림프구수가 많았으며, 특히 감태발효 사료첨가물이 2% 및 6% 첨가된 실시예 5 및 실시예 7의 사료 급이구는 사육 8주 및 12주차에 감태발효 사료첨가물이 첨가되지 않은 비교예 2의 사료 대조구와 비교하여 혈림프구수가 유의적으로 높았다.

사육 기간(주)	비교예 2	실시예 5	실시예 6	실시예 7
0	1.53 ± 0.14	1.49 ± 0.14	1.55 ± 0.12	1.58 ± 0.07
1	1.59 ± 0.16	1.65 ± 0.42	1.70 ± 0.05	1.74 ± 0.07
2	1.50 ± 0.13	1.59 ± 0.12	1.60 ± 0.42	1.55 ± 0.39
3	1.49 ± 0.05	1.55 ± 0.05	1.58 ± 0.05*	1.50 ± 0.11
4	1.50 ± 0.24	1.55 ± 0.13	1.45 ± 0.02	1.56 ± 0.12
8	1.34 ± 0.07	1.42 ± 0.10*	1.40 ± 0.07	1.41 ± 0.02*
12	1.29 ± 0.07	1.38 ± 0.10*	1.35 ± 0.07	1.35 ± 0.02*
*p<0.05

이상의 결과로부터 감태발효 사료첨가물은 까막전복의 생리활성을 높일 수 있는 기능성 사료첨가제로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있다.

최근 양식 산업의 급속한 발달로 물리 화학적 스트레스에 의한 양식 생물의 질병이나 스트레스 등에 관한 많은 연구가 이루어지고 있으며, 이러한 연구들은 양식 산업에 많은 도움을 주고 있다. 그러나 이러한 연구의 대부분이 어류에 국한되어 지고 있으며, 전복 등과 같은 패류에 관한 연구는 일부만 이루어지고 있는 실정이다.

어류 및 패류가 스트레스를 받으면 질병에 대한 내성을 감소시키고, 성장률의 감소, 먹이 섭취율의 감소 그리고 호흡대사율의 변화를 유발한다고 알려져 있다. 그러나 이러한 연구는 양식 산업을 위한 기초연구에 그치고 있어 패류의 스트레스에 대한 생리학적인 반응 및 적응 메카니즘을 이해하기에는 부족한 점이 많다.

최근 제주도는 수온이 25.3℃, 염분농도가 27.8‰로 나타나고 있어 염분농도 33.0‰에 적응된 수산생물의 경우 저염분(25.0‰) 상태가 되면 삼투압 변화를 초래해 활력이 떨어지고 심하면 폐사로 이어진다.

따라서, 본 실험예에서는 까막전복에 급격한 저염분(25.0‰) 스트레스 자극-실험군을 저염분(25.0‰) 수조에서 48시간 동안 방치하면서 실시예 5 내지 7 및 비교예 2의 사료 급이에 따른 전복의 생존율 및 생리활성 증대 여부를 조사하였다.

표 9은 저염분 스트레스에 따른 까막전복의 생존율에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 저염분 스트레스를 가한 후 24시까지 실시예 5 내지 7 및 비교예 2의 사료 급이구 전체에서 폐사가 없었으고, 48시간 후에는 전 실험구에서 폐사가 일어났으나, 감태발효 사료첨가물이 6% 첨가된 실시예 7의 사료 급이구에서는 96.3%의 가장 높은 생존율을 나타내었다.

시간(hr)	비교예 2	실시예 5	실시예 6	실시예 7
0	100	100	100	100
3	100	100	100	100
6	100	100	100	100
12	100	100	100	100
24	100	100	100	100
48	74.1	77.8	70.4	96.3

일반적으로 스트레스를 받게 되면 생체내의 활성산소가 발생하는데, 이들 활성산소는 생체내에서 다른 물질과 결합할려는 화학적 산화력이 강해서 세포나 기관의 막을 공격하여 세포의 기능을 손상시키는 것으로 알려져 있다. 이런 활성산소에 대하여 체내에서는 항산화효소인 슈퍼옥사이드 디스무타제(Superoxide dismutase, SOD) 및 카타라제(Catalase, CAT) 등을 생성하여 세포기능 손상을 방지한다.

도 11은 저염분 스트레스 자극에 대한 까막전복의 SOD 활성에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 저염분의 자극에 따른 SOD의 활성은 스트레스를 가하기 전인 0시간째의 실험구와 비교하여 염분 스트레스를 가한 후 48시간이 지난 후 모든 급이구의 실험군에서 큰 차이를 나타내지 않았다.

도 12는 저염분 스트레스 자극에 대한 까막전복의 카타라제(CAT) 활성에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 실시예 5 내지 7의 사료 급이구 모두 48시간 염분 스트레스를 받은 후에도 실험개시 전의 수치와 유사한 수치를 나타내었으나, 비교예 2의 사료 대조구는 높은 수치를 나타내었다.

이러한 결과는 감태발효 사료첨가물의 첨가에 의해 외부 스트레스 작용에 대한 생체내의 항산화 효소 활성의 변화가 없어지게 되고 외부 환경에 대한 덜 민감하여 생리적으로 건강한 전복을 생산할 수 있음을 알 수 있다.

이상에서와 같이 본 발명은 비록 상기의 실시 예에 한하여 설명하였지만 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다.

도 1은 본 발명의 실시예 1인 감태발효 사료첨가물의 제조공정을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 실시예 1 및 미발효 감태가공부산물의 항산화 활성 실험 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 실시예 1 및 미발효 감태가공부산물의 면역증진효과(T 세포 증식효과) 실험 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 실시예 1 및 미발효 감태가공부산물의 세포보호 효과 실험(세포 생존율) 결과 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 실시예 1 및 미발효 감태가공부산물의 세포보호 효과 실험 결과의 현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 6a 및 도 6b는 본 발명의 실시예 1 및 미발효 감태가공부산물의 세포보호 효과 실험으로서 세포 DNA 손상억제 효과 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 실시예 1의 해양세균에 대한 항균 효과를 나타낸 사진이다.

도 8은 본 발명의 실시예 2 내지 4 및 비교예 1 사료의 급이에 의한 넙치의 면역증강 효과(식세포 활성)를 나타낸 것이다.

도 9은 본 발명의 실시예 2 내지 4 및 비교예 1 사료의 급이에 의한 넙치의 면역증강 효과(혈청 라이소자임 활성)를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 실시예 5 내지 7 및 비교예 2 사료의 급이에 의한 까막전 복의 중량변화를 나타낸 것이다.

도 11은 저염분 스트레스 환경에서 본 발명의 실시예 5 내지 7 및 비교예 2 사료의 급이에 의한 까막전복의 항산화 활성(슈퍼옥사이드 디스무타제 활성)을 나타낸 것이다.

도 12은 저염분 스트레스 환경에서 본 발명의 실시예 5 내지 7 및 비교예 2 사료의 급이에 의한 까막전복의 항산화 활성(카다라제 활성)을 나타낸 것이다.

Claims (9)

1. 함수율이 60 내지 70%이고, 감태분말 및 발효균을 포함하는 고형분을 발효시켜 제조한 감태발효체를 포함하는 것을 특징으로 하는 양어용 감태발효 사료첨가물.
2. 제1항의 양어용 감태발효 사료첨가물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
3. 제 2항에 있어서, 상기 사료는 전체사료 중량을 기준으로 상기 양어용 감태발효 사료첨가물을 2 ~ 10 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
4. 감태 또는 감태가공부산물을 준비하는 공정;

   상기 준비된 감태 또는 감태가공부산물을 건조하는 공정;

   상기 건조된 감태 또는 감태가공부산물을 분쇄하여 감태분말을 제조하는 공정;

   상기 감태분말에 발효균을 첨가한 다음, 감태분말 및 발효균을 포함하는 고형분의 함수율이 60 내지 70%이 되도록 물을 첨가하는 공정;

   상기 발효균 및 물이 첨가된 감태분말을 발효하는 공정을 포함하는 감태발효 사료첨가물의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 발효균은 바실러스(Bacillus) 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 단독 또는 혼합 고온내성 발효균인 것을 특징으로 하는 감태발효 사료첨가물의 제조방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 4항에 있어서, 상기 발효균 및 물이 첨가된 감태분말을 발효하는 공정에서 발효 온도는 80 ~ 100℃인 것을 특징으로 하는 감태발효 사료첨가물의 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 발효균 및 물이 첨가된 감태분말을 발효하는 공정에서 발효 시간은 5 내지 7시간인 것을 특징으로 하는 감태발효 사료첨가물의 제조방법.

Images