JPS6176420A - 膜多糖およびその製造方法 - Google Patents
膜多糖およびその製造方法Info
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- JPS6176420A JPS6176420A JP60198699A JP19869985A JPS6176420A JP S6176420 A JPS6176420 A JP S6176420A JP 60198699 A JP60198699 A JP 60198699A JP 19869985 A JP19869985 A JP 19869985A JP S6176420 A JPS6176420 A JP S6176420A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、細菌由来の膜プ[−1テAグリカンから得ら
れる低分子量(約90,000)の多糖およびその製造
法ならびにその薬剤、特に免疫刺激剤、特にNK(ナヂ
ュラルキラー)細胞を活性化する免疫刺激剤としての使
用法およびワクチン中のアジコバン1〜としての使用法
に関する。
れる低分子量(約90,000)の多糖およびその製造
法ならびにその薬剤、特に免疫刺激剤、特にNK(ナヂ
ュラルキラー)細胞を活性化する免疫刺激剤としての使
用法およびワクチン中のアジコバン1〜としての使用法
に関する。
(従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕
1978年12月19日の出願にががるフランス特許7
8/35649号は、莢膜に包まれておらずかつ非病原
性のklel)siella pneuIIlonia
eバイオタイプaの突然変異株から単離した毒性を除去
した膜プロテオグリカンについて記載している。このプ
ロテオグリカンは2,000,000ダルトンを超える
分子量を有し、これと組合される抗原に対する抗体産生
において特徴的なアジュバント特性を発揮する。
8/35649号は、莢膜に包まれておらずかつ非病原
性のklel)siella pneuIIlonia
eバイオタイプaの突然変異株から単離した毒性を除去
した膜プロテオグリカンについて記載している。このプ
ロテオグリカンは2,000,000ダルトンを超える
分子量を有し、これと組合される抗原に対する抗体産生
において特徴的なアジュバント特性を発揮する。
その反面このプロテオグリカンは有意な程度のNKII
II胞刺激活竹を右していない。ワクモレ処方にJ3け
るイのアジコバン1〜どしての語例が記載されでいる。
II胞刺激活竹を右していない。ワクモレ処方にJ3け
るイのアジコバン1〜どしての語例が記載されでいる。
1982年3月9[1出W1にかかるフランス1、′l
訂第82103921弓は、1−記ブ1]テAグリカン
からリゾ1−ムの作用を介して分子量200.000・
−、40+1.00flダル1〜ンのブ[I′7″Aグ
リカン画分をq 3iL 、)るIノを人について記載
している。このプロテオグリカン画分は、内生インタフ
1【−1ンの誘起を介しく’ N K細胞を強く刺激す
るという新規4【特f1を411. Tいる。
訂第82103921弓は、1−記ブ1]テAグリカン
からリゾ1−ムの作用を介して分子量200.000・
−、40+1.00flダル1〜ンのブ[I′7″Aグ
リカン画分をq 3iL 、)るIノを人について記載
している。このプロテオグリカン画分は、内生インタフ
1【−1ンの誘起を介しく’ N K細胞を強く刺激す
るという新規4【特f1を411. Tいる。
その反面この両分は上記87竹を除去したゾn −>−
Aグリカンが有するアジニ1バント特竹を右し41−い
。
Aグリカンが有するアジニ1バント特竹を右し41−い
。
〔発明の(14成〕
本発明は、特に細菌由来の膜から得られる新規な化合物
に関り゛る。それは分子量が80.000−・100、
0(+(lダルトンであり、凍結乾燥した状態τ゛次の
組成を有するものである。
に関り゛る。それは分子量が80.000−・100、
0(+(lダルトンであり、凍結乾燥した状態τ゛次の
組成を有するものである。
ガラク1〜−ス成分 66」6%ガラク1〜−
ス以外の ヘキソース成分 〈1% へ4−ソリーミン (グルコ4ノミン)成分 85+2% アミノ酸成分 5±2% 脂肪酸成分 〈1% 核酸成分 < 0.005%タン白
質成分 〈0.3%細菌の可溶性膜プロ
テオグリカンから得Iここの新規な多糖の特徴は、その
低い分子1 (9,000:+−10,000)および
その特殊な組成である。実質的にそれはただ1つずつの
ヘキソース、ガラク1−−ス。
ス以外の ヘキソース成分 〈1% へ4−ソリーミン (グルコ4ノミン)成分 85+2% アミノ酸成分 5±2% 脂肪酸成分 〈1% 核酸成分 < 0.005%タン白
質成分 〈0.3%細菌の可溶性膜プロ
テオグリカンから得Iここの新規な多糖の特徴は、その
低い分子1 (9,000:+−10,000)および
その特殊な組成である。実質的にそれはただ1つずつの
ヘキソース、ガラク1−−ス。
ヘキソザミン、グルコリ−ミンを含みこれらに分析され
たアミノ酸に対応するペプチドが結合している。またこ
の多糖は脂肪酸、核酸お」:びタン白質が実質上取除か
れており、明瞭に定義される成生物であり、その構造も
特定することが可能であった。
たアミノ酸に対応するペプチドが結合している。またこ
の多糖は脂肪酸、核酸お」:びタン白質が実質上取除か
れており、明瞭に定義される成生物であり、その構造も
特定することが可能であった。
過ヨウ素酸化、メチル化、質吊分析どガスクロマ1−グ
ラフィーの組合せ、NMR等の古Q的方法によりこの多
糖の構造を研究した結果、その構成成分の配列がより正
確に判った。
ラフィーの組合せ、NMR等の古Q的方法によりこの多
糖の構造を研究した結果、その構成成分の配列がより正
確に判った。
= 7 −
その結果はこの多糖が次の構造を有り−るモノマ一単位
の反復結合からなることを示している。
の反復結合からなることを示している。
[(3−Gal、 −(1=+3)−Gal、、
−(1→3)−Galp =(1−) 3)−Gal
p−(1−13)−Gal、 −(1−) 3)−G
al。
−(1→3)−Galp =(1−) 3)−Gal
p−(1−13)−Gal、 −(1−) 3)−G
al。
−(1→3) ] Gal (1→↑
G a I p
ただしQ a l (−ガラク1〜フラノースGal、
−ガラク1−ピラノース (α型おJ:σβヤ) この七ツマ−4M ’14 t、L次の構造式に相当す
る。
−ガラク1−ピラノース (α型おJ:σβヤ) この七ツマ−4M ’14 t、L次の構造式に相当す
る。
■
○
一
上記多糖は種々のli法にJζつで!A 造’Uること
ができる。
ができる。
本発明にJ:れば、細菌の膜多糖を調整Jる好ましい方
法は次の二F稈を含む。
法は次の二F稈を含む。
a)ダラム陰↑Il菌の株から出発し、水溶1!1.−
、/nnアダリカンをイの膜から抽出するf稈b)
該水溶性ブ1]アオグリカンから分子部が80、000
と100,000どの間の多糖を1.li ldlする
T稈 C)所望により該11i filされた多糖の画分から
クン白質を除去り−ることにより該甲離された多糖を精
製づ゛る1稈 使用可能なグラlい陰性菌どしては、l、:どえぽクン
、ノーショプル、ド、クルヂコール、ド、ミクロオルガ
ニズム(Col lec目on tJationale
を昆Cu1ture de Hicroorgani
smes (CN CM ) )に寄託番号145−1
−I Pとして寄託され(いる。
、/nnアダリカンをイの膜から抽出するf稈b)
該水溶性ブ1]アオグリカンから分子部が80、000
と100,000どの間の多糖を1.li ldlする
T稈 C)所望により該11i filされた多糖の画分から
クン白質を除去り−ることにより該甲離された多糖を精
製づ゛る1稈 使用可能なグラlい陰性菌どしては、l、:どえぽクン
、ノーショプル、ド、クルヂコール、ド、ミクロオルガ
ニズム(Col lec目on tJationale
を昆Cu1ture de Hicroorgani
smes (CN CM ) )に寄託番号145−1
−I Pとして寄託され(いる。
可溶性プロテオグリカンは公知技術特にフランス特11
第78/3564’)号に記載された方法にJ:す、1
−1られた粗膜プロテオグリカンを可溶化することにJ
=つC調整することが望ましい。この方法は数度の遠心
分離を行うことによって基礎細胞調整物から膜を除去す
るものである。
第78/3564’)号に記載された方法にJ:す、1
−1られた粗膜プロテオグリカンを可溶化することにJ
=つC調整することが望ましい。この方法は数度の遠心
分離を行うことによって基礎細胞調整物から膜を除去す
るものである。
こうしC得られた粗プロテAグリカンを塩基、特に水酸
化アルカリ金属、好ましくは七ル淵度0.3〜1M、θ
fましくは0.5Mの水酸化ナトリウムで処171!−
J−’る。この処迎1ま50℃〜60℃たとえば56℃
で数時間たとえば1時間好ましくは撹拌しながら継続し
て行う。
化アルカリ金属、好ましくは七ル淵度0.3〜1M、θ
fましくは0.5Mの水酸化ナトリウムで処171!−
J−’る。この処迎1ま50℃〜60℃たとえば56℃
で数時間たとえば1時間好ましくは撹拌しながら継続し
て行う。
」−記フランス特許78/35649号に記載された方
法に比べて、この培地は粗プロテオグリカンをより完全
に加水分解させるため塩基性が強い。
法に比べて、この培地は粗プロテオグリカンをより完全
に加水分解させるため塩基性が強い。
過剰な試薬を除去するため、懸澗液は冷却後たとえば塩
酸等の酸で中和し、次いでたとえば60分、 30,0
OOQの遠心力I!1等の方法により不溶+1残基を沈
降させて除去−リ−ることにより清澄なものどする。
酸等の酸で中和し、次いでたとえば60分、 30,0
OOQの遠心力I!1等の方法により不溶+1残基を沈
降させて除去−リ−ることにより清澄なものどする。
可溶(41プ「]テAグリカンを構成するI: i+’
iを採集し凍結乾燥覆る。
iを採集し凍結乾燥覆る。
この」二滴から9両ンノ、 (fracl 1oni口
ion Bocess )好ましくtより1171〜グ
ラフイ一分両(こJ、0所望の分子部を右する細菌山来
膜多糖を中−1!Jる。j> 7串go、ooo−10
0,000の多糖を含むカラム溶離物が1qられる。
ion Bocess )好ましくtより1171〜グ
ラフイ一分両(こJ、0所望の分子部を右する細菌山来
膜多糖を中−1!Jる。j> 7串go、ooo−10
0,000の多糖を含むカラム溶離物が1qられる。
このりo マl−グラフィー分画は5ijpHarO3
OCl−−2F3等の7万[1−ス樹脂を用いて行うこ
とがてきるが、他の万両方法を使用してもJ、い。
OCl−−2F3等の7万[1−ス樹脂を用いて行うこ
とがてきるが、他の万両方法を使用してもJ、い。
本発明の1実施例においては、次にこの多糖を精製J−
ることがでさる。この精製は特にjl!雌1した多糖の
分子部に近い分子Mのタン白質を除去り−ることににつ
て行う。タン白質はたとえば、酵素加水分解、特にブ1
]ディナーぜの作用にJ、る加水分解の後多糖を分画法
好ましくはクロマI〜グラフィー分画により分1Ill
IすることによつC行われる。
ることがでさる。この精製は特にjl!雌1した多糖の
分子部に近い分子Mのタン白質を除去り−ることににつ
て行う。タン白質はたとえば、酵素加水分解、特にブ1
]ディナーぜの作用にJ、る加水分解の後多糖を分画法
好ましくはクロマI〜グラフィー分画により分1Ill
IすることによつC行われる。
次いで多糖を含む両分を収集し、所望により凍結乾燥す
る。凍結乾燥した両分は本発明の多糖を構成する。
る。凍結乾燥した両分は本発明の多糖を構成する。
−12一
本発明はまたこのようなプロテオグリカンを単独でまた
はワクチン剤と組合せて薬剤どして使用する使用に関す
る。
はワクチン剤と組合せて薬剤どして使用する使用に関す
る。
要するに本発明の多糖は免疫刺激特性を有するものであ
り、その主要な特性は次のとおりである。
り、その主要な特性は次のとおりである。
○ 非常に僅小の投与量たるワクチン特にリポソームワ
クチンに対するアジュバント力○ インビトロおよびイ
ンビボにおいてNKI胞を刺激する高い能ノ〕 かくしてマウスのインヒポでのHa+oneVリンパ腫
(Haloney’s lymphoma (Y A
C−1細胞)に対して上記多糖がNK細胞を強く活性化
することが示されlこ。
クチンに対するアジュバント力○ インビトロおよびイ
ンビボにおいてNKI胞を刺激する高い能ノ〕 かくしてマウスのインヒポでのHa+oneVリンパ腫
(Haloney’s lymphoma (Y A
C−1細胞)に対して上記多糖がNK細胞を強く活性化
することが示されlこ。
さらに、ワクチン、特にリポソームワクチンすなわちワ
クチン剤がリポソームからなるワクチンに対するアジコ
バント特性が示されたが、−h記多糖は他のワクチンに
も使用しうるものである。
クチン剤がリポソームからなるワクチンに対するアジコ
バント特性が示されたが、−h記多糖は他のワクチンに
も使用しうるものである。
上記諸性性を考慮に入れると、薬剤どしての組成と使用
投与量は広範囲にわたることは明らかである。NK細胞
の活性化は標的細胞と患者の状態に事実上か21り依存
Jることがある。同様に)′ジコバン1〜の場合【、1
、アジ−1パン1〜とワクヂン剤との比率および投ジノ
品【ま最適条(’1rIll究のみに土って決定するこ
とができる。
投与量は広範囲にわたることは明らかである。NK細胞
の活性化は標的細胞と患者の状態に事実上か21り依存
Jることがある。同様に)′ジコバン1〜の場合【、1
、アジ−1パン1〜とワクヂン剤との比率および投ジノ
品【ま最適条(’1rIll究のみに土って決定するこ
とができる。
尖■L
バイオマスを0.15 M N a Clを含む水冷
したp117の0.O1M+・リス11C1緩衝液に分
散し、次いで細胞壁を破砕するため機械的磨砕1:、
/+)IJる。
したp117の0.O1M+・リス11C1緩衝液に分
散し、次いで細胞壁を破砕するため機械的磨砕1:、
/+)IJる。
細菌分解物を10分間7.500gで遠心分離し、次い
で上清を60分間3+1,000(]で辿心ヅ)−1!
Iる。
で上清を60分間3+1,000(]で辿心ヅ)−1!
Iる。
ペレッ1へを0.15 M N aCl水溶Hbに分
11り4る。得らねた懸濁液を10分間?、 !100
(] Y” 7’l In ’(^澄化し、次い(/1
5分間30,000(3r遠心分1i111リ−る、。
11り4る。得らねた懸濁液を10分間?、 !100
(] Y” 7’l In ’(^澄化し、次い(/1
5分間30,000(3r遠心分1i111リ−る、。
ペレツ1−を蒸溜水中IJ取土げ再ffl 7.50+
10.次いで30,000gの遠心分離にか(Jる。
10.次いで30,000gの遠心分離にか(Jる。
次イテ、1lrl IIG! フ[1”r イン’tr
m ’Ill ’7)体Ji!+ 1/) 1 /
4の無菌然溜水中(二数]げ、懸濁液を10分間7.5
00gで清澄化し、上清を凍結乾燥する。
m ’Ill ’7)体Ji!+ 1/) 1 /
4の無菌然溜水中(二数]げ、懸濁液を10分間7.5
00gで清澄化し、上清を凍結乾燥する。
友隻遺−2
可溶性膜プロテオグリカンの調整
上記凍結乾燥した粗膜プロテオグリカンを 。
N a Ol−l (0,5M )中に分散し56℃で
一時間加水分解する。冷却後懸濁液をl−I CIで中
和覆る。
一時間加水分解する。冷却後懸濁液をl−I CIで中
和覆る。
次いで懸濁液を60分間30,000gで遠心力1li
lI4ることによって清澄化し、上清を収集リ−る。ろ
液IJl凍結乾燥する。
lI4ることによって清澄化し、上清を収集リ−る。ろ
液IJl凍結乾燥する。
実−茄1A
り」トメ」:〜グラフ仁」画による多−W」」I上記凍
結乾燥物を001Mトリスl−I CI緩衝液(pH7
)に溶解し、次いで同じ緩衝液中で平衡化した5epH
arose CL −2B(ス■−デンpltarma
−cia)(特定孔径のアガ[1−スゲル)のカラム(
5Q x 2.6cru )上で最初のクロマ1へグ
ラフィー分画にか【Jる。
結乾燥物を001Mトリスl−I CI緩衝液(pH7
)に溶解し、次いで同じ緩衝液中で平衡化した5epH
arose CL −2B(ス■−デンpltarma
−cia)(特定孔径のアガ[1−スゲル)のカラム(
5Q x 2.6cru )上で最初のクロマ1へグ
ラフィー分画にか【Jる。
第1図はこの段階で19られたクロマ1〜グラフイ一分
#1の1例を示すものであり、多糖のピークの正確4【
局在化が破線で示されでいる。
#1の1例を示すものであり、多糖のピークの正確4【
局在化が破線で示されでいる。
= 15 −
このりt171〜グラム上で、多糖のピ〜り(IC1は
はるかに人きい分子Vのカラl\溶離物のピークli&
h)ら完全に分離してdタリ、多糖の後に溶1ifl
l 7F−る多糖に近い低い分子量を右−リ゛るタン白
質画分の組合せからは不完全に分画している。
はるかに人きい分子Vのカラl\溶離物のピークli&
h)ら完全に分離してdタリ、多糖の後に溶1ifl
l 7F−る多糖に近い低い分子量を右−リ゛るタン白
質画分の組合せからは不完全に分画している。
多糖を含む溶離画分を収集し蒸溜水に対し透析した後凍
結乾燥り″る。
結乾燥り″る。
この両分はまだ僅かに多糖の分子量(70,000−・
100.000)に近い分子量の各種タン白質を含んで
いる。これらタン白質を最後のり[171〜グラフイ一
分画にか【Jる前に酵素の作用により加水分解する。
100.000)に近い分子量の各種タン白質を含んで
いる。これらタン白質を最後のり[171〜グラフイ一
分画にか【Jる前に酵素の作用により加水分解する。
害J1凱A
外ユ留−り≦へ白質の酵素加水分解
上記凍結乾燥物を1.1mM、 EDT、Aを20
mFJ/dの割合で含むpH3の0.01M1−リスl
−I CI緩衝液に溶解する。次にこの溶液にプ[Iデ
プ−IK(Tritiracl+iumアルバムのタン
白質分解酵素)50 #l!F / mQを添加し、撹
拌しつつ37℃で2時間インキコベー1−する。
mFJ/dの割合で含むpH3の0.01M1−リスl
−I CI緩衝液に溶解する。次にこの溶液にプ[Iデ
プ−IK(Tritiracl+iumアルバムのタン
白質分解酵素)50 #l!F / mQを添加し、撹
拌しつつ37℃で2時間インキコベー1−する。
害一旗例5
’t D ? +−グラフィー分両にJ:る多糖の1一
覧1−記タン白質分解によって分子量が減った睨合タン
白質を5ephacryl S−200(ス■−デン
Pl’1arlllac!a ) (所定孔径のポリ
アクリルアミドゲル)上でクロマトグラフィー分画する
ことに、Jこり多糖から分離する。
覧1−記タン白質分解によって分子量が減った睨合タン
白質を5ephacryl S−200(ス■−デン
Pl’1arlllac!a ) (所定孔径のポリ
アクリルアミドゲル)上でクロマトグラフィー分画する
ことに、Jこり多糖から分離する。
第2図はこの段階で得られるクロマ1〜グラフイ一分離
の1例を示す。
の1例を示す。
このクロマ1−グラムにおいて、破線で示J多糖のピー
ク値は実線で示す加水分解されたタン白¥1のピーク値
から今や完全に分離しており、このタン白質のカラムか
らの溶離は多糖に比べて非常に遅れていることが示され
Cいる。
ク値は実線で示す加水分解されたタン白¥1のピーク値
から今や完全に分離しており、このタン白質のカラムか
らの溶離は多糖に比べて非常に遅れていることが示され
Cいる。
純粋な多糖を含む両分を収集し、濃縮し、カッ ゛
トオフしぎい値io、oooダルI・ンの膜を使用して
恭溜水に対し連続的に透析し、0.211の膜で濾過り
−ることによつて滅菌する。
トオフしぎい値io、oooダルI・ンの膜を使用して
恭溜水に対し連続的に透析し、0.211の膜で濾過り
−ることによつて滅菌する。
こうして得られjこ凍結乾燥物は本発明の対象であるK
lebsiella pneumoniaeの多糖を構
成する。
lebsiella pneumoniaeの多糖を構
成する。
に蒲−拠刃
1−作
ウシ胎児自消5%を添加したR P M I 1(i4
0培地1 meにつき107の■常ンウス牌蔵細胞を用
意する。
0培地1 meにつき107の■常ンウス牌蔵細胞を用
意する。
多糖の品を種々に変えてCO2インキ、1ベーター中で
37℃でイン−1−」べ−1・する。
37℃でイン−1−」べ−1・する。
標的細胞としてNK細胞に感受f[を右り−る51CJ
ip、識YAC−I1111胞(71に−リンパ腫)を
用いる。
ip、識YAC−I1111胞(71に−リンパ腫)を
用いる。
]−フ■クター細胞/標的細胞比率200:1゜100
:1,50:17.″4時間インーV−5べ−1・した
時に放出される Crをh1測り”ることによつて標的
細胞の分解を測定寸−る。
:1,50:17.″4時間インーV−5べ−1・した
時に放出される Crをh1測り”ることによつて標的
細胞の分解を測定寸−る。
精−エ
結果はきわめで明らかであり、投与量1110 、/’
mR以十から標的細胞分解率(P< 0.01 )の非
常に顕著な増加を示している。
mR以十から標的細胞分解率(P< 0.01 )の非
常に顕著な増加を示している。
第3図はこの研究におい(4tlられた結果の1例を示
す。
す。
揖−1
動物=44力ないし5力月のCBA/Jマウス標的細胞
:NK細胞に対し感受性を有するYAC−1(マロニー
リンパ腫) NK活性測定の3日前に緩衝生理食塩水0.2d中に5
0μ0の投与量で多糖を腹腔内に注射する。
:NK細胞に対し感受性を有するYAC−1(マロニー
リンパ腫) NK活性測定の3日前に緩衝生理食塩水0.2d中に5
0μ0の投与量で多糖を腹腔内に注射する。
対照マウスに対しては同一条件で生理食塩水のみを与え
る。
る。
牌臓細胞を取出し、上記のにうにXフエクタ−細胞/標
的細胞比率200; 1,100 : 1゜4時間イン
キュベートする。放出された Orをt1測J−ること
により分解した標的細胞の百分比を測る。
的細胞比率200; 1,100 : 1゜4時間イン
キュベートする。放出された Orをt1測J−ること
により分解した標的細胞の百分比を測る。
第4図はこの研究において得られた結果の1例を示す。
火菊」I
芝34 (1’i−乙2■工l(ンー十−4屓1(lS
tr(!ptOcOcclIs l1110jJenQ
SグループAリボソーl\抗原に関する多糖のアジュバ
ント特t’lの1111究例肛−濃 マウスを一定投!−i吊のト月1W1叫皇4!−糺1y
りり19Sリポソームで免疫し、このリポソームにl;
L 14る投しノRの多糖を添加しくおく。次いでFl
、、ISAγノ、にJ、り各リポソームに対する特異的
t1抗体反応を測定り”る。
tr(!ptOcOcclIs l1110jJenQ
SグループAリボソーl\抗原に関する多糖のアジュバ
ント特t’lの1111究例肛−濃 マウスを一定投!−i吊のト月1W1叫皇4!−糺1y
りり19Sリポソームで免疫し、このリポソームにl;
L 14る投しノRの多糖を添加しくおく。次いでFl
、、ISAγノ、にJ、り各リポソームに対する特異的
t1抗体反応を測定り”る。
対照グループの1つは生理食塩水−(・処理し、他の1
つは標準投与i1の匹101)Siellal)+10
1111011 i a−c−組成プロiAグリカン(
粗MPG)で処理する。
つは標準投与i1の匹101)Siellal)+10
1111011 i a−c−組成プロiAグリカン(
粗MPG)で処理する。
1作
牛後8週間のメスN M l’< 1マウス10匹(゛
9バッヂを用意する。各マウスは15E1間ぐF)回の
注射を受ける。
9バッヂを用意する。各マウスは15E1間ぐF)回の
注射を受ける。
バッチ1:生理食塩水
バッチ2:リポソーム10zzg 1−多糖0.0!i
Z!!1バッチ3: 10f1g +
n O,171gバッチ4: 7/ 10
μg+n O,5μgババッ5:10μg+/+
1.0 μgバッチ6:〃10μCJ+n 2.
5 /1パップ−7: 711071g +r
r 5.0 μQバッチ8 : 11 1
071g + N 10.0 μgパップ9:
u iQμ0+相HPG 15.0μg21日目
に71クスから採血し、E L、 I S A法ににす
5treptococcus pyOgcnesに対す
る抗体の力価を決定する。
Z!!1バッチ3: 10f1g +
n O,171gバッチ4: 7/ 10
μg+n O,5μgババッ5:10μg+/+
1.0 μgバッチ6:〃10μCJ+n 2.
5 /1パップ−7: 711071g +r
r 5.0 μQバッチ8 : 11 1
071g + N 10.0 μgパップ9:
u iQμ0+相HPG 15.0μg21日目
に71クスから採血し、E L、 I S A法ににす
5treptococcus pyOgcnesに対す
る抗体の力価を決定する。
その結果は、血清の最終希釈液はEl−ISA払におい
て正反応を示しCおり、第5図の柱状図として示されて
いる。
て正反応を示しCおり、第5図の柱状図として示されて
いる。
稈−浬
第5図は抗原と組合わされた多糖の投与量の関数として
の特異的な抗体反応のE L、 I S A測定法によ
る測定結果を示す柱状図である 抗原:各注射あたりs、 pyogenes 10 u
Qその結果は多糖2.5μgの投与」は粗MPG15
μq中の投与■に匹敵するアジュバント効果を有するこ
と、すなわら上記条イ′1において6倍の特異的活+1
を右することを示していく)。
の特異的な抗体反応のE L、 I S A測定法によ
る測定結果を示す柱状図である 抗原:各注射あたりs、 pyogenes 10 u
Qその結果は多糖2.5μgの投与」は粗MPG15
μq中の投与■に匹敵するアジュバント効果を有するこ
と、すなわら上記条イ′1において6倍の特異的活+1
を右することを示していく)。
添f−1図面においC1第1図は0.5N N EI
OItで加水分解しl、二10テAグリカンの5cp
haroscCL −、−28j−でのり目7トグラフ
ー(−11111!ilを示4図、第2図はブ[1テイ
ナー1で処理した多糖の5cphacryI S−2
00−Ir(7)りnzhグツフィー曲線を承り図、第
3図はインビl−n (q)N K細胞活性(実施例6
)を承り図、第4図はインじホでのNKI!II胞話t
’J(実施例7)を承り一図、第;−)図(,1実施例
8で得られるIE l。ISA測定法の(1状図4示J
図である。
OItで加水分解しl、二10テAグリカンの5cp
haroscCL −、−28j−でのり目7トグラフ
ー(−11111!ilを示4図、第2図はブ[1テイ
ナー1で処理した多糖の5cphacryI S−2
00−Ir(7)りnzhグツフィー曲線を承り図、第
3図はインビl−n (q)N K細胞活性(実施例6
)を承り図、第4図はインじホでのNKI!II胞話t
’J(実施例7)を承り一図、第;−)図(,1実施例
8で得られるIE l。ISA測定法の(1状図4示J
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、次の定量分析組成を有し分子量が90,000±1
0,000である細菌由来の膜多糖。 ガラクトース成分 66±6% ガラクトース以外の ヘキソース成分 <1% ヘキソサミン (グルコサミン)成分 8.5±2% アミノ酸成分 5±2% 脂肪酸成分 <1% 核酸成分 <0.005% タン白質成分 <0.3%。 2、次のモノマーによって規定されるポリマー構造の多
糖。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ただしGal_f=ガラクトフラノース Gal_p=ガラクトピラノース (α型およびβ型)。 3、該モノマーは次の構造式で表される特許請求の範囲
第2項記載の多糖。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ただしx=1、y=6。 る方法。 a)グラム陰性菌の株から出発し、水溶性プロテオグリ
カンをその膜から抽出する工程 b)該水溶性プロテオグリカンから分子量が80,00
0と100,000との間の多糖を単離する工程 c)所望により該単離された多糖の画分からタン白質を
除去することにより該単離され た多糖を精製する工程。 5、該グラム陰性菌は¥klebsiella pne
umoniae¥である特許請求の範囲第4項記載の方
法。 6、該水溶性プロテオグリカンを得る前記の工程a)に
おいて、粗膜プロテオグリカンを塩基で処理し水溶液中
に存在する可溶性プロテオグリカンを回収する特許請求
の範囲第4項または第5項記載の方法。 7、前記工程a)において使用される塩基は濃度0.3
M−1Mの水酸化アルカリ金属である特許請求の範囲第
4項ないし第6項のいずれかに記載の方法。 8、前記工程b)において、前記多糖はクロマトトグラ
フィー分画により分子量80,000と100,000
との間の多糖を含む溶離画分を収集することによって単
離される特許請求の範囲第4項ないし第7項のいずれか
に記載の方法。 9、前記工程c)において、単離画分中に存在するタン
白質をプロティナーゼの作用によって除去した後クロマ
トグラフィー分画を行い、次いで分子量が80,000
と100,000との間の多糖を含む溶離画分を収集す
る特許請求の範囲第4項ないし第8項のいずれかに記載
の方法。 10)特許請求の範囲第4項ないし第9項のいずれかに
記載の方法により得た細菌由来の多糖。 11)特許請求の範囲第1項、第2項、第3項または第
10項記載の多糖を含む薬剤。 12)さらにワクチン剤を含む特許請求の範囲第11項
記載の薬剤。 13)特許請求の範囲第11項および第12項のいずれ
かに記載の少くとも1種の薬剤を含む薬剤組成および製
薬上受諾可能な担体。
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