KR20120021854A - 악티노마이세템코미턴스 세균유래 암백신 보조제의 효능을 가지는 면역자극인자 아이에스티에프 재조합 단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

악티노마이세템코미턴스 세균유래 암백신 보조제의 효능을 가지는 면역자극인자 아이에스티에프 재조합 단백질 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 A. actinomycetemcomitans 세균유래 암 백신 보조제의 효능을 가지는 면역자극인자 ISTF(Imunostimulating factor) 재조합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 치주질환의 주요 병원성 세균인 Actinobacillus actinomycetemcomitans 으로 부터 비특이적이고 강력한 면역활성능을 나타내는 새로운 면역활성 물질인 ISTF 단백질은 유전자 동정과정을 통해 A. actinomycetemcomitans의 유사 외막단백질(omp-1 like protein)로 확인하였으며, B세포, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(DC, dendirtic cell)와 같은 항원제시세포를 포함한 면역세포에 대한 강력한 면역활성능을 나타낼 뿐만 아니라 종양이 형성된 동물모델로부터 ISTF 단백질을 처리한 수지상세포를 투여한 경우, 처리하지 않은 수지상세포만을 투여한 경우보다 훨씬 우수한 항종양 효과를 나타냄을 확인하였으므로, A. actinomycetemcomitans 세균으로부터 분리한 ISTF 단백질을 이용한 암 백신 보조제로서 생물학적 의약품 소재로 제공되며, 이들의 고부가치 제품을 통해 산업적으로 이용범위를 확대시키고자 이들 ISTF 재조합 단백질의 대량생산을 위한 제조방법에 관한 것이다.

Description

악티노마이세템코미턴스 세균유래 암백신 보조제의 효능을 가지는 면역자극인자 아이에스티에프 재조합 단백질 및 그의 제조방법{ Preparation for recombinant ISTF(Immunostimulating factor) protein to increase anti tumor effect as vaccine adjuvant }
본 발명은 A. actinomycetemcomitans 세균유래 암 백신 보조제의 효능을 가지는 면역자극인자 ISTF (Imunostimulating factor) 재조합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, A. actinomycetemcomitans로부터 강력한 면역활성능을 나타내며, 항종양 효과를 보이는 새로운 ISTF 단백질을 분리정제하였으며, 이들 단백질은 유전자 동정과정을 통해 A. actinomycetemcomitans 세균이 가지는 유사 외막단백질(omp-1 like protein)임을 확인하였으며, 이들 ISTF 단백질은 미생물 유래의 유용성분으로 새로운 생물학적 제재로서 고부가치의 의약품 소재로 제공될 수 있으므로 산업적 활용가치면에서 이들 단백질의 대량화를 위해 암 백신 보조제의 효능을 가지는 ISTF (Imunostimulating factor) 재조합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
백신은 감염에 대항해 장기적인 방어를 제공할 수 있도록 항원에 대한 강한 면역 반응을 생성하도록 하는 것으로 살아있는 약화 백신에 비해 사멸백신은 보조제가 부가적으로 필요한 경우가 있다. 보조제는 예방접종된 항원에 대항하는 특이적 면역반응을 강화하는 화합물로서 보조제라는 단어인 adjuvant에서 왔는데 이는 돕다 또는 강화하다라는 뜻을 갖는다.
보조제(adjuvant)는 다양한 목적으로 사용될 수 있다. (1) 매우 정제된 또는 재조합 항원의 면역성 강화, (2) 보호적인 면역에 필요한 면역의 수 또는 항원량의 감소, (3) 신생아, 노인 또는 면역 손상인들에서의 백신의 능력 개선, (4) 점막에 의한 항원의 수용에 대한 항원 운송 체계 등의 역할을 하게 된다.
보조제(adjuvant)는 원천, 활성, 기전. 또는 물리화학적 특성에 의해 분류될 수 있다. Edelman은 보조제를 세 그룹으로 분류하였는데, (1) 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 물질인 활성 면역 자극제(active immunmostimulant); (2) T 세포를 돕는 면역성 단백질인 운반체(carrier); (3) 면역반응을 자극하는 동시에 항원에 대한 매트릭스로서 오일 유상액이나 리포좀인 수송 보조제(vehichle adjuvant)이다. 그 중 세균유래의 보조제(adjuvant)는 기본적으로 뛰어난 면역자극 능력을 가진 물질들로서 그람음성세균의 세포벽 펩티트글리칸 또는 지질다당류는 그들 자신이 면역성이 강하지는 않지만 공동 조절되는 항원에 대한 면역반응을 강화시킨다. 이 보조제 활성은 숙주면역방어 체계를 활성화시키는 위험 신호를 매개하는 Toll과 같은 수용체의 활성화를 통해 매개된다. 특히 MPL(monophosphoryl lipid A), 지질당(LPS, lipopolysaccharide)처럼 잘 알려진 몇가지 비 경우 보조제 역시 점막보조제로 활동한다. Vibrio cholerae(CT)가 가장 효과적인 점막보조제로 알려져 있는 것들 중의 하나인긴 하지만 독성이 너무 높고 그 자신에 대한 강한 면역반응을 유도하기도 한다.
일반적으로 암백신은 암표면항원, 신호전달물질, 세포사멸인자, 수지상세포(DC), 독성 T 세포(CTL, Cytoxic T lymphocyte), 엔케이 세포(NK, Natural killer), DNA, 사이토카인(cytokine), 항체(antibody) 등을 이용한 각종 암 예방 및 치료백신 등이 해당된다. 암백신 보조제(adjuvant)는 종양을 늦추거나 아예 박멸하는 항암 백신에 대한 가능성이 증가하고 있다. 이러한 백신은 강력한 보조제와 혼합된 종양 성장 인자 수용체, 종양 항원 및 완전한 종양 세포를 활용하게 된다. 자체 분자를 기본으로 한 이러한 백신은 일반적으로 매우 낮은 면역원성을 가지며 따라서 효과적인 보조제에 대한 필요성을 이끌어 낸다.
최근 몇십년간 면역기능에 관한 지식의 공적에도 불구하고 우리는 여전히 80년전 처음 활성이 밝혀진 알루미늄을 기초로 한 화합물의 인간 면역보조제에 거의 전적으로 의지하고 있다. 백신 발달에 있어서 최근의 발전과 특히 재조합 방법으로 합성된 단백질 사용증가는 더 정확한 보조제의 개선에 대한 필요성을 요구한다.
대부분의 백신 회사들은 그들의 독점적 보조제 자료를 비밀로 유지하고 있으므로 아직까지 보조제에 기초한 백신 생성물에 대한 지식들을 공유하지 않고 있는 실정이다.
또한 현재 사용되고 있는 대부분의 백신은 전통적인 제조기술, 즉 바이러스나 세균을 화학약품 처리하여 이들을 불활성화시켜서 만들거나 약독화 시키는 기술이었으나, 생명공학의 발전에 따라 재조합 기술을 이용한 백신(예, B형간염백신)이 이미 산업적으로 생산되어 시판되고 있고, 제조공정 중 중간산물에 대한 품질관리시 돌연변이 모니터링에 생명공학기술이 적용되는 등, 백신의 대량생산, 안전성, 유효성 및 품질관리 측면에서 획기적으로 발전하고 있다. 특히 최근에 선진국에서 개발되어 외국에서 시판되게된 로타넥신이나 개발완료단계에 이른 자궁경부암 예방용 파릴로마바이러스백신의 경우에 각각 재조합바이러스와 재조합 단백질 생산기술로 제조된 인공바이러스 입자 등으로 제조된 면역원이 사용되고 있다.
따라서 본 발명에서는 치주질환의 중요한 병원성 세균인 A.actinomycetemcomitans로부터 유래한 새로운 암백신 보조제를 개발하여 보다 면역세포를 효과적으로 자극하고 종양치료 효과도 매우 우수한 단백질 성분의 백신보조제를 개발하는데 있으며, 이를 상용화하기 위해 대량분리를 위한 재조합 단백질 제조공정을 확립하였다.
이에 본 발명은 그람음성 세균의 일종인 A. actinomycetemcomitans으로 부터 분리한 ISTF 단백질은 유사 외막단백질(omp-1 like protein)로서 면역반응을 매개하는 중요한 면역세포인 항원제시세포(B세포, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(DC, dendirtic cell))를 강력하게 활성화 시키며, 특히 종양세포를 이용한 동물모델로부터 우수한 항종양 치료효과를 나타냄으로서 대장균으로부터 재조합 ISTF 단백질을 대량분리 정제하였고, 이들의 특성을 이용하여 생물학적 의약품 신소재를 개발하여 아직 미흡한 개발단계에 머물고 있는 백신보조제와 관련한 의약품 산업의 소재로 제공하고자 한다.
본 발명은 치주질환의 중요한 병원성 세균인 A. actinomycetemcomitans의 유사 외막단백질(omp-1 like protein)인 ISTF 단백질의 기능을 살펴보면, 항원제시세포(B세포, 대식세포, 수지상세포)의 활성화를 자극하였으며, 이를 이용하여 ISTF 단백질을 처리한 수지상 세포를 종양이 형며, 동물모델에 투여하였을때, ISTF를 처리하지 않은 수지상세포를 투여한 경우에 비해 매우 높은 활성효과를 나타내었으므로, ISTF 단백질은 세균유래의 면역활성물질로서 암백신 보조제로서의 고부가 가치의 생물학적 의약품 소재로서의 효용가치를 제공하는데 있다.
도 1은 A.actinomycetemcomitans로부터 순수 ISTF 단백질 (immunostimulating factor, pure ISTF) 단백질의 분리 및 동정의 흐름도
도 2는 재조합 ISTF (immunostimulating factor, GST-ISTF) 단백질 분리 및 정제과정의 흐름도
도 3은 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 밴드 및 분자량의 확인
도 4는 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 부분적인 아미노산 염기서열(EVLQAIPAQAK)
도 5는 A. actinomycetemcomitans 전체유전자 서열로부터 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자서열을 포함하는 contige 28 유전자 서열 및 아미노산 서열
도 6은 중합효소연쇄반응(PCR)을 통한 반응산물 및 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자 염기서열 (GenBank accession no.: AF321231)
도 7은 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 SDS-PAGE 전기영동 확인
도 8은 웨스턴 블라팅(western blotting)을 통한 64D10 단클론 항체를 이용한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)간의 항원-항체 결합능 확인
도 9는 A. actinomycetemcomitans의 배양액에서 분리 정제한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 림프구 증식능
도10은 기존 A. actinomycetemcomitans의 배양액에서 분리 정제한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 면역세포 활성능 비교
도 11은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 처리에 따른 수지상세포의 성숙(maturation)과정에 미치는 효과
도 12는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의한 수지상세포(DC) 활성화
도 13은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 자극시간에 조건에 따른 IFN-γ를 분비하는 CD8+T 세포의 증식능 확인
도 14는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 자극시간에 조건에 따른 IFN-γ를 분비하는 CD8+T 세포의 증식능
도 15는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극조건에 따른 최적의 수지상세포 활성화를 통한 OVA 종양 세포(EG7)의 세포독성능
도 16은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 최적의 수지상세포를 이용한 항종양동물모델을 이용한 치료효과
도 17은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 따른 최적의 수지상세포를 이용한 항종양동물모델을 이용한 예방효과
본원 발명은 A. actinomycetemcomitans 세균유래 암 백신 보조제의 효능을 가지는 면역자극인자 ISTF (Imunostimulating factor) 재조합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 치주질환의 주요 병원성 세균인 Actinobacillus actinomycetemcomitans 으로 부터 비특이적이고 강력한 면역활성능을 나타내는 새로운 면역활성 물질인 ISTF는 유전자 동정과정을 통해
A. actinomycetemcomitans의 유사 외막단백질(omp-1 like protein)로 확인하였으며, B세포, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(DC, dendirtic cell)와 같은 항원제시세포를 포함한 면역세포에 대한 강력한 면역활성능을 나타낼 뿐만 아니라 종양이 형성된 동물모델로부터 ISTF를 처리한 수지상세포를 투여한 경우 처리하지 않은 수지상세포만을 투여한 경우보다 훨씬 우수한 항종양 효과를 나타냄을 확인하였으므로 A.actinomycetemcomitans 세균으로부터 분리한 ISTF 단백질을 이용한 암백신 보조제로서 생물학적 의약품 소재로 제공되며, 이들의 고부가치 제품을 통해 산업적으로 이용범위를 확대시키고자 이들 ISTF 재조합 단백질 공정과정으로부터 대량생산을 위한 제조방법에 관한 것이다.
이하의 실시 예 및 실험 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정하는 것이 아니며, 여러 가지로 변형이 가능하다.
[실시 예 1] A. actinomycetemcomitans로부터 순수 ISTF (immunostimulating factor, pure ISTF) 단백질의 분리 및 동정
표준균주 A. actinomycetemcomitans ATCC 29522 (ATCC 분양균주)로부터 ISTF 단백질 분리 및 정제과정을 나타낸 것으로 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면,
도 1의 A. actinomycetemcomitans로부터 순수 ISTF (immunostimulating factor) 단백질의 분리 및 동정의 흐름도에서와 같이, A. actinomycetemcomitans ATCC 29522(American Type Culture Collection 분양받음)는 BHI(brain heart infusion)배지를 사용하여 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하였다. 48시간 후, 4℃에서 10,000g에서 30분간 원심분리 하여 상등액은 제거하고 세포만 회수하였다. 회수한 세균세포는 인산완충식염수로 2회 세척한 후, 3차 멸균 증류수로 1회 세척하여 -70℃ 초저온냉동고에 즉시 넣고 사용 전까지 보관하였다. 냉동보관 하였던 균체를 50 mM 농도의 트리스 완충용액 (Tris buffer, pH 7.5)를 사용하여 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기(Fisher 550 sonic dismembrator)를 사용하여 10분 동안 50% pulse mode, 40% power의 조건으로 파쇄하였다. 파쇄되지 않은 세균세포는 5,000g에서 10분간 원심분리하여 제거하였다. 용해되지 않은 세포벽은 100,000g에서 20분간 원심분리하여 제거하고 용해된 상등액만 회수하였다. 용해상태의 분획물은 전칼럼(precolumn)과 ISTF 단백질의 단일클론 항체(64D10 & 75B2)를 사용하여 제작한 면역화 칼럼(immunoaffinity column)에 적용하여 ISTF 단백질을 분리하였다(1).
분리정제한 순수 ISTF 단백질 (pure ISTF) 시료는 280 nm 조건의 자외선 검출기(UV detector)를 사용하여 확인하였으며, 바이오라드 단백질 정량법(Bio-Rad protein assay)으로 단백질을 정량하였다.
분리한 순수 ISTF 단백질((pure ISTF)(1)을 분취형 전기영동(preparative electrophoresis) 방법으로 분자량을 확인한 것으로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면,
면역화 칼럼(immunoaffinity column)에 의해 분리된 ISTF 단백질은 이후, 분취형 전기영동장치(491 Prep Cell)를 사용하여 정제분리하였다. 정제방법은 ISTF 단백질에 대한 단클론항체인 64D10항체가 결합되어 있는 CNBr-activated Sepharose 면역화 컬럼을 인산화완충용액(PBS)로 충분히 세척한 다음, 초음파로 파쇄된 분획물을 전컬럼(precolumn)인 bovine serum albumin-Sepharose 컬럼을 통해 부분정제하여 단백질을 회수하였으며, 이들 단백질 9 mg을 면역화 칼럼에 결합시킨 후,. peristaltic pupm를 사용하여 0.1 M 농도의 인산용액 (phosphoric acid, pH 12.5)을 분당 1ml의 유속으로 컬럼에 적용하여 64D10항체와 결합해 있는 ISTF 단백질을 용출시키고, 용출된 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)에 1/20 부피의 1 M 나트륨인산(sodium phosphate) , pH 6.8 용액을 첨가하여 중화시킨 다음. 1 mM 트리스 완충용액(Tris-Cl)으로 투석(dialysis)하며 원심분리농축기(centriprep concentrator)를 통해 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)을 농축하였다.
이들 정제 분리된 시료는 단백질 환원용 용액(SDS-reducing buffer)와 혼합하여 전기영동 실시 전 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 16.5% 폴리아크릴 아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 사용하여 12W, 50 mA조건에서 전기영동 하였다.
순수 ISTF 단백질((pure ISTF)의 아미노산 조성을 분석한 결과로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면,
전기영동을 통한 얻어진 ISTF 단백질 밴드(band)로부터 순수분리 정제된 ISTF 단백질 시료에 동량의 염산(HCl)을 첨가하고 110℃에서 24시간 끓여 가수분해 시킨 후, Pico-Tag방법을 사용하여 아미노산 분석을 실시하였다.
순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 Q-TOF 질량분석기(Q-Time of Flight Mass Spectrometer)를 통해 아미노산 서열을 분석한 결과로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면,
순수 분리 정제된 ISTF 단백질(pure ISTF)의 아미노산 서열을 분석하기 위한 질량분석기를 이용한 MS/MS 실험은 Q-TOF2 질량분석기(mass spectrometer)와 nano-ESI, coated glass capillary을 사용하여 실시하였다. 이들로부터 확인된 순수분리한 ISTF 단백질((pure ISTF)의 부분적인 아미노산 염기서열을 확보하여 Protein ProSpector 프로그램을 사용하여 이들 일부 아미노산 서열을 유전자(DNA) 염기서열로 재번역(back-translation) 하였다. ISTF 단백질의 부분적인 유전자(DNA) 염기서열을 이용하여 A. actinomycetemcomitans의 전체 유전자 염기서열로부터 ISTF 단백질의 전체 유전자서열을 확인하기 위하여 Oklahoma' Advanced Center (http://www. genome. ou.edu)의 데이터 베이스 및 VectorNTI suite 프로그램을 사용하였다.
A. actinomycetemcomitans로부터 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자 동정을 위한 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chanin reaction) 증폭반응을 확인한 결과로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면,
상기의 과정을 통해 최종 확인된 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자 서열을 A.actinomycetemcomitans의 전체 유전자로부터 동정하기 위해 유전자 분리용 키트(DNA extraction kit) 를 사용하여 A.actinomycetemcomitans에서 제놈(genomic DNA)를 분리하였다. 제놈(genomic DNA)에서 ISTF 단백질의 유전자를 증폭시키기 위해 프라이머(primer)를 양방향으로 제작하였다.
중합효소연쇄반응은 변성과정(denaturation,(95℃, 1분)), 가열냉각(annealing,(55℃, 1분)), 그리고 증폭(extension,(72℃, 1분)) 과정을 30회 반복하여 실시하였다. 마지막 사이클 (cycle)에서 증폭(extension) 단계에서는 72℃, 7분 실시하였다. 중합효소연쇄반응 산물 크기는 대략 576 bp로 예상하였다. 반응 산물을 pGEX-KG 벡터에 클로닝(cloning)하였으며, N말단(N-terminal) 위치에 glutathione-s-transferase (GST) 태그(tag)을 결합하여 재조합 ISTF 단백질이 발현되도록 하였다.
순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자 클로닝(cloning)과정으로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면,
미리 준비한 pGEX-KG 플라스미드(plasmid) 유전자(DNA)와 중합효소연쇄반응 반응산물 각각을 1 의 농도가 되도록 준비한 다음 HindIII 와 BamHI로 반응시켰다. 절단된 pGEX-KG 플라스미드(plasmid)와 ISTF 단백질의 유전자(DNA)를 NuSieve GTG 아가로스 겔 (1%)을 사용하여 분리하였으며, 이들 유전자(DNA)가 포함된 겔 조각을 65℃에서 5분 동안 녹였다. 절단된 pGEX-KG 벡터 유전자(DNA) 15 ng과 ISTF 단백질의 유전자(DNA) 조각 100 ng을 혼합하여 T4 라이게이저(ligase) 400 Unit를 첨가하고, T4 라이게이저 용액 (ligase buffer)이 총 20 ml이 되도록 넣어, 4.5시간 동안 반응하였다. 결합반응(ligation)은 항온수조(water bath)의 41℃에서 실시하였다: 반응액 5 를 E. coli BL21 (DE3) 세균에 형질전환 시키기 위해 사용하였으며, 이 반응액을 엠피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 한천(agar) 배지에 도말하였다. 형질전환체(clone)로부터 ISTF 단백질 유전자(DNA)의 삽입 유무를 확인하기 위해 프라이머(primer)를 사용하여 플라스미드(plasmid) 유전자(DNA)로부터 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자(DNA)가 삽입된 최종 형질전환체(clone)를 엠피실린(ampicillin)이 포함된 LB배지 2 ml에 넣고 37℃에서 5시간 동안 배양 후, 이들로부터 플라스미드(plasmid)를 분리하였으며, 삽입된 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자(DNA) 염기서열을 최종 분석하였다.
[실시 예 2] 재조합 ISTF (immunostimulating factor, GST-ISTF) 단백질 분리 및 정제과정
E. coli 세균에서 재조합 ISTF 단백질의 발현 및 분리정제 과정으로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면, 도 2의 재조합 ISTF (immunostimulating factor) 단백질 분리 및 정제과정의 흐름도에서와 같이,
삽입된 ISTF 단백질 유전자 서열이 100% 일치하는 형질전환체(clone)의 단일 콜로니를 50 /ml 농도의 엠피실린(ampicillin)이 포함된 LB 배지에서 24시간 배양하였다. 배양액을 가온한 LB 배지로 100배 희석 후, 37℃ 진탕배양기에서 교반시켰다. 약 4시간 후, 흡광도 550 nm에서 측정값이 약 1이 되었을 때, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 0.1 mM이 되도록 첨가하였다. 37℃에서 4시간 추가 배양 후, 원심분리(5,000 g, 10분, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 이들 균체는 인산완충식염수로 현탁시킨 후, 0.01 mg/ml 농도의 프로테아제 억제제 고농축액(protease inhibitor stock solution)과 0.1 mg/ml 농도의 라이소자임(lysozyme)를 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시키고, 0.1% 트리톤(triton) X-100을 첨가하여 4℃에서 초음파 파쇄하였다. 파쇄 후, 10 /ml 농도의 디엔나아제(DNase)와 알엔나아제(RNase), 그리고 1 mM DTT (dithiothreitol)를 첨가하여 4℃에서 20분 동안 반응하였다. 원심분리(14,000 g, 10분, 4℃)하여 균체 일부는 제거하고, 상등액을 회수하였다. 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 정제하기 위하여, 수용성(soluble) 단백질을 인산완충식염수에 50% 의 농도로 현탁한 글루타치온 아가로스 비드(glutathione agarose bead)에 첨가하여 30분 동안 실온에서 회전시켰다. 교반 후 비드(bead)는 찬 인산완충식염수로 3회 세척 후, 재조합 단백질은 비드(bead)의 1배 부피의 글루타치온 용출 용액(glutathione elution buffer, 50 mM tris-HCl, pH 8.0, 10 mM reduced glutathione)를 첨가하여 실온에서 30분 동안 회전하여 분리하였으며, 이 완충을 3회 반복하였다.
최종 분리한 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 농도는 바이오라드 단백질 정량(Bio-Rad protein assay)을 위한 반응액을 사용하여 측정하였으며, SDS-PAGE 전기영동으로 확인하였다. 또한 나이트로셀룰로스(nitrocellulse membrane)에서 단백질 밴드(band)와 ISTF 단백질의 단일클론 항체(64D10)를 결합시키고, 이를 goat anti-mouse HRP conjugate와 반응시켜 ECL kit으로 확인하였다.
[실시 예 3] 순수 ISTF 단백질 (pure ISTF) 및 재조합 ISTF(GST-ISTF) 단백질의 면역세포 활성능 평가
A. actinomycetemcomitans로부터 분리한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF (GST-ISTF) 단백질의 림프구 증식반응을 확인하는 과정으로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면,
A. actinomycetemcomitans로부터 분리정제한 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 E. coli로부터 얻은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 림프구 활성능을 측정하기 위하여 BALB/c 마우스의 비장을 무균적으로 분리 후, 멸균된 스테인레스 스틸 스크린(stainless steel screen)을 사용하여 단일 세포를 분리하였다.
적혈구는 NH4Cl 용액을 첨가하여 파괴시켰다. 증식반응을 평가하기 위해, 단일 세포 부유액은 세포배양액(RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum, 50 mM 2-mercaptoethanol, 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin)에 현탁시킨 후, 바닥이 평평한 96 well 세포배양용기에 분주하고 대조군 자극제 (ConA; 1 mg/ml, LPS; 10 mg/ml), GST 단백질 (1.6 ), 순수 ISTF 단백질(15?480 nM), 재조합 GST-ISTF 단백질(0.025?1.6 )을 첨가하여 3일 동안 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 이때, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)과 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)은 농도 의존적으로 배양하였다. 배양중인 세포에 0.5 mCi of 3H-thymidine를 배양과정의 마지막에 처리하여 6시간 동안 반응시켰다. 배양 세포는 자동세포 회수기(automatic cell harvester) 을 사용하여 회수하여 β scintillation counter 장치로 분석하였다.
A. actinomycetemcomitans로 부터 분리한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF (GST-ISTF) 단백질의 B 세포 활성능을 확인하는 과정으로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면, B 세포는 C57/BL6 마우스의 비장림프구에서 분리 후, 대조군 자극제(ConA; 1 mg/ml, LPS; 10 mg/ml), GST 단백질 (1.6 ), 순수 ISTF 단백질(15?480 nM), 재조합 ISTF 단백질(0.025?1.6 )을 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포를 회수 후, 마우스 Thy-1.2 (HO-13-4) 단클론항체를 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 세포를 원심분리하여 항체를 제거하고, Low-Tox-M Rabbit complement (Cedarlane)를 첨가 후, 37℃에서 45분 동안 반응시켰다. 살아남은 세포를 세척하고, 현탁 과정을 거친 후, Sephadex G-10 컬럼에 주입하였다. 첫 번째로 흘러나온 세포는 complete 배지로 현탁, 24 well 배양용기에 분주 후 자극물질을 처리하여 24시간 동안 반응시켰다. 세포에 희석한 항체(FITC 형광염색 dye와결합해 있는 마우스 유래 CD86 (B7-2), MHC class Ⅱ (I-A/I-E), CD40 항체)를 5?20 /ml의 농도로 처리하고 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 모든 반응액은 2% FBS가 포함된 인산완충식염수를 사용하여 각 염색단계의 세척과정에 사용하였다. 염색된 세포는 형광세포분석기(flow cytometer)를 사용하여 분석하였다.
A. actinomycetemcomitans로부터 분리한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF (GST-ISTF) 단백질의 대식세포(macrophage) 활성능을 확인하는 과정으로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면, 마우스유래 대식세포주인 Raw264.7 세포, 사람의 단핵구 유래 세포주인 THP-1 세포와 U373 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 이들 세포는 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum (FBS), 50 U/ml의 페니실린/트렙토마이신 (penicillin/ streptomycin) 항생제를 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 재조합 ISTF 단백질에 의한 대식세포의 활성능을 확인하기 위해 Raw 264.7 세포주를 사용하였으며, 순수 ISTF 단백질(15?480 nM) 및 재조합 ISTF 단백질(0.025?1.6 ) 처리에 따라 세포배양 상등액으로 분비되는 NO(Nitric oxide)량을 Griess 시약반응을 사용하여 측정하였다.
A. actinomycetemcomitans로부터 분리한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF (GST-ISTF) 단백질의 수지상세포(dendiritic cell) 활성능을 확인한 과정으로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면, 마우스 유래 수지상세포(dendritc cell, DC)는 7주령된 C57BL/6 암컷 마우스의 골수세포를 분리하여 분화시켰다. 골수세포는 20 ng/ml GM-CS와 10 ng/ml IL-4이 포함된 Opti-MEM 배지에서 배양하였다. 분화조건은 5×105 cells/ml 이 되도록 24 well 배양용기에서 7?8일 동안 배양하였다. 순수 ISTF 단백질(15?480 nM) 및 재조합 ISTF 단백질(0.025?1.6 ) 처리에 수지상세포의 활성능을 확인하기 위해 수지상세포(DC)의 보조자극인자(costimulatory mouleules)의 발현을 형광세포분석기(flow cytometer)를 통해 확인하였다. 세포에 희석한 항체(FITC 형광염색 dye와결합해 있는 마우스 유래 CD86 (B7-2), MHC class Ⅱ (I-A/I-E), CD40 항체)를 5?20 /ml의 농도로 처리하고 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 모든 반응액은 2% FBS가 포함된 인산완충식염수를 사용하여 각 염색단계의 세척과정에 사용하였다. 염색된 세포는 형광세포분석기(flow cytometer)를 사용하여 분석하였다.
[실시 예 4] 재조합 ISTF (immunostimulating factor, GST-ISTF) 단백질의 암 백신 보조제로서의 효능 평가
재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 처리한 수지상세포를 이용한 항종양 효과를 확인한 과정으로, 이를 더욱 상세하게 단계별로 설명하면, 실험동물로는 암컷 6?8주령 C57BL/6 (H-2b) 정상마우스(평균체중 21±2 g)를 사용하였으며, 종양모델에 사용한 세포주는 OVA 단백질의 유전자가 삽입되어 있는 EG7 세포를 사용하였다. 이들 세포는 2mM 글루타민(glutamine), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 항생제와 10% 소태아혈청(FBS)를 함유한 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
수지상세포(DC)는 7주령된 C57BL/6 암컷 마우스에서 분리하였다. 즉 골수에서 분리한 단일세포를 20 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4이 포함된 Opti-MEM배지에 현탁시켜 24 well 배양용기에 2×105 cells/well이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 8일동안 배양하였다.
OVA 단백질과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 다양한 조건의 조합으로 처리하여 수지상세포(DC)를 분화 및 성숙과정(maturation)을 유도하였다. 재조합 ISTF 단백질 자극에 따른 최적의 활성능을 가지는 수지상세포의 조건을 확인하기 위해 OVA 단백질 종양항원의 유무에 따라 LPS(1/ml) 또는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)(1.6 )을 8, 16, 24 시간 전에 배양 배지에 첨가하여 수지상세포(DC)에 처리하였다. 이후 이들 세포를 회수하여 인산완충식염수로 3회 세척 후 LPS (1 /ml)로 24시간 동안 처리하여 재자극시킨 다음 배양 상등액으로부터 IL-12 사이토카인 분비능을 ELISA 키트를 사용하여 확인하였다.
1) 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의한 수지상세포의 최적 활성능
재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의한 수지상세포의 최적 활성능을 확인하기 위해 세포내 사이토카인 IFN-γ의 동역학적(kinetic) 변화를 측정하였다. OVA 단백질 종양항원을 이용하여 수지상세포(DC)의 펄스(pulsing) 및 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 자극에 따른 사이토카인의 동역학적(kinetic) 변화도 함께 측정하였다. OVA 단백질 종양항원을 처리한 수지상세포(DC)에 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극하여 활성화된 수지상세포(DC)를 C57BL/6 마우스의 피하에 매일 1회, 3주동안 주사하였다. 3차 면역화한 다음 7일 후, 비장세포를 분리하여 이들 세포에 OVA 단백질 종양항원(0.4 mg/ml)를 5일 동안 처리하여 재자극 시켰다. 세포에 인산완충식염수를 첨가 후 원심분리(300 g, 5분, 4℃)하여 1×106 의 비장세포를 회수하였다. 회수한 세포에 인산완충식염수를 넣고 차게 준비한 고정용액 (0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) + 4% paraformaldehyde)를 넣고 현탁하였다. 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 세포에 1 ml permeabilization 용액을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 인산완충식염수로 세척하였다. 표지된 항체(FITC 형광dye가 결합된 마우스 유래 인터페론 감마(IFN-γ)와 PE형광 dye가 결합된 CD8 항체)를 염색용 용액(staining buffer)로 적당히 희석하여 세포에 첨가 후, 30분 동안 반응하였다. 세포는 염색용 용액(staining buffer)으로 3회 세척 후, 형광세포분석기(flow cytometer)로 세포내 인터페론 감마(IFN-γ) 사이토카인 변화를 분석하였다.
2) 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 수지상세포(DC)에 의한 세포독성(cytotoxicity) 효과
또한, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 수지상세포(DC)에 의한 세포독성(cytotoxicity) 효과를 확인하기 위하여 OVA 단백질 종양항원을 처리한 수지상세포(DC)에 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극하여 활성화된 수지상세포(DC)를 C57BL/6 마우스의 피하에 매일 1회, 3주동안 주사하였다. 면역화된 동물에서 획득한 비장으로부터 림프구를 분리하여 3×106/ml의 농도로 배양배지에 현탁하고 OVA 단백질 종양항원을 첨가하여 24 well 배양용기에서 5일간 추가배양 하였다. 배양 5일 후, 51Cr으로 표지한 target 세포와 각 조건별로 면역화하여 분리한 림프구(effector 세포)를 37℃에서 4시간동안 함께 배양한 다음 51Crrelease assay법을 표준으로하여 측정하였다. 즉 target 세포는 51Cr로 표지하고, OVA 단백질 종양항원을 펄스하지 않은 조건(unpulse) 또는 재조합 ISTF 단백질로 자극한 후 OVA 단백질 종양항원을 펄tm(plused)조건과 함께 차게 식힌 배양 배지에서 30분 동안 반응하였다. 세척 후, target 세포는 E:T 비율이 3:1에서 100:1이 되도록 effector 세포와 함께 분주하였다. 특정하게 방출되는 51Cr (중크롬산) 방출량을 3회 반복적으로다음과 같이 실시하였다: 106 개의 target 세포는 Na2 51CrO4를 100 첨가하여 37℃에서 60분 동안 반응시키고, 세척하였다. 51Cr (중크롬산) 방출량 측정을 위해 4시간 후, 상등액을 회수하고, gamma-counter (Beckman, Milan, Italy)를 사용하여 방사능량을 확인하였다. 51Cr(중크롬산) 방출량는 [(sample release - spontaneous release) / (total release - spontaneous release)] × 100의 식으로 계산하였다. 분석은 3반복구로 수행하여 effecter:target 비율을 확인하였다.
3) 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 수지상세포(DC)의 항종양 치료 및 예방효과를 확인
최종적으로 OVA 종양항원을 이용한 종양동물모델로부터 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 수지상세포(DC)의 항종양 치료 및 예방효과를 확인하기 위해 조건별로 처리한 수지상세포를 마우스에 면역화시켰다. 먼저 OVA를 시간별로 수지상세포에 자극을 주었고, OVA 단백질 종양항원과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 다양한 조건의 조합으로 처리하여 수지상세포(DC)의 분화 및 성숙과정(maturation)을 유도하였다. 배양 배지에 OVA 단백질 종양 항원을 4시간 처리 후, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 1.6 의 농도로 처리한 다음 4, 12, 20시간으로 각각 처리하였다(이를 8h, 16h, 24h 수지상세포(DC)라 표기함). 기능적으로 활성능력이 떨어진 수지상세포(DC)의 활성능이 다시 회복되는지를 확인하기위해 8, 16, 24 시간 전에 OVA 단백질 종양항원을 처리한 다음 LPS (1 /ml) 또는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)(1.6 )을 배양 배지에 첨가하였다. 세포를 인산완충식염수로 3회 세척 후, LPS (1 /ml)를 24시간 동안 처리하여 수지상세포(DC)를 재자극 시켰다.
이들 각 조건별로 처리한 DC를 회수하여 2×106 수지상세포(DC)/50 양으로 주 1회, 총 3주간 마우스에 면역화하였다. C57BL/6 마우스를 예방과 치료의 두 그룹으로 나누고, EG7 종양세포를 피하주사 하였다. 동일한 방법으로 인산완충식염수 또는 생리식염수에 희석한 100 의 OVA 단백질 종양항원을 펄스하지 않은 조건(unpulse)의 수지상세포(DC)를 마우스에 주사하였으며 이를 대조군으로 사용하였다. 예방그룹은, 마우스에 1×106 EG7 종양세포 주사 3일 후, 수지상세포(DC)(1×106 수지상세포/주사농도)를 피하주사 하였다. 치료그룹은, 면역되지 않은 동물에 1×106 EG7 종양세포를 피하주사 하였다. 몇일 후, 마우스를 무작위로 그룹을 나누고 다음과 같이 처리하였으며, 예방과 치료그룹은 동일하게 사용하였다. 즉 생리식염수그룹, OVA 단백질 종양항원을 펄스하지 않은 조건(unpulse)의 수지상세포(DC)(1×106 수지상세포/주사농도) 그룹, OVA 단백질 종양항원을 펄스한 조건(pulse)의 수지상세포(DC) 그룹 및 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 시간별 처리조건에 따라 자극하고 OVA 단백질 종양항원을 펄스한 조건(pulse)(1×106 수지상세포/주사농도) 그룹으로 나누어 투여하였다. 종양 크기는 1주에 2회 캘리퍼(caliper)를 이용하여 두 개의 수직 지름을 측정하였다. 종양 지름이 2 mm이상일 때 동물을 종양이 형성된 동물로 기록하였다. 종양세포 투여 10일 후에도 종양이 보이거나 만져지지 않는 동물은 종양이 형성되지 않은 동물로 기록하였다. 실험동물은 종양의 크기가 20?25 mm 이상일 때, 계획도살 하였다.
다음은 A. actinomycetemcomitans로부터 분리한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자 동정, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 분리 정제 및 이들 단백질의 면역활성능과 항종양 효능 결과를 서술한 것으로 다음과 같다.
[실험 예 1] A. actinomycetemcomitans로부터 순수 ISTF (immunostimulating factor, pure ISTF) 단백질의 분리 및 동정
가. A. actinomycetemcomitans 균주로부터 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 분리
A. actinomycetemcomitans 균주로부터 부분정제한 ISTF 단백질로부터 얻은 단클론항체(64D10 & 75B2)로부터 제작된 면역화 컬럼(immunoaffinity column)을 통해 순수한 ISTF 단백질(pure ISTF)을 분리하였다.
도 3의 순수 분리한 ISTF 단백질(pure ISTF) 밴드 및 분자량의 확인에서와 같이, Lane M은 단백질 사이즈 마커, Lane 1은 순수 분리한 ISTF 단백질(pure ISTF)을 나타낸 것으로, 순수분리된 ISTF 단백질(pure ISTF)는 실버염색액(silver stain reagent)를 사용한 SDS-PAGE 전기영동을 통해 13 kDa 분자량의 단일밴드로 확인하였다.
나. 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 아미노산 조성분석
분취형 전기영동(Preparative electrophoresis)을 통해 확인된 ISTF 단백질 band를 정제하여 얻어진 단백질로부터 ISTF의 일반적인 아미노산 조성을 분석하였다. 그 결과는 다음의 표 1에 제시한 바와 같다.
Figure pat00001
다. 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 아미노산 서열 확인
순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 펩티드 서열 분석과 부분적인 아미노산 서열을 확인하였는데, 분취형 전기영동(Preparative electrophoresis)을 통해 확인된 단일 밴드로부터 얻어진 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)은 ESI Q-TOF 질량분석장비를 사용하여 부분적인 아미노산 서열을 분석하고자 하였다.
도 4의 ISTF 단백질(pure ISTF)의 부분적인 아미노산 염기서열(EVLQAIPAQAK)에서 보는 바와 같이, 그 결과 부분적인 아미노산 서열을 분석하였으며. EVLQALPAQAK로 확인하였다. 이들 부분적인 아미노산 서열을 gaagtattacaagcattaccagcacaggcaaaa 염기서열로 재해석하였다. 이들 염기서열을 이용하여 A. actinomycetemcomitans의 유전자 제놈 프로젝트를 수행하고 있는 Oklahoma University의 데이터베이스를 검색한 결과,
A. actinomycetemcomitans 유전자 중 contig 28 (from 461 bp to 2031 bp)에 이들 부분적인 염기서열을 포함하고 있음을 확인하였다. 따라서 gene finder 프로그램을 사용하여 contig 28 유전자 중 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자서열(from 461 bp to 1034 bp)에 대한 open reading frame (ORF)을 확인하였으며, 이들 contig 28 유전자서열을 재번역(back translation)하여 192개의 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 아미노산 서열을 포함하고 있음을 확인하였다. 따라서 ISTF 단백질의 분자량은 약 21.5 kDa로 예측되며, 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자서열을 포함하는 contig 28 유전자 서열 및 아미노산 서열을 도 5에 제시하였다.
라. 중합효소연쇄반응(PCR)을 통한 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자 클로닝 과정
도 6. 중합효소연쇄반응(PCR)을 통한 반응산물 및 ISTF 단백자 염기서열에서와 같이, Lane 1은 DNA 사이즈 마커, Lane 2은 ISTF 단백질의 중합효소연쇄반응(PCR)산물을 나타낸 것으로, ISTF 단백질(pure ISTF)의 전체 유전자를 클로닝하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였으며, 프라이머는 ISTF 유전자 염기서열 (576 bp)로부터 양쪽 끝말단의 10-20 bp 염기서열로 각각 디자인하였다. 그 결과 A. actinomycetemcomitans의 전체 유전자서열(genomic DNA)로부터 ISTF 유질(pure ISTF)의 유전 전자가 삽입된 576 bp의 반응산물을 확인하였다(도 6).
또한 A. actinomycetemcomitans의 전체 유전자서열(genomic DNA)로부터 증폭한 ISTF 유전자의 중합효소연쇄반응(PCR)산물로부터 염기서열을 분석하기 위하여 이들 반응물을 pGEX-KG 플라스미드에 삽입한 다음 클로닝 과정을 거쳐 ISTF 유전자 염기서열이 100% 일치하는 클론을 선택하였다. 최종 확인된 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자 염기서열을 이용하여 NCBI blast의 GenBank 데이터베이스를 통해 검색한 결과, 이들 유전자 염기서열이 A. actinmycetemcomitans의 유사외막단백질(Omp1-like protein, GenBank accession no.: AF321231)과 100% 일치함을 확인하였다(도 6). 이로서 ISTF 단백질은 A. actinmycetemcomitans가 가지는 유사외막단백질(Omp1-like protein)로서 동정하였다.
[실험 예 2] 재조합 ISTF(immunostimulating factor, GST-ISTF) 단백질 분리 및 정제과정
가. E. coli에서 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 발현 및 분리정제
순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 유전자를 함유하는 pGEX-KG 플라스미드가 포함된 균주인 E. coli BL21 (DE3) 클론으로부터 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 발현을 위해 IPTG를 농도별 및 시간별 조건에 따라 수행하였다. 그 결과 0.1 mM IPTG로 4시간동안 발현유도(induction)하였을 때 가장 많은 단백질 발현을 나타내었다. 1L 배양액으로부터 2.58 g(총습중량)의 균체가 회수되었으며, 약 236 mg의 수용성(soluble) 단백질을 얻을 수 있었다. 이로부터 글루타치온 아가로스 친화성 컬럼(gluthathione-agarose affinity chromatography)에 의해 분리 정제하였으며, 분리한 재조합 ISTF 단백질을 SDS-PAGE 전기영동 겔을 사용하여 분리한 다음 Coomassie brilliant blue R-250 염색을 통해 확인하였다. GST 태그(tag) 단백질과 결합한 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 분자량은 47.5 kDa이며, 순수 GST 단백질은 26 kDa로 보여졌다. 또한 트롬빈(Thrombin)을 사용하여 재조합 GST-ISTF 단백질로부터 GST 단백질을 제거하고 순수한 ISTF 단백질(pure ISTF)을 분리하였으며, 이들 단백질은 약 21.5 kDa의 분자량을 나타내었다.
도 7은 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 SDS-PAGE 전기영동 확인을 한 것으로, M은 단백질 전기영동 사이즈 마크, Lane 1은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) IPTG 유도전 균체시료, Lane 2는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) IPTG 4시간 유도후 균체시료, Lane 3은 수용성(soluble) 단백질내 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 시료, Lane 4는 순수 분리정제한 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF), Lane 5는 순수 분리정제한 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF), Lane 6은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 트로빈(Thrombin) 처리하여 GST 단백질과 순수 ISTF 단백질이 혼합된 시료를 나타낸 것이다.
나. Western blotting analysis
A. actinomycetemcomitans의 배양액에서 직접 분리한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)로부터 제작된 단클론 항체인 64D10을 사용하여 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 및 이들 재조합 단백질(GST-ISTF)에서 GST 단백질을 제거한 순수 ISTF 단백질간의 상호결합능을 확인하기 위해 웨스턴블라팅(western blotting)을 실시하였다. 그 결과 재조합 ISTF 단백질은 47.5 kDa로 확인하였으며, GST 단백질을 제외한 순수한 ISTF 단백질은 21.5 kDa임을 이들 단클론항체를 통해 확인할 수 있었다(도 8).
도 8은 웨스턴 블라팅(western blotting)을 통한 64D10 단클론 항체와 재조합 ISTF 단백질 및 순수 ISTF 단백질간의 항원-항체 결합능 확인을 한 것으로, Lane 1은 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 시료, Lane 2는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 시료를 나타낸 것이다.
[실험 예 3] 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF (GST-ISTF) 단백질의 면역세포 활성능 평가
가. 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 림프구 증식능
재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)이 기존 A. actinomycetemcomitans의 배양액에서 분리 정제한 순수한 ISTF 단백질(pure ISTF)과 동일한 물질임을 증명하기 위하여 림프구 증식반응을 통해 확인하였다. 림프구 증식능은 BALB/c 마우스의 비장림프구에 대조군 자극제 (ConA 1 /ml과 LPS 10 /ml), 재조합 ISTF 단백질(1.6 ), 순수한 ISTF 단백질(480 nM)와 GST 단백질(1.6 )을 처리하여 확인하였다. 재조합 ISTF 단백질은 GST 단백질의 영향 없이 강한 림프구 증식반응을 나타내었다. 또한 GST 단백질이 분리된 순수한 ISTF 단백질의 경우 낮은 농도에서도 림프구 증식반응을 나타내었으며, 반응은 농도 의존적인 경향을 보였다(도 9). 이러한 결과를 토대로, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)은 사전연구를 통해 면역화 칼럼(immunoaffinity column)으로부터 순수분리한 ISTF 단백질(pure ISTF)이 림프구 증식반응을 유도한다는 사실과 일치함을 확인함으로서 이들이 동일한 단백질임을 알 수 있었다.
도 9는 기존 A. actinomycetemcomitans의 배양액에서 분리 정제한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 림프구 증식능을 나타낸 것으로, A는 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 림프구 증식반응, B는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 농도증가에 따른 림프구 증식반응, C는 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 농도증가에 따른 림프구 증식반응을 나타낸다.
나. 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 및 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 면역세포의 활성화
재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)과 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)은 수지상세포(DC), 대식세포(macrophage), 그리고 B 세포와 같은 항원제시세포(APC)와 같은 면역세포를 활성화 하는지를 확인하기 위해 세포표면에 발현되는 보조자극분자(costimulatory molecule)의 변화를 측정하였다.
도10은 기존 A. actinomycetemcomitans의 배양액에서 분리 정제한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 면역세포 활성능 비교를 나타낸 것으로, A는 수지상세포(DC)를 이용한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 활성능 비교, B는 대식세포(macrophage)를 이용한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 활성능 비교, C는 B세포를 이용한 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 활성능 비교를 나타낸다.
그 결과 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 뿐만 아니라 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)은 항원제시세포(APC)와 같은 면역세포에서 MHC class II, CD86 와 CD40의 보조자극분자(costimulatory molecule) 발현을 증가시켰으며, LPS와 유사한 활성을 나타내었다. 반면에 GST 단백질로 이들 세포를 자극한 경우 보조자극분자(costimulatory molecule) 발현에 차이가 없었다.
[실험 예 4] 재조합 ISTF (GST-ISTF) 단백질의 암 백신 보조제로서의 효능 평가
가. 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의한 최적의 수지상세포(DC) 분화 및 성숙과정 유도
도 11은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 처리에 따른 수지상세포의 성숙(maturation)과정에 미치는 효과를 나타낸 것으로, A는 6,7,8일째 각각 시간에 따른 수지상세포의 성숙(maturation)과정에 미치는 효과 비교, B는 종양항원 OVA, LPS, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 처리에 따른 MHC class II 발현능을 통해 수지상세포의 성숙(maturation)과정에 미치는 효과 비교, C는 종양항원 OVA, LPS, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 처리에 따른 CD86 발현능을 통해 수지상세포의 성숙(maturation)과정에 미치는 효과 비교, D는 종양항원 OVA, LPS, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 처리에 따른 CD40 발현능을 통해 수지상세포의 성숙(maturation)과정에 미치는 효과 비교를 나타낸다.
마우스 골수세포로부터 수지상세포(DC) 분화를 유도하여 6, 7, 8일째 수지상세포(DC)의 세포표면에 발현되는 MHC class II와 보조자극분자(costimulatory molecule)인 CD86 및 CD40의 발현양상을 통해 수지상세포(DC)의 성숙과정을 확인하였다. 그 결과 8일째 수지상세포(DC)에서 MHC class II, CD86이 가장 높게 발현됨으로서 일반적으로 8일째 가장 효과적으로 수지상세포(DC) 성숙과정(maturation)이 일어남을 확인하였다(도11-A).
또한 종양항원인 OVA항원을 자극하였을 때 항원자극이 없는 경우보다 더 성숙과정에 있어서 효율이 더 높게 나타났으며, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 처리한 수지상세포에서 MHC class II, CD40이 가장 높게 발현됨으로서 가장 효과적으로 수지상세포(DC) 성숙과정(maturation)을 유도한다는 사실을 확인하였다(도11-B, C. D).
나. 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의한 최적의 수지상세포(DC) 활성화
도 12는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의한 수지상세포(DC) 활성화를 나타낸 것으로, A는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 의한 수지상세포(DC)활성화로 인한 IL-12 분비능 비, B는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 농도증가에 따른 자극에 의한 수지상세포(DC)활성화로 인한 IL-12 분비능 비교를 나타낸다.
재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의한 수지상세포(DC) 활성화를 확인하고자 5, 6, 7일째 수지상세포(DC)에 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 농도별로 처리하여 24시간 반응한 다음 수지상세포(DC)에서 분비되는 IL-12량을 측정한 결과, 7일째 수지상세포(DC)에 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 자극한 다음 8일째 측정한 결과에서 IL-12 분비능이 최고에 이르렀다(도12).
또한 이러한 결과를 토대로 7일째 수지상세포(DC)에 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 농도별로 처리하였을 때, 농도의존적으로 IL-12 사이토카인 생성능이 증가함을 확인하였다(도13).
다. 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 수지상세포 활성화를 통한 최적의 세포독성(CTL)반응 유도
재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 처리한 수지상세포(DC)에 의한 최적의 종양세포 독성을 일으키는 세포독성(cell cytotoxicity)반응을 확인하기 위해 CD8+ T세포가 분비하는 IFN-γ 사이토카인 생성능을 확인하였다.
도13은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 자극시간에 조건에 따른 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 증식능 확인을 나타낸 것으로, OVA 종양항원 단백질에 4시간 노출하고 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의해 4시간 자극을 받은 8h-DC와 OVA 종양항원 단백질에 4시간 노출하고 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의해 20시간 자극을 받은 24h-DC를 매일 1회, 3주 동안 피하주사 하였다. 3차 면역화 7일 후, 비장세포를 분리하고 OVA 종양항원 단백질으로 재자극하였다. 8h-DC (OVA 종양항원 4시간, 재조합 ISTF 4시간)로 면역화한 마우스에서 CD8+ cell로 부터 IFN-γ의 수치가 가장 높았다(도13).
24h-DC 또는 아무런 자극되지 않은 수지상세포(DC)로 면역화한 마우스는 CD8+ cell로부터 IFN-γ의 수치가 낮게 나타났고(3.42, 0.76%), 생리식염수를 주사한 실험동물에서도 IFN-γ 생성이 낮았다(0.69%). 반면에, 8h-DC로 면역화한 마우스에서는 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T세포가 8.31%로 증가하였다(도14).
본 결과를 통해, 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극한 8h-DC를 생체내로 면역화할 경우 종양세포를 죽일 수 있는 가장 강력한 세포독성(CTL)반응이 나타날 것으로 보여진다.
도 14는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)의 자극시간에 조건에 따른 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 증식능 확인을 나타낸 것으로, A는 생리식염수로 면역화시킨 마우스에서 분리한 비장세포로부터 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 증식능 확인, B는 아무런 자극도 하지 않은 수지상세포(DC)로 면역화시킨 마우스에서 분리한 비장세포로부터 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 증식능 확인, C는 24시간동안 OVA 종양항원으로만 자극한 수지상세포(DC)로 면역화시킨 마우스에서 분리한 비장세포로부터 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 증식능 확인, D는 24시간동안 OVA 종양항원과 재조합 ISTF단백질(GST-ISTF)로 함께 자극한 수지상세포(DC)로 면역화시킨 마우스에서 분리한 비장세포로부터 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 증식능 확인, E는 4시간동안 OVA 종양항원으로 자극한 다음 재조합 ISTF단백질(GST-ISTF)로 20시간 추가 자극한 수지상세포(DC)로 면역화시킨 마우스에서 분리한 비장세포로부터 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 증식능 확인, F는 4시간동안 OVA 종양항원으로 자극한 다음 재조합 ISTF단백질(GST-ISTF)로 4시간 추가 자극한 수지상세포(DC)로 면역화시킨 마우스에서 분리한 비장세포로부터 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 증식능 확인을 나타낸다.
라. 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 최적조건 DC를 이용한 항종양 치료 및 예방효과
도 15는 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극조건에 따른 최적의 수지상세포 활성화를 통한 OVA 종양 세포(EG7)의 세포독성능 확인을 나타낸 것으로, 최적조건으로 활성화된 수지상세포(DC)에 의한 OVA종양항원 특이적인 세포독성반응을 확인하기 위하여, 사이토카인을 측정하였다. 실험동물로부터 분리한 비장림프구에 OVA종양항원 단백질로 자극하고 5일 후에 51Cr 방출량 측정법(release assays)를 실시하였다. 그 결과, 자극되지 않은 수지상세포(DC)와, OVA종양항원단백질 및 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극된 수지상세포(DC)에서의 세포독성반응을 확인하였다. 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극한 수지상세포(DC)는 OVA 종양항원 단백질에 의한 강력한 세포독성반응을 초래한다는 사실을 확인하였다. 특히 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 처리조건인 8h-DC는 또는 24h-DC를 동물에 면역화 후, 이를 비교하기 위하여 마찬가지로 세포독성능을 측정하였다. 그 결과, OVA 종양세포인 EG7세포에 있어서 4시간동안 OVA 종양항원으로 자극한 다음 재조합 ISTF단백질(GST-ISTF)로 4시간 추가 자극한 8h-DC에서 가장 효과적으로 세포독성을 나타내었다. 단 대조군의 target 세포로 사용한 DC와 EL4세포에 대해서는 모든 조건에서 반응의 큰 차이를 보이지 않았다(도15).
이러한 사실을 토대로 하여 OVA 종양항원 단백질과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극한 8h-DC와 24h-DC를 OVA 종양동물모델에 적용하여 방어 또는 치료 효과를 확인하였다.
도 16은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 최적의 수지상세포를 이용한 항종양동물모델을 이용한 치료효과를 나타낸 것으로, 치료효과 실험에서, 면역화 되지 않은 동물에 1×106 EG7 세포를 피하주사 하였다. 종양세포 주사후 종양크기가 일정하게 자랐을때, 마우스를 무작위로 그룹을 나누고 다음과 같이 처리하였다: 생리식염수 그룹, 자극되지 않은 수지상세포(DC)(1×106 DCs/injection)그룹, OVA 종양항원단백질과 재조합 ISTF단백질(GST-ISTF)을 각각 최적조건으로 자극한 수지상세포(DC)(1×106 DCs/injection) 그룹으로 나누어 각각 3주간 면역화 하였다. 그 결과 치료그룹에서 8h-DC (OVA 종양항원단백질 4시간자극 후 재조합 ISTF 단백질 4시간 자극)를 주사한 동물은 음성동물이 사망 하였음에도 100% 생존하였고, 두드러지게 오래 생존하였다.
또한 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극된 8h-DC와 24-DC로 면역화한 동물에서의 생존곡선을 비교하였을 때, 유의한 차이가 있었다(P<0.05). OVA 종양항원 단백질과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극된 수지상세포(DC)로 면역화하여 생존한 동물은 자극되지 않은 수지상세포(DC)로 면역화한 동물에 비하여, 종양크기도 유의하게 감소하였다.
도 17은 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 자극에 따른 최적의 수지상세포를 이용한 항종양동물모델을 이용한 예방효과를 나타낸 것으로, 예방그룹에서도 마찬가지로 EG7 종양세포를 피하 주사한 다음 바로 생리식염수 그룹, 자극되지 않은 수지상세포(DC)(1×106 DCs/injection)그룹, OVA 종양항원단백질과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 각각 최적조건으로 자극한 수지상세포(DC)(1×106 DCs/injection) 그룹을 동시에 면역화시켰다. 3주간 종양형성에 대한 예방효과를 확인한 실험에서도 치료그룹과 마찬가지로 재조합 ISTF 단백질로 자극한 8h-DC에서 생존율과 종양크기 억제능에서 가장 좋은 효과를 나타내었다. 따라서 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)로 자극한 8h-DC는 수지상세포(DC)의 활성화를 최적화함으로서 종양세포를 죽이는 능력이 우수하며, 종양동물모델에서 강력한 항종양치료효과를 나타냄으로서 향후 vaccine adjuvant로서 가능성이 매우 높음을 시사하였다.
본 발명은 항종양 A. actinomycetemcomitans 세균유래 암 백신 보조제의 효능을 가지는 면역자극인자 ISTF (Imunostimulating factor) 재조합 단백질 성분의 제조방법에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 치주질환의 주요 병원성 세균인 Actinobacillus actinomycetemcomitans으로 부터 비특이적이고 강력한 면역활성능을 나타내는 새로운 면역활성 물질인 ISTF 단백질은 유전자 동정과정을 통해 A. actinomycetemcomitans의 유사 외막단백질(omp-1 like protein)로 확인하였으며, B세포, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(DC, dendirtic cell)와 같은 항원제시포에 대한 강력한 면역활성능을 나타낼 뿐만 아니라 종양이 형성된 동물모델로부터 재조합 ISTF 단백질로 자극한 수지상세포를 투여한 경우 처리하지 않은 수지상세포만을 투여한 경우보다 훨씬 우수한 항종양 효과를 나타냄을 확인하였으므로 A. actinomycetemcomitans 세균으로부터 분리한 ISTF 단백질을 이용한 암 백신 보조제로서 생물학적 의약품 소재로 제공되며, 이들의 고부가치 제품을 통해 산업적으로 이용범위를 확대시키고자 이들 ISTF 단백질의 대량생산을 위한 제조방법에 관한 것이다.

Claims (6)

  1. A. actinomycetemcomitans ATCC 29522 로부터 순수 ISTF 단백질(pure ISTF) 분리 및 정제 과정에 있어서,
    A. actinomycetemcomitans ATCC 29522는 BHI(brain heart infusion) 배지를 사용하여 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하고, 48시간 후, 4℃, 10,000g에서 30분간 원심분리 하여 상등액은 제거하고 세포만 회수하였고, 회수한 세균세포는 인산완충식염수로 2회 세척한 후, 3차 멸균 증류수로 1회 세척하여 -70℃ 초저온냉동고에 보관 후,
    상기 냉동보관된 균체를 50 mM 농도의 트리스 완충용액(Tris buffer, pH 7.5)으로 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기(a Fisher 550 sonic dismembrator)로 10분 동안 50% pulse mode, 40% power의 조건으로 파쇄하고, 파쇄되지 않은 세균세포는 5,000g에서 10분간 원심분리하여 제거하고,
    초음파 파쇄를 통해 용해되지 않은 균체의 세포벽은 100,000g에서 20분간 원심분리하여 제거하고 용해된 상등액만 회수하여, 용해상태의 분획물은 전칼럼(precolumn)과 ISTF 단백질의 단일클론 항체(64D10 & 75B2)를 사용하여 제작한 면역화 칼럼(immunoaffinity column)에 적용하여 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)을 분리(1)하게 됨을 특징으로 하는 면역자극인자 ISTF (Imunostimulating factor) 재조합 단백질의 제조방법
  2. 제 1항에 있어서,
    면역화 칼럼(immunoaffinity column)에 의해 분리된 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)(1)은, 분취형 전기영동장치(491 Prep Cell)을 사용하여 정제하는 것으로, ISTF 단백질에 대한 단클론항체인 64D10항체가 결합되어 있는 CNBr-activated Sepharose 면역화 컬럼을 인산화완충용액(PBS)로 충분히 세척한 다음, 초음파로 파쇄된 분획물을 전컬럼(precolumn)인 bovine serum albumin-Sepharose 컬럼을 통해 부분정제하여 단백질을 회수하였으며, 이들 단백질 9 mg을 면역화 칼럼에 결합시킨 후,. peristaltic pupm를 사용하여 0.1 M 농도의 인산용액 (phosphoric acid, pH 12.5)을 분당 1ml의 유속으로 컬럼에 적용하여 64D10항체와 결합해 있는 ISTF 단백질을 용출시키고, 용출된 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)에 1/20 부피의 1 M 나트륨인산(sodium phosphate) , pH 6.8 용액을 첨가하여 중화시킨 다음. 1 mM 트리스 완충용액(Tris-Cl)으로 투석(dialysis)하며 원심분리농축기(centriprep concentrator)를 통해 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)을 농축하여. 정제 분리된 시료는 동량의 단백질 환원용 용액(SDS-reducing buffer) 와 혼합하여 전기영동 실시 전, 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 16.5% 폴리아크릴 아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 사용하여 12W, 50 mA조건에서 전기영동하여 분자량을 확인하게 됨을 특징으로 하는 면역자극인자 ISTF (Imunostimulating factor) 재조합 단백질의 제조방법
  3. 제 2항에 있어서,
    전기영동을 통하여 얻어진 순수분리 정제된 ISTF 단백질(pure ISTF)에 동량의 염산(HCl)을 첨가하고 110℃에서 24시간 끓여 가수분해 시킨 후, 정제된 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 아미노산 서열분석을 위하여, Q-TOF2 질량분석기(mass spectrometer)와 nano-ESI, coated glass capillary을 사용하여 실시하였고, 순수분리한 ISTF 단백질(pure ISTF)의 부분적인 아미노산 염기서열을 확보하여 Protein ProSpector 프로그램을 사용하여 이들 일부 아미노산 서열을 유전자(DNA) 염기서열로 재번역(back-translation)하고. ISTF 단백질의 부분적인 유전자(DNA) 염기서열을 이용하여 A.actinomycetemcomitans 의 전체 유전자 염기서열로부터 ISTF 단백질의 전체유전자서열을 확인하기 위하여 Oklahoma' Advanced Center의 데이터 베이스 및 VectorNTI suite 프로그램을 사용하여 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 유전자 서열 및 아미노산 서열을 분석하게 됨을 특징으로 하는 면역자극인자 ISTF(Imunostimulating factor) 재조합 단백질의 제조방법
  4. E. coli 세균에서 재조합 ISTF 단백질의 발현 및 분리정제 과정에 있어서,
    삽입 ISTF 단백질 유전자 서열이 100% 일치하는 형질전환체(clone)의 단일 콜로니를 50 /ml 농도의 엠피실린(ampicillin)이 포함된 LB 배지에서 24시간 배양하였고, 배양액을 가온한 LB배지로 100배 희석 후, 37℃ 진탕배양기에서 교반시키고, 4시간 후, 흡광도 550 nm에서 측정값이 1이 되었을 때, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 0.1 mM이 되도록 첨가하고, 37℃에서 4시간 추가 배양 후, 4℃, 5,000g에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하였고,
    상기 회수한 균체는 500ml의 인산완충식염수로 현탁시킨 후, 0.01 mg/ml 농도의 프로테아제 억제제 고농축액(protease inhibitor stock solution)과 0.1 mg/ml 농도의 라이소자임(lysozyme)를 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시키고, 0.1% 트리톤(triton) X-100을 첨가하여 4℃에서 초음파 파쇄하였으며,
    상기 파쇄 후, 10 /ml 농도의 디엔나아제(DNase)와 알엔나아제(RNase), 그리고 1 mM DTT (dithiothreitol)를 첨가하여 4℃에서 20분 동안 반응 후. 원심분리(14,000 g, 10분, 4℃)하여 균체 일부는 제거하고, 상등액을 회수하였으며,
    재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 정제하기 위하여, 수용성(soluble) 단백질을 인산완충식염수에 50%의 농도로 현탁한 글루타치온 아가로스 비드(glutathione agarose bead)에 첨가하여 30분 동안 실온에서 회전시키고. 교반 후 비드(bead)는 찬 인산완충식염수로 3회 세척 후, 재조합 단백질은 비드(bead)의 1배 부피의 글루타치온 용출 용액(glutathione elution buffer, 50 mM tris-HCl, pH 8.0, 10 mM reduced glutathione)를 첨가하여 실온에서 30분 동안 회전하여 분리하였으며, 이 완충을 3회 반복실시 후,
    최종 분리한 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF) 농도는 바이오라드 단백질 정량(Bio-Rad protein assay)을 위한 반응액을 사용하여 측정하였으며, SDS-PAGE 전기영동으로 확인 및 나이트로셀룰로스(nitrocellulse membrane)에서 단백질 밴드(band)와 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)의 단일클론 항체(64D10)를 결합시키고, 이를 goat anti-mouse HRP conjugate와 반응시켜 ECL kit으로 확인하게 됨으로서 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)과 순수 ISTF 단백질(pure ISTF)이 동일한 물질임을 확인하게 됨을 특징으로 하는 면역자극인자 ISTF(Imunostimulating factor) 재조합 단백질의 제조방법
  5. 제 4항에 있어서,
    재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 처리한 수지상세포를 이용한 항종양 효과를 확인하는 과정에 있어서,
    실험동물로 암컷 6?8주령 C57BL/6 (H-2b) 정상마우스(평균체중 21±2 g)를 사용하여, 종양모델에 사용한 세포주로 OVA 단백질의 유전자가 삽입되어 있는 EG7 세포를 사용하였으며, 이들 세포는 2mM 글루타민(glutamine), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 항생제와 10% 소태아혈청(FBS)를 함유한 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였고,
    수지상세포(DC)는 7 주령된 C57BL/6 암컷 마우스의 골수에서 분리한 단일세포를 20 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4이 포함된 Opti-MEM배지에 현탁시켜 24 well 배양용기에 2×105 cells/well이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 8일동안 배양하였으며,

    OVA 단백질과 재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 조합으로 처리하여 수지상세포(DC)를 분화 및 성숙과정(maturation)을 유도하였으며, 초기 자극을 통해 이미 활성화가 고갈된 DC의 회복(retrieval)능을 확인하기 OVA 단백질 종양항원의 유무에 따라 LPS (1 /ml) 또는 재조합 ISTF 단백질(1.6 )을 8, 16, 24시간 전에 배양 배지에 첨가하여 수지상세포(DC)에 처리한 후,
    상기 세포를 회수하여 인산완충식염수로 3회 세척 후, LPS (1 /ml)로 24시간 동안 처리하여 재자극시킨 다음 배양 상등액으로부터 IL-12 사이토카인 분비능을 ELISA 키트를 사용하여 확인하였고,

    재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)에 의한 수지상세포의 활성능을 확인하기 위해 세포내 사이토카인 IFN-γ의 동역학적(kinetic) 변화를 측정하였으며, OVA 단백질 종양항원을 이용하여 수지상세포(DC)의 펄스(pulsing) 및 재조합 ISTF 단백질의 자극에 따른 사이토카인의 동역학적(kinetic) 변화도 함께 측정하고. OVA 단백질 종양항원을 처리한 수지상세포(DC)에 재조합 ISTF 단백질로 자극하여 활성화된 수지상세포(DC)를 C57BL/6 마우스의 피하에 매일 1회, 3주동안 주사한 후. 3차 면역화한 다음 7일 후, 비장세포를 분리하여 이들 세포에 OVA 단백질 종양항원(0.4 mg/ml)를 5일 동안 처리하여 재자극 시킨 후, 세포에 인산완충식염수를 첨가 후 원심분리(300 g, 5분, 4℃)하여 1×106 의 비장세포를 회수하여, 회수한 세포에 인산완충식염수를 넣고 차게 준비한 pH 7.4의 0.1 M phosphate buffer에 4% paraformaldehyde가 포함된 고정용액을 넣고 현탁한 후, 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 세포에 1 ml permeabilization용액을 첨가하고. 세포를 37℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 인산완충식염수로 세척하였으며. 표지된 항체(FITC 형광dye가 결합된 마우스 유래 인터페론 감마(IFN-γ)와 PE형광 dye가 결합된 CD8 항체)를 염색용 용액(staining buffer)으로 희석하여 세포에 첨가 후, 30분 동안 반응하였으며, 세포는 염색용 용액(staining buffer)으로 3회 세척 후, 형광세포분석기(flow cytometer)로 세포내 인터페론 감마(IFN-γ) 사이토카인 변화를 분석함으로 재조합 ISTF 단백질에 의한 수지상세포의 활성능을 확인하게 됨을 특징으로 하는 면역자극인자 ISTF 재조합 단백질의 제조방법
  6. 제 4항에 있어서,
    재조합 ISTF 단백질(GST-ISTF)을 조건별로 처리한 수지상세포(DC)를 마우스에 면역화 시켰으며, 먼저 OVA를 시간별로 수지상세포에 자극을 주었고, OVA 단백질 종양항원과 재조합 ISTF 단백질을 다양한 조건의 조합으로 처리하여 수지상세포(DC)의 분화 및 성숙과정(maturation)을 유도하였으며, 배양 배지에 OVA 단백질 종양 항원을 4시간 처리 후, 재조합 ISTF 단백질을 1.6 의 농도로 처리한 다음 4, 12, 20시간으로 각각 처리한 후, 수지상세포(DC)의 활성능의 회복을 확인하기위해 8, 16, 24 시간 전에 OVA 단백질 종양항원을 처리한 다음 LPS (1 /ml) 또는 재조합 ISTF 단백질(1.6 )을 배양 배지에 첨가하였다. 세포를 인산완충식염수로 3회 세척 후, LPS (1 /ml)를 24시간 동안 처리하여 수지상세포(DC)를 재자극 시켰고,

    이들 각 조건별로 처리한 수지상세포(DC)를 회수하여 2×106 수지상세포(DC)/50 양으로 주 1회, 총 3주간 마우스에 면역화하였으며, C57BL/6 마우스를 예방과 치료의 두 그룹으로 나누고, EG7 종양세포를 피하주사 하였고,
    동일한 방법으로 인산완충식염수 또는 생리식염수에 희석한 100 의 OVA 단백질 종양항원을 펄스하지 않은 조건(unpulse)의 수지상세포(DC)를 마우스에 주사하였으며 이를 대조군으로 사용하였고,
    예방그룹은 마우스에 1×106 EG7 종양세포 주사 3일 후, 수지상세포(DC)(1×106 수지상세포/주사농도)를 피하주사 하였다. 치료그룹은, 면역되지 않은 동물에 1×106 EG7 종양세포를 피하주사 한 후, 마우스를 무작위로 그룹을 나누어 예방과 치료그룹은 동일하게 생리식염수그룹으로 하였고,
    OVA 단백질 종양항원을 펄스하지 않은 조건(unpulse)의 수지상세포(DC)(1×106 수지상세포/주사농도) 그룹, OVA 단백질 종양항원을 펄스한 조건(pulse)의 수지상세포(DC) 그룹 및 재조합 ISTF 단백질을 시간별 처리조건에 따라 자극하고 OVA 단백질 종양항원을 펄스한 조건(pulse)(1×106 수지상세포/주사농도) 그룹으로 나누어 투여하였으며, 종양 크기는 1주에 2회 캘리퍼(caliper)를 이용하여 두 개의 수직 지름을 측정하였고, 종양 지름이 2 mm이상일 때 동물을 종양이 형성된 동물로 기록하였으며, 종양세포 투여 10일 후에도 종양이 보이거나 만져지지 않는 동물은 종양이 형성되지 않은 동물로 기록하였으며, 실험동물은 종양의 크기가 20?25 mm 이상일 때, 계획도살 함으로써, OVA 종양항원을 이용한 종양동물모델로부터 재조합 ISTF 단백질 자극에 따른 수지상세포(DC)의 항종양 치료 및 예방효과를 확인하게 됨을 특징으로 하는 면역자극인자 ISTF 재조합 단백질의 제조방법
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