CN110859954B

CN110859954B - 一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110859954B
Application number: CN201911087155.2A
Authority: CN
Inventors: 胡浩; 陈瑞勤; 蒋浩然; 于旭博
Original assignee: Suzhou Ju Microbiology Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Ju Microbiology Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN110859954A

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法与应用。所述组合物包含B群脑膜炎球菌fHBP的变体1、变体2、变体3的重组蛋白V1、V2和V3；其中V1、V2和V3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示，且V1、V2和V3均具有脂质修饰。该组合物相对于现有疫苗具有更广的抗原谱，能够覆盖更多类型的变体菌株，免疫效果好。

Description

一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法与应用。

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰阴性荚膜菌，其寄居于约10％人群的上呼吸道中。基于荚膜多糖的结构，脑膜炎球菌可分为13个血清群。其中，A、B、C、Y和W135群是主要的致病菌，可引起95％以上的病例。在我国及欧美等其他国家由B群菌株引起的脑膜炎超过1/3，成为主要的致病菌。对于A、C、W135和Y群来说，荚膜多糖可用做疫苗抗原制备疫苗预防疾病。然而，但是该方法不能用于血清群B。因为其荚膜多糖多聚唾液酸聚合物是人类的一种自身抗原，能够引起交叉反应。

随着基因组学、蛋白组学、反向疫苗学等技术的发展，一系列位于细菌表面、能诱导杀菌抗体的疫苗候选蛋白被筛选鉴定出来。F因子结合蛋白(fHBP)是其中一个最为主要的保护性抗原。该脂蛋白在所有的脑膜炎球菌血清群中均有表达，已发现其存在于多种脑膜炎球菌菌株中。fHBP序列可分为三个家族(变异型V1、V2和V3)。已发现针对变异体V1的抗血清能够对变异体V1亚群内菌株具有杀菌活性，但对于变异体V2和V3则没有杀菌活性。对于变异体V2和V3来说，反之亦然。基于此，美国辉瑞制药公司(Pfizer)基于fHBP的两个变异型(V1和V3)开发了用于预防B群脑膜炎球菌的二价MenB疫苗(Trumenba)。然而，国外的疫苗主要针对其本土范围内的流行株。而在我国内，变异型V3也占有一定的比例。变异型V2虽与V3具有很高的同源性，表现出一定的交叉反应性，但是交叉保护的效果并不理想。为了提供更加广泛的保护效果，变异型V3有必要纳入疫苗组分，以应对B群脑膜炎球菌fHBP的多样性和变异型，从而为B群脑膜炎球菌提供更加全面的保护效果。此外，现有技术所提供的fHBP抗原还存在免疫原性不够强的问题。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种制备方法简单、可刺激机体产生针对不同变体菌株的抗体且免疫原性更强的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物，其包含B群脑膜炎球菌fHBP的变体1、变体2、变体3的重组蛋白V1、V2和V3；

其中V1、V2和V3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示，且V1、V2和V3均具有脂质修饰。

本发明还提供一种如上所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物的制备方法，包括以下步骤：

获取重组质粒，所述重组质粒分别包含有能够表达V1、V2和V3的编码基因；

将所述重组质粒分别转化至宿主细胞中，鉴定，筛选鉴定正确的阳性菌株，将所述鉴定正确的阳性菌株转化至表达细胞；培养；

从所述表达细胞中分离并富集V1、V2和V3，将它们以及任选的佐剂混合。

本发明还提供一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，具体技术方案如下：

一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，由如上所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物免疫动物而制备得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所提供的组合物，其具有三种fHBP的变体的抗原，且抗原部分均具有P4信号肽，信号肽能将fHBP序列在菌体内翻译表达的过程中将其引导并定位在细菌的细胞膜上，随后这个信号肽会被细菌内自带的一种蛋白酶降解去除，而定位细胞膜上的fHBP成熟肽会发生脂质修饰。脂质部分能够作为增强fHBP免疫原性的佐剂成分，进而提升免疫效果，作为疫苗使用效果更佳；且本发明所选的片段在修饰后得到的是可溶蛋白，更利于表达与纯化。且该组合物相对于现有疫苗具有更广的抗原谱，能够覆盖更多类型的变体菌株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中三个fHBP的SDS-PAGE鉴定结果；泳道1为蛋白marker；泳道2-4中箭头所指分别为经纯化达到变体1、2、3的fHBP重组蛋白；

图2为本发明一个实施例中三个fHPB分别与相应血清发生反应的WB鉴定结果图；泳道1-3箭头所指分别为变体1、2和3的fHBP重组蛋白与对应的变体血清反应的结果；

图3为本发明一个实施例中用纯化的重组蛋白(fHBP-V1/V2/V3)检测小鼠血清抗体效价；柱状图分别反映了经包被的不同变体fHBP抗原检测的各免疫组抗原特异性血清抗体水平。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物，其包含B群脑膜炎球菌fHBP的变体1、变体2、变体3的重组蛋白V1、V2和V3；

在一些实施方式中，所述组合物中V1、V2和V3的摩尔比为(1～3)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。

在一些实施方式中，所述组合物中V1、V2和V3的摩尔比为(1.5～2.5)：(0.7～1.3)：(0.7～1.3)。

在一些实施方式中，所述组合物中V1、V2和V3的摩尔比为2：1：1。

在一些实施方式中，所述组合物中还包括佐剂。

在一些实施方式中，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN以及Poly(I：C)中的至少一种。优选地，所述佐剂为氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，或者氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐与适用于人体的其他佐剂的组合物。其中，虽然弗氏佐剂不能用于人用疫苗中，但应当理解的是，其可以作为用于科研中小鼠试验的B群脑膜炎球菌疫苗的佐剂。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物的制备方法，包括以下步骤：

在一些实施方式中，能够表达V1、V2和V3的编码基因为：

a)依次如SEQ ID NO:4～6所示；或

b).与a)的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与a)的核苷酸序列不同的序列。

在一些实施方式中，所述富集的方法为亲和层析。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，其由如上所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物免疫动物而制备得到。

免疫对象可以选择包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。

其中，对本发明所涉及的名词，解释如下：

佐剂：是与抗原同时或预先注射到动物体内，可非特异性地增强机体对该抗原的免疫应答的物质，或称为非特异性免疫增强剂。

铝盐佐剂：以铝盐作为材料，通过传统工艺制备的一种佐剂，主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾3种，目前常用的铝盐佐剂为氢氧化铝和磷酸铝。

脂质体佐剂：由类脂质组成的人造细胞膜样小球体，主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构。可包括多种疫苗，并有效地引入细胞内，延长在体内停留时间，减少疫苗用量、降低毒副作用，提高免疫功能。

TLR类佐剂：以Toll样受体的配体为基准开发的一类新型疫苗佐剂，如细菌脂多糖是TLR4的配体，鞭毛蛋白是TLR5的配体，细菌或病毒的非甲基化CpG序列为TLR9的配体，以及其他具有佐剂活性TLR配体也包括在内。

MF59：一种由角鲨烯、山梨糖醇三油酸酯(Span85)、吐温80和柠檬酸缓冲液组成的水包油乳剂。

MPL：单磷酰脂质A，为TLR4配体，是已成功开发的TLR类佐剂中的一种。

CpG-ODN：人工合成含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤二核酸的寡聚脱氧核苷酸序列，为TLR9配体。

Poly(I.C)：为一段人工合成的双链RNA分子类似物，是TLR3配体。

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

Native-PAGE：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

ELISA：酶联免疫吸附测定。

SBA：杀菌活性检测。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

1、重组质粒的构建

通过基因工程手段，人工合成三条带有P4信号肽的fHBP基因。

B01(V1)-fHBP核苷酸序列(斜体加粗部分为P4信号肽核苷酸序列)：

其表达得到的蛋白序列如下(斜体加粗部分为P4信号肽氨基酸序列，其余部分对应SEQ ID NO:1)：

A19(V2)-fHBP核苷酸序列(斜体加粗部分为P4信号肽核苷酸序列)：

其表达得到的蛋白序列如下(斜体加粗部分为P4信号肽氨基酸序列，其余部分对应SEQ ID NO:2)：

A05(V3)-fHBP核苷酸序列(斜体加粗部分为P4信号肽核苷酸序列)

其表达得到的蛋白序列如下(斜体加粗部分为P4信号肽氨基酸序列，其余部分对应SEQ ID NO:3)：

其中分别以P4信号肽替换B群脑膜炎球菌三个典型流行株(V1/V2/V3)fHBP本身的信号肽序列，同时在序列的5’-端和3’-端添加酶切位点NdeI和XhoI，然后合成的序列插入pET24b表达载体，并转化到TOP10克隆菌株中。

质粒构建所用引物：(由于3个变体基因均采用的P4信号肽，所以这3个的上游引物相同，且V2和V3的C端序列相同，所以V2和V3的下游引物也相同。加粗划线为限制性内切酶识别序列)

VF：

V1R：

V2R：

PCR扩增体系：

10×buffer 5μL，dNTP 5μL，MgCl₂ 2μL，DNA模板100ng，引物F1.5μL，引物R1.5μL，KOD-plus-neo1μL，ddH₂O补足至50μL。

PCR扩增条件：

94℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸1min，循环30次，最后68℃延伸5min。将获得的PCR产物经DNA电泳检测，并采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR正确的产物进行纯化回收。

采用NdeI和XhoI分别双酶切3个基因片段和表达载体pET24b，均于37℃酶切反应1h。经DNA检测后，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物分别进行纯化回收，并测定回收产物的DNA浓度。

分别将双酶切回收的3个基因片段与pET24b按照摩尔质量3:1混匀，在T4连接酶作用下于24℃反应1-2h。

构建的重组表达质粒命名为fHBP(V1)-pET24b、fHBP(V2)-pET24b和fHBP(V3)-pET24b。所用的的菌株分别为：B01(V1)、A19(V2)和B05(V3)。

2、重组质粒的提取

含有重组质粒的TOP10穿刺菌接种于Kan抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm，进行扩大培养。取上述适量菌液，采用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取含有目的基因的质粒(具体操作详见说明书)，通过NanoDrop测定质粒浓度。对提取的质粒用NdeI和XhoI限制性内切酶于37℃酶切消化30min，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。挑取酶切鉴定为阳性的质粒送至测序公司(华大基因)测序。含有目的片段的表达质粒用于转染competent E.coli BL21(DE3)pLysS细胞。

3、重组质粒的转化

取100μl competent E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞置于冰浴中，如果有必要，则在冰浴状态下可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，冻存。适量的含有目的基因片段的fHBP(V1/2/3)-pET24a(+)表达质粒加入感受态细胞悬液中，并使所加质粒的量不超过1ng为宜。将离心管置于42℃水浴中放置90s，然后将离心管快速转移至冰浴中，冷却细胞约2min，该过程动作要轻柔，不要摇动离心管。然后，将900μL不含抗生素的无菌的SOC或LB培养基加入到每个离心管中，混匀后置于37℃摇床，于150rpm转速下震荡培养45min，目的是使菌体复苏，并使质粒上相关的抗性标记基因表达。将离心管中的内容物混合均匀，在含Kan抗生素LB固体琼脂培养基上加入100μL已转化的感受态细胞，用无菌的弯头玻璃棒将细胞轻轻地均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，将平板倒置并于37℃培养12-16h。

4、重组蛋白的小样表达

从转化的平板上挑取圆润的单克隆菌落，分别接种于3mL含Kan抗生素LB液体培养基中，置于37℃摇床，200rpm，震荡培养12-16h。培养至菌体浓度OD＝0.6-0.8，加入终浓度为1mM IPTG诱导，37℃，200rpm，3h。取1mL诱导的菌液，12000rpm离心1min，弃去上清液，视菌体的量，细胞沉淀用50-100μL10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散，加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，于沸水浴中加热5min，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。将表达目的蛋白的阳性单克隆菌液与含30％甘油的培养基等体积混合均匀，-80℃冻存，备用。

5、重组蛋白的大量表达

接1-2μL活化的目的蛋白表达量高的阳性单克隆菌液到5mL Kan抗性LB液体培养基中，37℃培养，200rpm。然后，将菌液转接到1000mL Kan抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(1mM)37℃诱导3h。将收获的菌液于8000rpm离心5min，弃上清。菌体用20-30mL 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散，超声破碎(250W，5s/5s，30min)。取100μL超声后的菌悬液，12000rpm，离心10min，取50μL离心后的上清至另一离心管，去除上清后的沉淀用50μL 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散。用SDS-PAGE确定各个目的蛋白的表达形式。

6、重组脂蛋白的纯化

经SDS-PAGE鉴定以可溶形式表达的目的蛋白经大量表达(1L培养体积)后，将菌体8，000rpm离心5min，弃去上清。用30mL 10mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液垂悬菌体沉淀，将其倒入体积为100mL的摇瓶，摇瓶置于500mL烧杯中，周围覆盖冰。超声破碎(250W，5s/5s，30min)。超声前取样0.5mL，置4℃备用。将超声后的菌液12000rpm，离心10min。分别收集上清和沉淀，同时分别留样0.5mL，置4℃备用。上清置于干净的的离心管。用去离子水清洗镍柱，至pH7.0。然后用100mL 10mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡镍柱。含有可溶性目的蛋白的上清加入镍柱，30mL/柱，并加入150μL咪唑(1M)，使咪唑终浓度为5mM。然后将镍柱置旋转培养箱上孵育，4℃，40rpm，2h。分别用20mL含15mM咪唑、60mM咪唑、500mM咪唑的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液洗脱，分别收集流穿液。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果，结果如图1所示。三个fHPB分别与相应血清发生反应的WB鉴定结果如图2所示。用lowry法测定纯化蛋白的浓度，如有必要，用10KDa超滤管浓缩样品至所需要的浓度和体积。另外，如果制备的菌体蛋白量大，可用样品处理量更大的层析柱进行纯化。

7、重组脂蛋白组合物的配制

去除内毒素的重组蛋白经过lowry法进行蛋白定量。定量后的三个重组蛋白分别吸附到磷酸铝佐剂上以制备疫苗。疫苗稳定性用其粒径进行表征。在疫苗配制时，三个变体蛋白的混合比例：V1:(V2+V3)＝2:(1+1)。

8、动物免疫

将制备的疫苗免疫接种7周龄雌性BALB/c小鼠，间隔两周加强一次。末次免疫后两周采血。分离血清，与-20℃冻存备用。以BPS组设为对照组。以fHBP-V1+fHBP-V2作为疫苗参照物。小鼠免疫剂量约为人体剂量的1/10。在疫苗配制时，小鼠免疫时，每剂量应分别包含fHBP变体(V1/V2/V3)的剂量为：V1:(V2+V3)＝2:(1+1)。

9、特异性抗体滴度测定

采用间接ELISA法测定免疫血清中的特异性IgG滴度，即:分别以纯化的重组fHBP-V1、fHBP-V2和fHBP-V3作为包被抗原包被酶标板，加入系列稀释的待检血清后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG酶标抗体(KPL公司)作为检测抗体，经显色反应后，在酶标仪(Molecule Device公司)上读取450mm光吸收值。以PBS组未血清为阴性对照，以阴性对照血清A45平均值的2.1倍作为cut-off值，判断阴/阳性反应。阳性反应最高稀释度即为待检样品的抗体滴度。结果见图3，免疫后，疫苗组分中的抗原成分均可诱导小鼠产生高滴度的针对V1、V2和V3的特异性抗体反应，其中包含三个变异体的疫苗组均诱导了针对三个变异体的特异性抗体应答，而不包含变异体V2的疫苗组对变异体V2的反应较弱。

10、重组蛋白制备的免疫血清的杀菌活性(SBA)

将经56℃30分钟灭活处理的待检血清，在96孔细胞培养板中作系列稀释，每孔25u1，加入等体积乳兔补体、新鲜培养的脑膜炎球菌菌液，混匀后于37℃孵育1小时；加入50u1TTC琼脂培养基，混匀后于37℃烛缸内孵育过夜，观察结果。同时设阳性血清(诊断血清或全菌体免疫兔血清，对相应的血清群菌株有杀菌作用)。对照、补体对照、细菌生长对照。补体对照和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落。与补体对照孔比较，所试样品孔菌落数减少70％及以上判为杀菌阳性，以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度，计算各组样品的几何平均滴度(GMT)。GMT≥1:8为杀菌力阳性。

结果表明，如表1所示，PBS对照组血清样品对B群脑膜炎球菌的各个变异体均无杀菌活性。磷酸铝佐剂化的fHBP-V1+fHBP-V3对变异体V1和V3具有良好的杀菌活性，但对变异体V2的杀菌活性明显减弱。这取决于fHBP-V2对fHBP-V3的交叉保护作用。而这种交叉保护作用并不充分和全面。磷酸铝佐剂化的fHBP-V1+fHBP-V2+fHBP-V3对三个变异体的所有菌株均有良好的杀菌活性，提示变异体V3在疫苗组分中的必要性。

表1：小鼠血清(n＝5/组)对不同fHBP变异体菌株的杀菌活性(SBA)

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州微超生物科技有限公司

<120> 一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 260

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 1

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<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 2

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<400> 3

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145 150 155 160

Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile

165 170 175

Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr

180 185 190

Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu

195 200 205

Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu

210 215 220

Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly

245 250 255

Ile Ala Gly Lys Gln

260

<210> 4

<211> 843

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

atgaaaacaa cgttaaaaat gaccgcactt gcggctcttt ctgcttttgt tttagctggc 60

tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtca ccgccgacat cggcacgggg 120

cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 180

ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa 240

acttatggaa acggcgacag ccttaatacg ggcaaattga agaacgacaa ggtcagccgt 300

ttcgacttta tccgtcaaat cgaagtggac gggcagctca ttaccttgga gagcggagag 360

ttccaagtgt acaaacaaag ccattccgcc ttaaccgccc ttcagaccga gcaagaacaa 420

gatccagagc attccgagaa gatggttgcg aaacgccggt tcagaatcgg cgacatagcg 480

ggcgaacata catcttttga caagcttccc aaagacgtca tggcgacata tcgcgggacg 540

gcgttcggtt cagacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ctatagattt tgctgccaaa 600

cagggacacg gcaaaatcga acatttgaaa tcgccggaac tcaatgtcga tctggccgtc 660

gcctatatca agccggatga aaaacaccat gccgtcatca gcggttccgt tctttacaac 720

caagacgaga aaggcagtta ctccctcggt atctttggcg aaaaagccca ggaagttgcc 780

ggcagcgcgg aagtggaaac cgcaaacggc atacaccata tcggtcttgc cgccaagcag 840

taa 843

<210> 5

<211> 825

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

atgaaaacaa cgttaaaaat gaccgcactt gcggctcttt ctgcttttgt tttagctggc 60

tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 120

accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 180

aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 240

gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 300

caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 360

caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 420

gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 480

ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 540

gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 600

gaacacctga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgccg ccgccgaact caaagcagat 660

gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcagcgaaga aaaaggcact 720

taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 780

ataggggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 825

<210> 6

<211> 846

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

atgaaaacaa cgttaaaaat gaccgcactt gcggctcttt ctgcttttgt tttagctggc 60

tgcagcagcg gaagcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacagggctt 120

gccgatgcac taactgcgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg 180

gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 240

ttcaaagtcg gcgacaaaga caacagtctc aatacaggca aattgaagaa cgacaaaatc 300

agccgcttcg actttgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 360

ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 420

atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 480

ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccagcg gcaaagccga gtatcacggc 540

aaagcattca gctccgacga tgccggcgga aaactgacct ataccataga ttttgccgcc 600

aaacagggac acggcaaaat cgaacacctg aaaacacccg agcagaatgt cgagcttgcc 660

tccgccgaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgccgtca ttttgggcga cacgcgctac 720

ggcagcgaag aaaaaggcac ttaccacctc gctcttttcg gcgaccgagc ccaagaaatc 780

gccggctcgg caaccgtgaa gataagggaa aaggttcacg aaatcggcat cgccggcaaa 840

cagtag 846

Claims

1.一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物，其特征在于，其包含B群脑膜炎球菌fHBP的变体1、变体2、变体3的重组蛋白V1、V2和V3；

其中V1、V2和V3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1~3所示，且V1、V2和V3均具有脂质修饰；所述组合物中V1、V2和V3的摩尔比为2：1：1。

2.根据权利要求1所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物，其特征在于，所述组合物中还包括佐剂。

3.根据权利要求2所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物，其特征在于，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN以及Poly（I：C）中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂。

5.权利要求1~4任一项所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6. 根据权利要求5所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物的制备方法，其特征在于，能够表达V1、V2和V3的编码基因为：

a）依次如SEQ ID NO:4~6所示；或

b）与a）的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与a）的核苷酸序列不同的序列。

7.根据权利要求6所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物的制备方法，其特征在于，所述富集的方法为亲和层析。

8.根据权利要求6所述的包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞和/或表达细胞为原核细胞。