KR20200121825A - 포도상구균 항원을 포함하는 면역원성 조성물 - Google Patents

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KR20200121825A
KR20200121825A KR1020207025858A KR20207025858A KR20200121825A KR 20200121825 A KR20200121825 A KR 20200121825A KR 1020207025858 A KR1020207025858 A KR 1020207025858A KR 20207025858 A KR20207025858 A KR 20207025858A KR 20200121825 A KR20200121825 A KR 20200121825A
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카린 고라이
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 단백질 항원을 함유하는 포도상구균 항원, 특히 Hla, ClfA, SpA, 및 피막 폴리사카라이드의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 아주반트 제형이 또한 제공된다. 본 발명은 포도상구균 감염, 특히 에스. 아우레우스 감염 및 질환의 예방 및 치료에서 사용될 수 있다.

Description

포도상구균 항원을 포함하는 면역원성 조성물
본 발명은 포도상구균 감염 및 질환, 특히 에스. 아우레우스(S. aureus) 감염 및 질환의 예방 및 치료를 위한 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 포도상구균 항원, 특히 Hla, ClfA, SpA, 및 피막 폴리사카라이드의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 아주반트 제형이 또한 제공되며, 포도상구균 감염의 예방 및 치료에서 이러한 조성물의 용도가 제공된다.
에스. 아우레우스는 미국 및 유럽에서 혈류, 하기도, 피부 및 연조직 감염의 주요 원인인 그람-양성 구형 박테리아이다. 이는 또한 전세계적으로 골 감염의 주된 원인이고, 이들 감염은 고통스럽고, 쇠약하게 만들며, 치료하기 어렵다.
에스. 아우레우스의 치료는 에스. 아우레우스의 여러 균주에 의한 항생제 내성의 발달로 인해 점점 더 어려워지고 있다. 메티실린-내성 에스. 아우레우스 (MRSA)는 병원에서 고질적이고, 지역 사회-연관된 MRSA 균주는 전세계적으로 확산되어 세계적인 주요 문제를 제기하고 있다. MRSA는 모든 지역 사회 및 병원 감염의 절반 이상에서 발견된다. 최근 몇년 동안 최후 수단의 항생제인 반코마이신에 대해서도 내성이고 본질적으로 치료할 수 없는 MRSA 균주의 출현이 확인되었다.
현재 승인된 백신은 없다. 항생제 내성의 문제, 및 에스. 아우레우스 감염이 그의 잘 발달된 면역 회피 능력 때문에 추후 감염에 대한 면역력을 제공하지 않는다는 사실로 인해 백신이 특히 극심하게 요구된다. 에스. 아우레우스의 면역 회피 성질은 또한 효과적인 백신의 개발을 더욱 어렵게 만든다. 면역 회피의 메카니즘이 충분히 이해되지 않지만, 적어도 부분적으로는 이뮤노글로불린 (Ig)의 Fcγ에 결합하고 VH3-유형 B 세포 수용체의 Fab 부분에 결합하는 에스. 아우레우스 표면 분자인 포도상구균 단백질 A (SpA) 때문이다. SpA와 B 세포 수용체의 상호작용은 감염 동안에 B 세포 발달에 영향을 미치고, 적응성 면역 반응의 발달을 방해한다. Ig Fc에 결합하는 SpA는 다형핵 백혈구에 의한 포도상구균의 옵소닌 식세포 작용성 제거를 방해한다.
따라서, 포도상구균 질환을 예방하기 위한 백신이 시급히 요구된다. 피막 폴리사카라이드 (CPS) 접합체, 개별 단백질 항원, 및 리포테이코산에 대한 모노클로날 항체 (mAb)를 비롯하여 몇몇 백신을 임상 시험에서 시험하였다. 그러나, 이들 모두는 다양한 개발 단계에서 실패하였고, 지금까지 시판중인 에스. 아우레우스에 대한 백신이 없다.
에스. 아우레우스 CPS, ClfA 및 MntC를 포함하는 다성분 백신 (Anderson et al. 2012, Hum Vaccine Immunother 8: 1585-1594)을 PhI 인간 실험에서 시험하였다. 백신은 PhI에서 옵소닌성 항-CP 항체 및 억제성 항-ClfA 항체를 유도하였고, 후속적으로 선택적인 척추 융합 수술 환자에서 예방적 사용을 위한 PhIIb 효능 실험에서 시험하였지만, PhIIb 실험은 무용성으로 중단되었다.
그러나, 아직 에스. 아우레우스에 대한 백신도 PhIII 실험에서 보호 효능을 갖는 것으로 확인된 바 없다. 슈도모나스 엑소프로테인 A에 접합된 에스. 아우레우스 유형 5 및 유형 8 피막 폴리사카라이드의 접합체를 함유하는 백신 (StaphVAX - 나비 바이오파마슈티칼스(Nabi Biopharmaceuticals))이 임상 실험에서 시험되었고, WO 03/61558에 기재된 바와 같이 이는 PhI 및 II에서 안전성을 입증하였지만 PhIII에서 요구되는 종점을 달성하는데 실패하였다.
유사하게, IsdB 단백질 항원을 기반으로 하는 백신 (V710 백신; Kuklin et al., Infect Immun, 2006, 74: 2215-23)은 심장흉부 에스. 아우레우스 감염에서 수행된 PhIII 실험에서 효능 종점을 충족시키는데 실패하였다.
따라서, 포도상구균 감염, 특히 에스. 아우레우스 감염에 대한 효과적인 백신이 계속해서 요구된다.
본 발명은 포도상구균 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 면역원성 조성물은 (a) ClfA 항원;(b) Hla 항원; (c) SpA 항원; 및/또는 (d) 포도상구균 피막 폴리사카라이드 중 2종 이상을 포함한다. ClfA 항원, Hla 항원 및 SpA 항원은 바람직하게는 포도상구균 항원, 적합하게는 에스. 아우레우스 항원이다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 ClfA 항원; Hla 항원; SpA 항원; 및 포도상구균 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 피막 폴리사카라이드는 적합하게는 에스. 아우레우스 혈청형 5 및/또는 유형 8 피막 폴리사카라이드일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 ClfA 항원; Hla 항원; SpA 항원; 에스. 아우레우스 혈청형 5로부터의 피막 폴리사카라이드 및 에스. 아우레우스 혈청형 8로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
한 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 피막 폴리사카라이드 단백질은 상기 항원 (a)-(c) 중 하나에 접합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 Hla 항원에 접합된 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드 및/또는 ClfA 항원에 접합된 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
한 실시양태에서, ClfA 항원은 서열식별번호(SEQ ID NO): 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ClfA 단백질, 또는 그의 면역원성 단편이다.
ClfA 항원은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 (또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열에서 동등한 위치)을 기준으로 하여 P116에서 S로의 아미노산 치환 및 Y118에서 A로의 아미노산 치환으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 임의적으로 서열식별번호: 5-7 또는 32 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
ClfA 항원은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 1개 이상의 컨센서스 서열(들)을 포함할 수 있으며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 상기 컨센서스 서열은 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 313-342 사이의 1개 이상의 아미노산에서 부가될 수 있거나 또는 그를 치환할 수 있고, 임의적으로 위치 I337에서의 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산을 치환할 수 있다. 한 실시양태에서, X는 Q (글루타민)이고, Z는 A (알라닌)이다 (예를 들어 K-D-Q-N-A-T- K, 서열식별번호: 31).
바람직한 실시양태에서, ClfA 항원은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 32의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 실시양태에서, Hla 항원은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Hla 단백질, 또는 그의 면역원성 단편이다.
Hla 항원은 서열식별번호: 3의 위치 H35에서의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 임의적으로 H에서 L로의 아미노산 치환이다.
Hla 항원은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 1개 이상의 컨센서스 서열(들)을 포함할 수 있으며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 상기 컨센서스 서열은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열의 1개 이상의 아미노산에서 부가될 수 있거나 또는 그를 치환할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 컨센서스 서열은 서열식별번호: 3의 위치 K131에서의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산을 치환하였다. 한 실시양태에서, X는 Q (글루타민)이고, Z는 R (아르기닌)이다 (예를 들어 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30).
바람직한 실시양태에서, Hla 항원은 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 실시양태에서, SpA 항원은 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 26 또는 서열식별번호: 27과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 SpA 단백질, 또는 그의 면역원성 단편이다.
SpA 항원은 (a) VH3과의 결합을 방해하거나 또는 감소시키는 도메인 E, D, A, B 또는 C의 VH3-결합 서브-도메인에서의 1개 이상의 아미노산 치환, 및 (b) IgG Fc와의 결합을 방해하거나 또는 감소시키는 도메인 E, D, A, B 또는 C의 IgG Fc 결합 서브-도메인에서의 1개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, SpA 항원은 (i) 서열식별번호: 14의 아미노산 위치 34 및 35에서의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 E; 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 39 및 40에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D; 서열식별번호: 16의 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 A; 서열식별번호: 17의 위치 아미노산 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 B, 및/또는 서열식별번호: 18의 위치 아미노산 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 C를 포함하고/거나; (ii) 서열식별번호: 14의 아미노산 위치 7 및 8에서의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 E; 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 12 및 13에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D; 서열식별번호: 16의 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 A; 서열식별번호: 17의 위치 아미노산 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 B, 및/또는 서열식별번호: 18의 위치 아미노산 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 C를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 글루타민에서 리신으로의 치환 및/또는 아스파르트산에서 알라닌으로의 치환이다. 예시적인 서열은 서열식별번호: 19-23, 24 및 25이다.
한 실시양태에서, SpA 항원은 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 4 및 5에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D를 포함한다. 상기 아미노산 치환은 적합하게는 글루타민에서 리신으로의 치환 및/또는 글루타민에서 아르기닌으로의 치환, 예를 들어 QQ에서 KR로의 치환일 수 있다 (예를 들어 서열식별번호: 24 및 서열식별번호: 25).
한 실시양태에서, SpA 항원은 서열식별번호: 19-23, 26 또는 27의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 19-23, 26 또는 27과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, SpA 항원은 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 (i) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 ClfA 항원; (ii) 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 Hla 항원; (iii) 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 SpA 항원; (iv) 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드, 및 (v) 에스. 아우레우스 혈청형 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함한다. ClfA 항원은 에스. 아우레우스 혈청형 유형 8 피막 폴리사카라이드에 접합될 수 있고, Hla 항원은 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드에 접합될 수 있다. 상기 ClfA-CP8 및 Hla-CP5 접합체는 적합하게는 생체접합체일 수 있다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 (i) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 ClfA 항원; (ii) 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 Hla 항원; (iii) 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 SpA 항원; (iv) Hla 항원에 접합된 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드, 및 (v) ClfA 항원에 접합된 에스. 아우레우스 혈청형 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 ClfA-CP8 및 Hla-CP5 접합체는 생체접합체이다. 면역원성 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 본 발명의 면역원성 조성물 및 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 백신을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 (i) 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 포함하는 제1 용기; 및 (ii) 아주반트를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 한 측면은 포도상구균 감염, 예를 들어 에스. 아우레우스 감염의 예방 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물 또는 백신은 아주반트와 조합하여 투여된다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 아주반트를 포함한다. 또 다른 측면에서, 면역원성 조성물은 아주반트와 조합하여 투여된다. 아주반트는 면역원성 조성물과 동시에 투여될 수 있으며, 예를 들어 이는 투여 전에 면역원성 조성물과 혼합될 수 있다.
한 실시양태에서, 아주반트는 적합하게는 리포솜 제형 중에 사포닌 및 TLR4 효능제를 포함한다. 한 실시양태에서, 아주반트는 스테롤을 추가로 포함한다. 사포닌은 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 껍질로부터 유래된 면역학적으로 활성인 사포닌 분획, 바람직하게는 QS21일 수 있다. 한 실시양태에서, TLR4 효능제는 리포폴리사카라이드이다. 리포폴리사카라이드는 지질 A 유도체, 바람직하게는 3D-MPL일 수 있다. 스테롤은 콜레스테롤일 수 있다. 한 실시양태에서, 아주반트는 인간 용량당 25 μg의 수준으로 QS21 및/또는 인간 용량당 25 μg의 수준으로 3D-MPL (예를 들어 AS01E)을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 포도상구균 감염, 예를 들어 에스. 아우레우스 감염의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 포도상구균 감염, 예를 들어 에스. 아우레우스 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 대상체에게 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 아주반트는 면역원성 조성물과 동시에 투여될 수 있으며, 예를 들어 이는 투여 전에 면역원성 조성물과 혼합될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 항원, 및 임의적으로 아주반트를 제약상 허용가능한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, 청구항들 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 면역원성 조성물의 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
도 1. 마우스에서 백신-특이적 IgG. 아주반트화되지 않은 및 알룸/TLR7 또는 AS01E로 아주반트화된 백신으로 면역화된 나이브 마우스에서 항원-특이적 IgG 역가 (항-CP5 (1A), 항-CP8 (1B), 항-Hla (1C), 항-ClfA (1D), 및 항-SpA (1E). 각각의 기호는 30 마리의 마우스 그룹을 나타내고, 이들은 AS01 (삼각형), 알룸/TLR7 (원) 또는 아주반트 없음 (사각형)으로 10 μg (빈 기호) 또는 1 μg (채워진 기호)으로 제1일 및 제29일에 면역화되었다. Y-축: 95% CI를 갖는 GMT. 제1 및 제2 면역화 이후 상이한 시점에서 출혈시켰다. IgG 역가의 GMT 및 출혈 시점을 각각 y 및 x 축 상에 기록한다. 점선 = LLOQ/2: 정량 하한의 절반. 각각의 시점에 대한 30개의 개별 BALB/c 혈청을 루미넥스(Luminex)에 의해 분석하였다.
도 2: 아주반트화되지 않은 및 알룸/TLR7 또는 AS01 E 로 아주반트화된 백신에 의해 유도된 마우스에서 백신-특이적 CD4 T-세포 반응의 규모 및 질. 제2 면역화 이후 12 일째에 희생된 단일 마우스로부터의 비장세포를 시험관 내에서 백신 단백질로 자극하거나 자극하지 않고 (2a: SpAmut, 1 μg/ml; 2b: Hlamut, 10 μg/ml; 2C: ClfAmut, 10 μg/ml), 염색하고, ICS에 의해 분석하였다. IL-2, TNF, IL-4/IL-13, IFN-γ 또는 IL-17A를 생성하는 CD4+CD44high T 세포를 확인하였다. 위쪽 그래프: CD4+CD44high ≥ CYT+. 아래쪽 그래프: CD4+CD44high ≥ IFN-γ. 비자극된 세포의 반응을 자극된 세포의 반응으로부터 차감하였다. 규모: 백신 단백질 자극에 대한 반응으로 분석한 시토카인 중 적어도 하나를 생성하는 CD4+CD44high T 세포의 백분율. 질: 적어도 IL-4/IL-13이 아니라 IFN-γ를 생성하는 CD4+CD44high T 세포의 백분율. % 기하 평균 비의 이원 ANOVA, p < 0.05를 나타냄: * 백신 (아주반트 있음 또는 없음) vs. 대조군 그룹; * 아주반트가 있는 백신 vs. 아주반트가 없는 백신; * AS01E가 있는 백신 vs. 알룸/TLR7이 있는 백신; * 백신-10 μg vs. 백신-1 μg.
도 3: 사전 노출된 토끼에서 백신-특이적 IgG. AS01E 아주반트 또는 버퍼가 있거나 또는 없는 백신의 2회 주사를 제공받은 사전 노출된 토끼에서 기하 평균 역가 항-CP5 (3a), 항-CP8 (3b), 항-Hla (3c), 항-ClfA (3d), 및 항-SpA (3e). Pre: 투여 1 이전, 1wp1: 투여 1 이후 1 주, 2wp1: 투여 1 이후 2 주, 4wp1: 투여 1 이후 4 주, 2wp2: 투여 2 이후 2 주, 4wp2: 투여 2 이후 4 주; 5wp2: 투여 2 이후 5 주. LLOQ2 점선: 정량 하한의 절반. 삼각형: 1 μg 용량; 원: 10 μg 용량; 사각형: 50μg 용량. 빈 기호: 아주반트 없음, 채워진 기호: AS01E. 채워진 다이아몬드로 제시된 버퍼 대조군. 회색 점선은 검정에서 사용된 최저 희석의 역수를 나타낸다.
도 4a: 백신은 마우스에서 시험관내 Hla 활성을 중화시키는 기능적 IgG를 유도한다. 마우스 (10 마리의 마우스/그룹)를 아주반트 없이 또는 알룸/TLR7 또는 AS01E 아주반트의 존재 하에 지정된 용량의 백신으로 면역화시켰다. 풀링된 혈청의 중화 역가를 각각의 시점에서 측정하였고, 3회의 독립적인 연구의 중앙값으로 표현하였다 (적색 및 청색 사각형 및 별). 막대의 상부 및 하부 값은 각각 최대 및 최소 역가를 나타낸다. 빈 기호: 10 μg 용량; 막힌 기호: 1 μg 용량. 사각형: 아주반트 없음; 삼각형: AS01E 아주반트; 원: 알룸/TLR7 아주반트. 회색 점선은 검정에서 사용된 최저 희석의 역수를 나타낸다.
도 4b: 백신은 사전 노출된 토끼에서 시험관내 Hla 활성을 중화시키는 기능적 IgG를 유도한다. 분석된 출혈의 Hla 중화 역가 및 시점을 각각 y 및 x 축 상에 기록한다. 회색 점선은 검정에서 사용된 최저 희석의 역수를 나타낸다. 비반응자에게는 3의 임의 역가가 배정되었다. 삼각형: 1 μg 용량; 원: 10 μg 용량; 사각형: 50μg 용량. 빈 기호: 아주반트 없음, 채워진 기호: AS01E. 채워진 다이아몬드로 제시된 버퍼 대조군.
도 5a: 백신은 마우스에서 시험관내 ClfA 활성을 중화시키는 기능적 IgG를 유도한다. 마우스 (10 마리의 마우스/그룹)를 아주반트 없이 또는 알룸/TLR7 또는 AS01E 아주반트의 존재 하에 3회의 독립적인 생체내 실험으로 지정된 용량의 백신으로 면역화시켰다. 3회의 생체내 실험의 풀링된 혈청의 중화 역가를 각각의 시점에서 측정하였고, 중앙값으로 표현하였다. 막대의 상부 및 하부 값은 각각 최대 및 최소 역가를 나타낸다. 빈 기호: 10 μg 용량; 막힌 기호: 1 μg 용량. 사각형: 아주반트 없음; 삼각형: AS01E 아주반트; 원: 알룸/TLR7 아주반트. 회색 점선은 검정에서 사용된 최저 희석의 역수를 나타낸다.
도 5b: 백신은 사전 노출된 토끼에서 시험관내 ClfA 활성을 중화시키는 기능적 IgG를 유도한다. 개별 혈청의 중화 역가를 백신접종 이전에, 4wp1 및 2wp2에 측정하였다. 2wp2에서만 일부 중화 활성을 95% 신뢰 구간 (CI)으로 기하 평균 (GMT)으로서 표현한다. 회색 점선은 검정에서 사용된 최저 희석의 역수를 나타낸다. 비반응자에게는 2의 임의 역가가 배정되었다. 삼각형: 10 μg 용량; 원: 10 μg 용량; 사각형: 50μg 용량. 빈 기호: 아주반트 없음, 채워진 기호: AS01E. 채워진 다이아몬드로 제시된 버퍼 대조군.
도 6: 백신은 사전 노출된 토끼에서 혈청형 5 (도 6a) 및 8 (도 6b) 에스. 아우레우스 균주에 대해 OPK 활성을 갖는 항체를 유도한다. 12개의 개별 혈청의 OPK 역가를 백신접종 이전에 및 2wp2에 측정하였다. 95% 신뢰 구간으로 표현된 GMT. 삼각형: 아주반트 없음. 원: AS01E 아주반트. 다이아몬드: 버퍼 단독.
도 7: 백신접종은 사전 노출된 토끼에서 더 높은 친화도를 갖는 항-Hla 항체를 증가시킨다. 백신접종 이전에, 2wp1 및 2wp2에 개별 혈청에서 검정된 % 항체 해리. 95% 신뢰 구간으로 표현된 GMT. 삼각형: 아주반트 없음. 원: AS01E 아주반트. 다이아몬드: 버퍼 단독.
도 8: 백신접종은 사전 노출된 토끼에서 더 높은 친화도를 갖는 항-SpA mut 항체를 증가시킨다. 백신접종 이전에, 2wp1 및 2wp2에 개별 혈청에서 검정된 % 항체 해리. 95% 신뢰 구간으로 표현된 GMT. 삼각형: 아주반트 없음. 원: AS01E 아주반트. 다이아몬드: 버퍼 단독.
도 9: 백신접종은 사전 노출된 토끼에서 더 높은 친화도를 갖는 항-ClfA 항체를 증가시킨다. 백신접종 이전에, 2wp1 및 2wp2에 개별 혈청에서 검정된 % 항체 해리. 95% 신뢰 구간으로 표현된 GMT. 삼각형: 아주반트 없음. 원: AS01E 아주반트. 다이아몬드: 버퍼 단독.
도 10: 백신접종은 사전 노출된 토끼에서 더 높은 친화도를 갖는 항-CP5 항체를 증가시킨다. 백신접종 이전에, 2wp1 및 2wp2에 개별 혈청에서 검정된 % 항체 해리. 95% 신뢰 구간으로 표현된 GMT. 삼각형: 아주반트 없음. 원: AS01E 아주반트. 다이아몬드: 버퍼 단독.
정의
용어
담체 단백질: 접합체 (예를 들어 생체접합체)를 생성하기 위해 항원 (예를 들어 사카라이드 항원)에 공유 부착된 단백질. 담체 단백질은 그가 접합된 항원과 관련하여 T-세포 매개된 면역력을 활성화시킨다.
접합체: 담체 단백질에 공유 연결된 사카라이드 (예컨대 피막 폴리사카라이드).
생체접합체: 사카라이드 합성에 필요한 효소, 담체 단백질, 및 숙주 세포에서의 접합을 위해 필요한 효소를 발현시킴으로써 재조합적으로 생성되는 접합체이며, 사카라이드가 N-연결된 단백질 글리코실화를 통해 담체 단백질에 N-연결된 접합체를 생성함 (효소 작용에 의해 표적 단백질의 폴리펩티드 쇄에서 탄수화물 분자를 아스파라긴 잔기에 부가).
프롤린 (pro, P) 이외의 임의의 아미노산은 알라닌 (ala, A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp,D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile,I), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y), 및 발린 (val, V)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 지칭한다.
ClfA: 에스. 아우레우스로부터의 응괴 인자 A
Hla: 에스. 아우레우스로부터의 알파-용혈소 (알파-독소로도 공지됨)
ClfA: 에스. 아우레우스로부터의 포도상구균 단백질 A
CP: 피막 폴리사카라이드
LPS: 리포폴리사카라이드.
환원 단부: 폴리사카라이드의 환원 단부는 글리코시드 결합에 관여하지 않아서 열린 사슬 형태로 전환될 수 있는 유리 아노머 탄소를 갖는 모노사카라이드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체접합체"는 숙주 세포 백그라운드에서 제조된 단백질 (예를 들어 담체 단백질)과 항원 (예를 들어 사카라이드) 사이의 접합체를 지칭하며, 숙주 세포 기구는 항원을 단백질에 연결시킨다 (예를 들어 N-연결).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 대상체에게 요법 (예를 들어 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신)을 투여하는 것과 관련하여 예방적 및/또는 치료적 효과(들)을 갖는 요법의 양을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "유효량"은 하기 효과 중 1, 2, 3, 4 가지 또는 그 초과를 달성하는데 충분한 요법의 양을 지칭한다: (i) 박테리아 감염 또는 그와 연관된 증상의 중증도를 감소시키거나 또는 개선시킴; (ii) 박테리아 감염 또는 그와 연관된 증상의 지속기간을 감소시킴; (iii) 박테리아 감염 또는 그와 연관된 증상의 진행을 예방함; (iv) 박테리아 감염 또는 그와 연관된 증상의 퇴행을 일으킴; (v) 박테리아 감염 또는 그와 연관된 증상의 발달 또는 개시를 예방함; (vi) 박테리아 감염 또는 그와 연관된 증상의 재발을 예방함; (vii) 박테리아 감염과 연관된 장기 부전을 감소시킴; (viii) 박테리아 감염을 가진 대상체의 입원을 감소시킴; (ix) 박테리아 감염을 가진 대상체의 입원 기간을 감소시킴; (x) 박테리아 감염을 가진 대상체의 생존을 증가시킴; (xi) 대상체에서 박테리아 감염을 제거함; (xii) 대상체에서 박테리아 복제를 억제하거나 또는 감소시킴; 및/또는 (xiii) 또 다른 요법의 예방적 또는 치료적 효과(들)을 증강시키거나 또는 개선시킴.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 동물, 특히 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어 인간)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성 단편"은 숙주 동물, 예를 들어 인간에서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는, 해당 단편에 대해 특이적인, 전체 항원보다 작은 항원의 일부분이다. 단백질의 단편은 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여, 예를 들어 재조합적으로, 단백질 가수분해 소화에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 하나의 단부 (말단 단편의 경우) 또는 말단 둘 다 (내부 단편의 경우)로부터의 1개 이상의 뉴클레오티드를 제거함으로써 생성될 수 있다. 전형적으로, 단편은 전장 서열의 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50개의 연속하는 아미노산을 포함한다. 그러나, 단편은 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상 또는 400개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 단편은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산을 N 및 C 말단 중 하나 또는 둘 다에 부가하거나 또는 그로부터 제거함으로써 용이하게 변형될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 해당 위치에서 아미노산 잔기의 크기, 극성, 전하, 소수성 또는 친수성에 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않고 면역원성을 감소시키지 않도록 본래의 아미노산 잔기를 본래의 것이 아닌 잔기로 치환하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이들은 하기 그룹 내에서의 치환일 수 있다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 폴리펩티드 서열에 대한 보존적 아미노산 변형 (및 코딩 뉴클레오티드의 상응하는 변형)은 모 폴리펩티드와 유사한 기능적 및 화학적 특징을 갖는 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결실"은 단백질 서열로부터 1개 이상의 아미노산 잔기의 제거이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "삽입"은 단백질 서열에서 1개 이상의 본래의 것이 아닌 아미노산 잔기의 부가이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산 ... 사이의" (예를 들어 "아미노산 313-342" 사이의)는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 연속하여 카운팅한 아미노산 번호를 지칭하며, 예를 들어 "서열식별번호: 2의 ... 아미노산 313-342 사이의"는 서열식별번호: 2의 313번째와 342번째 아미노산 사이의 아미노산 서열에서의 임의의 위치를 지칭한다.
"서열 동일성"은 기준 서열의 전장에 걸쳐 또는 의문 서열의 전장에 걸쳐 계산될 수 있다. 서열 정렬 도구에는 클러스탈 오메가(Clustal Omega) (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk) MUSCLE (www(.)ebi(.)ac(.)uk), 또는 티-커피(T-coffee) (www(.)tcoffee(.)org)가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 한 측면에서, 사용된 서열 정렬 도구는 클러스탈 오메가 (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)이다.
본 발명의 설명
SpA 항원
야생형 SpA (포도상구균 단백질 A)는 폐 감염, 패혈증, 및 농양 발달에 대한 결정적인 병독성 인자인 세포 벽-고정된 표면 단백질이며, 대부분의 임상적 에스. 아우레우스 단리물에 의해 발현된다. 야생형 SpA는 인간 IgG의 Fc 부분에, VH3-함유 B 세포 수용체에, 그의 A1 도메인의 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자에 및 TNF-α 수용체 1에 결합한다. SpA와 B 세포 수용체의 상호작용은 적응성 및 선천성 면역 반응에 대해 효과를 가지면서 B 세포 발달에 영향을 미치는 반면에, IgG의 Fcγ에 대한 그의 결합은 다형핵 백혈구에 의한 포도상구균의 옵소닌 식세포 작용성 제거를 방해한다. 성숙한 SpA의 N-말단 부분은 4개 또는 5개의 56-61-잔기 Ig-결합 도메인으로 구성되고, 이는 짧은 링커에 의해 연결된 삼중 나선형 번들로 접히고, E, D, A, B 및 C의 순서로 지정된다. 이들 도메인은 아미노산 수준에서 ~80% 동일성을 나타내고, 56 내지 61개 잔기 길이이고, 직렬 반복부로서 조직화된다. C-말단 영역은 매우 반복적이지만 가변적인 옥타펩티드인 "Xr" 및 SpA의 세포 벽 고정 구조체에 인접한 도메인인 "Xc"로 구성된다.
NCTC 8325 균주에서 SpA는 SAOUHSC_00069이고, 아미노산 서열 서열식별번호: 4 (GI:88193885)를 갖는다. 뉴만(Newman) 균주에서 이는 nwmn_0055 (GI:151220267)이다. 서열식별번호: 4의 유용한 단편은 아미노산 37 내지 325 (서열식별번호: 13)이다. 이 단편은 5개의 모든 SpA Ig-결합 도메인 (N-말단에서 C-말단으로 E, D, A, B, C의 순서로 자연적으로 배열되며, 각각 서열식별번호: 14, 15, 16, 17 및 18의 서열을 가짐)을 함유하고, SpA의 가장 많이 노출된 도메인을 포함한다. 이는 인간 단백질과의 항원 유사성을 또한 감소시킨다. SpA가 B 세포 수퍼항원으로 기능하는 경우에 발생할 수 있는 과도한 B 세포 확장을 방지하기 위해, 다른 유용한 단편에서는 천연 A, B, C, D 및/또는 E 도메인 중 1, 2, 3 또는 4개가 생략될 수 있다. 다른 유용한 단편은 천연 A, B, C, D 및/또는 E 도메인 중 1, 2, 3 또는 4개만을 포함할 수 있으며, 예를 들어 SpA(A) 도메인만을 포함하고 B 내지 E는 포함하지 않거나, 또는 SpA(D) 도메인만을 포함하고 A, B, C 또는 E는 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명에서 유용한 SpA 항원은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 IgG-결합 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 SpA 항원은 (예를 들어 인간에게 투여될 때) 서열식별번호: 13을 인식하는 항체를 유도할 수 있고/거나, (a) 서열식별번호: 13과 50% 이상의 동일성 (예를 들어 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과)을 갖고/거나 (b) 서열식별번호: 13의 적어도 'n'개의 연속적인 아미노산의 단편 또는 서열식별번호: 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 (여기서 'n'은 7 이상임 (예를 들어 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 SpA 항원에는 서열식별번호: 13의 변이체가 포함된다. (b)의 바람직한 단편은 서열식별번호: 13, 또는 서열식별번호: 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로부터의 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은, 서열식별번호: 13의 적어도 1개의 에피토프를 보유하면서, 서열식별번호: 13의 C-말단으로부터 1개 이상의 아미노산 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 또는 그 초과) 및/또는 N-말단으로부터 1개 이상의 아미노산 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 또는 그 초과)이 결여되어 있다. 개별 IgG-결합 도메인은 단독으로 또는 조합되어 유용한 면역원일 수 있다.
항원이 SpA 도메인의 1가지 유형만을 (예를 들어 Spa(A), SpA(D) 또는 Spa(E) 도메인만을) 포함하는 경우, 이는 단일 폴리펩티드 쇄에서 이 도메인의 1개 초과의 카피, 예를 들어 다중 SpA(D) 도메인을 포함할 수 있다. 이는 또한 1가지 유형의 SpA 도메인 및 또 다른 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항원은 1가지 유형의 SpA 도메인만을, 예컨대 SpA(D) 도메인만을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 SpA 항원은 인간 IgG의 Fcγ 부분에 대해 및/또는 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 감소된 친화도를 갖도록 서열식별번호: 13에 비해 돌연변이 될 수 있다. 이는 예를 들어 WO2011/005341, WO12/003474 및 WO2015/144653에서의 지침에 따라 달성되고 평가될 수 있다. 따라서, 야생형 SpA에서 적어도 1개의 Gln-Gln 디펩티드가 돌연변이 (예를 들어 Lys-Lys로; 다른 가능한 돌연변이에는 Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Ala-Ala, Ser-Ser, Ser-Thr, Thr-Thr 등이 포함됨)될 수 있고/거나, 야생형 SpA에서 적어도 1개의 Asp-Asp 디펩티드가 돌연변이 (예를 들어 Ala-Ala로; 다른 가능한 돌연변이에는 Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg, Arg-Lys, His-His, Val-Val 등이 포함됨)될 수 있다. 돌연변이에 대한 이들 표적 서열은 서열식별번호: 4의 아미노산 43, 44, 70, 71, 96, 97, 104, 105, 131, 132, 162, 163, 189, 190, 220, 221, 247, 248, 278, 279, 305 및/또는 306에 상응하는 잔기이다.
항원 내의 개별 도메인은 서열식별번호: 4에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산에서 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, Gln-Gln 및 Asp-Asp 서열과 관련하여 상기를 참고하고, 도메인 D의 잔기 3 및/또는 24에서, 도메인 A의 잔기 46 및/또는 53 등에서의 돌연변이를 개시하는 WO2011/005341을 참고함). 이러한 돌연변이는 서열식별번호: 13을 인식하는 항체를 유도하는 항원의 능력을 제거하지 않아야 하지만, 상기 언급된 바와 같이 IgG 및/또는 다른 인간 단백질 (예컨대 인간 혈액 단백질)에 대한 항원의 결합은 감소시키거나 또는 제거할 것이다. 한 실시양태에서, 돌연변이 SpA 항원은 서열식별번호: 4의 위치 43, 44, 70, 71, 96, 97, 104, 105, 131, 132, 162, 163, 189, 190, 220, 221, 247, 248, 278, 279, 305 및/또는 306에 상응하는 아미노산에서 적어도 1개, 더욱 특별하게는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개, 더욱 더 특별하게는 20개의 아미노산에서 돌여변이된 서열식별번호: 13을 포함하거나 또는 그로 이루어진 서열을 갖는다. 이들 위치에 대해 유용한 치환은 상기 언급되어 있다. 예를 들어, SpA 도메인 E는 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 43, 44, 70 및/또는 71에 상응하는 위치에서 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 19). SpA 도메인 D는 서열식별번호: 4의 아미노산 잔기 96, 97, 104, 105, 131 및/또는 132에 상응하는 위치에서 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 20 또는 24). SpA 도메인 A는 서열식별번호: 4의 아미노산 잔기 162, 163, 189 및/또는 190에 상응하는 위치에서 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 21). SpA 도메인 B는 서열식별번호: 4의 아미노산 잔기 220, 221, 247 및/또는 248에 상응하는 위치에서 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 22). SpA 도메인 C는 서열식별번호: 4의 아미노산 잔기 278, 279, 305 및/또는 306에 상응하는 위치에서 돌연변이될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 23). 서열식별번호: 4의 위치 43, 44, 96, 97, 104, 105, 162, 163, 220, 221, 278 및/또는 279에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 인간 IgG의 Fcγ 부분과의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 반면에, 서열식별번호: 4의 위치 70, 71, 131, 132, 189, 190, 247, 248, 305 및/또는 306에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분과의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 것으로 생각된다.
따라서, SpA 항원은 바람직하게는 (a) VH3과의 결합을 방해하거나 또는 감소시키는 SpA 도메인 E, D, A, B 또는 C의 VH3-결합 서브-도메인에서 1개 이상의 아미노산 치환, 및 (b) IgG Fc와의 결합을 방해하거나 또는 감소시키는 SpA 도메인 E, D, A, B 또는 C의 IgG Fc 결합 서브-도메인에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. E/D, D/A, A/B 및 B/C 도메인 경계는 문헌 [Kim et al., 2014.Vaccine 32: 464-469]에 기재된 도메인을 기반으로 할 수 있다.
한 실시양태에서, SpA 항원은 서열식별번호: 14의 아미노산 위치 7 및 8에서의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 E; 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 12 및 13에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D; 서열식별번호: 16의 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 A; 서열식별번호: 17의 위치 아미노산 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 B, 및/또는 서열식별번호: 18의 위치 아미노산 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 C를 포함한다. 바람직하게는, 상기 아미노산 치환은 예를 들어 서열식별번호: 19-24에서와 같이 글루타민에서 리신으로의 치환이다. 바람직한 실시양태에서, SpA 항원은 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 4 및 5에서의 아미노산 치환, 예를 들어 글루타민에서 리신 또는 아르기닌으로의 치환, 예를 들어 KR을 갖는 도메인 D를 추가로 포함한다 (예를 들어 서열식별번호: 24 또는 서열식별번호: 25).
한 실시양태에서, SpA 항원은 서열식별번호: 14의 아미노산 위치 34 및 35에서의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 E; 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 39 및 40에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D; 서열식별번호: 16의 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 A; 서열식별번호: 17의 위치 아미노산 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 B, 및/또는 서열식별번호: 18의 위치 아미노산 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 C를 포함한다. 바람직하게는, 상기 아미노산 치환은 예를 들어 서열식별번호: 19-24에서와 같이 아스파르트산에서 알라닌으로의 치환이다.
본 발명의 예시적인 SpA 항원은 서열식별번호: 26 또는 더욱 바람직하게는 서열식별번호: 27의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 다른 예시적인 SpA 항원은 서열식별번호: 26 또는 서열식별번호: 27과 50% 이상의 동일성 (예를 들어 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과의)을 가질 수 있고/거나, 서열식별번호: 26 또는 서열식별번호: 27의 적어도 'n'개의 연속적인 아미노산의 단편을 포함할 수 있고, 여기서 'n'은 7 이상 (예를 들어 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 그 초과)이다.
ClfA 항원
숙주 세포외 매트릭스 성분에 대한 박테리아의 부착은 박테리아 감염에서 결정적인 초기 단계이다. 응괴 인자 A (ClfA)는 병독성에 필요한 중요한 에스. 아우레우스 부착소이며, 박테리아가 숙주 방어 메카니즘을 회피하는 것을 도와준다. 이는 ECM에서 피브리노겐에 결합하여, 숙주 조직의 부착 및 콜로니화를 보조하고, 추가로 세포 응괴 및 피브리노겐에서 박테리아 세포의 코팅을 일으키며, 이는 박테리아 상에서 옵소닌의 침착을 손상시킴으로써 면역 회피를 촉진시킨다.
ClfA는 거의 모든 에스. 아우레우스 균주에 존재한다. 이는 중요한 병독성 인자이며, 패혈성 관절염 및 심내막염의 병인에 기여한다. ClfA는 피브리노겐의 γ-쇄의 C-말단에 결합하고, 이로써 피브리노겐 용액에서 박테리아의 응괴를 유도할 수 있다. 에스. 아우레우스 상에서 ClfA의 발현은 마크로파지 및 호중구 둘 다에 의한 식세포 작용을 방해한다. 호중구에서 이는 피브리노겐-의존성 및 피브리노겐-비의존성 메카니즘 둘 다로 인한 것이다. 대조적으로, 혈소판은 ClfA를 발현하는 박테리아에 의해 GPIIb/IIIa과의 상호작용을 통해 활성화되어 응집을 초래한다. 이는 피브리노겐이 존재할 때 가장 효율적으로 수행되지만, 혈소판 활성화를 위한 피브리노겐-비의존성 경로 또한 있다.
ClfA는 520개 아미노산 N-말단 A 도메인 (피브리노겐 결합 영역)을 함유하며, 이는 3가지 별도로 접힌 서브도메인 N1, N2 및 N3을 포함한다. A 도메인에 이어서 세린-아스파르테이트 디펩티드 반복 영역 및 세포 벽- 및 막-스패닝 영역이 있으며, 이는 세포 벽으로의 소르타제-촉진된 고정을 위한 LPDTG-모티프를 함유한다. A 도메인 (서브도메인 N1-3)의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제시된다. A 도메인 서브도메인 N2N3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 제시된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 ClfA 항원은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 면역원성 단편 및/또는 변이체 (예를 들어 서열식별번호: 5-7) 또는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 ClfA 항원은 전장 서열의 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 100, 적어도 약 300 또는 적어도 약 400개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 5-8의 면역원성 단편을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 대해 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ClfA 항원은 ClfA의 서브도메인 N1, N2 및 N3 (서열식별번호: 1) 또는 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (또는 그로 이루어질 수 있다). 다른 실시양태에서, 본 발명의 변형된 ClfA 항원은 서브도메인 N2 및 N3 (서열식별번호: 2) 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (또는 그로 이루어질 수 있다).
따라서, 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 5)을 포함하는 (또는 그로 이루어진) ClfA 항원을 제공한다. 한 실시양태에서, ClfA 항원은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된, 글리코실트랜스퍼라제 효소, 예를 들어 PglB에 대한 1개 이상의 컨센서스 서열(들)을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 한 실시양태에서, 컨센서스 서열은 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 28)이고, X는 Q (글루타민)이고, Z는 R (아르기닌)이다 (예를 들어 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30)). 바람직한 실시양태에서, 컨센서스 서열은 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)이고, 여기서 X는 Q (글루타민)이고, Z는 A (알라닌)이다 (예를 들어 K-D-Q-N-A-T-K (서열식별번호: 31)). ClfA 항원은 클로닝 목적을 위해 N-말단 세린의 부가에 의해 추가로 변형될 수 있다 (예를 들어 서열식별번호: 7). ClfA 항원은 하기 기재된 바와 같이 피브리노겐 결합을 제거하는 돌연변이를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다 (예를 들어 서열식별번호: 5-7).
한 실시양태에서, 본 발명의 ClfA 항원은 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이 서열은 1개 이상의 아미노산 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산)의 결실 및/또는 부가 및/또는 치환에 의해 변형된 서열식별번호: 2의 변이체이다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적일 수 있다. 한 측면에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 변이체가 면역원성 폴리펩티드인 한, 치환, 결실, 부가 또는 이들의 임의의 조합은 단일 변이체에서 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 ClfA 항원은 1 내지 10개, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 1 내지 2개 또는 1개의 아미노산이 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 부가된 변이체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ClfA 항원은 추가의 N-말단 세린을 포함한다는 점에서 서열식별번호: 2의 변이체인 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 7)로부터 유래될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 B-세포 또는 T-세포 에피토프를 포함하는 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 이러한 에피토프는 예를 들어 PSIPRED 프로그램 (영국 억스브릿지 유비8 3피에이치, 브루넬 유니버시티(Brunel University), 생물과학과(Dept. Biological Sciences), 브루넬 바이오인포르마틱스 그룹(Brunel Bioinformatics Group), 데이비드 존스(David Jones)로부터)을 사용하는 2D-구조 예측, 및 제임슨(Jameson) 및 울프(Wolf)에 의해 기재된 방법 (CABIOS 4:181-186 [1988])을 기반으로 하여 계산된 항원 지수의 조합을 이용하여 예측될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, ClfA 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 ClfA 아미노산 서열을 가짐)의 1개 이상의 아미노산 (예를 들어 1-7개의 아미노산, 예를 들어 1개의 아미노산)은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 또는 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) (예를 들어 K-D-Q-N-A-T-K (서열식별번호: 31)) 컨센서스 서열에 의해 치환되었다. 예를 들어, ClfA 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 2 또는 5)에서 단일 아미노산은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 또는 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) (예를 들어 K-D-Q-N-A-T-K (서열식별번호: 31)) 컨센서스 서열로 치환될 수 있다. 대안적으로, ClfA 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 ClfA 아미노산 서열)의 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 또는 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) (예를 들어 K-D-Q-N-A-T-K (서열식별번호: 31)) 컨센서스 서열로 치환될 수 있다.
한 실시양태에서, 컨센서스 서열은 서열식별번호: 2의 1개 이상의 아미노산 잔기 313-340에서 (예를 들어, 1개 이상의 아미노산 잔기(들) 330-340 대신에, 또는 아미노산 잔기 Q327, D329, P331 또는 I337, 바람직하게는 I337 대신에) 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 5-7)에서의 동등한 위치에서 부가되었거나 또는 그를 치환하였다.
D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 컨센서스 서열(들)의 도입은 ClfA 항원이 글리코실화되게 한다. 따라서, 본 발명은 또한 ClfA 항원이 글리코실화된 본 발명의 ClfA 항원을 제공한다.
병독성 인자로서 작용하기 위해서는 ClfA의 피브리노겐-결합 활성이 필요하기 때문에, ClfA 항원은 생체내 투여될 수 있도록 피브리노겐-결합 활성을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형된 ClfA 항원은 WO2011/007004에 기재된 돌연변이 중 하나, 예를 들어 서열식별번호: 2의 잔기 P116 및 Y118에 상응하는 아미노산 중 하나 또는 바람직하게는 둘 다에서의 돌연변이, 예를 들어 P116S 및/또는 Y118A를 가질 수 있다. 예시적인 서열은 서열식별번호: 5-7의 것들이다. 한 실시양태에서, 한 측면에서, 본 발명의 ClfA 항원은 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 (또는 그로 이루어지고), 상기 아미노산 서열은 P116에서 S로의 아미노산 치환 및 Y118에서 A로의 아미노산 치환을 포함한다 (예를 들어 서열식별번호: 5-7 또는 32).
한 실시양태에서, 예를 들어 서열식별번호: 7에서와 같이, 추가의 아미노산 잔기 (예를 들어, 세린 또는 알라닌)가 성숙한 항원의 N-말단에서 부가된다. 이러한 잔기는 리더 서열의 더욱 효율적인 절단을 유도하는 이점을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명의 ClfA 항원은 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 (또는 그로 이루어지고), 상기 아미노산 서열은 P116에서 S로의 아미노산 치환 및 Y118에서 A로의 아미노산 치환, K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) 컨센서스 서열을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고 (바람직하게는 K-D-Q-N-A-T-K (서열식별번호: 31), 예를 들어 서열식별번호: 6), 임의적으로 N-말단에서 추가의 세린 잔기를 갖는다 (예를 들어 서열식별번호: 7). 한 실시양태에서, 본 발명의 ClfA 항원은 서열식별번호: 1, 2 또는 5-7로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 ClfA 항원은 서열식별번호: 1, 2 또는 5-7로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
Hla 항원
Hla는 중요한 분비된 포도상구균 독소이다. 이는 인간 적혈구 및 다른 세포의 막에 있는 공극을 관통하는 지질-이중층을 생성하여, 세포 용해를 일으킨다.
한 실시양태에서, 본 발명의 Hla 항원은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다 (또는 그로 이루어진다).
한 실시양태에서, Hla 항원은 서열식별번호: 3의 위치 H48 및 G122에서의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 치환은 각각 H에서 C 및 G에서 C이다 (예를 들어 H48C 및 G122C, 예를 들어 서열식별번호: 10-12). 상기 치환은 디술피드 브릿지를 Hla 항원에 도입시키는 역할을 하며, 이는 재조합적으로 생성될 때 단백질의 안정성 및 수율을 개선시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 Hla 항원은 디술피드 브릿지가 결여된 Hla, 예를 들어 야생형 또는 해독된 Hla (예를 들어, Hla H35L, 예를 들어 서열식별번호: 8)와 비교하여 응집하는 경향의 감소를 제시할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 변형된 Hla 항원은 실시예에 기재된 바와 같이 야생형 Hla 또는 HlaH35L에 비해 낮은 응집을 나타내는 것일 수 있다 (예를 들어 웨스턴 블롯에서 검출가능하거나 또는 크로마토그래피 기술, 예를 들어 IMAC 또는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 측정됨). 예를 들어, 적합한 변형된 Hla 항원은 야생형, 해독된 (예를 들어 HlaH35L) Hla 또는 다른 가교된 Hla의 0%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 또는 5%; 약 0%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1% 또는 5%; 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1% 또는 5% 미만; <10%, <20%, <30%, <40%, <50%, <60%, <70%, <80% 또는 <90%인 응집 수준 (본원에 기재된 임의의 방법을 이용하여 결정된 바와 같음)을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 IMAC를 이용할 때, 단량체성 Hla를 나타내는 피크는 가교를 감소시키도록 변형되지 않은 야생형 Hla 또는 HlaH35L 또는 다른 Hla에 비해 더 높을 수 있고/거나, 응집된 Hla를 나타내는 피크는 더 낮을 수 있다.
본 발명의 Hla 항원은 디술피드 브릿지가 결여된 Hla, 예를 들어 야생형 또는 해독된 Hla (예를 들어, Hla H35L, 예를 들어 서열식별번호: 8)에 비해 높은 전체 수율로 생성될 수 있다. 전체 수율이 더 높지 않은 경우에는, 변형된 Hla 항원은 디술피드 브릿지가 결여된 Hla, 예를 들어 야생형 또는 해독된 Hla (예를 들어, Hla H35L, 예를 들어 서열식별번호: 8)에 비해 높은 Hla 단량체 수율로 생성될 수 있다. 예를 들어, 변형된 Hla 항원의 수율은 야생형, 해독된 (예를 들어 HlaH35L) Hla 또는 다른 가교된 Hla와 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90%, 110%, 120%, 150%, 200% 또는 그 초과, 또는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90%, 110%, 120%, 150%, 200% 또는 그 초과만큼 증가될 수 있다. 단백질 수율은 하기 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 Hla 항원은 서열식별번호: 3의 면역원성 단편 및/또는 변이체, 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Hla 항원은 서열식별번호: 3의 면역원성 단편, 또는 전장 서열의 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 40, 또는 적어도 약 60개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 대해 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 Hla 항원은 1개 이상의 아미노산 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산)의 결실 및/또는 부가 및/또는 치환에 의해 변형된 서열식별번호: 3의 변이체인, 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로부터 유래될 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적일 수 있다. 한 측면에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 변이체가 면역원성 폴리펩티드인 한, 치환, 결실, 부가 또는 이들의 임의의 조합은 단일 변이체에서 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 변형된 Hla 항원은 1 내지 10개, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 1 내지 2개 또는 1개의 아미노산이 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 부가된 변이체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 Hla 항원은 N 말단에서 1개 또는 2개의 추가의 아미노산을 갖는다는 점에서 (예를 들어 초기 N-말단 S) 서열식별번호: 3 또는 8-11 중 어느 하나의 변이체인 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 12)로부터 유래될 수 있다. 변형된 Hla 항원은 추가로 또는 대안적으로 C 말단에서 1개 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산을 가질 수 있다. 이러한 추가의 아미노산은 정제를 돕기 위해 펩티드 태그를 포함할 수 있으며, 예를 들어 GSHRHR을 포함할 수 있다 (예를 들어 서열식별번호: 12).
한 실시양태에서, 본 발명은 B-세포 또는 T-세포 에피토프를 포함하는 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 이러한 에피토프는 예를 들어 PSIPRED 프로그램 (영국 억스브릿지 유비8 3피에이치, 브루넬 유니버시티, 생물과학과, 브루넬 바이오인포르마틱스 그룹, 데이비드 존스로부터)을 사용하는 2D-구조 예측, 및 제임슨 및 울프에 의해 기재된 방법 (CABIOS 4:181-186 [1988])을 기반으로 하여 계산된 항원 지수의 조합을 이용하여 예측될 수 있다.
Hla는 독소이기 때문에, 이는 생체내 투여될 수 있기 전에 해독될 필요가 있다 (즉, 보호에 적합한 용량으로 제공될 때, 포유동물, 예를 들어 인간에게 무독성이게 할 필요가 있음). Hla의 세포 용해 활성은 멘지스(Menzies) 및 커노들(Kernodle) (Menzies and Kernodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847)에 의해 기재된 바와 같이 공극 형성에 관여하는 아미노산 잔기의 돌연변이에 의해 감소될 수 있다. 본 발명의 Hla 항원은 유전적으로 해독될 수 있다 (즉, 돌연변이에 의해). 추가로 및/또는 대안적으로, Hla 항원은 예를 들어 에스. 아우레우스 피막 폴리사카라이드에 접합시킴으로써 해독될 수 있다. 유전적으로 해독된 서열은, 인간에게 투여후 항-Hla 보호 및/또는 중화 항체를 유도하는 능력을 유지하면서, 바람직하지 않은 활성, 예컨대 공극을 관통하는 지질-이중층을 형성하는 능력, 막 침투, 세포 용해, 및 인간 적혈구 및 다른 세포에 대한 세포용해 활성을 제거하여 독성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, Hla 항원은 그의 면역원성 에피토프를 여전히 유지하면서 생물학적으로 불활성이도록 변경될 수 있다.
본 발명의 Hla 항원은 1개 이상의 점 돌연변이에 의해 유전적으로 해독될 수 있다. 예를 들어, 공극 형성에 관여하는 잔기는 Hla의 용해 활성과 관련이 있었다. 한 측면에서, 본 발명의 변형된 Hla 항원은 멘지스 및 커노들 (Menzies and Kernodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847)에 의해 기재된 바와 같이 아미노산 치환, 예를 들어 H35, H48, H114 및/또는 H259의 또 다른 아미노산, 예컨대 리신으로의 치환에 의해 해독될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 Hla 항원은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 (또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열에서의 동등한 위치)을 기준으로 하여 H35L, H114L 또는 H259L로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변형된 Hla 항원은 치환 H35L을 포함한다 (예를 들어 서열식별번호: 8-12).
본원에서 지칭되는 아미노산 번호는 서열식별번호: 3에서의 아미노산에 상응하며, 상기 기재된 바와 같이 관련 기술분야의 기술자는 정렬에 의해 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열에서의 동등한 아미노산 위치를 결정할 수 있다.
본 발명의 Hla 항원의 용혈 활성을 예를 들어 문헌 [Menzies and Kernodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847]에 기재된 방법에 의해 검정하고 특징분석할 수 있다. 시험관내 용혈 검정을 이용하여 야생형 Hla에 비한 변형된 Hla 항원의 용혈 (예를 들어 세포용해) 활성을 측정할 수 있다. 용혈 억제 검정을 이용하여, 본 발명의 변형된 Hla 항원에 대해 상승된 항혈청이 Hla에 의한 용혈을 억제하는 능력을 측정할 수 있고, (전형적으로) 항-(변형된 Hla) 항혈청과 항-(야생형 Hla) 항혈청을 비교할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 변형된 Hla 항원은 (예를 들어 시험관내 용혈 검정을 통해 측정되는) 야생형 Hla에 비해 낮은 용혈 활성을 나타내는 것일 수 있다. 예를 들어, 적합한 변형된 Hla 항원은 야생형 Hla의 특이적 활성의 약 (하기 각각의 값에 대해 독립적으로 지칭됨) 0%, 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5% 또는 <10%인 특이적 활성 (시험관내 용혈 검정을 이용하여 결정된 바와 같음)을 가질 수 있다. 본 발명의 적합한 변형된 Hla 항원은 또한 숙주에게 투여후 숙주가 (예를 들어 용혈 억제 검정을 통해) 야생형 Hla에 의한 용혈을 억제하는 항체를 생성하게 하는 것일 수 있고, 이는 면역원성 (예를 들어 야생형 Hla에 대한 항체의 생성을 유도함) 및/또는 보호성 (예를 들어 숙주를 감염으로부터 보호하거나 또는 이미 존재하는 감염을 제한하는 면역 반응을 유도함)이다. 검정은 실시예에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 변형된 Hla 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 Hla 아미노산 서열, 예를 들어 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 10을 가짐)의 1개 이상의 아미노산 (예를 들어 1-7개의 아미노산, 예를 들어 1개의 아미노산)은 글리코실트랜스퍼라제 효소, 예를 들어 PglB에 대한 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 또는 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) (예를 들어 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30)) 컨센서스 서열로 치환되었다. 예를 들어, Hla 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 3)에서 단일 아미노산은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 또는 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) (예를 들어 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30)) 컨센서스 서열로 대체될 수 있다 (예를 들어 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 11-12). 대안적으로, Hla 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 Hla 아미노산 서열)에서 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 또는 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) (예를 들어 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30)) 컨센서스 서열로 대체될 수 있다.
한 실시양태에서, D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) (예를 들어 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30))로부터 선택된 컨센서스 서열(들)은 서열식별번호: 3의 아미노산 K131에 상응하는 위치에서 또는 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 9 및 11-12)에서의 동등한 위치에서 부가되거나 치환된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 컨센서스 서열은 서열식별번호: 3의 K131에 상응하는 아미노산을 치환할 수 있다.
D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 컨센서스 서열(들)의 도입은 Hla 항원이 글리코실화되게 한다. 따라서, 본 발명은 또한 글리코실화된 본 발명의 Hla 항원을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 컨센서스 서열은 Hla 아미노산 서열의 특정한 영역으로, 예를 들어 단백질의 N 또는 C 말단에서 및/또는 디술피드 브릿지에 의해 안정화된 루프에서 단백질의 표면 구조체로 도입된다. 본 발명의 한 측면에서, 컨센서스 서열(들)의 위치는 개선된 글리코실화, 예를 들어 증가된 수율을 제공한다.
이러한 글리코실화 부위의 도입은 예를 들어 새로운 아미노산을 항원의 일차 구조에 부가함으로써 (즉, 글리코실화 부위가 전체적으로 또는 부분적으로 부가됨) 또는 글리코실화 부위를 생성하도록 항원에서 기존 아미노산을 돌연변이시킴으로써 (즉, 아미노산이 항원에 부가되지 않지만, 항원의 선택된 아미노산이 글리코실화 부위를 형성하도록 돌연변이됨) 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는, 항원의 아미노산 서열이 관련 기술분야에 공지된 접근법, 예를 들어 항원을 코딩하는 핵산 서열의 변형을 포함하는 재조합 접근법을 이용하여 용이하게 변형될 수 있음을 인식할 것이다.
한 실시양태에서, Hla 항원은 아미노산 서열이 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 1개 이상의 컨센서스 서열(들) (여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임) (예를 들어 서열식별번호: 30)을 포함한다는 점에서 추가로 변형될 수 있다. 이들 서열은 본원에 기재된 바와 같이 클로닝 목적을 위해 N-말단 세린 및/또는 알라닌의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 서열은 해독 돌연변이, 예컨대 본원에 기재된 해독 돌연변이 중 어느 하나 또는 모두를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직한 해독 돌연변이는 서열식별번호: 3의 H35L이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 3의 Hla 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 Hla 아미노산 서열 (예를 들어 서열식별번호: 9 또는 10)에 재조합적으로 도입된, D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 1개 이상의 컨센서스 서열(들) (여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 Hla 항원을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 Hla 항원은 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함한다 (또는 그로 이루어진다). 한 실시양태에서, 본 발명의 변형된 Hla 항원은 N-말단 세린 및/또는 알라닌 (즉, N-말단에 부가된 S 잔기)을 갖는 서열식별번호: 3 또는 8-11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다 (또는 그로 이루어진다). 한 실시양태에서, 본 발명의 변형된 Hla 항원은 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함한다 (또는 그로 이루어진다).
한 실시양태에서, 본 발명의 Hla 항원은 "펩티드 태그" 또는 "태그", 즉, 변형된 Hla 항원의 단리 및/또는 식별을 가능하게 하는 아미노산의 서열을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 Hla 항원에 태그의 부가는 해당 항원의 정제, 따라서 태그 부착된 변형된 Hla 항원을 포함하는 접합체 백신의 정제에 유용할 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 예시적인 태그에는 비제한적으로 히스티딘 (HIS) 태그가 포함된다. 한 실시양태에서, 태그는 헥사-히스티딘 태그이다. 또 다른 실시양태에서, 태그는 HR 태그, 예를 들어 HRHR 태그이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 사용된 태그는 더 이상 필요하지 않을 때, 예를 들어 항원이 정제된 후에 제거가능하며, 예를 들어 화학적 작용제에 의해 또는 효소적 수단에 의해 제거된다. 임의적으로 펩티드 태그는 아미노산 서열의 C-말단에 위치한다. 임의적으로 펩티드 태그는 아미노산 서열의 C-말단에서 6개의 히스티딘 잔기를 포함한다. 임의적으로 펩티드 태그는 아미노산 서열의 C-말단에서 4개의 HR 잔기 (HRHR)를 포함한다. 펩티드 태그는 1개, 2개 또는 그 초과의 추가의 아미노산 잔기, 예를 들어 알라닌, 세린 및/또는 글리신 잔기, 예를 들어 GS를 포함하거나 또는 이들 뒤에 이어질 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 변형된 Hla 항원은 서열식별번호: 3의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 (또는 그로 이루어지고), 상기 아미노산 서열은 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 컨센서스 서열 (여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임) (예를 들어 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) 또는 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30)), 및 H35L, H48C 및 G122C로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 치환, 및 아미노산 서열의 C-말단에서 GSHRHR 펩티드 태그를 포함한다. 임의적으로, 본 발명의 변형된 Hla 항원은 서열식별번호: 3 또는 9-12와 적어도 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, 세린 및/또는 알라닌 잔기, 예를 들어 SA 또는 S, 바람직하게는 S는 성숙한 단백질의 N-말단에 부가된다 (예를 들어 서열식별번호: 12). 이러한 잔기 또는 잔기들은 리더 서열의 더욱 효율적인 절단을 유도하는 이점을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명의 Hla 항원은 서열식별번호: 3의 서열과 적어도 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 (또는 그로 이루어지고), 상기 아미노산 서열은 G122에서 C, H48에서 C, 및 H35에서 L로의 아미노산 치환, 서열식별번호: 3의 위치 K131에 상응하는 아미노산을 치환한 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30), 아미노산 서열의 C-말단에서 HRHR 태그 (서열식별번호: 32)를 포함한다 (예를 들어 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12).
바람직한 실시양태에서, 상기 Hla 항원은 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함한다 (또는 그로 이루어진다). 바람직한 실시양태에서, 상기 Hla 항원은 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함한다 (또는 그로 이루어진다).
폴리사카라이드 항원
에스. 아우레우스 균주의 75%는 유형 5 또는 유형 8 피막 폴리사카라이드를 발현하며, 따라서 CP5 및 CP8을 포함하는 백신은 잠재적으로 대부분의 순환하는 에스. 아우레우스 균주에 대한 보호를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 에스. 아우레우스로부터의 박테리아 피막 사카라이드를 포함한다. 에스. 아우레우스로부터의 박테리아 피막 사카라이드는 에스. 아우레우스 혈청형 5 또는 8 피막 사카라이드로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항원은 에스. 아우레우스로부터의 박테리아 피막 사카라이드의 반복 단위를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항원은 에스. 아우레우스 혈청형 5 또는 8로부터의 박테리아 피막 사카라이드의 반복 단위를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항원은 에스. 아우레우스 혈청형 8로부터의 박테리아 피막 사카라이드의 반복 단위를 포함한다. 이 실시양태에서, 항원은 다음을 포함한다:
Figure pct00001
본 발명의 한 실시양태에서, 항원은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈청형 5로부터의 박테리아 피막 사카라이드의 반복 단위를 포함한다. 본 발명의 이 실시양태에서, 항원은 다음을 포함한다:
Figure pct00002
한 실시양태에서, 항원은 폴리사카라이드이다. 한 실시양태에서, 항원은 2개 이상의 모노사카라이드, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20개 또는 그 초과의 모노사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 항원은 20, 15, 12, 10, 9, 또는 8개 이하의 모노사카라이드를 함유하는 폴리사카라이드이다.
한 실시양태에서, 상기 피막 폴리사카라이드 항원은 담체 단백질에 접합된다. 본 발명의 접합체는 하기에 기재되어 있다.
접합체
본 발명은 또한 담체 단백질에 연결된, 예를 들어 공유 연결된 본원에 기재된 피막 사카라이드를 포함하는 (또는 그로 이루어진) 접합체 (예를 들어 생체접합체)를 제공한다. 한 실시양태에서, 담체 단백질은 본 발명의 Hla 단백질이다. 한 실시양태에서, 단백질은 본 발명의 ClfA 단백질이다.
한 실시양태에서, 담체 단백질은 화학적 접합 방법을 이용하여 수득가능한 화학적 연결을 통해 폴리사카라이드 항원에 공유 연결된다 (즉, 접합체는 화학적 접합에 의해 생성됨).
한 실시양태에서, 화학적 접합 방법은 카르보디이미드 화학, 환원적 아미노화, 시아닐화 화학 (예를 들어 CDAP 화학), 말레이미드 화학, 히드라지드 화학, 에스테르 화학, 및 N-히드록시숙신이미드 화학으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 접합체는 US200710184072 (하우스도르프(Hausdorff)) US 4365170 (제닝스(Jennings)) 및 US 4673574 (앤더슨(Anderson))에 기재된 바와 같은 직접적인 환원적 아미노화 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 방법은 EP-0-161-188, EP-208375 및 EP-0-477508에 기재되어 있다. 접합 방법은 대안적으로 사카라이드를 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)에 의해 활성화시켜 시아네이트 에스테르를 형성하는 것에 의존할 수 있다. 이러한 접합체는 PCT 공개 출원 WO 93/15760 (유니폼드 서비시즈 유니버시티(Uniformed Services University)) 및 WO 95/08348 및 WO 96/29094에 기재되어 있다. 문헌 [Chu C. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256]을 또한 참고한다.
일반적으로, 변형된 ClfA 단백질 상의 화학적 기의 하기 유형은 커플링 / 접합을 위해 사용될 수 있다:
A) 카르복실 (예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산을 통해). 한 실시양태에서, 이 기는 사카라이드 상의 아미노 기에 직접적으로 또는 카르보디이미드 화학에 의해, 예를 들어 EDAC에 의해 링커 상의 아미노 기에 연결된다.
B) 아미노 기 (예를 들어 리신을 통해). 한 실시양태에서, 이 기는 사카라이드 상의 카르복실 기에 직접적으로 또는 카르보디이미드 화학에 의해, 예를 들어 EDAC에 의해 링커 상의 카르복실 기에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 이 기는 사카라이드 상의 CDAP 또는 CNBr에 의해 활성화된 히드록실 기에 직접적으로 또는 링커 상의 이러한 기에; 알데히드 기를 갖는 사카라이드 또는 링커에; 숙신이미드 에스테르 기를 갖는 사카라이드 또는 링커에 연결된다.
C) 술프히드릴 (예를 들어 시스테인을 통해). 한 실시양태에서, 이 기는 브로모 또는 클로로 아세틸화 사카라이드에 또는 말레이미드 화학에 의해 링커에 연결된다. 한 실시양태에서, 이 기는 비스 디아조벤지딘에 의해 활성화/변형된다.
D) 히드록실 기 (예를 들어 티로신을 통해). 한 실시양태에서, 이 기는 비스 디아조벤지딘에 의해 활성화/변형된다.
E) 이미다졸릴 기 (예를 들어 히스티딘을 통해). 한 실시양태에서, 이 기는 비스 디아조벤지딘에 의해 활성화/변형된다.
F) 구아니딜 기 (예를 들어 아르기닌을 통해).
G) 인돌릴 기 (예를 들어 트립토판을 통해).
사카라이드 상에서, 일반적으로 하기 기는 커플링을 위해 사용될 수 있다: OH, COOH 또는 NH2. 알데히드 기는 퍼아이오데이트, 산 가수분해, 과산화수소 등과 같은 상이한 처리 후에 생성될 수 있다.
직접적인 커플링 접근법:
사카라이드-OH + CNBr 또는 CDAP -----> 시아네이트 에스테르 + NH2-단백질 ----> 접합체
사카라이드-알데히드 + NH2-단백질 ----> 쉬프 염기 + NaCNBH3 ----> 접합체
사카라이드-COOH + NH2-단백질 + EDAC ----> 접합체
사카라이드-NH2 + COOH-단백질 + EDAC ----> 접합체
스페이서 (링커)를 통한 간접적인 커플링 접근법:
사카라이드-OH + CNBr 또는 CDAP ---> 시아네이트 에스테르 + NH2----NH2 ----> 사카라이드----NH2 + COOH-단백질 + EDAC -----> 접합체
사카라이드-OH + CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 + NH2-----SH -----> 사카라이드----SH + SH-단백질 (노출된 시스테인을 갖는 본래의 단백질, 또는 예를 들어 SPDP에 의한 단백질의 아미노 기의 변형 이후에 수득됨) -----> 사카라이드-S-S-단백질
사카라이드-OH + CNBr 또는 CDAP ---> 시아네이트 에스테르 + NH2----SH -------> 사카라이드----SH + 말레이미드-단백질 (아미노 기의 변형) ----> 접합체
사카라이드-OH + CNBr 또는 CDAP ---> 시아네이트 에스테르 + NH2-----SH ---> 사카라이드-SH + 할로아세틸화-단백질 ----> 접합체
사카라이드-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> 사카라이드------NH2 + EDAC + COOH-단백질 ----> 접합체
사카라이드-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> 사카라이드----SH + SH-단백질 (노출된 시스테인을 갖는 본래의 단백질, 또는 예를 들어 SPDP에 의한 단백질의 아미노 기의 변형 이후에 수득됨) -----> 사카라이드-S-S-단백질
사카라이드-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> 사카라이드----SH + 말레이미드-단백질 (아미노 기의 변형) ----> 접합체
사카라이드-COOH + EDAC + NH2----SH ---> 사카라이드-SH + 할로아세틸화-단백질 ----> 접합체
사카라이드-알데히드 + NH2-----NH2 ----> 사카라이드---NH2 + EDAC + COOH-단백질 ----> 접합체
비고: 상기 EDAC 대신에 임의의 적합한 카르보디이미드가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 항원은 담체 단백질에 직접적으로 연결된다.
한 실시양태에서, 항원은 링커를 통해 담체 단백질에 부착된다. 임의적으로, 링커는 4-12개 탄소 원자를 갖는 링커, 이관능성 링커, 말단에서 1 또는 2개의 반응성 아미노 기를 함유하는 링커, B-프로프리온아미도, 니트로페닐-에틸아민, 할로아실 할라이드, 6-아미노카프로산 및 ADH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 활성화된 사카라이드는 담체 단백질 상의 아미노 기에 직접적으로 또는 스페이서 (링커) 기를 통해 커플링될 수 있다. 예를 들어, 말레이미드-활성화된 담체 단백질 (예를 들어 GMBS (4-말레이미도부티르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르) 사용) 또는 할로아세틸화 담체 단백질 (예를 들어 SIAB (숙신이미딜 (4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트), 또는 SIA (숙신이미딜 아이오도아세테이트), 또는 SBAP (숙신이미딜-3-(브로모아세트아미드)프로피오네이트) 사용)과의 반응 후에 수득된 티오에테르 연결을 통해 담체에 커플링될 수 있는 티올화된 폴리사카라이드를 제공하도록 스페이서는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있다. 한 실시양태에서, 시아네이트 에스테르 (임의적으로 CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 디아민 또는 ADH (아디프산 디히드라지드)와 커플링되고, 아미노-유도체화된 사카라이드는 카르보디이미드 (예를 들어 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDAC 또는 EDC)) 화학을 이용하여 단백질 담체 상의 카르복실 기를 통해 담체 단백질에 접합된다. 이러한 접합체는 PCT 공개 출원 WO 93/15760 (유니폼드 서비시즈 유니버시티) 및 WO 95/08348 및 WO 96/29094에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 항원이 연결된 담체 단백질 상의 아미노산 잔기는 아스파라긴 잔기가 아니며, 이 경우에 접합체는 전형적으로 화학적 접합에 의해 생성된다. 한 실시양태에서, 항원이 연결된 담체 단백질 상의 아미노산 잔기는 Ala, Arg, Asp, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의적으로, 아미노산은 말단 아민 기를 함유하는 아미노산, 리신, 아르기닌, 글루타민산, 아스파르트산, 시스테인, 티로신, 히스티딘 또는 트립토판이다. 임의적으로, 항원은 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 시스테인, 티로신, 히스티딘, 아르기닌 또는 트립토판으로부터 선택된 담체 단백질 상의 아미노산에 공유 연결된다.
한 실시양태에서, 항원은 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 시스테인, 티로신, 히스티딘, 아르기닌 또는 트립토판 (예를 들어 아스파라긴)으로부터 선택된 담체 단백질 상의 아미노산에 연결된다. 한 실시양태에서, 항원이 연결된 담체 단백질 상의 아미노산 잔기는 아스파라긴 잔기이다. 한 실시양태에서, 항원이 연결된 담체 단백질 상의 아미노산 잔기는 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) 컨센서스 서열의 일부 (예를 들어 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29) 컨센서스 서열에서 아스파라긴)이다.
본 발명은 스타필로코쿠스 아우레우스 피막 사카라이드 (예를 들어 피막 폴리사카라이드)에 연결된 본원에 기재된 ClfA 또는 Hla 단백질을 포함하는 생체접합체를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 생체접합체는 본원에 기재된 ClfA 또는 Hla 단백질 및 스타필로코쿠스 아우레우스 혈청형 CP5 또는 CP8의 피막 사카라이드 (예를 들어 피막 폴리사카라이드)로부터 선택된 항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 생체접합체는 본 발명의 ClfA 항원 및 스타필로코쿠스 아우레우스 혈청형 CP8의 피막 사카라이드 (예를 들어 피막 폴리사카라이드)로부터의 항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 생체접합체는 본 발명의 Hla 항원 및 스타필로코쿠스 아우레우스 혈청형 CP5의 피막 사카라이드 (예를 들어 피막 폴리사카라이드)로부터의 항원을 포함한다.
숙주 세포를 사용하여 생체접합체를 생성하는 방법은 예를 들어 WO 2003/074687, WO 2006/119987 및 WO2011/138361에 기재되어 있다.
생체접합체는 글리코실트랜스퍼라제(들)을 코딩하는 하나 이상의 핵산; 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산; 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 및 임의적으로 폴리머라제 (예를 들어 wzy)를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에서 생성될 수 있다.
본 발명의 생체접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포에는 고세균류, 원핵생물 숙주 세포, 및 진핵생물 숙주 세포가 포함된다. 본 발명의 생체접합체의 생성에서 사용하기 위한 예시적인 원핵생물 숙주 세포는 비제한적으로 에스케리키아(Escherichia) 종, 쉬겔라(Shigella) 종, 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 크산토모나스(Xhantomonas) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 바실루스(Bacillus) 종, 및 클로스트리디움(Clostridium) 종이다. 구체적인 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli)이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 생체접합체를 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포는 이종성 핵산, 예를 들어 1종 이상의 담체 단백질을 코딩하는 이종성 핵산 및/또는 1종 이상의 단백질을 코딩하는 이종성 핵산, 예를 들어 1종 이상의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하도록 조작된다. 구체적인 실시양태에서, 글리코실화 경로 (예를 들어 원핵생물 및/또는 진핵생물 글리코실화 경로)에 수반되는 단백질을 코딩하는 이종성 핵산을 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 이러한 핵산은 비제한적으로 올리고사카릴 트랜스퍼라제, 에피머라제, 플립파제, 폴리머라제 및/또는 글리코실트랜스퍼라제를 비롯한 단백질을 코딩할 수 있다. 이종성 핵산 (예를 들어 담체 단백질을 코딩하는 핵산 및/또는 다른 단백질, 예를 들어 글리코실화에 수반되는 단백질을 코딩하는 핵산)을 전기천공, 열 충격에 의한 화학적 전환, 자연적 전환, 파지 형질도입, 및 접합과 같은 방법을 이용하여 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 이종성 핵산은 플라스미드를 사용하여 숙주 세포에 도입되고, 예를 들어 이종성 핵산은 플라스미드 (예를 들어 발현 벡터)에 의해 숙주 세포에서 발현된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 이종성 핵산은 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/068737 (WO 14/037585로 공개됨)에 기재된 삽입 방법을 이용하여 숙주 세포에 도입된다.
추가의 변형이 숙주 세포에 도입될 수 있다 (예를 들어 재조합 기술 사용). 예를 들어, 가능하게는 경쟁 또는 방해 글리코실화 경로 (예를 들어 숙주 세포에 재조합적으로 도입되는 글리코실화에 수반되는 1개 이상의 이종성 유전자와 경쟁하거나 또는 그를 방해함)의 일부를 형성하는 단백질을 코딩하는 숙주 세포 핵산 (예를 들어 유전자)은 불활성/기능장애가 되도록 하는 방식으로 숙주 세포 백그라운드 (게놈)에서 결질되거나 또는 변형될 수 있다 (즉, 결실된/변형된 숙주 세포 핵산은 기능적 단백질을 코딩하지 않거나 또는 단백질을 코딩하지 않음). 핵산이 숙주 세포의 게놈으로부터 결실될 때, 이들은 바람직한 서열, 예를 들어 당단백질 생성에 유용한 서열에 의해 대체될 수 있다.
숙주 세포에서 결실될 수 있는 (일부 경우에 다른 원하는 핵산 서열로 대체될 수 있는) 예시적인 유전자에는 당지질 생합성에 수반되는 숙주 세포의 유전자, 예컨대 waaL (예를 들어 문헌 [Feldman et al. 2005, PNAS USA 102:3016-3021] 참고), 지질 A 코어 생합성 클러스터 (waa), 갈락토스 클러스터 (gal), 아라비노스 클러스터 (ara), 콜론산 클러스터 (wc), 피막 폴리사카라이드 클러스터, 운데카프레놀-피로포스페이트 생합성 유전자 (예를 들어 uppS (운데카프레닐 피로포스페이트 신타제), uppP (운데카프레닐 디포스파타제)), Und-P 재순환 유전자, 뉴클레오티드 활성화된 당 생합성에 수반되는 대사 효소, 엔테로박테리아 공통 항원 클러스터, 및 프로파지 O 항원 변형 클러스터, 예컨대 gtrABS 클러스터가 포함된다.
이러한 변형된 원핵생물 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드에 부착된 항원, 예를 들어 사카라이드 항원을 포함하는 생체접합체를 생성할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 숙주 세포는 사카라이드 항원의 생성에 대해 특이적인 핵산을 천연적으로 발현할 수 있거나, 또는 숙주 세포는 이러한 핵산을 발현하도록 제조될 수 있고, 즉, 특정 실시양태에서 상기 핵산은 숙주 세포에 대해 이종성이다. 사카라이드 항원의 생성에 대해 특이적인 상기 핵산 중 하나 이상은 숙주 세포에 대해 이종성일 수 있고, 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 숙주 세포는 단백질의 N-글리코실화에서 활성인 추가의 효소를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 및/또는 다른 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함한다.
피막 폴리사카라이드 유전자 클러스터를 포함하는 핵산 서열이 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포에 삽입된 피막 폴리사카라이드 유전자 클러스터는 하기 기재되는 바와 같이 포도상구균 균주 (예를 들어 에스. 아우레우스)로부터의 피막 폴리사카라이드 유전자 클러스터일 수 있다.
숙주 세포는 혼성체 폴리사카라이드를 생성할 수 있는 유전자 기구 (예를 들어 글리코실트랜스퍼라제, 플립파제, 폴리머라제, 및/또는 올리고사카릴트랜스퍼라제), 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩티드에 항원을 연결시킬 수 있는 유전자 기구를 코딩하는 핵산을 포함하고/거나 포함하도록 변형될 수 있다.
에스. 아우레우스 피막 폴리사카라이드는 그람-음성 박테리아에서 O 폴리사카라이드 합성의 폴리머라제-의존성 경로와의 상동성을 공유하는 보존된 경로에 의해 박테리아 막 담체 지질 운데카프레닐 피로포스페이트 상에서 조립된다. O 항원 조립은 DP-공여자로부터 운데카프레닐 포스페이트로 당 포스페이트의 전달에 의해 개시된다. 지질 연결된 O 항원은 상이한 글리코실트랜스퍼라제의 순차적 작용에 의해 내부 막의 세포질 측에서 조립된다. 이어서, 당지질이 원형질막 공간으로 뒤집혀서 중합된다. O 항원 리가제 WaaL을 올리고사카릴트랜스퍼라제 PglB로 교체함으로써, 중합된 O 항원을 지질 A 코어로가 아니라 단백질 담체로 전달할 수 있다.
숙주 세포는 폴리사카라이드 반복 단위를 생성하는 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 반복 단위는 환원 단부에서 헥소스를 포함하지 않고, 상기 폴리사카라이드 반복 단위는 환원 단부에서 헥소스를 포함하는 공여자 폴리사카라이드 반복 단위로부터 유래된다.
숙주 세포는 운데카프레닐 피로포스페이트 (Und-PP) 상에서 헥소스 모노사카라이드 유도체를 조립하는 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 한 측면에서, Und-PP 상에서 헥소스 모노사카라이드 유도체를 조립하는 글리코실트랜스퍼라제는 숙주 세포에 대해 이종성 및/또는 글리코실트랜스퍼라제(들)을 코딩하는 유전자 중 하나 이상에 대해 이종성이다. 상기 글리코실트랜스퍼라제는 예를 들어 에스케리키아 종, 쉬겔라 종, 클레브시엘라 종, 크산토모나스 종, 살모넬라 종, 예르시니아 종, 애로모나스(Aeromonas) 종, 프란시셀라(Francisella) 종, 헬리코박터(Helicobacter) 종, 프로테우스(Proteus) 종, 락토코쿠스 종, 락토바실루스 종, 슈도모나스 종, 코리네박테리움 종, 스트렙토마이세스 종, 스트렙토코쿠스 종, 엔테로코쿠스(Enterococcus) 종, 스타필로코쿠스 종, 바실루스 종, 클로스트리디움 종, 리스테리아(Listeria) 종, 또는 캄필로박터(Campylobacter) 종으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, Und-PP 상에서 헥소스 모노사카라이드 유도체를 조립하는 글리코실트랜스퍼라제는 임의적으로 이. 콜라이로부터의 wecA이다 (wecA는 UDP-GlcNAc로부터 UndP 상에서 GlcNAc를 조립할 수 있음). 헥소스 모노사카라이드는 글루코스, 갈락토스, 람노스, 아라비노톨, 푸코스 및 만노스 (예를 들어 갈락토스)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
숙주 세포는 Und-PP 상에서 조립된 헥소스 모노사카라이드 유도체에 모노사카라이드를 부가할 수 있는 1종 이상의 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 헥소스 모노사카라이드 유도체에 모노사카라이드를 부가할 수 있는 상기 1종 이상의 글리코실트랜스퍼라제는 쉬겔라 보예디이(Shigella boyedii)로부터의 갈락토실트랜스퍼라제 (wfeD); 이. 콜라이 O28로부터의 갈락토푸라노실트랜스퍼라제 (wbeY); 또는 이. 콜라이 O167로부터의 갈락토푸라노실트랜스퍼라제 (wfdK)일 수 있다. Galf-트랜스퍼라제, 예컨대 wfdK 및 wbeY는 UDP-Galf로부터의 Galf (갈락토푸라노스)를 -GlcNAc-P-P-운데카프레닐로 전달할 수 있다. 바람직하게는, 헥소스 모노사카라이드 유도체에 모노사카라이드를 부가할 수 있는 상기 1종 이상의 글리코실트랜스퍼라제는 이. 콜라이 O28로부터의 갈락토푸라노실트랜스퍼라제 (wbeY) 및 이. 콜라이 O167로부터의 갈락토푸라노실트랜스퍼라제 (wfdK)이다.
숙주 세포는 헥소스 모노사카라이드 유도체 상에서 공여자 폴리사카라이드 반복 단위를 조립하는 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 헥소스 모노사카라이드 유도체 상에서 공여자 폴리사카라이드 반복 단위를 조립하는 글리코실트랜스퍼라제는 공여자 폴리사카라이드의 제1 반복 단위의 환원 단부에 존재하는 헥소스 모노사카라이드를 헥소스 모노사카라이드 유도체에 부가할 수 있는 글리코실트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 예시적인 글리코실트랜스퍼라제에는 갈락토실트랜스퍼라제 (wciP), 예를 들어 이. 콜라이 O21로부터의 wciP가 포함된다.
헥소스 모노사카라이드 유도체 상에서 공여자 폴리사카라이드 반복 단위를 조립하는 글리코실트랜스퍼라제는 공여자 폴리사카라이드의 제1 반복 단위의 환원 단부에 존재하는 헥소스 모노사카라이드에 인접한 모노사카라이드를 공여자 폴리사카라이드의 제1 반복 단위의 환원 단부에 존재하는 헥소스 모노사카라이드에 부가할 수 있는 글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 예시적인 글리코실트랜스퍼라제에는 글루코실트랜스퍼라제 (wciQ), 예를 들어 이. 콜라이 O21로부터의 wciQ가 포함된다.
숙주 세포는 스타필로코쿠스 아우레우스 CP5 또는 CP8 유전자 클러스터로부터 선택된 폴리사카라이드의 반복 단위의 합성을 위한 글리코실트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 에스. 아우레우스 CP5 및 CP8은 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) O11 항원 합성 유전자와 유사한 구조를 가져서, 이들 유전자를 이. 콜라이 모노사카라이드 합성 유전자와 조합하여, 반복되는 트리사카라이드 단위로 이루어진 운데카프레닐 피로포스페이트-연결된 CP5 또는 CP8 중합체를 합성할 수 있다.
CP5 또는 CP8 사카라이드의 반복 단위의 합성에 충분한 글리코실트랜스퍼라제는 에스. 아우레우스 CP5 또는 CP8로부터의 capH, capI, capJ 및/또는 capK를 포함한다. 임의적으로, 숙주 세포는 에스. 아우레우스 CP5 또는 CP8로부터의 capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, capO, capP를 또한 포함한다. 대안적으로, 숙주 세포는 피. 아에루기노사 O11로부터의 wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjL, wbpM, wzz 및/또는 wzx 및 이. 콜라이 O16으로부터의 wecB, wecC를 또한 포함한다.
CP5 사카라이드의 반복 단위의 합성에 충분한 글리코실트랜스퍼라제는 에스. 아우레우스 CP5로부터의 capH, capI, capJ 및/또는 capK를 포함한다. 임의적으로, 숙주 세포는 에스. 아우레우스 CP5로부터의 capD, capE, capF, capG, capL, capM, capN, capO, capP를 또한 포함한다. 대안적으로, 숙주 세포는 피. 아에루기노사 O11로부터의 wbjB, wbjC, wbjD, wbjE, wbjF, wbjL, wbpM, wzz 및/또는 wzx 및 이. 콜라이 O16로부터의 wecB, wecC를 또한 포함한다.
숙주 세포는 헥소스 모노사카라이드 유도체 상에서 공여자 폴리사카라이드 반복 단위를 조립하는 글리코실트랜스퍼라제를 포함할 수 있고, 공여자 폴리사카라이드의 제1 반복 단위의 환원 단부에 존재하는 헥소스 모노사카라이드를 헥소스 모노사카라이드 유도체에 부가할 수 있는 글리코실트랜스퍼라제를 포함할 수 있다.
N-연결된 단백질 글리코실화 (표적 단백질의 폴리펩티드 쇄에서 아스파라긴 잔기에 탄수화물 분자의 부가)는 지질 담체 (돌리콜 포스페이트)로부터의 사전 조립된 올리고사카라이드를 소포체에서 보존된 서열 Asn-X-Ser/Thr (여기서 X는 프롤린 이외의 임의의 아미노산임) 내의 초기 단백질의 아스파라긴 잔기에 전달하는 것을 담당하는 효소적 올리고사카릴트랜스퍼라제 복합체 (OST)에 의해 달성된다.
박테리아, 식품-매개 병원체 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 또한 그 자신의 글리코실화 기구를 갖는다는 사실로 인해 그의 단백질을 N-글리코실화시킬 수 있는 것으로 제시된 바 있다 (Wacker et al. Science. 2002; 298(5599):1790-3). 이 반응을 담당하는 기구는 (단백질 글리코실화를 위해) "pgl"로 불리는 클러스터에 의해 코딩된다.
씨. 제주니 글리코실화 기구는 이. 콜라이로 전달되어, 이. 콜라이 세포에 의해 발현된 재조합 단백질의 글리코실화를 가능하게 한다. 이전의 연구는 N-글리코실화를 수행할 수 있는 이. 콜라이 균주를 생성하는 방법을 입증하였다 (예를 들어, 문헌 [Wacker et al. Science. 2002; 298 (5599):1790-3; Nita-Lazar et al. Glycobiology. 2005; 15(4):361-7; Feldman et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(8):3016-21; Kowarik et al. EMBO J. 2006; 25(9):1957-66; Wacker et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(18):7088-93]; 국제 특허 출원 공개 번호 WO2003/074687, WO2006/119987, WO 2009/104074, 및 WO/2011/06261, 및 WO2011/138361 참고). 최적화된 성질을 갖는 PglB 돌연변이체는 WO2016/107818에 기재되어 있다. 바람직한 돌연변이체는 PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V이다.
올리고사카릴 트랜스퍼라제는 N-글리코실화 컨센서스 모티프, 예를 들어 Asn-X-Ser(Thr) (여기서 X는 Pro 이외의 임의의 아미노산임); 또는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기서 X 및 Z는 Pro 이외의 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨)를 포함하는 초기 폴리펩티드 쇄의 아스파라긴 잔기에 지질-연결된 올리고사카라이드를 전달한다 (WO 2006/119987 참고). 예를 들어 WO 2003/074687 및 WO 2006/119987을 참고한다.
숙주 세포는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 포함하는 핵산을 포함한다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산은 숙주 세포 본래의 것일 수 있거나, 또는 상기 기재된 바와 같이 유전자 접근법을 이용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터, 구체적으로 캄필로박터 제주니로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제 (즉, pglB; 예를 들어 문헌 [Wacker et al. 2002, Science 298:1790-1793] 참고; 또한 예를 들어 NCBI 유전자 ID: 3231775, 유니프롯(UniProt) 수탁 번호 O86154)이다.
따라서, 에스. 아우레우스 피막 폴리사카라이드의 생체접합체는 (i) 에스. 아우레우스로부터의 피막 폴리사카라이드 클러스터로부터 유래된 글리코실트랜스퍼라제 (상기 글리코실트랜스퍼라제는 상기 숙주 세포의 게놈에 통합됨); (ii) 올리고사카릴 트랜스퍼라제 (예를 들어 캄필로박터 제주니로부터의 pglB)를 코딩하는 핵산 (올리고사카릴 트랜스퍼라제를 코딩하는 상기 핵산은 플라스미드-매개이고/거나 숙주 세포의 게놈에 통합됨); 및 (iii) 본 발명의 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드는 플라스미드-매개이거나 또는 숙주 세포의 게놈에 통합됨)를 포함하는 원핵생물 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 숙주 세포의 waaL 유전자는 기능적으로 불활성화되었거나 또는 결실되었고, 예를 들어 올리고사카릴트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산에 의해, 예를 들어 씨. 제주니 pglB에 의해 교체되었다.
피막 사카라이드의 폴리- 및 올리고사카라이드를 생성하기 위해, 폴리머라제 (예를 들어 wzy)를 숙주 세포에 도입시킨다 (즉, 폴리머라제는 숙주 세포에 대해 이종성임). 에스. 아우레우스 CP5 및 CP8의 생성을 위해, 숙주 세포에 도입된 폴리머라제는 에스. 아우레우스 CP5 또는 CP8의 피막 폴리사카라이드 유전자 클러스터 (cap5J/cap8I)로부터의 wzy 유전자이다.
최종적으로, 플립파제 (wzx 또는 상동체)를 숙주 세포에 도입시킨다 (즉, 플립파제는 숙주 세포에 대해 이종성임). 플립파제는 야생형 반복 단위 및/또는 그들의 상응하는 조작된 (혼성체) 반복 단위를 세포질로부터 숙주 세포 (예를 들어 이. 콜라이)의 주변 세포질로 전위시킨다. 따라서, 숙주 세포는 플립파제 (wzx)를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 에스. 아우레우스의 피막 폴리사카라이드 생합성 경로의 플립파제를 숙주 세포에 도입시킨다. 숙주 세포에 도입된 플립파제는 에스. 아우레우스 CP5 또는 CP8의 피막 폴리사카라이드 유전자 클러스터로부터의 capK 유전자일 수 있다. 숙주 세포에 도입될 수 있는 다른 플립파제는 예를 들어 캄필로박터 제주니로부터의 것이다 (예를 들어 pglK).
본 발명의 생체접합체는 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어 이온 교환, 양이온 교환, 음이온 교환, 친화도, 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Saraswat et al. 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18)]을 참고하고; 또한 WO 2009/104074에 기재된 방법을 참고한다. 추가로, 생체접합체를 본원에 기재되거나 또는 정제를 용이하게 하기 위해 관련 기술분야에 달리 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합시킬 수 있다. 예를 들어, Hla 단백질은 양이온 교환에 의한 정제를 위해 펩티드 태그, 예컨대 HRHR 태그 (예를 들어 서열식별번호: 12)를 포함할 수 있다. 특정한 생체접합체를 정제하기 위해 사용된 실제 조건은 부분적으로 합성 전략, 및 생체접합체의 순 전하, 소수성 및/또는 친수성과 같은 인자에 따라 좌우될 것이며, 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 (i) 본 발명의 숙주 세포를 단백질 생성에 적합한 조건 하에 (및 임의적으로 사카라이드 생성에 적합한 조건 하에) 배양하고, (ii) 상기 숙주 세포에 의해 생성된 생체접합체를 단리하는 것을 포함하는, 사카라이드에 연결된 ClfA 또는 Hla 항원을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 생체접합체를 생성하는 방법이다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 방법에 의해 생성된 생체접합체이며, 상기 생체접합체는 ClfA 또는 Hla 항원에 연결된 에스. 아우레우스 폴리사카라이드를 포함한다.
면역원성 조성물 및 백신
본 발명의 면역원성 조성물은 대상체에게 투여하기 전에 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 한 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물 및 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조성물 및 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 백신을 제공한다.
또한, 아주반트 및 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 본원에 기재된 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신과 함께 사용하기 위한 아주반트 조성물을 제공한다.
제약상 허용가능한 부형제 및 담체는 관련 기술분야의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체에는 버퍼, 예컨대 트리스 (트리메타민), 포스페이트 (예를 들어 인산나트륨), 아세테이트, 보레이트 (예를 들어 붕산나트륨), 시트레이트, 글리신, 히스티딘 및 숙시네이트 (예를 들어 숙신산나트륨), 적합하게는 염화나트륨, 히스티딘, 인산나트륨 또는 숙신산나트륨이 포함될 수 있다. 제약상 허용가능한 부형제에는 염, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨 또는 염화마그네슘이 포함될 수 있다. 임의적으로, 제약상 허용가능한 부형제는 용해도 및/또는 안정성을 안정화시키는 적어도 1종의 성분을 함유한다. 가용화제/안정화제의 예에는 세제, 예를 들어 라우렐 사르코신 및/또는 폴리소르베이트 (예를 들어 트윈(TWEEN)™ 80)가 포함된다. 안정화제의 예에는 또한 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 124, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407)가 포함된다. 제약상 허용가능한 부형제에는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리소르베이트-80 (트윈™ 80), 폴리소르베이트-60 (트윈™ 60), 폴리소르베이트-40 (트윈™ 40) 및 폴리소르베이트-20 (트윈™ 20), 또는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (적합하게는 폴리소르베이트-80)가 포함될 수 있다. 대안적인 가용화제/안정화제에는 아르기닌, 및 유리 형성 폴리올 (예컨대 수크로스, 트레할로스 등)이 포함된다. 제약상 부형제는 보존제, 예를 들어 페놀, 2-페녹시에탄올, 또는 티오메르살일 수 있다. 다른 제약상 허용가능한 부형제에는 당 (예를 들어 락토스, 수크로스), 및 단백질 (예를 들어 젤라틴 및 알부민)이 포함된다. 제약상 허용가능한 담체에는 물, 식염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 포함된다. 수많은 제약상 허용가능한 부형제 및 담체가 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co. Easton, PA, 5th Edition (975)]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 버퍼를 포함한다. 액체 제제의 pH는 조성물의 성분들 및 대상체에게 투여하기 위해 필요한 적합성의 측면에서 조정된다. 적합하게는, 액체 혼합물의 pH는 적어도 4, 적어도 5, 적어도 5.5, 적어도 5.8, 적어도 6이다. 액체 혼합물의 pH는 9 미만, 8 미만, 7.5 미만 또는 7 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, 액체 혼합물의 pH는 4 내지 9, 5 내지 8, 예컨대 5.5 내지 8이다.
적절한 버퍼는 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 말레에이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트 및 트리스로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 버퍼는 포스페이트 버퍼, 예컨대 Na/Na2PO4, Na/K2PO4 또는 K/K2PO4이다.
버퍼는 적어도 6 mM, 적어도 10 mM 또는 적어도 40 mM의 양으로 액체 혼합물 중에 존재할 수 있다. 버퍼는 100 mM 미만, 60 mM 미만 또는 40 mM 미만의 양으로 액체 혼합물 중에 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 세포 찌그러짐 또는 용해를 피하기 위해 제약상 허용가능한 삼투질 농도를 갖는다. 제약상 허용가능한 삼투질 농도는 일반적으로 용액이 대략적으로 등장성이거나 또는 약간 고장성인 삼투질 농도를 가질 것을 의미할 것이다. 적합하게는, 본 발명의 조성물은 재구성될 때 250 내지 750 mOsm/kg 범위의 삼투질 농도를 가질 것이고, 예를 들어 삼투질 농도는 250 내지 550 mOsm/kg의 범위, 예컨대 280 내지 500 mOsm/kg의 범위일 수 있다.
삼투질 농도는 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라, 예컨대 상업적으로 입수가능한 삼투압계, 예를 들어 어드밴스드 인스트루먼츠 인크.(Advanced Instruments Inc.) (미국)로부터 입수가능한 어드밴스드(Advanced)® 모델 2020의 사용에 의해 측정될 수 있다.
"등장화제"는 제형과 접촉하는 세포 막을 가로지르는 물의 순 흐름을 방지하기 위해 제형에 적합한 장성을 부여하는 생리학적으로 허용되는 화합물이다. 일부 실시양태에서, 조성물을 위해 사용되는 등장화제는 염 (또는 염의 혼합물)이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 조성물은 비이온성 등장화제를 포함하고, 조성물 중 염화나트륨의 농도는 100 mM 미만, 예컨대 80 mM 미만, 예를 들어 50 mM 미만, 예컨대 40 mM 미만, 30 mM 미만 및 특히 20 mM 미만이다. 조성물 중에서 이온 강도는 100 mM 미만, 예컨대 80 mM 미만, 예를 들어 50 mM 미만, 예컨대 40 mM 미만 또는 30 mM 미만일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 비이온성 등장화제는 폴리올, 예컨대 소르비톨이다. 소르비톨의 농도는 예를 들어 약 3% 내지 약 15% (w/v), 예컨대 약 4% 내지 약 10% (w/v)일 수 있다. 면역학적으로 활성인 사포닌 분획 및 TLR4 효능제를 포함하는 아주반트 (등장화제는 염 또는 폴리올임)는 WO2012/080369에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 염, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 글루탐산일나트륨, 및 알루미늄 염 (예를 들어 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 알룸 (황산알루미늄칼륨), 또는 이러한 알루미늄 염의 혼합물)을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 염을 포함하지 않는다.
본 발명은 본 발명의 항원과 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
면역원성 조성물은 본 발명의 단백질 또는 접합체 (예를 들어 생체접합체), 뿐만 아니라 임의의 다른 성분의 면역학적 유효량을 포함한다. "면역학적 유효량"이란, 단일 용량으로서 또는 일련의 일부로서 개체에게 해당 양의 투여가 치료 또는 예방에 효과적임을 의미한다. 이러한 양은 치료할 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 원하는 보호 정도, 백신의 제형 및 다른 관련 인자에 따라 달라진다. 이러한 양은 일상적인 실험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다.
백신 제제는 일반적으로 문헌 [Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)]에 기재되어 있다. 리포솜 내로의 피막화는 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 4,235,877에 기재되어 있다.
본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은 투여에 대한 지침서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 본 발명은 (i) 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 포함하는 제1 용기; 및 (ii) 본원에 기재된 아주반트를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
아주반트
한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 아주반트를 포함하거나 또는 그와 조합하여 투여된다. 본 발명의 면역원성 조성물과 조합하여 투여하기 위한 아주반트는 상기 면역원성 조성물 또는 백신의 투여 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 투여하기 전에 상기 아주반트를 면역원성 조성물과 혼합한다.
아주반트는 예를 들어 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 비롯한 몇몇 메카니즘에 의해 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 아주반트는 TH1 또는 TH2 유형의 반응, 바람직하게는 TH1 유형 반응의 우선적인 유도인자이도록 선택된다. 높은 수준의 Th1-유형 시토카인은 주어진 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있는 반면에, 높은 수준의 Th2-유형 시토카인은 항원에 대한 체액성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. Th1 및 Th2-유형 면역 반응의 구별이 절대적이지 않음을 기억하는 것이 중요하다. 실제로, 개체는 주로 Th1 또는 주로 Th2인 것으로 기재된 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 모스만(Mosmann) 및 코프만(Coffman)에 의해 뮤린 CD4 양성 T 세포 클론에 대해 기재된 것을 참고하여 시토카인의 패밀리를 고려하는 것이 종종 편리하다 (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). 전통적으로, Th1-유형 반응은 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2 시토카인의 생성과 연관이 있다. 종종 Th1-유형 면역 반응의 유도와 직접적으로 연관된 다른 시토카인은 T-세포, 예컨대 IL-12에 의해 생성되지 않는다. 대조적으로, Th2-유형 반응은 Il-4, IL-5, IL-6, IL-10의 분비와 연관이 있다. Th1 반응을 주로 촉진시키는 적합한 아주반트 시스템에는 다음이 포함된다: 모노포스포릴 지질 A 또는 그의 유도체, 특히 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL) (그의 제조에 대해서는 GB 2220211 A 참고); MPL, 예를 들어 리포솜, 예를 들어 콜레스테롤 및 DPOC를 포함하는 리포솜에서 3D-MPL 및 사포닌 QS21; 및 모노포스포릴 지질 A, 예를 들어 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염 (예를 들어 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄)의 조합물 또는 수중유 에멀젼. 이러한 조합물에서, 항원 및 3D-MPL은 동일한 미립자 구조체에 함유될 수 있으며, 이는 항원 및 면역자극 신호의 더욱 효율적인 전달을 가능하게 한다. 연구에 의해, 3D-MPL이 알룸-흡착된 항원의 면역원성을 추가로 증강시킬 수 있는 것으로 제시된 바 있다 (Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1).
한 실시양태에서, 아주반트는 TLR4 효능제 및 면역학적으로 활성인 사포닌 둘 다를 포함한다. 한 실시양태에서, TLR4 효능제는 리포폴리사카라이드이다. 적합하게는, 사포닌은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 껍질로부터 유래된 사포닌의 활성 분획, 예컨대 QS21을 포함한다. 적합하게는, 리포폴리사카라이드는 지질-A 유도체, 예컨대 3D-MPL이다. 구체적인 실시양태에서, 리포폴리사카라이드는 3D-MPL이고, 면역학적으로 활성인 사포닌은 QS21이다. 한 실시양태에서, 상기 아주반트 조성물은 리포솜 제형 중에 리포폴리사카라이드 및 면역학적으로 활성인 사포닌을 포함한다. 적합하게는, 이 실시양태의 한 형태에서, 아주반트는 3D-MPL 및 QS21로 본질적으로 이루어지고, 임의적으로, 바람직하게는 콜레스테롤인 스테롤을 갖는다.
리포솜 크기는 인지질 조성물 및 그들의 제조에 이용된 방법에 따라 30 nm 내지 수 um로 달라질 수 있다. 본 발명의 특정한 실시양태, 리포솜 크기는 50 nm 내지 500 nm, 추가의 실시양태에서 50 nm 내지 200 nm의 범위일 것이다. 최적으로는, 리포솜은 안정해야 하고, 여과에 의해 멸균가능하도록 ~100 nm의 직경을 가져야 한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 다른 TLR4 효능제에는 WO2008/153541 또는 WO2009/143457 또는 문헌 [Coler RN et al. (2011) Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi:10.1371/journal.pone.0016333 and Arias MA et al. (2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144]에 기재된 것과 같은 글루코피라노실 지질 아주반트 (GLA)가 포함된다. WO2008/153541 또는 WO2009/143457은 본 발명에서 사용될 수 있는 TLR4 효능제를 정의하기 위해 본원에 참고로 포함된다.
그람-음성 박테리아의 깊고 거친 돌연변이 균주로부터 추출된 LPS의 산 가수분해에 의해 수득가능한 4'-모노포스포릴 지질 A (MPL)는 LPS의 아주반트 성질을 보유하면서, 1000배 초과로 감소된 독성을 입증한다 (병아리 배아 알에서 치사 용량에 의해 측정됨) (Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl:S512-S516). 전형적으로 중간 정도의 세기를 갖는 광물산 용액 (예를 들어 0.1 M HCl) 중에서 대략 30 분 동안 LPS를 환류시킨다. 이 공정은 1 위치에서의 탈인산화 및 6' 위치에서의 탈탄수화물화를 일으켜, MPL을 생성한다.
MPL의 약알칼리성 가수분해에 의해 수득될 수 있는 3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)는 다시 아주반트성을 유지하면서 추가로 감소된 독성을 갖는다 (US4,912,094 (리비 이뮤노케미컬즈(Ribi Immunochemicals) 참고). 알칼리성 가수분해는 전형적으로 유기 용매, 예컨대 클로로포름/메탄올의 혼합물 중에서, 약염기의 수성 용액, 예컨대 pH 10.5의 0.5 M 탄산나트륨에 의한 포화에 의해 수행된다. 3D-MPL의 제조에 대한 추가의 정보는 예를 들어, US4,912,094 및 WO02/078637 (코릭사 코포레이션(Corixa Corporation))에서 입수가능하다.
퀼라자 사포닌은 퀼라자 사포나리아 나무의 껍질로부터 추출된 트리테르펜 글리코시드의 혼합물이다. 조 사포닌은 수의학용 아주반트로서 광범위하게 사용되어 왔다. Quil-A는 퀼라자 사포닌 물질의 부분적으로 정제된 수성 추출물이다. Quil A는 남아메리카 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무로부터 단리된 사포닌 제제이며, 문헌 [Dalsgaard et al. in 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fuer die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)]에 의해 아주반트 활성을 갖는 것으로 최초로 기재되었다. Quil A (EP 0 362 278)와 관련된 독성이 없이 아주반트 활성을 보유하는 Quil A의 정제된 단편, 예를 들어 QS7 및 QS21 (QA7 및 QA21로도 공지됨)이 HPLC에 의해 단리되었다. QS-21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 껍질로부터 유래된 천연 사포닌이며, 이는 CD8+ 세포독성 T 세포 (CTL), Th1 세포 및 주로 IgG2a 항체 반응을 유도하고, 본 발명에서 바람직한 사포닌이다. QS21은 Quil A의 HPLC 정제된 무독성 분획이고, 그의 제조 방법은 (QA21로서) 미국 특허 번호 5,057,540에 개시되어 있다. 바람직하게는, 아주반트는 실질적으로 순수한 형태로 QS21을 함유하며, 즉, QS21은 적어도 90% 순도, 예를 들어 적어도 95% 순도, 또는 적어도 98% 순도를 갖는다.
리포폴리사카라이드 및 퀼라자 사포닌의 조합물을 함유하는 아주반트가 예를 들어 EP0671948에서 이전에 개시되었다. 이 특허는 리포폴리사카라이드 (3D-MPL)가 퀼라자 사포닌 (QS21)과 조합되었을 때 강력한 상승작용을 입증하였다. 양호한 아주반트 성질은, WO2007/068907에 기재된 바와 같이 심지어 면역자극제가 인간 용량에서 소량으로 존재할 때에도, 아주반트 조성물 중의 면역자극제로서 리포폴리사카라이드 및 퀼라자 사포닌의 조합물에 의해 달성될 수 있다.
구체적인 실시양태에서, QS21은 그의 덜 반응 유발성인 조성물 중에서 제공되며, 이는 외인성 스테롤, 예컨대 콜레스테롤에 의해 켄칭된다. QS21이 외인성 콜레스테롤에 의해 켄칭되는 것인 덜 반응 유발성인 조성물의 몇몇 특정한 형태가 존재한다. 구체적인 실시양태에서, 사포닌 /스테롤은 리포솜 구조체의 형태를 갖는다 (WO 96/33739, 실시예 1). 이 실시양태에서, 리포솜은 적합하게는 중성 지질, 예를 들어 적합하게는 실온에서 비결정질인 포스파티딜콜린, 예를 들어 난황 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린 (DOPC) 또는 디라우릴 포스파티딜콜린을 함유한다. 리포솜은 또한 포화된 지질로 이루어진 리포솜에 대해 리포솜-사포닌 구조체의 안정성을 증가시키는 하전된 지질의 제한된 양을 함유할 수 있다. 이들 경우에, 하전된 지질의 양은 적합하게는 리포솜 조성물의 1-20% w/w, 바람직하게는 5-10% w/w이다. 이러한 하전된 지질의 적합한 예에는 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜세린이 포함된다. 적합하게는, 중성 리포솜은 5% w/w 미만의 하전된 지질, 예컨대 3% w/w 미만 또는 1% w/w 미만을 함유할 것이다. 스테롤 대 인지질의 비는 1-50% (mol/mol), 적합하게는 20-25%이다.
적합한 스테롤에는 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레스테롤이 포함된다. 한 특별한 실시양태에서, 아주반트 조성물은 스테롤로서 콜레스테롤을 함유한다. 이들 스테롤은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 콜레스테롤은 문헌 [Merck Index, 11th Edn., page 341]에서 동물 지방에서 발견되는 천연 발생 스테롤로서 개시된다.
활성 사포닌 분획이 QS21인 경우, QS21 : 스테롤의 비는 전형적으로 대략 1:100 내지 1:1 (w/w), 적합하게는 1:10 내지 1:1 (w/w), 및 바람직하게는 1:5 내지 1:1 (w/w)일 것이다. 적합하게는 과량의 스테롤이 존재하고, QS21:스테롤의 비는 적어도 1:2 (w/w)이다. 한 실시양태에서, QS21:스테롤의 비는 1:5 (w/w)이다. 스테롤은 적합하게는 콜레스테롤이다.
3D-MPL은 글락소스미스클라인 바이올로지컬즈 에스.에이.(GlaxoSmithKline Biologicals S.A.)에 의해 MPL의 명칭으로 판매되며, 문서에서 MPL 또는 3D-MPL로 지칭된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 및 4,912,094를 참고한다. 3D-MPL은 주로 IFN-g (Th1) 표현형을 갖는 CD4+ T 세포 반응을 촉진시킨다. 3D-MPL은 GB 2 220 211 A에 개시된 방법에 따라 생성될 수 있다. 화학적으로, 이는 3-데아실화 모노포스포릴 지질 A와 3, 4, 5 또는 6개의 아실화 쇄의 혼합물이다. 바람직하게는 본 발명의 조성물에서 소형 입자 3D-MPL이 사용된다. 소형 입자 3D-MPL은 0.22 μm 여과기를 통해 멸균 여과될 수 있도록 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제는 WO 94/21292에 기재되어 있다.
적합한 아주반트 조성물은 초기에 MPL 없이 리포솜을 제조한 다음 (WO 96/33739에 기재된 바와 같이), MPL를 적합하게는 100 nm 입자 미만의 소형 입자로서 또는 0.22 μm 막을 통해 멸균 여과할 수 있는 입자로서 첨가한 것이다. 따라서, MPL는 소포 막 내에 함유되지 않는다 (MPL out으로 공지됨). MPL가 소포 막 내에 함유된 조성물 (MPL in으로 공지됨) 또한 본 발명의 측면을 형성한다. 항원은 소포 막 내에 함유될 수 있거나 또는 소포 막 밖에 함유될 수 있다.
12g의 최대 배치 크기의 경우, MPL 액체 벌크 제제는 멸균 유리 용기에 담지된다. MPL의 분산액은 하기 단계로 이루어진다: MPL 분말을 주사용수에 현탁시키고: 임의의 큰 응집물을 가열에 의해 분해하고 (열 처리); 미세유동화에 의해 입자 크기를 100 nm 내지 200 nm로 감소시키고; 사르토클린(Sartoclean) 예비 여과 장치, 0.8/0.65μm 상에서 제제를 예비 여과하고; 실온에서 제제를 멸균 여과한다 (사르토브란(Sartobran) P 장치, 0.22 μm).
MPL 분말을 미세유동화에 의해 동결 건조시켜, 안정한 콜로이드성 수성 분산액을 생성한다 (멸균 여과할 수 있는 크기를 갖는 MPL 입자). MPL 동결 건조된 분말을 주사용수에 분산시켜, 조대한 10 mg/ml 현탁액을 수득한다. 이어서, 현탁액을 교반하면서 열 처리에 적용한다. 실온에서 냉각시킨 후, 미세유동화 공정을 시작하여, 입자 크기를 감소시킨다. 미세유동화는 미세유체공학 장치 M110EH를 사용하여, 최소의 통과량을 위해 한정된 압력에서 미세유동화 상호작용 챔버를 통해 분산액을 연속적으로 순환시킴으로써 수행된다 (사이클 수: nmin). 사이클 수를 나타내는 미세유동화 지속시간은 측정된 유량 및 분산액 부피를 기준으로 하여 계산된다. 주어진 압력에서 주어진 장비 상에서, 생성된 유량은 상호작용 챔버마다 및 특정한 상호작용 챔버의 수명에 걸쳐 서로 다를 수 있다. 이 예에서 사용된 상호작용 챔버는 유형 F20Y 미세유체공학이다. 미세유동화 효율이 커플 압력 (유량)과 관련이 있으므로, 가공 시간은 배치마다 서로 다를 수 있다. 1 사이클에 필요한 시간은 유량을 기준으로 하여 계산된다. 고려되는 유량은 MPL을 장치에 도입시키기 직전에 주사용수에 의해 측정된 유량이다. 1 사이클은 MPL의 총 부피가 장치를 통해 1회 통과하는데 필요한 시간 (분)으로서 정의된다. n 사이클을 수득하기 위해 필요한 시간은 하기와 같이 계산된다:
n x 처리하기 위한 MPL의 양 (ml) / 유량 (ml/min)
따라서, 사이클 수는 그에 따라 조정된다. 수행할 사이클의 최소량 (분)은 사용된 바람직한 장비 및 상호작용 챔버에 대해 기재된다. 작동할 사이클의 총량은 nmin 사이클 이후에 수행된 입자 크기 측정의 결과에 의해 결정된다. 입자 크기 한계 (dlim)는 과거 데이터를 기준으로 정의된다. 측정은 광자 상관법 (PCS) 기술에 의해 실현되고, dlim은 단봉 결과로서 표현된다 (Z평균). 이 한계 아래에서는, 미세유동화가 nmin 사이클 이후에 중단될 수 있다. 이 한계 위에서는, 최대 또 다른 50 사이클 동안 만족스러운 크기 감소가 수득될 때까지 미세유동화가 계속된다.
여과가 미세유동화 직후에 수행되지 않는 경우, 분산된 MPL은 여과 영역으로의 전달을 대기하면서 +2 내지 +8℃에서 보관된다.
미세유동화 이후에, 분산액을 주사용수로 희석하고, 층류 하에서 0.22μm 여과기를 통해 멸균 여과한다. 최종 MPL 농도는 1 mg/ml (0.80-1.20 mg/ml)이다.
MPL을 함유하는 리포솜의 생성 과정에서, DOPC (디올레일 포스파티딜콜린), 콜레스테롤 및 MPL을 에탄올에 용해시킨다. 진공 하에 용매 증발에 의해 지질 필름을 형성한다. pH 6.1의 포스페이트 버퍼 식염수 (9 mM Na2HPO4, 41 mM KH2PO4, 100 mM NaCl)를 첨가하고, 혼합물을 사전 균질화에 적용한 다음, 15,000 psi에서 고압 균질화에 적용하였다 (대략 15 내지 20 사이클). 이로써 무균 (클래스 100) 영역에서 0.22 μm 막을 통해 멸균 여과된 리포솜이 생성된다. 이어서, 멸균 생성물을 멸균 유리 용기에 분배하고, 냉장실에서 보관하였다 (+2 내지 +8℃).
이러한 방식으로 생성된 리포솜은 막 안에 MPL을 함유한다 (WO 96/33739의 "MPL in" 실시양태).
QS21을 원하는 농도로 수성 용액에 첨가한다.
아주반트 AS01은 콜레스테롤에 의해 켄칭된 형태로 3D-MPL 및 QS21을 포함하고, WO 96/33739에 기재된 바와 같이 제조되었다. 특히, AS01 아주반트는 본질적으로 WO 96/33739의 실시예 1.1에서와 같이 제조되었다. AS01B 아주반트는 다음을 포함한다: 디올레오일 포스파티딜콜린 (DOPC), 콜레스테롤 및 3D MPL [1000μg DOPC, 250 μg 콜레스테롤 및 50 μg 3D-MPL의 양으로, 각각의 값은 백신 용량에 따라 대략 주어짐]을 포함하는 리포솜, QS21 [50μg/용량], 포스페이트 NaCl 버퍼, 및 0.5ml 부피까지의 물.
AS01E 아주반트는 AS01B와 동일한 성분을 포함하지만, 500μg DOPC, 125μg 콜레스테롤, 25μg 3D-MPL 및 25μg QS21, 포스페이트 NaCl 버퍼, 및 0.5ml 부피까지의 물의 양으로 낮은 농도를 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에서 사용된 아주반트는 AS01E이다.
투여 방법
한 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신은 근육내 전달 경로에 의해 투여된다. 근육내 투여는 허벅지 또는 상완으로일 수 있다. 주사는 전형적으로 니들 (예를 들어 피하 니들)을 통한다. 전형적인 근육내 용량은 하기 기재되는 바와 같이 0.5 ml이다.
용량
각각의 면역원성 조성물 또는 백신 용량 중 접합체 항원의 양은 전형적인 백신에서 유의한 부작용 효과없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 사용된 구체적인 면역원 및 그의 제시 방법에 따라 달라질 것이다. 각각의 단백질 항원의 함량은 전형적으로 1-200μg, 적합하게는 1-100μg, 적합하게는 5-50μg의 범위일 것이다. 각각의 사카라이드 항원의 함량은 전형적으로 0.1-50μg, 적합하게는 0.1-10μg, 적합하게는 1-5 μg의 범위일 것이다.
인간 사용에 적합한 부피인 용량은 일반적으로 0.25 내지 1.5 ml이지만, 피부로의 투여의 경우에는 0.05 ml 내지 0.2 ml의 더 낮은 부피가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 용량은 0.5 ml이다. 추가의 실시양태에서, 인간 용량은 0.5 ml 초과, 예를 들어 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 ml이다. 추가의 실시양태에서, 인간 용량은 1 ml 내지 1.5 ml이다. 또 다른 실시양태에서, 특히 면역원성 조성물이 소아과 집단을 위한 것인 경우에는, 인간 용량이 0.5 ml 미만, 예컨대 0.25 내지 0.5 ml일 수 있다.
면역원성 조성물이 3D-MPL 및 QS21를 포함하는 아주반트를 포함하는 경우, QS21 및 3D-MPL은 바람직하게는 면역원성 조성물의 인간 용량당 동일한 최종 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 대략 25 μg, 예를 들어 20 - 30 μg, 적합하게는 21 - 29 μg 또는 22 내지 28 μg 또는 23 내지 27 μg 또는 24 내지 26 μg, 또는 25 μg의 수준으로 3D-MPL을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 대략 25 μg, 예를 들어 20 - 30 μg, 적합하게는 21 - 29 μg 또는 22 내지 28 μg 또는 23 내지 27 μg 또는 24 내지 26 μg, 또는 25 μg의 수준으로 QS21을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 25 μg의 3D-MPL 및 25 μg의 QS2의 최종 수준을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 50 μg의 3D-MPL 및 50 μg의 QS21의 최종 수준을 포함한다.
면역원성 조성물을 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 아주반트 조성물과 조합하여 사용하는 경우, QS21 및 3D-MPL은 바람직하게는 아주반트 조성물의 인간 용량당 동일한 최종 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 아주반트 조성물의 인간 용량은 대략 25 μg, 예를 들어 20 - 30 μg, 적합하게는 21 - 29 μg 또는 22 내지 28 μg 또는 23 내지 27 μg 또는 24 내지 26 μg, 또는 25 μg의 수준으로 3D-MPL을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 용량에 적합한 부피인 아주반트 조성물에서 아주반트 조성물의 인간 용량은 대략 25 μg, 예를 들어 20 - 30 μg, 적합하게는 21 - 29 μg 또는 22 내지 28 μg 또는 23 내지 27 μg 또는 24 내지 26 μg, 또는 25 μg의 수준으로 QS21을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 아주반트 조성물의 인간 용량은 25 μg의 3D-MPL 및 25 μg의 QS21의 최종 수준을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아주반트 조성물의 인간 용량은 50 μg의 3D-MPL 및 50 μg의 QS21의 최종 수준을 포함한다.
아주반트가 항원 조성물의 액체 형태와 조합되도록 액체 형태를 갖는 경우, 아주반트 조성물은 인간 용량의 의도된 최종 부피의 대략 절반인 인간 용량 적합한 부피, 예를 들어 0.7ml의 의도된 인간 용량의 경우 360 μl 부피, 또는 0.5 ml의 의도된 인간 용량의 경우 250 μl 부피를 가질 것이다. 아주반트 조성물은 항원 조성물과 조합될 때 희석되어, 백신의 최종 인간 용량을 제공한다. 이러한 용량의 최종 부피는 물론 아주반트 조성물의 초기 부피 및 아주반트 조성물에 첨가되는 항원 조성물의 부피에 따라 달라질 것이다. 대안적인 실시양태에서, 액체 아주반트를 사용하여 동결 건조된 항원 조성물을 재구성한다. 이 실시양태에서, 아주반트 조성물의 인간 용량 적합한 부피는 인간 용량의 최종 부피와 대략 동일하다. 액체 아주반트 조성물을 동결 건조된 항원 조성물을 함유하는 바이알에 첨가한다. 최종 인간 용량은 0.5 내지 1.5 ml로 달라질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인간 용량은 0.5 ml이다.
예방적 및 치료적 용도
본 발명은 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 박테리아 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 포도상구균 박테리아에 의한 대상체 (예를 들어 인간 대상체)의 감염의 예방에 사용된다. 에스. 아우레우스는 다양한 포유동물 (예컨대 소, 개, 말 및 돼지)을 감염시키지만, 본 발명에서 사용하기에 바람직한 대상체는 인간이다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물을 사용하여 스타필로코쿠스 종, 특히 에스. 아우레우스에 의한 감염을 치료하거나 또는 예방한다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물을 사용하여 에스. 아우레우스 감염, 예컨대 병원내 감염을 예방할 수 있다.
또한, 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 포도상구균 박테리아, 특히 에스. 아우레우스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 대상체는 투여 시점에 박테리아 감염을 갖고 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 대상체는 투여 시점에 박테리아 감염을 갖고 있지 않다. 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 사용하여 스타필로코쿠스 종, 특히 에스. 아우레우스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
또한, 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 포도상구균 박테리아, 특히 에스. 아우레우스에 대한 옵소닌 식세포 작용성 항체의 생성을 유도하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 대상체는 투여 시점에 박테리아 감염을 갖고 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 대상체는 투여 시점에 박테리아 감염을 갖고 있지 않다.
또한, 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 포도상구균 Hla, ClfA 및/또는 SpA의 활성을 중화시키거나 또는 감소시킬 수 있는 항체의 생성을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 Hla 활성은 인간 적혈구를 용해시키는 능력일 수 있다 (용혈). 상기 ClfA 활성은 인간 피브리노겐에 결합하는 능력일 수 있다. 상기 SpA 활성은 이뮤노글로불린 (Ig)의 Fcγ에 및 VH3-유형 B 세포 수용체의 Fab 부분에 결합하는 능력일 수 있다.
또한, 숙주에게 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 포도상구균 감염, 특히 에스. 아우레우스 감염에 대해 인간 숙주를 면역화시키는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 포도상구균 박테리아, 특히 에스. 아우레우스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
또한, 질환의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 예를 들어 포도상구균 감염, 특히 에스. 아우레우스 감염에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다.
또한, 포도상구균 감염, 특히 에스. 아우레우스 감염에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다.
또한, 질환의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 예를 들어 포도상구균 감염, 특히 에스. 아우레우스 감염에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 포함하는, 포도상구균 감염, 특히 에스. 아우레우스 감염의 치료 또는 예방을 위한 약제가 제공된다.
또한, 대상체에서 포도상구균 박테리아, 특히 에스. 아우레우스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다.
또한, 대상체에서 포도상구균 박테리아, 특히 에스. 아우레우스에 대한 옵소닌 식세포 작용성 항체의 생성을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다.
또한, 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 포도상구균 Hla, ClfA 및/또는 SpA의 활성을 중화시키거나 또는 감소시킬 수 있는 항체의 생성을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다. 상기 Hla 활성은 인간 적혈구를 용해시키는 능력일 수 있다 (용혈). 상기 ClfA 활성은 인간 피브리노겐에 결합하는 능력일 수 있다. 상기 SpA 활성은 이뮤노글로불린 (Ig)의 Fcγ에 및 VH3-유형 B 세포 수용체의 Fab 부분에 결합하는 능력일 수 있다.
본 특허 명세서에 인용된 모든 참고문헌 또는 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 측면들은 하기에 번호 매긴 항들에서 요약된다:
1. 하기를 포함하는 면역원성 조성물:
a. ClfA 항원;
b. Hla 항원;
c. SpA 항원; 및
d. 포도상구균 피막 폴리사카라이드.
2. 제1항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 담체 단백질에 접합되는 것인 면역원성 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 에스. 아우레우스 혈청형 5 및/또는 유형 8 피막 폴리사카라이드인 면역원성 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 제1항의 항원 (a)-(c) 중 하나에 접합되는 것인 면역원성 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드 및 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 Hla 항원에 접합된 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드 및/또는 ClfA 항원에 접합된 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
a. ClfA 항원이 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ClfA 단백질, 또는 그의 면역원성 단편이고;
b. Hla 항원이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Hla 단백질, 또는 그의 면역원성 단편이고/거나;
c. SpA 항원이 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 26과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 SpA 단백질, 또는 그의 면역원성 단편인
면역원성 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ClfA 항원이 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 (또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열에서 동등한 위치)을 기준으로 하여 P116에서 S로의 아미노산 치환 및 Y118에서 A로의 아미노산 치환으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하며, 임의적으로 서열식별번호: 5-7 또는 32 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 조성물.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, ClfA 항원이 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 1개 이상의 PglB 컨센서스 서열(들)을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 면역원성 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 컨센서스 서열이 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 313-342 사이의 1개 이상의 아미노산에서 부가되었거나 또는 그를 치환하였으며, 임의적으로 위치 I337에서의 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산을 치환한 것인 면역원성 조성물.
11. 제9항 내지 제10항에 있어서, X가 Q (글루타민)이고, Z가 A (알라닌)인 (예를 들어 K-D-Q-N-A-T-K, 서열식별번호: 31) 면역원성 조성물.
12. 제11항에 있어서, ClfA 항원이 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 32의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 면역원성 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Hla 항원이 서열식별번호: 3의 위치 H35에서의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 치환은 임의적으로 H에서 L로의 아미노산 치환인 면역원성 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Hla 항원이 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 1개 이상의 PglB 컨센서스 서열(들)을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 면역원성 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 컨센서스 서열이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열의 1개 이상의 아미노산에서 부가되었거나 또는 그를 치환한 것인 면역원성 조성물.
16. 제14항에 있어서, 상기 컨센서스 서열이 서열식별번호: 3의 위치 K131에서의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산을 치환한 것인 면역원성 조성물.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, X가 Q (글루타민)이고, Z가 R (아르기닌)인 (예를 들어 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30)) 면역원성 조성물.
18. 제17항에 있어서, Hla 항원이 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 면역원성 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 항원이 (a) VH3과의 결합을 방해하거나 또는 감소시키는 도메인 E, D, A, B 또는 C의 VH3-결합 서브-도메인에서의 1개 이상의 아미노산 치환, 및 (b) IgG Fc와의 결합을 방해하거나 또는 감소시키는 도메인 E, D, A, B 또는 C의 IgG Fc 결합 서브-도메인에서의 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 항원이 (i) 서열식별번호: 14의 아미노산 위치 34 및 35에서의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 E; 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 39 및 40에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D; 서열식별번호: 16의 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 A; 서열식별번호: 17의 위치 아미노산 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 B, 및/또는 서열식별번호: 18의 위치 아미노산 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 C를 포함하고/거나; (ii) 서열식별번호: 14의 아미노산 위치 7 및 8에서의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 E; 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 12 및 13에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D; 서열식별번호: 16의 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 A; 서열식별번호: 17의 위치 아미노산 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 B, 및/또는 서열식별번호: 18의 위치 아미노산 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 C를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 글루타민에서 리신으로의 치환 및/또는 아스파르트산에서 알라닌으로의 치환인 면역원성 조성물.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 항원이 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 4 및 5에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 글루타민에서 리신 및/또는 글루타민에서 아르기닌으로의 치환, 예를 들어 QQ에서 KR로의 치환인 면역원성 조성물.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SpA 항원이 서열식별번호: 19-23, 26 또는 27의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 19-23, 26 또는 27과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 (i) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 ClfA 항원; (ii) 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 Hla 항원; (iii) 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 SpA 항원; (iv) 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드, 및 (v) 에스. 아우레우스 혈청형 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
26. 제25항에 있어서, ClfA 항원이 에스. 아우레우스 혈청형 유형 8 피막 폴리사카라이드에 접합되고, Hla 항원이 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드에 접합되는 것인 면역원성 조성물.
27. 제26항에 있어서, 상기 ClfA-CP8 및 Hla-CP5 접합체가 생체접합체인 면역원성 조성물.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 아주반트를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
29. 제28항에 있어서, 아주반트가 사포닌 및 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
30. 제29항에 있어서, 아주반트가 리포솜 제형 중에 사포닌, 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 스테롤을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌이 퀼라자 사포나리아 몰리나의 껍질로부터 유래된 면역학적으로 활성인 사포닌 분획인 면역원성 조성물.
33. 제32항에 있어서, 사포닌이 QS21인 면역원성 조성물.
34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 리포폴리사카라이드가 지질 A 유도체인 면역원성 조성물.
35. 제34항에 있어서, 리포폴리사카라이드가 3D-MPL인 면역원성 조성물.
36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤이 콜레스테롤인 면역원성 조성물.
37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 인간 용량당 25 μg의 수준으로 QS21을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 인간 용량당 25 μg의 수준으로 3D-MPL을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
39. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 백신.
40. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 백신.
41. 제1항 내지 제27항 및 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 아주반트와 조합되어 투여되는 것인, 포도상구균 감염의 예방 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 면역원성 조성물 또는 백신.
42. 제41항에 있어서, 면역원성 조성물이 대상체에게 투여하기 전에 아주반트와 혼합되는 것인 면역원성 조성물 또는 백신.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 아주반트가 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 면역원성 조성물 또는 백신.
44. 제43항에 있어서, 아주반트가 인간 용량당 25 μg의 수준으로 3D-MPL 및 인간 용량당 25 μg의 수준으로 QS21을 포함하는 것인 면역원성 조성물 또는 백신.
45. (i) 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제39항에 따른 백신을 포함하는 제1 용기; 및 (ii) 아주반트를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트.
46. 제45항에 있어서, 아주반트가 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 키트.
47. 제46항에 있어서, 아주반트가 인간 용량당 25 μg의 수준으로 3D-MPL 및 인간 용량당 25 μg의 수준으로 QS21을 포함하는 것인 키트.
48. 포도상구균 감염의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 제39항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 포도상구균 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 대상체에게 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 아주반트가 면역원성 조성물과 동시에 투여되는 것인 방법.
51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 아주반트가 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 방법.
52. 포도상구균 감염의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 제40항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 포도상구균 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법.
53. 항원, 및 임의적으로 아주반트를 제약상 허용가능한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, 상기 항들 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하는 방법.
실시예
실시예 1: 백신 조성물 및 제형.
백신 성분
6 내지 20개의 반복 단위를 함유하며, 1개의 글리코실화 부위, H35L/H48C/G122C 돌연변이 및 C-말단 HRHR 태그를 함유하는 Hlamut (서열식별번호: 12, FlgL 신호 서열을 이용하여 발현됨)에 연결된 CP5의 생체접합체를 에스. 아우레우스 피막 폴리사카라이드 CP5, 위치 131에서 글리코실화 부위 및 C-말단 히스티딘-아르기닌-히스티딘-아르기닌 태그를 갖는 에스. 아우레우스 담체 단백질 HlaH35L-H48C-G122C, 및 캄필로박터 제주니 올리고사카릴트랜스퍼라제 PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V를 코딩하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 세포의 유가식 발효를 이용하여 생성하였다.
5 내지 16개의 반복 단위를 함유하며, 1개의 글리코실화 부위 및 P116S/Y118A 돌연변이를 갖는 ClfA N2/N3 도메인을 포함하는 ClfAmut (서열식별번호: 7)에 연결된 CP8의 생체접합체를 PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V 및 에스. 아우레우스 CP8을 발현하는 이. 콜라이 세포 (W3110 waaL::pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V; O16::O11_ wbjB-wbpM; ΔrmlB-wecG; wecA-wzzE::CP8_p2636(CCW)_Cat)의 유가식 발효에 의해 생성하였고, ClfAmut를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다.
생체접합체를 상이한 제형에서 안정성에 대해 시험하였다. 각각의 배치에 대해 3가지 상이한 제형의 안정성을 상기 표에서 보고된 분석 패널의 일부를 적용함으로써 -80℃ (장기간), +4℃ (중간) 및 +25℃에서 3 개월 이하 동안 시험하여, 단백질 및 폴리사카라이드 안정성과 관련하여 함량, 순도, 응집, 분해를 평가하였다.
CP5-Hla 및 CP8-ClfA 생체접합체는 4℃ 및 -80℃에서 적어도 3 개월 동안 및 25℃에서 3 개월 이하 동안 안정하였다.
IgG 및 IgM 결합을 고도로 손상시키는, 5개의 IgBD 각각에서 4개의 핵심 잔기에서 아미노산 치환 (글루타민 및 아스파르테이트를 각각 리신 및 알라닌으로 교체함)을 보유하는 IgG 결합 부분 (IgG 결합 도메인 EDABC), 뿐만 아니라 각각 리신 70 및 아르기닌 71로 돌연변이된 (K70 및 R71) IgG 결합 부분의 Q70 및 Q71에 상응하는 2개의 추가의 이뮤노글로불린 결합 잔기 (전장 단백질의 Q96 및 Q97)를 포함하는 SpA 변이체 (SpAKR-KKAA, 본원에서 SpAmut로 지정되고, 서열식별번호: 27의 서열을 포함하고, WO2015/144653에 기재됨). SpAmut는 표면 플라즈몬 공명 실험에 의해 인간 IgG 및 IgM에 대해 검출가능한 친화도를 갖지 않는 것으로 확인되었고, 이는 분자를 백신 사용에 대해 더욱 안정하게 만든다. SpAmut는 시판되는 에스케리키아 콜라이 BL21 (DE3) 균주를 사용하여 박테리아 배치 발효에 의해 재조합 형태로 발현되었다.
4가지 적합한 제형 버퍼 중에서 4℃에서, RT에서 및 37℃에서 3, 10 및 30 일 동안 보관한 후에 단백질의 분석을 위해 SDS-PAGE 및 SE-UPLC를 이용하여 가속된 안정성 연구를 수행하였다.
SpAmut는 4℃에서 3 개월까지 안정하였고, 25℃에서 10 일까지 안정하였고, 37℃에서 4 일까지 안정하였다.
백신 제형
아주반트화되지 않은 및 AS01E (상기 기재된 바와 같이 리포솜 조성물 중 3D-MPL + QS21) 및 알룸/TLR7 (WO2011/027222, 실시예 20, WO2012/031140 및 문헌 [Bagnoli et al., PNAS, 2015, 112: 3680-3685]에 기재된 바와 같이 AlOH에 흡착된 TLR7 효능제)에 의해 아주반트화된 마우스 면역화 연구를 위한 제형을 제조하였다. 3가지 성분 (CP5-Hla, CP8-ClfA, SpAmut)을 단백질 함량을 기준으로 각각의 성분에 대해 200 μg/ml의 농도로 (최종 고용량과 관련하여 2배 농축됨, 본원에서 2X로 지칭됨) 동일한 바이알에서 제형화하였다. 최종 상이한 제형을 수득하기 위해, 3가지 혼합된 성분을 갖는 바이알 2X를 면역화 이전에 베드측(bed-side) 혼합 접근법을 통해 제형 버퍼 (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl pH 6.5) 또는 아주반트 (아주반트 최종 용량과 관련하여 2배 농축됨)에 의해 재구성하였다. 100 μg/ml (10 μg/100μl와 동등함)의 원하는 최종 단백질 농도를 갖도록, 1 부피의 바이알 2X를 동등한 부피의 AS01B (AS01E와 비교하여 2배 농축됨) 또는 알룸/TLR7 (2배 농축됨, 20 μg/용량의 알룸/TLR7), 또는 대안적으로 아주반트화되지 않은 그룹의 경우 제형 버퍼로 재구성함으로써 높은 단백질 용량에 도달하였다. 10 μg/ml (1 μg/100μl와 동등함) 및 1 μg/ml (0.1 μg/100μl와 동등함)의 최종 농도에 도달하도록 동등한 부피의 AS01B (2X) 또는 알룸 /TLR7 (2X)에 의해 최종적으로 재구성하기 전에, 대신에 바이알 2X를 제형 버퍼에 의해 각각 1:10 및 1:20으로 사전 희석하여 중간 및 낮은 단백질 용량을 수득하였다. 제형 버퍼는 대조군 그룹에 대한 희석제로서 사용되었다. 제형의 단기간 안정성 (2-8℃ 보관 조건에서 24 시간까지)을 평가하기 위해, 혼합물 2X를 갖는 바이알 및 아주반트 또는 위약에 의한 재구성 단계 이후 둘 다에 대해 상용성 연구를 수행하였다. 하기 파라미터의 평가를 통해, 확장된 분석 패널을 제형의 특징분석에 적용하였다:
1. 물리-화학적 (육안 검사, pH 및 삼투질 농도)
2. 항원 동일성 (각각의 단일 성분에 대한 웨스턴 블롯, 단백질 및 사카라이드 둘 다)
3. 총 단백질 함량 (μBCA)
4. 멸균성 (플레이트 성장을 통한 미생물 오염)
5. AS01 입자 크기 (DLS)
6. 알룸 /TLR7 회수 (RP-HPLC)
전임상 연구에서의 평가를 위해 고려된 항원/아주반트 또는 위약 조합물에 대해 주요한 비상용성이 관찰되지 않았다.
실시예 2: AS01 E 또는 알룸/TLR7에 의해 아주반트화된 백신에 대한 마우스 및 사전 노출된 토끼에서의 면역원성
상이한 동물 종을 면역화시키기 위해 백신 제형을 사용하였다:
i) 나이브 마우스, 백신 성분에 대해 특이적인 IgG 및 T 세포 반응 둘 다의 생체내 유도를 연구하기 위해. 이들 연구에서, 아주반트화되지 않거나 또는 상이한 면역화 용량으로 AS01E 또는 알룸/TLR7에 의해 아주반트화된 백신을 시험하였다.
ii) 에스. 아우레우스 사전 노출된 토끼, 백신 성분에 대해 특이적인 IgG의 기존 수준이 존재하는 모델에서 백신에 대한 반응을 평가하기 위해. 이 연구에서, 상이한 용량으로 AS01E에 의해 아주반트화되거나 또는 아주반트화되지 않은 백신을 시험하였다. 알룸 /TLR7 아주반트는 토끼 세포에 대한 효능제 수용체의 결여로 인해 이 모델에서 사용할 수 없었다.
특이적 면역 반응을 다음에 의해 평가하였다:
a) 백신접종 이후 상이한 시점에서 마우스 및 토끼 면역 혈청 둘 다에서 루미넥스 기술에 의한 항원-특이적 IgG를 측정함.
b) 면역화된 마우스의 비장에서 백신 항원에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 존재를 평가함.
c) 마우스 및 토끼 혈청에 존재하는 항체가 단백질 성분, 야생형 Hla 및 ClfA 항원 중 2가지의 생물학적 활성을 중화시키는 능력을 측정함.
연구의 개요가 표 1에 제시된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
마우스의 면역화
5 주령의 암컷 마우스에게 IM 경로에 의해 28 일 간격으로 100 μl의 버퍼 또는 시험한 제형의 2회 용량 (각각의 뒷다리 사두근에서 50 μl)을 제공하였다. 혈액 샘플을 제1 주사 이전에 (제0일), 제1 주사 이후 1 주, 2 및 4 주째에 (1wp1, 2wp1, 4wp1), 및 제2 주사 이후 1, 2, 4, 8, 12 및 16 주째에 (1wp2, 2wp2, 4wp2, 8wp2, 12wp2, 6wp2) 취하였다. 실험 변동성을 평가하기 위해 실험을 3회 반복하였다. 각각의 그룹에 대해 풀링된 샘플에 대해 통계 분석을 수행하였다. 3회 실험에서 사용된 마우스의 총 수에 대한 연구 개요는 표 2에 제시되어 있다.
표 2: 면역화된 마우스에서 IgG 역가의 결정을 위한 연구 설계
Figure pct00005
백신-특이적 IgG의 평가
마우스 및 토끼에서 백신-특이적 IgG를 평가하기 위한 혈청학적 분석은 루미넥스 기술에 의한 멀티플렉스 검정을 기반으로 한다. 이 기술을 이용하여 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 백신에 의해 면역화된 대상체로부터 인간 혈청에서 항체를 측정하였다 (Raedler et al., Clin Vaccine Immuno 2009, 16: 739-49).
상기 검정은 3가지 SA 재조합 단백질 (SPAmut, ClfAmut, Hlamut) 및 상이한 혈청형을 갖는 2가지 피막 폴리사카라이드 (CP5 및 CP8)에 의해 코팅된 자성 비드를 이용하여 5가지 항원을 동시에 (5-플렉스) 분석한다. N-히드록시술포숙신이미드-강화된 카르보디이미드 (EDC)-매개된 접합 화학을 이용하여 단백질 항원을 미세구의 유리 카르복실 기에 공유 접합시킨다. CP5 및 CP8을 비오틴-히드라지드 (BH) 및 EDC를 이용하여 비오티닐화시키고, 정제하고, 후속적으로 스트렙타비딘 비드에 접합시킨다.
HlaH35R+ClfAmut+CP5-TT+CP8-TT+SpAmut-10μg/알룸/TLR7에 의해 면역화된 5 마리의 마우스로부터 제2 주사 이후 D12에 수집된 과다면역 혈청을 풀링함으로써 5가 표준 혈청을 제조하였다. 5가 표준에 대해 100 RLU/ml의 임의 역가를 배정하였다.
검정을 하기 기준에 따라 설정하였다:
모노플렉스 대 멀티플렉스 설정에 의해 수득된 신호를 비교함으로써 관찰된 5가지 항원 사이의 교차-반응성 없음.
멀티플렉스 흡착전 연구에 의해 확인된 검정의 특이성.
검정의 검정내 및 검정간 재현성 (각각 %CV <10% 및 20%).
표준 및 시험 혈청에 의해 수득된 5PL MFI 곡선의 선형 범위에서 선형성 평가: R2 값 > 0.9.
각각의 항원에 대한 검출 하한 (LLOD, 하기 표 참고)은 블랙 샘플로부터의 평균 RLU로서 결정되었다.
정량 하한 (LLOQ, 하기 표 참고): 1:1000의 최소 요구 희석 (MDR)을 이용하여 허용가능한 정확성 (스파이킹 실험에서 CV<20%)에 의해 결정될 수 있는 더 낮은 역가.
Figure pct00006
샘플 시험의 경우, 5개 이하의 증가하는 희석액을 독립적으로 제조하고, 적절한 양의 커플링된 미세구를 갖는 96 웰 플레이트 상에 로딩하였다. 각각의 희석액을 2회 반복으로 시험하였다. 항원 특이적 항체가 항-마우스 IgG 피코에리트린-라벨링된 이차 항체에 의해 드러났고, 루미넥스 200 판독기를 사용하여 MFI를 측정하였다.
상이한 시점에서 각각의 그룹에 대해 3회 실험을 이용하여 분석을 수행하였다. 각각의 항원 및 용량에 대한 실험간의 생물학적 변동성을 평가하기 위해, 이원 혼합 ANOVA를 적용하였다 (고정된 효과로서 "그룹" 및 "실험" 및 무작위 효과로서 "개별 마우스"). p-값 = 0.001로서 용량 0.1μg의 ClfAmut 및 Hlamut를 제외하고는, 유의한 그룹-실험 상호작용이 관찰되지 않았다.
마우스 연구에 대한 전반적인 결과 (도 1, 0.1 μg 용량에 대한 데이터는 제시되지 않음)는 다음을 나타내었다:
모든 백신 성분은 마우스에서 면역원성이었다. 대조군 그룹 (10, 11 및 12)은 임의의 5가지 항원에 대한 검출가능한 항체를 나타내지 않았다. 유사하게, 추정된 역가의 14%가 LLOQ보다 약간 높은 Hlamut 항원을 제외하고는, 면역화 이전 혈청에서 검출가능한 IgG가 측정되지 않았다.
아주반트가 없는 백신에 대한 반응은 아주반트가 있는 백신에 대한 반응보다 항상 열등하였다.
유의한 용량 효과를 아주반트가 있는 및 없는 모든 그룹에서 관찰하였다 (일원 ANOVA를 적용하였고, 터키(Tukey) "정직한 유의한 차이(Honest Significant Difference)"를 이용하여 다중 비교를 위해 조정하였음). 특히:
아주반트 없음: 제2 면역화 이후에 모든 항원의 경우 0.1μg < 1μg < 10μg (p-값 <0.01 터키 사후 검정).
AS01 E : 임의의 시점에 ClfAmut, HLAmut 및 SpAmut의 경우 0.1μg < 1μg < 10μg (p-값 <0.05 터키 사후 검정); CP8의 경우 0.02μg < 0.2μg ≤ 2μg (폴리사카라이드-기반 용량) (p-값 <0.05 터키 사후 검정). CP5의 경우 제2 면역화 이후에 0.02μg = 0.2μg > 2μg (p-값 <0.0001 터키 사후 검정).
알룸/TLR7: 임의의 시점에 ClfAmut 및 SpAmut의 경우 0.1μg < 1μg ≥ 10μg (p-값 <0.05 터키 사후 검정). CP5의 경우 제2 면역화 이후에 0.02 μg = 0.2μg > 2μg (폴리사카라이드-기반) (p-값 <0.05 터키 사후 검정)인 반면에, CP8의 경우 임의의 시점에 0.02μg < 0.2μg >2μg (p-값 <0.05 터키 사후 검정), 최종적으로 HLAmut의 경우 0.1μg < 1μg ≤ 10μg.
가장 높은 IgG 역가를 수득하기 위해 2회 면역화가 필요하였다 (p-값 <0.01 터키 사후 검정).
사전 노출된 토끼의 선택 및 연구 설계
백신에 존재하는 3가지 단백질 항원 및 2가지 폴리사카라이드에 대해 혈청 기존 항체에서 측정하기 위해 총 350 마리의 토끼를 ELISA에 의해 스크리닝하였다. ELISA 분석은 흡광도 A450nm = 0.2가 1/100 희석에서 IgG 반응을 측정하기 위한 검출 한계였고, 모든 토끼가 적어도 하나의 항원에 대해 양성이었음을 제시하였다.
표 3에 제시된 연구 설계에 따라 토끼 그룹을 모으기 위해, 84 마리의 토끼의 선택을 수행하였다.
표 3: 토끼 연구 설계
Figure pct00007
# AS01E 아주반트는 12.5 μg의 MPL, TLR4 활성화제, 및 12.5 μg의 QS- 21 (퀼라자 사포나리아 몰리나, 분획 21)로 구성되고, 이는 APC에 대한 항원 제시를 증가시킨다.
350 마리의 토끼를 ELISA 결과 >0.2 A450nm을 갖는 항원을 기반으로 하여 5가지 하위 그룹 또는 계층으로 나누었다 (즉, 5, 4, 3, 2 또는 ≤1 항원에 대해 ELISA >0.2). '5가지 항원에 대해 양성' 또는 '4가지 항원에 대해 양성'인 두 계층 각각에서의 모든 토끼 (총 n= 35)를 연구에 포함되는 것으로 선택하였고, 무작위로 7가지 실험 그룹에 할당하였다 (각각의 그룹에 대해 총 n=5). 다른 필요한 토끼는 '3가지 항원에 대해 양성' 계층 (n=102)으로부터 취하였고, 추가의 선택 기준을 적용하였다. '3가지 항원에 대해 양성'인 계층에서, ClfA에 대해 양성인 토끼만이 연구에 적격인 것으로 고려되었고 (n=64), 이들 중에서 사분위 범위 내에서 Hla 및 SpA 항원 둘 다에 대해 ELISA 결과를 갖는 토끼만이 연구에 적격인 것으로 고려되었다 (n=51). 51 마리의 토끼 중 49 마리를 무작위로 선택하였고, 7개의 연구 그룹 중 하나에 할당하였다 (각각의 그룹에 대해 총 n=7).
토끼의 면역화
항원 최종 용량 및 주사 부피에 따라 적절한 농도 및 희석 단계를 이용하여, 사전 노출된 토끼에서 시험하기 위한 백신 제형을 제조하기 위해 상기 기재된 것과 동일한 베드측 혼합 접근법을 이용하였다.
사전 노출된 토끼 (12-14 주령의 수컷)에게 28 일 간격으로 제1일 및 제29일에 IM 경로에 의해 제형 버퍼 단독 (대조군 그룹) 또는 6가지의 시험한 백신 제형 중 하나의 2회 용량을 제공하였다. 혈액 샘플을 제1 주사 이전에 (제0일), 제1 주사 이후 1 주, 2 및 4 주째에 (1wp1, 2wp1, 4wp1), 및 제2 주사 이후 2 및 5 주째에 (2wp2, 5wp2) 취하였다.
백신-특이적 IgG의 평가
토끼에서 백신-특이적 IgG를 결정하기 위해 이용된 검정은 상기 기재된 루미넥스 5-플렉스였다. 토끼 검정을 96 웰 포맷으로 개발하였다.
5가지 모든 항원에 대한 과다면역 1가 토끼 폴리클로날 혈청을 풀링함으로써 5가 표준 혈청을 제조하였다. 모든 항원의 경우 50000 RLU/ml의 임의 역가를 5가 표준에 대해 배정하였다.
검정을 상기 보고된 기준에 따라 설정하였다. 검정간 재현성을 결정하였다 (%CV <15%). 선형성 평가는 R2 값 > 0,9를 수득하였다. LOQ 및 LOQ는 하기에 보고된다.
Figure pct00008
샘플 시험의 경우, 8가지 일련의 3배 희석액 (1:100에서 출발)을 자동으로 제조하였고, 적절한 양의 커플링된 미세구를 갖는 단일 96 웰 플레이트 상에 로딩하였다. 항원 특이적 항체가 항-토끼 Fab2 IgG에 의해 드러났다. 피코에리트린-라벨링된 이차 항체 및 MFI를 루미넥스 플렉스맵(Flexmap) 3D 판독기를 사용하여 측정하였다. 5PL 곡선으로부터 수득된 모든 유효한 개별 역가의 중앙값을 추정함으로써 각각의 샘플/항원의 IgG 역가를 결정하였다.
제1 백신접종 이후 4 주째 및 제2 백신접종 이후 2 주째에 항-ClfAmut, -Hlamut, -CP5, -CP8 및 -SpAmut에 대한 기하 평균 역가 (GMT)는 7가지 모든 그룹에서 백신접종 이전으로부터 통계적으로 유의한 증가를 나타내었다 (도 3). 제2 백신접종 이후 2 주째의 항체 역가는 제1 백신접종 이후에 비해 더 높았다. 항체 역가가 임의의 시점에서 버퍼 대조군 그룹과 유사한 Hlamut를 제외하고는, 제2 백신접종 이후 2 주째에, 백신접종한 모든 그룹은 모든 항원에 대해 버퍼 대조군 그룹과 비교하여 통계적으로 유의하게 더 높은 항체 반응을 나타내었다. 제2 백신접종 이후에, 아주반트화된 및 아주반트화되지 않은 것들 사이의 GMT는 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 3: 기능적 항체의 분석
면역화된 마우스 및 토끼로부터 수득한 혈청을 시험관내 야생형 Hla 및 ClfA 활성을 중화시킬 수 있는 기능적 항체의 존재에 대해 시험하였다.
Hla 활성의 억제 - 마우스
백신-특이적 항체가 Hla-유도된 용혈을 억제하는 능력을 시험관내 적혈구 (RBC)-기반 용혈 중화 검정으로 평가하였고, 이는 이전에 기재된 방법을 변형하여 수행되었다 (Bagnoli et al., PNAS 2015, 112: 3680-3685). 각각의 면역화 그룹에 대해 3회의 상이한 반복 실험 각각으로부터 10가지 혈청의 3개의 풀을 이용하여 알파 용혈소 중화 검정을 수행하였다. 중화 역가는 Hla의 독성을 50% 중화시키는 혈청의 희석으로서 정의되는 유효 희석 (ED50)을 계산함으로써 결정되었다.
각각의 시점에서 각각의 그룹에 대해, 중화 곡선의 비선형 회귀법에 의해 4-파라미터 로지스틱 (4PL)의 변곡점 파라미터의 추정에 의해 ED50을 평가하였다.
수득된 결과는 도 4a에 제시되어 있고, 다음을 나타내었다:
아주반트의 부재 하에 및 0.1 μg 아주반트화된 그룹의 존재 하에서는 기능적 항체가 검출되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
1 또는 10 μg 용량의 아주반트 둘 다를 사용하여 2회 면역화한 후에 Hla 중화가 관찰되었다.
10 μg을 갖는 제형은 1 μg을 갖는 제형과 비교하여 통계적으로 유의한 더 높은 중화 역가를 유도하였다 (p ≤ 0.05 윌콕슨(Wilcoxon) 검정).
ClfA 활성의 억제 - 마우스
ClfA 활성을 억제할 수 있는 기능적 항체를 백신이 유도하였는지 여부를 평가하기 위해 ClfA 결합 억제 검정을 개발하였다. 검정은 ClfA와 피브리노겐의 결합을 억제하는 항체의 능력의 ELISA-기반 측정이다. 항체가 ClfA에 효율적으로 결합하는 경우, 피브리노겐과의 상호작용이 억제된다. 혈청 역가는 피브리노겐 결합의 50% 감소를 제공하는 혈청 희석의 역수 (ED50)로 정의된다. 4-파라미터 로지스틱 (4PL) 비선형 회귀법 모델이 억제 곡선의 곡선-핏팅 분석을 위해 이용되고, ED50은 4PL 변곡점의 추정에 의해 평가되었다.
ClfA 결합 검정을 나이브 마우스에서 백신 제형에 의해 유도된 혈청에 적용하였다.
하기 면역화 시점에 수집된 혈청을 분석하였다: 제1 면역화 이후 4 주째 (4wp1); 및 제2 면역화 이후 1-2-4-8-12-16 주째 (1wp2, 2wp2,…)
수득된 결과는 도 5a에 제시되어 있다.
각각의 그룹으로부터의 혈청을 풀링하고 (각각 10 마리의 마우스), 중화 역가 (ED50)를 상이한 시점에서 각각의 풀에 대해 측정하였다. 상이한 시점에서 각각의 그룹에 대해 3가지 독립적인 마우스 면역화 실험으로 분석을 수행하였다. 결과는 도 5a에 제시되어 있고, 각각의 점은 3회의 독립적인 실험의 중앙값을 나타내고; 막대의 상부 말단 및 하부 말단은 각각 최대값 및 최소값을 나타낸다.
수득된 결과는 다음을 나타낸다:
0.1 μg 용량에서 및 아주반트의 부재 하에서는 ClfA 중화가 측정되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
1 또는 10 μg으 아주반트 둘 다를 사용하여 ClfA 중화가 관찰되었다.
10 μg 용량을 갖는 제형 (ClfA 함량과 관련)은 1 μg을 갖는 제형과 비교하여 통계적으로 유의한 더 높은 중화 역가를 유도하였다 (p 값 윌콕슨 검정 ≤ 0.05)
10 μg 용량에서 AS01E는 1w 및 2wp2에서 알룸/TLR7을 능가하였다 (p 값 윌콕슨 검정 ≤ 0.05)
마우스 혈청에 대해 이전에 기재된 검정을 이용하여, 시험관내 야생형 Hla 및 ClfA 활성을 중화시킬 수 있는 기능적 항체의 존재에 대해 면역화된 토끼로부터 수득된 혈청을 시험하였다.
Hla 활성의 억제 - 토끼
토끼를 표 3에 보고된 바와 같이 시험하였다. 모든 동물을 제1 주사 이전에 (제0일), 제1 주사 이후 1 주, 2 및 4 주째에 (1wp1, 2wp1, 4wp1), 및 제2 주사 이후 2 및 5 주째에 (2wp2, 5wp2) 출혈시켰다. 중화 검정을 상기 기재된 상이한 시점에서 단일 샘플 혈청에 대해 수행하였다.
95% 신뢰 구간 (CI)을 비롯하여 각각의 시점에서 기하 평균 역가를 기술적으로 요약하였다. GMT 및 95% CI는 스튜던트(Student) t-분포를 기반으로 하여 로그-변환된 역가의 평균에 대해 계산된 신뢰 한계의 역변환에 의해 계산되었다 (도 4b). 점선은 각각의 토끼 혈청의 측정에 대해 정립된 최소 요구 희석을 나타낸다.
역가 vs . 면역 이전:
각각의 백신접종 이후 시점에서 백신접종 이전으로부터 기하 평균 배수 증가를 로그-변환된 역가를 기반으로 하여 계산하였다. 스튜던트 대응표본 t 검정을 이용하여 로그-변환 이전 및 이후 역가의 차이를 분석하였다.
2wp1에서 단백질 함량 ≥10 ug을 갖는 모든 그룹은 면역 이전과 비교하여 더 높은 역가를 유도한다 (모든 p 값 < 0.017)
2wp2에서 모든 면역화된 그룹은 면역 이전과 비교하여 더 높은 역가를 유도한다 (모든 p 값 < 0.005)
역가 vs . 버퍼 그룹:
각각의 시점에서 면역화된 그룹과 버퍼 사이의 쌍별 비교를 웰치(Welch) 스튜던트 t-검정을 이용하여 수행하였다.
2wp1에서 아주반트화된 50 ug 용량만이 버퍼 그룹과 비교하여 더 높은 역가를 유도한다 (모든 p 값 < 0.003)
2wp2에서 아주반트화되지 않은 1 ug 용량을 제외한 모든 면역화된 그룹은 버퍼와 비교하여 더 높은 역가를 유도한다 (모든 p 값 < 0.013)
제1 주사 이후 vs . 제2 주사 이후:
50 μg, 10 μg+AS01E, 50 μg+AS01E에서 2wp1 및 2wp2 사이에서 관찰된 유의한 차이 (p 값 웰치 스튜던트 t-검정 <0.025).
ClfA 활성의 억제 - 토끼
ClfA 결합 억제 검정을 사전 노출된 토끼에서 백신 제형에 의해 유도된 혈청에 적용하였다. 억제 곡선의 비선형 회귀법에 의해 4-파라미터 로지스틱 (4PL)의 변곡점 파라미터의 추정에 의해 역가를 결정하였다.
하기 면역화 시점에서 혈청을 분석하였다: 면역화 이전, 제1 면역화 이후 4 주째 (4wp1), 제2 면역화 이후 2 주째 (2wp2).
각각의 그룹 (각각 12 마리의 토끼)으로부터 혈청을 수집하였고, 중화 역가 (ED50)를 상이한 시점에서 각각의 개별 토끼에 대해 측정하였다.
95% 신뢰 구간 (CI)을 비롯하여 각각의 시점에서 기하 평균 역가를 기술적으로 요약하였다. GMT 및 95% CI는 스튜던트 t-분포를 기반으로 하여 로그-변환된 역가의 평균에 대해 계산된 신뢰 한계의 역변환에 의해 계산되었다 (도 5b).
토끼 혈청에 의해 수득된 중화 결과는 도 5b에 제시되어 있고, 다음을 나타내었다:
면역 이전, 4wp1 및 버퍼 그룹 혈청에서 항-ClfA 기능적 활성 없음.
ClfA 중화 활성을 유도하기 위해 2회 용량이 필요하다.
아주반트를 갖는 10ug 용량 뿐만 아니라 아주반트를 갖지 않는 또는 갖는 50ug 용량을 수행한다.
전반적인 중화 역가는 마우스 혈청에서 관찰된 것에 비해 훨씬 낮다.
실시예 4: 백신접종된 마우스에서 백신 단백질에 대한 CD4 T-세포 반응
SA에 대한 숙주 면역 반응을 촉발시키는데 있어서 병원체-특이적 CD4+ T 세포의 잠재적인 역할은 잘 기재되어 있다. 따라서, 알룸/TLR7 또는 AS01E에 의해 아주반트화된 백신이 마우스에서 T 세포 반응을 유도하는 능력을 또한 시험하였다.
특히 연구 목적은 다음과 같다:
백신에 의해 마우스의 면역화가 백신 백신 단백질에 대한 T-세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 참고한다 (규모).
반응의 Th1, Th2 또는 Th17 양극화를 연구한다 (질).
백신 제형에서 아주반트의 포함이 T 세포 반응의 규모를 개선시키고/거나 질에 영향을 미치는지 여부를 평가한다.
T-세포 반응의 규모 및 질에 대해 AS01 및 알룸/TLR7 아주반트를 비교한다.
이 목적을 위해, 5 주령의 BALB/c 암컷 마우스에게 IM 경로에 의해 제1일 및 제29일에 2회 면역화 (각각의 뒷다리 사두근에서 50 μl)를 제공하였다. 10 μg 또는 1 μg (단백질-기반)의 각각의 성분으로 이루어진 제형, 백신-10 및 백신-1의 2회 용량을 단독으로 또는 알룸/TLR7 또는 AS01E 아주반트와 함께 제공하였다. 대조군 그룹에게 PBS, 알룸/TLR7 또는 AS01E 단독을 주사하였다. 실험 변동성을 평가하기 위해 실험을 3회 반복하였다. 3회 실험에서 사용된 마우스의 총 수에 대한 연구의 개요는 표 4에 제시되어 있다.
표 4: 면역화된 마우스에서 T 세포 반응의 결정에 대한 연구 설계
Figure pct00009
백신-특이적 CD4 T-세포 반응의 유도를 제2 면역화 이후 12 일째에 (d12p2) 단일 마우스로부터 단리된 비장세포의 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 평가한 다음, 시험관 내에서 항-CD28 및 항-CD49d mAb (각각 2 μg/ml) 단독으로 또는 각각의 백신 단백질 (Hlamut 및 ClfAmut, 10 μg/ml; SpAmut, 1 μg/ml)과 함께 37℃에서 16 시간 동안 처리하였다. 브레펠딘 A, 5 μg/ml를 인큐베이션 마지막 4 시간 동안 첨가하였다. 이어서, 세포를 라이브/데드 니어이어(Live/Dead NearIr) (인비트로겐(Invitrogen))로 염색하고, 고정시키고, 시토픽스/시토펌(Cytofix/Cytoperm) (BD)으로 투과화시키고, 투과/세척 버퍼 (BD)로 세척하고, 항-CD16/CD32 Fc 블록 (BD)과 함께 20 분 동안 RT에서 인큐베이션하고, 하기 mAbs 항: CD3-BV605, CD4-BV510, CD8-PE-CF594, CD44-V450, IFNγ-BV785, IL-2-PE Cy5, TNF-AF488, IL-17A-PE Cy7, IL-4-PerCP eFluor710, 및 IL-13-PerCP eFluor710으로 20 분 동안 RT에서 염색하고, 투과/세척 버퍼로 2회 세척하고, PBS에서 현탁시켰다.
LSRII 유세포 분석기 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 상에서 샘플을 획득하였고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리스타(TreeStar))를 이용하여 CD4 T-세포 반응을 분석하였다.
IL-2, TNF, IL-4/IL-13, IFN-γ 또는 IL-17A를 생성하는 CD4+CD44high T 세포를 게이팅 전력에 따라 확인하였다.
백신 단백질에 의한 시험관내 자극에 대한 반응으로 분석된 시토카인 중 적어도 하나를 생성하는 CD4+CD44high T 세포 (CD4+CD44high T 세포 ≥ 1 시토카인+)의 빈도 (%)를 측정하여 T 세포 반응의 규모를 계산하였다.
IFN-γ를 생성하지만 IL-4/IL-13을 생성하지 않는 (≥ IFN-γ+, Th1), IL-4/IL-13을 생성하지만 IFN-γ를 생성하지 않는 (≥ IL-4/IL-13+, Th2) 또는 적어도 IL-17A를 생성하는 (≥ IL-17A+, Th17) CD4+CD44high T 세포의 빈도 (%)를 측정하여 CD4 T 세포 반응의 질 (Th1, Th2 또는 Th17 양극화)을 평가하였다.
불리언(Boolean) 게이트 분석을 적용하였고, 배지-처리된 세포의 반응을 자극된 세포의 것으로부터 차감하였다.
결과의 분석을 위해, 고정된 효과로서 그룹 (9개 그룹), 실험 (3회 실험) 및 상호작용 그룹*실험을 포함하고 이종 분산 모델을 사용하여 이원 ANOVA를 log10 CD4+CD44high 백분율에 핏팅하였다 (그룹간에는 동일한 분산이 가정되지 않았음). 이 모델을 이용하여 그룹 기하 평균 및 그들의 95% CI, 뿐만 아니라 기하 평균 비 및 그들의 95% CI를 추정하였다.
그들의 95% CI가 1을 포함하지 않은 경우에는, 2배 초과의 기하 평균 비가 유의한 차이로 고려되었다 (p < 0.05).
수득된 결과는 도 2에 도시되며, 통계적으로 유의한 차이가 표시된다. 이들은 다음과 같이 요약될 수 있다:
백신 제형에서 아주반트의 포함은 대조군 그룹과 비교하여 백신-특이적 T 세포의 유의하게 더 높은 빈도를 수득하기 위해 필요하였다.
AS01은 각각의 단백질 항원을 갖는 알룸/TLR7을 능가하였다.
AS01에 의해 아주반트화된 백신만이 각각의 항원에 대해 특이적인 IFN-γ를 생성하는 CD4+ T-세포 (Th1 양극화)를 유도한 반면에, 알룸/TLR7에 의해 아주반트화된 백신은 유의하게 더 낮은 빈도로 SpAmut-특이적 Th1만을 유도하였다.
Th2 및 Th17의 매우 낮은 빈도는 AS01 아주반트화된 백신에서만 관찰되었다.
1 또는 10 μg의 아주반트화되지 않은 백신에 의한 면역화 이후에 T-세포 반응의 규모 및 질에서 큰 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 5: 동물 모델: 피부 감염 모델에서의 보호
생체 내에서 에스. 아우레우스 감염에 대해 보호하는 것에 대한 5Ag/AS01E 백신 (AS01E에 의해 아주반트화된 SpAmut, ClfAmut-CP8 생체접합체 및 Hlamut - CP5 생체접합체를 포함함)의 효능을 평가하기 위해 에스. 아우레우스 감염의 마우스 모델에서 실험을 수행하였다. 또한, 실험은 5Ag/AS01E 백신과 SpA가 결여된 4Ag/AS01E 백신을 비교하였고, 5Ag 백신에서 아주반트 AS01E의 효과를 수산화알루미늄 (Al(OH)3)으로 아주반트화된 5Ag 백신과 비교하였다. 사용된 마우스 모델은 피부 감염 모델 및 신장 농양 모델이었다.
연구 설계 및 프로토콜
5-주령의 암컷 CD1 마우스를 사용하였다.
각각의 모델에 대해 3회 실험을 순차적으로 수행하였다. 총 6회의 실험, 농양 모델에서 3회 동일한 연구 (Sa-5Ag-7, Sa-5Ag-8, Sa-5Ag-9) 및 피부 모델에서 3회 (Sa-5Ag-10, Sa-5Ag-11, Sa-5Ag-12)를 수행하였다. 피부 모델에서, 각각의 그룹을 10 마리의 마우스와 비교하여, 그룹당 총 30 마리의 마우스를 각각의 모델에서 시험하였다.
마우스에게 상이한 백신 제형 또는 PBS 중 하나의 2회 주사를 1 개월 간격으로 (제0일 및 제30일) 근육내로 (IM, 각각의 발에 30 μl) 제공하였다.
마지막 주사후 3 주째에 (제51일) 마우스를 피하 (SC, 피부 모델) 감염 경로를 이용하여 USA300 박테리아의 적절한 아치사 용량으로 감염시켰다. 50 μl의 SA USA 300 (이론적 3X107 CFU/마우스)을 접종하였다.
피부 모델에서, 관련 병변 영역을 감염후 5 일째에 측정한 후, 감염후 7 일째에 수집하였고, 균질화하고, CFU 값을 결정하였다.
표 5 에스. 아우레우스 균주 USA 300에 의한 피부 모델의 연구 설계
Figure pct00010
IM: 근육내; SC: 피하; AS01E는 2.5 μg/용량의 MPL 및 2.5 μg/용량의 QS21을 함유한다; Al(OH)3: 수산화알루미늄. * 단백질 기준.
표 6: 피부 모델의 처리 스케쥴
Figure pct00011
물질 및 방법
-80℃에서 보관하기 위한 박테리아 분취량 제조
20 ml의 신선한 트립신 처리 소이 브로쓰 (TSB) (사용하기 전에 37℃에서 밤새 또는 적어도 1 시간 동안 예열함)를 50 ml의 일회용 튜브에서 0.3 ml의 해동된 박테리아 (올드 스톡)와 혼합하였다. 초기 OD600nm는 0.03이었고, 박테리아를 OD600nm = 0.55까지 성장시켰다. 2 ml의 이 박테리아 현탁액을 냉동 바이알에 분취하고, -80℃에서 보관하였다.
성장 조건
상기 기재된 바와 같이 제조된 -80℃ 냉동기로부터의 박테리아 (에스. 아우레우스 USA300)의 스톡을 37℃의 수조에서 10 분 동안 해동시켰다. 20 ml의 신선한 트립신 처리 소이 브로쓰 (TSB) (사용하기 전에 37℃에서 밤새 또는 적어도 1 시간 동안 예열함)를 0.3 ml의 해동된 박테리아와 혼합하였다. 초기 OD600nm은 0.03이었고, 박테리아를 50 ml의 일회용 튜브에서 성장시켰다. 박테리아를 150rpm에서 진탕하면서 약 2.0 시간 동안 37℃에서 최종 OD600nm가 0,6이 될 때까지 인큐베이션한 다음, 4500 rpm에서 10 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 동일한 부피의 PBS 중에 재현탁시키고, 4500 rpm에서 10 분 동안 4℃에서 다시 원심분리하였다. 상청액을 다시 제거하고, 박테리아 펠렛을 2 ml의 PBS (대략 5x109cfu/ml) 중에 재현탁시켰다. 이 시점에서, 50μl 중에서 3x107 cfu/마우스의 박테리아 농도에 도달하도록 최종 희석액을 제조하였다. 100μl의 최종 박테리아 현탁액을 희석하고, 10-5 및 10-6 희석액을 트립신 처리 소이 아가 (TSA) 플레이트 상에 플레이팅하여, CFU를 카운팅하였다.
에스. 아우레우스에 의한 피하 감염의 생체내 모델
감염하기 전날, 마취된 마우스 (졸라제팜 + 틸레타미나 / 크실라진)를 전기 면도기 및 제모 크림을 사용하여 등 위치에서 제모하였다. 제모 크림을 37℃의 물로 부드럽게 제거하였다. 졸라제팜 + 틸레타미나 / 크실라진으로 마취된 마우스에서 상기 기재된 바와 같이 제조된 박테리아를 피하 접종하였다 (50 μl/동물). 질환의 임상적 증상에 대한 전용 스코어 시트를 사용하여 동물을 매일 추적하였다. 치수를 결정하기 위해 감염후 5 일째에 디지털 카메라를 사용하여 병변의 사진을 찍었다. 감염후 7 일째에, 마우스를 희생시키고, 병변을 가진 피부를 원형 메스 (8mm)를 사용하여 제거하였고; 더 큰 병변의 경우에는 가위를 사용하여 전체 병변이 회수되도록 하였다. 제거된 피부를 CFU 카운트를 위해 균질화시켰다. 10-8까지 10배수 희석액을 제조하였고, 10 μl 스팟 (이벌식)을 TSA 플레이트 상에 플레이팅하였다.
모델의 판독
ㆍ 제5일에 피부 병변 영역: 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어에 의해 측정되며 mm2로 표현됨.
ㆍ 감염후 매일 등록된 임상 스코어.
ㆍ 감염후 7 일째에 CFU 카운트 (CFU/샘플로 표현됨).
결과
5Ag+AS01E 백신은 피부 병변을 예방하고 CFU 카운트를 감소시키는데 효과적이었다.
피부 감염후 5 일째에 5Ag+AS01E로 백신접종된 마우스는 모두 피부 병변을 나타내지 않았다. 5Ag+Al(OH)3으로 백신접종된 마우스의 17% (5/30)가 피부 병변을 나타낸 반면에, 각각 4Ag+AS01E 및 PBS로 백신접종된 마우스의 60% (18/30) 및 100% (30/30)가 피부 병변을 나타내었다. 결과는 표 7-9에 제시되어 있다.
SpA 항원을 갖지 않는 SA 백신 제형 (Sa-4Ag+AS01E)에서 감염후 7 일째의 CFU GM은 SpA를 갖는 Sa 백신 제형 (Sa-5Ag+AS01E)에 비해 거의 3배 (2.84배) 더 높았고, 상기 차이는 통계적으로 유의하였다 (두 백신 그룹 사이의 CFU GM 백신 그룹 비의 95% CI는 값 1을 포함하지 않았음) (표 7 및 8).
AS01E 또는 Al(OH)3으로 아주반트화된 2가지 Sa-5Ag 백신 제형 사이에는 피부에서 생존가능한 박테리아의 수준에서 차이가 있었지만, 상기 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 아주반트로서 AS01E를 갖는 백신 Sa-5Ag 백신 제형 (Sa-5Ag+AS01E)에 비해 아주반트로서 Al(OH)3을 갖는 Sa-5Ag 백신 제형 [Sa-5Ag+Al(OH)3]에서 CFU GM이 1.6배 더 높았고, CFU GM 백신 그룹 비의 95% CI는 값 1을 포함하였다 (표 7 및 8).
PBS 단독 그룹에서 감염후 7 일째에 피부에서 생존가능한 박테리아의 수준은 평가된 임의의 백신 제형에서 관찰된 수준에 비해 유의하게 더 높았다. PBS 그룹에서 CFU GM은 백신 제형에서 관찰된 CFU GM에 비해 40.32 내지 114.48배 더 높았다. (표 7 및 8).
2-샘플 중앙값 검정을 이용하여 수행된, 두 그룹의 중앙값의 탐구적 쌍별 비교는 SpA를 갖는 및 갖지 않는 백신 제형 사이에서 (p<0.0001) 및 AS01E 및 Al(OH)3을 갖는 Sa-5Ag 백신 제형 사이에서 (p=0.0206) 유의한 차이를 나타내었다.
표 7 피부 모델 - 에스. 아우레우스 균주 USA 300에 의한 감염후 4 일째에 CFU 기하 평균 및 95% CI
Figure pct00012
표 8 피부 모델 - 에스. 아우레우스 균주 USA 300에 의한 감염후 4 일째에 CFU GM 백신 그룹 비 및 95% CI
Figure pct00013
* GM 비의 95% CI가 값 1 (즉, 동일한 GM)을 포함하지 않을 때, 상기 차이는 통계적으로 유의하다. 특히, 두 그룹 사이의 GM 비의 95% CI-하한이 >1일 때, 제1 성분은 비교의 제2 성분에 비해 통계적으로 유의하게 더 높은 것으로 고려된다. 그 반대로, 두 그룹 사이의 GM 비의 95% CI-상한이 <1일 때, 제1 성분은 비교의 제2 성분에 비해 통계적으로 유의하게 더 낮은 것으로 고려된다. 기호 ν는 통계적으로 유의한 비교를 나타낸다.
표 9 피부 모델 - 그룹에 의한 병변 영역의 평균, 중앙값, 최소, 최대 *
Figure pct00014
* 분석의 목적을 위해 병변 영역 없음은 0.1로 설정되었다.
박테리아가 피하 농양에도 존재하기 때문에, CFU는 임의의 피부 병변을 나타내지 않는 마우스에서도 측정될 수 있었다. 마우스의 하위 집합이 병변을 나타내지 않고 그룹에서 나머지 마우스가 병변을 나타내는 두가지 백신 제형에서 (즉, 그룹 5Ag+Al(OH)3 및 4Ag+AS01E), 피부에서 평균 및 중앙값 CFU 카운트는 병변을 가진 마우스에 비해 병변 영역을 갖지 않은 마우스에서 더 낮았다. 각각의 백신 그룹의 경우, 병변 영역의 존재 또는 부재에 의한 CFU 카운트의 기술 통계 (평균, 중앙값, 최소, 최대)가 표 10에 제시되어 있다.
표 10 피부 모델 - CFU 카운트의 평균, 중앙값, 최소, 최대
Figure pct00015
실시예 6: 동물 모델: 신장 농양 모델에서의 보호
상기 실시예 5에 기재된 바와 같이, 생체내 에스. 아우레우스 감염에 대한 보호에 있어서 5Ag/AS01E 백신의 효능을 평가하기 위해, 전신 감염의 모델로서 신장 농양 마우스 모델에서 실험을 수행하였다.
프로토콜 및 연구 설계
5-주령의 암컷 CD1 마우스를 사용하였다.
각각의 모델에 대해 3회 실험을 순차적으로 수행하였다. 총 6회의 실험, 농양 모델에서 3회 동일한 연구 (Sa-5Ag-7, Sa-5Ag-8, Sa-5Ag-9)를 수행하였다. 각각의 그룹을 12 마리의 마우스와 비교하여, 그룹당 총 36 마리의 마우스를 각각의 모델에서 시험하였다.
마우스에게 상이한 백신 제형 또는 PBS 중 하나의 2회 주사를 1 개월 간격으로 (제0일 및 제30일) 근육내로 (IM, 각각의 발에 30 μl) 제공하였다.
마지막 주사후 3 주째에 (제51일) 마우스를 정맥내 (IV, 신장 농양 모델) 감염 경로를 이용하여 USA300 박테리아의 적절한 아치사 용량으로 감염시켰다.
100 μl의 SA USA 300 (이론적 1X107 CFU/마우스) 균주를 접종하였다.
감염된 마우스를 감염후 4 일째에 희생시키고, 신장을 수집하고, 균질화하고, CFU 값을 카운팅하였다.
표 11 에스. 아우레우스 균주 USA 300에 의한 농양 모델의 연구 설계
Figure pct00016
IM: 근육내; IV: 정맥내; AS01E는 2.5 μg/용량의 MPL 및 2.5 μg/용량의 QS21을 함유한다; Al(OH)3: 수산화알루미늄
* 단백질 기준.
표 12: 농양 모델의 처리 스케쥴
Figure pct00017
물질 및 방법
-80℃에서 보관하기 위한 박테리아 분취량 제조
20 ml의 신선한 트립신 처리 소이 브로쓰 (TSB) (사용하기 전에 37℃에서 밤새 또는 적어도 1 시간 동안 예열함)를 50 ml의 일회용 튜브에서 0.3 ml의 해동된 박테리아 (올드 스톡)와 혼합하였다. 초기 OD600nm는 0.03이었고, 박테리아를 OD600nm = 0.55까지 성장시켰다. 2 ml의 이 박테리아 현탁액을 냉동 바이알에 분취하고, -80℃에서 보관하였다.
성장 조건
상기 기재된 바와 같이 제조된 -80℃ 냉동기로부터의 박테리아 (에스. 아우레우스 USA300)의 스톡을 37℃의 수조에서 10 분 동안 해동시켰다. 20 ml의 신선한 트립신 처리 소이 브로쓰 (TSB) (사용하기 전에 37℃에서 밤새 또는 적어도 1 시간 동안 예열함)를 0.3 ml의 해동된 박테리아와 혼합하였다. 초기 OD600nm은 0.03이었고, 박테리아를 50 ml의 일회용 튜브에서 성장시켰다. 박테리아를 150rpm에서 진탕하면서 약 2.0 시간 동안 37℃에서 최종 OD600nm가 0,6에 도달할 때까지 인큐베이션하였다. 박테리아를 4500 rpm에서 10 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 동일한 부피의 PBS 중에 재현탁시키고, 4500 rpm에서 10 분 동안 4℃에서 다시 원심분리하였다. 상청액을 다시 제거하고, 박테리아 펠렛을 2 ml의 PBS (대략 5x109cfu/ml) 중에 재현탁시켰다. 이 시점에서, 100μl 중에서 1x107 cfu/마우스의 박테리아 농도에 도달하도록 최종 희석액을 제조하였다. 100μl의 최종 박테리아 현탁액을 희석하고, 10-5 및 10-6 희석액을 트립신 처리 소이 아가 (TSA) 플레이트 상에 플레이팅하여, CFU를 카운팅하였다.
에스. 아우레우스에 의한 피하 감염의 생체내 모델
꼬리 정맥을 팽창시키기 위해 적외선 램프를 사용하여 마우스를 따뜻하게 하였다. 상기 기재된 바와 같이 제조된 박테리아를 꼬리 정맥으로 정맥내로 접종하였다 (100 μl/동물). 질환의 임상적 증상에 대한 전용 스코어 시트를 사용하여 동물을 매일 추적하였다. 감염후 4 일째에, 마우스를 희생시키고, 신장을 회수하였다. 제거된 신장을 CFU 카운트를 위해 균질화시켰다 (2ml PBS). 10-8까지 10배수 희석액을 제조하였고, 10 μl 스팟 (이벌식)을 TSA 플레이트 상에 플레이팅하였다.
모델의 판독
ㆍ 감염후 매일 등록된 임상 스코어.
ㆍ 감염후 4 일째에 CFU 카운트 (CFU/샘플로 표현됨).
결과
5Ag+AS01E 백신은 대조군과 비교하여 박테리아 감염을 감소시키는데 매우 효과적이었다. SpA 항원이 없는 백신 제형 (Sa-4Ag+AS01E)에서, CFU 기하 평균 (GM)으로 측정되는, 감염후 4 일째에 수집된 신장에서 생존가능한 박테리아의 수준은 SpA가 있는 SA 백신 제형 (Sa-5Ag+AS01E)에 비해 6.6배 더 높았고, 상기 차이는 통계적으로 유의하였다. 아주반트로서 AS01E를 갖는 백신 Sa-5Ag 백신 제형 (Sa-5Ag+AS01E)에 비해 아주반트로서 Al(OH)3을 갖는 Sa-5Ag 백신 제형 [Sa-5Ag+Al(OH)3]에서 CFU GM이 거의 2배 (1.78배) 더 높았지만, 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. PBS 단독 그룹에서 감염후 4 일째에 신장에서 생존가능한 박테리아의 수준은 연구에서 평가된 임의의 GSK Sa 백신 제형에서 관찰된 수준에 비해 적어도 4배 더 높았다. 상기 결과는 표 13에 제시되어 있다.
표 13: 신장 농양 모델 - 에스. 아우레우스 균주 USA 300에 의한 감염후 4 일째에 CFU 기하 평균 및 95% CI
Figure pct00018
* CFU GM은 조정되지 않은 GM이다.
서열 목록
서열식별번호: 1 - 야생형 ClfAN1N2N3
Figure pct00019
서열식별번호: 2 - 야생형 ClfAN2N3
Figure pct00020
서열식별번호: 3 - 성숙한 야생형 Hla
Figure pct00021
서열식별번호: 4 - 야생형 SpA. 밑줄은 각각 Fcγ 및 VH3 결합을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 QQ 및 DD 잔기이다.
Figure pct00022
서열식별번호: 5 - ClfA N2N3 P116S/Y118A
Figure pct00023
서열식별번호: 6 - 잔기 I337을 치환하는 PglB 컨센서스 서열 (KDQNATK, 밑줄)을 갖는 ClfA N2N3 P116S/Y118A
Figure pct00024
서열식별번호: 7 - 잔기 I337을 치환하는 PglB 컨센서스 서열 (KDQNATK, 밑줄) 및 N-말단 S를 갖는 ClfA N2N3 P116S/Y118A
Figure pct00025
서열식별번호: 8 - 성숙한 Hla H35L
Figure pct00026
서열식별번호: 9 - 잔기 K131을 치환하는 PglB 컨센서스 서열 (KDQNRTK)을 갖는 성숙한 Hla H35L
Figure pct00027
서열식별번호: 10 - 성숙한 Hla H35L/H48C/G122C
Figure pct00028
서열식별번호: 11 - 잔기 K131을 치환하는 PglB 컨센서스 서열 (KDQNRTK)을 갖는 성숙한 Hla H35L/H48C/G122C
Figure pct00029
서열식별번호: 12 - N-말단 S, C-말단 GSHRHR, 및 잔기 K131을 치환하는 KDQNRTK를 갖는 Hla H35L/H48C/G122C
Figure pct00030
서열식별번호: 13 - SpA IgG 결합 부분 (도메인 E, D, A, B, C). 밑줄은 각각 Fcγ 및 VH3 결합을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 QQ 및 DD 잔기이다.
Figure pct00031
서열식별번호: 14 - SpA E 도메인. 밑줄은 각각 Fcγ 및 VH3 결합을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 QQ 및 DD 잔기이다.
Figure pct00032
서열식별번호: 15 - SpA D 도메인. 밑줄은 각각 Fcγ 및 VH3 결합을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 QQ 및 DD 잔기이다.
Figure pct00033
서열식별번호: 16 - SpA A 도메인. 밑줄은 각각 Fcγ 및 VH3 결합을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 QQ 및 DD 잔기이다
Figure pct00034
서열식별번호: 17 - SpA B 도메인. 밑줄은 각각 Fcγ 및 VH3 결합을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 QQ 및 DD 잔기이다.
Figure pct00035
서열식별번호: 18 - SpA C 도메인. 밑줄은 각각 Fcγ 및 VH3 결합을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 QQ 및 DD 잔기이다.
Figure pct00036
서열식별번호: 19 - 위치 7 및 8에서 QQ-KK 치환 및 위치 34 및 35에서 DD-AA 치환을 갖는 SpA E 도메인
Figure pct00037
서열식별번호: 20 - 위치 12 및 13에서 QQ-KK 치환 및 위치 39 및 40에서 DD-AA 치환을 갖는 SpA D 도메인
Figure pct00038
서열식별번호: 21 - 위치 9 및 10에서 QQ-KK 치환 및 위치 36 및 37에서 DD-AA 치환을 갖는 SpA A 도메인
Figure pct00039
서열식별번호: 22 - 위치 9 및 10에서 QQ-KK 치환 및 위치 36 및 37에서 DD-AA 치환을 갖는 SpA B 도메인
Figure pct00040
서열식별번호: 23 - 위치 9 및 10에서 QQ-KK 치환 및 위치 36 및 37에서 DD-AA 치환을 갖는 SpA C 도메인
Figure pct00041
서열식별번호: 24 - 위치 4 및 5에서 QQ-KR 치환, 위치 12 및 13에서 QQ-KK 치환 및 위치 39 및 40에서 DD-AA 치환을 갖는 SpA D 도메인
Figure pct00042
서열식별번호: 25 - 위치 4 및 5에서 QQ-KR 치환을 갖는 SpA D 도메인
Figure pct00043
서열식별번호: 26 - 서열식별번호: 19-23의 치환 (SpAKKAA)을 갖는 SpA IgG 결합 부분 (EDABC 도메인)
Figure pct00044
서열식별번호: 27 - 서열식별번호: 19 및 21-24의 치환 (SpAKKAA-KR)을 갖는 SpA IgG 결합 부분 (EDABC 도메인)
Figure pct00045
서열식별번호: 28 - PglB 컨센서스 서열
Figure pct00046
서열식별번호: 29 - PglB 컨센서스 서열
Figure pct00047
서열식별번호: 30 - PglB 컨센서스 서열
Figure pct00048
서열식별번호: 1 - PglB 컨센서스 서열
Figure pct00049
서열식별번호: 32 - I337에서 (밑줄), N-말단 S, C-말단 GS를 갖는 ClfAN2N3P116S/Y118A
Figure pct00050
SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Smith Kline Biologicals SA <120> IMMUNOGENIC COMPOSITION <130> VB66439 <150> 1802339.0 <151> 2018-02-13 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 522 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Ala Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ser Asn Glu Ser 1 5 10 15 Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala Ala Pro Lys Thr Asp Asp 20 25 30 Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser Asn Thr Asn Asn Gly Glu 35 40 45 Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln Glu Thr Thr Gln Ser Ser 50 55 60 Ser Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr Pro Val Thr Gly Glu Ala Thr 65 70 75 80 Thr Thr Thr Thr Asn Gln Ala Asn Thr Pro Ala Thr Thr Gln Ser Ser 85 90 95 Asn Thr Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gln Thr Ser Asn Glu Thr Thr 100 105 110 Phe Asn Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val Asn Ser Pro Gln Asn Ser 115 120 125 Thr Asn Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gln Asp Thr Ser Thr Glu Ala 130 135 140 Thr Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gln Ser Thr Asp Ala Ser Asn 145 150 155 160 Lys Asp Val Val Asn Gln Ala Val Asn Thr Ser Ala Pro Arg Met Arg 165 170 175 Ala Phe Ser Leu Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gly Thr 180 185 190 Asp Ile Thr Asn Gln Leu Thr Asn Val Thr Val Gly Ile Asp Ser Gly 195 200 205 Thr Thr Val Tyr Pro His Gln Ala Gly Tyr Val Lys Leu Asn Tyr Gly 210 215 220 Phe Ser Val Pro Asn Ser Ala Val Lys Gly Asp Thr Phe Lys Ile Thr 225 230 235 240 Val Pro Lys Glu Leu Asn Leu Asn Gly Val Thr Ser Thr Ala Lys Val 245 250 255 Pro Pro Ile Met Ala Gly Asp Gln Val Leu Ala Asn Gly Val Ile Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Val Ile Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asn Thr Lys 275 280 285 Asp Asp Val Lys Ala Thr Leu Thr Met Pro Ala Tyr Ile Asp Pro Glu 290 295 300 Asn Val Lys Lys Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ser 305 310 315 320 Thr Thr Ala Asn Lys Thr Val Leu Val Asp Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys 325 330 335 Phe Tyr Asn Leu Ser Ile Lys Gly Thr Ile Asp Gln Ile Asp Lys Thr 340 345 350 Asn Asn Thr Tyr Arg Gln Thr Ile Tyr Val Asn Pro Ser Gly Asp Asn 355 360 365 Val Ile Ala Pro Val 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Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 15 <211> 61 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 15 Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu 35 40 45 Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 16 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 16 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 17 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 17 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 18 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 18 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 19 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA E domain with QQ-KK substitutions at positions 7 and 8 and DD-AA substitutions at positions 34 and 35 <400> 19 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 20 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA D domain with QQ-KK substitutions?t positions 12 and 13 and DD-AA substitutions at?ositions 39?nd 40 <400> 20 Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu 35 40 45 Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 21 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA A domain with QQ-KK substitutions?t positions 9 and108 and DD-AA substitutions at?ositions 36?nd 37 <400> 21 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 22 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA B domain with QQ-KK substitutions?t positions 9 and 10 and DD-AA substitutions at?ositions 36?nd 37 <400> 22 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 23 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA C domain with QQ-KK substitutions?t positions 9 and 10 and DD-AA substitutions at?ositions 36?nd 37 <400> 23 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 24 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA D domain with QQ-KR substitutions at positions 4 and 5, QQ-KK substitutions?t positions 12 and 13 and DD-AA substitutions at?ositions 39?nd 40 <400> 24 Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu 35 40 45 Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 25 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA D domain with QQ-KR substitutions at positions 4 and 5 <400> 25 Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu 35 40 45 Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 26 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA IgG binding portion with the substitutions of SEQ ID NOs 19-23 <400> 26 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 27 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA IgG binding portion with the substitutions of SEQ ID NOs 19 and 21 24 <400> 27 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PglB consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid except proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid except proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 28 Xaa Xaa Asn Xaa Xaa 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PglB consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid except proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid except proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 29 Lys Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Lys 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PglB consensus sequence <400> 30 Lys Asp Gln Asn Arg Thr Lys 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PglB consensus sequence <400> 31 Lys Asp Gln Asn Ala Thr Lys 1 5 <210> 32 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClfAN2N3P116S/Y118A at I337, N-terminal S, C-terminal GS <400> 32 Ser Val Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gly Thr Asp Ile Thr Asn Gln 1 5 10 15 Leu Thr Asn Val Thr Val Gly Ile Asp Ser Gly Thr Thr Val Tyr Pro 20 25 30 His Gln Ala Gly Tyr Val Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser Val Pro Asn 35 40 45 Ser Ala Val Lys Gly Asp Thr Phe Lys Ile Thr Val Pro Lys Glu Leu 50 55 60 Asn Leu Asn Gly Val Thr Ser Thr Ala Lys Val Pro Pro Ile Met Ala 65 70 75 80 Gly Asp Gln Val Leu Ala Asn Gly Val Ile Asp Ser Asp Gly Asn Val 85 90 95 Ile Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asn Thr Lys Asp Asp Val Lys Ala 100 105 110 Thr Leu Thr Met Ser Ala Ala Ile Asp Pro Glu Asn Val Lys Lys Thr 115 120 125 Gly Asn Val Thr Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr Thr Ala Asn Lys 130 135 140 Thr Val Leu Val Asp Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Tyr Asn Leu Ser 145 150 155 160 Ile Lys Gly Thr Ile Asp Gln Ile Asp Lys Thr Asn Asn Thr Tyr Arg 165 170 175 Gln Thr Ile Tyr Val Asn Pro Ser Gly Asp Asn Val Ile Ala Pro Val 180 185 190 Leu Thr Gly Asn Leu Lys Pro Asn Thr Asp Ser Asn Ala Leu Ile Asp 195 200 205 Gln Gln Asn Thr Ser Ile Lys Val Tyr Lys Val Asp Asn Ala Ala Asp 210 215 220 Leu Ser Glu Ser Tyr Phe Val Asn Pro Glu Asn Phe Glu Asp Val Thr 225 230 235 240 Asn Ser Val Asn Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gln Tyr Lys Val Glu 245 250 255 Phe Asn Thr Pro Asp Asp Gln Ile Thr Thr Pro Tyr Ile Val Val Val 260 265 270 Asn Gly His Ile Asp Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser 275 280 285 Thr Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Ile Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp 290 295 300 Asp Asn Glu Val Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Ile 305 310 315 320 Asp Lys Pro Val Val Pro Glu Gln Pro Asp Glu Pro Gly Glu Ile Glu 325 330 335 Pro Lys Asp Gln Asn Ala Thr Lys Pro Glu Asp Gly Ser 340 345

Claims (53)

  1. 하기를 포함하는 면역원성 조성물:
    a. ClfA 항원;
    b. Hla 항원;
    c. SpA 항원; 및
    d. 포도상구균 피막 폴리사카라이드.
  2. 제1항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 담체 단백질에 접합되는 것인 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 에스. 아우레우스(S. aureus) 혈청형 5 및/또는 유형 8 피막 폴리사카라이드인 면역원성 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피막 폴리사카라이드가 제1항의 항원 (a)-(c) 중 하나에 접합되는 것인 면역원성 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드 및 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 Hla 항원에 접합된 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드 및/또는 ClfA 항원에 접합된 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. ClfA 항원이 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ClfA 단백질, 또는 그의 면역원성 단편이고/거나;
    b. Hla 항원이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Hla 단백질, 또는 그의 면역원성 단편이고/거나;
    c. SpA 항원이 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 26과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 SpA 단백질, 또는 그의 면역원성 단편인
    면역원성 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ClfA 항원이 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 (또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열에서 동등한 위치)을 기준으로 하여 P116에서 S로의 아미노산 치환 및 Y118에서 A로의 아미노산 치환으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하며, 임의적으로 서열식별번호: 5-7 또는 32 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, ClfA 항원이 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 1개 이상의 PglB 컨센서스 서열(들)을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 면역원성 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 컨센서스 서열이 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 313-342 사이의 1개 이상의 아미노산에서 부가되었거나 또는 그를 치환하였으며, 임의적으로 위치 I337에서의 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산을 치환한 것인 면역원성 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, X가 Q (글루타민)이고, Z가 A (알라닌)인 (예를 들어 K-D-Q-N-A-T-K, 서열식별번호: 31) 면역원성 조성물.
  12. 제11항에 있어서, ClfA 항원이 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 32의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 면역원성 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Hla 항원이 서열식별번호: 3의 위치 H35에서의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 치환은 임의적으로 H에서 L로의 아미노산 치환인 면역원성 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Hla 항원이 D/E-X-N-Z-S/T (서열식별번호: 28) 및 K-D/E-X-N-Z-S/T-K (서열식별번호: 29)로부터 선택된 1개 이상의 PglB 컨센서스 서열(들)을 포함하며, 여기서 X 및 Z는 독립적으로 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 면역원성 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 컨센서스 서열이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열의 1개 이상의 아미노산에서 부가되었거나 또는 그를 치환한 것인 면역원성 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 컨센서스 서열이 서열식별번호: 3의 위치 K131에서의 또는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산을 치환한 것인 면역원성 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, X가 Q (글루타민)이고, Z가 R (아르기닌)인 (예를 들어 K-D-Q-N-R-T-K (서열식별번호: 30)) 면역원성 조성물.
  18. 제17항에 있어서, Hla 항원이 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 면역원성 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 항원이 (a) VH3과의 결합을 방해하거나 또는 감소시키는 도메인 E, D, A, B 또는 C의 VH3-결합 서브-도메인에서의 1개 이상의 아미노산 치환, 및 (b) IgG Fc와의 결합을 방해하거나 또는 감소시키는 도메인 E, D, A, B 또는 C의 IgG Fc 결합 서브-도메인에서의 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 항원이 (i) 서열식별번호: 14의 아미노산 위치 34 및 35에서의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 E; 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 39 및 40에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D; 서열식별번호: 16의 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 A; 서열식별번호: 17의 위치 아미노산 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 B, 및/또는 서열식별번호: 18의 위치 아미노산 위치 36 및 37에서의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 C를 포함하고/거나; (ii) 서열식별번호: 14의 아미노산 위치 7 및 8에서의 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 E; 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 12 및 13에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D; 서열식별번호: 16의 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 A; 서열식별번호: 17의 위치 아미노산 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 B, 및/또는 서열식별번호: 18의 위치 아미노산 위치 9 및 10에서의 또는 서열식별번호: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 C를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 글루타민에서 리신으로의 치환 및/또는 아스파르트산에서 알라닌으로의 치환인 면역원성 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 항원이 서열식별번호: 15의 아미노산 위치 4 및 5에서의 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열 내의 동등한 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 도메인 D를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 글루타민에서 리신 및/또는 글루타민에서 아르기닌으로의 치환, 예를 들어 QQ에서 KR로의 치환인 면역원성 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SpA 항원이 서열식별번호: 19-23, 26 또는 27의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 19-23, 26 또는 27과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 (i) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 ClfA 항원; (ii) 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 Hla 항원; (iii) 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 SpA 항원; (iii) 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드, 및 (iii) 에스. 아우레우스 혈청형 유형 8 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, ClfA 항원이 에스. 아우레우스 혈청형 유형 8 피막 폴리사카라이드에 접합되고, Hla 항원이 에스. 아우레우스 혈청형 5 피막 폴리사카라이드에 접합되는 것인 면역원성 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 ClfA-CP8 및 Hla-CP5 접합체가 생체접합체인 면역원성 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 아주반트를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 아주반트가 사포닌 및 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 아주반트가 리포솜 제형 중에 사포닌, 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 스테롤을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌이 퀼라자 사포나리아 몰리나의 껍질로부터 유래된 면역학적으로 활성인 사포닌 분획인 면역원성 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 사포닌이 QS21인 면역원성 조성물.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 리포폴리사카라이드가 지질 A 유도체인 면역원성 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 리포폴리사카라이드가 3D-MPL인 면역원성 조성물.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤이 콜레스테롤인 면역원성 조성물.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 인간 용량당 25 μg의 수준으로 QS21을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 인간 용량당 25 μg의 수준으로 3D-MPL을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  39. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 백신.
  40. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 백신.
  41. 제1항 내지 제27항 및 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 아주반트와 조합되어 투여되는 것인, 포도상구균 감염의 예방 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 면역원성 조성물 또는 백신.
  42. 제41항에 있어서, 면역원성 조성물이 대상체에게 투여하기 전에 아주반트와 혼합되는 것인 면역원성 조성물 또는 백신.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 아주반트가 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 면역원성 조성물 또는 백신.
  44. 제43항에 있어서, 아주반트가 인간 용량당 25 μg의 수준으로 3D-MPL 및 인간 용량당 25 μg의 수준으로 QS21을 포함하는 것인 면역원성 조성물 또는 백신.
  45. (i) 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제39항에 따른 백신을 포함하는 제1 용기; 및 (ii) 아주반트를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트.
  46. 제45항에 있어서, 아주반트가 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 키트.
  47. 제46항에 있어서, 아주반트가 인간 용량당 25 μg의 수준으로 3D-MPL 및 인간 용량당 25 μg의 수준으로 QS21을 포함하는 것인 키트.
  48. 포도상구균 감염의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 제39항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 포도상구균 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 대상체에게 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 아주반트가 면역원성 조성물과 동시에 투여되는 것인 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 아주반트가 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 방법.
  52. 포도상구균 감염의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 제40항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 포도상구균 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법.
  53. 항원, 및 임의적으로 아주반트를 제약상 허용가능한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하는 방법.
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