ES2855474T3 - Composiciones de liposomas que comprenden un adyuvante que activa o incrementa la actividad de TLR2 y usos del mismo - Google Patents

Composiciones de liposomas que comprenden un adyuvante que activa o incrementa la actividad de TLR2 y usos del mismo Download PDF

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Abstract

Una suspensión de liposomas sin agua que comprende: un adyuvante que activa o incrementa la actividad del receptor tipo toll 2 (TLR2) y liposomas que contienen un antígeno, reconstituidos en un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba; en la que el antígeno puede inducir una respuesta inmunitaria humoral; y en la que el adyuvante comprende dipalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAM2Cys) o tripalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAM3Cys).

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de liposomas que comprenden un adyuvante que activa o incrementa la actividad de TLR2 y usos del mismo
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente solicitud se refiere a composiciones de vacunas que potencian la producción de anticuerpos específicos de antígeno en sujetos inmunizados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las respuestas inmunitarias inducidas por la vacunación se pueden clasificar ampliamente en tipos humorales o celulares. Típicamente, se desea una respuesta humoral para proteger frente a invasores víricos o bacterianos, mientras que la inmunidad frente a células infectadas por virus y células cancerosas implica típicamente una respuesta mediada por células. La inmunidad humoral se caracteriza por altos niveles de producción de anticuerpos por los linfocitos B, mientras que la inmunidad celular se caracteriza por un incremento en la activación de linfocitos T CD8 citotóxicos.
Suzanne M. Bal et al., Vaccine, vol. 29, n.° 5, 1 de enero de 2011, páginas 1045-105, divulga la coencapsulación de ovoalbúmina y ligando TLR2 (PAM(3)CSK(4) (PAM) o CpG) en liposomas catiónicos.
M. Mansour et al., Clinical and Vaccine Immunology, vol. 14, n.° 10, 22 de agosto de 2007, páginas 1381-1383, divulga que la formulación de difteria, tétanos, tosferina acelular y virus de la poliomielitis inactivado en un adyuvante en emulsión de liposomas/aceite da como resultado una respuesta de anticuerpos en ratones frente a los componentes de la tosferina de la vacuna y es protectora frente a una exposición a bacterias.
Daftarian P. et al., Vaccine, vol. 24, n.° 24, 12 de junio de 2006, páginas 5235-5244, divulga una vacuna que comprende antígeno y adyuvante encapsulados en liposomas. Los adyuvantes son CpG o Pam3c. La suspensión resultante de liposomas se emulsionó en IFA o Montanide ISA51 como vehículo oleoso.
El documento WO 2009/146523 A1 divulga una composición sin agua que comprende un adyuvante que activa o incrementa la actividad del receptor tipo toll y liposomas que contienen un antígeno, reconstituida en un vehículo que comprende como fase continua una sustancia hidrófoba, en la que el antígeno puede inducir una respuesta inmunitaria humoral.
El documento WO 2007/041832 A1 divulga una composición de vacuna que comprende proteínas de fusión (epítopos CTL) con CpG o Pam3C encapsuladas en liposomas emulsionados, por ejemplo, en PBS/IFA o Montanide ISA 51. Fransen et al 2007 divulga la actividad adyuvante de un panel de diferentes agonistas del receptor tipo Toll (TLR). El tipo de inmunidad inducida por una vacuna depende en gran medida del tipo de adyuvante incluido en la vacuna. Se ha informado de que los adyuvantes a base de ácido palmítico, tales como dipalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAM2Cys) y tripalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAMaCys) y variantes de los mismos, potencian las respuestas humorales y celulares frente a una variedad de antígenos. Por motivos prácticos, la solubilidad de dichos adyuvantes se ha mejorado típicamente con la adición de residuos aminoacídicos no inmunogénicos hidrófilos (lisinas, por ejemplo). Dichos adyuvantes se han mezclado con antígeno, pero en muchos casos los adyuvantes basados en ácido palmítico se han unido de forma covalente a los antígenos antes de administrarse a un sujeto. Los adyuvantes de ácido palmítico también se han administrado conjuntamente con antígeno usando liposomas como vehículos. Los antígenos basados en proteínas y basados en carbohidratos se han combinado con adyuvantes de ácido palmítico para producir respuestas de anticuerpos y linfocitos T. El uso de adyuvantes de ácido palmítico para aplicaciones de cáncer está bien documentado, con actividad mediada principalmente por respuestas celulares.
Aunque es conocido que los derivados del ácido palmítico hacen proliferar los linfocitos B, inducen el cambio isotípico, inducen la diferenciación de los linfocitos B humanos a células plasmáticas secretoras de IgG e incrementan la expresión de varias moléculas coestimuladoras (MHC I, II, CD80, etc.), los informes de adyuvantes de ácido palmítico que inducen respuestas de anticuerpos han variado en la literatura desde que pueden potenciar las respuestas de anticuerpos hasta que no son en particular útiles para generar dichas respuestas.
Sigue existiendo la necesidad de desarrollar composiciones de vacuna para generar fuertes respuestas humorales frente a una variedad de antígenos. La presente invención proporciona composiciones de vacunas que contienen un adyuvante a base de lípidos y son en particular útiles para inducir un alto nivel de anticuerpos en sujetos inmunizados.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, se proporciona una suspensión de liposomas sin agua que comprende: liposomas; un antígeno que puede inducir una respuesta inmunitaria humoral; un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba; y un adyuvante que activa o incrementa la actividad del receptor tipo toll 2 (TLR2), por ejemplo, interactuando con un dímero TLR2 tal como TLR1/2 o TLR2/6. El adyuvante a base de lípidos comprende dipalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAM2Cys) o tripalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAMaCys).
En otro modo de realización de la suspensión como se describe en el presente documento, el adyuvante a base de lípidos es, o comprende: la lipoproteína diacilada sintética FSL-1 (Pam2CGDPKHPKSF), una lipoproteína sintética derivada de Mycoplasma salivarium o el lipopéptido activador de macrófagos (MALP-2) de Mycoplasma fermentans. En un modo de realización, la suspensión de la invención puede comprender un adyuvante como se describe en el presente documento en combinación con al menos otro adyuvante adecuado.
En otro modo de realización de la suspensión como se describe en el presente documento, el antígeno es un polipéptido o un carbohidrato.
En un modo de realización de la suspensión como se describe en el presente documento, el antígeno comprende un epítopo de linfocito B o una pluralidad de epítopos de linfocitos B.
En otro modo de realización de la suspensión como se describe en el presente documento, el antígeno es un antígeno tumoral unido a la superficie de la membrana; una toxina; un alérgeno tal como polen; o una proteína amiloide. En otro modo de realización de la suspensión como se describe en el presente documento, el liposoma comprende un fosfolípido o colesterol no esterificado.
En otro modo de realización, la suspensión como se describe en el presente documento puede inducir una respuesta inmunitaria humoral en un sujeto con una dosis única.
La presente invención en otro aspecto proporciona la suspensión mencionada anteriormente para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En un modo de realización de la invención, el sujeto al que se hace referencia en el presente documento es un mamífero.
En otro modo de realización de la invención, el sujeto al que se administra la suspensión es un ser humano.
También se divulga un kit útil para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno como se describe en el presente documento, o neutralizar una toxina, virus, bacteria o alérgeno, con un anticuerpo, en el que el kit comprende una suspensión de la invención e instrucciones para su uso.
También se divulga un procedimiento de preparación de una suspensión de la presente invención como se describe en el presente documento.
Otros aspectos y rasgos característicos de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la revisión de la siguiente descripción de modos de realización específicos de la invención junto con las figuras adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
En las figuras, que ilustran modos de realización de la invención solo a modo de ejemplo:
La figura 1 ilustra la respuesta inmunitaria humoral generada por una vacuna preparada de acuerdo con la invención ("vacuna A"). Se vacunaron dos grupos de ratones (n=8 o 9) como sigue: los ratones del grupo 1 se vacunaron con una dosis única de 1 microgramo de rHA y 1 microgramo de Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4 en una dosis de 50 microlitros formulada como una vacuna sin agua/ liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo (vacuna A). Los ratones del grupo 2 se trataron con 1 microgramo de rHA y 50 microgramos de alumbre por dosis de 50 microlitros de vacuna de alumbre de control; a los ratones se les administró un refuerzo 28 días después de la vacunación. Las respuestas inmunitarias humorales se midieron por ELISA como se describe anteriormente. Para cada grupo de tratamiento, se promediaron los valores log10 de los valores de anticuerpos de criterio de valoración y se calcularon las desviaciones estándar para cada punto de tiempo.
La figura 2 ilustra el efecto de una administración única de una vacuna preparada de acuerdo con la invención ("vacuna B"). Se vacunaron tres grupos de ratones (n=9 u 11) como sigue: Los ratones del grupo 1 se vacunaron con una dosis única de 1 microgramo de PT y 1 microgramo de Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4 en una dosis de 50 microlitros formulada como una vacuna sin agua/ liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo (vacuna B). Los ratones del grupo 2 y del grupo 3 se trataron con 1 microgramo de PT y 100 microgramos de alumbre por dosis de 100 microlitros de vacuna de alumbre de control; los ratones del grupo 2 recibieron una dosis única, los ratones del grupo 3 recibieron un refuerzo los días 21 y 31. Los ratones del grupo 4 permanecieron sin vacunar. Los ratones se expusieron 56 días después de la vacunación con inoculación en aerosol a Bordetella pertussis y se establecieron recuentos pulmonares bacterianos 8 y 15 días después de la exposición. Para cada grupo de tratamiento, se promediaron los valores log10 de las unidades formadoras de colonias por pulmón y se calcularon las desviaciones estándar para cada punto de tiempo.
La figura 3 ilustra el efecto de una administración única de una vacuna preparada de acuerdo con la invención ("vacuna C"). Se vacunaron dos grupos de conejos (N=8) como sigue: Los conejos del grupo 1 se vacunaron con una dosis única de 8 microgramos de rPA y 2 microgramos de Pam-3-Cys en una dosis de 100 microlitros formulada como una vacuna de liposomas/ p 3c / vehículo hidrófobo (vacuna C). Los conejos del grupo 2 se trataron con 8 microgramos de rPA y 350 microgramos de hidróxido de aluminio por dosis de 100 microlitros de vacuna de alumbre de control; a los conejos se les administró un refuerzo a los 28 y 84 días después de la vacunación. Las respuestas inmunitarias humorales se midieron por ELISA como se describe anteriormente. Para cada grupo de tratamiento, se promediaron los valores log10 de los valores de anticuerpos de criterio de valoración y se calcularon las desviaciones estándar para cada punto de tiempo.
La figura 4 ilustra que la vacuna A de la invención, que comprende específicamente un antígeno, liposomas, un adyuvante de ácido palmítico y un vehículo hidrófobo, puede simular la inmunogenicidad máxima. Se vacunaron cuatro grupos de ratones (N=10) como sigue: Los ratones del grupo 1 se vacunaron con una dosis única de 1 microgramo de rHA y 1 microgramo de Pam-3-Cys en una dosis de 50 microlitros formulada como una vacuna de liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo (vacuna A, la invención). Los ratones del grupo 2 se trataron con 1 microgramo de rHA y 1 microgramo de P3C por dosis de 50 microlitros. Los ratones del grupo 3 se trataron con 1 microgramo de rHA y 1 microgramo de P3C por dosis de 50 microlitros formulados como una vacuna acuosa/ liposomas/ P3C. Los ratones del grupo 4 se trataron con 1 microgramo de rHA formulado como una vacuna de liposomas/ vehículo hidrófobo. Las respuestas humorales se midieron por ELISA como se describe anteriormente. Para cada grupo de tratamiento, se promediaron los valores log10 de los valores de anticuerpos de criterio de valoración y se calcularon las desviaciones estándar para cada punto de tiempo.
La figura 5 ilustra que la vacuna D de la invención, que comprende un adyuvante a base de lípidos (es decir, Pam-3-Cys), puede potenciar la respuesta inmunitaria a las formulaciones de vacunas víricas inactivadas. El panel (A) muestra la puntuación clínica y el panel (B) muestra la supervivencia global de los ratones expuestos a la gripe A/PR/8/34 (H1N1) 28 días después de una vacunación única. Los ratones del grupo 1 se trataron con 50 microlitros de solución salina. Los ratones del grupo 2 se trataron con 50 microlitros de 2,56 x 10A3 TCID50 A/PR/8/34 con alumbre. Los ratones del grupo 3 se trataron con 50 microlitros de 2,56 x 10A3 TCID50 A/PR/8/34 y 1 microgramo de Pam-3-Cys formulados como una vacuna de liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo (vacuna D). Tras la exposición vírica, se realizó un seguimiento de los signos clínicos de cada ratón todos los días durante 10 días, y se puntuaron en función del aspecto físico, la postura, el nivel de actividad/comportamiento, la temperatura corporal, el peso corporal y la hidratación. Se sacrificó a cualquier ratón con una puntuación de >12 (de un total de 18 posible).
La figura 6 ilustra que la vacuna A de la invención puede estimular una respuesta inmunitaria específica que es significativamente más fuerte que una vacuna comparable preparada con un adyuvante diferente (liposomas/ IMQ/ vehículo hidrófobo). Se vacunaron dos grupos de ratones (N=9) como sigue: Los ratones del grupo 1 se vacunaron con una dosis única de 1 microgramo de rHA y 1 microgramo de Pam-3-Cys en una dosis de 50 microlitros formulada como una vacuna de liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo (vacuna A). Los ratones del grupo 2 se trataron con 1 microgramo de rHA y 1 microgramo de imiquimod por dosis de 50 microlitros formulados como una vacuna de liposomas/ IMQ/ vehículo hidrófobo (vacuna de control). Las respuestas inmunitarias humorales se midieron por ELISA como se describe anteriormente. Para cada grupo de tratamiento, se calcularon los valores log10 de los valores de anticuerpos de criterio de valoración. Análisis estadístico realizado por prueba de la T para datos independientes, P < 0,005.
La figura 7 ilustra que tanto Pam3Cys como Pam2Cys pueden inducir una potente proliferación de linfocitos B. Se estimularon los linfocitos B purificados de ratones C57BL6 durante tres días in vitro con Pam2Cys (A), Pam3Cys (B), Poli I:C (C) o LPS (D) en tres concentraciones diferentes en presencia de anti-Ig y anti-CD40. La proliferación se midió por la incorporación de [3H]-timidina, cuantificada como recuentos por minuto (CPM). N=2-10, análisis estadístico realizado por ANOVA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
El tipo de inmunidad inducida por una vacuna depende en gran medida del tipo de adyuvante incluido en la vacuna. La magnitud y duración de una respuesta de este tipo depende del tipo de adyuvante usado, así como de la composición o procedimiento por el que el antígeno y el adyuvante se presentan al sistema inmunitario. Por ejemplo, se pueden usar virus vivos atenuados para suministrar genes para antígenos de interés que a continuación se producen in vivo para presentarse fácilmente por las células presentadoras de antígeno; se pueden usar liposomas para coadministrar antígeno y adyuvante directamente a las células presentadoras de antígeno para impulsar una mejor respuesta inmunitaria de la que se puede por el antígeno no marcado y el adyuvante.
La presente invención proporciona composiciones de vacuna, que son suspensiones de liposomas sin agua, que usan un adyuvante que activa o incrementa la actividad de TLR2 para generar respuestas de anticuerpos inesperadamente fuertes.
Las composiciones de vacuna de la invención son como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
En algunos modos de realización, las composiciones de vacuna de la invención pudieron proteger a un sujeto de un agente patógeno con tan solo una dosis única, mientras que, como se muestra en los ejemplos en el presente documento, las vacunas de control no pudieron producir dichos niveles de anticuerpos y no pueden proteger a sujetos vacunados en el mismo grado.
Las composiciones de la invención como se definen en las reivindicaciones adjuntas, que combinan un antígeno que puede inducir una respuesta inmunitaria humoral, un adyuvante que activa o incrementa la actividad de TLR2, liposomas y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba proporcionaron valores de anticuerpos sorprendentemente mayores que las composiciones de control acuosas basadas en aluminio. Además, una dosis única de una composición de la invención pudo proteger eficazmente a los ratones de la exposición bacteriana y permitirles curarse completamente de la infección de los pulmones, lo que no se observó en las composiciones de control acuosas basadas en aluminio.
La capacidad de producir respuestas inmunitarias humorales consistentes y duraderas con al menos una inmunización usando los componentes de la composición de la invención descrita (por ejemplo, ejemplos 1 a 4) ilustra la utilidad particular de estas composiciones en una amplia gama de aplicaciones médicas, tales como por ejemplo, las descritas en el presente documento. Como se muestra en los ejemplos en el presente documento, las composiciones de la invención pueden producir una respuesta inmunitaria fuerte y potenciada al menos tan temprano como tres semanas después de la inmunización, y la respuesta inmunitaria es de larga duración con valores de anticuerpos que permanecen altos durante al menos veinticuatro semanas después de la inmunización (por ejemplo, figura 3).
Las composiciones de la invención como se definen en las reivindicaciones adjuntas pueden producir respuestas inmunitarias humorales consistentes y duraderas. Por ejemplo, los datos descritos en el ejemplo 4 en el presente documento muestran que los valores de anticuerpos generados por los ratones en el grupo 1 (una vacuna de la invención) fueron significativamente mayores que los valores de anticuerpos generados por los ratones en los grupos de control sin liposomas (grupo 2), sin vehículo hidrófobo (grupo 3) o sin adyuvante a base de lípidos (grupo 4).
Por tanto, las composiciones de vacuna de la invención pueden generar fuertes respuestas inmunitarias humorales, con altos niveles de producción de anticuerpos, en sujetos inmunizados.
Las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades y/o trastornos mejorados por respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, que implican linfocitos B y producción de anticuerpos). Las composiciones encuentran aplicación en cualquier caso en el que se desee administrar un antígeno a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria humoral o la producción de anticuerpos.
Como se usa en el presente documento, "inducir" una respuesta inmunitaria es provocar y/o potenciar una respuesta inmunitaria. Inducir una respuesta inmunitaria engloba casos donde la respuesta inmunitaria se potencia, eleva, mejora o refuerza en beneficio del huésped en relación con el estado de respuesta inmunitaria anterior, por ejemplo, antes de la administración de una composición de la invención.
Una respuesta inmunitaria humoral, a diferencia de la inmunidad mediada por células, está mediada por anticuerpos secretados que se producen en las células de la estirpe de linfocitos B (linfocitos B). Dichos anticuerpos secretados se unen a antígenos, tales como, por ejemplo, aquellos en las superficies de sustancias extrañas y/o patógenos (por ejemplo, virus, bacterias, etc.) y los señalan para su destrucción.
Un "anticuerpo" es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancial o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante k, A, a, y, 6, £ y p, así como innumerables genes de la región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como k o bien A. Las cadenas pesadas se clasifican como y, p, a, 6 o £, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende una proteína que contiene cuatro polipéptidos. Cada unidad estructural de anticuerpo está compuesta por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada una una cadena "ligera" y una "pesada". El extremo N de cada cadena define una región variable principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Las unidades estructurales de anticuerpos (por ejemplo, de las clases IgA e IgM) también se pueden ensamblar en formas oligoméricas entre sí y cadenas polipeptídicas adicionales, por ejemplo, como pentámeros de IgM en asociación con el polipéptido de cadena de J.
Los anticuerpos son los productos de glucoproteínas específicas de antígeno de un subconjunto de glóbulos blancos llamados linfocitos B. El acoplamiento del antígeno con el anticuerpo expresado en la superficie de los linfocitos B puede inducir una respuesta de anticuerpo que comprende la estimulación de los linfocitos B para que se activen, experimenten mitosis y se diferencien terminalmente en células plasmáticas, que están especializadas para la síntesis y secreción de anticuerpos específicos de antígeno.
Los linfocitos B son los únicos productores de anticuerpos durante una respuesta inmunitaria y, por tanto, son un elemento clave para una inmunidad humoral eficaz. Además de producir grandes cantidades de anticuerpos, los linfocitos B también actúan como células presentadoras de antígeno y pueden presentar antígenos a los linfocitos T, tales como T cooperadores CD4 o citotóxicos CD8, propagando, por tanto, la respuesta inmunitaria. Los linfocitos B, así como los linfocitos T, son parte de la respuesta inmunitaria adaptativa que es esencial para la eficacia de la vacuna. Durante una respuesta inmunitaria activa, inducida por vacunación o bien infección natural, los linfocitos B específicos de antígeno se activan y se expanden clonalmente. Durante la expansión, los linfocitos B evolucionan para tener una mayor afinidad por el epítopo. La proliferación de linfocitos B se puede inducir indirectamente por linfocitos T cooperadores activados, y también directamente a través de la estimulación de receptores, tales como los receptores tipo toll (TLR).
Las células presentadoras de antígeno, tales como las células dendríticas y los linfocitos B, se dirigen a los sitios de vacunación y pueden interactuar con los antígenos y adyuvantes contenidos en la vacuna. El adyuvante estimula a las células a que se activen y el antígeno proporciona el modelo para la diana. Los diferentes tipos de adyuvantes proporcionan diferentes señales de estimulación a las células. Por ejemplo, poli I:C (un agonista de TLR3) puede activar las células dendríticas, pero no los linfocitos B. Los adyuvantes tales como Pam3Cys, Pam2Cys y FSL-1 son especialmente hábiles para activar e iniciar la proliferación de linfocitos B, lo que se espera que facilite la producción de una respuesta de anticuerpos (Moyle et al., Curr Med Chem, 2008; So., J Immunol , 2012).
Como se usa en el presente documento, el término "respuesta de anticuerpos" se refiere a un incremento en la cantidad de anticuerpos específicos de antígeno en el cuerpo de un sujeto en respuesta a la introducción del antígeno en el cuerpo del sujeto.
Un procedimiento de evaluación de la respuesta de un anticuerpo es medir los valores de anticuerpos reactivos con un antígeno particular. Esto se puede realizar usando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, tales como el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) de sustancias que contienen anticuerpos obtenidas de animales. Por ejemplo, los valores de anticuerpos séricos que se unen a un antígeno particular se pueden determinar en un sujeto tanto antes como después de la exposición al antígeno. Un incremento estadísticamente significativo en el valor de anticuerpos específicos de antígeno tras la exposición al antígeno indicaría que el sujeto había aumentado una respuesta de anticuerpos con respecto al antígeno.
Otros ensayos que se pueden usar para detectar la presencia de un anticuerpo específico de antígeno incluyen, sin limitación, ensayos inmunológicos (por ejemplo, radioinmunoanálisis (RIA)), ensayos de inmunoprecipitación y ensayos de transferencia de proteínas (por ejemplo, inmunoelectrotransferencia); y ensayos de neutralización (por ejemplo, neutralización de la infecciosidad vírica en un ensayo in vitro o in vivo).
Las composiciones de la presente invención, al estimular fuertes respuestas de anticuerpos, pueden proteger a un sujeto de una enfermedad, trastorno o dolencia asociada con un antígeno que puede inducir una respuesta inmunitaria humoral.
Esto incluye, por ejemplo, una enfermedad infecciosa; un cáncer seleccionado de carcinoma, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, sarcoma, blastoma, mieloma y tumores de células germinativas; una alergia; o enfermedad de Alzheimer.
La "respuesta inmunitaria humoral", como se hace referencia en el presente documento, se refiere a la producción de anticuerpos y los procesos secundarios que la acompañan, tales como, por ejemplo, la activación de los linfocitos T cooperadores 2 (Th2) y la producción de citocinas, el cambio de isotipo, la maduración por afinidad y la activación de los linfocitos de memoria. También se refiere a las funciones efectoras de un anticuerpo, tales como, por ejemplo, neutralización de toxinas, activación clásica del complemento, y promoción de fagocitosis y eliminación de patógenos. La respuesta inmunitaria humoral se favorece por los linfocitos Th2 CD4+ y, por lo tanto, la activación o generación de este tipo de células también es indicativa de una respuesta inmunitaria humoral como se hace referencia en el presente documento.
Una "respuesta inmunitaria humoral" como se hace referencia en el presente documento también puede englobar la generación y/o activación de los linfocitos T cooperadores 17 (Th17). Los linfocitos Th17 son un subconjunto de linfocitos T efectores cooperadores caracterizados por la secreción de citocinas de defensa del huésped tales como IL-17, IL-17F e IL-22. Las linfocitos Th17 se consideran distintos desde el punto de vista de desarrollo de los linfocitos Th1 y Th2, y se ha postulado que facilitan la respuesta inmunitaria humoral, tal como, por ejemplo, proporcionando una función importante en la inmunidad antimicrobiana y protegiendo frente a infecciones. Se cree que su producción de IL-22 estimula las células epiteliales para que produzcan proteínas antimicrobianas y la producción de iL-17 puede estar implicada en el reclutamiento, activación y migración de neutrófilos para proteger frente a la infección del huésped por diversas especies bacterianas y fúngicas.
Una respuesta inmunitaria humoral es el mecanismo principal para vacunas eficaces frente a enfermedades infecciosas. Sin embargo, una respuesta inmunitaria humoral también puede ser útil para combatir el cáncer. A diferencia de una vacuna contra el cáncer diseñada para producir una respuesta de linfocitos T CD8 citotóxicos que puede reconocer y destruir células cancerosas, las respuestas mediadas por linfocitos B se pueden dirigir a las células cancerosas a través de otros mecanismos que, en algunos casos, pueden cooperar con una célula T CD8 citotóxica para obtener el máximo beneficio. Los ejemplos de mecanismos de respuestas antitumorales mediadas por linfocitos B (por ejemplo, mediadas por la respuesta inmunitaria humoral) incluyen, sin limitación: 1) anticuerpos producidos por linfocitos B que se unen a antígenos de superficie que se encuentran en las células tumorales u otras células que influyen en la oncogénesis. Dichos anticuerpos pueden, por ejemplo, inducir la destrucción de las células diana a través de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o la fijación del complemento, lo que potencialmente da como resultado la liberación de antígenos adicionales que se pueden reconocer por el sistema inmunitario; 2) anticuerpos que se unen a los receptores en las células tumorales para bloquear su estimulación y, en efecto, neutralizar sus efectos; 3) anticuerpos que se unen a factores liberados por o asociados con tumores o células asociadas a tumores para modular una vía de señalización o celular que respalda el cáncer; y 4) anticuerpos que se unen a dianas intracelulares y median en la actividad antitumoral a través de un mecanismo actualmente desconocido.
Se pueden usar varios procedimientos para demostrar la inducción de inmunidad humoral tras la vacunación. Estos se pueden clasificar ampliamente en la detección de: i) células presentadoras de antígeno específicas; ii) células efectoras específicas y sus funciones; y iii) liberación de mediadores solubles tales como citocinas.
(i) Células presentadoras de antígeno: las células dendríticas y los linfocitos B (y en menor medida los macrófagos) están equipadas con receptores inmunoestimuladores especiales que permiten una activación potenciada de los linfocitos T, y se denominan células presentadoras de antígeno (APC) profesionales. Estas moléculas inmunoestimuladoras (también llamadas moléculas coestimuladoras) se regulan por incremento en estas células tras una infección o vacunación, durante el proceso de presentación de antígenos a las células efectoras tales como los linfocitos T citotóxicos CD4 y CD8. Dichas moléculas coestimuladoras (tales como CD80, CD86, MHC de clase I o MHC de clase II) se pueden detectar usando citometría de flujo con anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra estas moléculas junto con anticuerpos que identifican específicamente APC (tales como CD11c para las células dendríticas).
(ii) Linfocitos T "cooperadores" CD4+: los linfocitos CD4+, o linfocitos T cooperadores, son mediadores de la respuesta inmunitaria y desempeñan un papel importante en el establecimiento y la maximización de las capacidades de la respuesta inmunitaria adaptativa. Estas células no tienen actividad citotóxica o fagocítica; y no pueden destruir células infectadas o eliminar patógenos, pero, en esencia, "gestionan" la respuesta inmunitaria, dirigiendo a otras células para que realicen estas tareas. Dos tipos de respuestas de linfocitos T cooperadores CD4+ efectores se pueden inducir por una APC profesional, denominados Th1 y Th2, diseñados cada uno para eliminar diferentes tipos de patógenos. Las linfocitos T cooperadores expresan receptores de linfocitos T (TCR) que reconocen el antígeno unido a moléculas de MHC de clase II. La activación de un linfocito T cooperador indiferenciado provoca que libere citocinas, lo que influye en la actividad de muchos tipos de células, incluyendo la APC que lo activó. Las dos poblaciones de linfocitos Th, Th1 y Th2, difieren en el patrón de las proteínas efectoras (citocinas) producidas. En general, los linfocitos Th1 ayudan a la respuesta inmunitaria celular por la activación de los macrófagos y linfocitos T citotóxicos; mientras que los linfocitos Th2 promueven la respuesta inmunitaria humoral por la estimulación de los linfocitos B para su conversión en células plasmáticas y por la formación de anticuerpos. Una respuesta regulada por células de tipo Th2 puede potenciar predominantemente la producción de IgG1 en ratones (IgG2 en seres humanos). La medida de las citocinas asociadas con las respuestas Th1 o Th2 dará una medida de una vacunación satisfactoria. Esto se puede lograr por ELISA específico diseñado para Thl-citocinas tal como IFN-y, IL-2, IL-12, TNF-a y otros, o Th2-citocinas tal como IL-4, IL-5, IL10 entre otras.
Otra población de linfocitos Th es el linfocito Th17. La medida de citocinas asociadas con los linfocitos Th17 también puede dar una medida de una vacunación satisfactoria. Esto se puede lograr, por ejemplo, por ELISA específico diseñado para Th17-citocinas tal como IL-17, IL-17F e IL-22.
(iii) Medición de citocinas: liberadas de los ganglios linfáticos regionales da una buena indicación de una inmunización satisfactoria. Como resultado de la presentación de antígenos y la maduración de las APC y las células efectoras inmunitarias tales como los linfocitos T CD4 y CD8, varias citocinas se liberan por las células de los ganglios linfáticos. Al cultivar estas LNC in vitro en presencia de antígeno, se puede detectar una respuesta inmunitaria específica de antígeno midiendo la liberación si determinadas citocinas importantes tales como IL-4, IL-5 e IL10 para la detección de una respuesta inmunitaria humoral. Esto se podría realizar por ELISA usando sobrenadantes de cultivo y citocinas recombinantes como patrones.
La inmunización satisfactoria se puede determinar además de una serie de maneras adicionales conocidas por el experto en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) y de inhibición de la neutralización del suero para detectar anticuerpos funcionales; estudios de exposición, en los que los sujetos vacunados se exponen al patógeno asociado para determinar la eficacia de la vacunación; y el uso de separación de células activadas por fluorescencia (FACS) para determinar la población de células que expresan un marcador de superficie celular específico, por ejemplo, en la identificación de linfocitos activados o de memoria. Además, la eficacia de la vacuna en la estimulación de una respuesta inmunitaria humoral se puede evaluar por detección con ELISA de niveles de anticuerpos específicos de antígeno en el suero de sujetos inmunizados. Un experto en la técnica también puede determinar si la inmunización con una composición de la invención provocó una respuesta humoral (o mediada por anticuerpos) usando otros procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology Coligan et al., ed. (Wiley Interscience, 2007). El término "enfermedad infecciosa", como se usa en el presente documento, se puede referir, por ejemplo, a cualquier enfermedad infecciosa, enfermedad contagiosa o enfermedad transmisible resultante de la infección, presencia y/o crecimiento de agentes biológicos patógenos. Sin limitación, un agente patógeno infeccioso puede incluir, por ejemplo, virus, bacterias, hongos, protozoos y parásitos. Los ejemplos no limitantes de enfermedades infecciosas incluyen gripe (por ejemplo, infección por el virus de la gripe), infecciones respiratorias tales como, por ejemplo, bronquiolitis y neumonía (por ejemplo, infección por el virus respiratorio sincicial), tosferina o tos ferina (por ejemplo, infección por Bordetella pertussis), carbunco (por ejemplo, infección por Bacillus anthracis) y malaria (por ejemplo, infección por Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale o Plasmodium knowlesi).
Como se usa en el presente documento, los términos "cáncer", "células cancerosas", "tumor" y "células tumorales" (usados de manera intercambiable) se refieren a células que presentan un crecimiento anormal, caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular o células que se han inmortalizado. El término "cáncer" o "tumor" incluye cáncer o tumores metastásicos así como no metastásicos. Un cáncer se puede diagnosticar usando criterios en general aceptados en la técnica, incluyendo la presencia de un tumor maligno.
Una "toxina", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia producida por células u organismos vivos (por ejemplo, vegetales, animales, microorganismos, etc.) que puede provocar una enfermedad o dolencia, o una sustancia infecciosa, o una molécula recombinante o sintetizada que puede producir efectos adversos. Las toxinas pueden ser, por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos o proteínas. Las toxinas incluyen estupefacientes tales como, por ejemplo, la cocaína.
Un "alérgeno", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia que pueda provocar una alergia. El alérgeno se puede derivar de, sin limitación, células, extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, conjugados de polisacáridos, imitadores peptídicos y no peptídicos de polisacáridos y otras moléculas, moléculas pequeñas, lípidos, glucolípidos y carbohidratos de vegetales, animales, hongos, insectos, alimentos, drogas, polvo y ácaros. Los alérgenos incluyen pero no se limitan a aeroalérgenos ambientales; polen de plantas (por ejemplo, ambrosía/polinosis); alérgenos de polen de malezas; alérgenos de polen de las gramíneas; hierba Johnson; alérgenos de polen de árboles; cizaña; alérgenos de arácnidos (por ejemplo, alérgenos de ácaros del polvo doméstico); alérgenos de ácaros de almacén; polen de cedro japonés/polinosis; alérgenos de moho/esporas de hongos; alérgenos de animales (por ejemplo, alérgenos de perro, cobaya, hámster, jerbo, rata, ratón, etc.,); alérgenos alimentarios (por ejemplo, crustáceos, frutos secos, cítricos, harina, café); alérgenos de insectos (por ejemplo , pulgas, cucarachas); venenos: (himenópteros, avispa norteamericana, abeja melífera, avispa europea, avispón, hormiga roja); alérgenos bacterianos (por ejemplo, antígenos estreptocócicos; alérgenos de parásitos tales como el antígeno ascaris); antígenos víricos; alérgenos de fármacos (por ejemplo, penicilina); hormonas (por ejemplo, insulina); enzimas (por ejemplo, estreptocinasa); y fármacos o productos químicos que pueden actuar como antígenos o haptenos incompletos (por ejemplo, los anhídridos de ácido y los isocianatos).
Cuando se usa un hapteno en una composición de la invención, se puede fijar a un vehículo, tal como, por ejemplo, una proteína, para formar un aducto hapteno-vehículo. El aducto hapteno-vehículo puede iniciar una respuesta inmunitaria humoral, mientras que el hapteno por sí mismo no provocaría ninguna producción de anticuerpos. Los ejemplos no limitantes de haptenos son anilina, urushiol (una toxina en la hiedra venenosa), hidralacina, fluoresceína, biotina, digoxigenina y dinitrofenol.
"Tratar" o "tratamiento de", o "prevenir" o "prevención de", como se hace referencia en el presente documento, se refiere a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo los resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución del grado de la enfermedad, estabilización del estado de la enfermedad, prevención de la aparición de la enfermedad, prevención de la propagación de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, retraso o ralentización del inicio de la enfermedad, conferir inmunidad protectora frente a un agente patógeno y mejora o atenuación del cuadro clínico. "Tratar" o "prevenir" también puede querer decir prolongar la supervivencia de un paciente más allá de lo esperado en ausencia de tratamiento y también puede querer decir inhibir la progresión de la enfermedad temporalmente, aunque más preferentemente, implica prevenir la aparición de la enfermedad, tal como previniendo la infección en un sujeto.
El sujeto que se va a tratar puede ser cualquier vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano.
Adyuvantes
Los adyuvantes adecuados de la composición de la invención son adyuvantes que activan o incrementan la actividad de TLR2 y que comprenden PAIVhCys o PAMaCys. El adyuvante es un adyuvante a base de lípidos, es decir, un adyuvante que comprende al menos un resto lipídico o componente lipídico.
Como se usa en el presente documento, la expresión "resto lipídico" o "componente lipídico" se refiere a cualquier ácido graso (por ejemplo, acilos grasos) o derivado del mismo, incluyendo, por ejemplo, triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos. Los ácidos grasos ejemplares incluyen, sin limitación, los grupos palmitoílo, miristoílo, estearoílo y decanoílo o cualquier grupo acilo graso de C2 a C30 saturado o insaturado, preferentemente cualquier grupo acilo graso de C14 a C22 saturado o insaturado, y más preferentemente un grupo acilo graso C16 saturado o insaturado. Por tanto, como se hace referencia en el presente documento, la expresión "adyuvante a base de lípidos" engloba cualquier adyuvante que comprende un grupo acilo graso o un derivado del mismo.
Los adyuvantes a base de lípidos usados en la presente invención contienen como mínimo al menos un resto lipídico, o un análogo de resto lipídico sintético/semisintético, como se define en las reivindicaciones adjuntas, que se puede acoplar a un aminoácido, un oligopéptido u otras moléculas (por ejemplo, un carbohidrato, un glicano, un polisacárido, biotina, rodamina, etc.). Por tanto, sin limitación, el adyuvante a base de lípidos puede ser, por ejemplo, un lipoaminoácido, un lipopéptido, un lipoglicano, un lipopolisacárido o un ácido lipoteicoico. Además, un resto lipídico o una estructura que contiene un resto lipídico se puede acoplar de forma covalente o no covalente a un antígeno para crear compuestos antigénicos con propiedades adyuvantes incorporadas. Por ejemplo, y sin limitación, el resto basado en lípidos puede comprender un catión (por ejemplo, níquel) para proporcionar una carga positiva para el acoplamiento no covalente.
En algunos modos de realización, el resto lipídico o el componente lipídico puede ser natural, tal como, por ejemplo, un componente de la pared celular (por ejemplo, lipoproteína) de una bacteria grampositiva o gramnegativa, Rhodopseudomonas viridis o micoplasma. En otros modos de realización, el resto lipídico o el componente lipídico puede ser sintético o semisintético.
El adyuvante a base de lípidos usado en la composición de la presente invención comprende ácido palmítico (PAM) en forma de PAM2Cys o PAMaCys como al menos uno de los restos o componentes lipídicos del adyuvante. Dichos adyuvantes basados en lípidos se denominan en el presente documento "adyuvante de ácido palmítico". El ácido palmítico es un lípido de bajo peso molecular que se encuentra en la lipoproteína de Braun inmunológicamente reactiva de Escherichia coli. Otros nombres químicos comunes para el ácido palmítico incluyen, por ejemplo, ácido hexadecanoico en la nomenclatura IUPAC y ácido 1-pentadecanocarboxílico. La fórmula molecular del ácido palmítico es CHa(CH2) i4CO2H. Como entenderán los expertos en la técnica, es posible que se pueda alterar la cadena lipídica del ácido palmítico. Los compuestos ejemplares que se pueden usar en la presente memoria como adyuvantes de ácido palmítico y los procedimientos para su síntesis se describen, por ejemplo, en las publicaciones de patente de Estados Unidos US 2008/0233143; US 2010/0129385; y US2011/0200632.
Como se describe anteriormente para restos lipídicos en general, el resto de ácido palmítico del adyuvante de ácido palmítico usado en la composición de la invención se puede acoplar a un aminoácido, un oligopéptido u otras moléculas. El resto de ácido palmítico o la estructura que contiene ácido palmítico se puede acoplar de forma covalente o no covalente a un antígeno para crear compuestos antigénicos con propiedades adyuvantes incorporadas. El resto de ácido palmítico o una estructura química que contiene ácido palmítico se conjuga con un péptido de cisteína (Cys) para permitir diversas configuraciones estructurales del adyuvante, incluyendo estructuras lineales y ramificadas. El residuo de cisteína se ha extendido habitualmente por residuos polares tales como serina (Ser) y/o lisina (Lys) en el extremo C para crear compuestos adyuvantes con solubilidad mejorada. Los compuestos adyuvantes que contienen ácido palmítico se podrían mezclar con un antígeno, asociar con el antígeno a través de interacciones no covalentes o, de forma alternativa, unir de forma covalente a un antígeno, directamente o bien con el uso de un conector/espaciador, para generar respuestas inmunitarias potenciadas. Más habitualmente, dos restos de ácido palmítico se fijan a una cadena principal de glicerilo y un residuo de cisteína para crear dipalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAM2Cys) o tripalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAM3Cys), que también se pueden usar en múltiples configuraciones como se describe anteriormente.
Es conocido que los adyuvantes de ácido palmítico activan los linfocitos B provocando una rápida proliferación y producción de anticuerpos. Los linfocitos B reconocen el antígeno coadministrado con el adyuvante en la formulación de la vacuna y, a través de maduración por afinidad, proliferarán con una especificidad creciente hacia el antígeno. Es conocido que los linfocitos B activados secretan grandes cantidades de anticuerpos inmunoglobulínicos solubles que se pueden unir a dianas solubles, tales como bacterias, presentes en la sangre. Las funciones efectoras del anticuerpo son i) opsonización; ii) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); iii) activación del complemento; iv) neutralización. Si bien la mayoría de los linfocitos B madurarán para convertirse en células plasmáticas secretoras de anticuerpos, una parte se debería diferenciar en linfocitos B de memoria que persisten después de que la respuesta inmunitaria ha controlado la infección. Esto proporciona inmunidad a largo plazo frente a la exposición posterior al patógeno. Idealmente, una vacuna profiláctica debería inducir una fuerte población de linfocitos B de memoria.
Como se menciona anteriormente, el adyuvante de ácido palmítico comprende PAM2Cys o PAM3Cys.
Dichos adyuvantes de ácido palmítico están disponibles, por ejemplo, como reactivos de investigación en EMC Microcollections GmbH (Alemania) e InvivoGen (San Diego, California, EE. UU.).
También están disponibles en EMC Microcollections diversos análogos de Pam-2-Cys-Ser-(Lys)4 y Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4, incluyendo los análogos marcados. Estos análogos se engloban en el presente documento e incluyen, sin limitación, PAM3Cys-SKKKK (P-irradiado), R-PAM3Cys-SKKKK, S-PAM3Cys-SKKKK, PAM3Cys-SKKKK(biotina-Aca-Aca), PAM3Cys-SKKKK(fluoresceína-Aca-Aca), PAM3Cys-SKKKK(rodamina-Aca-Aca), PAM3Cys-SKKKK-FLAG-marca, PHC-SKKKK, PHC-SKKKK(biotina-Aca-Aca), PAM3Cys-SSNAKIDQLSSDVQT, PAM3Cys-SSNKSTTGSGETTTA, PAM3Cys-SSTKPVSQDTSPKPA, PAM3Cys-SSGSKPSGG PLPDAK, PAM3Cys-SSGNKSAPSSSASSS, PAM3Cys-GSHQMKSEGHANMQL, PAM3Cys-SSSNNDAAGNGAAQT, PAM3Cys-KQNVSSLDEKNSVSV, PAM3Cys-NNSGKDGNTSA NSAD, PAM3Cys-NNGGPELKSDEVAKS, PAM3Cys-SQEPAAPAAEATPAG, PAM3Cys-SSSKSSDSSAPKAYG, PAM3Cys-AQEKEAKSELDYDQT, Pam2Cys-SKKKK (mezcla de estereoisómeros RR y RS), R-Pam2Cys-SKKKK (estereoisómero RR), S-Pam2Cys-SKKKK (estereoisómero RS), PamCys(Pam)-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK(biotina-Aca-Aca)-NH2, Pam2Cys-SKKKK(fluoresceína-Aca-Aca)-NH2, PAM2Cys-SKKKK(rodamina-Aca-Aca)-NH2 y PAM2Cys-SKKKK-FLAG-marca. Cuando sea apropiado, el adyuvante de ácido palmítico o análogo del mismo se puede usar como compuestos definidos estereoquímicamente o como una mezcla de estereoisómeros.
El adyuvante es aquel que activa o incrementa la actividad de los receptores tipo toll TLR2. Como se usa en el presente documento, un adyuvante que "activa" o "incrementa la actividad" de un TLR2 actúa como un agonista de TLR2. Además, la activación o el aumento de la actividad de TLR2 engloba su activación en cualquier forma monomérica, homodimérica o heterodimérica, y en particular incluye la activación de TLR2 como heterodímero con TLR1 o TLR6 (es decir, TLR1/2 o TLR2/6), como se describe en más detalle a continuación.
Los TLR son una familia conservada de receptores que abarcan la transmembrana que se encuentran principalmente en leucocitos tales como las células dendríticas (CD) y los macrófagos, células presentadoras de antígeno profesionales. Los TLR han evolucionado específicamente para reconocer e inducir una respuesta inmunitaria a patrones moleculares asociados a patógenos, tales como por ejemplo lipoproteínas y lipopéptidos bacterianos y ARN bicatenario vírico. Se han identificado más de 10 TLR distintos en ratones y seres humanos, aunque el ligando y las vías de señalización aún no se conocen para algunos (véase la tabla 1 a continuación). Existen l3 TLR identificados en seres humanos, numerados del 1 al 13.
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Los TLR normalmente forman homodímeros, con la excepción de TLR2 que forma un heterodímero con TLR1 o TLR6, lo que da como resultado una especificidad de ligando diferente. TLR2 media en la señalización en dirección 3', por lo que estos heterodímeros a menudo se denominan conjuntamente TLR2 (Takeuchi, O. y S. Akira, Cell, 2010, 140(6): p. 805-20). La estimulación de los TLR en las CD da como resultado una regulación por incremento de MHC y las moléculas coestimuladoras, que potencian la función de presentación de antígeno de estas células, así como la producción de citocinas de tipo Th1 y la promoción de la presentación cruzada (Lahiri et al., Vaccine , 2008, 26(52): p.
6777-83; Welters et al., Vaccine, 2007, 25(8): p. 1379-89; Matsumoto et al., Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60(7): p. 805­ 12; Blander, J.M., Ann Rheum Dis, 2008, 67 Suppl 3: p. iii44-9). Debido a que la estimulación a través de los TLR tiene un efecto directo sobre el refuerzo de la respuesta inmunitaria, se han estudiado los agonistas de TLR como adyuvantes potenciales (Barchet et al., Curr Opin Immunol, 2008, 20 (4): p. 389-95).
Los TLR tienen un dominio citosólico conservado denominado receptor de Toll-interleucina 1 (TIR) que está asociado con una molécula adaptadora que facilita las vías de señalización en dirección 3' que dan lugar a la activación celular. Los TLR se podrían clasificar ampliamente por la proteína adaptadora con la que están asociados, MyD88 o TRIF. TLR4 solo puede señalizar a través de ambas vías. Ambas vías de señalización convergen en la activación del factor de transcripción NF-KB (Ouyang et al., Biochem Biophys Res Commun, 2007, 354(4): p. 1045-51). Varios estudios han demostrado que aunque diferentes TLR comparten algunas moléculas de señalización en dirección 3', cada receptor produce un perfil único de mediadores proinflamatorios (Welters et al., Vaccine, 2007, 25(8): p. 1379-89; Seya et al. , Evid Based Complement Alternat Med, 2006, 3(1): p. 31-8 y análisis 133-7; Ghosh et al., Cell Immunol, 2006, 243(1): p. 48-57; Re, F. y Strominger, J.L., J Immunol, 2004, 173(12): p. 7548-55; Avril et al., J Immunother, 2009, 32(4): p. 353-62). No se ha dilucidado por completo la vía en dirección 3' completa para los receptores TLR, pero las diferencias en la activación podrían ser el resultado de la fuerza del ligando, la localización subcelular del receptor, el tipo de célula y la presencia de factores reguladores de interferón (IRF).
Se ha informado de que los adyuvantes de ácido palmítico señalizan a través del receptor tipo toll 2 (TLR2). Por ejemplo, PAIVhCys se reconoce por el heterodímero TLR2 y TLR6. También como ejemplo, PAMsCys, que se reconoce por el heterodímero TLR1 y TLR2, desencadena una respuesta antibacteriana tipificada por la actividad humoral. Por el contrario, el ARN bicatenario de los virus se reconoce por TLR3 e induce una respuesta antivírica que normalmente se caracteriza por la liberación de interferón y la actividad de los linfocitos T. La mediación de las respuestas celulares se ha asociado con TLR2.
PamaCys se ha sometido a prueba en una variedad de modelos animales y en un ensayo clínico de fase I en seres humanos sin efectos secundarios informados (Moyle, P.M. y Toth. I., Curr Med Chem, 2008, 15(5): p. 506-16; Wiedemann et al., J Pathol, 1991, 164(3): p. 265-71). En un cribado de agonistas de TLR en CD murinas, la estimulación con PamaCys in vitro produjo altos niveles de citocinas proinflamatorias IL-12p40, IL-6 y TNFa que se alcanzaron con solo pequeñas cantidades del adyuvante en relación con otros agonistas de TLR sometidos a prueba (Welters et al., Vaccine, 2007, 25(8): p. 1379-89).
Otros agonistas de TLR2 ejemplares que se pueden usar como adyuvantes a base de lípidos en la composición de la invención incluyen, sin limitación, componentes de la pared celular tales como ácido lipoteicoico y lipoproteína de bacterias grampositivas, y lipoarabinomanano de micobacterias. Una serie de estos componentes de la pared celular están disponibles en InvivoGen (San Diego, California, EE. UU.), tales como lipoarabinomanano de M. smegmatis (LAM-MS), lipomanano de M. smegmatis (LM-MS), lipopolisacárido de P. gingivalis (LPS-PG ultrapuro) y ácido lipoteicoico de B. subtilis (LTA-BS) y S. aureus (LTA-SA). En algunos modos de realización, el adyuvante a base de lípidos que activa o incrementa la actividad de TLR2 puede englobar una bacteria termoinactivada que comprende uno cualquiera o más de los componentes de la pared celular descritos anteriormente. Dichas bacterias termoinactivadas están disponibles, por ejemplo, en InvivoGen (San Diego, California, EE. UU.).
Las lipoproteínas sintéticas que actúan como agonistas de TLR también se engloban por la invención, e incluyen, sin limitación, los adyuvantes y análogos de ácido palmítico descritos anteriormente y la lipoproteína diacilada sintética FSL-1 disponible en InvivoGen (San Diego, California, EE. UU.) y EMC Microcollections GmbH (Alemania). FSL-1 (Pam2CGDPKHPKSF) es una lipoproteína sintética que representa la parte N terminal de la lipoproteína LP44 de 44 kDa de Mycoplasma salivarium. FSL-1 comprende PAM2Cys y tiene una estructura de marco similar a la del lipopéptido activador de macrófagos 2 (MALP-2), un lipopéptido derivado de Mycoplasma fermentans. Se postula que FSL-1 y MALP-2, que contienen un residuo de cisteína diacilada N terminal lipolizada, se reconocen por el dímero TLR2 y TLR69TLR2/6). MALP-2 sintético está disponible en Enzo Life Sciences (Farmingdale, Nueva York, EE. UU.).
En un modo de realización, el adyuvante a base de lípidos de la invención comprende FSL-1 o MALP-2, o el adyuvante a base de lípidos es FSL-1 o MALP-2. Cuando sea apropiado, FSL-1 o MALP-2 se pueden usar como compuestos definidos estereoquímicamente o como una mezcla de estereoisómeros. La FSL-1 o el MALP-2 pueden estar marcados (por ejemplo, biotina, fluoresceína, rodamina, etc.). FSL-1 también está disponible como una colección de exploración de Ala para FSL-1 (EMC Microcollections) que comprende nueve compuestos FSL-1-Ala diferentes. Cada una de estas moléculas de FSL-1-Ala se engloba en el presente documento de forma individual o en combinación.
En algunos modos de realización, el adyuvante a base de lípidos de las composiciones de la invención es uno que activa o incrementa la actividad de TLR2 solo, heterodímero TLR1 y TLR2 (TLR1/2) y/o heterodímero TLR2 y TLR6 (TLR2/6), mientras que otros TLR no se activan. En otro modo de realización, el adyuvante a base de lípidos activa o incrementa solo la actividad del heterodímero TLR1/2 y/o TLR2/6, pero no activa otros TLR.
La composición de la invención puede comprender un adyuvante como se describe anteriormente en combinación con al menos otro adyuvante adecuado. Los modos de realización ejemplares del al menos otro adyuvante engloban, pero de ninguna manera se limitan a, compuestos orgánicos e inorgánicos, polímeros, proteínas, péptidos, glúcidos de fuentes sintéticas, no biológicas o biológicas (incluyendo, pero sin limitarse a virosomas, partículas similivíricas, virus y bacterias de sus componentes).
Otros ejemplos de adyuvantes compatibles pueden incluir, sin limitación, quimiocinas, agonistas de receptores tipo Toll, factores estimulantes de colonias, citocinas, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS04, AS15, ABM2, Adjumer, Algammulin, AS01B, AS02 (SBASA), ASO2A , BCG, calcitriol, chitosán, toxina del cólera, CP-870.893, CpG, poli l:C, CyaA, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), ftalato de dibutilo (DBP), dSLIM, gamma inulina, GM-CSF, GMDP, glicerol, IC30, IC31, imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISCOM, iSc OMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, LPS, proteína central lipídica, MF59, monofosforil lípido A, Montanide® IMS1312, adyuvantes basados en Montanide®, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, sistema de vector PepTel, otras moléculas basadas en palmitoílo, micropartículas de PLG, resiquimod, escualeno, SLR172, YF-17 DBCG, QS21, QuilA, P1005, poloxámero, saponina, polinucleótidos sintéticos, cimosano, toxina de la tosferina.
En consecuencia, la composición puede comprender uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables, donde al menos uno de los adyuvantes de la composición es un adyuvante que activa o incrementa la actividad de TLR2.
En otro modo de realización, el antígeno se puede acoplar al resto lipídico como se describe anteriormente. La composición también puede comprender otros excipientes, diluyentes, etc., farmacéuticamente aceptables, como es conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EE. UU. 1985) y The United States Pharmacopoeia: The National Formulary (USP 24 NF19) publicado en 1999.
En un modo de realización, dichos adyuvantes adecuados adicionales pueden comprender un oligodesoxinucleótido que contiene CpG (ODN CpG), tal como 5'-TCCATGACGTTCC TGACGTT-3'. El experto en la técnica puede seleccionar un CpG apropiado en función de la especie diana y la eficacia.
La cantidad de adyuvante usada depende de la cantidad de antígeno y del tipo de adyuvante. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de adyuvante necesaria en una aplicación particular por pruebas empíricas.
Antíaenos
Las composiciones de la invención comprenden uno o más antígenos. En general, el término "antígeno" se refiere a una sustancia que se puede unir específicamente a un anticuerpo. Los antígenos adecuados de la composición son los que pueden inducir una respuesta inmunitaria humoral en un sujeto.
Los antígenos útiles en las composiciones de la invención incluyen, sin limitación, polipéptidos, carbohidratos, un microorganismo o una parte del mismo, tal como una bacteria, virus o protozoario vivo, atenuado, inactivado o destruido, o parte del mismo. El antígeno puede ser, por ejemplo, un agente biológico patógeno, una toxina, un alérgeno, un péptido, una proteína o polipéptido natural, no natural, recombinante o desnaturalizado adecuado, o un fragmento del mismo, o un epítopo que puede producir una respuesta inmunitaria humoral en un sujeto.
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, el término "antígeno" también incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido que funciona como un antígeno. Son conocidas estrategias de vacunación a base de ácidos nucleicos, en las que se administra a un sujeto una composición de vacuna que contiene un polinucleótido. El polipéptido antigénico codificado por el polinucleótido se expresa en el sujeto, de modo que el polipéptido antigénico está finalmente presente en el sujeto, igual que si la propia composición de vacuna hubiera contenido el polipéptido. Para los propósitos de la presente invención, el término "antígeno", cuando el contexto lo dicta, engloba dichos polinucleótidos que codifican el polipéptido que funciona como antígeno.
Los polipéptidos o fragmentos de los mismos que pueden ser útiles como antígenos en la invención incluyen, sin limitación, los derivados del toxoide del cólera, toxoide tetánico, toxoide diftérico, antígeno de superficie de la hepatitis B, hemaglutinina (por ejemplo, proteína hemaglutinina recombinante H5N1), antígeno protector recombinante del carbunco (List Biologics; Campbell, CA), neuraminidasa, proteína de la gripe M, PfHRP2, pLDH, aldolasa, MSP1, MSP2, AMA1, Der-p-1, Der-f-1, adipofilina, AFP, AIM-2, ART-4, BAGE, a-fetoproteína, BCL-2, Bcr-Abl, BING-4, CEA, CPSF, CT, ciclina DlEp-CAM, EphA2, EphA3, ELF-2, FGF-5, G250, hormona liberadora de gonadotropinas, HER-2 , carboxil esterasa intestinal (iCE), IL13Ra2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MART-1, MART-2, M-CSF, MDM-2, MMP-2, MUC-1, NY-EOS-1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, proteína toxoide de la tosferina, p53, PBF, PRAME, PSA, PSMA, RAGE-1, RNF43, RU1, RU2AS, SART-1, SART-2, SART-3, SAGE-1, SCRN 1, SOX2, SOX10, STEAP1, survivina, telomerasa, TGFpRIl, TRAG-3, TRP-1, TRP-2, TERT y WT1.
Los virus, o partes de los mismos, útiles como antígenos en la invención incluyen, sin limitación, virus de la viruela vacuna, virus de la vaccinia, virus de paravacuna, virus del herpes humano 1, virus del herpes humano 2, citomegalovirus, adenovirus humano A-F, poliomavirus, papilomavirus humano, parvovirus, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana, ortoreovirus, rotavirus, virus del Ébola, virus paragripal, virus de la gripe (por ejemplo, virus de la gripe H5N1, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de la gripe C), virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubéola, neumovirus, virus respiratorio sincicial humano, virus de la rabia, virus de la encefalitis de California, virus de la encefalitis japonesa, hantavirus, virus de la coriomeningitis linfocítica, coronavirus, enterovirus, rinovirus, virus de la poliomielitis, norovirus, flavivirus, virus del dengue, virus del Nilo Occidental, virus de la fiebre amarilla y varicela.
En un modo de realización, se puede usar una composición de la invención para tratar y/o prevenir una infección por el virus de la gripe en un sujeto que lo necesite. La gripe es un virus de ARN monocatenario de la familia Orthomyxoviridae y a menudo se caracteriza por dos grandes glucoproteínas en el exterior de la partícula vírica, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Se han identificado numerosos subtipos HA de la gripe A (Kawaoka et al., Virology (1990) 179:759-767; Webster et al., "Antigenic variation among type A influenza viruses", p. 127-168. En: P. Palese y D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York).
Las bacterias o partes de las mismas útiles como antígenos en la invención incluyen, sin limitación, carbunco (Bacillus anthracis), brucela, Bordetella pertussis, cándida, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, cólera, Clostridium botulinum, Coccidioides immitis, criptococo, difteria, Escherichia coli 157: H7, Escherichia coli enterohemorrágica, Escherichia coli enterotoxinógena, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, legionela, leptospira, Listeria, meningococo, Mycoplasma pneumoniae, micobacteria, tosferina, neumonía, salmonela, shigella, estafilococo, Streptococcus pneumoniae y Yersinia enterocolitica.
El antígeno puede ser, de forma alternativa, de origen protozoario, por ejemplo, del género Plasmodium (Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale o Plasmodium knowlesi), que provoca malaria.
El antígeno puede ser, de forma alternativa, una toxina natural o sintetizada, tal como un estupefaciente (por ejemplo, cocaína).
El término "polipéptido" engloba cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de su longitud (por ejemplo, al menos 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 aminoácidos) o modificación postraduccional (por ejemplo, glucosilación o fosforilación), e incluye, por ejemplo, proteínas naturales, polipéptidos y péptidos sintéticos o recombinantes, epítopos, moléculas híbridas, variantes, homólogos, análogos, peptoides, peptidomiméticos, etc. Por lo tanto, una variante o derivado de la misma incluye deleciones, incluyendo truncamientos y fragmentos; inserciones y adiciones, por ejemplo sustituciones conservadoras, mutantes dirigidos al sitio y variantes alélicas; y modificaciones, incluyendo peptoides que tienen uno o más grupos distintos de aminoacilo (por ejemplo, glúcido, lípido, etc.) unidos de forma covalente al péptido y modificaciones postraduccionales. Como se usa en el presente documento, el término "sustituciones de aminoácido conservadas" o "sustituciones conservadoras" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro en una localización determinada en el péptido, donde la sustitución se puede realizar sin pérdida sustancial de la función pertinente. Al realizar dichos cambios, se pueden realizar sustituciones de residuos aminoacídicos similares en función de la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral, por ejemplo, su tamaño, carga, hidrofobia, hidrofilia y similares, y dichas sustituciones se pueden someter a ensayo para determinar su efecto sobre la función del péptido por pruebas de rutina. Los ejemplos específicos no limitantes de una sustitución conservadora incluyen los siguientes ejemplos:
Residuo original Sustituciones conservadoras
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gin, His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
His Asn; Gln
Ile Leu, Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln; Glu
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
Se pueden usar polipéptidos o péptidos que tienen una identidad sustancial con respecto a una secuencia de antígeno preferente. Se considera que dos secuencias tienen una identidad sustancial si, cuando están alineadas de manera óptima (con huecos permitidos), comparten al menos aproximadamente un 50 % de identidad de secuencia, o si las secuencias comparten motivos funcionales definidos. En modos de realización alternativos, se puede considerar que las secuencias alineadas de manera óptima son sustancialmente idénticas (es decir, que tienen una identidad sustancial) si comparten al menos un 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad en una región especificada. El término "identidad" se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas de polipéptidos. La identidad se puede determinar comparando cada posición en las secuencias alineadas. El grado de identidad entre las secuencias de aminoácidos es función del número de aminoácidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias, por ejemplo, en una región especificada. La alineación óptima de secuencias para comparaciones de identidad se puede llevar a cabo usando una variedad de algoritmos, como son conocidos en la técnica, incluyendo el programa ClustalW, disponible en http://clustalw.genome.ad.ip. el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, el procedimiento de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, y las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programa informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, Madison, WI, EE. UU.). La identidad de secuencia también se puede determinar usando el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (usando la configuración por defecto publicada). Por ejemplo, se puede usar la herramienta "BLAST 2 Sequences", disponible a través del National Center for Biotechnology Information (a través de Internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/bl2seq/wblast2.cgi), seleccionando el programa "blastp" con la siguiente configuración por defecto: umbral esperado 10; tamaño de palabra 3; matriz BLOSUM 62; existencia de costes de hueco 11, extensión 1. En otro modo de realización, el experto en la técnica puede alinear fácil y apropiadamente cualquier secuencia dada y deducir la identidad y/u homología de secuencia por simple inspección visual.
Los polipéptidos y péptidos usados para llevar a la práctica la invención se pueden aislar de fuentes naturales, ser sintéticos o ser polipéptidos generados de forma recombinante. Los péptidos y las proteínas se pueden expresar de forma recombinante in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos usados para llevar a la práctica la invención se pueden preparar y aislar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. El polipéptido y los péptidos usados para llevar a la práctica la invención también se pueden sintetizar, total o parcialmente, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica. Véase ,por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Hom (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Pa. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede realizar usando diversas técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) y se puede lograr la síntesis automatizada, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
En algunos modos de realización, el antígeno puede ser un antígeno purificado, por ejemplo, de aproximadamente un 25 % a un 50 % puro, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 75 % puro, de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 85 % puro, de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 90 % puro, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 95 % puro, de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 98 % puro, de aproximadamente un 98 % a aproximadamente un 99 % puro, o más de un 99 % puro.
Como se indica anteriormente, el término "antígeno" también incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido que funciona como un antígeno. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, el término "polinucleótido" engloba una cadena de nucleótidos de cualquier longitud (por ejemplo, 9, 12, 18, 24, 30, 60, 150, 300, 600, 1500 o más nucleótidos) o número de hebras (por ejemplo, monocatenario o bicatenario). Los polinucleótidos pueden ser ADN (por ejemplo, ADN genómico o ADNc) o ARN (por ejemplo, ARNm) o combinaciones de los mismos. Pueden ser naturales o sintéticos (por ejemplo, sintetizados químicamente). Se contempla que el polinucleótido puede contener modificaciones de una o más bases nitrogenadas, glúcidos pentosa o grupos fosfato en la cadena de nucleótidos. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica y pueden tener el propósito de, por ejemplo, mejorar la estabilidad del polinucleótido.
El polinucleótido se puede administrar de diversas formas. En algunos modos de realización, se puede usar un polinucleótido no marcado, en forma lineal, o bien insertado en un plásmido, tal como un plásmido de expresión. En otros modos de realización, se puede usar un vector vivo tal como un vector vírico o bacteriano.
Pueden estar presentes una o más secuencias reguladoras que favorecen la transcripción de ADN en ARN y/o la traducción de ARN en un polipéptido. En algunos casos, tales como en el caso de un polinucleótido que es una molécula de ARN mensajero (ARNm), no se requieren secuencias reguladoras relacionadas con el proceso de transcripción (por ejemplo, un promotor), y la expresión de proteínas se puede efectuar en ausencia de un promotor. El experto en la técnica puede incluir secuencias reguladoras adecuadas como requieran las circunstancias.
En algunos modos de realización, el polinucleótido está presente en un casete de expresión, en el que está enlazado de forma funcional a secuencias reguladoras que permitirán que el polinucleótido se exprese en el sujeto al que se administra la composición de la invención. La elección del casete de expresión depende del sujeto al que se administra la composición, así como de los rasgos característicos deseados para el polipéptido expresado.
Típicamente, un casete de expresión incluye un promotor que es funcional en el sujeto y puede ser constitutivo o inducible; un sitio de unión al ribosoma; un codón de iniciación (ATG) si es necesario; el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés; un codón de parada; y opcionalmente una región terminal 3' (finalizador de traducción y/o transcripción). Se pueden incluir secuencias adicionales, tales como una región que codifica un péptido señal. El polinucleótido que codifica el polipéptido de interés puede ser homólogo o heterólogo con respecto a cualquiera de las otras secuencias reguladoras en el casete de expresión. Las secuencias que se van a expresar conjuntamente con el polipéptido de interés, tales como una región que codifica el péptido señal, se localizan típicamente contiguas al polinucleótido que codifica la proteína que se va a expresar y se colocan en el marco de lectura apropiado. El marco abierto de lectura constituido por el polinucleótido que codifica la proteína que se va a expresar sola o conjuntamente con cualquier otra secuencia que se va a expresar (por ejemplo, el péptido señal), se coloca bajo el control del promotor de modo que se produzcan la transcripción y la traducción en el sujeto al que se administra la composición.
La cantidad de antígeno usada en un tratamiento individual con una composición como se describe en el presente documento puede variar dependiendo del tipo de antígeno y el tamaño del sujeto. Un experto en la técnica podrá determinar, sin experimentación excesiva, la cantidad eficaz de antígeno a usar en una aplicación particular. El término "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, quiere decir una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado deseado.
En otro modo de realización, el antígeno puede ser o comprender un epítopo de linfocito B que puede inducir una respuesta inmunitaria humoral. Por ejemplo, el antígeno puede ser o comprender un epítopo de linfocito B derivado de un virus, tal como, por ejemplo, el virus de la gripe o el virus respiratorio sincicial.
En otro modo de realización, el epítopo de linfocito B puede ser un epítopo derivado de la glucoproteína hemaglutinina del virus de la gripe H5N1.
En otro modo de realización, el antígeno puede ser o comprender un epítopo de linfocito B derivado de una bacteria, tal como, por ejemplo, Bordetella pertussis o Bacillus anthracis.
En otro modo de realización, el epítopo de linfocito B puede ser un epítopo de la proteína toxoide de la tosferina producida por Bordetella pertussis.
En otro modo de realización, el epítopo de linfocito B puede ser un epítopo del antígeno protector recombinante del carbunco.
En otro modo de realización, el antígeno puede ser o comprender un epítopo de linfocito B asociado con una enfermedad infecciosa.
En otro modo de realización, el antígeno puede ser o comprender un epítopo de linfocito B derivado de un protozoo, tal como del género Plasmodium.
En otro modo de realización, el antígeno puede ser un cáncer o una proteína asociada a un tumor, tal como, por ejemplo, un antígeno tumoral unido a la superficie de la membrana que se puede reconocer por un anticuerpo.
Los cánceres que se pueden tratar y/o prevenir por el uso o la administración de una composición de la invención incluyen, sin limitación, carcinoma, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, sarcoma, blastoma, mieloma y tumores de células germinativas. En un modo de realización, el cáncer puede estar provocado por un patógeno, tal como un virus. Los virus vinculados con el desarrollo del cáncer son conocidos por el experto en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, papilomavirus humano (VPH), virus de John Cunningham (JCV), virus del herpes humano 8, virus de Epstein-Barr (VEB), poliomavirus de células de Merkel, virus de la hepatitis C y virus de leucemia de linfocitos T humanos-1. Una composición de la invención se puede usar para el tratamiento o bien la profilaxis del cáncer, por ejemplo, en la reducción de la gravedad del cáncer o la prevención de las recidivas del cáncer. Los cánceres que se pueden beneficiar de las composiciones de la invención incluyen cualquier célula maligna que exprese uno o más antígenos específicos de tumor.
En otro modo de realización, el antígeno puede ser una toxina o un alérgeno que se puede neutralizar por un anticuerpo. En un modo de realización, la toxina es un estupefaciente tal como, por ejemplo, cocaína.
En otro modo de realización, el antígeno puede ser un antígeno asociado con una enfermedad donde es deseable secuestrar el antígeno en circulación, tal como, por ejemplo, una proteína amiloide (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer). Por tanto, una composición de la invención puede ser adecuada para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto que lo necesite, en la que la enfermedad neurodegenerativa está asociada con la expresión de un antígeno. El sujeto puede tener una enfermedad neurodegenerativa o puede tener riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa. Las enfermedades neurodegenerativas que se pueden tratar y/o prevenir por el uso o administración de una composición de la invención incluyen, sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Por ejemplo,
la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la asociación de placas p-amiloides y/o proteínas tau en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer (véase, por ejemplo, Goedert y Spillantini, Science, 314: 777-781, 2006). También se ha propuesto que el virus del herpes simple de tipo 1 desempeña un papel causal en personas que portan las versiones susceptibles del gen apoE (Itzhaki y Wozniak, J Alzheimers Dis 13: 393-405, 2008).
En otro modo de realización, la composición puede comprender una mezcla de epítopos de linfocitos B como antígenos para inducir una respuesta inmunitaria humoral. Los epítopos de linfocitos B se pueden unir para formar un polipéptido individual.
En otro modo de realización, el antígeno puede ser cualquier péptido o polipéptido que puede inducir una respuesta inmunitaria humoral específica a una conformación específica en células tumorales seleccionadas.
Epítopos T cooperadores
Los epítopos T cooperadores son una secuencia de aminoácidos (aminoácidos naturales o no naturales) que tienen actividad de T cooperador. Los epítopos T cooperadores son reconocidos por los linfocitos T cooperadores, que desempeñan un papel importante en el establecimiento y maximización de las capacidades del sistema inmunitario, y están implicados en la activación y dirección de otras células inmunitarias, tales como por ejemplo el cambio de clase de anticuerpos de linfocitos B.
Un epítopo T cooperador puede consistir en un epítopo continuo o discontinuo. Por consiguiente, no todos los aminoácidos de un T cooperador son necesariamente parte del epítopo. En consecuencia, los epítopos T cooperadores, que incluyen análogos y segmentos de epítopos T cooperadores, pueden potenciar o estimular una respuesta inmunitaria. Los epítopos T cooperadores inmunodominantes son ampliamente reactivos en poblaciones animales y humanas con tipos de MHC ampliamente divergentes (Celis et al. (1988) J. Immunol. 140:1808-1815; Demotz et al. (1989) J. Immunol. 142:394-402; Chong et al. (1992) Infect. Immun. 60:4640-4647). El dominio T cooperador de los péptidos en cuestión tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos y preferentemente, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 aminoácidos. Cuando están presentes múltiples epítopos T cooperadores, a continuación, cada epítopo T cooperador actúa independientemente.
En un modo de realización, la composición descrita en el presente documento también puede comprender al menos un epítopo T cooperador. En algunos casos, el epítopo T cooperador puede formar parte del antígeno. En particular, si el antígeno tiene un tamaño suficiente, puede contener un epítopo que funciona como un epítopo T cooperador. En otros modos de realización, el epítopo T cooperador es una molécula separada del antígeno.
En otro modo de realización, los análogos de epítopos T cooperadores pueden incluir sustituciones, deleciones e inserciones de desde uno a aproximadamente 10 residuos aminoacídicos en el epítopo T cooperador. Los segmentos de T cooperadores son porciones contiguas de un epítopo T cooperador que son suficientes para potenciar o estimular una respuesta inmunitaria. Un ejemplo de segmentos de T cooperadores es una serie de péptidos superpuestos que se derivan de un único péptido más largo.
Las fuentes de epítopos T cooperadores para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, epítopos de linfocitos T cooperadores del antígeno de superficie de la hepatitis B, epítopos de linfocitos T cooperadores de la toxina de la tosferina, epítopo de linfocito T cooperador de la proteína F del virus del sarampión, epítopo de linfocito T cooperador de la proteína de la membrana externa principal de Chlamydia tracomitis, epítopos de linfocitos T cooperadores de la toxina diftérica, epítopos de linfocitos T cooperadores del circumsporozoíto de Plasmodium falciparum, epítopos de linfocitos T cooperadores de la fosfato isomerasa de la triosa de Schistosoma mansoni, epítopos de las linfocitos T cooperadores de Escherichia coli TraT y análogos y segmentos inmunopotenciadores de cualquiera de estos epítopos T cooperadores.
En un modo de realización, el epítopo T cooperador es un epítopo T cooperador universal. Un epítopo T cooperador universal como se usa en el presente documento se refiere a un péptido u otra molécula inmunogénica, o un fragmento del mismo, que se une a una multiplicidad de moléculas de MHC de clase II de una manera que activa la función de los linfocitos T de una manera restringida a la clase II (linfocitos T CD4+).
En otro modo de realización, el epítopo T cooperador puede ser un epítopo T cooperador universal tal como PADRE (epítopo pan-DR) que comprende la secuencia peptídica AKXVAAWTLKAAA, en la que X puede ser ciclohexilalanilo. PADRE tiene específicamente un epítopo T cooperador CD4+, es decir, estimula la inducción de una respuesta de T cooperador CD4+ específica de PADRE.
El toxoide tetánico tiene epítopos T cooperadores que funcionan de manera similar a PADRE. Las toxinas del tétanos y la difteria tienen epítopos universales para las células CD4+ humanas. (Diethelm-Okita, B.M. et al., Universal epitopes for human CD4+ cells on tetanus and diphtheria toxins. J. Infect. Diseases, 181:1001-1009, 2000). En otro modo de realización, el epítopo T cooperador puede ser un péptido del toxoide tetánico tal como F21E que comprende la secuencia peptídica FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (aminoácidos 947-967).
En otro modo de realización, el epítopo T cooperador se fusiona con al menos un antígeno (es decir, un péptido), o una mezcla de antígenos, para producir un péptido de fusión.
Vehículos
El vehículo de la composición de la invención comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, preferentemente una sustancia hidrófoba líquida. La fase continua puede ser una sustancia hidrófoba esencialmente pura o una mezcla de sustancias hidrófobas.
Las sustancias hidrófobas que son útiles en las composiciones como se describe en el presente documento son aquellas que son farmacéutica y/o inmunológicamente aceptables. El vehículo es preferentemente un líquido, pero se pueden licuar determinadas sustancias hidrófobas que no son líquidas a temperatura atmosférica, por ejemplo, por calentamiento, y también son útiles en la presente invención. En un modo de realización, el vehículo hidrófobo puede ser una emulsión de solución salina tamponada con fosfato/adyuvante incompleto de Freund (PBS/FIA).
Las emulsiones de aceite o agua en aceite son vehículos en particular adecuados para su uso en la presente invención. Los aceites deben ser farmacéutica y/o inmunológicamente aceptables. Los aceites adecuados incluyen, por ejemplo, aceites de vaselina (especialmente aceite de vaselina fluido o de baja viscosidad, tal como Drakeol® 6VR), grasas vegetales (por ejemplo, aceite de soja), aceites de frutos secos (por ejemplo, aceite de cacahuete) o mezclas de los mismos. En un modo de realización, el aceite es un oleato de manida en solución de aceite de vaselina, disponible comercialmente como Montanide® ISA 51. También se pueden usar grasas animales y materiales poliméricos hidrófobos artificiales, en particular los que son líquidos a temperatura atmosférica o que se pueden licuar con relativa facilidad.
La composición de la invención es una suspensión de liposomas sin agua ("sin agua"). Es posible que el vehículo hidrófobo de estas composiciones "sin agua" pueda contener todavía pequeñas cantidades de agua, siempre que el agua esté presente en la fase no continua del vehículo. Por ejemplo, los componentes individuales de la composición pueden tener agua unida que puede no retirarse completamente por procedimientos tales como liofilización o evaporación y determinados vehículos hidrófobos pueden contener pequeñas cantidades de agua disuelta en los mismos. En general, las composiciones de la invención que se describen como "sin agua" contienen, por ejemplo, menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o 0,01 % de agua sobre una base peso/peso del peso total del componente vehículo de la composición.
Liposomas
Los liposomas son membranas de bicapa lipídica completamente cerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los liposomas pueden ser vesículas unilaminares (que poseen una única membrana bicapa) o vesículas multilaminares caracterizadas por bicapas multimembrana, cada bicapa puede estar separada o no de la siguiente por una capa acuosa. Se puede encontrar un análisis general de los liposomas en Gregoriadis G. Immunol. Today, 11:89-97, 1990; y Frezard, F., Braz. J. Med. Bio. Res., 32:181-189, 1999. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, el término "liposomas" pretende englobar todas las estructuras vesiculares de este tipo descritas anteriormente, incluyendo, sin limitación, las descritas en la técnica como "niosomas", "transferomas" y "virosomas".
Aunque se puede usar cualquier liposoma en la presente invención, incluyendo los liposomas preparados a partir de lípidos de arqueobacterias, los liposomas en particular útiles usan fosfolípidos y colesterol no esterificado en la formulación de liposomas. El colesterol se usa para estabilizar los liposomas y cualquier otro compuesto que estabiliza los liposomas puede reemplazar el colesterol. Otros compuestos estabilizadores de liposomas son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fosfolípidos saturados producen liposomas con mayores temperaturas de transición, lo que indica un incremento en la estabilidad.
Los fosfolípidos que se usan preferentemente en la preparación de liposomas son aquellos con al menos un grupo de cabeza seleccionado del grupo que consiste en fosfoglicerol, fosfoetanolamina, fosfoserina, fosfocolina y fosfoinositol. Son más preferentes los liposomas que comprenden lípidos que son fosfatidilcolina al 94-100 %. Dichos lípidos están disponibles comercialmente en la lecitina Phospholipon® 90 G. Cuando también se usa colesterol no esterificado en la formulación de liposomas, el colesterol se usa en una cantidad equivalente a aproximadamente un 10 % del peso del fosfolípido. Si se usa un compuesto distinto del colesterol para estabilizar los liposomas, un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad necesaria en la composición.
Las composiciones de liposomas se pueden obtener, por ejemplo, usando lípidos naturales, lípidos sintéticos, esfingolípidos, lípidos éter, esteroles, cardiolipina, lípidos catiónicos y lípidos modificados con poli(etilenglicol) y otros polímeros. Los lípidos sintéticos pueden incluir los siguientes constituyentes de ácidos grasos; dodecanoílo, tetradecanoílo, palmitoílo, estearoílo, araquidoílo, oleoílo, linoleoílo, erucoílo o combinaciones de estos ácidos grasos.
Composiciones
También se divulgan procedimientos de preparación de una composición de la invención.
Los procedimientos para fabricar liposomas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Gregoriadis (1990) y Frezard (1999), ambos citados previamente. En la práctica de la invención se puede usar cualquier procedimiento adecuado para fabricar liposomas, o se pueden obtener liposomas de una fuente comercial. Los liposomas se preparan típicamente hidratando los componentes de los liposomas que formarán la bicapa lipídica (por ejemplo, fosfolípidos y colesterol) con una solución acuosa, que puede ser agua pura o una solución de uno o más componentes disueltos en agua, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina sin fosfatos o cualquier otra solución acuosa fisiológicamente compatible.
En un modo de realización, un componente de liposoma o una mezcla de componentes de liposomas, tales como un fosfolípido (por ejemplo, Phospholipon® 90G) y colesterol, se puede solubilizar en un disolvente orgánico, tal como una mezcla de cloroformo y metanol, seguido de filtración (por ejemplo, un filtro de 0,2 pm de PTFE) y secado, por ejemplo, por evaporación rotatoria, para retirar los disolventes.
La hidratación de la mezcla de lípidos resultante se puede efectuar, por ejemplo, inyectando la mezcla de lípidos en una solución acuosa o sometiendo a ultrasonido la mezcla de lípidos y una solución acuosa. Durante la formación de los liposomas, los componentes de los liposomas forman bicapas individuales (unilaminares) o múltiples bicapas (multilaminares) que rodean un volumen de la solución acuosa con la que se hidratan los componentes de los liposomas.
En algunos modos de realización, a continuación se deshidratan los liposomas, tal como por liofilización.
Los liposomas se combinan con el vehículo que comprende una fase hidrófoba continua. Esto se puede hacer de una variedad de maneras.
Si el vehículo se compone solo de una sustancia hidrófoba o una mezcla de sustancias hidrófobas (por ejemplo, uso de un vehículo de aceite de vaselina al 100%), los liposomas se pueden mezclar simplemente con la sustancia hidrófoba, o si existen múltiples sustancias hidrófobas, mezclar con una cualquiera o una combinación de ellas.
Si, en cambio, el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba contiene una fase acuosa discontinua, el vehículo típicamente adoptará la forma de una emulsión de la fase acuosa en la fase hidrófoba, tal como una emulsión de agua en aceite. Dichas composiciones pueden contener un emulsionante para estabilizar la emulsión y para promover una distribución uniforme de los liposomas. A este respecto, los emulsionantes pueden ser útiles incluso si se usa un vehículo sin agua, con el propósito de promover una distribución uniforme de los liposomas en el vehículo. Los emulsionantes típicos incluyen oleato de manida (Arlacel™ A), lecitina (por ejemplo, lecitina S100), un fosfolípido, Tween™ 80 y Spans™ 20, 80, 83 y 85. Típicamente, la proporción en volumen (v/v) de sustancia hidrófoba a emulsionante está en el intervalo de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1, siendo preferente una proporción de aproximadamente 10:1.
Se pueden añadir los liposomas a la emulsión finalizada o pueden estar presentes en la fase acuosa o bien en la fase hidrófoba antes de la emulsión.
El antígeno se puede introducir en diversas fases diferentes del procedimiento de formulación. Se puede incorporar más de un tipo de antígeno en la composición (por ejemplo, un virus inactivado, un virus vivo atenuado, una proteína o un polipéptido).
En algunos modos de realización, el antígeno está presente en la solución acuosa usada para hidratar los componentes que se usan para formar las bicapas lipídicas de los liposomas (por ejemplo, fosfolípido(s) y colesterol). En este caso, el antígeno se encapsulará en el liposoma, presente en su interior acuoso. Si los liposomas resultantes no se lavan o se secan, de modo que exista una solución acuosa residual presente que finalmente se mezcla con el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, es posible que pueda estar presente antígeno adicional fuera de los liposomas en el producto final. En una técnica relacionada, el antígeno se puede mezclar con los componentes usados para formar las bicapas lipídicas de los liposomas, antes de la hidratación con la solución acuosa. El antígeno también se puede añadir a liposomas preformados, en este caso el antígeno se puede cargar activamente en los liposomas o unir a la superficie de los liposomas o el antígeno puede permanecer externo a los liposomas. En dichos modos de realización, antes de la adición de antígeno, los liposomas preformados pueden ser liposomas vacíos (por ejemplo, que no contienen antígeno encapsulado o adyuvante a base de lípidos) o los liposomas preformados pueden contener adyuvante a base de lípidos incorporado en o asociado con los liposomas. Estas etapas se pueden producir preferentemente antes de mezclar con el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.
En un enfoque alternativo, el antígeno se puede mezclar en cambio con el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, antes, durante o después de que el vehículo se combine con los liposomas. Si el vehículo es una emulsión, el antígeno se puede mezclar con cualquiera o ambas de la fase acuosa o la fase hidrófoba antes de la emulsificación. De forma alternativa, el antígeno se puede mezclar con el vehículo después de la emulsificación.
La técnica de combinar el antígeno con el vehículo se puede usar conjuntamente con la encapsulación del antígeno en los liposomas como se describe anteriormente, de modo que el antígeno esté presente tanto dentro de los liposomas como en el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.
Los procedimientos descritos anteriormente para introducir el antígeno en la composición se aplican también al adyuvante de las composiciones de la presente invención. Es decir, el adyuvante se puede introducir en, por ejemplo, uno cualquiera o más de: (1) la solución acuosa usada para hidratar los componentes que se usan para formar las bicapas lipídicas de los liposomas; (2) la solución acuosa después de la formación de las bicapas lipídicas de los liposomas; (3) los componentes usados para formar las bicapas lipídicas de los liposomas; o (4) el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, antes, durante o después de que el vehículo se combine con los liposomas. Si el vehículo es una emulsión, el adyuvante se puede mezclar con cualquiera o ambas de la fase acuosa o la fase hidrófoba antes, durante o después de la emulsificación.
La técnica de combinar el adyuvante con el vehículo se puede usar conjuntamente con la encapsulación del adyuvante en los liposomas, o con la adición del adyuvante a los liposomas, de modo que el adyuvante esté presente dentro y/o fuera de los liposomas y en el vehículo que comprende un fase continua de una sustancia hidrófoba.
El adyuvante se puede incorporar en la composición conjuntamente con el antígeno en la misma etapa de procesamiento, o por separado, en una etapa de procesamiento diferente. Por ejemplo, tanto el antígeno como el adyuvante pueden estar presentes en la solución acuosa usada para hidratar los componentes del liposoma que forman la bicapa lipídica, de modo que tanto el antígeno como el adyuvante se encapsulan en los liposomas. De forma alternativa, el antígeno se puede encapsular en los liposomas y el adyuvante se puede mezclar con el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba. En otro modo de realización, el adyuvante se puede incorporar a la composición después de la etapa de encapsulación de antígeno haciendo pasar la preparación de liposoma-antígeno a través de una miniextrusora manual y a continuación, mezclando la preparación de liposomaantígeno obtenida con el adyuvante a base de lípidos en, por ejemplo, tampón de fosfato. El adyuvante también se puede incorporar a la composición, solo o bien conjuntamente con el antígeno, después de que se han formado los liposomas, de modo que el adyuvante se pueda asociar o permanecer externo a los liposomas. El adyuvante también se puede incorporar o asociar con liposomas antes de la adición del antígeno, permaneciendo el antígeno fuera de los liposomas preformados o se puede cargar en/asociar con los liposomas por procesamiento adicional. En dichos modos de realización, la preparación de liposoma-antígeno-adyuvante resultante se puede liofilizar y a continuación, reconstituir en el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba. Se apreciará que son posibles muchas de dichas combinaciones.
Si la composición contiene uno o más adyuvantes adicionales, dichos adyuvantes adicionales se pueden incorporar en la composición de modo similar a como se describe anteriormente para el adyuvante o combinando varios de dichos procedimientos que puedan ser adecuados para el/los adyuvante(s) adicional(es).
Se pueden añadir a dichas composiciones estabilizantes tales como glúcidos, antioxidantes o conservantes que mantienen la actividad biológica o mejoran la estabilidad química para prolongar la vida útil del antígeno, adyuvante, los liposomas o el vehículo hidrófobo continuo.
En algunos modos de realización, se puede usar una mezcla de antígeno/adyuvante, en este caso el antígeno y el adyuvante se incorporan en la composición al mismo tiempo. Una "mezcla de antígeno/adyuvante" se refiere a un modo de realización en el que el antígeno y el adyuvante están en el mismo diluyente al menos antes de su incorporación a la composición. El antígeno y el adyuvante en una mezcla de antígeno/adyuvante pueden, pero no necesariamente necesitan, estar químicamente enlazados, tal como por enlace covalente.
En algunos modos de realización, el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba puede tener por sí mismo actividad adyuvante. El adyuvante incompleto de Freund es un ejemplo de un vehículo hidrófobo con efecto adyuvante. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, cuando se usa el término "adyuvante", se pretende que indique la presencia de un adyuvante además de cualquier actividad adyuvante proporcionada por el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.
En un modo de realización, para formular una composición de la invención, se hidrata una mezcla homogénea de lecitina S100 y colesterol (por ejemplo, 10:1 p:p) en presencia de un antígeno, opcionalmente en tampón fosfato, para formar liposomas con antígeno encapsulado. A continuación, la preparación de liposomas se puede extrudir, opcionalmente a través de una miniextrusora manual, y mezclar con el adyuvante, opcionalmente en tampón fosfato, para incorporar el adyuvante. A continuación, esta suspensión se puede liofilizar y reconstituir en un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba para formar una suspensión de liposomas sin agua.
En algunos modos de realización, la composición se puede formular hidratando una mezcla homogénea de lecitina S100 y colesterol (por ejemplo, 10:1 p:p) en presencia de un antígeno y un adyuvante adecuado (por ejemplo, Pam-3-Cys), opcionalmente en tampón fosfato, para formar liposomas con antígeno y adyuvante encapsulados. A continuación, la preparación de liposomas/antígeno/adyuvante se puede diluir hasta una cantidad suficiente, opcionalmente usando agua, y liofilizarse. A continuación, los liposomas liofilizados se pueden reconstituir en un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba (por ejemplo, aceite de vaselina o Montanide® ISA 51) para formar una suspensión de liposomas sin agua.
En algunos modos de realización, la composición se puede formular hidratando una mezcla homogénea de dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) y colesterol (por ejemplo, 10:1 p:p) en presencia de un antígeno y un adyuvante adecuado (por ejemplo, Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4), opcionalmente en tampón fosfato, para formar liposomas encapsulados con antígeno y adyuvante. A continuación, la preparación de liposomas/antígeno/adyuvante se puede liofilizar y reconstituirse el producto resultante en un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba (por ejemplo, aceite de vaselina o Montanide® ISA 51) para formar una suspensión de liposomas sin agua.
De forma alternativa, el antígeno o complejo antígeno/adyuvante puede estar asociado, en contacto con o separado de los liposomas y no encapsulado en liposomas. La eficacia de la encapsulación en liposomas de algunos antígenos hidrófilos o complejos antígeno/adyuvante hidrófilos puede ser deficiente, de modo que tras colocarlos en un entorno hidrófobo o liofilizarlos, la mayor parte del antígeno se asocia con la superficie externa de los liposomas. Esto representa otro modo de realización de la invención.
En otro modo de realización, un antígeno (péptido o polipéptido) que tiene un epítopo de linfocito B y PADRE (fusionado al antígeno o separado) se pueden encapsular juntos en liposomas. En otro modo de realización, se pueden colocar juntos más de un antígeno en los mismos liposomas. En otro modo de realización, se pueden usar otras sustancias en lugar de PADRE que tengan un epítopo T cooperador, por ejemplo, péptido(s) de toxoide tetánico. En otro modo de realización, también se puede encapsular en los liposomas un adyuvante, preferentemente un adyuvante basado en ácido palmítico que comprende PAIVhCys o PAIV^Cys. Los liposomas se suspenden preferentemente en PBS. A continuación, esta suspensión se emulsiona en un vehículo hidrófobo, tal como, por ejemplo, ISA51 o aceite de vaselina. El resultado es que los liposomas que contienen el/los antígeno(s) y el/los adyuvante(s) se suspenden en PBS que a su vez se emulsiona en un vehículo hidrófobo, por ejemplo, ISA51 o aceite de vaselina.
En un modo de realización, los valores de anticuerpos obtenidos de ratones a los que se les inyectó por vía intramuscular una dosis única de una composición de la invención que comprende liposomas/proteína hemaglutinina recombinante H5N1 (antígeno)/Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4 (adyuvante)/vehículo hidrófobo (vacuna A) se potenciaron significativamente a las tres, cuatro y ocho semanas después de la inmunización en comparación con los ratones tratados (y con refuerzo administrado) con una vacuna de control acuosa basada en aluminio (figura 1). Por ejemplo, la vacuna A de la invención pudo generar valores de anticuerpos de criterio de valoración a las tres y cuatro semanas después de la vacunación de hasta 1/2.048.000 y hasta 1/8.192.000 a las ocho semanas después de la vacunación, mientras que los valores de anticuerpos de criterio de valoración para la vacuna de control fueron sólo de hasta 1/512.000, 1/256.000 y 1/4.096.000 a las tres, cuatro y ocho semanas después de la vacunación, respectivamente. Estos resultados indican que las composiciones de la invención pueden generar, tras una dosis única, una respuesta inmunitaria humoral in vivo potenciada en comparación con una vacuna de control acuosa basada en alumbre única o reforzada.
En un modo de realización, la inmunización de ratones por tratamiento único con una composición de la invención que comprende liposomas/proteína toxoide de la tosferina (antígeno)/Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4 (adyuvante)/vehículo hidrófobo (vacuna B) pudo reducir los recuentos pulmonares bacterianos de tanto como 6,2 x 10A4 ufc por pulmón el día 8 después de la exposición a Bordetella pertussis a 0 ufc por pulmón el día 15 después de la exposición (figura 2). Estos resultados indican que una dosis única de una composición de la invención protege eficazmente a los ratones de la exposición bacteriana y les permite curarse completamente de la infección de los pulmones.
En un modo de realización, los valores de anticuerpos obtenidos de conejos a los que se les inyectó por vía intramuscular una dosis única de una composición de la invención que comprende liposomas/antígeno protector recombinante de carbunco (antígeno)/Pam-3-Cys (adyuvante)/vehículo hidrófobo (vacuna C) se potenciaron significativamente en comparación con los conejos tratados con una vacuna de control acuosa basada en aluminio en los puntos de tiempo tempranos (antes del refuerzo) (figura 3). Por ejemplo, la vacuna C de la invención pudo generar valores de anticuerpos de criterio de valoración a las tres y cuatro semanas después de la vacunación de hasta 1/2.048.000 y hasta 1/8.192.000 a las ocho semanas después de la vacunación, mientras que los valores de anticuerpos de criterio de valoración para la vacuna de control fueron solo de hasta 1/ 64.000, 1/256.000 y 1/2.048.000 a las tres, cuatro y ocho semanas después de la vacunación, respectivamente. Estos resultados indican que las composiciones de la invención pueden generar una respuesta inmunitaria humoral in vivo sorprendentemente fuerte tan temprano como tres semanas después de una vacunación única.
En un modo de realización, los valores de anticuerpos obtenidos de ratones a los que se les inyectó por vía intramuscular una dosis única de la vacuna A de la invención (grupo 1) se potenciaron significativamente en comparación con la administración de dosis única de composiciones de control sin liposomas (grupo 2), sin vehículo hidrófobo (grupo 3) o sin adyuvante a base de lípidos (grupo 4) (figura 4). Por ejemplo, la vacuna C de la invención pudo generar valores de anticuerpos de criterio de valoración a las ocho semanas después de la vacunación de hasta 1/2.048.000, mientras que los grupos 2, 3 y 4 solo pudieron generar valores de anticuerpos de criterio de valoración en el mismo punto de tiempo de 1/64.000, 1/128.000 y 1/128.000, respectivamente. Estos resultados muestran que las composiciones de la invención que comprenden cada uno de: un antígeno, liposomas, un adyuvante a base de lípidos y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba, pueden generar respuestas inmunitarias humorales in vivo consistentes y duraderas.
Las composiciones como se describen en el presente documento se pueden formular en una forma que sea adecuada para la administración oral, nasal, rectal o parenteral. La administración parenteral incluye los modos de administración intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intramuscular, transepitelial, intrapulmonar, intratecal y tópica. Las vías preferentes son intramuscular, subcutánea e intradérmica para lograr un efecto de liberación lenta.
El experto en la técnica puede determinar regímenes de tratamiento, vías de administración, dosificaciones, etc., adecuados para cualquier aplicación particular para lograr el resultado deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen, por ejemplo: la naturaleza del antígeno; el estado de enfermedad que se va a prevenir o tratar; la edad, condición física, peso corporal, sexo y dieta del sujeto; y otros factores clínicos. Véase, por ejemplo, "Vaccine Handbook", editado por Researcher's Associates (Gaku-yuu-kai) del The National Institute of Health (1994); "Manual of Prophylactic Inoculation, 8.a edición", editado por Mikio Kimura, Munehiro Hirayama y Harumi Sakai, Kindai Shuppan (2000); "Minimum Requirements for Biological Products", editado por la Association of Biologicals Manufacturers of Japan (1993).
La cantidad óptima de adyuvante y antígeno para provocar una respuesta inmunitaria óptima puede depender de una serie de factores que incluyen, sin limitación, la composición, la enfermedad, el sujeto, y se pueden establecer fácilmente por el experto en la técnica usando estudios estándar que incluyen, por ejemplo, observaciones de valores de anticuerpos y otras respuestas inmunogénicas en el huésped.
Las composiciones como se describen en el presente documento pueden ser eficaces cuando se administran en una aplicación única.
En otro modo de realización, las composiciones como se describen en el presente documento se pueden usar en combinación, antes o después, con otros tratamientos.
Kits y reactivos
La presente invención se proporciona opcionalmente a un usuario como un kit. Por ejemplo, un kit contiene una o más de las composiciones de la invención. El kit puede comprender además uno o más reactivos adicionales, material de envasado, recipientes para contener los componentes del kit y un conjunto de instrucciones o manual de usuario que detalla los procedimientos preferentes de uso de los componentes del kit.
La invención se ilustra además por los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Se obtuvieron ratones CD1 hembra sin patógenos, de 6 a 8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) y se alojaron de acuerdo con las pautas institucionales con agua y alimentos a voluntad, bajo circulación de aire controlada por filtro.
La proteína hemaglutinina recombinante H5N1 se adquirió en Protein Sciences (Meridien, CT, EE. UU.). Esta proteína recombinante tiene un peso molecular aproximado de 72.000 dalton y corresponde a la glucoproteína hemaglutinina, una proteína antigénica presente en la superficie del virus de la gripe H5N1. Esta proteína recombinante, a continuación en el presente documento denominada rHA, se usó como antígeno modelo para someter a prueba la eficacia de las formulaciones de vacunas. Se usó rHA a 1 microgramo por dosis de 50 microlitros.
La eficacia de la vacuna se evaluó por un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un procedimiento que permite la detección de niveles de anticuerpos específicos de antígeno en el suero de animales inmunizados. Realizar el ELISA en sueros recogidos de ratones inmunizados en un intervalo habitual (cada cuatro semanas, por ejemplo) es útil para supervisar las respuestas de anticuerpos a una formulación de vacuna dada. En resumen, una placa de microvaloración de 96 pocillos se recubre con antígeno (rHA, 1 microgramo/mililitro) durante la noche a 4 grados Celsius, se bloquea con gelatina al 3 % durante 30 minutos, a continuación se incuba durante la noche a 4 grados Celsius con diluciones seriadas de sueros, comenzando típicamente a una dilución de 1/2000. A continuación, se añade a cada pocillo un reactivo secundario (proteína G conjugada con fosfatasa alcalina, EMD chemicals, Gibbstown, NJ, EE. UU.) a una dilución 1/500 durante una hora a 37 grados Celsius. Después de una incubación de 60 minutos con una solución que contiene 1 miligramo/mililitro de sal disódica de fosfato de 4-nitrofenilo hexahidrato (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suiza), se mide la absorbancia a 405 nanómetros de cada pocillo usando un lector de placas de microvaloración (ASYS Hitech GmbH, Austria). Los valores de criterio de valoración se calculan como se describe en Frey A. et al. (Journal of Immunological Methods, 1998, 221:35-41). Los valores calculados representan la dilución más alta a la que se observa un incremento estadísticamente significativo de la absorbancia en muestras de suero de ratones inmunizados frente a muestras de suero de ratones de control no inmunizados sin exposición previa. Los valores se presentan como valores log10 de la dilución de criterio de valoración.
Para formular la vacuna correspondiente a la invención, se hidrató una mezcla homogénea 10:1 p:p de lecitina S100 y colesterol (Lipoid GmbH, Alemania) en presencia de rHA en tampón fosfato para formar liposomas con rHA encapsulado. En resumen, se añadieron 20 microgramos de rHA en 775 microlitros de tampón fosfato 50 milimolar (pH 7,4) a 132 miligramos de la mezcla de lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente 900 microlitros de una suspensión de liposomas que encapsulaban el antígeno rHA. A continuación, se extrudió la preparación de liposomas haciendo pasar el material a través de una miniextrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, EE. u U.) equipada con una membrana de policarbonato de 200 nanómetros. Para incorporar el adyuvante, la mezcla de liposomas dimensionada se mezcló minuciosamente con 20 microgramos de adyuvante Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4 (denominado P3C) (EMC Microcollections GmbH, Alemania) en 100 microlitros de tampón fosfato. Después de diluir la mezcla final a la mitad usando agua, la suspensión de liposomas se liofilizó usando el liofilizador Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, EE. UU.). Por cada 1 mililitro de suspensión de liposomas original que contenía rHA y P3C, se usaron 800 microlitros de un vehículo de aceite de vaselina equivalente al adyuvante incompleto de Freund (conocido como Montanide® ISA 51, suministrado por Seppic, Francia) para reconstituir los liposomas liofilizados para formar una suspensión de liposomas sin agua. Cada dosis de vacuna consistía en 50 microlitros de la formulación descrita anteriormente que contenía liposomas, antígeno rHA, adyuvante P3C y el vehículo de aceite de vaselina. Esta formulación de vacuna se denominará sin agua/ liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo.
La eficacia de la formulación de liposomas sin agua descrita anteriormente se comparó con la eficacia de una vacuna de control que consistía en 1 microgramo de rHA y 50 microgramos de hidróxido de aluminio (Alhidrogel, Sigma, Mississauga, ON, Canadá, a continuación en el presente documento denominado alumbre) en 50 microlitros de tampón fosfato 50 milimolar (pH 7,4). A un grupo de ratones (N = 9) se les inyectó una vez (sin refuerzo) 1 microgramo de antígeno rHA y 1 microgramo de adyuvante P3C formulados en 50 microlitros de sin agua/ liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo como se describe anteriormente. Los ratones del grupo 2 (N = 8) se vacunaron dos veces (día 0 y día 28) con 1 microgramo de rHA y 50 microgramos de adyuvante de alumbre suspendido en tampón fosfato 50 milimolar. Todos los ratones se vacunaron por vía intramuscular en la región del flanco y se recogieron muestras de suero a las 3, 4 y 8 semanas después de la inmunización. Los valores de anticuerpos de rHA en estos sueros se examinaron por ELISA como se describe anteriormente.
Los resultados de este experimento se muestran en la figura 1. Los ratones del grupo 2 generaron una respuesta de anticuerpos específicos de antígeno detectable tras la administración de una vacuna de control con adyuvante de alumbre. Los ratones del grupo 1, vacunados con la formulación sin agua/ liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo, proporcionaron valores de criterio de valoración significativamente potenciados en comparación con los del grupo 2. Los ratones del grupo 2 generaron valores de hasta 1/512.000 (valor Iog10 de 5,71) y de hasta 1/256.000 (valor log10 de 5,41) a las tres y cuatro semanas respectivamente (antes del refuerzo) y de hasta 1/4.096.000 (log10 igual a 6,61) a las ocho semanas después de la vacunación (después del refuerzo). La presencia de dichas respuestas de anticuerpos confirma una respuesta inmunitaria genuina generada como resultado de la vacunación. Los ratones del grupo 1, vacunados con la vacuna correspondiente a la invención, pudieron generar valores de criterio de valoración que alcanzaron hasta 1/2.048.000 (valor Iog10 de 6,31) a las tres y cuatro semanas después de la vacunación y 1/8.192.000 (valor log10 de 6,91) a las ocho semanas después de la inmunización. Estos resultados indican que las formulaciones sin agua/ liposomas/ vehículo hidrófobo de dosis única que contienen un adyuvante de ácido palmítico pueden generar una respuesta inmunitaria potenciada in vivo en comparación con una vacuna de control acuosa basada en alumbre única (puntos de datos de la semana 3 y la semana 4) o con refuerzo (punto de datos de la semana 8).
Ejemplo 2
Se obtuvieron ratones Balb/C hembra adultos jóvenes sin patógenos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) y se alojaron de acuerdo con las pautas institucionales con agua y alimentos a voluntad, bajo circulación de aire controlada por filtro.
La proteína toxoide de la tosferina se obtuvo de Biocine (Connaught Biosciences, Toronto, ON, Canadá). Esta proteína de múltiples subunidades tiene un peso molecular aproximado de 106 kilodalton y corresponde a una toxina antigénica producida por Bordetella pertussis, la bacteria causante de la tosferina. Esta proteína, a continuación en el presente documento denominada Pt, se usó como antígeno modelo para someter a prueba la eficacia de las formulaciones de vacunas. Se usó PT a 1 microgramo por dosis de 50 microlitros.
La eficacia de la vacuna se evaluó por la exposición a bacterias vivas de Bordetella pertussis. Los ratones se expusieron por inoculación en aerosol a 9,1 x 10A8 Bordetella pertussis, 56 días después de la vacunación. Se sacrificaron de inmediato varios ratones para establecer los recuentos pulmonares bacterianos de referencia. Los ratones restantes se supervisaron y sacrificaron a los ocho y quince días después de la exposición y se establecieron los recuentos pulmonares bacterianos.
Para formular la vacuna correspondiente a la invención, se hidrató una mezcla homogénea 10:1 p:p de DOPC y colesterol (Lipoid GmbH, Alemania) en presencia de PT y Pam-3-Cys-Ser-(Lys)4 (denominada P3C) en tampón fosfato para formar liposomas con PT y P3C encapsulados. En resumen, se añadieron 20 microgramos de cada uno de PT y P3C en 850 microlitros de tampón fosfato 50 milimolar a 132 miligramos de la mezcla de lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente un mililitro de una suspensión de liposomas que encapsulaba el antígeno PT y el adyuvante P3C. A continuación, la preparación de liposomas se liofilizó usando el liofilizador Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, EE. UU.). Por cada mililitro de suspensión de liposomas original que contenía PT y P3C, se usaron 800 microlitros de un vehículo de aceite de vaselina equivalente al adyuvante incompleto de Freund (conocido como Montanide® ISA 51, suministrado por Seppic, Francia) para reconstituir los liposomas liofilizados para formar una suspensión de liposomas sin agua. Cada dosis de vacuna consistía en 50 microlitros de la formulación descrita anteriormente que contenía liposomas, antígeno PT, adyuvante P3C y el vehículo de aceite de vaselina. Esta formulación de vacuna se denominará sin agua/ liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo.
La eficacia de la formulación de liposomas sin agua descrita anteriormente se comparó con la eficacia de una vacuna de control que consistía en 1 microgramo de PT y 100 microgramos de adyuvante de hidróxido de aluminio (Alhydrogel, Sigma, Mississauga, ON, Canadá, a continuación en el presente documento denominado alumbre) en 100 microlitros de tampón fosfato 50 milimolar (pH 7,0). A un grupo de ratones (N = 11) se les inyectó una vez (sin refuerzo) 1 microgramo de antígeno PT y 1 microgramo de adyuvante P3C formulados en 50 microlitros de sin agua/ liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo como se describe anteriormente. Los ratones del grupo 2 (N = 9) y los ratones del grupo 3 (N = 9) se vacunaron una vez o tres veces (día 0, día 21 y día 31) con 1 microgramo de PT y 100 microgramos de adyuvante de alumbre suspendido en 100 microlitros de tampón fosfato. Los ratones se vacunaron por vía intramuscular en la región del flanco. Los ratones del grupo 4 (N = 10) permanecieron sin vacunar durante la duración del estudio. Todos los ratones se expusieron el día 56 después de la inmunización y se establecieron los recuentos pulmonares bacterianos 8 y 15 días después de la exposición como se describe anteriormente.
Los resultados de este experimento se muestran en la figura 2. Los ratones del grupo 4 (sin exposición previa) no se pudieron curar de la infección, los recuentos bacterianos fueron tanto como 2,5 x 10A5 ufc por pulmón a los 8 días después de la exposición y 4,7 x 10A3 ufc por pulmón a los 15 días después de la exposición. Los ratones del grupo 2, vacunados con una dosis de la vacuna de control con adyuvante de alumbre, tenían recuentos pulmonares bacterianos de tanto como 8,9 x 10A3 y 3,1 x 10A2 ufc por pulmón a los 8 y 15 días después de la exposición, respectivamente. Los ratones del grupo 3 vacunados con tres dosis del control tenían recuentos pulmonares de tanto como 3,5 x 10A3 y 1,8 x 10A3 ufc por pulmón en los mismos puntos de tiempo respectivos. Los ratones del grupo 1, vacunados con una dosis única de la vacuna correspondiente a la invención, tenían un recuento pulmonar bacteriano de tanto como 6,2 x 10A4 ufc por pulmón a los 8 días después de la exposición y 0 ufc por pulmón en todos los animales el día 15 después de la exposición. Una dosis única de la vacuna correspondiente a la invención protegió eficazmente a los ratones de la exposición bacteriana y les permitió curarse completamente de la infección de los pulmones.
Ejemplo 3
Se obtuvieron conejos blancos de Nueva Zelanda hembra sin patógenos, de 2-3 kg de peso, de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) y se alojaron de acuerdo con las pautas institucionales con agua y alimentos a voluntad, bajo circulación de aire controlada por filtro.
El antígeno protector recombinante del carbunco se adquirió de List Biologics (Campbell, CA). Esta proteína recombinante tiene un peso molecular aproximado de 83.000 dalton y corresponde a la proteína antigénica protectora, un componente de unión celular de la exotoxina de tres proteínas producida por un Bacillus anthracis. Esta proteína recombinante, a continuación en el presente documento denominada rPA, se usó como antígeno modelo para someter a prueba la eficacia de las formulaciones de vacunas. Se usó rPA a 8 microgramos por dosis de 100 microlitros.
La eficacia de la vacuna se evaluó por un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un procedimiento que permite la detección de niveles de anticuerpos específicos de antígeno en el suero de animales inmunizados. Realizar el ELISA en sueros recogidos de ratones inmunizados en un intervalo habitual (cada cuatro semanas, por ejemplo) es útil para supervisar las respuestas de anticuerpos a una formulación de vacuna dada. El ELISA se realizó como se resume en el ejemplo 1, usando rPA a 1 microgramo/mililitro como antígeno de recubrimiento.
Para formular la vacuna correspondiente a la invención, se hidrató una mezcla homogénea 10:1 p:p de lecitina DOPC y colesterol (Lipoid GmbH, Alemania) en presencia de rPA y Pam-3-Cys (P3C) para formar liposomas con rPA y P3C encapsulados. En resumen, se añadieron 80 microgramos de rPA y 20 microgramos de p 3c en 850 microlitros de agua estéril a 132 miligramos de la mezcla de lecitina DOPC/colesterol para formar aproximadamente un mililitro de una suspensión de liposomas que encapsulaba el antígeno rPA y el adyuvante P3C. Después de diluir hasta una cantidad suficiente usando agua estéril, la suspensión de liposomas se liofilizó usando el liofilizador Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, EE. UU.). Por cada 1 mililitro de suspensión de liposomas original que contenía rPA y P3C, se usaron 800 microlitros de un vehículo de aceite de vaselina equivalente al adyuvante incompleto de Freund (conocido como Montanide® ISA 51, suministrado por Seppic, Francia) para reconstituir los liposomas liofilizados para formar una suspensión de liposomas sin agua. Cada dosis de vacuna consistía en 100 microlitros de la formulación descrita anteriormente que contenía liposomas, antígeno rPA, adyuvante P3C y el vehículo de aceite de vaselina. Esta vacuna se denomina vacuna C (invención).
La eficacia de la formulación de la vacuna descrita anteriormente se comparó con la eficacia de una vacuna de control que consistía en 8 microgramos de rPA y 350 microgramos de adyuvante de hidróxido de aluminio (Alhydrogel) (Sigma, Mississauga, ON, Canadá) en 100 microlitros de agua estéril. A un grupo de conejos (N = 8) se les inyectó una vez (sin refuerzo) 8 microgramos de antígeno rPA y 2 microgramos de adyuvante P3C formulados en 100 microlitros de formulación de vacuna como se describe anteriormente (grupo 1). Los conejos del grupo 2 (N = 8) se vacunaron tres veces (día 0, 28 y 84) con 8 microgramos de rPA y 350 microgramos de adyuvante de alumbre suspendido en agua estéril. Todos los conejos se vacunaron por vía intramuscular en el músculo gemelo derecho y se recogieron muestras de suero a las 3, 4, 8, 12, 16, 20 y 24 semanas después de la inmunización. Los valores de anticuerpos de rPA en estos sueros se examinaron por ELISA como se describe anteriormente.
Los resultados de este experimento se muestran en la figura 3. Los conejos del grupo 2 generaron una respuesta de anticuerpos específicos de antígeno detectable tras la administración de una vacuna de control con adyuvante de alumbre. Los conejos del grupo 1, vacunados con la formulación de la vacuna C, proporcionaron valores de criterio de valoración significativamente potenciados en comparación con los del grupo 2, en los puntos de tiempo tempranos (antes del refuerzo). Los conejos del grupo 2 generaron valores de hasta 1/64.000 (valor log10 promedio de 4,66) y de hasta 1/256.000 (valor log10 promedio de 4,73) a las tres y cuatro semanas respectivamente (antes del refuerzo) y de hasta 1/2.048.000 (valor log10 promedio igual a 5,86) a las ocho semanas después de la vacunación (después del refuerzo). La presencia de dichas respuestas de anticuerpos confirma una respuesta inmunitaria genuina generada como resultado de la vacunación. Los conejos del grupo 1, vacunados con la vacuna correspondiente a la invención, pudieron generar valores de criterio de valoración que alcanzaron hasta 1/2.048.000 (valor log10 promedio de 6,20 y 6,09) a las tres y cuatro semanas después de la vacunación y 1/8.192.000 (valor log10 promedio de 6,53) a las ocho semanas después de la inmunización. Estos resultados muestran que las formulaciones de liposomas/vehículos hidrófobos de dosis única que contienen un adyuvante Pam-3-Cys pueden generar en promedio 34,6 veces y 22,9 veces (a las tres y cuatro semanas respectivamente) más anticuerpos in vivo de los que se podrían lograr con una vacuna de control con alumbre acuosa, demuestran la capacidad de producir una respuesta inmunitaria sorprendentemente fuerte tan temprano como tres semanas tras una vacunación única.
Ejemplo 4
Se obtuvieron ratones CD1 hembra sin patógenos, de 6 a 8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) y se alojaron de acuerdo con las pautas institucionales con agua y alimentos a voluntad, bajo circulación de aire controlada por filtro.
La proteína hemaglutinina recombinante H5N1 se adquirió en Protein Sciences (Meridien, CT, EE. UU.). Esta proteína recombinante tiene un peso molecular aproximado de 72.000 dalton y corresponde a la glucoproteína hemaglutinina, una proteína antigénica presente en la superficie del virus de la gripe H5N1. Esta proteína recombinante, a continuación en el presente documento denominada rHA, se usó como antígeno modelo para someter a prueba la eficacia de las formulaciones de vacunas. Se usó rHA a 1 microgramo por dosis de 50 microlitros.
La eficacia de la vacuna se evaluó por un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un procedimiento que permite la detección de niveles de anticuerpos específicos de antígeno en el suero de animales inmunizados. Realizar el ELISA en sueros recogidos de ratones inmunizados en un intervalo habitual (cada cuatro semanas, por ejemplo) es útil para supervisar las respuestas de anticuerpos a una formulación de vacuna dada. El ELISA se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1.
Para formular la vacuna correspondiente a la invención, se hidrató una mezcla homogénea 10:1 p:p de lecitina S100 y colesterol (Lipoid GmbH, Alemania) en presencia de rHA y Pam-3-Cys (P3C) en tampón fosfato para formar liposomas con rHA y P3C encapsulados. En resumen, se añadieron 20 microgramos de cada uno de rHA y P3C en 850 microlitros de tampón fosfato 50 milimolar a 132 miligramos de la mezcla de lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente un mililitro de una suspensión de liposomas que encapsulaba el antígeno rHA y el adyuvante P3C. La preparación de liposomas se diluyó hasta una cantidad suficiente con agua estéril y a continuación se liofilizó usando el liofilizador Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, EE. UU.). Por cada mililitro de suspensión de liposomas original que contenía rHA y P3C, se usaron 800 microlitros del vehículo de aceite de vaselina (Montanide® iSa 51, suministrado por Seppic, Francia) para reconstituir los liposomas liofilizados para formar una suspensión de liposomas sin agua. Cada dosis de vacuna consistía en 50 microlitros de la formulación descrita anteriormente que contenía liposomas, antígeno rHA, adyuvante P3C y el vehículo de aceite de vaselina. Esta formulación de vacuna se denominará liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo. Esta formulación se usó para vacunar a los ratones del grupo 1 (n=10).
Los ratones del grupo 2 (n = 10) se trataron con 1 microgramo de rHA y 1 microgramo de P3C por dosis de 50 microlitros, en ausencia de liposomas/vehículo hidrófobo. Los ratones del grupo 3 (n=10) se trataron con 1 microgramo de rHA y 1 microgramo de P3C por dosis de 50 microlitros formulados como una vacuna acuosa/ liposomas/ P3C, en ausencia de un vehículo hidrófobo. Los ratones del grupo 4 (n=10) se trataron con 1 microgramo de rHA formulado como una vacuna de liposomas/ vehículo hidrófobo, en ausencia de P3C. Todos los ratones se vacunaron por vía intramuscular en la región del flanco y se recogieron muestras de suero a las 3, 4, 8, 12, 16 y 20 semanas después de la inmunización. Los valores de anticuerpos de rHA en estos sueros se examinaron por ELISA como se describe.
Se sometieron a prueba las eficacias de estas formulaciones de vacunas para evaluar la contribución relativa de los componentes de estas formulaciones de vacunas (véase la figura 4). Los valores de ratones en todos los grupos de control (grupos 2, 3 y 4) fueron consistentemente menores que los valores del grupo 1, vacunados con la vacuna A, lo que indica que todos los componentes de esta formulación pueden ser importantes para potenciar la inmunogenicidad. Por ejemplo, en la semana 8 después de la vacunación, los ratones en el grupo 1 (vacunados con la vacuna A) pudieron generar valores de criterio de valoración que alcanzaron hasta 1/2.048.000 (valor log10 promedio de 5,65), mientras que los ratones en el grupo 2, 3 y 4 pudieron generar valores de criterio de valoración de 1/64.000 (valor log10 promedio de 4,41), 1/128.000 (valor log10 promedio de 4,44) y 1/128.000 (valor log10 promedio de 4,69), respectivamente. Los valores generados por los ratones en el grupo uno fueron significativamente mayores (p < 0,0001, por análisis de la varianza unidireccional) que los valores generados en cualquiera de los tres grupos de vacuna de control. Esto indica una participación de todos los componentes de la formulación de la vacuna A, específicamente el antígeno, los liposomas, un adyuvante de ácido palmítico y un vehículo hidrófobo, en la simulación de la inmunogenicidad máxima de esta formulación.
Ejemplo 5
Se obtuvieron ratones Balb/C hembra sin patógenos, de 6 a 12 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) y se alojaron de acuerdo con las pautas institucionales con agua y alimentos a voluntad, bajo circulación de aire controlada por filtro.
El antígeno usado en las formulaciones de vacunas fue una cepa de gripe A/PR/8/34 (H1N1) termoinactivada. Se preparó una reserva vírica por propagación en huevos de gallina. Una alícuota de la reserva vírica A/PR/8/34 se descongeló rápidamente y se colocó en un baño de agua a 56 grados Celsius durante 30 minutos para permitir la inactivación térmica del virus.
Las vacunas se administraron el día cero bajo anestesia con isoflurano, por vía intramuscular en el músculo del muslo (una dosis de vacuna se dividió en dos inyecciones, una por pata). Los ratones se pesaron durante la semana después de la vacunación para garantizar que la vacuna por sí misma no provocara la enfermedad.
El día 28, los ratones se anestesiaron usando isoflurano y se inocularon por vía intranasal con 10 x MLD50 de virus (dos administraciones separadas de 25 microlitros cada una dividida por igual en cada fosa nasal). A continuación, los ratones se supervisaron durante 10 días midiendo el peso, la temperatura y la hidratación, y observando el aspecto, la postura y el comportamiento. Los ratones que alcanzaron puntos predeterminados de morbilidad se sacrificaron.
Los ratones en el grupo 1 (n=10) se vacunaron solo con solución salina y sirvieron como vacuna de control negativo.
Los ratones en el grupo 2 (n=10) se vacunaron con 2,56 X 10A3 TCID50 de la cepa de gripe A/PR/8/34 (H1N1) termoinactivada formulada en Alhydrogel.
Los ratones en el grupo 3 (n=10) se vacunaron con una vacuna de liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo. En resumen, se hidrató una mezcla homogénea 10:1 (p:p) de lecitina S100 y colesterol (Lipoid GmbH, Alemania) en presencia de la cepa de gripe A/PR/8/34 termoinactivada y agua estéril para formar aproximadamente 850 microlitros de liposomas con antígeno encapsulado. A continuación, se añadió adyuvante Pam-3-Cys (P3C), se mezclaron bien los liposomas y se diluyó la mezcla hasta una cantidad suficiente con agua estéril antes de liofilizarse usando el liofilizador Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, EE. UU.). Por cada 1 mililitro de suspensión de liposomas original que contenía A/PR/8/34 y P3C, se usaron 800 microlitros de un vehículo de aceite de vaselina (Montanide® ISA 51, Seppic, Francia) para reconstituir los liposomas liofilizados para formar una suspensión de liposomas sin agua. Cada volumen de dosis fue de 50 microlitros y contenía liposomas, cepa de gripe A/PR/8/34 (2,56 X 10A3 TCID50), P3C (1 microgramo) y el vehículo de aceite de vaselina.
Los resultados de este experimento se muestran en la figura 5. Los ratones del grupo 1 vacunados con solución salina sola desarrollaron rápidamente signos clínicos de infección por gripe y todos sucumbieron a la infección al cuarto día. Los ratones en el grupo 2, vacunados con antígeno formulado en Alhydrogel, demostraron síntomas clínicos moderadamente intensos tras la infección por gripe, sucumbiendo un 30 % de los animales a la infección. Sin embargo, los ratones en el grupo 3, vacunados con la vacuna de liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo, tenían síntomas clínicos relativamente leves y un 100 % sobrevivió a la infección por gripe.
Estas observaciones demuestran que Pam-3-Cys formulado en la vacuna de la invención puede potenciar la respuesta inmunitaria con respecto a las formulaciones de vacunas víricas inactivadas, como se demuestra por el control potenciado del virus tras la infección.
Ejemplo 6
Se obtuvieron ratones CD1 hembra sin patógenos, de 6 a 8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) y se alojaron de acuerdo con las pautas institucionales con agua y alimentos a voluntad, bajo circulación de aire controlada por filtro.
Como en los ejemplos 1 y 4, la proteína hemaglutinina recombinante H5N1, correspondiente a la glucoproteína hemaglutinina en la superficie del virus de la gripe H5N1, se adquirió en Protein Sciences (Meridien, CT, EE. UU.). Esta proteína recombinante, a continuación en el presente documento denominada rHA, se usó como antígeno modelo para someter a prueba la eficacia de las formulaciones de vacunas. Se usó rHA a 1 microgramo por dosis de 50 microlitros.
La eficacia de la vacuna se evaluó por un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un procedimiento que permite la detección de niveles de anticuerpos específicos de antígeno en el suero de animales inmunizados. Realizar el ELISA en sueros recogidos de ratones inmunizados en un intervalo habitual (cada cuatro semanas, por ejemplo) es útil para supervisar las respuestas de anticuerpos a una formulación de vacuna dada. El ELISA se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1.
Ambas vacunas en este ejemplo se formularon como se describe en el ejemplo 4. En resumen, para la vacuna correspondiente a la invención se usó antígeno rHA y adyuvante Pam-3-Cys (P3C) en tampón fosfato 50 milimolar para hidratar lecitina S100 y colesterol. La preparación de liposomas final se liofilizó y a continuación se reconstituyó con ISA51. La vacuna final consistía en 50 microlitros de una formulación que contenía liposomas, 1 microgramo de antígeno rHA, 1 microgramo de P3C de adyuvante y el vehículo de aceite de vaselina. Esta formulación de vacuna se denominará liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo. Esta formulación se usó para vacunar a los ratones del grupo 1 (n=9).
Los ratones del grupo 2 (n=9) se trataron con una formulación que contenía liposomas, 1 microgramo de rHA, 1 microgramo de adyuvante imiquimod (IMQ) y el vehículo de aceite de vaselina. Esta vacuna se denominará liposomas/ IMQ/ vehículo hidrófobo. En resumen, se usaron antígeno rHA y adyuvante IMQ (InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU.) en tampón fosfato 50 milimolar para hidratar la lecitina S100 y el colesterol. La preparación de liposomas final se liofilizó y a continuación se reconstituyó con ISA51.
Todos los ratones se vacunaron por vía intramuscular en la región del flanco y se recogieron muestras de suero a las 4 semanas después de la inmunización. Los valores de anticuerpos de rHA en estos sueros se examinaron por ELISA como se describe en el ejemplo 1.
Se sometieron a prueba las eficacias de estas formulaciones de vacuna para evaluar la contribución relativa del adyuvante P3C en la formulación de liposomas/ vehículo hidrófobo (véase la figura 6). Los ratones del grupo 2 generaron una respuesta de anticuerpos específicos de antígeno detectable tras la administración de una vacuna de control con adyuvante de imiquimod. Los ratones del grupo 1, vacunados con la formulación de liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo, proporcionaron valores de criterio de valoración significativamente potenciados en comparación con los del grupo 2 (P < 0,005). Los ratones del grupo 2 generaron valores de hasta 1/128.000 (valor log10 de 5,11) a los 28 días (4 semanas) después de la vacunación. Como se indica en el ejemplo 1, la presencia de dichas respuestas de anticuerpos confirma una respuesta inmunitaria genuina generada como resultado de la vacunación. Los ratones del grupo 1, vacunados con la vacuna correspondiente a la invención, pudieron generar valores de criterio de valoración que alcanzaron hasta 1/1.024.000 (valor Iog10 de 6,01) a las cuatro semanas después de la inmunización. Estos datos indican que la vacuna correspondiente a la invención (liposomas/ P3C/ vehículo hidrófobo) puede estimular una respuesta inmunitaria humoral específica significativamente más fuerte que una vacuna comparable preparada con un adyuvante diferente (liposomas/ IMQ/ vehículo hidrófobo).
Ejemplo 7
Se obtuvieron ratones C57BL6 hembra sin patógenos, de 6 a 8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) y se alojaron de acuerdo con las pautas institucionales con agua y alimentos a voluntad, bajo circulación de aire controlada por filtro.
Se sacrificaron los ratones "sin exposición previa" no tratados y se recogieron los bazos. Se preparó una suspensión de células individuales a partir de esplenocitos y glóbulos rojos lisados usando tampón de lisis ACK. Los linfocitos B se aislaron usando un kit de aislamiento magnético de selección negativa de Miltenyi (Auburn, CA, EE. UU.). Las células se resuspendieron en medio RPMI completo que contenía FBS al 10 %, penicilina-estreptomicina al 1 %, L-glutamina al 1 % y b-mercaptoetanol (c-RPMI) al 0,1 % a una concentración final de 2*10® células/ml. Se añadieron linfocitos B a los pocillos de una placa de 96 pocillos (2*105 células/pocillo) con anti-Ig (2,5 ug/ml; BD Biosciences, Mississauga, Canadá) y anti-CD40 (1 ug/ml; BD Biosciences) . Los linfocitos B se estimularon con los siguientes adyuvantes por triplicado: Pam2Cys (EMC Microcollections, Tuebingen, Alemania), Pam3Cys (EMC Microcollections), Poli I:C (Thermo Fisher, MI, EE. Uu.) y LPS (Sigma-Aldrich, Oakville, Canadá), o sin adyuvante. Cada adyuvante se dosificó a 10 ug/ml, 1 ug/ml y 0,1 ug/ml, excepto LPS que se dosificó a 100 ng/ml, 10 ng/ml y 1 ng/ml. Las células se incubaron a 37 °C/5 % de CO2 durante 3 días. Dieciocho horas antes del final del experimento, se añadió [3H]-timidina a cada pocillo a una concentración final de 0,2 uCi/pocillo. Las placas se recolectaron usando Titertek Cel1Harvester (Skatron Instruments, Sterling, VA, EE. UU.) sobre membranas de filtro que a continuación se contaron con un contador de centelleo líquido Beckman LS6000IC (Beckman Coulter Inc., Mississauga, ON, Canadá). La proliferación se cuantificó promediando los recuentos por minuto (CPM) por triplicado que representan la incorporación de [3H]-timidina.
Los resultados de la estimulación adyuvante de los linfocitos B muestran que mientras Pam3Cys y Pam2Cys pueden inducir una potente proliferación de linfocitos B, Poli I:C no lo hace (véase la figura 7). Es conocido que el LPS, incluido como control positivo, induce la proliferación de linfocitos B en concentraciones bajas. En base a estos resultados, es razonable esperar que las vacunas que contienen Pam2Cys o Pam3Cys tengan efectos similares sobre los linfocitos B in vivo y puedan facilitar la producción de niveles similares de anticuerpos específicos de antígeno.
Se debe tener en cuenta que, como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención.
La frase "y/o", como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, se debe entender que quiere decir "cualquiera o ambos" de los elementos así unidos, es decir, elementos que están presentes de forma conjuntiva en algunos casos y presentes de forma disyuntiva en otros casos. Los elementos múltiples enumerados con "y/o" se deben interpretar del mismo modo, es decir, "uno o más" de los elementos unidos. Opcionalmente, pueden estar presentes otros elementos distintos de los elementos identificados específicamente por la cláusula "y/o", ya sea que estén relacionados o no relacionados con los elementos identificados específicamente. Por tanto, como ejemplo no limitante, una referencia a "A y/o B", cuando se usa junto con un lenguaje abierto tal como "que comprende" se puede referir, en un modo de realización, a A solo (incluyendo opcionalmente elementos distintos de B); en otro modo de realización, a B solo (incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); aún en otro modo de realización, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos); etc.
Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "o" se debe entender que engloba el mismo significado que "y/o" como se define anteriormente. Por ejemplo, cuando se separan elementos en una lista, "o" o "y/o" se interpretará como que es inclusivo, es decir, la inclusión de al menos uno, pero también que incluye más de uno, de un número o lista de elementos, y, opcionalmente, elementos adicionales no listados.
Como se usa en el presente documento, ya sea en la especificación o en las reivindicaciones adjuntas, los términos de transición "que comprende", "que incluye", "que porta", "que tiene", "que contiene", "que implica" y similares se han de entender como que son inclusivos o abiertos (es decir, que quieren decir que incluyen, pero sin limitarse a), y no excluyen elementos, materiales o etapas del procedimiento no mencionados. Solo las frases de transición "que consiste en" y "que consiste esencialmente en", respectivamente, son frases de transición cerradas o semicerradas con respecto a las reivindicaciones. La frase de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente que no se mencione específicamente.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una suspensión de liposomas sin agua que comprende:
un adyuvante que activa o incrementa la actividad del receptor tipo toll 2 (TLR2) y liposomas que contienen un antígeno, reconstituidos en un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba;
en la que el antígeno puede inducir una respuesta inmunitaria humoral; y
en la que el adyuvante comprende dipalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAIVhCys) o tripalmitoil-S-gliceril-cisteína (PAMbCys).
2. La suspensión de la reivindicación 1, en la que el adyuvante es PAM2-Cys-SKKKK, PAM3-Cys-SKKKK, PAM3-Cys-SKKKK p-irradiada, R-PAM3-Cys-SKKKK, S-PAM3-Cys-SKKKK, PAM3-Cys-SKKKK-biotina-ácido aminocaproico (Aca)-Aca, PAM3-Cys-SKKKK-fluoresceína-Aca-Aca, PAM3-Cys-SKKKK-rodamina-Aca-Aca, PAM3-Cys-SKKKK-FLAG-marca, PAM3-Cys-SSNAKIDQLSSDVQT, PAM3-Cys-SSNKSTTGSGETTTA, PAM3-Cys-SSTKPVSQDTSPKPA, PAM3-Cys-SSGSKPSGGPLPDAK, PAM3-Cys-SSGNKSAPSSSASSS, PAM3-Cys-GSHQMKSEGHANMQL, PAM3-Cys-SSSNNDAAGNGAAQT, PAM3-Cys-KQNVSSLDEKNSVSV, PAM3-Cys-NNSGKDGNTSANSAD, PAM3-Cys-NNGGPELKSDEVAKS, PAM3-Cys-SQEPAAPAAEATPAG, PAM3-Cys-SSSKSSDSSAPKAYG, PAM3-Cys-AQEKEAKSELDYDQT, R-PAM2-Cys-SKKKK, S-PAM2-Cys-SKKKK, PAM2-Cys-SKKKK-biotina-Aca-Aca-NH2, PAM2-Cys-SKKKK-fluoresceína-Aca-Aca-NH2, PAM2-Cys-SKKKK-rodamina-Aca-Aca-NH2, PAM2-Cys-SKKKK-FLAG-marca o Pam2-Cys-GDPKHPKSF (FSL-1).
3. La suspensión de la reivindicación 1, en la que el adyuvante es dipalmitoil-S-gliceril (PAM2)-Cys-SKKKK.
4. La suspensión de la reivindicación 1, en la que el adyuvante es (PAM3)-Cys-SKKKK.
5. La suspensión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el antígeno es un polipéptido o un carbohidrato.
6. La suspensión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el antígeno comprende una pluralidad de epítopos de linfocitos B.
7. La suspensión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el antígeno comprende un epítopo de linfocito B que se deriva de un virus o una bacteria, incluyendo, por ejemplo, el virus de la gripe, Bordetella pertussis o Bacillus anthracis.
8. La suspensión de la reivindicación 7, en la que el epítopo de linfocito B es un epítopo de una proteína hemaglutinina del virus de la gripe H5N1, un epítopo de la proteína toxoide de tosferina o un epítopo de un antígeno protector recombinante del carbunco.
9. La suspensión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el antígeno es un antígeno de cáncer unido a la superficie de la membrana; una toxina; un alérgeno tal como el polen o una proteína amiloide.
10. La suspensión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que tanto el antígeno como el adyuvante están encapsulados en los liposomas reconstituidos en el vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba.
11. La suspensión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la composición puede inducir una respuesta inmunitaria humoral con una dosis única.
12. La suspensión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento o prevención de: una enfermedad infecciosa; un cáncer seleccionado de carcinoma, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, sarcoma, blastoma, mieloma y tumores de células germinativas; una alergia; enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington o esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
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