JP5227592B2 - アジュバント物質 - Google Patents

Description

本発明は、免疫応答を生成するのに使用するための化合物および組成物に関する。

例えばある種の感染症または癌等の広範囲にわたる疾患を予防するまたは治療するのに免疫療法またはワクチン接種が魅力的である。しかしながら、標的抗原が免疫原性に乏しいことからこのような処置の適用および成功は一部限られている。ペプチド、糖ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポペプチド、糖質等の多くが免疫原性に乏しい。対象の免疫原に対する免疫応答を増強するためにいくつかの技術が用いられている。

対象のペプチド／タンパク質免疫原に対する免疫応答を増強するために、例えば完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）等のペプチド／タンパク質免疫原にとって外因性のアジュバント剤（すなわち、使用前に、アジュバント剤は免疫原と混合される）を利用することが知られている。しかしながら、現在利用可能なアジュバントの多くはヒトに使用できないほど有毒であるかまたは単に効果がない。

アジュバントとして作用することで知られている脂質部分がペプチド免疫原に共有結合しているリポペプチドは、外因性のアジュバントがない状態で、免疫原性が弱い他のペプチドの免疫原性を増強することができる可能性がある［Ｊｕｎｇら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ，Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ １０，８７２，（１９８５）；Ｍａｒｔｉｎｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９，３４１６，（１９９２）；Ｔｏｙｏｋｕｎｉら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１６，３９５，（１９９４）；Ｄｅｐｒｅｚら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３８，４５９，（１９９５）；およびＳａｕｚｅｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３，１３３９，（１９９５）；Ｂｅｎｍｏｈａｍｅｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，１２４２，（１９９７）；Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ７，２９，（１９８９）；Ｎａｒｄｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６，５９０，（１９９８）；Ｂｅｎｍｏｈａｍｅｄら、Ｖａｃｃｉｎｅ １８，２８４３，（２０００）；およびＯｂｅｒｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６，１６１，（１９９８）］。適したリポペプチドはアジュバント剤に関連する有害な副作用を全く示さず、リポペプチドに対する抗体反応および細胞応答の両方が観察されている。

いくつかの異なる脂肪酸が脂質部分に使用されることが知られている。典型的な脂肪酸には、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基、およびデカノイル基が含まれるが、これに限定されない。または、より一般に、Ｃ２からＣ３０の任意の飽和脂肪族アシル基、モノ不飽和脂肪族アシル基、またはポリ不飽和脂肪族アシル基が有用であると考えられる。

Ｐａｍ３ＣｙｓまたはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨとしても知られているリポアミノ酸であるＮ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システイン（Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒら、Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６４（１９８３），ｐ５９３）は、グラム陰性菌の内膜および外膜を補うブラウンのリポタンパク質のＮ末端部分を合成したものである。Ｐａｍ３Ｃｙｓは式（１）の構造を有する。

Ｍｅｔｚｇｅｒらの米国特許第５７００９１０号（１９９７年１２月２３日）には、合成アジュバント、Ｂリンパ球賦活薬、マクロファージ賦活薬、または合成ワクチンとして用いられるリポペプチドの調製において中間体として使用するためのいくつかのＮ−アシル−Ｓ−（２−ヒドロキシアルキル）システインが記載されている。Ｍｅｔｚｇｅｒらはまた、このような化合物のＰａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨ（Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒら、Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６４，ｐ５９３，１９８３）の合成における中間体としての使用、およびリポアミノ酸またはその類似体をＮ末端に含むリポペプチドの使用について教示する。

Ｐａｍ３Ｃｙｓは、適切なエピトープと結合した時に、インフルエンザウィルス感染細胞に対するウィルス特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を促すことができること（Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２，５６１，１９８９）、および口蹄疫に対する防御抗体を誘発すること（Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ７，２９，１９８９；Ｊｕｎｇらの米国特許第６０２４９６４号、２０００年２月１５日）が証明されている。

最近、Ｐａｍ３Ｃｙｓの類似体であるＰａｍ２Ｃｙｓ（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システインまたはＳ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システインとしても知られている）が合成され（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ａ．Ｇ．Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｌｏｌｅｉｔ，Ｍ．Ｅｃｋｅｒｔ，Ｗ．Ｇ．Ｂｅｓｓｌｅｒ，およびＧ．Ｊｕｎｇ．１９９５．Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ １：１８４．）、このＰａｍ２Ｃｙｓは、マイコプラズマから単離されたマクロファージ活性化リポペプチドであるＭＡＬＰ−２の脂質部分に相当することが証明された（Ｓａｃｈｔ，Ｇ．，Ａ．Ｍａｒｔｅｎ，Ｕ．Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ｒ．Ｓｕｓｓｍｕｔｈ，Ｇ．Ｊｕｎｇ，Ｅ．Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ，およびＰ．Ｆ．Ｍｕｈｌｒａｄｔ．１９９８．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ２８：４２０７：Ｍｕｈｌｒａｄｔ，Ｐ．Ｆ．，Ｍ．Ｋｉｅｓｓ，Ｈ．Ｍｅｙｅｒ，Ｒ．Ｓｕｓｓｍｕｔｈ，およびＧ．Ｊｕｎｇ．１９９８．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６：４８０４：Ｍｕｈｌｒａｄｔ，Ｐ．Ｆ．，Ｍ．Ｋｉｅｓｓ，Ｈ．Ｍｅｙｅｒ，Ｒ．Ｓｕｓｓｍｕｔｈ，およびＧ．Ｊｕｎｇ．１９９７．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８５：１９５１）。Ｐａｍ２Ｃｙｓは式（ＩＩ）の構造を有する。

Ｐａｍ２ＣｙｓはＰａｍ３Ｃｙｓよりも脾細胞およびマクロファージの強力な刺激物質であることが報告されている（Ｍｅｔｚｇｅｒら、Ｊ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ １，１８４，１９９５；Ｍｕｈｌｒａｄｔら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８５，１９５１，１９９７，およびＭｕｈｌｒａｄｔら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６，４８０４，１９９８）。

樹状細胞（ＤＣ）は、一次免疫応答のみを促すことができる抗原提示細胞（ＡＰＣ）の希少な集団であり、癌免疫療法における樹状細胞の使用に強い関心が高まっている（Ｆｏｎｇら、Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，２４５，２０００）。強力な免疫応答を促すためにＤＣの能力を利用する試みにおいて生体外でのＤＣの操作を伴う手順がこれまで主に注目されてきた。この手法は、ＤＣを患者から単離し、数を増やし、抗原（Ａｇ）を与え（Ｈｅｉｓｅｒ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，２９５３，２００１；Ｇａｔｚａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５２２７，２００２；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ９９，１５１７，２００２；Ｍａｒｔｅｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９，３９５，２００２）、次いで、患者に再導入することを必要とすることがよくある。この手順はおおむね単純であるが、このような希少な細胞集団を単離し、培養するのに関連して困難が伴ってしまう（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２，６３１，１９９０；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ９，４７８４，２０００）。生体内でＡｇを直接ＤＣに送達させ、適切な免疫応答を誘発させることができる戦略に非常に大きな臨床的可能性があることは明らかである。

ＤＣは骨髄中の前駆体から生じ、未熟細胞として末梢組織に移動し、そこでＡｇを内部に取り入れ、複雑な成熟過程を経る。Ａｇは、補体受容体（例えばＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）ならびにエンドサイトーシス受容体（例えば、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮ、およびＴｏｌｌ様受容体）を含む多くの表面受容体によって内部に取り入れられる。未熟ＤＣはまた、細菌細胞壁リポ多糖（ＬＰＳ）等の病原体関連分子またはＩＦＮ−γ等のサイトカインによる炎症性の刺激といった形態の「危険信号」をＡｇ獲得中に受けてもよい。次いで、ＤＣは二次リンパ器官に移動し、有能なＡＰＣになるために成熟する（Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，６１，２００２）。ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮ、およびＴｏｌｌ様受容体等の受容体は、Ａｇの捕捉および提示の過程において重大な役割を果たし、主にＤＣにおいて発現する。

国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ００／００３９７（国際公開第００／６４４７１号パンフレット）において、生体膜、合成膜、またはリポソームを修飾する方法であって、修飾された生体膜、合成膜、またはリポソームが生体内に投与された時に、免疫を変更させる目的のためのまたは薬剤および他の作用物質が特異的な細胞型もしくは組織を標的とするための方法が記載されている。金属キレート基の取り込みまたは結合によりこの膜またはリポソームの修飾が達成され、その結果として、金属アフィニティータグを有する１つまたは複数の標的分子の移植が可能になる。

国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００４／００１１２５（国際公開第２００５／０１８６１号パンフレット）において、樹状細胞を標的として抗原を生体内で送り込むことにより免疫を調節するための組成物であって、複数の金属キレート基を表面に有する、抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームの調製物と、リガンド上の金属アフィニティータグにより上述の金属キレート基に連結されている、上述の樹状細胞上の受容体に対する上述のリガンドとを含み、上述の抗原を含む小胞または上述の抗原を含むリポソームが免疫調節因子を含む組成物が開示されている。

第１の態様において、本発明は、金属キレート基が共有結合した、樹状細胞を標的とした脂質部分を含むアジュバント物質を提供する。

第２の態様において、本発明は、（ａ）金属キレート基が共有結合した、樹状細胞を標的とした脂質部分と、（ｂ）金属アフィニティータグを含む抗原と、任意選択で（ｃ）金属イオンとを含み、金属アフィニティータグと金属キレート基との間の相互作用により、抗原が樹状細胞を標的とした脂質部分に連結している免疫原性組成物を提供する。

第１の態様において、本発明は、金属キレート基が共有結合した、樹状細胞を標的とした脂質部分を含むアジュバント物質を提供する。

第２の態様において、本発明は、（ａ）金属キレート基が共有結合した、樹状細胞を標的とした脂質部分と、（ｂ）金属アフィニティータグを含む抗原と、任意選択で（ｃ）金属イオンとを含み、金属アフィニティータグと金属キレート基との間の相互作用により、抗原が樹状細胞を標的とした脂質部分に連結している免疫原性組成物を提供する。

第１および第２の態様の好ましい実施形態において、樹状細胞を標的とした脂質部分は、Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｓ−（２，３−ジパルミテート−プロピル）システイン）またはＰａｍ３Ｃｙｓ（Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システイン）である。当業者により理解されるように、これらの分子の脂質鎖を変更してもよい。脂質は、樹状細胞上のＴＬＲ−２受容体を標的にすると証明されたＰａｍ２Ｃｙｓであることが特に好ましい（Ｊａｃｋｓｏｎら、ＰＮＡＳ，１０１，１５４４０−１５４４５，２００４）。使用してもよい代替脂質には、Ｓｔｅ_２Ｃｙｓ（ジステアロイル−Ｓ−グリセリル−システインまたはＳ−［２，３−ビス（ステアロイルオキシ）プロピル］システインとしても知られている）、Ｌａｕ_２Ｃｙｓ（ジラウロイル−Ｓ−グリセリル−システインまたはＳ−［２，３−ビス（ラウロイルオキシ）プロピル］システインとしても知られている）、およびＯｃｔ_２Ｃｙｓ（ジオクタノイル−Ｓ−グリセリル−システインまたはＳ−［２，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロピル］システインとしても知られている）が挙げられる。

適した金属キレート基は当業者に知られているものである。金属キレート基は、カルボン酸ベースの金属キレート基であることが好ましい。例えば、金属キレート基は、３−ＮＴＡ（トリニトリロ三酢酸）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）およびその誘導体であるＮ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸等、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびその誘導体、Ｎ^４，Ｎ^α，Ｎ^α，Ｎ^ε，Ｎ^ε−［ペンタキス（カルボキシメチル］−２，６−ジアミノ−４−アザヘキサン酸ヒドラジド、エチレンジニトリロテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）ならびにその誘導体であるアミノベンジル−ＥＤＴＡおよびイソシアナベンジル−ＥＤＴＡ等、エチレンジアミンジコハク酸（ＥＤＤＳ）およびその誘導体、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）およびその誘導体、ならびに他のカルボン酸ベースの金属キレート部分から選択することができる。

金属キレート基は好ましくは３−ＮＴＡである。

第２の態様の好ましい形態において、免疫原性組成物はさらに金属イオンを含む。本発明者たちは、本発明の免疫原性組成物が組成物中に金属イオンのない状態で免疫原性反応を引き起こすことを発見した。理論に拘束されることなく、本発明者たちは、組成物が投与された組織に金属イオンが偶発的に存在するおかげで樹状細胞を標的とした脂質部分に連結している抗原によりこの免疫原性反応がもたらされるものと考える。本出願人は、金属イオンが免疫原性組成物中に存在する場合、組成物により誘発される免疫応答が改善されることを発見した。金属イオンは、Ｎｉ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、およびＣｕ^２＋から成る群から選択されることが好ましい。

抗原は、ウィルス、原核生物、または真核生物の任意の適した免疫原性のタンパク質、リポタンパク質、または糖タンパク質とすることができ、哺乳類対象または上述の対象に感染する細菌、菌類、原生動物、もしくは寄生生物に由来する抗原を含むがこれに限定されない。脂質で修飾されたＢ細胞エピトープが含まれるように、免疫応答が要求されるイディオタイプＢ細胞エピトープおよび抗イディオタイプＢ細胞エピトープが特に含まれる。あるいは、Ｂ細胞エピトープは、例えばＡＢＨ血液型抗原、移植抗原（例えばＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ；Ｓａｎｄｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１１３９１−１１３９５，１９９３；Ｇａｌｉｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，１３６９−１３７３，１９８７；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ ４１８：７８５−７８９，２００２）、またはＡＢＨ血液型抗原および移植抗原の複合体等の糖鎖抗原であってもよい。

寄生生物からの好ましい抗原は、リーシュマニア、マラリア、トリパノソーマ症、バベシア症、または住血吸虫症に関連した抗原である。好ましいウィルス抗原は、肝炎ウィルス、ロタウィルス、ヘルペスウィルス、コロナウィルス、ピコルナウィルス（例えば、アフトウィルス）、呼吸器合胞体ウィルス、インフルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス、アデノウィルス、ポックスウィルス、ウシヘルペスウィルスＩ型、ウシウィルス性下痢ウィルス、ウシロタウィルス、イヌジステンパーウィルス（ＣＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウィルス（ＥＲＡＶ）、ウマ鼻炎Ｂウィルス（ＥＲＢＶ）、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、はしかウィルス（ＭＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦｌＶ）、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）等に由来する。好ましい細菌抗原には、パスツレラ、アクチノバシラス、ヘモフィルス、リステリア菌、ミコバクテリウム、ブドウ球菌、大腸菌、赤痢菌、サルモネラ菌等に由来する抗原が含まれる。哺乳類対象からの好ましい抗原は、少なくとも１つの腫瘍抗原に由来しおよび／またはこの腫瘍抗原に対する免疫応答を起こさせることができる。腫瘍抗原は通常自己抗原または外来性抗原であって、腫瘍抗原の発現は、腫瘍の発生、成長、存在、または再発と相互に関連している。腫瘍抗原が異常組織を正常組織と区別するのに使用できるため、腫瘍抗原は治療的介入のための標的として有用であるといえる。腫瘍抗原は当技術分野でよく知られている。実際に、いくつかの例が十分に述べられており、現在、腫瘍特異的治療法の作成における大きな関心の的となっている。腫瘍抗原の非限定的な例として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ）、およびＭＵＣ−１等のムチンが挙げられる。

また、哺乳類対象からの抗原は、ヒトまたはブタ等の他の哺乳類のＺＰ３（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｄｅａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７，６０１４−６０１８，１９９０）またはＺＰ３ａ（Ｙｕｒｅｗｉｃｚら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ １１７４，２１１−２１４，１９９３）］等の透明帯タンパク質に由来する。この分類における特に好ましい抗原として、ヒトのＺＰ３のアミノ酸残基３２３〜３４１（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｄｅａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７，６０１４−６０１８，１９９０）、ブタのＺＰ３ａのアミノ酸残基８〜１８またはアミノ酸残基２７２〜２８３またはアミノ酸残基３１９〜３３０（Ｙｕｒｅｗｉｃｚら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７４，２１１−２１４，１９９３）が挙げられる。

哺乳類対象からのさらに好ましい抗原は、例えば、満腹ホルモン（例えばレプチン）、消化ホルモン（例えばガストリン）、もしくは生殖ペプチドホルモン［例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｃａｒｌｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８，６８１０−６８２７，１９７３）等のペプチドホルモンまたはその代わりに、例えばＦＳＨ受容体等のホルモン受容体（Ｋｒａａｉｊら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５８，１２７−１３６，１９９８）に由来しおよび／またはこのペプチドホルモンもしくはホルモン受容体に対する抗体を発生させることができる。この分類における特に好ましいエピトープとして、抗原性的にＬＨと非交差反応性のｂ−ｈＣＧのＣ末端部分（ＣＴＰ）が挙げられる（Ｃａｒｌｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８，６８１０−６８２７，１９７３）。

さらに好ましい実施形態において、抗原は、複数の異なるＣＴＬエピトープを含むポリトープである。

特定のウィルスおよび生物の好ましい抗原について以下に記載する。
ウィルス 抗原
ヒト乳頭腫ウィルス Ｅ６Ｅ７タンパク質
インフルエンザ Ｍタンパク質
Ｂ型肝炎 Ｂ型肝炎小型抗原（ＨＢｓＡｇ）
ヒト免疫不全ウィルス ｇｐ１２０、ｇｐ４ｌ
単純ヘルペス ｇＢ
生物 毒素からのＢサブユニット
炭疽菌 致死因子
百日咳菌 アデニル酸シクラーゼ
百日咳菌 百日咳毒素
破傷風菌 破傷風毒素
ジフテリア菌 ジフテリア毒素
腸管出血性大腸菌 志賀毒素
毒素原性大腸菌 易熱性毒素
コレラ菌 コレラ毒素
他の抗原 リシン

金属アフィニティータグはヘキサヒスチジンが好ましいが、４〜１６個のヒスチジン残基を有するポリヒスチジンまたは金属キレートに対する親和性を有するヒスチジンリッチペプチド、例えば、哺乳類のヒスチジンリッチ糖タンパク質のヒスチジンプロリンリッチ繰り返しペプチドとすることができる（ＨｕｌｅｔｔおよびＰａｒｉｓｈ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７０，２８０−２８７，２０００）。

図１に示すように、好ましい実施形態において、本発明による構築物は、樹状細胞上のＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ−２）を標的にする脂質であるＰａｍ２Ｃｙｓを含む。３−ＮＴＡは、Ｐａｍ２Ｃｙｓに共有結合している。抗原は、６−Ｈｉｓタグタンパク質であり、タンパク質は、組換えワクチンタンパク質、糖質、ポリトープ、またはエピトープをベースとし、６−Ｈｉｓタグを有するワクチンとすることができる。３−ＮＴＡ（トリニトリロ三酢酸）はＰａｍ２Ｃｙｓが抗原に結合するように６−Ｈｉｓタグをキレート化し、好ましい実施形態の構築物が形成される。

図２は、３ＮＴＡ−ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓを生成するための方法について説明する概略図である。上記に記載するように、３ＮＴＡ基を介してこの構築物に関連する６−Ｈｉｓタグ付き抗原を単に変化させて、ＤＣへの抗原送達の範囲を増加させることにより、一般的なワクチンとして貢献する大きな可能性をこの構築物は有する。ここに示す構築物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、このポリエチレングリコールは３ＮＴＡおよびＰａｍ２Ｃｙｓを連結するブリッジとして貢献し、さらに重要なことには、（生成物の生体内における効力を改善するための）「隠れた」特性を分子に与える。マレイミド基およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド基で誘導体化されたＰＥＧ（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃｓ；ネクターセラピューティクス社）（ｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）によりチオール基およびアミノ基にそれぞれ結合することを可能にするヘテロ二官能性架橋剤が実現される。３ＮＴＡはアミノ官能基を含む。第１の反応（Ａ）は、アミノ−３ＮＴＡのアミノ基およびｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＮＨＳ基の間の縮合反応を示し、アミド結合が形成され、ｍａｌ−ＰＥＧ−３ＮＴＡが生成される。（Ｂ）は、ｍａｌ−ＰＥＧ−３ＮＴＡのマレイミド基およびＰａｍ２Ｃｙｓ中の末端システイン残基のスルフヒドリル基の間のチオールアルキル化反応を示し、チオエーテル結合の形成がもたらされる。連続して、任意の順序で、または同時に（Ａ）および（Ｂ）を実行してもよい。また、ここに示した同一の化学の法則に従い、ＰＥＧスペーサーなしで、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ（Ｐｉｅｒｃｅ；ピアス社）等の「マレイミド−スクシンイミジル」ヘテロ二官能性架橋剤を使用してＰａｍ２Ｃｙｓおよびアミノ−３ＮＴＡを結合させてもよい。好ましい形態において、ヘテロ二官能性架橋剤はＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエートである。

当業者によって認識されているように、アジュバント物質は、６−Ｈｉｓタグを含む組換えタンパク質または組換えペプチドと共に使用するのに最適である。本発明の物質により、金属アフィニティータグを含む抗原を樹状細胞標的脂質に容易に結合させ、その結果として抗原の免疫原性を増加させることができる。こういったことは、抗原が発現された組換えタンパク質である場合、これらの分子は精製用の６−Ｈｉｓタグと共に生成されることがよくあるため、特に有用である。これらの分子を本発明のアジュバント物質と単純に反応させ、本発明の第２の態様の免疫原性組成物を得ることができる。

本発明の本質がより明確に理解されるために、本発明の好ましい形態について以下の非限定的な実施例に関連して記載することとする。

実施例１
（材料と方法）
１．化学物質
特に記載されない限り、化学物質が分析用グレードまたはその相当物であった。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｏ’ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）ならびにジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）はオースペップ社（Ａｕｓｐｅｐ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）、メルボルン、豪州およびシグマアルドリッチ社、キャッスルヒル、豪州から入手した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびジエチルエーテルはメルク社（キルシス、豪州）製であり、フェノールおよびトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）はアルドリッチ社（ミルウォーキー、ＷＩ）製であった。トリニトロベンジルスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）およびジアミノピリジン（ＤＭＡＰ）はフルカ社製であった。１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）はシグマ社から入手し、パルミチン酸はフルカ社製であった。固体担体ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭはラップポリメーレ社製、チュービンゲン、ドイツであった。Ｏ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノエチル−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）−ウンデカエチレングリコール（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ）はノバビオケム社、メルクバイオサイエンス、スイスから入手した。ヘテロ二官能性リンカー分子であるＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエート（ＭＣＳ）はフルカ バイオケミカ社（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ）製、スイスであった。実質的に、国際公開第２００５／０１８６１０号パンフレットに記載されるように、３ＮＴＡを生成した。ＮＴＡはＤｏｊｉｎｄｏ社、日本から購入した。

２．ペプチドワクチンの合成
ペプチドワクチンＨｉｓ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧは６つのヒスチジン残基、Ｔヘルパー細胞エピトープＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ、およびＢ細胞エピトープＨＷＳＹＧＬＲＰＧを含む。Ｔヘルパー細胞エピトープはインフルエンザウィルスヘマグルチニンの軽鎖（ＨＡ２）からのものであり、Ｂ細胞エピトープは黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）である。Ｆｍｏｃ化学を使用する従来の固相法により連続した配列としてペプチドワクチンを合成した。ペプチド合成のために使用した一般的な手順は、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １８，３５５（１９９９）に記載されている。固体担体ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭを使用した。Ｚｅｎｇ，Ｗ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６９，４９０５−４９１２に記載されるように６個のヒスチジン残基がないこのペプチドワクチンＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧの脂質修飾型を合成した。

３．脂質部分の合成
４つの脂質部分を開発し、合成した。
（ｉ）Ｐａｍ_２ＣｙｓＳｅｒ（Ｌｙｓ）_８Ｃｙｓ
（ｉｉ）Ｐａｍ_２ＣｙｓＳｅｒＳｅｒ（Ｌｙｓ）_８Ｃｙｓ
（ｉｉ）Ｐａｍ_２ＣｙｓＳｅｒＳｅｒＰＥＧ_１０Ｃｙｓ
（ｉｉｉ）Ｐａｍ_２ＣｙｓＳｅｒＳｅｒＰＥＧ_２０Ｃｙｓ

Ｆｍｏｃ化学を使用する従来の固相法により脂質部分を作成した。ペプチド合成のために使用した一般的な手順は、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １８，３５５（１９９９）に記載されている。固体担体ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭを使用した。２倍過剰だけ使用したＦｍｏｃ−ＰＥＧのカップリングを除き、４倍過剰のＦｍｏｃアミノ酸誘導体をカップリングステップに使用した。８つのリシン残基の後にセリンが１つ余分に挿入されているということが最初の２つの脂質部分における差異である。

Ｊｏｎｅｓら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ５，１５５（１９７５）およびＭｅｔｚｇｅｒら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３８，５４５（１９９１）に記載される方法により以下の変更を伴ってＰａｍ２Ｃｙｓをペプチドに結合させた。

Ｉ．Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システインの合成：
トリエチルアミン（６ｇ、８．２ｍｌ、５８ミリモル）をＬ−システイン塩酸塩（３ｇ、１９ミリモル）および３−ブロモ−プロパン−１，２−ジオール（４．２ｇ、２．３６ｍｌ、２７ミリモル）の水溶液に加え、均一溶液を３日間室温で保存した。溶液を４０℃真空中で凝縮して白い残渣を得て、これをメタノール（１００ｍｌ）と共に煮沸し、遠心分離し、この残渣を水（５ｍｌ）に溶解させた。この水溶液をアセトン（３００ｍｌ）に加え、遠心分離によって沈澱物を単離した。沈殿反応を数回行い沈澱物をアセトンで水から精製し、白いアモルファス粉末としてＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システイン（２．４ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、６４．７％）を得た。

ＩＩ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−システイン（Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨ）の合成：
Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システイン（２．４５ｇ、１２．６ミリモル）を９％の炭酸ナトリウム（２０ｍｌ）中で溶解させた。アセトニトリル（２０ｍｌ）中のフルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．４５ｇ、１０．５ミリモル）の溶液を加え、混合物を２時間撹拌し、次いで水（２４０ｍｌ）で希釈し、ジエチルエーテルで抽出した（２５ｍｌ×３）。水相を濃塩酸で酸性化してｐＨ２にし、次いで、酢酸エチルで抽出した（７０ｍｌ×３）。抽出物を、水（５０ｍｌ×２）および飽和塩化ナトリウム溶液（５０ｍｌ×２）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、乾燥させた。エーテルおよび酢酸エチルから−２０℃で再結晶させることにより無色の粉末（２．８ｇ、６．７ミリモル、６３．８％）を得た。

ＩＩＩ．樹脂結合ペプチドへのＦｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨの結合：
Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨ（１００ｍｇ、０．２４ミリモル）をＨＯＢｔ（３６ｍｇ、０．２４ミリモル）およびＤＩＣＩ（３７μｌ、０．２４ｍｍｏｌ））を用いＤＣＭおよびＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ、３ｍｌ）中で５分間０℃で活性化させた。次いで、樹脂結合ペプチド（０．０４ミリモル、０．２５ｇのアミノ−ペプチド樹脂）を含む容器にこの混合物を加えた。２時間振盪した後、溶液を濾過により除去し、ＤＣＭおよびＤＭＦで樹脂を洗浄した（各３×３０ｍｌ）。反応を完成させるためにＴＮＢＳＡ試験を用いて監視した。必要であれば、ダブルカップリングを行った。

ＩＶ．Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃペプチド樹脂の２つの水酸基のパルミトイル化：
パルミチン酸（２０４ｍｇ、０．８ミリモル）、ＤＩＣＩ（１５４μｌ、１ミリモル）、およびＤＭＡＰ（９．７６ｍｇ、０．０８ミリモル）を２ｍｌのＤＣＭおよび１ｍｌのＤＭＦ中で溶解させた。樹脂結合Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂（０．０４ミリモル、０．２５ｇ）をこの溶液中に懸濁させ、室温で１６時間振盪した。溶液を濾過により除去し、次いで、尿素のいかなる残渣をも除去するためにＤＣＭおよびＤＭＦで樹脂を徹底的に洗浄した。２．５％のＤＢＵでＦｍｏｃ基を除去した（２×５分間）。

樹脂結合ペプチド構築物をすべて試薬Ｂ（８８％のＴＦＡ、５％のフェノール、２％のＴＩＰＳ、５％の水）を用いて固相担体から２時間ではがし、Ｚｅｎｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ １８，１０３１ （２０００）に記載されるように逆相クロマトグラフィーにより精製した。

ウォーターズ社製ＨＰＬＣシステムに取り付けられたバイダック社製Ｃ４カラム（４．６×３００ｍｍ）を用いて分析逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を実行し、Ｈ２Ｏ中０．１％のＴＦＡおよびＣＨ３ＣＮ中０．１％のＴＦＡを制限溶媒として使用し、１ｍｌ／分の流速で展開させた。生成物はすべて分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて単一の大きなピークとして示され、アジレント社製１１００ ＬＣ−ＭＳＤトラップ質量分析計により分析すると、予期した質量を有していた。

４．ＬＩＰＯＫＥＬの合成
ＬＩＰＯＫＥＬは、ヘテロ二官能性リンカー分子であるＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエート（ＭＣＳ）を介して３ＮＴＡに結合された脂質部分Ｐ_２ＣＳＫ_８Ｃを含む。ＬＩＰＯＫＥＬの改良物を上記に取り上げた脂質部分Ｐ_２ＣＳ_２ＰＥＧ_１０およびＰ_２ＣＳ_２ＰＥＧ_２０を用いて合成した。
ＬＩＰＯＫＥＬ： Ｐａｍ_２ＣｙｓＳｅｒＬｙｓ_８Ｃｙｓ−３ＮＴＡ
ＬＩＰＯＫＥＬＰ−１０： Ｐａｍ_２ＣｙｓＳｅｒＳｅｒＰＥＧ_１０−３ＮＴＡ
ＬＩＰＯＫＥＬＰ−２０： Ｐａｍ_２ＣｙｓＳｅｒＳｅｒＰＥＧ_２０−ＭＣＳ−３ＮＴＡ

３ＮＴＡへの脂質部分のカップリングを以下の通り行った。
１）リン酸緩衝アセトニトリル中で等モル量の３ＮＴＡおよびＭＣＳを混合し、２〜３時間室温で保温することにより３ＮＴＡをＭＣＳにカップリングさせた。３ＮＴＡ−ＭＣＳの特性についてＭＳにより確認し、化合物をＨＰＬＣにより精製した。
２）すべての反応成分が溶けるように固体のグアニジン粉末を加えたリン酸緩衝アセトニトリルを含む溶液中で、等モル量の３ＮＴＡ−ＭＣＳおよび脂質部分を用いて３ＮＴＡ−ＭＣＳと脂質部分の結合を行った。ｐＨ６．０と比較してｐＨ７．５で反応効率が大幅に増加したことが分かった。反応生成物の特性についてＭＳにより確認し、ＬＩＰＯＫＥＬ、ＬＩＰＯＫＥＬＰ−１０、およびＬＩＰＯＫＥＬＰ−２０をＨＰＬＣにより精製した。ＬＩＰＯＫＥＬの質量スペクトルについて質量分析計であるアジレント社シリーズ１１００ ＬＣ−ＭＳＤを使用して決定した。実験による質量３０７３．９５が、推定した質量３０７４．９Ｄａとほぼ一致した。

５．動物試験
ニッケルがある状態またはない状態で、ＨＩＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧと共に混合されたＬＩＰＯＫＥＬ、ＨｌＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧのみ、ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧの脂質修飾型、または（第１の投与では完全、第２の投与では不完全）フロイントアジュバント中で乳化されたＨＩＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧを２回（第１の投与量として２０ナノモル、続いて第２の投与量として５ナノモル）０週目および３週目にそれぞれＢＡＬＢ／ｃマウスの５群に与えた。３週目および４週目にマウスから採血し、血清を調製し、抗ＬＨＲＨ抗体反応についてＥＬＩＳＡにより測定した（図２）。

本明細書の全体にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、示した要素、数値もしくはステップ、または要素、数値もしくはステップの群を包含し、他のいかなる要素、数値もしくはステップ、または要素、数値もしくはステップの群を排除するものではないということを意味することが理解されるであろう。

本明細書中で述べた刊行物はすべて、参照によってここに含むものとする。本明細書中に含まれる文書、行為、物質、装置、製品等についてのいかなる議論も単に本発明にとっての背景を提供するためのものである。任意のもしくはすべてのこれらの事項が、先行技術の基礎の一部を形成するまたは本出願の各請求項の優先日の前にどこにでも存在したかのように本発明に関連する分野における共通の一般知識だったということが許可されるべきではない。

広く記載した本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において示されるように多数の変形形態および／または変更形態が本発明に対してなされてもよいことが当業者により十分に理解されるであろう。それゆえ、本実施形態は、すべての点で、例示的なものとしてかつ限定的ではないものとしてみなされるべきである。

本発明の好ましい実施形態によるアジュバント物質を含む構築物を示す図である。 ３ＮＴＡ−ＰＥＧ−ｍａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ_８−Ｓｅｒ−Ｐａｍ２Ｃｙｓを生成するための方法について説明する概略図である。 本発明に係るアジュバント物質を用いて送達されたＨｉｓタグペプチドワクチンに対する抗体反応を示す図である。この物質をＬＩＰＯＫＥＬと呼ぶ。ＬＩＰＯＫＥＬは、ヘテロ二官能性リンカー分子であるＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエート（ＭＣＳ）を介して３ＮＴＡに結合された脂質部分Ｐ_２ＣＳＫ_８Ｃを含む。ニッケルがある状態またはない状態でＨＩＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧと共に混合されたＬＩＰＯＫＥＬを０週目および３週目にマウスに２回投与した。ＨＩＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧのみ、このペプチドワクチンの脂質修飾型、またはフロイントアジュバント中で乳化されたＨＩＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧをそれぞれ、同じスケジュールで対照マウスに与えた。第１の投与量はマウス当たり２０ナノモルであり、第２の投与量は５ナノモルだった。３週目および４週目にマウスから採血した。１回目のワクチン投与後にマウスの血清でＥＬＩＳＡを行った結果。 本発明に係るアジュバント物質を用いて送達されたＨｉｓタグペプチドワクチンに対する抗体反応を示す図である。この物質をＬＩＰＯＫＥＬと呼ぶ。ＬＩＰＯＫＥＬは、ヘテロ二官能性リンカー分子であるＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエート（ＭＣＳ）を介して３ＮＴＡに結合された脂質部分Ｐ_２ＣＳＫ_８Ｃを含む。ニッケルがある状態またはない状態でＨＩＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧと共に混合されたＬＩＰＯＫＥＬを０週目および３週目にマウスに２回投与した。ＨＩＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧのみ、このペプチドワクチンの脂質修飾型、またはフロイントアジュバント中で乳化されたＨＩＳ_６−ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ−ＨＷＳＹＧＬＲＰＧをそれぞれ、同じスケジュールで対照マウスに与えた。第１の投与量はマウス当たり２０ナノモルであり、第２の投与量は５ナノモルだった。３週目および４週目にマウスから採血した。２回目のワクチン投与後にマウスの血清でＥＬＩＳＡを行った。

Claims (13)

1. ３−ＮＴＡである金属キレート基が共有結合した、樹状細胞を標的とした脂質部分を含み、前記樹状細胞を標的とした脂質部分が、Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｓ−（２，３−ジパルミテート−プロピル）システイン）もしくはＰａｍ３Ｃｙｓ（Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システイン）である、アジュバント物質。
2. 前記樹状細胞を標的とした脂質部分がＰａｍ２Ｃｙｓである、請求項１に記載のアジュバント物質。
3. 前記樹状細胞を標的とした脂質部分と前記金属キレート基とがヘテロ二官能性架橋剤により共有結合している、請求項１または２に記載のアジュバント物質。
4. 前記ヘテロ二官能性架橋剤がＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエートである請求項３に記載のアジュバント物質。
5. （ａ）３−ＮＴＡである金属キレート基が共有結合した、樹状細胞を標的とした脂質部分と、（ｂ）４〜１６個のヒスチジン残基の金属アフィニティータグを含む抗原と、任意選択で（ｃ）金属イオンとを含み、金属アフィニティータグおよび金属キレート基の間の相互作用により、前記抗原が前記樹状細胞を標的とした脂質部分に連結しており、前記樹状細胞を標的とした脂質部分が、Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｓ−（２，３−ジパルミテート−プロピル）システイン）もしくはＰａｍ３Ｃｙｓ（Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システイン）である、免疫原性組成物。
6. 前記樹状細胞を標的とした脂質部分がＰａｍ２Ｃｙｓである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
7. 前記樹状細胞を標的とした脂質部分と前記金属キレート基とがヘテロ二官能性架橋剤により共有結合している、請求項５または６に記載の免疫原性組成物。
8. 前記ヘテロ二官能性架橋剤がＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエートである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
9. 金属イオンをさらに含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
10. 前記金属イオンが、Ｎｉ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、およびＣｕ^２＋から成る群から選択される、請求項９に記載の免疫原性組成物。
11. 前記抗原が、少なくとも１つの腫瘍抗原に由来し、および／または少なくとも１つの腫瘍抗原に対して免疫応答を生成することができる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
12. 前記抗原が、複数の異なるＣＴＬエピトープを含むポリトープである、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
13. 前記金属アフィニティータグがヘキサヒスチジンである、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

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