BRPI0817484B1 - Composição de vacina sem água, processo de produção e o uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

composições compreendendo antígeno, composto anfipático e um veículo hidrofóbico e o uso dos mesmos. a presente invenção refere-se a composições compreendendo um antígeno, um composto antipático, e um veículo hidrofóbico, em que o antígeno é suspenso no dito veículo hidrofóbico em ausência substancial de água e os métodos para utilizar essas composições para indução de um anticorpo ou de uma resposta mediada por célula em um paciente.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS.

[001] Este pedido reivindica o benefício de, e a prioridade do Pedido Provisório de Patente dos Estados Unidos N. 60/977.197, arquivo 3 de outubro de 2007, que é incorporado aqui pela referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO.

[002] A presente invenção refere-se a composições compreen dendo um antígeno, um composto anfipático, e um veículo hidrofóbico. As composições da invenção foram avaliadas como fornecendo res-postas imunes melhoradas in vivo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A vacinação geralmente envolve a injeção de uma substância antigênica ou antígeno em um animal. A substância antigênica gera uma resposta imune no animal. O antígeno pode ser, por exemplo, um organismo morto, tal como uma bactéria, ou um vírus inativado, um componente de um organismo que tem propriedades antigênicas, um organismo vivo ou vírus com baixa virulência.

[004] A eficácia de um antígeno na estimulação de uma resposta imune pode ser melhorada pela administração com um adjuvante. Um adjuvante pode funcionar por mecanismos diferentes, incluindo (1) aprisionar o antígeno dentro do corpo para causar uma liberação lenta, (2) atrair células do sistema imune para o sítio de injeção, (3) estimular células do sistema imune a se proliferar e se tornarem ativadas, e (4) melhorar a dispersão do antígeno no corpo do receptor. Os adjuvantes comumente usados incluem sais de alumínio, emulsões de água em óleo e óleo em água, sais minerais e outros compostos que podem atuar como um sinal de perigo estimulador. Os policátions, tais como dietilaminoetil dextrano (DEAE dextrano) também podem ser eficazes como adjuvantes em alguns casos. O adjuvante pode estar incluído na vacina como um aditivo ou pode ser administrado separadamente.

[005] Muitas composições de vacina são emulsões de óleo em água ou água em óleo. As composições de água em óleo em particular são eficazes por causa da presença prolongada de tais composições no sítio de injeção, causando a liberação lenta do antígeno no sítio da imunização. Contudo, as emulsões de água em óleo podem se tornar instáveis uma vez injetadas in vivo, causando a separação das fases aquosa e oleosa da composição. Isto leva à liberação prematura ou acelerada de antígenos e outros componentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo: um antígeno; um composto anfipático; e um veículo hi- drofóbico; em que a composição é substancialmente sem água.

[007] Em outro aspecto, a invenção fornece um processo para a produção da composição tal como descrito acima, o processo compre-endendo: (a) combinação de um antígeno e um composto anfipático para formar uma mistura seca; e (b) suspensão da dita mistura em um veículo hidrofóbico; em que a composição é substancialmente sem água.

[008] Em outro aspecto, a invenção fornece um método compreendendo a administração da composição tal como descrito acima a um paciente.

[009] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para in duzir uma resposta de anticorpo ou resposta imune mediada por célula em um paciente, o método compreendendo a administração, a um paciente que esteja necessitando do mesmo, da composição tal como descrito acima.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A figura 1 ilustra o crescimento de tumor durante um período de 42 dias em ratos implantados com células C3 e tratados com a solução salina de tampão fosfato 8 dias após a implantação do tumor de acordo com a presente invenção. Os ratos de controle (grupo 1, n=10) implantados com células C3 expuseram o crescimento de tumor normal durante o período de 42 dias. Todos os ratos neste grupo foram tratados com o solução salina de tampão fosfato 8 dias após a implantação do tumor (PTI).

[0011] A figura 2 ilustra o crescimento de tumor durante um período de 42 dias em ratos implantados com células C3 e tratados no dia 8 com uma formulação de controle consistindo em antígeno de FP em uma emulsão de água em óleo. Os ratos de controle (grupo 2, n=8) foram implantados com células C3 e tratados no dia 8 com uma formulação de controle consistindo em antígeno de FP em uma emulsão de água em óleo. Os tumores foram monitorados semanalmente para um total de 42 dias.

[0012] A figura 3 ilustra o crescimento de tumor durante um período de 42 dias em ratos implantados com células C3 e tratados no dia 8 com uma composição sem água consistindo em antígeno de FP, veículo DOPC e um veículo hidrofóbico (adjuvante de Freund incompleto). Os ratos (grupo 3, n=8) foram implantados com células C3 e tratados no dia 8 com uma composição sem água consistindo em antígeno de FP, veículo de DOPC e um veículo hidrofóbico (adjuvante de Freund incompleto). Os tumores foram monitorados semanalmente para um total de 42 dias.

[0013] A figura 4 ilustra o crescimento de tumor em ratos implantados com células C3 e tratados no dia 8 com uma formulação de controle consistindo em antígeno de FP e adjuvante de Pam3Cys em uma emulsão de água em óleo (adjuvante de Freund incompleto). Os ratos de controle (grupo 4, n=8) implantados com células C3 e tratados no dia 8 com uma formulação de controle consistindo em antígeno de FP e adjuvante de Pam3Cys em uma emulsão de água em óleo (adjuvante de Freund incompleto). Os tumores foram monitorados semanalmente para um total de 42 dias.

[0014] A figura 5 ilustra o crescimento de tumor durante um período de 42 dias em ratos implantados com células C3 e tratados no dia 8 com uma composição sem água consistindo em antígeno de FP, adjuvante de Pam3Cys, veículo de DOPC e um veículo hidrofóbico (adjuvante de Freund incompleto). Os ratos (grupo 5, n=7) implantados com células C3 e tratados no dia 8 com uma composição sem água consistindo em antígeno de FP, adjuvante de Pam3Cys, veículo de DOPC e um veículo hidrofóbico (adjuvante de Freund incompleto). Os tumores foram monitorados semanalmente para um total de 42 dias.

[0015] A figura 6 ilustra a resposta imune celular em três grupos de ratos (n=4) vacinado como se segue: os ratos do grupo 1 foram vacinados com FP em uma emulsão de água em óleo típica (adjuvante de Freund incompleto), os ratos do grupo 2 foram vacinados com uma formulação sem água consistindo em FP, DOPC e e o adjuvante de Freund incompleto, e os ratos do grupo 3 foram vacinados com uma formulação de controle sem água consistindo em FP e o adjuvante de Freund incompleto. As respostas imunes celulares foram medidas pelo ensaio de ELISPOT e são apresentados como uma média de unidades de formação de colônia.

[0016] A figura 7 mostra que os frascos (vista da elevação frontal) contendo o veículo hidrofóbico (frasco ISA51), polyIC formulado de acordo com a presente invenção (frasco 21), e polyIC suspenso no veículo hidrofóbico na ausência do composto anfipático DOPC (frasco 26). Uma suspensão heterogênea de fitas insolúveis de polyIC pode ser facilmente vista no frasco 26.

[0017] A figura 8 mostra que os frascos (vista do plano de fundo) contendo o veículo hidrofóbico (frasco ISA51), antígenos de peptídeo formulados de acordo com a presente invenção (frasco 30), e antíge- nos de peptídeo suspensos no veículo hidrofóbico na ausência do composto anfipático DOPC (frasco 35). Os agregados de antígeno que não puderam ser ressuspenso no veículo hidrofóbico podem ser facilmente vistos no frasco 35 (circulados).

DESCRIÇÃO DETALHADA.

[0018] A invenção fornece composições compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em: um antígeno; um composto anfipático; e um veículo hidrofóbico; em que a composição é substancialmente sem água.

ANTÍGENOS.

[0019] As composições da invenção compreendem um ou mais antígenos. Tal com aqui utilizado, o termo "antígeno" refere-se a uma substância que pode se ligar especificamente a um anticorpo ou a um receptor de célula-T.

[0020] Antígenos úteis nas composições da invenção, incluem, sem limitação, polipeptídeos, um micro-organismo ou uma parte dos mesmos, tais como uma bactéria, vírus ou protozoário vivo, atenuado, inativado ou morto, ou parte dos mesmos.

[0021] Tal com aqui utilizado e nas reivindicações, o termo "antí-geno" também inclui um polinucleotídio codificando o polipeptídeo que funciona como um antígeno. As estratégias de vacinação a base de ácidos nucleicos são conhecidas, em que uma composição de vacina que contém um polinucleotídio é administrada a um paciente. O poli- peptídeo antigênico codificado pelo polinucleotídio é expresso no paciente, de tal modo que o polipeptídeo antigênico está, ao final, presente no paciente, exatamente como se a própria composição da vacina contivesse o polipeptídeo. Para os objetivos da presente invenção, o termo "antígeno", em que o contexto exige, abrange tais polinucleotí- dios codificandom o polipeptídeo que funciona como o antígeno.

[0022] Os polipeptídeos ou os fragmentos dos mesmos que podem ser úteis como antígenos na invenção incluem, sem limitação, os derivados do toxoide da cólera, toxoide do tétano, toxoide da difteria, antígeno superficial da hepatite B, hemaglutinina, neuraminidase, proteína da influenza M, PfHRP2, pLDH, aldolase, MSP1, MSP2, AMA1, Der-p-1, Der-f-1, adipofilina, AFP, AIM-2, ART-4, BAGE, alfa- fetoproteína, BCL-2, Bcr-Abl, BING-4, CEA, CPSF, CT, D1EP-CAME ciclina, EphA2, EphA3, ELF-2, FGF-5, G250, Hormônio de liberação da gonadotropina, HER-2, carboxil estearase intestinal (iCE), IL13Ralpha2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MART-1, MART-2, M-CSF, MDM-2, MMP-2, MUC-1, NY-EOS-1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, p53, PBF, PRAME, PSA, PSMA, RAGE-1, RNF43, RU1, RU2AS, SART-1, SART-2, SART-3, SAGE-1, SCRN 1, SOX2, SOX10, STEAP1, surviving, Telomerase, TGFbetaRII, TRAG-3, TRP-1, TRP-2, TERT e WT1.

[0023] Os vírus, ou partes dos mesmos, úteis como antígenos napresente invenção incluem, sem limitação, Cowpoxvírus, Vaccinia vírus, vírus de Pseudovaríola bovina, herpesvírus Humano 1, herpesví- rus Humano 2, Citomegalovírus, adenovírus Humano A-F, Poliomaví- rus, Papilomavírus humano, Parvovírus, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite C, Vírus da Imunodeficiência Humana, Ortoreovírus, Rotavírus, Ebolavírus, vírus de parainfluenza, vírus da influenza A, vírus da influenza B, vírus da influenza C, vírus do sarampo, vírus da parotidite, vírus da rubéola, pneumovírus, vírus sincicial respiratório humano, vírus da hidrofobia, vírus da encefalite da Califórnia, vírus da encefalite japonesa, vírus de Hantaan, vírus da coriome- ningite linfocítica, Coronavírus, Enterovírus, Rhinovírus, Poliovírus, No- rovírus, Flavivírus, vírus da dengue, vírus do Nilo do Oeste, vírus da febre amarela e vírus da varicela.

[0024] As bactérias ou as partes das mesmas úteis como antíge- nos na invenção incluem, sem limitação, Antraz, Brucella, Candida, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Cólera, Clostridium botulinum, Coccidioides immitis, Cryptococcus, Difteria, Escherichia coli O157: H7, Escherichia coli entero-hemorrágica, Escherichia coli ente- rotoxigênica, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella, Leptospira, Listeria, Meningococcus, Mycoplasma pneumoniae, Mycobacterium, Pertussis, Pneumonia, Salmonela, Shigella, Estafilococo, Estreptococo pneumoniae e Yersinia enterocolitica.

[0025] O antígeno pode ser alternativamente de origem protozoária, por exemplo, o Plasmodium falciparum, que causa a malária.

[0026] Tal com aqui utilizado, o termo "polipeptídeo" ou "proteína" significa qualquer cadeia de aminoácidos, independente do comprimento (por exemplo, 4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 200, 500 ou mais amino- ácidos) ou modificação pós-translação (por exemplo, glicação ou fosfo- rilação). Ambos os termos estão usados de modo trocável. Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são destinados a abranger moléculas (tal como peptidomiméticos) que imitam as propriedades ou a função de um polipeptídeo ou proteína, mas incorporando modificações para alterar as propriedades da molécula, tais como a estabilidade da molécula ou a atividade biológica. Estas modificações incluem cadeias principais, por exemplo, alteradas (por exemplo, a inclusão de ligações não-peptídicas) e a incorporação de aminoácidos de ocorrência não natural.

[0027] Tal com aqui utilizado, o termo "polinucleotídio" abrange uma cadeia de nucleotídios de qualquer comprimento (por exemplo, 9, 12, 18, 24, 30, 60, 150, 300, 600, 1500 ou mais nucleotídios) ou qualquer número de fitas (por exemplo, de fita simples ou fita dupla). Os polinucleotídios podem ser DNA (DNA, por exemplo, genômico ou cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA) ou combinações dos mesmos. Eles podem ser de ocorrência natural ou sintéticos (por exemplo, qui- micamente sintetizados). É contemplado que o polinucleotídio possa conter modificações de uma ou mais bases nitrogenadas, açúcares de pentose ou grupos fosfato na cadeia de nucleotídio. Tais modificações são bem conhecidas na técnica e pode ser usadas com o objetivo de, por exemplo, melhorar a estabilidade do polinucleotídio.

[0028] A concentração do antígeno pode ser tão alta quanto necessário para estimular eficazmente uma resposta imune, com as limitações da quantidade do antígeno sendo aquela em que o antígeno não deve precipitar da composição, e o antígeno deve ser ressuspen- dível no veículo hidrofóbico. Também, a concentração do antígeno varia dependendo do tipo do antígeno e a quantidade de outros componentes na composição. Um versado na técnica pode determinar prontamente a quantidade de antígeno necessária em uma determinada aplicação. Por exemplo, para antígenos de peptídeo aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/ml podem ser usados (a base de volume total da composição), com a faixa de variação preferida sendo não menor do que 0,1 e não maior do que 1,0 mg/ml. Para outros antíge- nos, tais como proteínas recombinantes, a concentração pode estar numa faixa de variação de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 mg/ml, com a faixa de variação preferida sendo não menor do que 0,01 e não maior do que 0,5 mg/ml.

COMPOSTOS ANFIFÍLICOS

[0029] As composições da invenção compreendem um ou mais compostos anfifílicos. Um "composto anfipático" é um composto possuindo ambas as partes, ou características, hidrofílicas e hidrofóbicas. A porção hidrofóbica de um composto anfipático é tipicamente uma grande porção de hidrocarboneto, tal como uma cadeia longa da forma CH3(CH2)n, com n> 4. A porção hidrofílica de um composto anfipático é normalmente um grupo polar com carga ou um grupo sem carga. Os grupos com cargas incluem grupos aniônicos e catiônicos. Os exem- plos de grupos aniônicos com carga incluem os seguintes (em que a parte hidrofóbica da molécula é representada por "R"): carboxilatos: RCO2-; sulfatos: RSO4-; sulfonatos: RSO3-; e fosfatos (a funcionalidade com carga nos fosfolipídios). Os grupos catiônicos com cargas incluem, por exemplo, aminas: RNH3+ ("R" representando novamente a parte hidrofóbica da molécula). Os grupos polares sem cargas incluem, por exemplo, álcoois com grandes grupos R, tais como diacil glicerol (DAG). Os compostos anfifílicos podem ter várias partes hidrofóbicas, várias partes hidrofílicas, ou várias de ambas. São exemplos as proteínas e alguns copolímeros em bloco. Os esteroides, colesterol, ácidos graxos, ácidos da bile, e saponinas, são também compostos anfifílicos úteis na prática da presente invenção.

[0030] As composições da invenção podem conter um único composto anfipático ou uma mistura de compostos anfifílicos. Em algumas modalidades, o composto anfipático é um fosfolipídio ou uma mistura de fosfolipídios.

[0031] Amplamente definido, o termo "fosfolipídio" é um membro de um grupo de compostos de lipídio que produzem, sob hidrólise com ácido fosfórico, um álcool, o ácido graxo, e a base nitrogenada. Os fos- folipídios que podem ser usados na prática da presente invenção, incluem os fosfoglicerídios, que são fosfolipídios nos quais duas cadeias laterais de acil graxos são esterificados em dois dos três grupos hidro- xila de uma molécula de glicerol. O terceiro grupo hidroxila da molécula de glicerol é esterificado com o fosfato. O grupo de fosfato é normalmente também esterificado a um grupo hidroxila em um composto hidrofílico, tal como etanolamina, serina, colina, ou glicerol. Os fosfoli- pídios que são fosfoglicerídios incluem, por exemplo, fosfatidiletanola- mina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, dioleoil fosfatidilcolina ("DOPC"), fosfatidilinositol, e difosfatidilglicerol. Outro fosfolipídio comum é esfin- gomielina. A esfingomielina contém a esfingosina, um aminoálcool com uma cadeia de hidrocarboneto nãosaturada longa. Um cadeia lateral de acil graxo é ligada ao grupo amino da esfingosina por uma ligação amida, para formar a ceramida. O grupo hidroxila da esfingosina é esterificado à fosfocolina. Como os fosfoglicerídios, a esfingomielina é anfifílica. Todos esses e outros fosfolipídios podem ser usados na prática da presente invenção. Em algumas modalidades, são usados fosfolipídios possuindo um comprimento de cadeia de carbono entre 4 e 24 átomos. A lecitina, que também pode ser usada, é uma mistura natural de fosfolipídios tipicamente derivados de ovos de galinha ou lã de ovelhas. Os fosfolipídios podem ser comprados os lipídios da Avan- ti (Alabastar, Alabama, EUA), e os lipoides da LLC (Newark, NJ, EUA). EMULSIFICANTE.

[0032] As composições da invenção podem compreender um ou mais emulsificantes. O emulsificante pode ser um agente emulsificante puro ou uma mistura de agentes emulsificantes. Os emulsificantes da presente invenção são farmaceuticamente e/ou imunologicamente aceitáveis. Os emulsificantes geralmente auxiliam na estabilização da mistura de composto anfipático e antígeno ou na mistura de composto anfipático, antígeno e adjuvante, quando as misturas são ressuspen- sas no veículo hidrofóbico.

[0033] O emulsificante pode ser anfipático e por isso, o emulsifi-cante pode incluir uma ampla faixa de variação de compostos. Em algumas modalidades, o emulsificante pode ser um tensoativo, tal como, por exemplo, um tensoativo não-iônico.

[0034] Os exemplos de emulsificantes que podem ser usados in cluem polissorbatos, que são líquidos oleosos derivados do polietileno sorbital glicado, e ésteres de sorbitano. Os polissorbatos podem incluir, por exemplo, o monooleato de sorbitano. Os emulsificantes típicos incluem o oleato de manida (Arlacel® A), lecitina, Tween® 80, e Spans® 20, 80, 83 e 85, o emulsificante é geralmente pré-misturado com o veículo hidrofóbico.

[0035] Em algumas modalidades, um veículo hidrofóbico que já contém um emulsificante pode ser usado. Por exemplo, um veículo hidrofóbico tal como o Montanide® ISA-51 já contém o emulsificante oleato de manida. Em outras modalidades, o veículo hidrofóbico pode ser misturado com o emulsificante antes de se combinar com o composto anfipático e o antígeno.

VEÍCULO HIDROFÓBICO.

[0036] O veículo hidrofóbico pode ser uma substância hidrofóbica essencialmente pura ou uma mistura de substâncias hidrofóbicas.

[0037] As substâncias hidrofóbicas que são úteis nas composições tal como aqui descrito são aquelas que são farmaceuticamente e/ou imunologicamente aceitáveis. O veículo é preferivelmente um líquido, mas certas substâncias hidrofóbicas que não são líquidas na temperatura atmosférica podem ser liquefeitas, por exemplo, com aquecimento, e são também úteis na presente invenção.

[0038] Os óleos ou as misturas de óleos são veículos particularmente adequados para usam na presente invenção. Os óleos devem ser farmaceuticamente e/ou imunologicamente aceitáveis. Os óleos podem ser metabolizáveis ou não-metabolizáveis, ou pode ser utilizada uma mistura de óleos metabolizáveis e não-metabolizáveis.

[0039] Os exemplos preferidos de óleos são o óleo mineral (oleo mineral especialmente leve ou de viscosidade baixa), óleo vegetal (por exemplo, óleo de soja), óleo de grãos (por exemplo, óleo de amendoim). Um óleo mineral de viscosidade baixa, tal como Drakeol® 6VR pode ser usado em algumas modalidades. Em uma modalidade, o óleo é um oleato de manida em uma solução de óleo mineral, comercialmente disponível como Montanide® ISA 51. Outros óleos podem incluir as séries Montanide ISA 700 (Seppic Inc, França) ou o MAS-1 (Mercia Pharmaceuticals), por exemplo. Em modalidades em que há um veículo hidrofóbico puro, o veículo hidrofóbico pode ser misturado com o emulsificante antes do uso nas composições da presente invenção.

[0040] Gorduras animais e materiais poliméricos hidrofóbicos artificiais, particularmente aqueles que são líquidos na temperatura atmosférica ou isto podem ser liquefeitos relativamente facilmente, também podem ser usados.

[0041] Os fluorcarbonos líquidos são veículos hidrofóbicos medicamente aplicáveis que também podem ser usados na prática da presente invenção.

OUTROS COMPONENTES

[0042] A composição pode compreender também um ou mais componentes adicionais tal como, por exemplo, adjuvantes farmaceu- ticamente aceitáveis, os excipientes, etc., como são conhecidos na técnica: Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA 1985)) e na The United States Pharmacopoeia: The National Formulary (USP 24 NF19) publicado em 1999.

[0043] O termo "adjuvante" refere-se a um composto ou mistura que melhora a resposta imune a um antígeno. Um adjuvante pode servir como um depósito no tecido que lentamente libera o antígeno e também como um ativador do sistema linfoide que melhora não- especificamente a resposta imune (Hood et al, Immunology, 2d ed., Benjamin/Cummings: Menlo Park, C.A., 1984; ver Wood and Williams, In: Nicholson, Webster and May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 23, pp. 317-323).

[0044] Os adjuvantes adequados incluem, mas não são limitados a, alúmen, outros compostos de alumínio, bacilo de Calmette e Guerin (BCG), TiterMax®, Ribi®, o adjuvante de Freund incompleto (IFA), sa- ponina, substâncias com superfície ativa, tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, Corynebacteriumparvum, QS-21, Adjuvante Completo de Freund (FCA), adjuvantes da família de ago- nista TLR, tais como CpG, polyIC (um RNA de dupla fita), flagelina, lipopeptídeos, peptidoglicanos, imidazoquinolinas, RNA de fita única, lipopolissacarídios (LPS), proteína de choque térmico (HSP), e cera- midas e derivados, tais como alfa Gal-cer. Os adjuvantes adequados também incluem citocinas ou quimiocinas no seu polipeptídeo ou formas de codificação de DNA tal como, mas não-limitados a, GM-CSF, TNF-alfa, IFN-gama, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21.

[0045] O veículo hidrofóbico, discutido acima, pode em alguns exemplos funcionar como um adjuvante.

[0046] A quantidade usada do adjuvante depende da quantidade de antígeno e no tipo do adjuvante. Um versado na técnica pode determinar prontamente a quantidade de adjuvante necessário em uma determinada aplicação.

[0047] A composição também pode conter um ou mais polipeptí-deos adicionais, que podem ser um polipeptídeo sintético curto, tal como um epítopo auxiliar T.

PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES.

[0048] O antígeno e o composto anfipático são misturados antes para a suspensão no veículo hidrofóbico. Preferivelmente, o antígeno e o composto anfipático são combinados de tal maneira que é formada uma mistura substancialmente homogênea. Isto pode ser realizado solubilizando o antígeno e/ou o composto anfipático em um solvente adequado antes que os componentes sejam combinados. Alternativamente, as duas entidades podem ser misturadas em conjunto na sua forma seca (por exemplo, por moagem). Neste contexto, uma "mistura substancialmente homogênea" de antígeno e o composto anfipático é uma mistura na qual o composto anfipático é substancialmente uniformemente disperso dentro do componente do antígeno.

[0049] O composto anfipático ou a mistura de compostos anfifílicos está presente nas composições da invenção em uma quantidade suficiente para que o antígeno possa ser ressuspenso no veículo hidrofó- bico. A quantidade do composto anfipático nas composições da presente invenção pode ser, por exemplo, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 250 mg do composto anfipático por ml da composição, mais preferivelmente aproximadamente 0,1 a aproximadamente 120 mg do composto anfipático por ml da composição.

[0050] Se o antígeno e/ou o composto anfipático forem solubiliza-dos, o versado na técnico pode identificar prontamente solventes adequados ou sistemas de solventes (geralmente solventes orgânicos) para solubilização de um determinado composto anfipático ou antíge- no. No caso de um composto anfipático que é um fosfolipídio, um solvente prótico polar, tal como um álcool (por exemplo, terc-butanol, n- butanol, isopropanol, n-propanol, etanol ou metanol), água, ácido fór- mico ou ácido acético, ou clorofórmio, pode ser usado. Os antígenos, tais como polipeptídeos podem ser solubilizados com um solvente aprótico polar, tal como sulfóxido de dimetila (DMSO), dimetil formami- da (DMF), ou tetra-hidrofurano (THF). Outros solventes, tais como solventes não polares (por exemplo, hexano) podem ser usados, bem como CO2 líquido.

[0051] Em alguns casos, o mesmo solvente pode ser usado para solubilizar ambos o anfipático e o antígeno de interesse.

[0052] O antígeno solubilizado e composto anfipático solubilizado são então misturados. Alternativamente, o antígeno e o composto an- fipático podem ser misturados antes para solubilização, e depois solu- bilizados em conjunto. Em uma alternativa adicional, só um dos compostos, ou o anfipático ou o antígeno é solubilizado, e o componente não-solubilizado é acrescentado.

[0053] O solvente é então removido, e isto pode ser realizado usando as técnicas padrão. Se um solvente rapidamente evaporável for usado, tal como etanol, metanol, ou clorofórmio, uma técnica de evaporação padrão, tal como evaporação rotativa, a evaporação sob pressão reduzida, ou a liofilização, pode ser empregada. Os solventes tais como água, podem ser removidos por, por exemplo, liofilização ou secagem por atomização. A secagem por baixo aquecimento que não compromete a integridade dos componentes também pode ser usada. O aquecimento também pode ser usado para auxiliar na ressuspensão da mistura de antígeno/composto anfipático antes do seu uso.

[0054] Preferivelmente, o antígeno solubilizado e o composto anfi-pático solubilizado são misturados completamente e depois secos, tal como descrito acima. Preferivelmente, a mistura seca é uma mistura substancialmente homogênea do antígeno e o composto anfipático em que o composto anfipático é substancialmente uniformemente disperso dentro do componente do antígeno. Se, em vez disso, a mistura substancialmente homogênea do antígeno e do composto anfipático for formada por um processo sem solvente, tal como a moagem seca, não há naturalmente nenhuma necessidade para uma etapa de secagem.

[0055] A mistura seca do antígeno e o composto anfipático é então ressuspensa no veículo hidrofóbico para fornecer a composição final. Em algumas modalidades, o veículo hidrofóbico pode conter um emul- sificante, tal como descrito detalhadamente acima, que é fornecido em uma quantidade suficiente para ressuspender a mistura seca do antí- geno e o composto anfipático no veículo hidrofóbico e manter o antí- geno e o composto anfipático em suspensão no veículo hidrofóbico. Por exemplo, o emulsificante pode estar presente em aproximadamente 5% peso/peso ou peso/volume a aproximadamente 15% peso/peso ou peso/volume do veículo hidrofóbico.

[0056] Os componentes adicionais tal como os descritos acima, tais como um adjuvante ou outros auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, podem ser acrescentados em qualquer etapa no processo de formulação. Por exemplo, um ou mais dos tais componentes adicionais podem ser combinados com o antígeno ou o composto anfipático antes ou depois da solubilização, ou acrescentados à mistura solubiliza- da. Os componentes adicionais, tal como um adjuvante, podem ser em vez disso acrescentados a, ou combinados com, a mistura seca do antígeno e o composto anfipático, ou combinados com o veículo hidro- fóbico antes ou depois da suspensão da mistura seca do antígeno e o composto anfipático no veículo hidrofóbico. Similarmente se uma técnica de mistura seca for usada, qualquer componente adicional pode ser acrescentado antes ou depois da moagem.

[0057] Inesperadamente, uma resposta imune forte é conseguível quando o antígeno é suspenso no veículo hidrofóbico tal como descrito, na ausência de quantidades substanciais de água. Não se espera que os antígenos possam ser colocados em um veículo hidrofóbico a menos que sejam formulados na composição aqui descrita. Na prática, pode ser difícil obter composições completamente sem água. Isto é, embora toda, ou substancialmente toda, a água seja removida, tal como por evaporação, liofilização ou qualquer outra técnica de secagem adequada, na etapa apropriada no processo de formulação, pode haver pequenas quantidades de água remanescentes. Por exemplo, os componentes individuais da composição podem ter se ligado a água que pode não ser completamente removida por processos, tais como liofilização ou evaporação, e certos veículos hidrofóbicos podem conter pequenas quantidades de água dissolvidas no mesmo. Quando a água está presente, por exemplo, na forma de uma emulsão na composição, espera-se que alguma quantidade do antígeno possa ficar partilhada na água. Consequentemente, a presença de água na composição reduz a quantidade do antígeno suspenso no veículo hi- drofóbico e, assim, a água é indesejável na composição final.

[0058] A composição final é substancialmente sem água. Por "substancialmente sem água" deseja-se significar que a proporção do antígeno suspenso em (por exemplo, dissolvido na) água em relação à quantidade total do antígeno na composição (peso/peso) é baixa o bastante para que a quantidade de antígeno suspenso em água, por si mesma, seja incapaz de estruturar uma resposta imune equivalente a aquela fornecida pela composição como um todo. Ao contrário, a quantidade do antígeno que está suspensa no veículo hidrofóbico é suficientemente alta para que uma resposta imune equivalente possa ser gerada com aquela quantidade (isto é, a quantidade total menos a quantidade de antígeno presente em um componente de água residual). A eficácia da composição (isto é a sua capacidade de produzir a resposta biológica desejada), por isso, deve ser atribuída principal-mente ao antígeno suspenso no veículo hidrofóbico. Neste sentido, a eficácia da composição é de pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% tão grande quanto a induzida pela mesma composição na qual nenhum antígeno está presente em um componente de água residual.

[0059] As composições da invenção que são "substancialmente sem água" geralmente contêm menos de aproximadamente 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, água de 0,05% ou de 0,01% em uma base de peso/peso. Espera-se que a quantidade do antígeno suspenso no componente de água residual seja menor que 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos da quantidade total (em base de peso) do antígeno na composição.

[0060] Tipicamente, as composições da invenção são suficiente mente livres de água de modo que não é formada nenhuma emulsão de água em óleo que seja visível a olho nu. Por exemplo, a presença de uma emulsão de água em óleo indesejável poderia ser detectada por uma aparência não-transparente, nublada ou opaca na composição. Ao contrário as composições da invenção tipicamente têm uma aparência clara ou transparente e são livres de material particulado visível, tal como precipitado ou agregado de antígeno que não esteja suspenso no veículo hidrofóbico.

[0061] As composições tal como aqui descrito podem ser formuladas em qualquer forma adequada para a liberação de um antígeno a um paciente, incluindo, por meio de exemplos não-limitantes, uma forma que é adequada para administração oral, nasal, retal ou parenteral. A administração parenteral inclui, sem limitação, a intravenosa, intraperitonial, intradérmica, subcutânea, intramuscular, transepitelial, intrapulmonar, intratecal, e os modos tópicos de administração.

KITS E REAGENTES

[0062] A presente invenção é opcionalmente fornecida a um usuário como um kit. Por exemplo, um kit da invenção contém uma ou mais das composições da invenção. O kit pode compreender também um ou mais reagentes adicionais, material para embalagem, reservatórios para manter os componentes do kit, e um conjunto de instruções ou manual do usuário com detalhamento de métodos preferidos para usar os componentes do kit para um objetivo desejado.

[0063] Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser fornecidas na forma de uma mistura seca do antígeno e do composto anfipático empacotada em um primeiro reservatório e do veículo hidrofóbico empacotado em um segundo reservatório. A mistura seca do antígeno e do composto anfipático pode ser então suspensa no veículo hidrofóbico pouco antes da administração a um paciente.

USOS

[0064] A invenção encontra a aplicação em qualquer exemplo na qual seja desejável administrar um antígeno em um paciente. O paciente pode ser um vertebrado, tal como um peixe, pássaro ou mamífero, preferivelmente um ser humano.

[0065] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas a um paciente para levantar uma resposta de anticorpo ao antígeno.

[0066] Um "anticorpo" é uma proteína compreendendo um ou mais polipeptídeos substancialmente ou parcialmente codificados por genes da imunoglobulina ou fragmentos de genes da imunoglobulina. Os genes da imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como inumeráveis genes da região variável da imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lamdba. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, o que por sua vez define as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Uma unidade estrutural típica da imunoglobulina (anticorpo) compreende uma proteína contendo quatro polipeptídeos. Cada unidade estrutural de anticorpo sendo composta de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada uma possuindo uma cadeia "leve" e uma cadeia "pesada". A terminação N de cada cadeia define uma região variável principalmente responsável para reconhecimento do antígeno. As unidades estruturais do anticorpo (por exemplo, do IgA e as classes de IgM) também podem se aglomerar em formas oli- goméricas umas com as outras com cadeias adicionais de polipeptí- deo, por exemplo, como pentâmeros de IgM em associação com o po- lipeptídeo de cadeia J.

[0067] Os anticorpos são os produtos de glicoproteína específicos para o antígeno de um subconjunto de células brancas do sangue chamadas linfócitos B (células B). A ligação do antígeno com o anticorpo expressado na superfície das células B pode induzir uma resposta de anticorpo compreendendo o estímulo para que as células B se tornem ativadas, sofram mitose e finalmente se diferenciem em células plasmáticas, que são especializadas para síntese e secreção do anticorpo específico para o antígeno.

[0068] Tal como aqui utilizado, o termo "resposta de anticorpo" re-fere-se a um aumento na quantidade de anticorpos específicos para o antígeno no corpo de um paciente em resposta à introdução do antí- geno no corpo do paciente.

[0069] Um método para avaliar uma resposta de anticorpo deve medir as titulações de anticorpos reativos com um determinado antí- geno. Isto pode ser executado usando vários métodos conhecidos na técnica, tais como ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) de substâncias contendo anticorpo, obtidas de animais. Por exemplo, as titulações de anticorpos no soro que se ligam a um determinado antí- geno podem ser determinadas em um paciente tanto antes como depois da exposição ao antígeno. Um aumento estatisticamente significativo na titulação de anticorpos específicos para o antígeno em seguida a exposição ao antígeno indicaria que o paciente tinha estruturada uma resposta de anticorpo ao antígeno.

[0070] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas a um paciente de modo a fazer surgir uma resposta imune mediada por célula para o antígeno. Tal com aqui utilizado, o termo "resposta imune mediada por célula" refere-se a um aumento a quantidade de finfócitos-T citotóxicos específicos para o antígeno, macrófagos, células natural killer, ou citocinas no corpo de um paciente em resposta à introdução do antígeno no corpo do paciente.

[0071] Historicamente, o sistema imune foi separado em dois ra mos: a imunidade humoral, para a qual a função protetora da imunização pode ser encontrada no humor (fluido corpóreo livre de células ou soro contendo anticorpos) e imunidade celular, para a qual a função protetora da imunização foi associada com células. A imunidade mediada por célula é uma resposta imune que envolve a ativação de ma- crófagos, células natural killer (NK), linfócitos-T citotóxicos específicos para o antígeno, e a liberação de várias citocinas em resposta a um antígeno não self. A imunidade celular é um componente importante da resposta imune adaptável e sucede o reconhecimento do antígeno pelas células através de sua interação com células apresentando o antígeno, tais como células dendríticas, Linfócitos B e em uma menor extensão, os macrófagos, que protege o corpo por vários mecanismos, tais como:1. Ativação de linfócitos-T citotóxicos específicos para o an- tígeno que sejam capazes de induzir a apoptose em células do corpo expondo os epítopos do antígeno estranho nas suas superfícies, tais como células infectadas por vírus, células com bactérias intracelulares, e células de câncer expondo antígenos de tumor;2. Ativação de macrófagos e células exterminadoras naturais, permitindo-as destruir agentes patogênicos intracelulares; e3. Estimulação de células para secretar várias citocinas que influem na função de outras células envolvidas em respostas imunes adaptáveis e respostas imunes inatas.

[0072] A imunidade mediada por célula é a mais eficaz na remoção de células infectadas por vírus, mas também participa na defesa contra fungos, protozoários, cânceres, e bactérias intracelulares. Ela também desempenha um papel principal na rejeição de transplantes.

DETECÇÃO DA RESPOSTA IMUNE MEDIADA POR CÉLULA APÓS A VACINAÇÃO

[0073] Como a imunidade mediada por célula envolve a participa ção de vários tipos de célula e é mediada por mecanismos diferentes, vários métodos podem ser usados para demonstrar a indução da imunidade em seguida à vacinação. Estes podem ser amplamente classificados na detecção de: i) células de apresentação de antígeno específico; ii) células efetoras específicas e as suas funções e iii) liberação de mediadores solúveis, tais como citocinas.

[0074] i) Células de apresentação de antígeno: células dendríticas e as células B (e em uma menor extensão os macrófagos) são equipados de receptores imunoestimuladores especiais que permitem uma ativação melhorada das células T, e são denominadas células de apresentação de antígeno profissionais (APC). Estas moléculas imu- noestimuladoras (também chamadas moléculas coestimuladoras) são sobre-reguladas nestas células em seguida à infecção ou vacinação, durante o processo da apresentação de antígeno para as células efe- toras, tais como as células T citotóxicas CD4 e CD8. Tais moléculas coestimuladoras (tais como CD80, CD86, MHC classe I ou MHC classe II) podem ser detectadas usando citometria de fluxo com anticorpos conjugados a fluorocromos dirigidos contra essas moléculas juntamente com anticorpos que especificamente identificam APC (tal como o CD11c para células dendríticas).

[0075] ii) Células T citotóxicas: (também conhecidas como Tc, célula T exterminadora, ou Linfócito T citotóxico (CTL)) são um subgrupo de células T que induzem a morte de células que são infectadas com vírus (e outros agentes patogênicos), ou antígenos expressando tumor. Essas CTLs atacam diretamente outras células que transportam certas moléculas estranhas ou anormais na sua superfície. A capacidade de tal citotoxicidade celular pode ser detectada usando ensaios citolítico in vitro (ensaio de liberação de cromo). Assim, a indução da imunidade celular adaptável pode ser demonstrada pela presença de tais células T citotóxicas, em que, quando o antígeno é carregado, tais células alvo são lisadas por CTLs específicas que são geradas in vivo em seguida à vacinação ou infecção.

[0076] As células T citotóxicas naturais são ativadas quando o seu receptor de célula-T (TCR) interage fortemente com uma molécula MHC de classe I ligada ao peptídeo. Esta afinidade depende do tipo e a orientação do antígeno / complexo de MHC, e é o que mantém o CTL e a célula infectada ligados em conjunto. Uma vez ativado o CTL sofre um processo chamado de expansão clonal no qual ganha a fun-cionalidade, e se divide rapidamente, para produzir um exército de células efetoras "armadas". O CTL ativado viajará então para todas as partes do corpo à procura de células que carregam aquela única MHC classe I + peptídeo. Isto pode ser usado para identificar tais CTLs in vitro usando tetrâmeros de peptídeo-MHC classe I em ensaios de ci- tometria de fluxo.

[0077] Quando expostos a estas células somáticas infectadas ou disfuncionais, os CTL efetores liberam a perforina e granulisina: as ci- totoxinas que formam poros na membrana plásmica da célula-alvo, permitindo aos íons e à água fluírem da célula infectada, e fazendo-a estourar ou lisar. Os CTL liberam a granzima, uma protease da serina que entra nas células via poros para induzir a apoptose (morte da célula). A liberação dessas moléculas de CTL pode ser usada como uma medida de indução bem sucedida de resposta imune celular em seguida à vacinação. Isto pode ser feito por ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA) ou o ensaio de imunospot ligado à enzima (ELISPOT) em que os CTLs podem ser quantitativamente medidos. Como os CTLs também são capazes de produzir citocinas importantes, tais como IFN-g, a medição quantitativa de células CD8 produtoras de IFN-g pode ser realizada por ELISPOT e pela medição por citometria de fluxo da IFN-g intracelular nestas células.

[0078] CD4+ Células-T "auxiliares": os linfócitos CD4+, ou células- T auxiliares, são mediadores da resposta imunes, e desempenham um papel importante no estabelecimento e maximização das capacidades da resposta imune adaptável. Estas células não têm atividade citotóxi- ca ou fagocítica; e não pode matar células infectadas ou os agentes patogênicos limpos, mas, em essência "gerenciam" a resposta imune, direcionando outras células para executar essas tarefas. Dois tipos de resposta de CD4+ efetores células-T auxiliares podem ser induzidas por um APC profissional, denominado Th1 e Th2, cada um projetado para eliminar tipos diferentes de agentes patogênicos.

[0079] As células-T auxiliares expressam receptores de célula-T (TCR) que reconhecem o antígeno ligado à moléculas de MHC classe II. A ativação de uma Célula-T auxiliar natural faz com que ela libere citocinas, que influenciam na atividade de muitos tipos de célula, inclusive no APC que a ativou. As células-T auxiliares necessitam de um estímulo de ativação muito mais brando do que as células-T citotóxi- cas. As células-T auxiliares podem fornecer sinais extras que "auxiliam" na ativação de células citotóxicas. Dois tipos de resposta de CD4+ efetores células-T auxiliares podem ser induzidas por um APC profissional, denominado Th1 e Th2, cada um projetado para eliminar tipos diferentes de agentes patogênicos. A medida de citocinas associadas com as respostas Th1 ou Th2 dará uma medida da vacinação bem sucedida. Isto pode ser atingido por ELISA específico projetado para Th1-citocinas, tais como IFN-g, IL-2, IL-12, TNF-a e outros, ou Th2- citocinas, tais como IL-4, IL-5, IL10 entre outros.

[0080] iii) Medição das citocinas: liberadas dos linfonodos elas for necem uma boa indicação da imunização bem sucedida. Como um resultado da apresentação de antígeno e da maturação do APC e das células imunoefetoras, tais como células T CD4 e CD8, várias citoci- nas são liberadas por células do nodo linfático. Por cultivo destes LNC in vitro na presença do antígeno, a resposta imune específica para o antígeno pode ser detectada medindo a liberação se certas citocinas importantes, tais como IFN-g, IL-2, IL-12, TNF-a e GM-CSF. Isto pode ser feito por ELISA utilizando a cultura de sobrenadantes e citocinas recombinantes como padrões.

[0081] A invenção encontra uma ampla aplicação na prevenção e tratamento de qualquer doença suscetível de prevenção e/ou tratamento por meio da administração de um antígeno. As aplicações re- presentativas da invenção incluem o tratamento e prevenção do câncer, terapia genética, terapia adjuvante, tratamento e prevenção de doença contagiosa, tratamento e prevenção de alergia, tratamento e prevenção de doença autoimune, tratamento de doença degenerativa do neurônio, e tratamento de arteriosclerose, tratamento e prevenção de dependência de droga, controle hormonal para tratamento e prevenção de doença, controle de um processo biológico com objetivos de contracepção.

[0082] A prevenção ou o tratamento da doença incluem a obten ção de resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, mas não estão limitados a, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas ou condições, diminuição de extensão da doença, estabilização do estado da doença, prevenção do desenvolvimento da doença, prevenção da extensão de doença, atraso ou redução de velocidade da progressão de doença, atraso ou redução de velocidade do ataque de doença, conferir imunidade protetora contra um agente que causa a doença e melhoria ou redução do estado de doença. A prevenção ou o tratamento também podem significar que o prolongamento da sobrevivência de um paciente, além do que seria esperado na ausência do tratamento e também pode significar a inibição da progressão da doença temporariamente, embora mais preferivelmente, ela implique na prevenção da ocorrência da doença tal como prevenindo a infecção em um paciente.

[0083] O versado na técnica pode determinar regimes de tratamento adequados, vias de administração, dosagens, etc., para qualquer aplicação determinada para atingir o resultado desejado. Os fatores que podem ser considerados incluem, por exemplo: a natureza do antígeno; o estado da doença a ser prevenido ou tratado; a idade, condição física, peso de corpo, sexo e dieta do paciente; e outros fato-res clínicos.

[0084] A invenção é também ilustrada pelos seguintes exemplos não-limitantes.

EXEMPLO 1.

[0085] Os ratos C57BL/6 fêmeas livres de agentes patogênicos, com 6-8 semanas da idade, foram obtidos dos Laboratórios Charles River (St Constant, Quebec, Canadá) e foram alojados de acordo com a orientação institucional com água e comida à vontade, sob circulação controlada de ar filtrado.

[0086] A linhagem de células C3 usada neste estudo, um modelo de rato bem descrito de pesquisa pré-clínica de câncer cervical, é uma linhagem de células HPV-16 expressando células tumorais C3 derivadas de células B6 (B6mec) de embrião de rato e transformadas com o genoma HPV 16 completo sob o seu próprio promotor e um oncogene com ativação ras. A linhagem de célula C3 desenvolve tumores quando injetada subcutaneamente e foi usada em estudos de provocação de câncer para examinar a eficácia da vacina administrada antes ou depois da implantação das célula de tumor C3. A linhagem de célula C3 foi mantida em meio Iscove modificado da Dulbecco (IMDM; Sigma, St Louis, Missouri) complementado com 10% soro de bezerro fetal inativado por aquecimento (Sigma, St Louis, Missouri), l-glutamina a 2 mM, 2-mercaptoetanol a 50 mM, penicilina e estreptomicina. As células foram incubadas a 37 graus Centígrado/5% CO2.

[0087] O peptídeo HPV 16 E7 (H-2Db) RAHYNIVTF49-57 (SEQ ID N°: 1) contendo um epítopo CTL foi fundido à PADRE contendo um epítopo CD4+ auxiliar da Dalton Chemical Laboratories Inc (Toronto, Ontário, Canadá). Este peptídeo é daqui por diante denominado FP e foi usado como antígeno na vacina a 50 microgramas / 100 microlitros de dose. O FP foi usado em estudos de vacina para prevenir ou eliminar tumores C3 em ratos.

[0088] Para formular as vacinas aqui descritas, a dioleoil fosfatidil- colina (DOPC) foi solubilizada em terc-butanol. O FP foi primeiro solu- bilizado no sulfóxido de dimetila, embora uma suspensão em água de FP também possa ser usada. O FP foi então acrescentado à mistura de DOPC/terc-butanol. Em que indicado, um composto imunoestimu- lante a base de lipopeptídeo sintético (adjuvante) foi ressuspenso em água e acrescentado à mistura de DOPC/FP/terc-butanol. Uma mistura homogênea seca do antígeno (com ou sem adjuvante) foi preparada removendo o solvente e a água presente na formulação por liofiliza- ção.

[0089] A mistura seca foi então suspensa no adjuvante de Freund incompleto, um modelo de veículo hidrofóbico a base de óleo mineral.

[0090] A eficácia destas formulações foi comparada com aquelaconsistindo em antígeno (com ou sem adjuvante) na emulsão de água em óleo típica, tal como a emulsão a base de adjuvante de Freund incompleto consistindo principalmente de água (contendo o antíge- no/adjuvante) em um veículo oleoso contínuo a base de óleo mineral.

[0091] Para testar a eficácia destas formulações sem água, os grupos de ratos (7 a 10 ratos por grupo) foram injetados com quinhentas mil células C3 subcutaneamente no flanco esquerdo acima da base da cauda. Oito dias após o implante, todos os ratos foram injetados com formulações de vacina (100 microlitros por dose) subcutaneamen- te no flanco direito. Cinco grupos de ratos foram vacinados como se segue: os ratos do grupo 1 (Figura 1) serviram de ratos de controle que foram injetados com a solução salina de tampão fosfato para permitir a progressão normal dos tumores; os ratos do grupo 2 (Figura 2) foram vacinados com uma emulsão padrão de água em óleo a base de óleo mineral (adjuvante de Freund incompleto) contendo o antígeno FP (50 microgramas por dose) no componente aquoso da emulsão; os ratos do grupo 3 (Figura 3) foram vacinados com uma formulação ho- mogênea sem água preparada tal como descrito acima e contendo o antígeno FP (50 microgramas por dose), DOPC (12 microgramas por dose) e 100 microlitros de um veículo hidrofóbico (adjuvante de Freund incompleto); os ratos do grupo 4 (Figura 4) foram vacinados com uma emulsão padrão de água em óleo a base de óleo mineral (adjuvante de Freund incompleto) contendo o antígeno FP (50 microgramas por dose) e adjuvante de Pam3Cys (50 microgramas por dose) no componente aquoso da emulsão; os ratos do grupo 5 (Figura 5) foram vacinados com uma formulação sem água homogênea preparada tal como descrito acima e contendo o antígeno FP (50 microgramas por dose), adjuvante de Pam3Cys (50 microgramas por dose), DOPC (12 micro- gramas por dose) e 100 microlitros de um veículo hidrofóbico (adjuvante de Freund incompleto); o crescimento de tumor foi monitorado em todos os ratos segundo uma base semanal por 42 dias para avaliar o efeito da vacinação no crescimento de tumor.

[0092] Todos os ratos do grupo 1 implantados com células C3 desenvolveram tumores com tumores atingindo 1881 milímetros cúbicos de tamanho no dia 42 após a implantação do tumor. As vacinações de controle consistindo em antígeno de FP em uma emulsão de água em óleo controlaram o crescimento de tumor em ratos (grupo 2), com os tumores progredindo a um tamanho médio de 548 milímetros cúbicos no dia 42. Os ratos do grupo 3 vacinados com uma composição sem água do antígeno FP em um veículo hidrofóbico que e utiliza DOPC como um veículo anfipático para assegurar ressuspensão homogênea do antígeno no óleo, foi significativamente mais eficaz do que as vacinas do grupo 2 no controle do crescimento de tumor. O tamanho de tumor médio nos ratos do grupo 3 foi de 73 milímetro cúbico no dia 42 após a implantação do tumor, com 6 dentre 8 ratos sendo considerados livres de tumor. A adição de um adjuvante, Pam3Cys neste exemplo, melhorou ligeiramente a eficácia da formulação de vacina de água em óleo usada para o grupo 2 (grupo 4 tamanho médio de tumor no dia 42 foi 320 milímetros cúbicos contra o grupo 2 tamanho médio de tumor de 548 milímetros cúbicos). A adição do adjuvante Pam3Cys melhorou a eficácia da formulação de vacina sem água também (vacina do grupo 5), com um tamanho de tumor médio de 14 milímetros cúbicos no dia 42, com 6 entre 7 ratos sendo considerados sem tumor.

[0093] Estes resultados claramente mostram que a exclusão da água de formulações de vacina e o uso de um fosfolipídio a base de uma molécula anfifílica para assegurar a homogeneidade de compostos de ativação imune no veículo hidrofóbico, gerou respostas imunes visadas melhoradas.

EXEMPLO 2

[0094] Os ratos C57BL/6 fêmeas livres de agentes patogênicos,com 6-8 semanas da idade, foram obtidos dos Laboratórios Charles River (Santa Constante, Quebec, Canadá) e foram alojados de acordo com a orientação institucional com água e comida à vontade, sob circulação controlada de ar filtrado.

[0095] O peptídeo HPV 16 E7 (H-2Db) RAHYNIVTF49-57 (SEQ ID N°: 1) contendo um epítopo CTL foi fundido à PADRE contendo um epítopo CD4+ auxiliar pela Dalton Chemical Laboratories Inc (Toronto, Ontário, Canadá). Este peptídeo é daqui por diante denominado FP e foi usado como antígeno na vacina em 20 microgramas / dose de 100 microlitros.

[0096] A eficácia de vacina foi avaliada pelo ensaio de Imunospot ligado à Enzima (ELISPOT), um método que permite a detecção ex vivo de respostas imunes celulares específicas para o antígeno em esplenócitos colhidos de ratos C57BL/6 imunizados. O ensaio de ELISPOT é útil para a avaliação da presença/ausência de uma resposta imune específica para o antígeno, mas tem as suas limitações quando usado como uma correlação da eficácia da vacina contra um alvo in vivo. Resumidamente, no dia 8 pós-imunização, uma micropla- ca de nitrocelulose de 96 poços foi coberta com o anticorpo de captura, anticorpo antirrato IFN-gama purificado, pela incubação durante a noite a 4 °C, depois bloqueado com o meio completo. Os esplenócitos foram acrescentados aos poços em uma concentração inicial de 5x105 células/poço em um volume de 100 μl e uma linha preparada de diluições seriais. As células em uma série de diluição foram estimuladas com o peptídeo específico RAHYNIVTF49-57 (10 μg/ml). A placa foi incubada durante a noite a 37 °C/5%CO2. No dia seguinte, a placa foi incubada com o anticorpo de detecção (um anticorpo antirrato de IFN- Y biotinilado), para 2 horas na temperatura ambiente. O anticorpo de detecção não-ligado foi removido por lavagem e a enzima conjugada (Streptavidina-HRP) foi acrescentada. Após uma incubação de 1 hora na temperatura ambiente, a enzima conjugada não-ligada foi removida por lavagem e a microplaca foi corada com uma solução de substrato AEC por 20 minutos. A microplaca foi lavada, deixada secando ao ar durante a noite, e os focos de coloração foram contados usando uma lente de aumento.

[0097] Para formular a vacina aqui descrita, a dioleoil fosfatidilcoli- na (DOPC) foi solubilizada no terc-butanol. O FP foi primeiro solubili- zado no sulfóxido de dimetila, embora uma suspensão de água de FP também possa ser usado. O FP foi depois acrescentado à mistura DOPC/terc-butanol. Uma mistura homogênea seca do antígeno e DOPC foi preparada removendo o solvente presente na formulação por liofilização.

[0098] A mistura seca foi então suspensa no adjuvante de Freund incompleto, um modelo do veículo hidrofóbico a base de óleo mineral.

[0099] A eficácia dessa formulação foi comparada com uma con sistindo em antígeno na emulsão típica de água em óleo, tal como a emulsão a base de adjuvante de um Freund incompleto consistindo principalmente da água (contendo o antígeno) em um veículo oleoso contínuo a base de óleo mineral. A eficácia da formulação foi também comparada com a de um composto consistindo do antígeno diluído diretamente de uma solução de estoque de antígeno/sulfóxido de di- metila na emulsão de água em óleo típica, tal como a emulsão a base de adjuvante de Freund incompleto.

[00100] Para testar a eficácia desta formulação sem água, os grupos de ratos (4 ratos por grupo) foram injetados com formulações de vacina (100 microlitros por dose) subcutaneamente no flanco direito. Três grupos de ratos foram vacinados como se segue: os ratos do grupo 1 serviram de ratos de controle e foram vacinados com uma emulsão padrão de água em óleo a base de óleo mineral (adjuvante de Freund incompleto) contendo o antígeno FP (20 microgramas por dose) no componente aquoso da emulsão; os ratos do grupo 2 foram vacinados com uma formulação sem água homogênea preparada tal como descrito acima e contendo o antígeno FP (20 microgramas por dose), DOPC (12 microgramas por dose) e 100 microlitros de um veículo hidrofóbico (adjuvante de Freund incompleto); o os ratos do grupo 3 serviram de ratos de controle e foram vacinado com uma formulação sem água homogênea sem o veículo anfipático (DOPC) mas contendo antígeno de FP (20 microgramas por dose), e 100 microlitros de um veículo hidrofóbico (adjuvante de Freund incompleto). Os baços foram removidos de todos os ratos 8 dias depois para examinar a presença de uma resposta imune específica para o antígeno pelo ensaio de ELISPOT.

[00101] Os ratos do grupo 1 geraram uma resposta celular significativa específica para o antígeno. A presença de tal resposta tal como detectado por ELISPOT indica que a formulação de vacina tem o potencial para induzir uma resposta imune eficaz contra um alvo in vivo. Os ratos do grupo 2 que foram injetados com a formulação sem água contendo FP, o veículo anfipático (DOPC), e o veículo de óleo hidrofó- bico foi também capaz de induzir uma resposta imune que indica um potencial para induzir uma resposta imune eficaz contra um alvo in vivo. E os ratos do grupo 3 que foram injetados com uma formulação sem água sem o veículo anfipático (DOPC) mas contendo FP e o veículo de óleo hidrofóbico induziram uma resposta imune significativamente reduzida, tal como detectado por ELISPOT, claramente indicando que esta determinada formulação tem um potencial imunogêni- co consideravelmente mais baixo. Estes resultados claramente mostram que a exclusão de água de formulações de vacina tem o potencial para gerar melhores respostas imunes visadas, contanto que uma molécula anfifílica à base de fosfolipídio esteja presente na formulação.

EXEMPLO 3

[00102] Neste exemplo, o RNA de dupla fita poliIC (Pierce, Milwaukee, EUA) foi usado como uma molécula representativa que tem características físicas e químicas que são semelhantes àquelas de um construtor genético de antígeno (um plasmídio a base de nucleotídio ou molécula de RNA). O polyIC também serve de um adjuvantes a base de nucleotídio representativo que pode ser coformulados com o an- tígeno na invenção. Para formular um volume final de 1 ml da vacina aqui descrita, 120,0 mg da dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) foram solu- bilizados em 480 μl do terc-butanol em uma temperatura de 40 oC por 10 a 15 minutos com agitação. O polyIC foi primeiro solubilizada em água em uma concentração de 5 mg/ml. Então 80 μl de polyIC (0,4 mg) foram também diluídos em 320 μl de água. A diluição de polyIC foi então acrescentada e misturada à mistura DOPC/terc-butanol no frasco 21. Uma mistura homogênea seca de DOPC/adjuvante foi preparada removendo o solvente e a água presentes na formulação por liofili- zação. Uma formulação de controle contendo somente polyIC (frasco 26) foi feita da mesma maneira que descrito acima, com a exceção de que o DOPC não foi acrescentado ao terc-butanol.

[00103] Os teores secos dos frascos 21 e 26 foram então suspensos acrescentando 0,88 ml de um veículo hidrofóbico ao frasco 21, e 1 ml do veículo hidrofóbico ao frasco 26. O veículo hidrofóbico usado foi um oleato de manida contendo de óleo mineral e conhecido como Montanide® ISA 51 (Seppic, França). A mistura seca foi ressuspensa no veículo hidrofóbico por agitação em vórtex por aproximadamente 3 minutos (frasco 21), ou um mínimo de 30 minutos (frasco 26). Os frascos 21 e 26 foram comparados pela inspeção visual em comparação com um frasco contendo somente 1 ml do veículo hidrofóbico (frasco etiquetado como ISA51).

[00104] Pela inspeção visual (figura 7), os teores do frasco 21 pareceram semelhantes àquele de ISA51, sem a presença de qualquer material particulado visível. Isto sugeriu que as moléculas de nucleotí- dio foram eficazmente suspensas no veículo hidrofóbico na presença de DOPC. Ao contrário, o frasco 26, sem DOPC e contendo somente as moléculas de nucleotídio e o veículo hidrofóbico, apresentou uma suspensão heterogênea de moléculas de nucleotídio no veículo hidro- fóbico que pode ser facilmente detectada pela inspeção visual. Na ausência de DOPC, as moléculas hidrofílicas de nucleotídio não puderam ser suspensas no veículo hidrofóbico. Isto claramente demonstra que uma molécula, tal como DOPC que é anfipático por natureza, facilitou a formulação de moléculas a base de nucleotídio hidrofílico em um veículo hidrofóbico na ausência de uma quantidade significativa de água. EXEMPLO 4

[00105] Neste exemplo, o peptídeo S9L (SVYDFFVWL) (SEQ ID N°: 2) e o peptídeo F21E (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE) (SEQ ID N°: 3) estiveram usados como modelos de antígenos. Os peptídeos foram sintetizados quimicamente por um fabricante de peptídeo por encomenda (Anaspec, San Jose, EUA). Para formular um volume final de 1 ml desses peptídeos na invenção aqui descrita, 120,0 mg da dio- leoil fosfatidilcolina (DOPC) foram solubilizados em 470 μl de terc- butanol em uma temperatura de 40 oC por 10 a 15 minutos com agitação. Então, a mistura foi esfriada à temperatura ambiente (22oC a 25oC). Os S9L e F21E foram primeiro solubilizados separadamente no sulfóxido de dimetila em uma concentração de 5 mg/ml. Então, 10 μl de S9L (50 μg) e 10 μl F21E (50 μg) foram acrescentados sequencialmente enquanto se agitava em vórtex a mistura DOPC/terc-butanol. Para concluir o volume da mistura, 400 μl de água foram acrescentados à mistura S9L/F21E/DOPC/terc-butanol no frasco 30. Uma mistura homogênea seca de DOPC/peptídeos foi preparada removendo o sol-vente e a água presente na formulação por liofilização. Uma formulação de controle contendo os peptídeos de S9L e F21E (frasco 35) foi feita da mesma maneira que descrito acima, com exceção de que o DOPC não foi acrescentado ao terc-butanol.

[00106] Os conteúdos secos dos frascos 30 e 35 foram então suspensos acrescentando 0,88 ml de um veículo hidrofóbico ao frasco 30, e 1 ml do veículo hidrofóbico ao frasco 35. O veículo hidrofóbico usado foi um oleato de manida contendo óleo mineral e conhecido como Montanide® ISA 51 (Seppic, França). A mistura seca foi ressuspensa no veículo hidrofóbico por mistura em vortex por aproximadamente 30 segundos (frasco 30), ou um mínimo de 30 minutos (frasco 35). Os frascos 30 e 35 foram comparados pela inspeção visual em relação a um frasco contendo 1 ml do veículo hidrofóbico sozinho (frasco etiquetado ISA51).

[00107] Pela inspeção visual (figura 8), os conteúdos do frasco 30 pareceram semelhantes àqueles do ISA51, sem a presença de qualquer material particulado visível. Isto sugeriu que os peptídeos fossem eficazmente suspensos no veículo hidrofóbico na presença de DOPC. Ao contrário, no frasco 35 sem DOPC e contendo somente os peptí- deos e um veículo hidrofóbico, continha uma suspensão heterogênea de agregados de peptídeo no veículo hidrofóbico que pode ser facilmente detectada pela inspeção visual. Na ausência de DOPC, os antí- genos a base de peptídeo não puderam ser suspensos no veículo hi- drofóbico. Isto claramente demonstrou que uma molécula, tal como DOPC que é anfipático por natureza, facilitou a formulação de antíge- nos a base de peptídeo em um veículo hidrofóbico na ausência de uma quantidade significativa de água.

[00108] Todas as publicações e os pedidos de patente citados neste relatório descritivo são aqui incorporados pela referência como se cada publicação individual ou o pedido de patente fossem especificamente e individualmente indicados para ser incorporados pela referência. A citação de qualquer publicação refere-se à sua publicação antes da data de arquivamento e não deve ser interpretada como uma admissão que a presente invenção não tenha o direito de datar anteriormente tal publicação em virtude de uma invenção prévia.

[00109] Tal como usado no presente relatório descritivo e nas reivindicações acrescentadas, as formas singulares "a", "um", e "o" incluem as referências ao plural a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. A menos que seja definido de outra maneira todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm a mesma significação que a comumente entendida de um versado na técnica à qual esta invenção pertence.

[00110] Tal com aqui utilizado e nas reivindicações, o termo transi- cional "compreendendo", é usado como sendo sinônimo de "incluindo" ou "contendo" e é inclusivo ou aberto e não exclui elementos adicionais, ou etapas de método não citadas. A frase transicional "consistindo em" tem a intenção de para excluir qualquer elemento, etapa, ou ingrediente não-especificado. A frase transicional "consistindo essen- cialmente em" tem a intenção de limitar o alcance de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados e a aquelas que não afetam materialmente as características básicas e novas da invenção reivindicada.

[00111] Embora a invenção precedente tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e de exemplos com objetivos de esclarecer sua compreensão, fica prontamente evidente para aqueles versados na técnica à luz dos ensinamentos da presente invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas à mesma sem fugir do espírito ou do escopo das reivindicações acrescentadas.

Claims (16)

1. Composição de vacina sem água caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura homogênea de um antígeno e um composto anfipático, suspensa em um veículo hidrofóbico,em que a composição de vacina compreende de 0% a 10% em peso de água, baseado no peso total da composição,em que o composto anfipático compreende um fosfolipídio ou em que o composto anfipático é a lecitina,em que o veículo hidrofóbico compreende um óleo ou uma mistura de óleos e um emulsificante, em que dito emulsificante compreende Span80, oleato de manida ou uma mistura dos mesmos,em que o antígeno compreende: um polipeptídeo, um poli- nucleotídio codificando um polipeptídeo, uma bactéria, vírus ou protozoário vivo, atenuado, inativado ou morto, ou parte dos mesmos.

2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que 0% a 20% do antígeno (em peso) estão suspensos em água.

3. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que dito veículo hidro- fóbico é óleo mineral.

4. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de também compreender um adjuvante.

5. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende de 0,1 mg a 250 mg do composto anfipático por ml da composição.

6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o veículo hidrofóbico compreende 5% a 15% em peso do emulsificante.

7. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o antígeno compreende um epítopo de células T citotóxicas (CTL) e é capaz de induzir uma resposta CTL; e em que a formulação compreende adicionalmente um epítopo T auxiliar.

8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o antígeno é fundido ou epítopo T auxiliar.

9. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é um álcool.

10. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o processo sem solvente é moagem seca.

11. Processo para a produção da composição de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) solubilizar um composto anfipático em um solvente orgânico;(b) misturar dito composto anfipático com um antígeno, em que dita mistura fornece uma mistura homogênea do antígeno e composto anfipático;(c) secar dita mistura homogênea; e(d) suspender dita mistura homogênea seca em um veículo hidrofóbico.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que também compreende a adição de um adjuvante à composição de vacina.

13. Processo de acordo com a reivindicação 11 ou 12, ca-racterizado pelo fato de que o dito veículo hidrofóbico compreende um emulsificante.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 11 a 13, caracterizado pelo fato de que dito antígeno é solubiliza- do antes da mistura com dito composto anfipático solubilizado.

15. Uso da composição de vacina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, na preparação de um medi-camento para induzir uma resposta de anticorpo ou resposta imune mediada por célula em um paciente.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada oralmente, nasalmente, retalmente ou parenteralmente.

Images