BRPI0412444B1 - fração de quil a com baixa toxidez e seu uso - Google Patents

Abstract

"fração de quil a com baixa toxidez e seu uso". a invenção refere-se ao uso da fração a de quil a em conjunto com pelo menos um outro adjuvante para a preparação de uma composição adjuvante, em que os componentes adjuvantes incluídos atuam sinergicamente para aumentar o nível de resposta imune e apresentam atividade imuno-moduladora sinérgica sobre os antígenos ou imunógenos co-administrados. o pelo menos outro adjuvante pode ser escolhido de saponinas, de ocorrência natural, moléculas de saponina sintéticas ou semi-sintéticas, por exemplo, saponinas e frações de saponina de quil a, esqueleto de parede celular, polímeros em bloco, tdm, lipopeptídeos, lps e derivados de lps, lipídeo a de diferentes espécies de bactérias e derivados deste, por exemplo, monofosforil lipídeo a, variantes de cpg, ct e lt ou frações (derivados destes.

Description

FRAÇÃO DE QUIL A COM BAIXA TOXIDEZ E SEU USO

Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao uso da fração A de Quil A em conjunto com pelo menos um outro adjuvante para a preparação de uma composição adjuvante com efeitos sinérgicos incluindo nível de respostas imunes e atividade imuno-moduladora.

Estado da Técnica Há uma grande necessidade por sistemas adjuvantes e de liberação de vacinas eficientes, tanto para o homem quanto para animais, a serem utilizadas para profilaxia imunológica ou para terap.i a imunológica. Para vacinas animais existe uma quantidade de diferentes adjuvantes incluindo vacinas com adjuvantes de iscom e matriz de iscom. No entanto, apenas adjuvantes de hidróxido de alumínio e fosfato de cálcio são comercialmente disponíveis em vacinas humanas, e um adjuvante de emulsão em óleo (MF59) foi recentemente registrado para uma vacina de influenza humana. Desta forma, há uma falta de adjuvantes eficientes, particularmente para vacinas humanas. Adjuvantes não são apenas importantes para aumentar o nível de resposta imune, mas muito mais para a qualidade ou tipo de resposta imune, a qual deve combinar com o tipo de infecção para a qual a vacir.a se destina a proteger contra. Em relação a patógenos que se estabelecem de forma intracelular como vírus, mas também algumas bactérias e parasitas, é requerida uma resposta imune do assim chamado tipo Thl para proreçâo imunológica ótima, e em muitos casos uma resposta do tipo Thl é um pré-requisito para a proteção imunológica. Να entanto, está hoje bem estabelecido que uma resposta do tipo Thl ou Th2 pura pode causar efeitos colaterais, uma vez que é necessário um balanço entre os dois tipos de células T helper para a regulação imunológica. Isto é, a resposta Thl regula a resposta Th2, por exemplo, pela produção de IFN-γ e a resposta Thl é regulada pela resposta Th2, por exemplo, pela produção da citocina IL 10. Assim, o balanço Thl-Th2 é essencial para evitar-se efeitos colaterais. De maneira a se ser capaz de induzir o tipo correto de resposta imune para a proteção contra os vários patógenos, um número de adjuvantes será necessário. Uma resposta Thl é refletida pela resposta do anticorpo IgG2a, e, desta forma, utilizada como um marcador para a resposta de célula T helper Thl. Um aspecto importante para os adjuvantes é a segurança incluindo o fato da resposta imune evocada dever apresentar uma qualidade de forma a evitar efeitos colaterais quando ocorre uma infecção subseqüente. Efeitos colaterais severos foram o caso com o virus respiratório sincicial quando uma vacina com o vírus respiratório sincicial (RSV) desativado por formalína com hidróxido de alumínio como adjuvante, foi testada em crianças aproximadamente 30 anos atrás. As crianças vacinadas adoeceram e houve uma taxa de mortalidade mais alta entre elas após a infecção natural com RSV que em crianças não vacinadas.

Toxidez aquda ou efeitos colaterais têm sido uma preocupação maior tanto para uso veterinário quanto, particularmente, para uso humano de saponinas de quílaia em preparações de vacina. Estes objetivos foram apenas parcialmente atingidos com sucesso, as frações purificadas, por exemplo, de QA-21 (EP 0 362 279 B2) de combinações de frações A e C (WO 96/11711, da Iscotec) foram de fato quimicamente definidas em comparação com "Quillaja Saponaria Molina", no entanto ainda causavam alguma toxidez e efeitos colaterais.

Verificou-se agora que a fração A de Quil A apresenta baixa toxidez, e em baixa dosagem aumenta o nível de resposta imune e a capacidade imuno-moduladora de outros adjuvar.tes em doses sub-ótimas, os quais quando urilizados por si só podem ser tóxicos ou provocar efeitos colaterais em doses eficientes. Desta forma, facilita a utilização de outros adjuvantes que, quando utilizados por si só, poderíam ser tóxicos nas dosagens em que são eficientes.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se ao uso da fração A de Quil A em conjunto com pelo menos um outro adjuvante para a preparação de uma composição adjuvante com efeito sinérgico para aumentar o nível de respostas imunes e a atividade imuno-moduladora. Refere-se especialmente ao uso da fração A de Quil A em uma composição compreendendo partículas de iscom onde as diferentes frações de Quil A são integradas em diferentes partículas de iscom e partículas de matriz de iscom.

Descrição dos Desenhos Fig. 1-1 Alta dose de QHC (50 μg) em matriz é tóxica, enquanto que uma alta dose de QWT em matriz é não tóxica quando suplementada para OVA para aumentar a resposta de anticorpo em camundongos Balb/C (ver texto). Ambas as formulações aumentam as respostas de anticorpo específicas semelhantes contra OVA conforme determinadas 3 semanas após a segunda imunização por ELISA para resposta de IgG total (A) e na sub-classe IgG2a (B).

Fig. 1-2 Efeitos sinérgicos de QWT-matriz e QHC-matriz quando suplementados para OVA para aumentar a resposta de anticorpo em camundongos Balb/C (ver texto). A dose de QWT-matriz e QHC-matriz variou como se segue: no grupo 1, sem QWT ou C; grupo 2, 0,3 pq de QWT sem C; grupo 3, 0,3 pg de QWT + 0,3 pg de C; grupo 4, 10 pg de QWT sem C; grupo 5 10 pg de QWT + 2 pg de C. A dose de OVA foi de 10 pg. Utilizou-se 8 camundongos por grupo, os quais foram imunizados duas vezes com 4 semanas entre cada imunização. As titulagens de anticorpo foram medidas por ELISA contra OVA: A - IgG total 3 semanas após a primeira imunização B - IgG2a 2 semanas após a segunda imunização C - IgGi 2 semanas após a segunda imunização Fig. 2-1 Toxidez de iscoms de virus respiratório sincicial (RSV) QWT e AC (isto é, 703) determinada pela taxa de sobrevivência de camundongos recém nascidos (1 semana c.e idade) após uma injeção intraperitoneal com 1 pg de iscom (proteína). A razão proteina/saponina é de 1/1.

Fig. 3-1 Resposta de anticorpo de camundongos recém nascidos (1 semana de idade) e adultos após uma imunização intraperitoneal e subsequente reforço após 3 semanas com 1 pg de iscom (proteína). A razão proteina/saponina é de 1/1.

Fig. 4-1 Resposta citotóxica de célula T (CTL) após uma imunização intraperitoneal com 1 pg de isccm (proteína). A razão proteína-saponina é de 1/1. As células de baço foram coletadas 1 e 3 semanas após a imunização intraperitoneal.

Fig. 5-1 Matriz de QWT é menos tóxica para células VERO (uma linhagem celular de macaco) que a matriz de 703 e matriz de C após exposição por 72 horas em cultura determinada pela taxa de crescimento proporcional (¾) a culturas de células não expostas. Δ matriz de QWT é bem tolerada a todas as concentrações testadas, isto é, até 1300 pg. Nenhum crescimento foi observado em culturas celulares expostas a 800 pg de matriz de 703 ou 45 pg de matriz de QHC. A. Exposição de células VERO a matriz de QWT e matriz de 703 conforme indicado. B. Exposição de células VERO a matriz de QHC conforme indicado.

Fig. 5-2 Matriz de QWT é menos tóxica para células de baço obtidas de camundongos que matriz de C após exposição por 72 horas em cultura determinada pela taxa de crescimento determinada por um método colorimétrico conforme descrito no texto. A taxa de crescimento é comparada com células de baço crescidas apenas em meio ou juntamente com mitógeno Con A. A. Exposição de células de baço a matriz de QWT em doses decrescentes a partir de 10 até 1,25 pg conforme indicado. B. Exposição de células de baço a matriz de QHC em doses decrescentes a partir de 10 até 1,25 pg cor.forme indicado.

Figura 6 Esta figura mostra a preparação de frações A, B e C por HPLC.

Figura 7 Esta figura mostra o efeito sinérgico de QWT-matríz e QHC-matriz. Grupos de 8 fêmeas de camundongo Balb/C foram imunizadas s.c. na base da cauda com 5 microgramas de cvalbumina (OVA) apenas (Gr. 1) ou misturada com A-matriz (Gr. 2) ou C-matriz (Gr. 3) respectivamente, ou uma mistura de A-matriz e C-matriz (Gr. 4). Os camundongos foram imunizados nas semanas 0 e 4, foram tomadas amostras de soro nas semanas 3 (inicial) e 6 (reforço). Os soros foram testados para anticorpos específicos de antigeno IgG ou sub-classes (IgGl e IgG2a) em ELISA. A resposta de anticorpo a OVA (5 pg) é fortemente aumentada por uma combinação de QWT-matriz e QHC-matriz quando em comparação com a utilização de cada uma das matrizes em separado. Particularmente a resposta IgG2a é aumentada. O aumento (IgG e IgG2a) é demonstrado três semanas após a dose inicial (7-1 A e B) e duas semanas após o reforço (IgG, IgGl e IgG2a), 7—2 A, B e C) .

Figura 8 Esta figura mostra respostas de anticorpo (IgG total e IgG2a) a OVA após imunização com 5 pg de OVA apenas (Gr. 1) ou misturada com QWT (Gr. 2) ou misturada com uma combinação de QWT e CT (Gr. 3) ou QWT e MLP (Gr. 4) respectivamente. O efeito adjuvante sinérgico de QWT- matriz dado em conjunto com CT e MLP é demonstrado para um imunógeno fraco: OVA. Tanto a magnitude da resposta IgG (A) quanto particularmente um aumento específico (ímuno-modulação) da sub-classe lgG2a (B) deve ser observada.

Figura 9-1 Esta figura mostra a reposta de anticorpo (IgG total) a TT (Toxóide Tetânico) após imunização com 2,5 Lf de TT apenas ou com CT (1 ou 0,2 pg) ou uma combinação de QWT e 0,2 pg de CT (A após a primeira imunização e B após o reforço).

Figura 9-2 Esta figura mostra a resposta de anticorpo (IgG2A) a TT (Toxóide Tetânico) após imunização com 2,5 Lf de TT apenas ou com (1 ou 0,2 pg) ou uma combinação de QWT e 0,2 pg de CT (A após a primeira imunização e B após o reforço). 0 efeito adjuvante da toxina da cólera (CT) , determinado como a resposta de anticorpo a Toxóide Tetânico, é aumentado e modulado pela adição de QWT-matriz. A resposta IgG após a adição de QWT-matriz a uma dose baixa de CT (0,2 pg) fica na mesma faixa que aquela de 1 pg de CT (fig. 9-1 A e B) . A resposta JgG2a (9-2 A e B) é no entanto fortemente aumentada, indicando um efeito modulador sinérgico de QWT-matriz e CT.

Figura 10-1 Esta figura mostra a resposta de anticorpo (IgG total) a TT (Toxóide Tetânico) após a imunização com 2,5 Lf de TT apenas ou com MPL (50 ou 10 pg) ou uma combinação de QWT e 10 pg de MPL (A após a primeira imunização e B após o reforço).

Figura 10-2 Esta figura mostra a resposta de anticorpo (IgG2a) a TT (Toxóíde Tetânico) após imunização com 2,5 Lf de TT apenas ou com MPL (50 ou 10 pg) ou uma combinação de QWT e 10 pg de MPL (A após a primeira imunização e B após o reforço). O efeito adjuvante ce monofosforil lipídio A (MPL), determinado como a resposta de anticorpo a Toxóide Tetânico (TT), é aumentado e modulado pela adição de QWT-matriz. A resposta IgG após a adição de QWT-matriz a uma dose baixa de MPL (10 pg) é mais alta que tanto a de 50 quanto a de 10 pg de MPL (fíg. 10-1). A resposta IgG2a (10-2) é fortemente aumentada, indicando um efeito modulador sinérgico de QWT-matriz e MPL.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção refere-se ao uso de fração A de Quil A em conjunto com pelo menos um outro adjuvante para a preparação de uma composição adjuvante com efeito sinérgico para aumentar o nível e qualidade da atividade imuno-moduladora. Refere-se especíalmente ao uso da fração A de Quil A em conjunto com um ou mais outros adjuvantes onde a fração A a uma dose baixa e bem tolerada aumenta sinergicamente o efeito imune do adjuvante co-administrado, o qual por si só é muito tóxico para a profilaxia ou uso clínico. Isto é, uma dose baixa bem tolerada (ou seja, sub-ótima) do adjuvante co-administrado é tornada eficiente e própria para uso. Desta forma, os outros adjuvantes são preferivelmente aqueles, os quais apresentam uma toxidez substancial e a dose dos quais deve ser reduzida para ser aceita para a profilaxia e uso clínico, mas também adjuvantes que são fracos e não podem por si só aumentar os níveis de eficiência de respostas imune ou exercer uma capacidade imuno-moduladora qualitativa eficiente. 0 pelo menos um outro adjuvante pode ser escolhido preferivelmente de saponinas, de ocorrência natural, ou derivados destas, moléculas de saponina sintéticas ou semi sintéticas derivadas de extrato de saponina bruto de Quíllaja saponaria Molina; por exemplo, saponinas e frações de saponina de Quil A, esqueleto de parede celular, polímeros em bloco, por exemplo, copolímeros em bloco hidrofílícos, por exemplo, CRL-1005, TDM (di-mucolato de trealose), lipopeptídeos, LPS e derivados de LPS, lipídeo A de diferentes espécies de bactérias e seus derivados, por exemplo, monofosforil lipídeo A, muramil di ou tri peptídeo ou derivados destes. Variantes de CpG, variantes de CpGODN, ímuno-moduladores humanos e animais endógenos, por exemplo, GM-CSF. IL-2, adjuvantes de toxinas bacterianas ativas, nativas ou modificadas, por exemplo, toxina da cólera CT, e seus sub-componentes CTB e CTA1, toxina ternolábil (LT) ou toxina de E. coli, ou Bordetella pertussis (BP) e hemaglutenina filamentosa de BP.

As frações de saponina de Quil A outras que não a fração A podem ser as frações B e C descritas no documento WO 96/11711, as frações B3, B4 e B4b descritas no documento EP 0 436 620. As frações QAl-22 descritas no documento EP 0 3632 279 B2, Q-VAC (Nor-Feed, AS Dinamarca), Quíllaja Saponaria Molina Spikoside (Isconova AB, Uppsala Science Park, 75183 Uppsala, Suécia).

As frações QA-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20-21 e 22 do documento EP 03632 279 B2, especialmente QA-7, 17-18 e 21 podem ser utilizadas. São obtidas como descrito no documento EP 03632 279 B2, especialmente na página 6 e no Exemplo 1 na página 8 e 9.

As frações A, B e C descritas no documento WO 96/11711 são preparadas a partir da fração lipofílica obtida na separação cromatográfica do extrato aquoso de Quíllaja saponaria Molina e eluição com acetonitrila 70% em água para recuperar a fração lipofílica. Esta fração é então separada por HPLC semi-preparativa com eluição utilizando um gradiente de acetonitrila 25% a 60% em água acidificada. A fração a que se faz referência aqui como "Fração A" ou "QH-A" é a, ou corresponde a, fração a qual é eluída a aproximadamente acetonitrila 39%. A fração a que se faz referência aqui como "Fração B" ou "QH-B" é a, ou corresponde a, fração a qual é eluida a aproximadamente acetonitrila 47%. A fração a que se faz referência aqui como "Fração C" ou "QH-C" é a, ou corresponde a, fração a qual é eluída a aproximadamente acetonitrila 49%.

Preferivelmente, o pelo menos outro adjuvante é o sub-fragmento C ou B de Quil A.

Em uma realização da invenção o adjuvante de fração A de Quil A, neste texto também referida como QWT, e o pelo menos outro adjuvante podem ser integrados cada um em uma partícula diferente de iscom ou partículas de matriz de iscom. Podem também ser integrados na mesma partícula de iscom ou partículas de matriz de iscom. Assim, os adjuvantes podem ser integrados cada um em uma partícula diferente de iscom ou diferentes partículas de matriz de iscom e então misturadas em uma composição. A partícula de íscom pode ser um complexo de iscom ou um complexo de matriz de iscom. A fração acjuvante A e o outro pelo menos um adjuvante também pode ser acoplado às mesmas ou diferentes partículas de iscom ou partículas de matriz de iscom ou um ou mais dos adjuvantes podem ser misturados com as partículas de iscom.

De maneira a ser integrados com as partículas de iscom ou partículas de matriz de iscom, os adjuvantes necessitam conter alguma molécula hídrofilica. Adjuvantes que não apresentam moléculas hidrofílicas podem ser acoplados a tais moléculas. Moléculas hidrofílicas e métodos de acoplamento são descritos no documento EP 180564. Preferivelmente, os adjuvantes são integrados em diferentes partículas de iscom.

Em uma outra realização da invenção a fração A adjuvante de Quil A é integrada em partículas de iscom, enquanto que o outro pelo menos um adjuvante não é integrado em partículas de iscom e é utilizado na forma livre na composição.

Em uma outra realização da invenção o adjuvante de frações de Quil A é integrado às partículas de iscom ou partículas de matriz de iscom, enquanto que outros adjuvantes não são integrados em partículas de iscom e são utilizados na forma livre na composição.

Em uma outra realização especialmente preferida, a composição compreende a fração A de Quil A integrada a partículas de iscom ou partículas de matriz de iscom e pelo menos um outro adjuvante, o qual não é integrado em partículas de iscom ou partículas de matriz de iscom.

Em urna outra realização preferida o pelo menos outro adjuvante é MPL ou toxina de cólera CT. O MPL ou toxina de cólera podem ser integrados na mesma partícula de iscom ou partícula de matriz de iscom ou cada um em uma partícula de iscom ou partícula de matriz de iscom diferente. Preferivelmente o MPL ou toxina de cólera estão na forma livre.

Em ainda uma outra realização preferida, a fração A de Quil A é incorporada em uma partícula de iscom ou partícula de matriz de iscom e o pelo menos um outro adjuvante é incorporado cada um em uma partícula de iscom ou partícula de matriz de iscom diferente ou o outro pelo menos um adjuvante é incorporado na mesma partícula de iscom ou partícula de matriz de iscom, no entanto diferente da partícula na qual a fração A de Quil A foi incorporada ou o outro pelo menos um adjuvante está na forma livre. 0 adjuvante de fração A e o outro (co-administrado) pelo menos um acjuvante podem também ser formulados em lipossomas ou com formulações adjuvantes de base oleosa ou com um polímero em bloco não iônico ou apresentados em outras formulações particuladas tais como PLG, amido, Al(OH)3 ou na forma livre.

Iscom contém pelo menos um glicosideo, pelo menos um lipídeo e pelo menos um tipo de substância antigêníca. O lipídeo é pelo menos um esterol tal como colesterol e opcionalmente também fosfatidil colina. Estes complexos podem também conter uma ou mais outras substâncias imuno-moduladoras (ativas como adjuvantes), e pedem ser produzidos como descrito nos documentos EP 0 109 942 Bl, EP 0 242 380 Bl e EP 0 180 564 Bl.

Uma matriz de iscom compreende pelo menos um glicosídeo e pelo menos um lipídeo. 0 lipídeo é pelo menos um esterol tal corão colesterol e opcionalmente também fosfatidil colina. Os complexos de iscom podem também conter uma ou mais outras substâncias imuno-moduladoras (ativas como adjuvante), não necessariamente uma saponina, e podem ser produzidos como descrito no documento EP 0 436 620 Bl.

Em uma formulação preferida os iscoms e matriz de iscom foram formulados com as frações A e °C de quilaia em diferentes partículas de iscom, o que provoca efeitos colaterais mínimos (ver os exemplos). Estes iscoms foram comparados com uma formulação compreendendo 70% de fração A e 30% de fração °C de Quil A chamada de 7 03 e produzida de acordo com o documento WO 96/11711, que está em fase de ensaio clínico no homem para uma vacina do vírus da influenza. De acordo com o documento WO 96/1171 as frações A e °C são integradas na mesma partícula. O estudo de toxidez foi realizado em camundongos recém nascidos, que são muito mais sensíveis que camundongos adultos. O estudo mostra que os camundongos recém nascidos toleram melhor os novos iscoms produzidos a partir da fração A de Quil A que a formulação 703. Além disto, a eficácia das novas formulações de acordo com a invenção é testada com antigenos de um patógeno, isto é, vírus respiratório sincicial humano hRSV e com um antigeno fraco, isto é, ovalbumína (OVA). Um efeito sinérgico da fração A de Quil A em uma formulação matriz chamada de QWT é mostrado no exemplo 1. Também antigenos fortes como toxina de cólera (CT) e toxina de tétano podem ser modulados pelas formulações adjuvantes de acordo com a presente invenção pelo aumento da produção de anticorpo, mas acima de tudo pela imuno-modulação potente conforme descrito nos exemplos 8 e 9. A composição de acordo com a invenção pode compreender o adjuvante de fração A de Quil A e o pelo menos outro adjuvante em quaisquer razões em peso. Preferivelmente, a fração A de Quil A é de 2-99,9% em peso, preferivelmente, de 5 —9C% em peso e especialmente de 50-90% em peso em relação à quantidade total de adjuvantes. Para, por exemplo, adjuvantes oleosos e polímeros em bloco a quantidade da fração A de Quil A pode ser substancialmente mais baixa.

Uma composição de iscom preferida compreende de 50-99,9% do fragmento A de Quil A e de 0,1-50% do fragmento °C e;ou outras frações ou derivados de Quil A (doravante frações não A de Quil A) em relação ao peso total da fração A e frações não A de Quil A. Especialmente a composição compreende de 70-99,9% do fragmento A de Quil A e de 0,1-30% de frações não A de Quil A, preferivelmente de 75-99,9% do fragmento Ά de Quil A e de 0,1-25% de frações não A de Quil A e especialmente de 80-99,9% do fragmento A de Quil A e de 0,1-20% de frações não A de Quil A em relação ao peso total da fração A e frações não A. A composição mais preferida compreende 91-99,9% do fragmento A de Quil A e de 0,1-9% de frações não A de Quil A em relação ao peso total de frações A e não A de Quil A, especialmente de 98,0-99,9% da fração A e de 0,1-2,0% de frações não A de Quil A com base no peso total de frações A e não A de Quil Ά. A composição pode compreender adicionalmente um veículo, diluente, excipiente ou aditivo farmaceuticamente aceitável.

Para propósitos de identificação das frações A, B e c mencionadas aqui, pode-se fazer referência ao procedimento de purificação do Exemplo 1. Em termos gerais, neste procedimento as frações A, B e °C são preparadas a partir da fração lipofílica obtida na separação cromatográfica do extrato aquoso bruto de Quil A e eluição com acetonitrila 70% em água para recuperar a fração lipofílica. Esta fração lipofílica é então separada por HPLC semi-preparativa com eluição utilizando um gradiente de acetonitrila 25% até 601 em água acidificada. As frações a que se faz referência aqui como "Fração A" ou "QH-A" é, ou corresponde a que é eluída a aproximadamente acetonitrila 39%. A fração a que se faz referência aqui como "Fração B" oj "QH-3" é, ou corresponde à fração que é eluída a aproximadamente acetonitrila 47%. A fração a que se faz referência aqui como "Fração °C" ou "QH-°C" é, ou corresponde à fração que é eluida a aproximadamente acetonitrila 49%.

Quando preparadas conforme descrito aqui, as frações A, B e °C de Quil A cada uma representa grupos ou famílias de moléculas proximamente relacionadas quimicamente com propriedades definidas. As condições de cromatografia sob as quais são obtidas são tais que a reprodutibilidade bateiada a batelada em termos do perfil de eluição e atividade biológica são altamente consistentes.

Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas como referência. Pela expressão "compreendendo" entenda-se incluindo mas não se limitando a. A invenção será agora descrita pelos exemplos não limitantes a seguir. 0 escopo da invenção é principalmente aquele que a pessoa especialista interpretaria a partir da descrição e determinada como equivalente ou um desenvolvimento natural da invenção.

Exemplo 1 Neste experimento é enfatizado que QWT em iscom e matriz é bem tolerada e apresenta um aumento imunológico forte e capacidade imuno-moduladora. Ovalbumina (OVA) é utilizada tendo em vista ser um antígeno fraco e, como tal, não induz uma resposta do tipo Thl. QWT é comparada com QHC, uma vez que é avaliada em ensaios clínicos em humanos.

Materiais e Métodos Formulação de QHC, QWT e 703-matriz de iscoms Uma mistura de fosfatidil colina (PC) e colesterol (°C) (15 mg;mL de cada) é preparada em MEGA-10 20% em água. A preparação é aquecida a 60°C e tratada com sonicação branda até a solubilízação de todos os lipídeos.

Saponina de quilaia é dissolvida em água para 100 mg;mL. A mistura 703 contém 7 partes (em peso) de fração A e 3 partes de fração C.

Saponina de QWT contém apenas a fração A. 703-matriz. 5 mL de PBS são misturados com 10 mg da mistura PC;°C {667 microlítros), são adicionados 35 mg de 703 (350 microlítros), a mistura é misturada e é adicionado PBS para um volume total final de 10 mL. A mistura é extensivamente dialisada contra PBS utilizando-se um cassete de diálise Slide-A-Lyser (3-15 mL, Píerce). QWT-matriz e QHC-matriz. 5 mL de PBS são misturados com 10 mg de cada PC e °C (667 microlitros) , são adicionados 40 mg de QWT (400 microlitros) e 30 mg de QHC (300 microlitros) respectivamente, a mistura é misturada e é adicionado PBS para um volume total final de 10 mL. A mistura é extensivamente dialisada contra PBS utilizando-se um cassete de díãlise Slide-A-Lyser (3-15 mL, Pierce).

Procedimento Experimental Foram utilizadas fêmeas de camundongo MNRI neste Exemplo. O Grupo um consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com. 4 semanas de diferença subcutaneamente (s.c.) com 10 pg de OVA com 50 pg de QWT-matriz como adjuvante. O Grupo 2 teve o mesmo número de camundongos imunizados pelo mesmo procedimento, mas o adjuvante foi 50pg de QHC-matriz. Foram coletados soros antes da primeira imunização e 3 semanas após e 2 semanas após o reforço.

Determinação de Anticorpo As respostas de anticorpo sorológico específicas para OVA foram determinadas por ELISA tanto para resposta IgG total (incluindo todas as sub-classes de IgG) quanto para as sub-classes IgG2a conforme descrito anteriormente (Johansson, M. e Lõvgren-Bengtsson (1999) "Iscoms with different quillaja saponin components differ in their immunomodulating activities" Vaccine 19, 2894-2900).

Resultados Todos os camundongos imunizados com OVA com QWT-matriz como adjuvante sobreviveram e não desenvolveram qualquer sinal de desconforto. Dos 8 camundongos imunizados com OVA com QHC-matriz corr.o adjuvante 4 (53%) morreram. Não há qualquer diferença significativa entre os grupos em relação às respostas de anticorpo totais (Fig. 1-Ia) , no entanto há uma maior variação nas titulagens de anticorpo entre os animais no grupo i, isto é, camundongos imunizados com OVA com QWT-matriz como adjuvante. Não houve qualquer diferença nas titulagens médias na sub-classe IgG2a entre o grupo 1 e c grupo 2 (Fig. 1-1B), no entanto há uma maior variação nas titulagens de anticorpo entre os animais no grupo 2, isto é, camundongos imunizados com OVA com QHC-matriz como adjuvante.

No segundo experimento deste exemplo, foi explorado se QWT-matriz pode se beneficiar da complementação de um outro adjuvante, ou se facilita a utilização de um adjuvante mais tóxico. A resposta IgG2a mostra que o tipo Th2 de linfócitos está envolvido. A dose de QWT-matriz e QHC-matriz variou corão se segue: no grupo 1, sem QWT-matriz ou QHC-matriz; no grupo 2, 0,3 pg de QWT-matriz sem QHC-matriz; no grupo 3, 0,3 pg de QWT-matriz + 2 pg de QHC-matriz; no grupo 4, 10 pg de QWT-matriz sem QHC-matriz; no grupo 5 , 10 pg de QWT-matriz + 2 pg de QHC-matriz. A dose de OVA foi de 10 pg. Havia 8 camundongos por grupo, os quais foram imunizados duas vezes com duas semanas de diferença s.c. com a formulação respectiva (exemplo 8 Fig. 2 A, B e °C) .

Os soros foram coletados 3 semanas após a primeira imunização e 2 semanas após o reforço.

As respostas de anticorpo sorológicas específicas para OVA foram determinadas por ELISA para resposta IgG total e nas sub-classes IgG2a e IgGl como descrito (Johansson, M. e Lõvgren-Bengtsson (1999) "Iscoms with different quillaja saponin components differ in their iitimunomodulating activities" Vaccine 19, 2894-2900) .

Resultados Após a primeira Imunização foi registrada qualquer resposta de anticorpo nos camundongos que receberam OVA com adjuvante ou OVA com 0,3 pg de QWT-matriz como adjuvante com e sem 2 pg de QHC-matriz (Fig. 1-2A).

Após a segunda imunização foi detectada uma pequena resposta em 3 dos 8 camundongos imunizados com OVA sem adjuvante na sub-ciasse IgGl (Fig, 1-2B), mas nenhuma resposta foi registrada na sub-classe IgG2a. Nem foram registradas respostas de anticorpo na sub-classe IgG2a com as doses menores de adjuvante de QWT-matriz, isto é, 0,3 pg com e sem 2 pg de QHC-matriz (Fig. 1-2B). Houve um aumento claro da resposta de anticorpo na sub-classe IgG2a, quando a dose baixa de 2 pg de QHC-matriz foi adicionada às 10 pg de QWT-matriz (Fig. 1-2B).

Conclusão QWT apresenta uma baixa toxidez e ainda um efeito modulador forte conforme mostrado pela promoção de uma forte resposta do tipo Thl, em contraste com OVA sem adjuvante ou corrí muito pouco adjuvante, que apenas promoveu resposta de anticorpo na sub-classe IgGl. É mostrado tarr.bém que o QWT-matriz apresenta sinergia com uma dose baixa de QHC-matriz. Este fato é importante tendo em vista que QWT torna possível otimizar o efeito adjuvante e minimizar os efeitos colaterais de outros adjuvantes.

Exemplo 2 0 vírus respiratório sincicial (RSV) é um patógeno de grande relevância para crianças pequenas (hRSV), mas também para idosos. Um vírus proximamente relacionado (bRSV) é um patógeno para bezerros que provoca uma doença severa e altas perdas econômicas na criação de gado. As proteínas de envelope do hRSV foram selecionadas como antígenos modelo, tendo em vista que representam antígenos de um patógeno para o qual não existe uma vacina e para a qual existe uma grande necessidade. 0 camundongo recém nascido representa um modelo para os recém nascidos, e são uma animal extremamente sensível, que requer uma formulação de vacina vírtualmente livre de efeiLos colaterais, e um modelo no qual reações imunológicas importantes podem ser mensuradas tendo em vista técnicas reagentes disponíveis. Uma antiga vacina contra hRSV foi testada em crianças, mas não protegeu contra a doença. Ao contrário, exacerbou a doença quando ocorreu uma infecção natural subseqüentc. Neste experimento, selecionamos 703 como componente de quilaia no iscom para comparar com a presente invenção, tendo em vista que uma formulação de vacina de 703 está em fase de ensaio em humanos, assim uma candidata para vacinas humanas. No presente experimento, a toxidez de iscoms de QWT e iscoms de 703 é comparada.

Materiais e Métodos Formulação de ICOMs de 703 e QWT RSV

Iscoms de RSV com diferentes composições de saponina de Qníllaja (Ά, °C e AC, isto é, ISCOPREPTM703) foram preparados a partir de HRSV purificado com um gradiente de sacarose, utilizando-se essencialmente o método descrito previamente [17r18]. Em resumo, 2 ml (1,6 mg;mL) de RSV purificado foram solubilizados com OG (l-O-n-octil-p-D-glicopiranosídeo, C14H28O6, 3oehringer, Mannheim, GmbH, FRG) a uma concentração final de 2% (peso/voiume) por lha 37°C sob agitação constante. 0 virus solubilizado foi aplicado em um gradiente de sacarose descontínuo de 2 mL camada de sacarose 20% contendo 0,5% de OG, sobre uma almofada de sacarose 50%. Após centrifugação a 210000 g a 4°C em um rotor Kontron TST-41 por 1 h, 0 volume de amostra juntamente com a camada de sacarose 20% contendo as proteínas virais foram coletados, e lipídeos extra, isto é, colesterol e fosfatidil colina, e saponina de Quillaja, isto é, QH-A ou QH-°C ou ISCOPREPTM703, foi adicionada em proporções de proteína:colesterol:fosfatidil colina:saponina de Quillaja = 1:1:1:5 calculadas em peso. Após diálíse extensiva contra acetato de amônío 0,15 M a 4°C por 72 h, os ISCOMs foram purificados por centrifugação através de sacarose 10% a 210000 g em rotor Kontron TST-41 a 10°C por 18 h. O pelete contendo os iscoms foi re-suspenso em 200 μΐ de PBS. A concentração de proteína foi determinada por análise de aminoácidos (Aminosyraaanalyslaboratoriet, Uppsala, Suécia), As amostras foram submetidas a rnicroscopia eletrônica de marcação negativa. Não foram observadas quaisquer diferenças morfológicas entre os três iscoms. Todos mostraram estruturas de iscom típicas, isto é, partículas esféricas semelhante a gaiolas com um diâmetro de cerca de 40 nrn. Os antígenos de RSV e estruturas de iscom foram encontradas na mesma fração de um gradiente de sacarose após centrifugação.

Procedimento Experimental Uma ninhada de pelo menos 7 camundongos recém nascidos (uma semana de idade) por grupo foi injetada intraperitonealmente (i.p.) uma vez com uma formulação de iscoms de 703 ou iscoms de QWT. Os grupos de dosagem de cada componente de quilaia variaram entre 0,11 pg e 1 pg determinados como teor de proteína (Fíg. 2-1). A razão em peso de proteína de QWT ou 7 03 (saponina de quilaia) é de 1;1. Os filhotes foram observados por 15 dias após a injeção i.p. Deve ser observado que injeção i.p. é um modo de administração grosseiro e camundongos são muito mais sensíveis a injeção i.p. que a modos de administração intramuscular e subcutâneo.

Resultados As doses de 0,66 e 1 pg mataram 65 e 50% respectivamente dos camundongos injetados com os iscoms de 703, enquanto que todos os camundongos injetados com os iscoms de QWT sobreviveram incluindo aqueles que receberam 1 pg de iscoms de QWT.

Conclusão O iscom de QWT é bom tolerado mesmo por uma rota difícil como a rota i.p. em um modelo animal muito sensível. É mais bem tolerado que uma formulação ensaiada em humanos.

Exemplo 3 Neste exemplo a resposta de anticorpo sorológica foi testada com as proteínas G e F de envelope de hRSV como modelo para antígenos vacinais. Os anrígenos de hRSV foram selecionados tendo em vista que o hRSV representa antígenos de um patógeno para o qual não existe um vacina e para a qual existe uma grande necessidade. 0 camundongo recém nascido representa um modelo para os recém nascidos, que são iraunologicamente imaturos requerendo um sistema adjuvante com capacidade imuno-modulatória potente (WO 97/30727). Além disto, um camundongo recém nascido representa um sistema animal que é muito sensível e requer uma formulação de vacina virtualmente livre de efeitos colaterais. Formulações de vacinas semelhantes foram testadas como descrito no exemplo 2, isto é, os iscoms de QWT e 703.

Materiais e Métodos Formulação de iscoms de QWT e 703 RSV

Ver exemplo 2 Procedimento Experimental Camundongos de uma semana de idade e camundongos adultos (Balb/c) foram distribuídos em 2 grupos de recém nascidos e 2 grupos de adultos. Uma ninhada de recém nascidos com um mínimo de 7 animais por grupo e 8 adultos foi imunizada i.p. com 1 pg de hRSV nas formulações de iscoms de QWT ou de iscoms de 703. Um grupo de camundongos recém nascidos e 1 grupo de camundongos adultos foram imunizados uma vez, enquanto que 1 grupo de camundongos recém nascidos e 1 grupo de camundongos adultos receberam reforço 3 semanas após a primeira imunização com as mesmas formulações pelo mesmo modo. Todos os experimentos foram repetidos uma vez.

Os soros foram coletados antes do reforço e na semana 7 de vida, isto é, 3 semanas após o reforço. Tendo em vista o tamanho pequeno dos recém nascidos, os soros de um grupo foram reunidos.

Determinação de Anticorpo As respostas de anticorpo sorológicas específicas para RSV foram determinadas por ELISA tanto na sub-classe IgGl quanto na sub-classe IgG2a, conforme descrito utilizando-se 0,1 μΐ de.vírus RSV morto por formalina como antígeno de revestimento (Johansson, M. e Lõvgren-Bergtsson (1999) "Iscoms with different quillaja saponin components differ in their immunomodulating activities" Vaccine 19, 2894-2900).

Resultados Os resultados são ilustrados na Fig. 3-1. Após uma imunização tanto adultos quanto recém-nascidos responderam com anticorpos IgGl específicos para RSV determinados por ELISA. Após uma imunização, os iscoms de QWT induziram uma resposta de anticorpo IgGl específica para RSV mais alta nos recém nascidos que os iscoms de 703. Por outro lado, não houve diferenças claras entre as duas formulações de iscom no que diz respeito a sua capacidade de induzir respostas de anticorpo específicas para RSV IgGl e IgG2a em adultos ou recém nascidos. As titulagens de anticorpo em geral foram 10 vezes maiores nos adultos que nos recém ' nascidos. A resposta IgG2a ao RSV foi insignificante após uma imunização em recém nascidos independente de se foram imunizados com iscoms de QVJl ou 703. IgG2a específicos para RSV foram claramente detectados após uma imunização em adultos.

Conclusão As respostas de anticorpo sorológicas foram pelo menos tão altas após 1 imunização quanto após 2 imunizações de recém nascidos ou adultos com a formulação de iscom de QWT, quanto após a mesma imunização com o iscom de 7 03. Tendo em vista os resultados do exemplo 2, mostrando que o iscom de QWT apresenta uma toxidez consideravelmente mais baixa que o iscom de 703, o iscom de QWT é preferido para uma formulação de vacina.

Exemplo 4 Linfócitos T citotóxicos (CTL) são essenciais para a defesa imunolóçica contra patógenos intracelulares. Sobretudo, células infectadas com vírus são alvo para CTL pela eliminação das céLulas infectadas. Consequentemente, CTL é uma arma importante da defesa imunológica humana contra infecções virais. Este exemplo mostra que iscoms de QWT contendo antigenos de envelope de hRSV especificamente induzem e eficientemente iniciam a memorização de CTL tanto em camundongos recém nascidos quanto em adultos. É surpreendente o fato dos iscoms de QWT terem induzido a memória CTL tão eficientemente em recém nascidos quanto em adultos, tendo em vista seu sistema imunológico imaturo.

Materiais e Métodos Formulação de iscoms de QWT e 703 RSV

Os iscoms de QWT e 703 foram preparados como descrito no exemplo 2.

Animais e Procedimento Experimental Uma ninhada de recém nascidos com pelo menos 7 animais foi utilizada para cada experimento. 8 camundongos adultos Balb/c (H~2Kd) . Cada experimento foi realizado duas vezes. Camundongos de uma semana de idade ou camundongos adultos foram injetados i.p. com 1 pg de iscoms de QWT. Uma semana correspondendo a 3 semanas após a imunização, células de baço (células efetoras) foram cultivadas (re-estimuladas) por 6 dias in vitro com fibroblastos (BCH4) (células alvo) infectados com HRSV. A razão efetora/alvo (E/T) variou de 2 a 100 (Fíg. 4-1). A lise da célula alvo foi determinada pela liberação de Cr51 e expressa como lise específica % (%SL) de acordo com procedimentos padrão. Lise 100% foi determinada como liberação de Cr51 a partir de células traçadas com detergente. O fundo foi a lise provocada por fibroblastos não infectados (BC) (ver Fig. 4-1).

Resultados Já 1 semana após a iniciação dos camundongos recém nascidos e adultos com iscoms de QWT, seus esplenócitos geraram para re-estímulo in vitro com fibroblastos (BCH4) infectados com hRSV uma resposta de célula T citotóxica forte (Fig. 4-1). Não foi observada qualquer lise contra células alvo não infectadas (BC na Fig. 4-1).

Conclusão Iscoms de RSV-QWT induzem uma forte resposta citotóxica de célula T em camundongos de 1 semana de idade. É observada uma citotoxidade especifica forte já 1 semana após uma imunização. Tendo em vista o efeito adjuvante forte dos iscoms de QWT e sua baixa toxidez, este sistema de liberação e adjuvante é muito provável de ser valioso tanto para vacinas humanas quanto animais.

Exemplo 5 Mostrou-se que saponinas de quilaia apresentam efeitos adjuvantes fortes, mas têm provocado efeitos colaterais por suas propriedades líticas, as quais podem ser mensuradas pela lise de células vermelhas do sangue. Efeitos tóxicos de qualquer tipc podem impedir o crescimento celular ou proliferação de células vivas. Está bem estabelecido que QHC e saponinas de quilaia menos purificadas como Quil A lisam células vermelhas do sangue (Rõnnberg B., Fekadu M. e Morein B., "Adjuvant activity of non-toxíc Quíllaja saponaria Molina components for use in iscom matrix", Vaccine, 1995, 13, (14) : 1375-82) . Está também claro que o efeito lítico de saponinas de quilaia provoca reações locais quando injetadas. Uma forma de evitar-se os efeitos líticos de saponinas é incluí-las em matriz de iscom. Além disto, os efeitos colaterais podem ser reduzidos selecionando-se a saponina de quilaia, que comparativamente provoca um efeito colateral pequeno. Neste exemplo o efeito da matriz de QWT é testado em células VERO, que é uma linhagem celular de primata, e é comparado com formulações de matriz de QHC e 703. Em um segundo experimento, células de baço de camundongos foram expostas a matrizes de QWT e QHC. As células de baço são representativas para o sistema linfático essencial para a indução de respostas imunológicas. É utilizado o ensaio alamarBlue, que determina quantitativamente a proliferação de células com base na detecção da atividade metabólica.

Materiais e Métodos Células e crescimento celular. Células VERO foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Instituto Nacional de Veterinária, Uppsala, Suécia) suplementado com 7% de soro bovino fetal (obtido como acima). Após crescimento em frascos de 75 cm2 (Corning-Costar, Acton MA, EUA) as células são destacadas da superfície plástica e diluídas para 25 a 30000 por ml, e distribuídas em partes de 100 μΐ por poço em placas de cultura celular de 96 poços (Nunc A/S, Roskilde, Dinamarca). As culturas são incubadas em atmosfera de COj por 24, 48 e 72 horas. As matrizes preparadas com QWT, ou 703 ou QHC foram diluídas eia meio de 0 a 1300 pg por ml. As culturas celulares foram retiradas do meio e as diluições de matriz foram adicionadas aos poços. Como controle foi utilizado apenas meio. O teste foi conduzido com as formulações a serem testadas por períodos de incubação de 24, 48 e 72 horas. O período de tempo mais adequado foi de 72 horas, o qual é apresentado aqui. Os controles são considerados comc 1C0% de crescimento.

Registro do crescimento celular. O ensaio alamarBlue (Serotec Ltd., Oxfcrd UK) , que determina quanoitativamente a proliferação das células com base na detecção da atividade metabólica, foi utilizado de acordo com a descrição do fabricante.

Resultados Após 72 horas de incubação das culturas celulares com matriz de QWT a uma concentração de 1300 pg por ml, foi registrado um crescimento celular de 80% em comparação com as culturas de controle, enquanto que o crescimento celular caiu para 0% quando exposto à matriz 703 a uma concentração de 800 pg por ml. O crescimento celular caiu para 0% quando exposto à matriz de QHC a uma concentração de 40 pg por ml. A Fig. 5-1 ilustra um experimento dos três com resultados similares.

Conclusão A matriz de QWT é bem tolerada pelas células e apresenta efeito tóxico celular muito baixo.

Em um segundo experimento, células de baço foram expostas a matrizes de QWT e QHC.

Materiais e Métodos Células e crescimento celular Células de baço de camundongos Balb/c foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Instituto Nacional de Veterinária, Uppsala, Suécia) suplementado com soro bovino fetal 7% em placas de cultura celular de 96 paços (Nunc, Roskilde, Dinamarca). O teste foi conduzido em células de baço com as formulações de QWT-iscom e QHT-iscom com incubação por períodos de 24, 48 e 72 horas. O período mais adequado foi de 72 horas, o qual é apresentado aqui. Os controles são considerados como 100% de crescimento.

Registro do crescimento celular Foi utilizado o ensaio alamarBlue, o qual determina quantitativamente a proliferação das células com base na detecção da atividade metabólica, de acordo com a descrição do fabricante.

Resultados Após 72 horas de exposição, as culturas de células de baço à matriz de QWT a uma concentração de 10 pg por ml, foi registrado um crescimento celular de 80% em comparação com culturas de células de baço (controle) não expostas, enquanto que o crescimento celular caiu para próxi.mo a 0% quando expostas à matriz de QVC a uma concentração de 2 pg por ml (Fig. 5-2 A e B). A Fig. 5-2 ilustra un experimento de 3 com resultados similares.

Exemplo 5 Preparação de sub-fragmentos de saponinas de Quillaja saponaría Molina.

Purificação do extrato bruto de Quillaja saponaria Molina para frações A, B e C.

Uma solução (0,5 ml) de extrato bruto de casca de quilaia em água (0,5 g/mi) é pré-tratada em uma coluna sep-pak (Waters Associates, MA). O pré-tratamento envolve a lavagem da coluna sep-pak carregada com acetonitrila 10% em água acidifícada de maneira a remover substâncias hidrofílicas. Substâncias lipofílicas incluindo QH-A, QK-B e QH-C são então eluidas por acetonitrila 70% em água. A fração lipofilica proveniente da coluna sep-pak é então separada por uma coluna de HPLC semi-preparativa (CT-sil, C8, 10 x 250 mm, ChromTecíi, Suécia) . A amostra é eluida através da coluna por um gradiente de acetonitrila de 25% a 60% em água acidifícada. São coletadas três frações da coluna HPLC durante a separação. Os resíduos após evaporação destas três frações constituem em QH-A, QH-B e QH-C.

As frações designadas como QH-A, QH-B e QH-C foram eluidas a aproximadamente acetonitrila 39, 47 e 43% respectivamente. 0 perfil e condições exatas de diluição são mostradas na Figura 6.

Exemplo 6 OVA é um antigeno fraco requerendo um adjuvante para induzir uma resposta imune potente. Adjuvantes prospectivos são, desta forma, freqíientemente testados em conjunto com OVA para demonstrar quantitativamente o aumento imunológico pela determinação do nível de anticorpo ou qualitativamente pela determinação do efeito imuno-modulador. O efeitc modulador é, por exemplo, registrado pela capacidade de acionar respostas antigeno específicas para a sub-classe IgG. Uma resposta dominada pelo anticorpo IgGl é significativa para o tipo de resposta Th2 enquanto que lgG2a é significativa para o tipo Thl. Uma resposta tanto em IgGl quanto em IgG2a implica no equilíbrio da imuno-modulação entre Thl e Th2. Este exemplo é realizado para demonstrar que o QWT-marriz atua de forma sinérgica com o QHC-matriz mais tóxico para permitir o uso de uma dose comparatívainente baixa e bem tolerada de QHC-macriz com efeito otimizado.

Materiais e Métodos QWT e QHC-Matriz Estes componentes.de saponina de quílaia (ver Exemplo 5) foram obtidos e formulados em ISCOM-Matriz como descrito no Exemplo 1. Ovalbumina (OVA) foi obtida da Sigma (St. Louis, EUA).

Procedimento Experimental Todos os camundongos foram imunizados s.c. na base da cauda com um volume total de 100 μΐ. 0 Grupo 1 consistiu em 8 camundongos Balb/c imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença, com 5 yg de OVA sem adição de adjuvante. 0 Grupo 2 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença, com 5 yg de OVA com 6 yg de QWT-matriz como adjuvante. 0 Grupo 3 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença, com 5 yg de OVA com 6 yg de QHC-matriz como adjuvante. 0 Grupo 4 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença, com 5 yg de OVA com uma dose baixa de QHC-matriz (2 yg) como adjuvante suplementada com 6 yg de QWT-matriz. Foram coletados soros antes da primeira imunização e 3 semanas após a iniciação e 2 semanas após o reforço.

Determinação de anticorpo A determinação do anticorpo sorológico, incluindo IçG, e as sub-classes IgGl e IgG2a, foi determinada em ELISA como descrito no Exemplo 1.

Resultados Após a iniciação (Fig. 7-1), ocorreu uma resposta IgG acima de 1:100 em 1 de 8 camundongos imunizados com OVA + QWT-matriz (grupo 2), em 2 de 8 camundongos no grupo imunizado com OVA + QHC-matriz (grupo 3) . Em contraste, todos os 3 camundongos no grupo imunizado com dose baixa de QHC-matriz suplementada com QWT-matriz (grupo 4) responderam com uma resposta IgG. Nenhum dos camundongos imunizados apenas com OVA respondeu com um título > 1:100 após a imunização primária.

Após a iniciação 2 de 8 camundongos no grupo imunizado com a combinação de QWT-matriz e dose baixa de QHC-matriz (grupo 4) responderam com uma resposta IgG2a antigeno específica > 1:100. Nenhuma resposta IgG2a foi registrada após a iniciação nos outros grupos.

Após o reforço (Fig. 7-2) todos os camundongos nos grupos 2, 3 e 4 responderam com títulos de IgG > 1:100. No entanto, os títulos no Grupo 2 e Grupo 3 variaram em 2 logs (3 700 - 295 000 e 3 100 - 400 000, respectivamente) , enquanto que os títulos no grupo 4 variaram, dentro de 1:10 de log (260 000 - 350 OOC).

Os resultados de IgGl após a iniciação foram iguais àqueles da resposta IgG (total). Desta forma, estes resultados não foram mostrados em uma figura. A resposta antigeno específica IgG2a após reforço foi desprezível no Grupo 2 que recebeu OVA + QWT-matriz. Os Grupos 1 e 3 mostraram respostas da sub-classe IgG2a variáveis, enquanto que no Grupo 4, que recebeu OVA + QWT-matriz e 2 pg de QHC-matriz, todos responderam com títulos IgG2a altos, todos dentro de um log.

Conclusão QWT-matriz em uma dose baixa é bem tolerado e sem efeitos colaterais mensuráveis na dose utilizada neste exemplo, no entanto, é também tolerado em uma dose várias vezes mais alta, conforme mostrado no exemplo 1, Neste exemplo, QHC-matriz foi utilizado em uma dose baixa e bem tolerada mas sub-ótima, como adjuvante em si. Está clararaente documentado neste experimento, que QWT-matriz e QHC-matriz atuam de forma sinérgica em uma formulação adjuvante bem tolerada. Deve ser enfatizado que tanto as doses de QWT-matriz quanto QHC-matriz, conforme utilizadas na formulação combinada neste exemplo, são muito baixas para serem efetivas por si só, implicando em sinergismo.

Exemplo 7 Neste experimento o efeito sinérgico do QWT-matriz é testado em compostos derivados de bactéria ativos como adjuvante petente; monofosforil lipídec A (MPL) e toxina de cólera (CT) . É avaliado no que diz respeito ao aumento da imunogenicidade do antigeno fraco, OVA. Foram utilizados os camundongos exogâmicos NMRI, que, em contraste com camundongos Balb/c respondem prontamente com o tipo de imunidade Thl bem como Th2 refletidos pelos níveis de anticorpos IgG2a (Thl) e IgGl (Th2).

Materiais e Métodos OVA QWT-iscoms Estes ISCOMs foram preparados essencialmente como descrito para QWT-matriz no exemplo 1, com exceção que foi adicionada OVA transformada com ácido palmítico (pOVA) à preparação a uma concentração de 1 mg por mg de colesterol. A preparação de pOVA-iscoms foi descrita por Johansson e Lõvgrer.-Bengtsson em Vaccine 17 (1999), pg. 2894. CT foi obtida comercialmente da KeLab, Gothenburg, Suécia. MLP e OVA foram da Sigma (St. Louis, EUA).

Procedimento Experimental Todos os camundongos foram imunizados s.c. na base da cauda com um volume total de 100 μΐ. O Grupo 1 consistiu em 8 camundongos NMRI imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 5 pg de OVA sem adição de adjuvante. O Grupo 2 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 5 pg de OVA incorporados em QWT-iscoms contendo 6 pg de QWT sem adjuvante adicional. O Grupo 3 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 5 pg de OVA (como no grupo 1) com uma dose alta de CT (1 pg) como adjuvante. 0 Grupo 4 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 5 pg de OVA (como no grupo 1) com uma dose alta de MLP (50 pg) como adjuvante. O Grupo 5 consistiu em 8 camundongos imunizados com 5 pg de OVA em QWT-ISCDMs (como no grupo 2) suplementada com uma dose baixa de CT (0.2 pg). O Grupo 6 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 5 pg de OVA em QWT-iscoms (como no grupo 2) com uma dose baixa de MLP (10 pg) como adjuvante. Toram. coletados soros 3 semanas após a iniciação e 2 semanas após a injeção de reforço.

Determinação dc anticorpo A determinação de anticorpo sorológico, incluindo IgG total, e sub-classes IgGl e IgG2a, foi conduzida em ELISA como descrito no exemplo 1.

Resultados Os resultados são mostrados na Figura 8.

Após a primeira imunização, os níveis de IgG total eram comparáveis para os grupos 2 a 6 e a resposta de anticorpo IgG2a a OVA foi baixa para os camundongos em todos os grupos (não mostrado).

Após o reforço (Fig. 8a) os camundongos imunizados apenas com OVA reagiram com níveis sorológícos de IgG baixos. A OVA em QWT-ISCOM suplementada com uma dose baixa de CT (0,2 pg) induziu níveis de IgG 7 vezes mais altos que a OVA com dose alta (1 pg) de CT como adjuvante, A OVA em QWT-ISCOM suplementada com uma dose baixa de MPL (10 pg) induziu níveis de IgG 2 vezes mais altos que a OVA com dose alta (50 pg) de MPL como adjuvante.

As IgGl foram essencialmente refletidas pelas respostas de anticorpo IgG total, e não são mostradas.

Diferenças maiores foram registradas quando da determinação das respostas de anticorpo dentro da sub-classe IgG2a (Fig. 8B) . A dose baixa de MPL foi aumentada em cerca de 10 vezes nos níveis de anticorpo sorológico IgG2a com a formulação de OVA em QWT-ISCOM em comparação com OVA com a dose alta de MPL como adjuvante. Ainda mais marcante é o amento de 100 vezes da resposta IgG2a pela OVA-QWT-ISCOM com dose baixa de CT em comparação com OVA formulada com dose alta de CT.

Conclusão OVA em QWT-ISCOM formulada cora dose baixa de CT ou MPL foi consideravelmente mais imunogênica que as correspondentes formulações com altas doses de MPL ou CT, excluindo QWT. 0 aumento com QWT-ISCOM da imunogenicidade da OVA foi mais marcante na sub-classe IgG2a mostrando efeitos imuno-raoduladores fortes do componente QWT nas respectivas formulações. Embora a modulação de Thl tenha sido mais marcante que a de Th2, a modulação acionada por QWT-ISCOM foi balanceada. O efeito direcionado para Thl foi mais proeminente que com CT explicado pelo fato de CT ser mais direcionado para Th2 que MPL.

Exemplo S

Vacinas são frequentemente compostas de antígenos em formas particuladas como é freqüentemente o caso de vacinas contra bactérias ou virus. Toxinas, por outro lado, são antígenos solúveis detoxificados pela conversão a toxóides, por exemplo, pelo tratamento com formalina. No exemplo 1 (Figs. 1-2A, B e C) e nos exemplos 6 e 7 é mostrado que a imunogenicidade de um antigeno fraco como OVA é fortemente aumentada pelo efeito sinérgico de QWT-matriz, quando o QWT-matriz é utilizado para complementar uma dose baixa e bem tolerada de QHC-matríz, CL ou MPL.

Neste exemplo, ura antigeno vacinai solúvel comercial mas imunogênico, toxóide tetânico (TT) é suplementado com toxina de cólera (CT) sendo um forte adjuvante que aciona uraa resposta do tipo Th2, mas também tóxico em doses comparativamente baixas. Incluído no exemplo está também um grupo de camundongos imunizados com TT e com CT como adjuvante complementado com QWT-matriz. QWT-matriz é adicionado para mostrar que a modulação da resposta CT pode ser alcançada com uma dose baixa de CT e que uma formulação bem tolerada de CT/QWT pode ser obtida, a qual é bem tolerada devido ao efeito sinérgico.

Materiais e Métodos QWT-Matriz QWT-matriz foi formulado como descrito no Exemplo 1.

TT e CT TT foi obtida comercialmente do The State SERUM Institute, Copenhagen, Dinamarca. CT foi obtida comercialmente do KeLab, Gothenburg, Suécia.

Procedimento Experimental Todos os camundongos foram imunizados s.c. na base da cauda com 100 μΐ de vacina. O Grupo 1 consistiu em 6 camundongos exogâmicos NMRI imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 2,5 Lf de TT sem adição de adjuvante. O Grupo 2 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 2,5 Lf de TT com uma dose alta de CT (1 pg) como adjuvante. O Grupo 3 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 2,5 Lf de TT com uma dose baixa de CT {0,2 pg) como adjuvante. O Grupo 4 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 2,5 Lf de TT com uma dose baixa de CT (1 pg) como adjuvante suplementado com 10 pg de QWT-matriz. Foram coletados soros 3 semanas após a iniciação e 2 semanas após o reforço.

Determinação de anticorpo Esta foi realizada em ELISA como descrito no exemplo 1, exceto que o antigeno foi TT revestida para placas ELISA (Nunc) a uma concentração de 1 pg/ml.

Resultados Uma resposta de anticorpo primária clara, determinada como IgG antigeno especifica, foi registrada em todos os quatro grupos, mostrando que a TT é um imunógeno comparativamente forte. TT com dose baixa de CT (0,2 gg) como adjuvante suplementada com QWT-matriz induziu uma resposta IgG primária 3 vezes mais alta quando em comparação com as outras formulações (9-1 A).

Após o reforço, a resposta IgG total aumentou em todos os grupos em que TT foi suplementado com adjuvante (9-1 B) , enquanto que a segunda imunização não aumentou significativamente o nível de anticorpo em camundongos imunizados apenas com TT.

Após uma imunização, a resposta IgG2a, indicando uma resposta imune do tipo Thl, foi induzida apenas em camundongos (grupo 4) imunizados com TT com dose baixa de CT (0,2 gg) como adjuvante suplementada com QWT-matriz (9-2 A) .

Após o reforço, o grupo de camundongos com QWT-matriz respondeu com os títulos mais elevados de IgG2a. Os camundongos no grupo 3 com TT com baixa dose de CT (0,2 pg) como adjuvante responderam com títulos de anticorpo IgG2 específico para TT despezíveis ou muito baixos.

Conclusão A TT é um imunógeno comparativamente forte que promove um tipo Th2 de resposta. Ά CT é uma toxina forte com efeito adjuvante forte promovendo também um tipo Th2 de resposta. Neste experimento, é mostrado que QWT-matriz promove fortemente (modula) uma resposta por parte do hospedeiro também com anticorpo IgG2a antígeno específico quando adicionado ao antígeno TT suplementado com uma dose baixa de CT. É interessante notar-se que o forte efeito adjuvante direcionador para Th2 da CT é modulado pelo QWT-matriz para Thl. Desta forma, o QWT-matriz apresenta um efeito íinuno-niodulador combinado com CT como adjuvante.

Exemplo 9 Neste exemplo, um antígeno vacinai solúvel comercial de toxóide tetânico (TT) é suplementado com monofosforil lipídeo A (MPL) sendo um adjuvante forte que direciona uma resposta do tipo Thl. Uma dose baixa de MPL foi complementada com QWT-matriz para demonstrar o efeito modulador e sinérgico de QWT-matriz sobre o antígeno TT na presença dc MPL.

Materiais e Métodos QWT-Matriz QWT-matriz foi formulado como descrito no Exemplo 1.

TT e MPL

TT foi obtida comercialmente do The State SERUM

Institute, Copenhagen, Dinamarca. MPL (L6895 foi obtida comercialmente da Sigma (St. Louis, EUA).

Toxóide Tetânico (TT) TT foi obtida comercialmente do The State SERUM

Institute, Copenhagen, Dinamarca.

Procedimento Experimental Todos os camundongos foram imunizados s.c. na base da cauda com 100 μΐ da vacina. O Grupo 1 consistiu em 6 camundongos exogâmicos NMRI imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 2,5 Lf de TT sem adição de adjuvante. O Grupo 2 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 2,5 Lf de TT com uma dose alta de MPL (50 pg) como adjuvante. O Grupo 3 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 2,5 Lf de TT com uma dose baixa de MPL (10 pg) como adjuvante. O Grupo 4 consistiu em 8 camundongos imunizados duas vezes com 4 semanas de diferença com 2,5 Lf de TT com uma dose baixa de MPL (10 pg) como adjuvante suplementado com 10 pg de QWT-matriz. Foram coletados soros 3 semanas após a iniciação e 2 semanas após o reforço.

Determinação de anticorpo Esta foi realizada como descrito no Exemplo 8.

Resultados Uma resposta de anticorpo primária clara, determinada como IgG antigeno específica, foi registrada em todos os quatro grupos, mostrando que o TT é um imunógeno comparativamente forte (10-1 A) . TT com dose baixa de MPL (10 pg) como adjuvante suplementado com QWT-matriz induziu uma resposta IgG primária 2 vezes mais alta que a formulação de TT com 10 pg de MPL como adjuvante.

Após o reforço, a resposta IgG total aumentou substancialmente em todos os grupos em que TT foi suplementado com adjuvante (10-2 B), enquanto que a segunda imunização não aumentou significativamente o nível de anticorpo em camundongos imunizados apenas com TT. Os camundongos imunizados com TT com MPL (10 pg) como adjuvante suplementado com QWT-matriz responderam com uma resposta IgG específica de mais de 100 vezes (10-1 B) , o que foi cerca de 8 vezes mais alta que a resposta induzida por TT suplementado com uma dose baixa de MPL (10 mg) , mas sem QWT-matriz. A resposta IgGl mostrou o mesmo perfil que a resposta IgG total tanto após a imunização primária quanto após a segunda.

Os camundongos imunizados com TT com dose baixa de MPL (10 pg) como adjuvante suplementado com QWT-matriz responderam com títulos de IgG2a 10 vezes mais altos que os camundongos imunizados com TT suplementado com uma dose baixa de MPL (10-2 A) . Os camundongos nos outros grupos não desenvolveram resposta IgG2a primária.

Após o reforço, os camundongos imunizados com TT com dose baixa de MPL (10 pg) como adjuvante suplementado com QWT-matriz responderam com os títulos de IgG2a mais elevados sendo mais de 100 vezes mais altos que nos camundongos nos outros grupos (10-2 B) .

Conclusão QWT-matriz com antigeno e/ou MPL aumentou de forma potente a resposta de anticorpo IgG2a, mas também IgGl, indicando um efeito imuno-modulador equilibrado forte sobre o antigeno TT na presença de MPL. A forte imunogenicidade do TT é enfatizado pelo fato do MPL por si só não aumentou ou aumentou apenas de forma marginal as respostas IgG total e IgG2a ou IgGl ao antigeno TT. Isto indica que um adjuvante forte, como MPL, deve apresentar um efeito imuno- modulador limitado na presença de um imunógeno forte como TT. Em contraste, QWT é simbiótico no efeito com MPL demonstrado pelo fato desta combinação apresentar um efeito imuno-modulador forte.

Claims (10)

1. Uso da fração A de Quil A integrada em uma partícula de ISCOM em conjunto pelo menos outro adjuvante com capacidade imunomodu.l adora na forma livre ou integrada era outra partícula de ISCOM separada, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição adjuvante corn efeito sinergistico incluindo aumento de respostas imunes e atividade imunomoduladora facilitando o uso de outro adjuvante que, quando utilizado por si só pode ser tóxico em, doses que são eficientes.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos outro adjuvante é escolhido de saponinas, de ocorrência natural, moléculas de saponina sintéticas ou semi-sintéticas derivadas do extrato de saponina bruto de Quillaja saponarla Molina escolhidos entre frações de C, B, B3, B4 e B4b e QA-1, QA-2, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12, QA-13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20 e QA-22, esqueleto de parede celular, polímeros em bloco, por exemplo, copolímeros em bloco hidrofilicos, por exemplo, CRL-1GG5, TDM ídi-mucolafo de trealose) , 1 ipopeptideos, LPS e derivados de LPS, lipidio A de diferentes espécies de bactérias e derivados deste, por exemplo, monofosforil lipidio A, variantes de CpG, variantes de CpGODN, imunomoduladores humanos e animais endógenos, por exemplo, CMOS!', IL-2, adjuvantes de toxinas bacterianas ativas, por exemplo, toxina da cólera CT, e seus sub-componentes CTB e CTAl, toxina terinolãbil (LT) ou toxina de E. coli, ou Bordeüella pertussis (BP) e hemagluteniná filamentosa de BP.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fração de saponina de Quil A é escolhida entre as frações C ou B de Quil A.

4 . Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracter i z ado pelo fato de que pelo menos outro adjuvante é integrado em uma partícula de ISCOM.

5. Uso de acordo com a reivindicações 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos outro adjuvante é integrado em partículas de ISCOM separadas.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a fração A de Quil A é integrada em uma partícula de ISCOM e pelo menos outro adjuvante está livre e não integrado em qualquer partícula de ISCOM.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos outro adjuvante que está livre e não integrado em qualquer partícula de ISCOM é monofosforil lipídio A e/ou toxina da cólera CT.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a partícula de ISCOM é um complexo de ISCOM.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a partícula de ISCOM é um complexo de matriz de ISCOM.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um veículo,· diluente, excipiente ou aditivo farmaceuticamente aceitável.