JP7417532B2 - 多価インフルエンザナノ粒子ワクチン - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１８年３月１９日に提出された米国仮出願第６２／６４４，６２３号、及び２０１９年１月３日に提出された米国仮出願第６２／７８７，９８０号の優先権を主張するものであり、そのそれぞれの内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本出願ではまた、２０１６年９月６日に提出された米国出願番号第１５／２５７，４３６号、及び２０１７年１１月２１日に提出された米国出願番号第１５／８１９，９６２号の内容が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、一般に、インフルエンザに対する免疫応答を刺激するのに有用なインフルエンザワクチン組成物に関する。

季節性インフルエンザの実質的な世界的な負担について数多く立証されてきた。米国だけでも、毎年約１４０，０００人から１０，０００人の入院と１２，０００人から５６，０００人の死亡がインフルエンザに起因しており、高齢者は入院の６２％、死亡率の７２％と高い割合を占める。季節性インフルエンザのワクチン接種は予防活動の中心であり、２０１０年以降、米国で広く推奨されてきた。

しかしながら、深刻な２０１７－２０１８ Ａ（Ｈ３Ｎ２）が優勢な米国のインフルエンザシーズンを含む最近の動向は、少なくともオーストラリア、カナダ、及び米国においてワクチンの有効性が低いことが示される。卵ベースのインフルエンザワクチンに関連する抗原ミスマッチなどのその他の問題、及び抗原ドリフトの持続的な課題も、より効果的なワクチン接種戦略を提供する必要性を表している。

したがって、インフルエンザウイルスに対するワクチンの製造に関心が寄せられているが、特に組換え卵タンパク質を含まないアプローチを使用して、効果的なワクチンを製造するニーズが依然として残っている。

本開示は、多価インフルエンザ組成物を提供する。該組成物は、複数のインフルエンザ株に対する免疫応答を刺激する。有利には、免疫応答は、組成物を調製するために使用されるものとは異なる株のバリアントに向けられた広域中和抗体を含み得る。インフルエンザ変異は「ドリフト株」をもたらし、開示された組成物は「ドリフト株」に対する保護を提供する。加えて、該組成物は優れた安定性を示し、長期間保管することができ、すぐに投与することができるプレフィルドシリンジで製造され得る。一部の態様では、プレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）は、予めアジュバント及びインフルエンザ抗原を含み得、長期間保管され得る。開示された組成物は、冷蔵（２～８℃）される必要がなく、より高温（例えば室温、約２５℃）で良好な安定性を示す。したがって、本明細書に開示された組成物は、優れた利便性及び優れた免疫応答を提供する。

特定の態様では、インフルエンザ抗原を含むナノ粒子は、対象への投与の前に、しばらくＩＳＣＯＭマトリックスアジュバント（本明細書では「マトリックス」とも呼ばれる）と混合することによってワクチン組成物に共製剤化し、ＨａＳＭａＮ（赤血球凝集素サポニンマトリックスナノ粒子）を形成する。ＨａＳＭａＮを含む組成物は、優れた安定性及び免疫原性を示すため、例えばプレフィルドシリンジでのパッケージングに適している。実際、ＨａＳＭａＮは洗浄剤コアナノ粒子よりも安定している。示差走査熱量計によって測定された熱安定性は、洗浄剤コアナノ粒子と比較して、ＨａＳＭａＮの方が約１度良好であった。従来は、ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントを使用するアプローチは、投与直前にワクチン組成物をベッドサイドでアジュバントと組み合わせることを伴った。特定の態様では、本明細書に開示された組成物は、その必要性を排除し、したがって免疫応答を誘導する改善された方法を提供する。驚くべきことに、インフルエンザの型によってＨａＳＭａＮの形成が異なることが判明した。ＨａＳＭａＮは通常、組成物がＡ型インフルエンザ株由来の赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を含む場合に形成されるが、ＨＡタンパク質がＢ型インフルエンザ株由来の場合には形成されない。

一部の実施形態では、多価インフルエンザ組成物中のＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントは、第１の型であるサポニン画分Ａを含むマトリックスＡ（本明細書では画分Ａマトリックスとも呼ばれる）と、第２の型であるサポニン画分Ｃを含むマトリックスＣ（本明細書では画分Ｃマトリックスとも呼ばれる）の、２つの型のマトリックスの組み合わせであるマトリックスＭである。ある特定の態様では、マトリックスＭは、少なくとも約８５％（ｗ／ｗ）の画分Ａマトリックスと、その残りの画分Ｃマトリックスを含み得る。特に指示されない限り、本明細書において使用されるマトリックスＭは、画分Ａマトリックス及び画分Ｃマトリックスを、８５：１５（ｗ／ｗ）の比率で含み、本明細書ではマトリックスＭ１とも呼ばれる。

いくつかの実施形態では、四価のナノ粒子インフルエンザ組成物中の各インフルエンザＨＡタンパク質は、異なるインフルエンザ株に由来し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの株は、サブタイプＡ株またはサブタイプＢ株であり得る。いくつかの実施形態では、サブタイプＡ株は、マトリックスＭアジュバントに複合化され得るが、サブタイプＢ株はそうではない。

本開示により、特に季節性ワクチンでの使用のための、多価組成物が想定されるが、一価ワクチン組成物はまた、例えば、時々発生するパンデミック・インフルエンザ株に対してワクチン接種するために使用するためのＨａＳＭａＮを用いて製造され得る。

安定性、特に室温での安定性は、コールドチェーン保管の必要性を低減または排除し、流通をより安く簡単に実現するため、貴重な性質である。有利には、本明細書に開示された多価組成物は、長期間、例えば、最大３ヶ月、最大６ヶ月、最大１２ヶ月、これらの期間、室温（すなわち、約２５℃）で安定である。特にマトリックスＭアジュバントと製剤化された場合の優れた安定性は、ワクチン組成物が、すぐに投与できる形式（例えばプレフィルドシリンジ製剤）での臨床現場への送達に適していることを意味する。

インフルエンザＨＡ洗浄剤コアナノ粒子のみ（左）、マトリックスＭのみ（中央）、ならびに赤血球凝集素サポニンマトリックスナノ粒子（ＨａＳＭａＮ）を形成するＨＡナノ粒子及びマトリックスＭの組み合わせ（右）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像の例を示す。 ４℃で、Ｔ＝０、６ヶ月、及び１２ヶ月における、高用量及び低用量の四価のベッドサイドバイアル製剤（２４０μｇ／ｍＬ／株及び６０μｇ／ｍＬ／株）、ならびにマトリックスＭを含有または非含有のプレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）製剤（１２０μｇ／ｍＬ／株及び３０μｇ／ｍＬ／株）のインフルエンザ抗原の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像を示す。図中の略語は、ＰＦＳがプレフィルドシリンジ、Ｍ１がマトリックスＭである。 ４℃で、時間＝０における、高用量のベッドサイドバイアル製剤（２４０μｇ／ｍＬ／株）、ならびにマトリックスＭを含有または非含有のＰＦＳ製剤（１２０μｇ／ｍＬ／株）のインフルエンザ抗原の非還元及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像を示す。 ４℃及び２５℃で、Ｔ＝３ヶ月時点における、高用量及び低用量のベッドサイドバイアル製剤（２４０μｇ／ｍＬ／株及び６０μｇ／ｍＬ／株）、ならびにマトリックスＭを含有または非含有のＰＦＳ製剤（１２０μｇ／ｍＬ／株及び３０μｇ／ｍＬ／株）のインフルエンザ抗原の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像を示す。 ２～８℃で、Ｔ＝０、２週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、及び１２ヶ月における、マトリックスＭを含有または非含有の、１２０μｇ／ｍＬ／株の用量のＰＦＳ製剤の、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ株の一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）結果を示す。図中の略語は、ＭＸＭがマトリックスＭ、ＨＫがＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ、ＭＩがＭｉｃｈｉｇａｎ、ＢｒｉｓがＢｒｉｓｂａｎｅ、ＰｈｕがＰｈｕｋｅｔである。 ２５℃で、Ｔ＝０、２週間、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月における、マトリックスＭを含有または非含有の、１２０μｇ／ｍＬ／株の用量のＰＦＳ製剤の、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ株のＳＲＩＤ結果を示す。 Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４に対する市販のインフルエンザワクチンと比較した、マトリックスＭを含有もしくは非含有のＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスの赤血球凝集抑制抗体応答を示す。抗体応答はＨＡＩ力価として表される。図中の略語は、ＨＡＩが赤血球凝集抑制、ＨＡが赤血球凝集素、Ｃｏ－ｆｏｒｍが共製剤、Ｑｕａｄ－ＮＩＶが四価ナノ粒子インフルエンザワクチン、ＱＩＶが四価インフルエンザワクチンである。 市販のインフルエンザワクチンと比較した、マトリックスＭを含有もしくは非含有のＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスのＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。 市販のインフルエンザワクチンと比較した、マトリックスＭを含有もしくは非含有のＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。 市販のインフルエンザワクチンと比較した、マトリックスＭを含有もしくは非含有のＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスのＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。 Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３に対する、マトリックスＭを含有した、Ｑｕａｄ－ＮＩＶプレミックスまたはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスの赤血球凝集抑制抗体応答を示す。ＰＦＳ製剤は４℃で３ヶ月間保管した。ベッドサイドミックスワクチンの場合、ウイルス抗原を－６０℃で３ヶ月間保管し、投与直前にマトリックスＭアジュバントと混合した。抗体応答は、ＨＡＩ ＧＭＴ力価として表した。ＧＭＴ結果には、９５％の下方管理限界と９５％の上方管理限界を使用した。図中の略語は、ＨＡＩが赤血球凝集抑制、ＨＡが赤血球凝集素、ＧＭＴが幾何平均力価、ＬＣＬが下方管理限界、ＵＣＬが方管理限界である。 ２１日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、表示の温度で６ヶ月間保管した。 ３５日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、表示の温度で６ヶ月間保管した。 ２１日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、表示の温度で６ヶ月間保管した。 ３５日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、表示の温度で６ヶ月間保管した。 ２１日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、表示の温度で６ヶ月間保管した。 ３５日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。抗体応答は、ＨＡＩ力価として表した。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、表示の温度で６ヶ月間保管した。 ２１日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＢ／Ｐｈｕｋｅｔ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、表示の温度で６ヶ月間保管した。 ３５日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＢ／Ｐｈｕｋｅｔ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。抗体応答は、ＨＡＩ力価として表した。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、表示の温度で６ヶ月間保管した。 ２１日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、４℃で１２ヶ月間保管した。 ３５日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、４℃で１２ヶ月間保管した。 ２１日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、４℃で１２ヶ月間保管した。 ３５日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、４℃で１２ヶ月間保管した。 ２１日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、４℃で１２ヶ月間保管した。 ３５日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。抗体応答は、ＨＡＩ力価として表した。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、４℃で１２ヶ月間保管した。 ２１日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＢ／Ｐｈｕｋｅｔ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、４℃で１２ヶ月間保管した。 ３５日目における、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ共製剤またはベッドサイドミックス製剤を投与したマウスにおけるＢ／Ｐｈｕｋｅｔ株に対する赤血球凝集抑制抗体応答を示す。抗体応答は、ＨＡＩ力価として表した。プレミックスしたＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤を、４℃で１２ヶ月間保管した。 ４℃で、Ｔ＝０、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、または１２ヶ月におけるＱｕａｄ－ＮＩＶ ＰＦＳ製剤（１２０μｇ／ｍＬ）、及び４℃で、Ｔ＝３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、または１２ヶ月における１００μｇ／ｍＬのマトリックスＭ１を含有したＱｕａｄ－ＮＩＶ ＰＦＳ製剤のＡＵＣ沈降プロファイルを示す。 実験開始時（Ｔ０）、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月における、マトリックスＭ１（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ ＰＦＳ製剤の遠心分析（ＡＵＣ）沈降プロファイルを示す。製剤は２５℃でインキュベートした。 インキュベーションなし（Ｔ＝０）の、高用量のＱｕａｄ－ＮＩＶのみ（１２０μｇ／ｍＬ／株）、マトリックスＭのみ（１００μｇ／ｍＬ）、高用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ＋マトリックスＭ、及び低用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（３０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）のＴＥＭ画像を示す。 ４℃または２５℃での高用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（１２０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）及び４℃または２５℃での低用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（３０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）のＴＥＭ画像を示す。全ての試料を４時間インキュベーションした。 ４℃または２５℃での高用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（１２０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）及び４℃または２５℃での低用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（３０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）のＴＥＭ画像を示す。全ての試料を２４時間インキュベーションした。例示的なＨａＳＭａＮを円で囲んでいる。 ４℃または２５℃での高用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（１２０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）及び４℃または２５℃での低用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（３０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）のＴＥＭ画像を示す。全ての試料を４８時間インキュベーションした。例示的なＨａＳＭａＮを円で囲んでいる。 ４℃または２５℃での高用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（１２０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）及び４℃または２５℃での低用量のＱｕａｄ－ＮＩＶ（３０μｇ／ｍＬ／株）＋マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）のＴＥＭ画像を示す。全ての試料を７日間インキュベーションした。例示的なＨａＳＭａＮを円で囲んでいる。 様々な温度（２～８℃、２５℃、及び３７℃）で１ヶ月間インキュベートした、マトリックスＭ（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、低用量のＰＦＳ群（３０μｇ／ｍＬ／株）のＴＥＭ画像を示す。 マトリックスＭ１（１００μｇ／ｍＬ）を含有または非含有の、１２０μｇ／ｍＬ／株の製剤の用量のＱｕａｄ－ＮＩＶのＤＳＣプロファイルを示す。４℃で３ヶ月、６ヶ月、及び１２ヶ月間インキュベートした、ならびに２５℃で３ヶ月及び６ヶ月間インキュベートした、四価ワクチン抗原のモル熱容量（Ｃｐ：ｋＪ／ｍｏｌ．ｋ）を示す。 Ａ株、Ｂ株、及びフォールドン（ｆｏｌｄｏｎ）に融合したＣ末端修飾Ａ株由来のＨＡタンパク質によるｎＨＡ（すなわち、洗浄コアナノ粒子）の減少によって測定されたＨａＳＭａＮの形成を示す。

定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で別段明確に指示されない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、１つのタンパク質またはそのようなタンパク質の混合物を指すことができ、「方法」への言及は、当業者に知られている同等のステップ及び／または方法への言及を含む、などである。

本明細書において使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫原と組み合わせて使用した場合に、免疫原に対して誘導される免疫応答を増強またはそうでなければ変更もしくは改変する化合物を指す。免疫応答の改変は、抗体及び細胞性免疫応答のいずれかまたは両方の特異性の強化または拡大を含み得る。

本明細書において使用される場合、数値の前にある「約」または「およそ」という用語は、値のプラスまたはマイナス１０％範囲を示す。例えば、「約１００」には９０及び１１０が含まれる。

本明細書において使用される場合、「免疫原」、「抗原」、及び「エピトープ」という用語は、免疫応答を誘発することができる、糖タンパク質を含むタンパク質及びペプチドなどの物質を指す。

本明細書において使用される場合、「免疫原性組成物」は、対象への該組成物の投与が、対象において抗原に対する体液性及び／または細胞性免疫応答の発展をもたらす抗原を含む組成物である。

本明細書において使用される場合、これらの「Ｑｕａｄ－ＮＩＶ」、「ＱｕａｄＮＩＶ」、または「四価ナノ粒子インフルエンザワクチン」は、４つのインフルエンザウイルス株由来の抗原を含むインフルエンザワクチン製剤を指す。

本明細書において使用される場合、「ベッドサイドミックス」、「ベッドサイド製剤」、「ベッドサイドワクチン組成物」、「ベッドサイドバイアル」、「ベッドサイドバイアル製剤」という用語は、投与直前に調製されるワクチン製剤を指す。そのようなワクチン製剤は、異なる容器に別々に保管されて対象に投与されるウイルス抗原及びアジュバントを含む（例えば、２回の連続注射を投与する、または投与前に抗原及びアジュバントを１回の注射に組み合わせる）。

本明細書において使用される場合、「共製剤ミックス」、「共製剤」、「共製剤ワクチン組成物」、「プレフィルドシリンジ」、「プレミックス」という用語は、対象への投与前に短期から長期間保管するために調製されるワクチン製剤を指す。このようなワクチン製剤は、インフルエンザ抗原及びＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントの組み合わせを同じ容器に含み、ＨａＳＭａＮ（赤血球凝集素サポニンマトリックスナノ粒子）を形成するのに十分な条件下で調製する。

本明細書において使用される場合、「処置する」、「処置」、及び「処置すること」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを指す。本開示の目的のために、有益なまたは所望の結果には、感染もしくは疾患の開始もしくは進行の阻害もしくは抑制、感染もしくは疾患の症状の改善もしくは発現の軽減、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。

「予防」は、本明細書において使用される場合、「予防法」と互換的に使用され、感染もしくは疾患の完全な予防、またはその感染もしくは疾患の症状の発現の予防、感染もしくは疾患もしくはその症状の発症の遅延、またはその後発展する感染もしくは疾患もしくはその症状の重症度の軽減を意味することができる。

本明細書において使用される場合、「有効用量」または「有効量」は、病原体感染の少なくとも１つの症状を軽減する免疫応答を誘発するのに十分な免疫原の量を指す。有効用量または有効量は、例えば中和分泌、及び／または血清抗体の量を測定することにより、例えばプラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、マイクロ中和アッセイ、及びＨＡＩ力価によって決定することができる。

本明細書において使用される場合、「ワクチン」という用語は、防御免疫（例えば、病原体による感染から対象を保護する及び／または病原体による感染によって引き起こされる疾患または状態の重症度を軽減する免疫）を提示する、病原体に対する免疫応答を誘発するために使用される、病原体由来の免疫原などの免疫原性組成物を指す。防御免疫応答には、抗体の形成及び／または細胞媒介性応答を含んでもよい。文脈に応じて、「ワクチン」という用語は、防御免疫を生じさせるために対象に投与される免疫原の懸濁液または溶液を指すこともある。

本明細書において使用される場合、「対象」という用語には、ヒト及び動物が含まれる。典型的には、対象はヒトである。例えば、対象は、成人、ティーンエイジャー、子供（２歳～１４歳）、乳幼児（１ヶ月～２４ヶ月）、または新生児（１ヶ月まで）であり得る。いくつかの態様では、成人は、約６５歳以上、または約６０歳以上の高齢者である。典型的な態様では、成人は、約６０歳～約７５歳未満、または少なくとも約７５歳である。いくつかの態様では、対象は、妊娠中の女性または妊娠することを意図している女性である。他の態様では、対象は、ヒトではなく、例えば非ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、またはマカクである。ある特定の態様では、対象は、イヌまたはネコなどのペットであってもよい。

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、特にヒトでの使用のために、米国連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されるか、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン及び／または抗原性組成物として有用である可能性がある。

ナノ粒子：構造及び形態
本明細書に開示された組成物は、２種類のナノ粒子を含む。洗浄剤コアナノ粒子と呼ばれる第１の種類は、本質的に前述のとおりである。あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１５／２５７，４３６号公報を参照のこと。簡潔に述べると、これらのナノ粒子は、バキュロウイルス発現系を使用してＨＡタンパク質を発現させ、次いで洗浄剤でＨＡタンパク質を抽出することにより、昆虫細胞において生成される。精製中、第１の洗浄剤を第２の洗浄剤、通常は非イオン性洗浄剤に変更し、三量体型のＨＡタンパク質の末端部分が埋め込まれた非イオン性洗浄剤コアを有するナノ粒子を得た。図１（左パネル）は、電子顕微鏡で観察したこれらの構造を示す。

本明細書では、第２の種類のナノ粒子をＨａＳＭａＮ（赤血球凝集素サポニンマトリックスナノ粒子）と呼ぶ。図１（右パネル）は、電子顕微鏡で観察したこれらの構造を示す。ＨＡ糖タンパク質は、マトリックスのかご型構造を修飾する。ＨａＳＭａＮ構造は、ＨＡナノ粒子を調製し、次いでＩＳＣＯＭマトリックスアジュバント粒子と一定期間インキュベートすることによって形成される。ＩＳＣＯＭマトリックス粒子は、図１の中央パネルに示される。注目すべきは、ＨａＳＭａＮは、Ａ型インフルエンザＨＡタンパク質と共に容易に形成されるが、Ｂ型とは形成されない。したがって、特定の態様では、Ａ型及びＢ型由来のＨＡタンパク質を有するナノ粒子を含む組成物は、両方の種類のナノ粒子（すなわち、洗浄剤コアナノ粒子及びＨａＳＭａＮ）を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子は２つの状態の間で遷移するため、組成物は遷移ナノ粒子を含み得る。

特定の実施形態では、洗浄剤コアナノ粒子は、非イオン性洗浄剤コアを囲む複数のタンパク質三量体で構成される。例えば、各ナノ粒子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１５の三量体を含み得る。いくつかの実施形態では、各ナノ粒子は、２～６の三量体を含む。特定の実施形態では、各ナノ粒子は、２～９の三量体を含む。

ＨＡタンパク質は、ナノ粒子の非イオン性洗浄剤含有コアと結合されている。典型的には、洗浄剤は、ポリソルベート－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート－６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート－６５（ＰＳ６５）、及びポリソルベート－８０（ＰＳ８０）から選択される。洗浄剤の存在は、抗原を組織化して提示するコアを形成することにより、ナノ粒子の形成を促進する。したがって、ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、マルチオリゴマー糖タンパク質－ＰＳ８０タンパク質－洗浄剤ナノ粒子に組み立てられた抗原を含み、ヘッド領域は外側に突出し、疎水性領域及びＰＳ８０洗浄剤は抗原によって囲まれた中心コアを形成する。特定の実施形態では、インフルエンザワクチン組成物中の非イオン性洗浄剤はＰＳ８０である。洗浄剤コアナノ粒子は、Ｚ－ａｖｅサイズが約２５ｎｍ～約３０ｎｍの範囲である。しかしながら、洗浄剤コアナノ粒子は、マトリックスＭとしばらく組み合わされると、ＨａＳＭａＮが形成され、それらは洗浄剤コアナノ粒子よりわずかに大きく、約５０ｎｍ～６０ｎｍである。粒径（Ｚ－ａｖｅ）は、特に指定のない限り、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。

ナノ粒子：製造
本開示の洗浄剤コアナノ粒子及びＨａＳＭａＮは、天然には存在しない生成物であり、その成分は自然には一緒に発生しない。一般的に、本明細書に開示された方法は、第１の洗浄剤を使用してタンパク質を単離し、次いで第１の洗浄剤を第２の洗浄剤と交換してナノ粒子を形成する洗浄剤交換アプローチを使用する。

ナノ粒子中の糖タンパク質抗原、典型的にはＨＡは、典型的には宿主細胞における組換え発現により産生される。典型的には、糖タンパク質は、バキュロウイルス系を使用して昆虫宿主細胞で発現される。好ましい実施形態では、バキュロウイルスは、カテプシン－Ｌノックアウトバキュロウイルスである。他の好ましい実施形態では、バキュロウイルスは、キチナーゼノックアウトバキュロウイルスである。さらに他の好ましい実施形態では、バキュロウイルスは、カテプシン－Ｌ及びキチナーゼの両方に対する二重ノックアウトである。昆虫細胞発現系で高レベルの発現が得られる場合がある。昆虫細胞の非限定的な例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である。好ましくは、細胞は、Ｓｆ９細胞またはその誘導体である。

典型的なトランスフェクション及び細胞増殖法を使用して、細胞を培養することができる。ベクター、例えば融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当該技術分野において周知の方法にしたがって宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、真核細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びポリアミントランスフェクション試薬を使用したトランスフェクションによって実現することができる。

宿主細胞を増殖させる方法としては、バッチ、バッチフェッド（ｂａｔｃｈ－ｆｅｄ）、連続及び灌流細胞培養技術が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養とは、細胞が、精製及び単離のためタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を増殖及び発現する、バイオリアクター（発酵チャンバー）での細胞の成長及び増殖を意味する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクターにおいて無菌の制御された温度及び大気条件下で行われる。バイオリアクターは、温度、雰囲気、攪拌、及び／またはｐＨなどの環境条件をモニターすることができる、細胞を培養するために使用されるチャンバーである。一実施形態では、バイオリアクターは、ステンレス鋼チャンバーである。別の実施形態では、バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチックバッグ（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ（登録商標），Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．）である。他の実施形態では、予め滅菌されたプラスチックバッグは、約５０Ｌ～３５００Ｌのバッグである。

ナノ粒子の洗浄剤抽出及び精製
宿主細胞の増殖後、洗浄剤及び精製プロトコルを使用して、タンパク質を宿主細胞から収集することができる。宿主細胞を４８～９６時間増殖させると、細胞を培地から単離し、洗浄剤含有溶液を添加して細胞膜を可溶化し、洗浄剤抽出物にタンパク質を放出させる。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＮＰ－９としても知られているテルギトールは、それぞれ抽出に適した洗浄剤である。洗浄剤は、約０．１％～約１．０％の最終濃度まで添加され得る。例えば、濃度は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．５％、約０．７％、約０．８％、または約１．０％であり得る。ある特定の実施形態では、範囲は、約０．１％～約０．３％であり得る。好ましくは、濃度は約０．５％である。

他の態様では、宿主細胞からタンパク質を単離するために、異なる第１の洗浄剤が使用され得る。例えば、第１の洗浄剤は、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、ノノキシノール－９、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－デカノイル－Ｎ－メチルグルカミン、ｎ－デシルα－Ｄグルコピラノシド、デシルβ－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデカノイル－Ｎ－メチルグルカミド、ｎドデシルα－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ｎ－ヘキサデシルβ－Ｄ－マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、イゲパルＣＡ－６３０、イゲパルＣＡ－６３０、メチル－６－０－（Ｎ－ヘプチルカルバモイル）－α－Ｄ－グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチルグルカミン、Ｎ－ノナノイルＮ－メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル－β－Ｄグルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ－１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアレート、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシエチレン８ステアレート、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ポリオキシエチレン２５プロピレングリコールステアレート、Ｑｕｉｌｌａｊａ樹皮のサポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－１２型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－３０型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－５型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－７型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－９型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－１０型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－４型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－４０型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＮＰ－７型 ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－９型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮ－１０型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮ－６型、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはその組み合わせであり得る。

次に、ナノ粒子は、遠心分離を使用して細胞破片から単離することができる。いくつかの実施形態では、例えば、塩化セシウム、スクロース、及びイオジキサノールなどを使用する勾配遠心分離を使用してもよい。例えば、イオン交換、アフィニティー、及びゲルろ過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術など、他の技術を代替としてまたは追加で使用してもよい。

例えば、第１のカラムは、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、例えばＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、第２のカラムは、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチンアフィニティー樹脂、第３のカラムは、カチオン交換カラム、例えばＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＳＯ３（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）樹脂であり得る。他の態様では、カチオン交換カラムは、ＭＭＣカラムまたはＮｕｖｉａ Ｃ Ｐｒｉｍｅカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）であり得る。好ましくは、本明細書に開示された方法は、例えば、疎水性相互作用カラムなどの洗浄剤抽出カラムを使用しない。このようなカラムは、精製中に洗浄剤を除去するためによく使用されるが、本明細書に開示されている方法に悪影響を与える可能性がある。

洗浄剤交換
洗浄剤コアナノ粒子を形成するために、宿主細胞からタンパク質を抽出するために使用される第１の洗浄剤は、ナノ粒子構造に到達するために実質的に第２の洗浄剤に置き換えられる。ＮＰ－９は好ましい抽出洗浄剤である。典型的には、ＨＰＬＣによって測定した場合、ナノ粒子は検出可能なＮＰ－９を含まない。第２の洗浄剤は、典型的には、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５、及びＰＳ８０からなる群から選択される。好ましくは、第２の洗浄剤はＰＳ８０である。

特定の態様では、洗浄剤交換は、それらの炭水化物部分を介して糖タンパク質に結合するアフィニティークロマトグラフィーを使用して行われる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーはマメ科レクチンカラムを使用してもよい。マメ科レクチンは、元は植物で同定されたタンパク質であり、炭水化物残基と特異的かつ可逆的に相互作用することが判明している。例えば、Ｓｈａｒｏｎ ａｎｄ Ｌｉｓ，“Ｌｅｇｕｍｅ ｌｅｃｔｉｎｓ－－ａ ｌａｒｇｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９０ Ｎｏｖ；４（１４）：３１９８－２０８、Ｌｉｅｎｅｒ，“Ｔｈｅ Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１２を参照のこと。適切なレクチンには、コンカナバリンＡ（ｃｏｎ Ａ）、エンドウマメレクチン、イガマメレクチン、レンズマメレクチンが挙げられる。レンズマメレクチンは、その結合特性により、洗浄剤交換に適したカラムである。レクチンカラムは市販されており、例えば、Ｃａｐｔｏ Ｌｅｎｔｉｌ ＬｅｃｔｉｎはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。ある特定の態様では、レンズマメレクチンカラムは、組換えレクチンを使用し得る。分子レベルでは、炭水化物部分がレンズマメレクチンに結合し、タンパク質のアミノ酸が遊離して洗浄剤の周りで合体し、洗浄剤コアを形成して抗原の複数のコピーを有するナノ粒子、例えば、洗浄剤に固定された二量体、三量体、または四量体であり得る糖タンパク質オリゴマー、をもたらすと考えられる。

洗浄剤は、タンパク質とインキュベートして洗浄剤交換中にナノ粒子を形成する場合、初期の精製工程中に最大約０．１％（ｗ／ｖ）存在し得る。

典型的には、インフルエンザ洗浄剤コアナノ粒子は、一価の単一株生成物として個別に調製される。例えば、非イオン性洗浄剤（例えば、ＰＳ８０）は、約０．０３％～約０．５％であり得る。特定の態様では、一価の原薬は、Ａ２８０により測定した約１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質及び約０．１２％のＰＳ８０を含み得、モル比は約４０：１になる。特に四価の組成物では、タンパク質濃度は、一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）で測定すると約０．４８ｍｇ／ｍＬであり得、計算量のＰＳ８０は約０．０４％である。

洗浄剤交換は、上記のように精製されたタンパク質を用いて行われ得、精製され、保管のために凍結され、その後、洗浄剤交換のために解凍され得る。

ＨａＳＭａＮの形成
本明細書に開示されたＨａＳＭａＮは、洗浄剤コアナノ粒子を、サポニン画分、コレステロール、及びリン脂質を含むＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントとインキュベートすることによって生成される。

典型的には、４℃または２５℃で約２４～４８時間のインキュベーションが形成に必要である。ＨａＳＭａＮの形成は、高温によって促進される。図３３及び３５を参照のこと。したがって、特定の態様では、ＨａＳＭａＮの形成は、約２５℃で少なくとも２４時間のインキュベーションによって発生する。対象に投与する直前に（すなわち、ベッドサイドミックス）、洗浄剤コアナノ粒子をＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントと混合すると、ＨａＳＭａＮは生成されない。インキュベーション期間がより長くても、ＨａＳＭａＮの形成には悪影響を及ぼさない。

ナノ粒子インフルエンザＨＡタンパク質
インフルエンザ抗原として使用されるＨＡ糖タンパク質は、任意のインフルエンザウイルス株に由来し得る。ヒトインフルエンザＡ型及びＢ型ウイルスは、米国ではほぼ毎冬、病気の季節的流行を引き起こす。Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルスの表面にある２つのタンパク質（赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ））に基づいてサブタイプに分類される。

ＨＡタンパク質は、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８から選択することができる。系統発生的に、インフルエンザはグループに分けられる。ＨＡの場合、グループ１にはＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８が含まれ、グループ２にはＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５が含まれる。

ある特定の態様では、インフルエンザナノ粒子は、中性ｐＨ精製を使用して生成されたトリプシン耐性ナノ粒子である。トリプシン耐性は、ＨＡナノ粒子の精製及び製剤化中に、６．９～８．５超の中性ｐＨ範囲によって達成される。トリプシン耐性インフルエンザ糖タンパク質及びトリプシン耐性インフルエンザナノ粒子、ならびにそれらを作製する方法は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に参照として組み込まれる米国特許出願第１５／８１９，９６２号に詳細に記述される。

改変抗原
典型的には、抗原は完全長の野生型配列であるが、抗原は野生型抗原の変種または変異体であり得る。ある特定の態様では、抗原は、開示された抗原と共通の同一性を有する場合があり、例えば、同一性パーセントは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％であり得る。同一性パーセントは、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／で入手可能なアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用して計算することができる。次のデフォルトパラメータは、ペアワイズアライメントのために使用してもよい：タンパク質重量マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ、ギャップ開始＝１０、ギャップ伸長＝０．１。

他のバリアントを使用してもよい。ＨＡはホモ三量体であり、各単量体は、約５５０アミノ酸残基からなる。ＨＡの各単量体は概念的には３つのドメインに分割される：約５１５残基の外部ドメインは分子のウイルス外部分を構成し、２７残基の単一ストレッチは膜貫通（ＴＭ）ドメインを定義し、約１０残基は細胞質尾部（ＣＴ）を構成する。いくつかの変更を抗原に行うことができるが、洗浄剤コアナノ粒子及びＨａＳＭａＮの両方の形成は、インタクトな膜貫通ドメイン（ＴＭ）を必要とする。したがって、特定の例では、改変ＨＡタンパク質配列は、ＴＭ及びＣＴドメイン全体で１００％の同一性（すなわち、野生型）を含み、残りの外部ドメイン部分はある程度の柔軟性を有し、その同一性は少なくとも９０％または少なくとも９５％であり得る。ドメインは、Ｍｅｌｉｋｙａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．１９９９ Ｊｕｎ；１０（６）：１８２１－１８３６）の図１に示されているＪａｐａｎ／３０５／５７ＨＡのＴＭドメイン及びＣＴのアミノ酸配列に対する相同性によって同定され得るが、エクトドメイン、ＴＭ、及びＣＴドメイン間の境界は、ＨＡタンパク質毎に最大３アミノ酸異なる場合があると言う点に留意すべきである。

ワクチンの安定性
有利には、開示されたナノ粒子インフルエンザワクチン製剤は安定であり、長期保管に適している。本明細書で提供される製剤は、共製剤戦略（すなわち、抗原及びマトリックスアジュバントが投与前にあらかじめ十分に組み合わされる場合、例えば、プレフィルドシリンジにおいて）に特に適している可能性がある。本明細書中に開示するように、共製剤インフルエンザワクチン戦略は、臨床診療に利点をもたらす可能性があり、現在使用されているベッドサイドミックス製剤に対して費用対効果の高い代替法となり得る。

いくつかの実施形態では、共製剤化されたワクチン組成物中のインフルエンザ抗原は、組成物が最大１２ヶ月間保管された場合に安定している。ワクチン組成物は、２～８℃で保管することができるが、それらは２５℃で優れた安定性を示す。

プレミックス（共製剤）製剤の安定性は、当技術分野で知られている方法及びプロトコルによって評価することができる。安定性は、ワクチン抗原の分解レベル及びワクチンの免疫原性によって測定可能である。安定性は、ワクチン中のウイルス抗原の熱安定性を評価することによって調べることができる。

室温（２５℃）での長期にわたるワクチン製剤の安定性は、特にコールドチェーンの流通及び保管が制限される可能性がある地域では、費用対効果の高いワクチン戦略に有利である。ワクチンの安定性を評価するためのＷＨＯのガイドラインで述べられているように、製造、流通、及び保管中の温度管理網は、ワクチンの有効性を保証するために重要である（“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ａ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｈａｉｎ、ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ／ＷＨＯ＿ＣＴＣ＿ｆｉｒｓｔ＿ｄｒａｆｔ＿２２＿Ｄｅｃ＿２０１４＿ａｍｅｎｄｅｄ．ｐｄｆにて入手可能）。

理論に束縛されるものではないが、ＨａＳＭａＮ構造は、共製剤化されたワクチン製剤の安定性に寄与し得ると考えられている。（マトリックスアジュバントの存在下での熱安定性が高いことを示す図３６を参照のこと、すなわちＨａＳＭａＮ粒子が洗浄剤コアのみの製剤よりも安定性が高いことを示す）。洗浄剤コアナノ粒子をマトリックスＭと混合してＨａＳＭａＮを提供すると、洗浄剤コアナノ粒子のみを含むワクチン組成物と比較して、約０．５℃～約１．０℃（示差走査熱量測定により測定）増加したワクチン組成物が得られる。

この改善された熱安定性は、ワクチンの保存期間に貢献する。特定の態様では、ワクチン製剤は、最大６ヶ月間、または最大１２ヶ月間安定であり得る。２～８℃で１２ヶ月保管した後の試験試料に対するＨＡＩ力価が新たに調製した試料と統計的に異ならない場合、及び２～８℃で１２ヶ月保管した後、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイにより少なくとも約７０％の値が得られる場合、試験試料は本開示の文脈において「安定」であると見なされる。ＨＡＩ力価測定の統計的有意性の分析は、以下の方法で行った。幾何平均力価（ＧＭＴ）及び関連する９５％信頼区間（ＣＩ）を、群毎に計算した。ＨＡＩによるｌｏｇ１０変換力価測定値の平均を、ＪＭＰ１３ソフトウェアでＴｕｋｅｙ ＨＳＤ分析を使用して群間で比較した。ｐ値＜０．０５は、２つの比較群間の統計的に有意な差を示す。

ワクチン組成物
本明細書に開示された組成物は、予防的または治療的に使用され得る。本開示は、インフルエンザウイルスの感染を防止するための方法を含む。本方法は、本開示の免疫原性組成物の治療量または予防量を対象に投与することを含む。好ましくは、医薬組成物は、保護効果を提供するワクチン組成物である。態様では、保護効果は、曝露された集団の割合における感染に関連する症状の改善を含み得る。例えば、組成物は、治療されていない対象と比較して、発熱疲労、筋肉痛、頭痛、及び喉の痛みから選択される１つまたは複数のインフルエンザ症状を予防または軽減することができる。

ワクチン組成物は、様々な賦形剤、薬学的に許容される緩衝剤などを含み得る。例えば、ワクチン組成物中の薬学的に許容される緩衝剤は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ヒスチジン、アルギニン塩酸塩、及びトレハロースの１つまたは複数を含み得る。リン酸ナトリウムは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭで存在し得る。特定の場合では、約２５ｍＭのリン酸ナトリウムが存在する。ヒスチジンは、約０．１％（ｗ／ｖ）～約２．５％（ｗ／ｖ）の範囲で存在し得る、例えば、ヒスチジンは、約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．７％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、または約２．５％（ｗ／ｖ）で存在し得る。

塩化ナトリウムは、約５０ｍＭ～約３００ｍＭの範囲であり得る。典型的には、塩化ナトリウムは、組成物中に存在する場合、約１５０ｍＭである。

アルギニン塩酸塩は、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭ、または約１００ｍＭ～約１８０ｍＭで存在し得る。特定の場合では、約１００ｍＭのアルギニン塩酸塩が存在する。

トレハロースは約１％～約１０％の範囲、例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％で存在し得る。

インフルエンザワクチン組成物のｐＨ範囲は、典型的には中性に近く、精製中及び組成物中でｐＨ ６．９超に維持される。例えば、緩衝剤及び組成物のｐＨは、約ｐＨ７．２～約ｐＨ７．８、より好ましくは約７．２～約７．５であり得る。特定の態様では、ｐＨは約ｐＨ７．５である。ＨＡ構造の安定性に悪影響を与えるため、６．９未満のｐＨレベルは選択しない。

アジュバント
ある特定の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、免疫応答を増強するために１つまたは複数のアジュバントと組み合わせることができる。他の実施形態では、組成物は、アジュバントなしで調製され、したがって、アジュバントを含まない組成物として投与するために利用可能である。

特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られている免疫応答の非特異的刺激物質の使用によって強化することができる。有効量のアジュバントは、抗原に対する免疫の一般的な増加を促進するために長い間使用されてきた（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。免疫化プロトコルは、長年にわたって応答を刺激するためにアジュバントを使用しており、そのため、アジュバントは当業者によく知られている。いくつかのアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を与える。例えば、ミョウバンによってタンパク質抗原が沈殿すると、免疫応答が増加する。抗原の乳化は、抗原提示の期間も延長する。本明細書において、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）”に記載の任意のアジュバントを含めることは、本開示の範囲内であると想定される。

様々なアジュバントが含まれ得るが、ＨａＳＭａＮはＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントを使用して生成され、これは対象への投与後、そのアジュバント有効活性を保持する。したがって、いくつかの態様では、追加のアジュバントは製剤に添加されない可能性がある。上記のように、この製剤化アプローチは、抗原とアジュバントとのベッドサイドでの混合を必要とせずに、ワクチンを含むプレフィルドシリンジの調製を可能にする。

マトリックス用のサポニンアジュバント
ＩＳＣＯＭマトリックスは、サポニン画分を使用して調製される。サポニンは、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮に由来するグリコシドである。典型的には、サポニンは、複数の画分をもたらす多段階精製プロセスを使用して調製される。本明細書において使用される場合、「Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ由来のサポニン画分」は、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの半精製もしくは定められたサポニン画分またはその実質的に純粋な画分について説明するために一般的に使用される。

サポニン画分
サポニン画分を生成するためのいくつかのアプローチが、好適である。画分Ａ、Ｂ、及びＣが、米国特許第６，３５２，６９７号に記載され、以下のように調製され得る。Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの粗水抽出液であるＱｕｉｌ Ａ由来の親油性画分をクロマトグラフィーにより分離し、７０％のアセトニトリル水溶液で溶出して親油性画分を回収する。次に、この親油性画分を、酸性水に溶解した２５％～６０％のアセトニトリルの勾配を使用して溶出する、セミ分取ＨＰＬＣにより分離する。本明細書において「画分Ａ」または「ＱＨ－Ａ」と呼ばれる画分は、約３９％のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはそれに相当する。本明細書において「画分Ｂ」または「ＱＨ－Ｂ」と呼ばれる画分は、約４７％のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはそれに相当する。本明細書において「画分Ｃ」または「ＱＨ－Ｃ」と呼ばれる画分は、約４９％のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはそれに相当する。画分の精製に関する追加の情報は、米国特許第５，０５７，５４０号に見出される。本明細書に記載されるように調製される場合、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ａ、Ｂ、及びＣはそれぞれ、定義可能な特性を有する化学的に密接に関連する分子のグループまたはファミリーを表す。それらが得られるクロマトグラフィー条件は、溶出プロファイル及び生物学的活性の観点からバッチ間再現性が非常に一貫しているものであった。

他のサポニン画分について記載されている。画分Ｂ３、Ｂ４及びＢ４ｂはＥＰ０４３６６２０に記載されている。画分ＱＡ１～ＱＡ２２は、ＥＰ０３６３２２７９ Ｂ２に記載されている、Ｑ－ＶＡＣ（Ｎｏｒ－Ｆｅｅｄ，ＡＳ Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ Ｓｐｉｋｏｓｉｄｅ（ｌｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ，Ｕｌｔｕｎａａｌｌｅｎ ２Ｂ，７５６ ５１ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。ＥＰ０３６３２２７９ Ｂ２の画分ＱＡ－１、ＱＡ－２、ＱＡ－３、ＱＡ－４、ＱＡ－５、ＱＡ－６、ＱＡ－７、ＱＡ－８、ＱＡ－９、ＱＡ－１０、ＱＡ－１１、ＱＡ－１２、ＱＡ－１３、ＱＡ－１４、ＱＡ－１５、ＱＡ－１６、ＱＡ－１７、ＱＡ－１８、ＱＡ－１９、ＱＡ－２０、ＱＡ－２１、及びＱＡ－２２、特にＱＡ－７、ＱＡ－１７、ＱＡ－１８、及びＱＡ－２１が使用され得る。それらは、ＥＰ０３６３２２７９ Ｂ２、特に６ページ、ならびに８及び９ページの実施例１に記載されているように得られる。

本明細書に記載された、アジュバントを形成するために使用されるサポニン画分は、実質的に純粋な画分であることが多く、すなわち、画分は他の物質からの汚染を実質的に含まない。特定の態様では、実質的に純粋なサポニン画分は、他の化合物、例えば他のサポニンまたは他のアジュバント物質などの最大４０重量％、最大３０重量％、最大２５重量％、最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０重量％、最大７重量％、最大５重量％、最大２重量％、最大１重量％、最大０．５重量％、または最大０．１重量％を含み得る。

他のサポニン画分、例えばＱＳ－７及びＱＳ－２１画分は、それらの製造及びそれらの使用が、米国特許第５，０５７，５４０号、同第６，２３１，８５９号、同第６，３５２，６９７号、同第６，５２４，５８４号、同第６，８４６，４８９号、同第７，７７６，３４３号、及び同第８，１７３，１４１号に記載されている。これらの画分は、本明細書に開示された方法及び組成物において使用され得る。

マトリックス粒子
本明細書に開示されたマトリックス粒子アジュバントは、ＨａＳＭａＮを生成するために使用され得るか、またはそれらのアジュバント特性のための個別の粒子として使用され得る。ＩＳＣＯＭマトリックスは、少なくとも１つのサポニン画分及び脂質を含む。脂質は少なくともコレステロールなどのステロールである。特定の態様では、脂質はリン脂質である。ＩＳＣＯＭマトリックス複合体はまた、１つまたは複数の他の免疫調節（アジュバント活性）物質を含み得、必ずしもグリコシドである必要はなく、ＥＰ０４３６６２０Ｂ１に記載されるように生成され得る。

サポニン画分は、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの画分Ａ、画分Ｂ、または画分Ｃ、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの半精製調製物、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの精製調製物、または任意の精製副画分、例えばＱＡ １－２１であり得る。

マトリックス粒子はサポニン画分の混合物を含んでもよく、または粒子は１つのサポニン画分のみを使用して形成されてもよい。本明細書に開示された組成物は、各粒子が１つのみのサポニン画分を含む複数の粒子を含み得る。すなわち、特定の組成物には、１つ以上の異なる種類のＩＳＣＯＭマトリックスが含まれ得、各個別の粒子にはＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ由来の１つのサポニン画分が含まれ、１つの粒子のサポニン画分は、他の複合粒子のサポニン画分とは異なる。

特定の態様では、１つの種類のサポニン画分または粗サポニン画分を１つのＩＳＣＯＭマトリックス粒子に統合し得、別の種類の実質的に純粋なサポニン画分または粗サポニン画分を別のＩＳＣＯＭマトリックス粒子に統合することができる。組成物またはワクチンは、物理的に異なる粒子に組み込まれた１つの種類のサポニンをそれぞれが有する少なくとも２つの種類の複合体または粒子を含み得る。

組成物では、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子の混合物を使用することができ、１つのサポニン画分Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ及び別のサポニン画分Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａは、異なるＩＳＣＯＭマトリックス複合粒子及び／またはＩＳＣＯＭ複合粒子に別々に組み込まれている。

それぞれが１つのサポニン画分を有するＩＳＣＯＭマトリックスは、任意の組み合わせの重量％で組成物に存在し得る。特定の態様では、組成物は、第１のサポニン画分を含むＩＳＣＯＭマトリックスの０．１重量％～９９．９重量％、５重量％～９５重量％、１０重量％～９０重量％、１５重量％～８５重量％、２０重量％～８０重量％、２５重量％～７５重量％、３０重量％～７０重量％、３５重量％～６５重量％、４０重量％～６０重量％、４５重量％～５５重量％、４０～６０重量％、または５０重量％と、異なるサポニン画分を含むＩＳＣＯＭマトリックスによって構成される残りの部分を含み得る。いくつかの態様では、残りの部分は、１つのみのサポニン画分を含む１つまたは複数のＩＳＣＯＭマトリックス粒子である。他の態様では、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子は、２つ以上のサポニン画分を含み得る。

好ましい組成物では、第１のＩＳＣＯＭマトリックス中のサポニン画分は画分Ａ（「画分Ａマトリックス」）であり、第２のＩＳＣＯＭマトリックスまたはＩＳＣＯＭ複合粒子中のサポニン画分は画分Ｃ（「画分Ｃマトリックス」）である。したがって、好ましい組成物は、アジュバントとして、画分Ａマトリックスアジュバント及び画分Ｃマトリックスアジュバントを含む。組成物中の各マトリックスの量は変化し得る。例えば、画分Ａマトリックスの量は、約８０％（ｗ／ｗ）、約８５％（ｗ／ｗ）、約９０％（ｗ／ｗ）、約９２％（ｗ／ｗ）、または約９５％（ｗ／ｗ）と残りの画分Ｃマトリックスであり得る。適切な８５：１５画分Ａマトリックスと画分Ｃマトリックスの組み合わせ（本明細書ではマトリックスＭまたはマトリックスＭ１と呼ばれる）の例は、マトリックス－Ｍ（商標）としてＮｏｖａｖａｘ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手することができる。

いくつかの態様では、マトリックス－Ｍは、本明細書に提供される組成物におけるアジュバントとして使用され得る。いくつかの態様では、本明細書で提供されるナノ粒子インフルエンザワクチン組成物における唯一のアジュバントとしてマトリックス－Ｍが使用され得る。

いくつかの実施形態では、投与される用量あたりのマトリックス－Ｍの量は、約２０μｇ～約１４０μｇ、例えば約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１１０μｇ、約１２０μｇ、約１３０μｇ、または約１４０μｇの範囲であり得る。特定の態様では、アジュバントは約５０μｇ～約７５μｇで存在し得る。

その他のアジュバント
例示的なアジュバントには、完全フロイントアジュバント（殺されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバント、及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントは、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ＭＤＰ化合物、例えばｔｈｕｒ－ＭＤＰ及びｎｏｒ－ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ－ＰＥ）、脂質Ａ、及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＭＦ－５９、ＲＩＢＩ（細菌から抽出された３つの成分、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルション中のＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）が含まれる）を含む。他の好ましい態様では、ミョウバン、例えば２％のアルヒドロゲル（Ａｌ（ＯＨ）_３）を使用する。いくつかの態様では、アジュバントは、少ラメラ（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）脂質小胞、例えば、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）であり得る。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、約１００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲にある少ラメラ非リン脂質小胞である。それらは、Ｂｒｉｊ ７２、コレステロール、オレイン酸、及びスクアレンを含む。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓは、有効なアジュバントであることが示されている（米国特許第５，６２９，０２１号、第６，３８７，３７３号、及び第４，９１１，９２８号を参照のこと）。

ナノ粒子ワクチン組成物の投与及び用量
本明細書に開示された組成物は、全身経路もしくは粘膜経路もしくは経皮経路を介して、または特定の組織に直接投与され得る。本明細書において使用される場合、「全身投与」という用語は、非経口経路による投与が含まれる。具体的には、非経口投与には、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または胸骨内注射が含まれる。典型的には、組成物は筋肉内注射により投与される。特定の態様では、組成物は粘膜投与され得る。本明細書において使用される場合、「粘膜投与」という用語は、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、及び気管内を含む。

組成物は、それを必要とする対象、典型的にはヒトに投与され得る。

組成物は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールで投与され得る。複数回投与は、一次免疫スケジュールまたは追加免疫スケジュールで使用してもよい。複数回投与スケジュールでは、様々な用量が、同じまたは異なる経路、例えば、非経口プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブーストなどによって与えられ得る。いくつかの態様では、追加のブースト投与は、前の投与の約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、または約６週間後に投与される。

いくつかの実施形態では、四価インフルエンザワクチン組成物中の４つの株のうちの少なくとも１つの株はＡ型株である。例えば、四価インフルエンザワクチンは、３つのＡ型株と１つのＢ型株を含むことができる。

ワクチン組成物中のインフルエンザＨＡの総量は、約２５μｇ～約２００μｇ、約３０μｇ～約１５０μｇ、約５０μｇ～約１００μｇ、約４５μｇ～約１８０μｇ、約６０μｇ～約１９０μｇ、または約１００μｇ～約２００μｇの範囲であり得る。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物中のインフルエンザＨＡタンパク質の量は、株あたり約５μｇ～株あたり約８０μｇ、株あたり約１０μｇ～株あたり約７５μｇ、株あたり約１５μｇ～株あたり約７０μｇ、株あたり約２０μｇ～株あたり約６５μｇ、株あたり約２５μｇ～株あたり約６０μｇ、株あたり約３０μｇ～株あたり約５５μｇ、株あたり約３５μｇ～株あたり５０μｇ、株あたり約１５μｇ～株あたり約６０μｇの範囲であり得る。有利には、組成物は最大９～１２ヶ月の安定性を示しており、ＳＲＩＤで測定した場合、残存量が初期量のかなりの割合、例えば、初期量の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％である。

いくつかの実施形態では、本開示は、ナノ粒子インフルエンザワクチン組成物のための共製剤（すなわち、プレフィルドシリンジまたはプレミックス）戦略を提供する。現在利用されている典型的なインフルエンザワクチンの投与戦略は、ベッドサイドミックス製剤である。すなわち、ワクチン組成物及びアジュバントは別々に保管され、投与前に混合される。インフルエンザワクチンのプレミックス、共製剤、またはプレフィルドシリンジ戦略は、インフルエンザ抗原の安定性及びその後の免疫原性能力が懸念されるため、あまり一般的ではない。本開示は、プレミックスし、事前に保管することができるナノ粒子インフルエンザワクチン組成物を提供する。開示されたワクチン接種戦略及び製剤は、全体的な安全性及び免疫原性を維持しながら、ワクチン接種の効率を改善し、ベッドサイドでの混合エラーのリスクを軽減する可能性がある。

ナノ粒子インフルエンザワクチンの免疫原性
本開示は、インフルエンザ感染を予防する方法を提供する。本明細書に開示されたナノ粒子インフルエンザワクチンの免疫原性は、ＨＡＩアッセイの実施を含む適切なアプローチを使用して、または中和抗体を測定することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子インフルエンザワクチンの免疫原性は、市販のインフルエンザワクチン組成物と比較され得る。本明細書において使用される場合、「市販のインフルエンザワクチン組成物」は、医学的使用に利用可能な任意のインフルエンザワクチン組成物であり得る。例えば、市販のインフルエンザワクチン組成物は、三価または四価の注射のために製剤化され得る。いくつかの態様では、注射用の製剤は、ウイルスの不活化形態を含むことができる。別の例では、市販のインフルエンザワクチン組成物は、鼻スプレー用に製剤化され得る。いくつかの態様では、鼻スプレー用の製剤は、弱毒化または弱めた形態のウイルスを含むことができる。

本明細書に開示された組成物は、他のワクチン、特にＡｆｌｕｒｉａ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕａｒｉｘ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、ＦｌｕＬａｖａｌ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｃｅｌｖａｘ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ａｆｌｕｒｉａ、Ｆｌｕｖｉｒｉｎ、Ｆｌｕａｄ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ、Ｆｌｕｂｌｏｋ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｂｌｏｋ、及びＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔを含む市販されているワクチンと比較して、非劣性免疫応答を提供する。

有利には、本明細書に開示された組成物は、同じインフルエンザのサブタイプ内のウイルスにおいて使用される配列と比較してドリフトした（すなわち、わずかな変異を受けた）株に結合する中和抗体を誘導する。特定の態様では、組成物において使用される株の１つ、２つ、３つ、４つ、または全てが、１つのドリフト株、２つのドリフト株、３つのドリフト株、４つのドリフト株、または５つのドリフト株に対する中和抗体を誘導する。理論に束縛されるものではないが、組成物中のマトリックスアジュバントの存在により、追加の抗原の曝露が促進され、ドリフトした株に対する幅広い保護がもたらされると考えられている。同様に、マトリックスアジュバントとサブタイプＡ ＨＡタンパク質とのインキュベーション後のＨａＳＭａＮの形成は、このプロセスに寄与すると考えられている。

重要なことに、ＨａＳＭａＮは、少なくとも洗浄剤コアナノ粒子と同じくらい免疫原性がある。例えば、下の表６に示すように、１．５μｇプレミックス製剤の３５日目におけるＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎに対するＨＡＩ力価は、２５℃で約５３８であったが、１．５μｇベッドサイドミックス製剤のＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎに対するＨＡＩ力価は、２５℃で約４５３であった。表８に示す別の例では、１．５μｇプレミックス製剤の３５日目におけるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇに対するＨＡＩ力価は、２５℃で約５３８であったが、１．５μｇベッドサイドミックス製剤のＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎに対するＨＡＩ力価は、－６０℃で約４９４であった。プレミックス製剤及びベッドサイドミックス製剤中の同様の免疫原性は、プレミックス製剤が室温で安定であることをさらに示唆している。加えて、室温で保管した本プレミックス製剤は、驚くべきことに、－６０℃でインキュベートしたベッドサイドミックス製剤と比較して同様の免疫原性を有することができる。

容器
単回投与用のシリンジ及びプラスチック製アンプルを含む、様々な容器を使用してプレミックス製剤を保管及び輸送することができる。場合によっては、プラスチック製アンプルは、ブローフィルシール製造技術または方法を使用して製造することができる。一般に、ブローフィルシール（ＢＦＳ）製造方法は、プラスチック材料（例えば、樹脂）を押し出してパリソンを形成し、次にそれを型に入れて所定のサイズに切断することを含む。次に、充填針またはマンドレルを使用してプラスチックを膨張させ、これにより金型の形状に実質的に適合する中空アンプルが得られる。膨張したら、所望の量の液体をアンプルに注入し、充填針またはマンドレルを取り外し、アンプルを密封することができる。したがって、ＢＦＳは、人が直接介入することなく、無菌環境で実施することができる自動化されたプロセスであり得る。

場合によっては、所望の液体を含む無菌アンプルを無菌で製造する能力により、ＢＦＳで製造されたアンプルが製薬産業に特に最適なものとなる。しかしながら、ＢＦＳ技術は、全ての薬液、薬物などに適合するわけではない。例えば、いくつかの既知のＢＦＳ製造方法は、プラスチックがまだ比較的熱い間にアンプルに液体または製品を供給することを含み、これは温度に敏感な液体及び／または製品、例えばワクチン、生物学的製剤に悪影響が生じる可能性がある。しかしながら、冷却ＢＦＳ技術の進歩によって、適切な製品、液体などの種類が増え、一部のワクチン、生物学的製剤、及び／またはその他の温度に敏感な医薬品をＢＦＳアンプルに収容することが可能となった。

場合によっては、ＢＦＳアンプルは、アンプルが含有するように構成された、所望の使用及び／または所望の薬液もしくは用量に少なくとも部分的に基づいたサイズ、形状、及び／または構造を有することができる。例えば、いくつかの既知のＢＦＳアンプルは、ピアススルートップ、ツイストオフトップ、オスもしくはメスのルアーを含むトップ、及び／またはその他を含むことができる。いくつかの既知のＢＦＳアンプルは、その中に配置されるように構成された液体の体積または用量に基づいたサイズ及び／または形状を有することができる。加えて、いくつかの既知のＢＦＳアンプルは、一時的に接続された複数のアンプルのストリップで製造でき、これは製造、パッケージング、及び／または保管効率、及び／またはその他を向上させることができる。

本開示に引用される全ての特許、特許出願、参考文献、及びジャーナル論文は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に明示的に援用される。

実施例１：ＨＡナノ粒子の精製
単一株由来のＨＡタンパク質は、バキュロウイルス感染を介してＳｆ９細胞で発現され、回収前に４８～９６時間増殖させた。次に、ＨＡタンパク質を洗浄剤抽出により回収し、精製中に洗浄剤コアナノ粒子に変えた。簡潔に述べると、ＴＭＡＥカラムは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ ＮＰ９で構成される緩衝剤で事前に平衡化した。試料を９０ｃｍ／時以下で添加し（２４分の滞留時間）、次いでＥＱ緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ塩化ナトリウムまたは８１ｍＭ塩化ナトリウム（それぞれＡ、Ｂ株に）、０．０２％ＮＰ－９）で洗浄した。精製した試料は、次いで１．５ＣＶ ＥＱ緩衝剤を使用して溶出した。

Ａ株の場合、ＴＭＡＥカラムから、生成物にナノろ過を行った後、３ＣＶのために２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ及び１０７ｍＭ塩化ナトリウム（それぞれＡ及びＢ株に）、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮＰ－９、ｐＨ８．０で構成される緩衝剤で事前に平衡化したレンズマメレクチンアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用した（流速：１５０ｃｍ／時）。試料は４分の滞留時間に添加した。添加後、３ＣＶのレンズマメレクチン平衡化緩衝剤で洗浄を行った。生成物は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、２００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭメチル－α－Ｄ－マンノピラノシド、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０、ｐＨ７．５によって、７５ｃｍ／時及び８分の滞留時間で２ＣＶ分を収集することにより、溶出した。

Ｂ株の場合、ＴＭＡＥカラム生成物をＣａｐｔｏ Ｂｌｕｅカラムを使用してさらに精製した。カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０７ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮＰ－９で平衡化した後、ＴＭＡＥ生成物を２２５ｃｍ／時の流速で４分の滞留時間で添加し、２ＣＶの平衡化緩衝剤で収集した。Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅカラムから、生成物にナノろ過を行った後、３ＣＶのために２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ及び１０７ｍＭ塩化ナトリウム（それぞれＡ及びＢ株に）、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮＰ－９、ｐＨ８．０で構成される緩衝剤で事前に平衡化したレンズマメレクチンアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用した（流速：１５０ｃｍ／時）。試料は４分の滞留時間に添加した。添加後、３ＣＶのレンズマメレクチン平衡化緩衝剤で洗浄を行った。生成物は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、２００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭメチル－α－Ｄ－マンノピラノシド、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０、ｐＨ７．５によって、７５ｃｍ／時及び８分の滞留時間で２ＣＶ分を収集することにより、溶出した。

Ａ株及びＢ株の両方のレンズマメレクチン生成物は、標的ＨＡ濃度になるように濃縮され、その後、緩衝剤を最終的な原薬の製剤緩衝剤に交換した。濃縮及び緩衝剤交換は、限外ろ過及び透析ろ過によって行った。

実施例２：ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
プレフィルドシリンジにおいてＱｕａｄ－ＮＩＶ及びＩＳＣＯＭマトリックスアジュバント（マトリックスＭ）を共製剤化する安定性を評価するため、及びそのようなワクチンの物理的、化学的、及び生物学的特性を理解するために、以下の表１に示すように製剤を調製した。試験したワクチン組成物を３つの群：（１）ＨＡ抗原のみを含むガラス製ベッドサイドバイアル、（２）マトリックスＭ１と共製剤化したＨＡワクチン抗原を含むプレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）、及び（３）ＨＡワクチン抗原を含有するＰＦＳ、に割り当てた。ベッドサイドミックス及びＰＦＳ用のガラス製バイアルは市販のもの（Ｓｃｈｏｔｔ）を購入した。

図２は、４℃で保管されたベッドサイドバイアル、または４℃で保管されたマトリックスＭ１を含有もしくは非含有のプレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）、のタンパク質のバンドを示す還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像を示す。試験した全ての時点において、ＰＦＳのタンパク質のバンドパターンは、ベッドサイドバイアルのタンパク質のバンドパターンと類似しており、ＰＦＳのタンパク質がベッドサイドバイアルのタンパク質と少なくとも同じくらい安定していたことを示す。マトリックスＭの有無は、ＰＦＳ群間のバンドパターンを変化させず、６ヶ月間または１２ヶ月間の保管も変化させなかった。ＬＤベッドサイドバイアル群及びＬＤ ＰＦＳ群も４℃で一貫して類似のバンドパターンを示したが、ＬＤ群は同じ時点でＨＤコホートと比較してバンドパターンが弱かった。

図３は、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで調べた、４℃で保管されたＰＦＳまたはベッドサイドバイアルのタンパク質のバンドパターンを示す。結果は、非還元ゲル上でもタンパク質のバンドパターンが全ての群で類似していたことを示し、さらにＰＦＳのタンパク質はゼロ時点でのベッドサイドバイアルのタンパク質と類似していたことを示す。

加えて、４℃または２５℃で３ヶ月保管された、ベッドサイドバイアル群及びマトリックスＭを含有または非含有のＰＦＳ群のタンパク質安定性を、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥアッセイを使用して調査した（図４）。より高い分子量のバンドは、より低い温度（例えば、４℃）で保管された群と比較して、より高い温度（２５℃）で保管された群の一部に現れる傾向があった。タンパク質のより強い発現は、より低温で保管された群でも観察された。結果は、ＰＦＳのタンパク質が、長期保管（例えば３ヶ月間の保管）の後でも、ベッドサイドバイアルのタンパク質と少なくとも同じくらい安定していたことを示す。

これらのデータは、ＰＦＳ共製剤ワクチン戦略が安定性に関して実現可能であることを示している。４℃及び２５℃の両方でのＰＦＳ共製剤ワクチンの保管が実現可能である。マトリックスＭ１の存在及び保管期間（例えば３ヶ月間）はワクチン製剤の安定性に悪影響を及ぼさず、ＨａＳＭａＮの形成が長期間にわたるタンパク質の安定性を妨げないことが確認された。

実施例３：ＳＲＩＤ分析
タンパク質の安定性は、ＰＦＳ群において製剤化された様々なインフルエンザＡ株及びＢ株に対してＳＲＩＤアッセイを実施することによって試験した。ＳＲＩＤアッセイは、２～８℃（例えば、４℃）で、Ｔ＝０、２週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２５℃でＴ＝０、２週間、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月間実施した。図５及び６は、２～８℃（図５）及び２５℃（図６）での、１００μｇ／ｍＬのマトリックスＭを含有または非含有の、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ、またはＢ／Ｐｈｕｋｅｔを含む１２０μｇ／ｍＬのＰＦＳ製剤のＳＲＩＤデータを示す。

マトリックスＭ含有ＰＦＳのＳＲＩＤ免疫応答性の結果は、マトリックスＭ非含有ＰＦＳのＳＲＩＤ免疫応答性の結果と同様か、またはそれより優れていた。データは、２５℃での保管時の経時的な免疫応答性の一般的な傾向が、４℃で観察された結果と著しく異ならないことを示す。ワクチンの免疫応答性に顕著な変化がないことは、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ ＰＦＳ製剤が少なくとも最大６ヶ月間、様々な温度で安定していることを示す。室温（２５℃）でのＱｕａｄ－ＮＩＶ ＰＦＳ製剤の安定性は、ＰＦＳ製剤が長期の冷蔵を必要としない、または低温での取り扱いに限定されるため、費用効果の高いワクチン戦略を有利に提供する。これらのデータはさらに、診療所でのワクチン接種のかなり前に、安定したプレミックスワクチン（インフルエンザ抗原及びマトリックスＭを含む）の大量生産が実現可能なアプローチであることを示す。

実施例４：フェレットにおけるＱｕａｄ－ＮＩＶ及び市販インフルエンザワクチンの比較免疫原性試験
フェレット研究は、市販のインフルエンザワクチンと様々な試験ワクチン戦略（ベッドサイド及び共製剤）の免疫原性を比較するために実施した。

＊－各Ｂ株の用量は９０μｇで、各Ａ株の用量は６０μｇであった。
＃－図７～１０に示される結果は、４２日目に対応する。

Ｑｕａｄ－ＮＩＶ製剤の場合、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５－Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４－Ｈ３Ｎ２株、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８株、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株を使用した。Ｆｌｕｚｏｎｅ ＨＤ（ＴＩＶ；Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）の場合、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５－Ｈ１Ｎ１、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４－Ｈ３Ｎ２、及びＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８を使用した。Ｆｌｕｚｏｎｅ ＨＤ（ＱＩＶ；Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）の場合、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５－Ｈ１Ｎ１、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４－Ｈ３Ｎ２、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３を使用した。Ｆｌｕａｄ（ＴＩＶ；Ｓｅｑｉｒｕｓ）の場合、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５－Ｈ１Ｎ１様）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４－Ｈ３Ｎ２、及びＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８を使用した。Ｆｌｕｂｌｏｋ（ＱＩＶ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の場合、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５－Ｈ１Ｎ１、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／２０１４－Ｈ３Ｎ２、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３を使用した。Ｆｌｕｃｅｌｖａｘ（ＱＩＶ；Ｓｅｑｉｒｕｓ）の場合、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５－Ｈ１Ｎ１様）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ２０５０／２０１５（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４－Ｈ３Ｎ２様）、Ｂ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２５９／２０１０（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８様）、及びＢ／Ｕｔａｈ／９／２０１４（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３様）を使用した。

フェレットは、研究の０日目と２１日目に免疫した。研究開始前日、研究の２１日目及び４２日目に採血した。フェレットで試験した製剤の免疫原性を評価するために、ヒト赤血球を使用してＨＡＩアッセイを実施した。実験プロトコルは、当技術分野で知られており、上記で考察されている。以下のＨＡＩ試薬を、ＶＬＰフォームの基準インフルエンザ抗原としてアッセイに使用した：（１）Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ ４５／１５（ＢＶ＃００１）、（２）Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／１４（ＢＶ＃１８０８）、（３）Ｂ／Ｂｒｉｓ／６０／０８（ＢＶ＃７１４）、（４）Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／１３（ＢＶ＃１６５９）、（５）Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３（ＢＶ＃１６６０）、（６）Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／２０１６（ＢＶ＃２１６５）、（７）Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（ＢＶ＃１３２４）、（８）Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６／１１（ＢＶ＃１５７７）、及び（９）Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９。インフルエンザ抗原ＶＬＰを作製する方法は、例えば、本明細書において、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、米国特許出願第１５／９０１，０００号に記載されている。

全ての市販のインフルエンザワクチンは、投与計画、製剤の種類（すなわち、ベッドサイド及び共製剤）に関係なく、マトリックスＭの存在下では、全てのＱｕａｄ－ＮＩＶ製剤と比較してＨＡＩ力価が低かった。図７（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１－２０１４）、図８（Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５）、図９（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）、及び図１０（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３）を参照のこと。

要約すると、Ｑｕａｄ－ＮＩＶ製剤は、市販のワクチンと比較して、本明細書に開示されている全ての試験したインフルエンザ株について、フェレットにおいてより強力な免疫原性効果を引き出すことができる一方で、その違いは、製剤にマトリックスＭが含まれている場合に顕著である。ＨａＳＭａＮを含むＱｕａｄ－ＮＩＶ共製剤（プレミックス）は、Ｑｕａｄ－ＮＩＶベッドサイド製剤と比較して同様の免疫原性を示した。共製剤群の中で、４℃及び２５℃で保管された製剤は、一般に非常に類似した免疫原性を示した。

実施例５：４℃で保管された四価ナノ粒子インフルエンザワクチンの免疫原性評価
表３は、プレミックスＰＦＳワクチン製剤及びベッドサイドミックスワクチンの免疫原性及び安定性を調査するためのマウス研究デザインを示す。ＰＦＳ製剤は４℃で３ヶ月間保管した。ベッドサイドミックスワクチンの場合、ウイルス抗原は－６０℃で３ヶ月保管され、投与直前にマトリックスＭアジュバントと混合した。

０日目と２１日目に筋肉内投与で免疫化した。免疫原性分析のために、研究開始前日、及び再度、研究の４２日目（または２回目の免疫後２１日目）に血液試料を採取した。免疫原性は、次のインフルエンザＡ及びＢ株：（１）Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４、（２）Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、（３）Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、及び（４）Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３に対する赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）応答に基づいて決定した。ＨＡＩは、それらの開示の参照により組み込まれる、インフルエンザの実験室診断及びウイルス学的監視のためのマニュアル（世界保健機関２０１１、２０１８／０２／１５にアクセスした：ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｉｓｒｓ＿ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ／ｍａｎｕａｌ＿ｄｉａｇｎｏｓｉｓ＿ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｅｎ／）に記載のように測定される。

図１１は、表３に列挙された製剤の３ヶ月目における全てのＨＤ群の４つのインフルエンザ株に対するＨＡＩ力価を示す。結果は、４℃で３ヶ月間保管されたプレミックス製剤が、－６０℃で保管されたベッドサイドミックス製剤と比較して同様の免疫原性能力を有していたことを示す。結果は、さらにプレミックス製剤が３ヶ月などの長期間保存された場合でも、マトリックスＭが試験したＱｕａｄ－ＮＩＶ製剤の免疫原性を変化させないことも示す。

実施例６：マトリックスＭを含有する、プレミックス対ベッドサイドミックスＨＡナノ粒子の２５℃での免疫原性及び長期安定性
以下の表４に示すように、群１～１４を準備した。プレミックス群の場合、ＨＡナノ粒子及びマトリックスＭ（画分Ａマトリックスと画分Ｃマトリックスが８５：１５ｗ／ｗ）を組み合わせ、投与前に４℃で６ヶ月間もしくは１２ヶ月間、または２５℃で６ヶ月間保管した。ベッドサイドミックス群の場合、ＨＡを２５℃で保管するか、－６０℃で６ヶ月間凍結するか、または－６０℃で１２ヶ月間凍結し、その後、マウスへの投与直前にマトリックスＭと組み合わせた。ＨＡタンパク質ナノ粒子は、以下の株Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ－Ｈ３Ｎ２ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ、及びＢ／ＰｈｕｋｅｔのＨＡを含んだ。

¹高用量:120μg/mL/株(480μg全HA)+100μg/mLマトリックス。
²低用量:30μg/mL/株HA(120μg全HA)+100μg/mLマトリックス。
³12ヶ月の安定性研究には、25℃で保管された試料は含まなかった。

４つの株のそれぞれに対してＨＡＩ力価を測定した。図１２～１９及び表５～１２は、６ヶ月目のＨＤ及びＬＤ群のＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ株に対するＨＡＩ力価を示す。

図２０～２７は、１２ヶ月目での高用量（ＨＤ）及び低用量（ＬＤ）群のＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ株、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ株、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ株、及びＢ／Ｐｈｕｋｅｔ株に対するＨＡＩ力価を示す。

データは、ベッドサイドミックスワクチン及びプレミックスワクチンが、ＨＡＩ力価の測定により、６ヶ月または１２ヶ月の保管後であってもマウスにおいて同様の免疫原性を生み出すことを示す。研究はまた、マトリックスＭの存在がより大きな免疫応答を生成するために有益であることを確認した。マトリックスＭは、長期間保管した場合でも、試験したＱｕａｄ－ＮＩＶ製剤の免疫原性を変化させない。

２５℃でのプレミックス製剤は、２５℃でのベッドサイドミックス製剤と比較して同様の免疫原性を示した。例えば、４℃または２５℃で保管された１．５μｇのプレミックス群は、２１日目にＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ株に対して同様のＨＡＩ力価応答を誘発した（表５、それぞれＧＭＴ：５７対６７）。２５℃で長期間保管されたプレミックス製剤の安定性と合わせて、ワクチンは、コールドチェーン保管が制限されているか、または存在しない場合に特に有用である。

図１２～２７に示すデータは、高用量群、特にプレミックス製剤が、２１日目の全ての株で低用量群と比較してより高いＨＡＩ力価応答があったことを示す。３５日目のＨＡＩ力価応答は、２１日目に観察されたＨＡＩ力価応答と比較して全ての株の全群において高かったが（例えば、２１日目対３５日目における２５℃での１．５μｇプレミックス製剤のＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ ＨＡＩ力価：２２対５３８）、３５日目の高用量群と低用量群の間にわずかな違いが観察された。

データは、Ａ型のＨＡタンパク質と形成されたＨａＳＭａＮ粒子が、ＨａＳＭａＮ形態ではない洗浄剤コアを有するＨＡナノ粒子と少なくとも同じくらい免疫応答を誘導するのに効果的であることを確認している。データは、ＨａＳＭａＮを形成するためのＨＡナノ粒子とマトリックスとの相互作用が、マトリックスのアジュバント効果またはＨＡタンパク質自体の免疫原性に悪影響を与えないことを示している。ＨＡナノ粒子は、洗浄剤コアへの挿入によりＨＡタンパク質の安定性を維持しているように見えるが、このデータは、ＨａＳＭａＮ粒子がＨＡタンパク質構造をある程度保護し得、また、洗浄剤コアに埋め込まれたＨＡタンパク質を必要とせずに、免疫系への提示にプラスの影響を与える可能性があることを示唆している。

実施例７：沈降係数分析
実施例６においてマウスでの安定性について以前に試験された四価組成物を、超遠心分析（ＡＵＣ）によって分析し、沈降速度（ＳＶ）を測定して、粒子サイズを決定した。図２８は、４℃で０、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、及び１２ヶ月でのＱｕａｄ－ＮＩＶ １２０μｇ／ｍＬ／株のみ（ＱＩＶのみ）の結果、または４℃で３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、及び１２ヶ月でのＱＩＶ＋１００μｇ／ｍＬ Ｍ１の結果を示す。データは、時間が経過するにつれて、急速に沈降する種の量が増加していることを示す、すなわち、より高い値で現れる構造はＨＡ粒子が時間の経過とともにＨａＳＭａＮへと形成されることを示す。図２９は、２５℃で０、３ヶ月、または６ヶ月目の単独、または１００μｇ／ｍＬのＭ１を含有するＱｕａｄ－ＮＩＶの結果を示し、ＨａＳＭａＮの形成が高温で速いことが確認された。

実施例８：ＨａＳＭａＮの形成の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析
前述したように、図１は、ＴＥＭを使用して見た、ＨＡナノ粒子（Ｆｌｕ）、マトリックスＭ、及びＨａＳＭａＮ（Ｆｌｕ－マトリックス相互作用）の様々な構造を示す。予想通り、ＨＡナノ粒子にはＨａＳＭａＮの形成がなかった。むしろ、ＨＡナノ粒子は、洗浄剤コア構造とコアを囲んでいるＨＡタンパク質を示す。マトリックスＭは、サポニン画分（画分Ａまたは画分Ｃのいずれかであり、両方ではない）、リン脂質、及びコレステロールを含むかご型構造を示す。ＨａＳＭａＮ構造では、ＨＡ糖タンパク質は、かご型のマトリックス粒子に付着しており、そのＨＡヘッド部分は外側に伸びている。

次に、様々な条件下でのＨａＳＭａＮの形成を視覚的に評価するために、ＴＥＭ下で以下に説明する様々な試料の時間経過を確認した。以下の表１３は、ＴＥＭを使用してプレミックスＱｕａｄ－ＮＩＶ製剤（高用量はＨＤ及び低用量はＬＤ）のナノ粒子構造を試験するための試料条件及び時点を示す。マーク「Ｘ」は、各時点で使用可能な試料条件を示している。加えて、ＬＤ製剤を１ヶ月で様々な温度下で試験した（図３５）。

図３０～図３４は、ＨａＳＭａＮ構造の代表的画像を示す。データは、ＨａＳＭａＮ形成が約４時間のインキュベーションで視認できることを示し、４時間以前にＨａＳＭａＮ形成の形跡はない（図３０及び図３１）。２４時間までに、ＨａＳＭａＮは低温（４℃）及び高温（２５℃）の両方で形成されたが、ＨａＳＭａＮの形成は４℃の高用量Ｑｕａｄ－ＮＩＶでは観察されなかった。高用量Ｑｕａｄ－ＮＩＶは、４℃で、４８時間までに（図３３）及び７日目までに（図３４）、ＨａＳＭａＮ形成を示す。データはまた、１ヶ月までにＨａＳＭａＮ構造がＬＤ群に留まり、高温、特に３７℃でより顕著になったことを示す（図３５）。

マトリックスM濃度：全試料において100μg/mL

これらのデータは、ＨａＳＭａＮの形成には、ＨＡナノ粒子とマトリックスＭ１の約４時間以上の共インキュベーションが必要であることを示す。全ての条件は、４８時間以内のＨａＳＭａＮの形成を示している。形成されたＨａＳＭａＮ粒子は長期間安定である。ＨａＳＭａＮの形成は、Ｑｕａｄ－ＮＩＶの温度が高く、用量が少ないほど早く発達する。

このことは、ＨａＳＭａＮを含むプレフィルドシリンジ製剤を、室温以上（例えば、３７℃）で保存できることを示唆し、これにより低温での保管及び輸送のコストを回避し、診療所でのワクチン接種の直前におけるワクチンの混合及び調製の不一致の可能性を防ぐ。

実施例９
Ｑｕａｄ－ＮＩＶの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）プロファイル
実施例６及び７に記載されているＱｕａｄ－ＮＩＶ製剤の安定性をＤＳＣアッセイによって調査した。１００μｇ／ｍＬのマトリックスＭ１を含有する１２０μｇ／ｍＬ／株のＱｕａｄ－ＮＩＶは、ｐＨ７．５で、２５ｍＭ ＮａＰｉ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭアルギニン、５％トレハロース、０．０３％ ＰＳ８０を含む緩衝剤で調製した。全てのＱｕａｄ－ＮＩＶ試料は、４℃で３ヶ月、６ヶ月、もしくは１２ヶ月間、または２５℃で３ヶ月もしくは６ヶ月間インキュベートした。ＤＳＣスキャンを４℃～１２０℃まで１℃／分で実施し、Ｑｕａｄ－ＮＩＶのモル熱容量（Ｃｐ：ｋＪ／ｍｏｌ．ｋ）を測定した。

図３６は、２５℃でインキュベートした製剤が、４℃でインキュベートした同じ群よりも融解温度（Ｔ_ｍ）のシフトが小さく、ピーク幅が広いことを示している。表１４は、２５℃でインキュベートした１２０μｇ／ｍＬ／株のＱｕａｄ－ＮＩＶ＋マトリックスＭ１製剤が、３ヶ月（５９．６℃対６０．４℃）及び６ヶ月（５９．０℃対６０．４℃）目の両方において４℃よりも低いＴ_ｍだった。表１４は、２５℃での製剤が４℃よりもピーク温度に到達するのに必要なＨｃａｌの変化が少ないことも示しており、これは、この製剤のＨａＳＭａＮ複合体が比較的少ないことをさらに示唆している。

ＤＳＣプロファイル及びＴ_ｍは、タンパク質の熱安定性の尺度である。結果は、ＨａＳＭａＮの形成が、ＨＡタンパク質のＴ_ｍを約０．５℃から約１℃増加させ、それにより、洗浄剤コアナノ粒子と比較して、ＨａＳＭａＮにおけるＨＡタンパク質の熱安定性を向上させることを示している。

実施例１０：Ｂ型株ではなくＡ型株がＨａＳＭａＮを形成する
異なるインフルエンザ株由来のＨＡ糖タンパク質がＨａＳＭａＮを形成する能力を調査した。以下の株について、実施例１に記載されるように洗浄剤コアナノ粒子を調製及び精製した：Ａ型：Ａ／Ｈｕｎａｎ、Ａ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（両方ともＨ７Ｎ９サブタイプ）及びＡ／Ｐａｎａｍａ及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４（両方ともＨ３Ｎ２サブタイプ）、ならびにＢ型：Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８。

最大４週間、ナノ粒子をマトリックスＭと混合した（画分Ａマトリックスと画分Ｃマトリックスが８５：１５ｗ／ｗ）。最終的なＨＡ濃度は１２０μｇ／ｍＬであった（０．５ｍＬ中、各Ａ株６０μｇ＋各Ｂ株６０μｇ）。遊離ｎＨＡを測定した。結果を図３７に示す。遊離ｎＨＡ種の減少はＨａＳＭａＮ形成に対応する。

これらのデータは、Ａ型株ＨＡ糖タンパク質がＨａＳＭａＮを形成するが、Ｂ型株ＨＡ糖タンパク質は形成しないことを示唆している。また、Ｃ末端にフォールドンを有するＨＡ糖タンパク質融合タンパク質も試験した。フォールドンの存在はＨａＳＭａＮ形成を阻害しており、これはＨＡ糖タンパク質がＨａＳＭａＮを形成できるように、Ｃ末端が自由でなければならないことを示している。

Claims (29)

1. 多価免疫原性インフルエンザ組成物であって、
   （ａ）Ｂ型インフルエンザ株由来の組換えインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質を含む洗浄剤コアナノ粒子と、
   ここで、前記洗浄剤コアは、非イオン性洗浄剤を含み、前記非イオン性洗浄剤がＰＳ８０であり、
   （ｂ）Ａ型インフルエンザ株由来の組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質、非イオン性洗浄剤及びＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントを含む赤血球凝集素サポニンマトリックスナノ粒子（ＨａＳＭａＮ）と、
   ここで、前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントは、画分Ａマトリックス及び画分Ｃマトリックスを含み、
   （ｃ）薬学的に許容される緩衝剤と、
   を含む、前記組成物。
2. １つ以上の洗浄剤コアナノ粒子及び／または１つ以上のＨａＳＭａＮをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ナノ粒子のそれぞれが、トリプシン耐性ナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントが、少なくとも約８５％（ｗ／ｗ）の画分Ａマトリックスを含み、前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントの残りが、画分Ｃマトリックスを含む、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントが、画分Ａマトリックス及び画分Ｃマトリックス（８５：１５、ｗ／ｗ）を含む、請求項１に記載の組成物。
6. 前記ＰＳ８０洗浄剤が約０．０３％～約０．５％で存在する、請求項１に記載の組成物。
7. 前記ＰＳ８０洗浄剤が約０．０４％で存在する、請求項１に記載の組成物。
8. 前記インフルエンザ株が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８からなる群から選択されるサブタイプのものである、請求項１に記載の組成物。
9. 前記薬学的に許容される緩衝剤が、（ｉ）約２５ｍＭのリン酸ナトリウム、（ｉｉ）約１５０ｍＭの塩化ナトリウム、（ｉｉｉ）約１００ｍＭのアルギニン塩酸塩、（ｉｖ）約５％のトレハロースを含み、前記組成物のｐＨが約７．５である、請求項１に記載の組成物。
10. 請求項１に記載の組成物を含む、プレフィルドシリンジまたはブローフィルシール容器。
11. 前記組成物が、少なくとも１２ヶ月間安定である、請求項１０に記載のプレフィルドシリンジまたはブローフィルシール容器。
12. 前記組成物が、２５℃で安定である、請求項１０に記載のプレフィルドシリンジまたはブローフィルシール容器。
13. インフルエンザに対する免疫応答を刺激するための、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
14. 前記組成物が筋肉内に投与される、請求項１３に記載の組成物。
15. ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバント、非イオン性洗浄剤、及び組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質三量体を含むＨａＳＭａＮ（赤血球凝集素サポニンマトリックスナノ粒子）であって、前記ＨＡ糖タンパク質がＡ型インフルエンザ株由来であり、前記ＨＡ糖タンパク質尾部が前記粒子と結合されており、前記ＨＡ糖タンパク質ヘッド部が前記粒子から遠位に伸びており、前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントが、画分Ａマトリックス及び画分Ｃマトリックスを含み、前記非イオン性洗浄剤がＰＳ８０である、前記ＨａＳＭａＮ。
16. 前記Ａ型インフルエンザ株が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８からなる群から選択されるサブタイプのものである、請求項１５に記載のＨａＳＭａＮ。
17. 請求項１５に記載のＨａＳＭａＮと、薬学的に許容される緩衝剤または担体と、を含む、組成物。
18. 前記アジュバントが用量あたり約５０μｇ～約７５μｇで存在する、請求項１に記載の組成物。
19. 前記Ｂ型インフルエンザ株由来の前記組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質及び前記Ａ型インフルエンザ株由来の前記組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質の両方が約６０μｇの量で存在する、請求項１に記載の組成物。
20. 前記Ｂ型インフルエンザ株由来の前記組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質及び前記Ａ型インフルエンザ株由来の前記組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質の両方が野生型インフルエンザＨＡ糖タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
21. 前記Ｂ型インフルエンザ株由来の前記組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質及び前記Ａ型インフルエンザ株由来の前記組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質が宿主細胞において発現される、請求項１に記載の組成物。
22. 前記宿主細胞が昆虫Ｓｆ９細胞である、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記Ｂ型インフルエンザ株由来の前記組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質及び前記Ａ型インフルエンザ株由来の前記組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質がバキュロウイルスを使用して発現される、請求項２１に記載の組成物。
24. 洗浄剤コアナノ粒子及びＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントを少なくとも２４時間組み合わせることを含み、
    前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントが、画分Ａマトリックス及び画分Ｃマトリックスを含み、
    前記洗浄剤コアナノ粒子が、Ａ型インフルエンザ株由来のＨＡ糖タンパク質、及び非イオン性洗浄剤を含み、前記非イオン性洗浄剤がＰＳ８０である、
    ＨａＳＭａＮの調製方法。
25. 前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントが、少なくとも約８５％（ｗ／ｗ）の画分Ａマトリックスを含み、前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントの残りが、画分Ｃマトリックスを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントが、画分Ａマトリックス及び画分Ｃマトリックス（８５：１５、ｗ／ｗ）を含む、請求項２４に記載の方法。
27. 約２５℃の温度で前記洗浄剤コアナノ粒子を前記ＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントと組み合わせることを含む、請求項２４に記載の方法。
28. 前記洗浄剤コアナノ粒子がＡ型インフルエンザ株由来の組換えインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質を含む、請求項２４に記載の方法。
29. 前記Ａ型インフルエンザ株が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。