ES2959258T3

ES2959258T3 - Antígenos proteicos que proporcionan protección contra la colonización y/o la enfermedad neumocócicas

Info

Publication number: ES2959258T3
Application number: ES14748672T
Authority: ES
Inventors: Richard Malley; Yingjie Lu; Fan Zhang
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2014-02-07
Publication date: 2024-02-22
Anticipated expiration: 2034-02-07
Also published as: AU2018201768B2; CA2900008A1; WO2014124228A1; EP2953638A4; EP2953638A1; JP2019108375A; US20230081705A1; EP2953638B1; EP4272750A2; AU2014214844B2; AU2018201768A1; JP2016509011A; AU2014214844A1; JP6494527B2; JP6916828B2; US11576958B2; EP4272750A3; US20150374811A1

Abstract

La presente solicitud se dirige generalmente a nuevos antígenos polipeptídicos neumocócicos y ácidos nucleicos que codifican dichos antígenos, y a composiciones inmunogénicas que comprenden dichos antígenos para tratar y prevenir la infección neumocócica. La presente invención proporciona además un método para utilizar los antígenos para provocar una respuesta inmune (por ejemplo, respuesta de IL-17A, respuestas inmunes mediadas por células T y/o mediadas por células B). La presente invención también proporciona métodos de profilaxis y/o tratamiento de enfermedades mediadas por neumococos, tales como sepsis, que comprenden administrar una composición inmunogénica que incluye uno o más de una combinación de antígenos neumocócicos o fragmentos funcionales de los mismos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, uno o más antígenos neumocócicos pueden estar presentes en un conjugado de polisacárido. Las composiciones inducen una respuesta inmune antineumococo cuando se administran a un mamífero. Las composiciones se pueden usar de forma profiláctica para vacunar a un individuo y/o terapéuticamente para inducir una respuesta inmune terapéutica en un individuo infectado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Antígenos proteicos que proporcionan protección contra la colonización y/o la enfermedad neumocócicas

Lista de secuencia

La presente solicitud contiene una Lista de Secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 6 de febrero de 2014, lleva el nombre 701039-074841-PCT_SL.txt y tiene un tamaño de 640.188 bytes.

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere generalmente a métodos para identificar inmunógenos de organismos y patógenos, y en particular para identificar inmunógenos que, cuando se administran como vacunas, provocan una respuesta inmunitaria celular y/o humoral. La presente solicitud también se refiere a inmunógenos de células T neumocócicas y a métodos y composiciones de los mismos.

Antecedentes de la invención

Casi un millón de niños en el mundo en desarrollo mueren cada año a causa de infecciones neumocócicas. A pesar de la eficacia de las vacunas neumocócicas conjugadas, persisten problemas con este enfoque, incluidos los gastos de producción y suministro, y el reemplazo de serotipo resultante, como se demuestra en varios ensayos clínicos y estudios epidemiológicos. Un efecto positivo de las actuales vacunas capsulares ha sido evidente en la población de pacientes que no está siendo vacunada: la inmunidad colectiva desempeña un papel impresionante en la actual estrategia de vacunación. Por cada caso de enfermedad neumocócica prevenido en niños, la inmunidad colectiva previene alrededor de tres casos de enfermedad neumocócica en adultos. Al menos en este contexto, la prevención de la colonización neumocócica es un objetivo principal de los enfoques de vacunas basadas en proteínas, porque el bloqueo de la colonización bloqueará la enfermedad.

El documento WO 2012/155007 A1 describe un sistema inmunogénico presentador de múltiples antígenos que comprende un polímero al que se asocian antígenos mediante moléculas de afinidad complementarias. Las composiciones inmunogénicas pueden provocar respuestas inmunitarias humorales y celulares a uno o múltiples antígenos al mismo tiempo.

Se necesitan con urgencia vacunas neumocócicas alternativas que provoquen inmunidad independiente del serotipo y que tal vez estén más fácilmente disponibles para los países económicamente emergentes. Sería muy atractivo contar con nuevos antígenos que puedan abordar esta necesidad. Además, los métodos actuales para identificar inmunógenos se centran en técnicas que no optimizan completamente la extracción o identificación del repertorio completo de antígenos. Esto es válido tanto para el neumococo como para otros patógenos. Un método que pueda identificar un nuevo conjunto de antígenos tiene potencial para tener un impacto en el desarrollo de vacunas para un amplio conjunto de patógenos, incluido el neumococo.

Compendio de la invención

La presente divulgación abarca el descubrimiento de nuevos antígenos para neumococos que provocan respuestas inmunitarias específicas de antígenos en mamíferos. Tales antígenos novedosos, y/o ácidos nucleicos que codifican los antígenos, pueden incorporarse a composiciones inmunogénicas y administrarse para provocar respuestas inmunitarias, p. ej., para proporcionar protección contra la colonización neumocócica, enfermedades invasivas, tales como, pero sin limitarse a, sepsis y enfermedades y trastornos causados por el neumococo. Tales antígenos novedosos y/o respuestas a antígenos novedosos se pueden detectar para identificar y/o caracterizar respuestas inmunitarias al neumococo. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión que comprende (i) una proteína de unión a biotina o una porción funcional de la misma, y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma que comprende un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, o una porción inmunogénica de la misma en donde la composición inmunogénica, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria de IL-17A en el sujeto.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona la composición inmunogénica para uso en medicina.

En un tercer aspecto de la invención, se proporciona la composición inmunogénica para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, trastorno y/o afección por neumococo debidos a una infección neumocócica.

También se describen en el presente documento composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden al menos un antígeno neumocócico aislado seleccionado entre las proteínas neumocócicas SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218, o fragmentos de las mismas.

En el presente documento se describe adicionalmente una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno neumocócico aislado o un fragmento del mismo con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234, y en donde la composición provoca una respuesta inmunitaria contraSteptococcus pneumoniaecuando se administra a un mamífero. El antígeno neumocócico o fragmento del mismo pueden existir como un producto conjugado de fusión, por ejemplo, donde el producto conjugado de fusión es un producto conjugado de polisacárido. El producto conjugado de fusión puede comprender el antígeno neumocócico o fragmento del mismo fusionados a un neumolisoide neumocócico PdT, en donde el neumolisoide neumocócico PdT está conjugada con el polisacárido. El producto conjugado de fusión puede comprender un polisacárido que es dextrano, polisacárido Vi deSalmonella typhi,o polisacárido de la pared celular de neumococo (CWPS), u otro polisacárido de origen procariótico o eucariótico.

La composición inmunogénica puede inducir una respuesta de IL-17A (células Th17) en un sujeto. La composición inmunogénica puede inducir una respuesta inmunitaria que comprende una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria celular.

La composición inmunogénica se puede preparar adicionalmente como una vacuna que reduce o protege a un mamífero contra la colonización neumocócica. La composición inmunogénica puede comprender adicionalmente un adyuvante. La composición inmunogénica como se divulga en el presente documento se puede administrar a través de la mucosa.

La composición inmunogénica puede comprender al menos 3, o al menos 5, o entre 5-20 antígenos neumocócicos o fragmentos o más de 20 con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153 234.

La composición inmunogénica puede comprender al menos una de las proteínas neumocócicas SP0785, SP1500 y SP2145.

Se describe adicionalmente en el presente documento un método para inducir una respuesta de IL-17A en un sujeto, que comprende administrar al sujeto al menos una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento, p. ej., un antígeno de neumococo de la Tabla 1, o un fragmento funcional del mismo eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen el sujeto.

También se describe en el presente documento un método para proteger contra la colonización por neumococo, que comprende administrar al sujeto al menos una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento, p. ej., un antígeno neumocócico de la Tabla 1, o un fragmento funcional del mismo.

Se describe adicionalmente en el presente documento un método para provocar una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero al menos una composición inmunogénica que comprende uno o más antígenos neumocócicos aislados o fragmentos de los mismos como se divulga en el presente documento en la Tabla 1, con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234 de forma eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen el sujeto.

También se describe en el presente documento un método para proteger contra la colonización porSalmonella typhien un mamífero, que comprende administrar al mamífero al menos una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento, p. ej., un antígeno de neumococo de la Tabla 1, o un fragmento funcional del mismo eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen el sujeto.

La composición inmunogénica puede comprender al menos un antígeno de neumococo aislado o fragmento del mismo seleccionado entre SP0785 o SP1500, y/o tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 34 (SP0785) o SEQ ID NO: 51 (SP1500) o un fragmento funcional de la misma.

Además, se describe en el presente documento un método para proteger contra una enfermedad invasiva deStreptococcus pneumoniaeen un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento, p. ej., un antígeno de neumococo de la Tabla 1, o un fragmento funcional del mismo eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen el sujeto. Tal enfermedad invasiva es, por ejemplo, sepsis. En tal caso, el método puede comprender una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno de neumococo aislado o un fragmento del mismo que es SP1386, SP1500, SP0084 y SP1479 y SP0346, y/o al menos un antígeno neumocócico que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 46 (SP1386), SEQ ID NO: 51 (SP1500), SEQ ID NO: 4 (SP0084), SEQ ID NO: 50 (SP1479) y SEQ ID NO: 15 (SP0346) o un fragmento funcional de la misma.

Una composición inmunogénica se puede administrar mediante administración por vía mucosa o cualquier otra vía aplicable, por ejemplo, pero sin limitarse a, administración intravenosa, subcutánea o intraperitoneal (IP).

Una composición inmunogénica puede comprender al menos un antígeno de neumococo aislado seleccionado entre uno cualquiera o una combinación de antígenos de neumococo con las secuencias de aminoácidos 1-76 o SEQ ID NO: 153-234. Los antígenos de neumococo pueden ser las proteínas de neumococo de longitud completa de SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218. Un antígeno de neumococo puede comprender una proteína de neumococo que carece de una secuencia señal y/o dominio transmembrana. Un antígeno de neumococo puede comprender una mezcla de proteínas de neumococo de longitud completa y fragmentos resultantes del procesamiento, o procesamiento parcial de una secuencia señal por un anfitrión de expresión, p. ej., E. coli o una línea celular de insecto (p. ej., el sistema de expresión de baculovirus), o una línea celular de mamífero (p. ej., ovario humano o de hámster chino (CHO)). Como se emplean en el presente documento, los términos "porción" y "fragmento" o equivalentes gramaticales se utilizan indistintamente.

Los antígenos neumocócicos pueden ser fragmentos de las proteínas neumocócicas de longitud completa de SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218, por ejemplo, al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de tales proteínas.

Un antígeno neumocócico puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99%) idéntica a 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de las proteínas neumocócicas SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218.

En consecuencia, los autores de la presente invención en el presente documento han identificado inmunógenos de células T neumocócicas que inducen una respuesta de IL-17A (p. ej., una célula Thl7) y protegen a los ratones de la colonización. Estas proteínas, incluidas SP0785, SP1500, SP2145 o fragmentos de las mismas, son prometedoras como candidatas a vacunas contra la colonización y la sepsis. Se pueden administrar nuevos inmunógenos neumocócicos como se divulga en el presente documento, p. ej., como se divulga en la Tabla 1, mediante inmunización a través de la mucosa y se pueden administrar opcionalmente con un adyuvante, para reducir la colonización nasal neumocócica posterior.

Una composición inmunogénica puede comprender SP1386, SP1500, SP0084, SP1479 y SP0346, o fragmentos de las mismas en un método para prevenir o tratar la sepsis en un sujeto, tal como un sujeto mamífero, incluido un sujeto humano.

Puede prepararse una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno neumocócico aislado como una vacuna que reduce o protege a un mamífero contra la colonización neumocócica. Tal composición inmunogénica puede comprender adicionalmente al menos un adyuvante, p. ej., seleccionado del grupo que comprende, pero sin limitarse a, toxina del cólera, CFA, IFA, alumbre y otros comúnmente conocidos en la técnica y divulgados en el presente documento.

En el presente documento se describe adicionalmente una composición farmacéutica para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende los inmunógenos estimulantes de células T preparados según los métodos divulgados en el presente documento. Una composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un adyuvante y/o un armazón de vacuna. Una composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un adyuvante.

La composición inmunogénica como se divulga en el presente documento se puede administrar a un sujeto a través de la mucosa. El sujeto puede ser un sujeto mamífero, p. ej., un ser humano, sin embargo, se contemplan otros sujetos tales como animales domésticos y agrícolas y similares.

La divulgación también proporciona composiciones que incluyen ácidos nucleicos que codifican un antígeno neumocócico como se describe en el presente documento. Una composición puede incluir un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno neumocócico seleccionado de la Tabla 1, o combinaciones de los mismos, y comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición puede comprender adicionalmente un adyuvante.

En el presente documento se describen adicionalmente métodos para provocar una respuesta inmunitaria contra neumococo en un mamífero basándose en los ácidos nucleicos descritos en el presente documento en la Tabla 1. Se describen métodos para provocar una respuesta inmunitaria contra neumococo en un mamífero administrando al mamífero una composición que comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno neumocócico como se divulga en la Tabla 1 o combinaciones de los mismos.

También se describen métodos para caracterizar y/o detectar una respuesta inmunitaria a un antígeno neumocócico en un sujeto (p. ej., un antígeno polipeptídico neumocócico seleccionado de la Tabla 1 o combinaciones de los mismos). Se puede caracterizar una respuesta inmunitaria en un sujeto no sensibilizado previamente. Se puede caracterizar una respuesta inmunitaria en un sujeto infectado, o sospechoso de haber sido infectado, con neumococo. Se puede caracterizar una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se le administra una composición inmunogénica que comprende un antígeno neumocócico (p. ej., una composición inmunogénica descrita en el presente documento). Se puede caracterizar una respuesta de anticuerpos. Se puede caracterizar una respuesta de células B. Se puede caracterizar una respuesta de células T. Se puede caracterizar la secreción de IFN-<y>por células T específicas de antígeno. Se puede caracterizar una respuesta de células T Th1. Se puede caracterizar una respuesta de células T Th17 y, en algunas realizaciones, se puede caracterizar la secreción de IL-17A. Se puede caracterizar una respuesta de células T citotóxicas. Se pueden caracterizar tanto la respuesta de las células T como las de las células B. Se puede caracterizar una respuesta inmunitaria innata.

Se describen adicionalmente métodos para preparar composiciones que incluyen antígenos neumocócicos y anticuerpos que se unen específicamente a antígenos neumocócicos como se divulga en la Tabla 1.

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para la profilaxis y/o tratamiento de cualquier enfermedad, trastorno y/o afección por neumococo debidos a una infección neumocócica. Una composición inmunogénica descrita en el presente documento puede reducir el riesgo de infección, y/o tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección neumocócicos. La profilaxis y/o tratamiento de la infección neumocócica pueden comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica que comprende un nuevo antígeno neumocócico descrito en el presente documento a un sujeto que lo necesite, en las cantidades y durante el tiempo que sea necesario para lograr el resultado deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición inmunogénica puede ser esa cantidad eficaz para tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de la infección neumocócica.

Los protocolos profilácticos, pronósticos y/o terapéuticos pueden implicar la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones inmunogénicas que comprenden un nuevo antígeno neumocócico a un sujeto de manera que se estimule una respuesta inmunitaria en una o ambas células T y B. También se proporcionan nuevas composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más antígenos neumocócicos (p. ej., uno o más de un antígeno polipeptídico seleccionado de la Tabla 1 o combinaciones de los mismos) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. La presente divulgación puede proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden una composición inmunogénica como se describe en el presente documento. Se proporciona un método para administrar una composición farmacéutica que comprende composiciones a un sujeto (p. ej., un ser humano, por ejemplo, un niño, adolescente o adulto joven) que lo necesita.

Se puede suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica a un paciente y/o animal antes, simultáneamente y/o después del diagnóstico de una enfermedad, trastorno y/o afección neumocócicos. Se puede suministrar una cantidad terapéutica de una composición inmunogénica a un paciente y/o animal antes, simultáneamente y/o después de la aparición de los síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección neumocócicos.

Las composiciones inmunogénicas pueden administrarse mediante cualquiera de una variedad de vías, incluyendo oral, intramuscular, subcutánea, transdérmica, intradérmica, rectal, intravaginal, mucosa, nasal, bucal, entérica, sublingual; mediante instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; y/o como pulverización oral, pulverización nasal y/o aerosol. Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar por una variedad de vías, incluyendo intravenosa, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, intraperitoneal, tópica (como polvos, ungüentos, cremas y/o gotas), transdérmica o mediante instilación intratraqueal.

Se puede administrar una composición inmunogénica combinada con uno o más agentes terapéuticos adicionales que tratan los síntomas de la infección neumocócica (p. ej., con un antibiótico tal como un antibiótico betalactámico, una eritromicina o una tetraciclina).

También se describe en el presente documento el uso de la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento para ser administrada a un sujeto para provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta de anticuerpos/células B, una respuesta de células T CD4+ (incluyendo células Th1, Th2 y Th17) y/o una respuesta de células T CD8+. Puede administrarse al menos un adyuvante junto con la composición inmunogénica.

En el presente documento se describe adicionalmente un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto a al menos un antígeno, que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento.

También se describe en el presente documento un método para vacunar a un animal, p. ej., un ave, un mamífero o un ser humano, contra al menos un antígeno que comprende administrar una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento.

El animal o el sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser un animal agrícola o no doméstico, o un animal doméstico. Una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento se puede administrar mediante inyección subcutánea, intranasal, oral, sublingual, vaginal, rectal, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular o mediante parche cutáneo para inmunización transcutánea.

La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta de anticuerpos/células B, una respuesta de células T CD4+ (incluidas las respuestas Th1, Th2 y Th17) o una respuesta de células T CD8+ contra antígenos proteicos/peptídicos. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta de anticuerpo/célula B contra el polímero, p. ej., un polisacárido neumocócico. Se puede administrar al menos un adyuvante junto con la composición inmunogénica.

Se describe adicionalmente el uso de la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento para su uso en un diagnóstico de exposición a un patógeno o agente inmunogénico.

En el presente documento se describen adicionalmente kits para preparar una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento. Por ejemplo, tales kits pueden comprender uno cualquiera o más de los siguientes materiales: un recipiente que comprende un polímero, p. ej., un polisacárido, entrecruzado con una pluralidad de primeras moléculas de afinidad; y un recipiente que comprende una molécula de afinidad complementaria que se asocia con la primera molécula de afinidad, en donde la molécula de afinidad complementaria se asocia con un antígeno.

La divulgación proporciona una variedad de kits que comprenden una o más de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se describe un kit que comprende una composición inmunogénica que comprende un antígeno neumocócico o un ácido nucleico que codifica el antígeno, en donde el antígeno se selecciona de la Tabla 1 o fragmentos funcionales o combinaciones de los mismos; e instrucciones de uso. Un kit puede comprender múltiples antígenos neumocócicos diferentes. Un kit puede comprender cualquiera de varios componentes o reactivos adicionales en cualquier combinación. Un kit puede incluir, por ejemplo, (i) un antígeno polipeptídico neumocócico seleccionado de la Tabla 1 o combinaciones de los mismos; (ii) un adyuvante; e (iii) instrucciones para administrar una composición que incluye el antígeno neumocócico y el adyuvante a un sujeto que lo necesita.

El kit puede comprender un recipiente que comprende un vector de expresión para expresar un antígeno polipeptídico neumocócico seleccionado de la Tabla 1, por ejemplo. El vector puede comprender opcionalmente una secuencia para un péptido conector, en donde el vector de expresión puede expresar un antígeno polipeptídico neumocócico seleccionado de la Tabla 1.

También se describe en el presente documento un método para vacunar a un sujeto, p. ej., un mamífero, p. ej., un ser humano, con las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento, comprendiendo el método administrar una composición de vacuna como se divulga en el presente documento al sujeto.

Breve descripción de los dibujos

LasFiguras 1A-1Bmuestran que los antígenos de neumococo brindan protección contra la colonización. LaFigura 1Amuestra una disminución de las unidades formadoras de colonias (UFC) en un lavado nasal de ratones sensibilizados con la cepa neumocócica del serotipo 6B después de la inmunización dos veces por semana con SP0785 en presencia de la toxina del cólera (CT) adyuvante en comparación con la CT sola. LaFigura 1Bmuestra una disminución de las unidades formadoras de colonias (UFC) en un lavado nasal de ratones sensibilizados con la cepa neumocócica del serotipo 6B después de la inmunización dos veces por semana con SP1500 en presencia de la toxina del cólera (CT) adyuvante en comparación con la CT sola.

LaFigura 2muestra que los antígenos de neumococo fusionados a Pdt (neumolisoide neumocócico PdT) protegen contra la sepsis y previenen contra la infección invasiva y la colonización nasofaríngea de neumococo. LaFigura 2es una curva de supervivencia de ratones con sepsis que muestra que la inmunización con una proteína de fusión que consiste en SP0785-PdT protegió 80% de los ratones contra la sepsis, y la proteína de fusión SP2145-PdT protegió 90% de los ratones contra la sepsis cuando se compararon los ratones inmunizados con los ratones de control (Alum solamente) o PdT solo (que protegió solo 30% de los ratones).

LasFiguras 3A-3Bmuestran que los antígenos neumocócicos fusionados a PdT (neumolisoide neumocócico PdT) y conjugados covalentemente con el polisacárido Vi generan IL-17A y anticuerpo anti-Vi; protegen contra la sepsis y previenen la infección invasiva y la colonización nasofaríngea por neumococo. LaFigura 3Amuestra altos niveles de IL-17A cuando se estimula con vacuna de células completas (WCV) después de que los ratones fueron inmunizados con el producto conjugado SP0785-PdT-Vi o el producto conjugado SP2145-PdT-Vi en comparación con el control con Alumbre solo. LaFigura 3Bmuestra altos niveles de IgG anti-Vi en ratones inmunizados con el producto conjugado SP0785-PdT-Vi o el producto conjugado SP2145-PdT-Vi, en comparación con Alumbre solo.

LaFigura 4muestra que los antígenos neumocócicos fusionados a Pdt (neumolisoide neumocócico PdT) y conjugados covalentemente con el polisacárido Vi protegen contra la sepsis y previenen la infección invasiva y la colonización nasofaríngea por neumococo. LaFigura 4es una curva de supervivencia de ratones con sepsis que muestra que la inmunización con una proteína de fusión que consiste en SP2145-PdT-Vi o SP0785-PdT-Vi protegió 80% de los ratones contra la sepsis cuando se compararon los ratones inmunizados con los ratones de control (Alumbre solamente) (que protegió solo a 20% de los ratones).

LaFigura 5muestra que los sueros de ratones inmunizados se unen a la cepa de neumococo encapsulada Tigr4. La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de citometría de flujo que muestra que los anticuerpos presentes en el suero de ratones inmunizados con SP0785 (color negro) pueden marcar la cepa de neumococo encapsulada Tigr4 en comparación con el suero obtenido de ratones inmunizados con alumbre solo (color gris). Por tanto, la Figura 5 demuestra que el anticuerpo anti-SP0785 es capaz de unirse a una cepa de neumococo encapsulada.

LasFiguras 6A-6Bdemuestran protección contra la colonización neumocócica mediante una construcción de sistema de presentación de antígenos múltiples (MAPS). Los complejos MAPS se elaboraron utilizando polisacárido neumocócico biotinilado tipo 1 unido a una proteína de fusión que consiste en rizavidina y SP0785, SP1500, SP0435 o PdT. Se inmunizaron ratones C57/BL6 con una mezcla de 3 complejos MAPS que contenían SP0785, SP1500 y PdT, o una mezcla de los 4 complejos MAPS descritos anteriormente, sobre hidróxido de aluminio, a una dosificación de 6,7 gg de cada antígeno. Los ratones de control recibieron hidróxido de aluminio solo (alumbre, control negativo) o una vacuna de células completas en alumbre (como control positivo). La inmunización se administró por vía subcutánea tres veces, con dos semanas de diferencia. Se extrajo sangre después de la tercera inmunización y se estimuló con 10 gg/ml de antígeno de células completas de S. pneumoniae o 5 gg/ml de proteína SP0785, SP1500 o PdT purificadas. La producción de IL-17A específica de antígeno o de células completas (WCB) se midió 7 días después de la estimulación mediante ELISA (Figura 6A). Una semana después de la recolección de sangre, los ratones fueron sensibilizados con la cepa neumocócica 603B y se determinó la tasa de colonización bacteriana en la nariz 10 días después de la sensibilización (Figura 6B). Los ratones que recibieron inmunizaciones con 3 o 4 complejos MAPS quedaron protegidos contra la colonización neumocócica.

LaFigura 7demuestra protección contra la colonización neumocócica mediante una proteína de fusión de SP0785, SP1500 y PdT conjugada con el polisacárido Vi deSalmonella typhi.Se inmunizaron ratones C57BL/6 con vacunas que contenían 5 gg de antígeno proteico adsorbidos en alumbre, por vía subcutánea tres veces, con dos semanas de diferencia. Los ratones de control recibieron alumbre solo. Dos semanas después de la última inmunización, los ratones fueron sensibilizados por vía intranasal a la cepa neumocócica 603B y se determinó la tasa de colonización bacteriana en la nariz mediante lavado nasal. Los ratones que fueron inmunizados con el producto conjugado de fusión estaban significativamente protegidos contra la colonización neumocócica en comparación con los ratones del grupo de control.

LaFigura 8demuestra que la transferencia pasiva de suero de conejo protege a los ratones contra la sensibilización neumocócica. Se inmunizaron conejos blancos New Zealand con SP0785, SP1500 o PdT purificadas. Se administró una mezcla igual de cada suero de conejo antes de la inmunización y después de la inmunización (en este caso, 67 gl cada uno) a grupos de 10 ratones por vía intraperitoneal. A continuación, los ratones se infectaron por vía intraperitoneal con una cepa del serotipo 324 horas después y se controló la supervivencia de los ratones durante 8 días. El grupo que recibió suero post-inmunización tuvo una supervivencia de 60% en comparación con una supervivencia del 0% en el grupo previo al suero, una diferencia que fue altamente significativa desde el punto de vista estadístico, lo que demuestra la capacidad protectora de los anticuerpos contra estas proteínas frente a la enfermedad invasiva neumocócica.

Descripción detallada de la invención

Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae)es una causa común de neumonía bacteriana, meningitis, otitis media y bacteriemia en niños, ancianos y personas inmunodeficientes. S.pneumoniaese puede subdividir en aproximadamente 90 serotipos, según el polisacárido capsular del organismo. Sin embargo, la enfermedad generalmente es causada por aproximadamente 30 tipos de productos aislados de S.pneumoniae.La Organización Mundial de la Salud estima que cada año hay un millón de muertes entre niños debido a meningitis neumocócica y sepsis, y 98% de estas muertes ocurren en países en desarrollo. La aparición de cepas de neumococo con resistencia a los antimicrobianos subraya la necesidad de tratar y prevenir la infección neumocócica mediante métodos además de los antimicrobianos.

La divulgación abarca el descubrimiento de nuevos antígenos para neumococos que provocan respuestas inmunitarias específicas de antígenos en mamíferos. Tales antígenos novedosos, y/o ácidos nucleicos que codifican los antígenos, pueden incorporarse a composiciones inmunogénicas y administrarse para provocar respuestas inmunitarias, p. ej., para proporcionar protección contra la colonización neumocócica, enfermedades invasivas, tales como, pero sin limitarse a, sepsis y enfermedades y trastornos causados por organismos neumococos. Tales antígenos novedosos y/o respuestas a antígenos novedosos se pueden detectar para identificar y/o caracterizar respuestas inmunitarias a organismos neumocócicos.

En el presente documento se describen composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden al menos un antígeno de neumococo aislado seleccionado de las proteínas de neumococo enumeradas en la Tabla 1, p. ej., SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218, o fragmentos funcionales de las mismas, tales como las que se muestran en SEQ ID NO: 153-234. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende al menos un antígeno de neumococo aislado seleccionado entre las proteínas de neumococo SP0785, SP1500, SP0346, SP1386, SP0084, SP1479 y SP2145 que protege contra el neumococo y la infección neumocócica, tal como la sepsis.

Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en el presente documento y, como tales, pueden variar. La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.

Definiciones

El término "antígeno" como se emplea en el presente documento se refiere a una molécula (p. ej., un polipéptido) que provoca una respuesta inmunitaria específica. Las respuestas inmunológicas específicas de antígeno, también conocidas como respuestas inmunitarias adaptativas, están mediadas por linfocitos (p. ej., células T, células B) que expresan receptores de antígenos (p. ej., receptores de células T, receptores de células B). En ciertas realizaciones, un antígeno es un antígeno de célula T y provoca una respuesta inmunitaria celular. En ciertas realizaciones, un antígeno es un antígeno de células B y provoca una respuesta humoral (es decir, de anticuerpos). En ciertas realizaciones, un antígeno es tanto un antígeno de células T como un antígeno de células B. Como se emplea en el presente documento, el término "antígeno" abarca tanto un polipéptido de longitud completa como una porción del polipéptido, que representan fragmentos inmunogénicos (es decir, fragmentos que provocan una respuesta de células T, una respuesta de células B específicas de antígeno o ambas) de tales polipéptidos completos. En algunas realizaciones, el antígeno es un epítopo peptídico que se encuentra dentro de una secuencia polipeptídica (p. ej., un epítopo peptídico unido por una molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) (p. ej., MHC clase I o MHC clase II). En consecuencia, los péptidos de 5-15 amino ácidos de longitud y polipéptidos más largos, p. ej., que tienen 60, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos, pueden ser "antígenos". En un ejemplo ilustrativo la presente invención proporciona un antígeno polipeptídico SP0785. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0785 incluye una secuencia de aminoácidos del polipéptido SP0785 de longitud completa (p. ej., un polipéptido SP0785 de longitud completa de SEQ ID NO: 34). En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0785 incluye una porción de un polipéptido SP0785 (p. ej., una porción del polipéptido SP0785 de SEQ ID NO: 34, cuya porción incluye al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:34). En algunas realizaciones, una porción de un polipéptido SP0785 corresponde a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0785 contiene una o más alteraciones de aminoácidos (p. ej., deleción, sustitución y/o inserción) de una secuencia de polipéptido SP0785 de tipo salvaje de origen natural. Por ejemplo, un antígeno polipeptídico SP0785 puede contener una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a SEQ ID NO:34 o una porción de la misma (p. ej., al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 34). Alternativamente, un antígeno polipeptídico SP0785 puede contener una porción (p. ej., al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos) de una secuencia que es al menos 60% (p. ej., en al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a SEQ ID NO:34 o SeQ ID NO: 190. El antígeno polipeptídico SP0785 se utiliza como ejemplo. Según la invención, el antígeno es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34 o un fragmento de la misma que comprende un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, o una porción inmunogénica de la misma. Este concepto es aplicable a otros antígenos polipeptídicos descritos en el presente documento, incluidos, pero sin limitarse a, los antígenos polipeptídicos SP1500, SP0346, SP1386, SP0084, SP1479 y SP2145, y cualquiera de los antígenos polipeptídicos enumerados en la Tabla 1.

El término "antígeno neumocócico" se refiere a un antígeno que provoca una respuesta inmunitaria específica del antígeno contra cualquier organismo del género neumocócico, tal como un organismoStreptococcus pneumoniae,etc. En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico provoca una respuesta inmunitaria específica de antígeno contra organismos de S.pneumoniaede múltiples especies. Los antígenos neumocócicos incluyen polipéptidos de longitud completa codificados por genes neumocócicos que se muestran en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1-76), así como porciones inmunogénicas de los polipéptidos que se muestran en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 153-234).

El término "composición inmunogénica" como se emplea en el presente documento se refiere a una composición que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria de anticuerpos o celular, cuando se administra a un sujeto. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un antígeno polipeptídico o peptídico. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden ser inmunoprotectoras o terapéuticas o no. Cuando las composiciones inmunogénicas de la presente invención previenen, mejoran, mitigan o eliminan la enfermedad del sujeto, la composición inmunogénica puede denominarse opcionalmente vacuna. Sin embargo, como se emplea en el presente documento, no se pretende que el término composición inmunogénica se limite a vacunas. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un ácido nucleico que codifica un antígeno polipeptídico o peptídico. Una composición inmunogénica puede incluir moléculas que inducen una respuesta inmunitaria contra múltiples antígenos.

El término "anticuerpo", como se emplea en el presente documento, se refiere a cualquier inmunoglobulina, ya sea natural o producida total o parcialmente sintéticamente. Todos sus derivados que mantienen una capacidad de unión específica también se incluyen en el término. El término también cubre cualquier proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo o en gran medida homólogo a un dominio de unión de inmunoglobulina. Tales proteínas se pueden obtener de fuentes naturales o se pueden producir total o parcialmente de forma sintética. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede ser miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluida cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Como se emplean en el presente documento, los términos "fragmento de anticuerpo" o "porción característica de un anticuerpo" se utilizan indistintamente y se refieren a cualquier derivado de un anticuerpo que tenga menos de su longitud completa. En general, un fragmento de anticuerpo conserva al menos una parte significativa de la capacidad de unión específica del anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dianticuerpo dsFv y Fd. El fragmento de anticuerpo puede producirse por cualquier medio. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede producirse enzimática o químicamente mediante fragmentación de un anticuerpo intacto y/o puede producirse de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia parcial del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, el fragmento de anticuerpo puede producirse total o parcialmente de forma sintética. El fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. Alternativa o adicionalmente, el fragmento de anticuerpo puede comprender múltiples cadenas que están unidas entre sí, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro. El fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un complejo multimolecular. El fragmento de anticuerpo funcional comprenderá típicamente al menos aproximadamente 50 aminoácidos y más típicamente comprenderá al menos aproximadamente 200 aminoácidos.

Los términos "linfocito T citotóxico" o "CTL" se refieren a linfocitos que inducen la muerte mediante apoptosis u otros mecanismos en las células diana. Los CTL forman productos conjugados específicos de antígeno con células diana mediante la interacción de los TCR con el antígeno (Ag) procesado sobre las superficies de las células diana, lo que da como resultado la apoptosis de la célula elegida como diana. Los cuerpos apoptóticos son eliminados por los macrófagos. El término "respuesta CTL" se utiliza para referirse a la respuesta inmunitaria primaria mediada por células CTL.

Los términos "inmunidad mediada por células" o "CMI" como se emplean en el presente documento se refieren a una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos o complemento, sino que implica la activación de, p. ej., macrófagos, células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos específicas de antígeno (células T), células T colaboradoras, neutrófilos y la liberación de diversas citocinas en respuesta a un antígeno diana. Dicho de otra manera, CMI se refiere a células inmunitarias (tales como células T y otros linfocitos) que se unen a la superficie de otras células que presentan un antígeno diana (tales como células presentadoras de antígenos (APC)) y desencadenan una respuesta. La respuesta puede implicar a otros linfocitos y/o cualquiera de los otros glóbulos blancos (leucocitos) y la liberación de citocinas. La inmunidad celular protege el organismo mediante: (i) la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno que pueden destruir las células del organismo que muestran epítopos de antígenos foráneos sobre su superficie, tales como células infectadas por virus y células con bacterias intracelulares; (2) la activación de macrófagos y células NK, permitiéndoles destruir patógenos intracelulares; y (3) la estimulación de células para que secreten una variedad de citocinas o quimiocinas que influyen en la función de otras células tales como células T, macrófagos o neutrófilos implicados en las respuestas inmunitarias adaptativas y las respuestas inmunitarias innatas.

El término "célula inmunitaria", como se emplea en el presente documento, se refiere a cualquier célula que pueda liberar una citocina, quimiocina o anticuerpo en respuesta a una estimulación antigénica directa o indirecta. En el término "células inmunitarias" del presente documento se incluyen linfocitos, incluidas células asesinas naturales (NK), células T (células CD4+ y/o CD8+), células B, macrófagos; leucocitos; células dendríticas; mastocitos; monocitos; y cualquier otra célula que sea capaz de producir una molécula de citocina o quimiocina en respuesta a una estimulación antigénica directa o indirecta. Típicamente, una célula inmunitaria es un linfocito, por ejemplo, una célula T linfocítica.

El término "citocina", como se emplea en el presente documento, se refiere a una molécula liberada por una célula inmunitaria en respuesta a la estimulación con un antígeno. Los ejemplos de tales citocinas incluyen, pero sin limitarse a: GM-CSF; IL-1 a; IL-1 p; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-17A, IL-17F u otros miembros de la familia IL-17, IL-22, IL-23, If N-y ; IFN-p; IFN-a; MIP-1a; MIP-1 p ; TGF-a; TNFα^ o TNFp. El término "citocina" no incluye anticuerpos.

El término”in vitro”como se emplea en el presente documento se refiere a eventos que ocurren en un ambiente artificial, p. ej., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo (p. ej., animal, planta y/o microbio).

Como se emplea en el presente documento, el término”en vivo”se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo (p. ej., animal, planta y/o microbio).

El término "aislado", como se emplea en el presente documento, significa que la entidad aislada ha sido separada de al menos un componente con el que estaba asociada previamente. Cuando se han eliminado la mayoría de los demás componentes, la entidad aislada se "purifica". El aislamiento y/o la purificación y/o la concentración se pueden realizar utilizando cualquier mecanismo conocido en la técnica incluyendo, por ejemplo, cromatografía, fraccionamiento, precipitación u otra separación.

El término "adyuvante" como se emplea en el presente documento se refiere a cualquier agente o entidad que aumenta la respuesta antigénica (p. ej., respuesta inmunitaria) de una célula o un sujeto a un antígeno diana. En algunas realizaciones, se utiliza un adyuvante para mejorar una respuesta inmunitaria a un antígeno peptídico administrado a un sujeto. En algunas realizaciones, se utiliza un adyuvante para mejorar una respuesta inmunitaria a un antígeno codificado por un ácido nucleico administrado a un sujeto.

Como se emplea en el presente documento, el término "patógeno" se refiere a un organismo o molécula que causa una enfermedad o trastorno en un sujeto. Por ejemplo, los patógenos incluyen, pero sin limitarse a, virus, hongos, bacterias, parásitos y otros organismos infecciosos o moléculas de los mismos, así como organismos macroscópicos taxonómicamente relacionados dentro de las categorías de algas, hongos, levaduras y protozoos o similares.

Como se emplea en el presente documento, el término "patógeno procariótico" se refiere a un patógeno bacteriano.

Como se emplea en el presente documento, el término "patógeno viral" se refiere a un virus que causa dolencias o enfermedades, tales como VIH.

Como se emplea en el presente documento, el término "patógeno parásito" se refiere a un microorganismo que es parásito, que reside durante un período prolongado dentro de una célula anfitriona u organismo anfitrión que obtiene beneficios del anfitrión y al mismo tiempo causa dolencias o enfermedades. Los patógenos parásitos pueden ser bacterias, virus, hongos, y parásitos y protistas.

Los términos "fragmento funcional" o "porción" como se emplean en el contexto de un fragmento funcional de un inmunógeno de la proteína "x" (p. ej., un antígeno o inmunógeno neumocócico enumerado en la Tabla 1) se refieren a un fragmento de tal proteína o péptido que media, efectúa o provoca una respuesta inmunitaria celular y/o humoral similar a la proteína o péptido de los que se obtienen (p. ej., un fragmento de los mismos). Por consiguiente, el término "funcional" cuando se emplea junto con "derivado" o "variante" o "fragmento" se refiere a un polipéptido que posee una actividad biológica que es sustancialmente similar a una actividad biológica de la entidad o molécula de la que es derivado o variante o fragmento del mismo. Por "sustancialmente similar" en este contexto se entiende que se retiene al menos 25%, al menos 35%, al menos 50% de la actividad biológica relevante o deseada de un péptido de tipo salvaje correspondiente. En el caso de un fragmento de un antígeno neumocócico, tal como por ejemplo, SP0785 (p. ej., SEQ ID NO: 34), un fragmento funcional de SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 190 sería una proteína o péptido que comprendiera un porción de SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 190 que conservara una actividad para provocar una respuesta de IL-17A en esplenocitos o PMBC humanas, y protegiera contra la colonización por organismos neumocócicos; preferiblemente el fragmento de SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 190 conserva al menos 25%, al menos 35%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 100% o incluso más (es decir, la variante o derivado tienen mayor actividad que el tipo salvaje), p. ej., al menos 110%, al menos 120% o más actividad en comparación con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 190 de longitud completa para provocar una respuesta de IL-17A en esplenocitos o PMBC humanas y proteger contra la colonización por neumococo. Tales fragmentos funcionales de los inmunógenos (p. ej., antígenos) enumerados en la Tabla 1 pueden evaluarse mediante los ensayos divulgados en los Ejemplos, p. ej., para evaluar si un fragmento funcional provoca una respuesta de IL-17A en esplenocitos de ratón o PBMC humanasin vitrocomo se divulga en el Ejemplo 2, o protege de la colonizaciónin vivoen un modelo de colonización de ratón, donde los ratones se sensibilizan con un serotipo de cepa neumocócica (p. ej., serotipos 6B, 14F o 19F) después de una inmunización quincenal con un antígeno neumocócico (o fragmento funcional), y se evalúa la presencia de colonización neumocócica en la nasofaringe, como se divulga en el Ejemplo 3.

Un "fragmento" de un antígeno o inmunógeno de la Tabla 1, como se emplea ese término en el presente documento, tendrá al menos 15 aminoácidos de longitud y puede tener, p. ej., al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20 o al menos 25 aminoácidos o más inclusive.

El término "linfocito T citotóxico" o "CTL" se refiere a linfocitos que inducen la apoptosis en células diana. Los CTL forman productos conjugados específicos de antígeno con células diana mediante la interacción de los TCR con el antígeno (Ag) procesado sobre las superficies de las células diana, lo que da como resultado la apoptosis de la célula elegida como diana. Los cuerpos apoptóticos son eliminados por los macrófagos. El término "respuesta de CTL" se utiliza para referirse a la respuesta inmunitaria primaria mediada por células CTL.

Los términos "inmunidad mediada por células" o "CMI" como se emplean en el presente documento se refieren a una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos o complemento, sino que implica la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (células T), y la liberación de diversas citocinas en respuesta a un antígeno diana. Dicho de otra manera, CMI se refiere a células inmunitarias (tales como células T y linfocitos) que se unen a la superficie de otras células que presentan el antígeno (tales como las células presentadoras de antígeno (APS)) y desencadenan una respuesta. La respuesta puede implicar a otros linfocitos y/o cualquiera de los otros glóbulos blancos (leucocitos) y la liberación de citocinas. En consecuencia, la inmunidad mediada por células (CMI) es una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos, sino que implica la activación de macrófagos y células NK, la producción de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y la liberación de varias citocinas en respuesta a un antígeno. La inmunidad celular protege al organismo mediante: (i) la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno que son capaces de destruir las células del organismo que muestran epítopos de antígenos foráneos sobre su superficie, tales como células infectadas por virus, células con bacterias intracelulares y células cancerosas que presentan antígenos tumorales; (2) la activación de macrófagos y células NK, permitiéndoles destruir patógenos intracelulares; y (3) la estimulación de células para que secreten una variedad de citocinas que influyen en la función de otras células implicadas en las respuestas inmunitarias adaptativas y las respuestas inmunitarias innatas. Sin desear vincularse a la teoría y a modo de antecedentes, el sistema inmunitario se separó en dos ramas: la inmunidad humoral, para la cual la función protectora de la inmunización se podía encontrar en el humor (fluido corporal libre de células o suero) y la inmunidad celular, para la cual la función protectora de la inmunización se asoció con las células.

El término "célula inmunitaria", como se emplea en el presente documento, se refiere a cualquier célula que pueda liberar una citocina en respuesta a una estimulación antigénica directa o indirecta. En el término "células inmunitarias" del presente documento se incluyen linfocitos, incluidas células asesinas naturales (NK), células T (células CD4+ y/o CD8+), células B, macrófagos y monocitos, células Th; células Th1; células Th2; células Tc; células estromales; células endoteliales; leucocitos; células dendríticas; macrófagos; mastocitos y monocitos y cualquier otra célula que sea capaz de producir una molécula de citocina en respuesta a una estimulación antigénica directa o indirecta. Típicamente, una célula inmunitaria es un linfocito, por ejemplo, una célula T linfocítica.

El término "ácido nucleico" como se emplea en el presente documento, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o se puede incorporar a una cadena de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o se puede incorporar a una cadena de oligonucleótidos mediante un enlace fosfodiéster. Como se emplean en el presente documento, los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" se pueden utilizar indistintamente. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" abarca ARN, así como ADN y/o ADNc de hebra sencilla y/o doble. Además, los términos "ácido nucleico", "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen una cadena principal distinta de fosfodiéster. El término "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y/o codifican la misma secuencia de aminoácidos. Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse utilizando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse químicamente, etc. Cuando sea apropiado, p. ej., en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos tales como análogos que tienen bases químicamente modificadas o azúcares, modificaciones del esqueleto, etc. Una secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario.

El término "polipéptido", como se emplea en el presente documento, generalmente tiene su significado reconocido en la técnica de un polímero de al menos tres aminoácidos. Sin embargo, el término también se utiliza para referirse a clases específicas de polipéptidos antigénicos, tales como, por ejemplo, polipéptidos SP0785, polipéptidos SP1500, polipéptidos SP0346, polipéptidos SP1386, polipéptidos SP0084, polipéptidos SP1479 y polipéptidos SP2145. Para cada una de estas clases, la presente memoria descriptiva varios ejemplos de secuencias conocidas de tales polipéptidos. Los expertos en la técnica apreciarán, sin embargo, que se pretende que el término "polipéptido", como se emplea en el presente documento para referirse a "antígeno polipeptídico", sea lo suficientemente general como para abarcar no sólo polipéptidos que tienen una secuencia enumerada en el presente documento, sino también para abarcar polipéptidos que tienen una variación de la secuencia que provoca una respuesta específica de antígeno al polipéptido. Por ejemplo, un "polipéptido SP0785" incluye el polipéptido SP0785 mostrado en SEQ ID NO:34, así como polipéptidos que tienen variaciones de una secuencia SEQ ID NO:34, tales como por ejemplo, un fragmento de SP0785 como se muestra en SEQ ID NO:34. NO: 190, y que mantienen la capacidad de provocar una respuesta específica de antígeno a un polipéptido de SEQ ID NO:34. Los expertos en la técnica entienden que las secuencias de proteínas generalmente toleran alguna sustitución sin destruir la inmunogenicidad y la especificidad del antígeno. Por tanto, cualquier polipéptido que conserve inmunogenicidad y comparta al menos aproximadamente 30-40% de identidad de secuencia global, a menudo más de aproximadamente 50%, 60%, 70% u 80%, y que adicionalmente incluya habitualmente al menos una región de identidad mucho mayor, a menudo superior a 90% o incluso a 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en una o más regiones altamente conservadas, que generalmente abarcan al menos 3-4 y a menudo hasta 20 o más aminoácidos, con otro polipéptido de la misma clase, está incluido dentro del término relevante "polipéptido" como se emplea en el presente documento. Los expertos en la técnica pueden determinar otras regiones de similitud y/o identidad mediante el análisis de las secuencias de diversos polipéptidos presentados en el presente documento. Véase la definición de antígeno. Se apreciará que las proteínas o polipéptidos a menudo contienen aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos comúnmente denominados 20 aminoácidos naturales, y que muchos aminoácidos, incluidos los aminoácidos terminales, pueden modificarse en un polipéptido dado, ya sea mediante procesos naturales tales como glicosilación y otras modificaciones postraduccionales, o mediante mecanismos de modificación química que son bien conocidos en la técnica. Las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitarse a, acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación, glicación, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación.

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que describen Altschul et al., en Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977. BLAST se utiliza, con los parámetros descritos en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y las proteínas de la presente divulgación. El soporte lógico para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (disponible en la siguiente dirección de Internet: ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de puntuación alta (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., más arriba). Estas coincidencias iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre>0) y N (puntuación de penalización por restos no coincidentes; siempre<0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa cae en una cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos con puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915 (1989)) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor que aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.

El término "sujeto" utilizado indistintamente en el presente documento con "paciente" o "individuo" se refiere a cualquier organismo al que se puede administrar una composición de esta divulgación, p. ej., con fines experimentales, de diagnóstico y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos, animales domésticos y seres humanos. En algunas realizaciones, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal en el que sea útil provocar una respuesta inmunitaria. El sujeto puede ser un animal salvaje, doméstico, comercial o de compañía tal como un ave o un mamífero. El sujeto puede ser un ser humano. Aunque en una realización de la divulgación se contempla que las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento también pueden ser adecuadas para el tratamiento terapéutico o preventivo en seres humanos, también es aplicable a vertebrados de sangre caliente, p. ej., mamíferos, tales como primates no humanos, (particularmente primates superiores), ovejas, perros, roedores (p. ej., ratón o rata), cobayas, cabras, cerdos, gatos, conejos, vacas y no mamíferos tales como pollos, patos o pavos. En otra realización, el sujeto es un animal salvaje, por ejemplo, un ave tal como para el diagnóstico de la gripe aviar. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal de experimentación o un sustituto animal como modelo de enfermedad. El sujeto puede ser un sujeto que necesita tratamiento veterinario, donde provocar una respuesta inmunitaria a un antígeno es útil para prevenir una enfermedad y/o controlar la propagación de una enfermedad, por ejemplo, SIV, STL1, SFV, o en el caso del ganado, la fiebre aftosa o, en el caso de las aves, la enfermedad de Marek o la gripe aviar, y otras enfermedades similares.

El término "recombinante" cuando se utiliza para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, viral, semisintético y/o sintético, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con todo o una parte de las secuencias de polinucleótidos con las que está asociado en la naturaleza. El término recombinante, como se emplea con respecto a un péptido, polipéptido, proteína o proteína de fusión recombinante, significa un polipéptido producido por expresión a partir de un polinucleótido recombinante. El término recombinante utilizado con respecto a una célula anfitriona significa una célula anfitriona en la que se ha introducido un polinucleótido recombinante. Recombinante también se utiliza en el presente documento para referirse, con referencia a material (p. ej., una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector), que el material ha sido modificado mediante la introducción de un material heterólogo (p. ej., una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector).

El término "vectores" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar o mediar la expresión de un ácido nucleico heterólogo al que se ha unido a una célula anfitriona; un plásmido es una especie del género abarcado por el término "vector". El término "vector" típicamente se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación y otras entidades necesarias para la replicación y/o el mantenimiento en una célula anfitriona. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes y/o secuencias de ácidos nucleicos a los que están conectados operativamente se denominan en el presente documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad suelen tener la forma de "plásmidos" que se refieren a moléculas circulares de ADN de doble hebra que, en su forma de vector, no están unidas al cromosoma, y típicamente comprenden entidades para la expresión estable o transitoria del ADN codificado. Otros vectores de expresión que se pueden utilizar en los métodos divulgados en el presente documento incluyen, pero sin limitarse a, plásmidos, episomas, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, bacteriófagos o vectores virales, y tales vectores pueden integrarse en el genoma del anfitrión o replicarse de forma autónoma en la célula concreta. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. También se pueden utilizar otras formas de vectores de expresión conocidas por los expertos en la técnica que cumplen funciones equivalentes, por ejemplo, vectores extracromosómicos autorreplicantes o vectores que se integran en un genoma anfitrión. Los vectores preferidos son aquellos susceptibles de replicación y/o expresión autónoma de los ácidos nucleicos a los que están conectados.

Un individuo que "sufre" una enfermedad, trastorno y/o afección ha sido diagnosticado o muestra uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección.

Un individuo que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno y/o afección no ha sido diagnosticado y/o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, una enfermedad, trastorno y/o afección están asociados con una infección neumocócica. Sin desear vincularse a la teoría, S.pneumoniaees responsable de 15-50% de todos los episodios de neumonía adquirida en la comunidad, de 30-50% de todos los casos de otitis media aguda y de una proporción significativa de bacteriemia y meningitis bacteriana. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una infección neumocócica puede estar expuesto a un neumococo (p. ej., por ingestión, inhalación, contacto físico, etc.). En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una infección neumocócica puede estar expuesto a un individuo que está infectado con el microbio. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una infección neumocócica es aquel que se encuentra en un lugar donde el microbio es prevalente (p. ej., alguien que viaja a un lugar donde el microbio es prevalente). En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una infección neumocócica lo es debido a su corta edad (p. ej., un niño, adolescente o adulto joven). En algunas realizaciones, un sujeto que es susceptible a la infección neumocócica es un sujeto con síndrome de Job (un sujeto que carece de respuesta mediada por células Th-17) o un sujeto agammaglobunémico (un sujeto que carece de respuesta mediada por anticuerpos). En algunas realizaciones, un sujeto que es susceptible es un sujeto cuyo sistema inmunológico está comprometido, tal como aquellos que viven con VIH, o tienen una enfermedad autoinmunitaria, o tienen influenza. En algunas realizaciones, un sujeto que es susceptible a una infección neumocócica es un sujeto que tiene otros factores de riesgo, tales como, pero sin limitarse a, hábito de fumar, uso de drogas inyectables, hepatitis C y EPOC. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se emplea en el presente documento, significa una cantidad de un agente terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico (p. ej., composición inmunogénica) que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, aliviar, mejorar, mitigar, aliviar los síntomas, prevenir, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de la enfermedad, trastorno y/o afección.

El término "agente terapéutico" como se emplea en el presente documento se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado.

El término "tratar", como se emplea en el presente documento, se refiere a aliviar, mejorar, mitigar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características parcial o completamente de una enfermedad, trastorno y/o afección particular. Por ejemplo, "tratar" una infección microbiana puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento y/o la propagación del microbio. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección y/o a un sujeto que muestra sólo signos tempranos de una enfermedad, trastorno y/o afección con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende el suministro de una composición inmunogénica (p. ej., una vacuna) a un sujeto.

El término "vacuna" como se emplea en el presente documento se refiere a una entidad que comprende al menos un componente inmunogénico (p. ej., un componente inmunogénico que incluye un péptido o proteína, y/o un componente inmunogénico que incluye un ácido nucleico). En ciertas realizaciones, una vacuna incluye al menos dos componentes inmunogénicos. En algunas realizaciones, una vacuna es capaz de estimular una respuesta inmunitaria tanto de células T como de células B. En algunas realizaciones, se puede utilizar cualquier ensayo disponible en la técnica para determinar si se han estimulado las células T y/o las células B. En algunas realizaciones, la estimulación de las células T se puede analizar controlando la producción de citocinas inducida por antígenos, la proliferación de células T inducida por antígenos y/o los cambios en la expresión de proteínas inducidos por antígenos. En algunas realizaciones, la estimulación de las células B se puede analizar controlando los títulos de anticuerpos, las afinidades de los anticuerpos, el rendimiento de los anticuerpos en ensayos de neutralización, la recombinación de cambio de clase, la maduración de la afinidad de los anticuerpos específicos de antígeno, el desarrollo de células B de memoria, el desarrollo de células plasmáticas de larga vida que pueden producir grandes cantidades de anticuerpos de alta afinidad durante períodos de tiempo prolongados, reacciones del centro germinal y/o rendimiento de los anticuerpos en ensayos de neutralización. En algunas realizaciones, una vacuna incluye adicionalmente al menos un adyuvante que puede ayudar a estimular una respuesta inmunitaria en células T y/o células B.

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos y composiciones que pueden administrarse a mamíferos sin toxicidad indebida. El término "portadores farmacéuticamente aceptables" excluye el medio de cultivo de tejidos. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a, sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares, y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica.

El término "tipo salvaje", como se emplea en el presente documento, se refiere a la forma típica o más común que existe en la naturaleza o como existe normalmentein vivo.

El término "mutante" se refiere a un organismo o célula con cualquier cambio en su material genético, en particular un cambio (es decir, deleción, sustitución, adición o alteración) con respecto a una secuencia de polinucleótidos de tipo salvaje o cualquier cambio con respecto a una secuencia de proteínas de tipo salvaje. El término "variante" puede utilizarse indistintamente con "mutante". Aunque a menudo se supone que un cambio en el material genético da como resultado un cambio de la función de la proteína, los términos "mutante" y "variante" se refieren a un cambio en la secuencia de una proteína de tipo salvaje independientemente de si ese cambio altera la función de la proteína (p. ej., aumenta, disminuye, confiere una nueva función), o de si ese cambio no tiene ningún efecto sobre la función de la proteína (p. ej., la mutación o variación es silenciosa).

El término "reducido" o "reducir" o "disminución" como se emplea en el presente documento generalmente significa una disminución en una cantidad estadísticamente significativa con respecto a una referencia. Para evitar dudas, "reducido" significa una disminución estadísticamente significativa de al menos 10% en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo una disminución de al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, al menos 90% o más, hasta e incluyendo una disminución de 100% (es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia), o cualquier disminución entre 10-100% en comparación con un nivel de referencia, tal como se define ese término en el presente documento.

El término "bajo", como se emplea en el presente documento, generalmente significa inferior en una cantidad estáticamente significativa; Para evitar dudas, "bajo" significa un valor estadísticamente significativo al menos 10% inferior a un nivel de referencia, por ejemplo un valor al menos 20% inferior a un nivel de referencia, al menos 30% inferior a un nivel de referencia, al menos 40% inferior de un nivel de referencia, al menos 50% inferior de un nivel de referencia, al menos 60% inferior de un nivel de referencia, al menos 70% inferior de un nivel de referencia, al menos 80% inferior de un nivel de referencia, al menos 90% inferior de un nivel de referencia, hasta e incluyendo un 100% inferior de un nivel de referencia (es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia).

Los términos "aumentado" o "aumento" como se emplean en el presente documento generalmente significan un aumento en una cantidad estáticamente significativa; tal como un aumento estadísticamente significativo de al menos 10% en comparación con un nivel de referencia, incluido un aumento de al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100% o más, inclusive, incluyendo, por ejemplo, un aumento de al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o más en comparación con un nivel de referencia, como se define ese término en el presente documento.

El término "alto", como se emplea en el presente documento, generalmente significa un valor superior en una cantidad estáticamente significativa con respecto a una referencia; tal como un valor estadísticamente significativo al menos 10% superior a un nivel de referencia, por ejemplo al menos 20% superior, al menos 30% superior, al menos 40% superior, al menos 50% superior, al menos 60% superior, al menos 70% superior, al menos 80% superior, al menos 90% superior, al menos 100% superior, inclusive, como por ejemplo al menos 2 veces superior, al menos 3 veces superior, al menos 4 veces superior, al menos 5 veces superior, al menos 10 veces superior o más, en comparación con un nivel de referencia.

Como se emplea en el presente documento y en las reivindicaciones, las formas singulares incluyen la referencia plural y viceversa, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aparte de los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, se debe entender que todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en el presente documento están modificados en todos los casos por el término "aproximadamente".

Como se emplean en el presente documento, los términos "aproximadamente" o "alrededor de" en referencia a un número generalmente se consideran números que se encuentran dentro de un rango de 5%, 10%, 15% o 20% en cualquier dirección (mayor o menor que) del número a menos que se indique lo contrario o resulte evidente del contexto (excepto cuando tal número sea inferior a 0% o exceda 100% de un valor posible).

Como se emplea en el presente documento, el término "que comprende" significa que también pueden estar presentes otros elementos además de los elementos definidos presentados. El uso de "que comprende" indica inclusión más que limitación.

El término "que consiste en" se refiere a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos como se describe en el presente documento, que excluyen cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realización.

Como se emplea en el presente documento, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a aquellos elementos necesarios para una realización determinada. El término permite la presencia de elementos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas o funcionales de esa realización de la invención.

Todas las patentes y otras publicaciones identificadas tienen el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que podrían utilizarse con relación a la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este sentido debe interpretarse como una admisión de que los autores de la presente invención no tienen derecho a anteceder tal divulgación en virtud de una invención anterior o por cualquier otro motivo. Todas las declaraciones sobre la fecha o representación sobre el contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión sobre la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que los comúnmente entendidos por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se puede utilizar cualquier método, dispositivo y material conocido en la práctica o prueba de la invención, los métodos, dispositivos y materiales a este respecto se describen en el presente documento.

Antígenos neumocócicos

Los autores de la presente invención han demostrado previamente que un mecanismo de protección contra la colonización neumocócica era el uso de una WCV (vacuna de células completas) que confiere protección contra la colonización y la enfermedad invasiva en ratones (Malley et al., 69 Infect. Immun. 4870-73 (2001); Malley et al., 74 Infect. Immun. 4290-92 (2004)). Anteriormente se demostró que la protección contra la colonización después de la inmunización con WCV (vacuna de células completas) es independiente de los anticuerpos y dependiente de las células T CD4+ (Malley et al., 102 P.N.A.S. USA 102,4848-53 (2005); Trzcinski et al., 73 Infect. Immun. 7043-46 (2005)). La célula T efectora es la célula TH17 CD4+, que con la neutralización de la respuesta de IL-17A con un anticuerpo anti-IL-17A disminuyó la protección de WCV, y los ratones con el gen del receptor de IL-17A inactivado no están protegidos por la WCV. Por el contrario, los ratones con deficiencia de IFN-gamma o IL-4 (que están desviados de las respuestas TH1 o TH2, respectivamente) están completamente protegidos. Lu et al., 4 PLoS Pathogens. e1000159 (2008)). Se ha informado de que las ratas y ratones inmunizados con WCV están significativamente protegidos contra la sepsis neumocócica en dos modelos de neumonía (Malley et al., 2001).

Utilizando análisis bioinformáticos como se divulga en el presente documento, los autores de la presente invención han identificado antígenos neumocócicos específicos que se enumeran en la Tabla 1 que protegen contra la colonización e infección neumocócica, tal como contra la infección por sepsis neumocócica. Estos antígenos neumocócicos enumerados en la Tabla 1 se pueden administrar como vacunas, en presencia o ausencia de un adyuvante, para provocar una respuesta sistémica de IL-17A y reducir o proteger contra la colonización neumocócica intranasal. En algunas realizaciones, se puede administrar un antígeno neumocócico de cualquiera de los enumerados en la Tabla 1 como vacunas a través de la mucosa para proteger contra la colonización neumocócica intranasal, así como contra la infección neumocócica, tal como la sepsis.

Tabla 1. La Tabla 1 enumera los números de identificación de la secuencia de aminoácidos de los inmunógenos neumocócicos. Las secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de los antígenos neumocócicos están disponibles en la red informática mundial: "xbase.ac.uk/genome/streptococcus-pneumoniaetigr4/NC_003028/features?page=1''.

En algunos casos, el otro antígeno de S.pneumoniaeapropiado tiene al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la correspondiente proteína de S.pneumoniaede tipo salvaje divulgada en la Tabla 1. Se conocen las secuencias de los polipéptidos mencionados anteriormente y los ácidos nucleicos que los codifican; véase, por ejemplo, la secuencia completa del genoma de S.pneumoniaeATCC 700669 con el número de acceso de GenBank FM211187.1 y las secuencias de polipéptidos vinculadas.

Además de los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en la Tabla 1 anterior, esta solicitud también proporciona composiciones inmunogénicas que incluyen uno o más de los polipéptidos o genes enumerados en la Tabla 2, o variantes o fragmentos de los mismos como se describe en el presente documento. La secuencia de ADN y proteína de cada gen y proteína se puede encontrar buscando Locus Tag en la base de datos disponible públicamente, Entrez Gene, como se describió anteriormente.

La presente divulgación proporciona composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden al menos un antígeno de neumococo aislado seleccionado entre las proteínas neumocócicas SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218, o fragmentos de las mismas. En algunas realizaciones, el antígeno neumocócico tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera o una combinación de SEQ ID NO: 1-76, o fragmentos funcionales de las mismas. En algunas realizaciones, el antígeno de neumococo correspondiente a SEQ ID NO: 1-76 está codificado por ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 77-152. En algunas realizaciones, se incluyen fragmentos del antígeno neumocócico para su uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento, por ejemplo, antígenos de neumococo correspondientes a SEQ ID NO: 153-234 como se divulga en la Tabla 1. Se incluyen otros fragmentos funcionales de los antígenos de neumococo para su uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento, y pueden ser evaluados por un experto en la técnica para evaluar si proporcionan protección contra la colonización por neumococos, según los métodos divulgados en el Ejemplo 3 en el presente documento. Un fragmento funcional de un antígeno neumocócico de SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234 también puede ser evaluado por un experto en la técnica para determinar la protección contra una enfermedad invasiva, tal como sepsis de acuerdo con los métodos divulgados en los Ejemplos 4 y 5, en particular cuando se utiliza solo o como parte de una proteína de fusión con PdT. En algunas realizaciones, un fragmento funcional de un antígeno neumocócico de SEQ Id NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234 también puede ser evaluado por un experto en la técnica para determinar la protección contra S.typhisegún los métodos divulgados en el Ejemplo 5, en particular cuando se utiliza solo o como parte de una proteína de fusión con PdT y/o fusionado a Vi.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende al menos un antígeno neumocócico aislado seleccionado entre uno cualquiera o una combinación de los antígenos neumocócicos con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234. En algunas realizaciones, los antígenos neumocócicos son las proteínas neumocócicas de longitud completa SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218. En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico comprende una proteína neumocócica que carece de una secuencia señal y/o dominio transmembrana. En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico comprende una mezcla de proteínas neumocócicas de longitud completa y fragmentos resultantes del procesamiento, o procesamiento parcial de una secuencia señal por un anfitrión de expresión, p. ej.,E. co lio una línea celular de insecto (p. ej., el sistema de expresión de baculovirus), o una línea celular de mamífero (p. ej., ovario de hámster chino (CHO) o humano). Como se emplean en el presente documento, los términos "porción" y "fragmento" o equivalentes gramaticales se utilizan indistintamente.

En algunas realizaciones, los antígenos neumocócicos son un fragmento de las proteínas neumocócicas de longitud completa SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218, por ejemplo, al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de tales. En algunas realizaciones, el fragmento de la proteína neumocócica de longitud completa corresponde a SEQ ID NO: 153-234. En algunas realizaciones, un fragmento de una proteína neumocócica es un fragmento funcional de cualquiera de SEQ ID NO: 153-234, por ejemplo, al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 consecutivos aminoácidos de antígenos neumocócicos correspondientes a SEQ ID NO: 153-234.

En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99%) idéntica en 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de las proteínas neumocócicas SP0010, SP0043, SP0079, SP0084, SP0092, SP0098, SP0106, SP0107, SP0127, SP0149, SP0191, SP0198, SP0249, SP0321, SP0346, SP0402, SP0453, SP0564, SP0582, SP0589, SP0601, SP0604, SP0617, SP0620, SP0629, SP0648, SP0659, SP0662, SP0664, SP0678, SP0724, SP0742, SP0757, SP0785, SP0787, SP0872, SP0878, SP0899, SP1002, SP1026, SP1032, SP1069, SP1154, SP1267, SP1376, SP1386, SP1404, SP1405, SP1419, SP1479, SP1500, SP1545, SP1560, SP1624, SP1652, SP1683, SP1826, SP1872, SP1891, SP1897, SP1942, SP1966, SP1967, SP1998, SP2048, SP2050, SP2083, SP2084, SP2088, SP2145, SP2151, SP2187, SP2192, SP2197, SP2207 y SP2218, o fragmentos de las mismas, p. ej., fragmentos de antígenos neumocócicos correspondientes a SEQ ID NO: 153-234.

Los autores de la presente invención demuestran en el presente documento que el antígeno neumocócicoSP0785mostró respuesta de IL-17 a la estimulación proteica y protección contra la colonización neumocócica, y que SP0785-PdT protegió 80% de los ratones de la infección por sepsis y SP0785-PdT-Vi protegió contra la infección porSalmonella typhi.Los autores de la presente invención también demostraron que el antígeno neumocócicoSP1500provocó una respuesta de IL-17 a la estimulación proteica y protegió contra la colonización neumocócica, y también dio como resultado la protección de 50% de los ratones contra la infección neumocócica, y que el antígeno neumocócicoSP0346protegió 60% de los ratones contra la infección neumocócica y la sepsis, que los antígenos neumocócicosSP1386, SP0084ySP1479protegieron 50% de los ratones de la infección neumocócica. Los autores de la presente invención también demostraron queSP2145,cuando se conjugó con PdT (SP2145-PdT) protegió 80% de los ratones de la infección por sepsis y que SP2145-PdT-Vi protegió contra la infección S.typhi.Por consiguiente, estos antígenos proporcionan composiciones novedosas para provocar respuestas inmunitarias con el objetivo de provocar respuestas inmunitarias beneficiosas, p. ej., para proteger contra infecciones neumocócicas y patógenos asociados. Estos antígenos proporcionan dianas novedosas para caracterizar las infecciones neumocócicas y las respuestas inmunitarias a las infecciones neumocócicas.

Por consiguiente, la divulgación proporciona una composición inmunogénica (p. ej., vacuna) que comprende un antígeno neumocócico aislado seleccionado entre un antígeno polipeptídicoSP0785, un antígeno polipeptídicoSP1500, un antígeno polipeptídicoSP0346, un antígeno polipeptídicoSP1386, un antígeno polipeptídicoSP0084, un antígeno polipeptídicoSP1479, un antígeno polipeptídicoSP2145, y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico neumocócicoSP0785. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0785 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SP0785. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0785 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID<n>O:34. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0785 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:35. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico SP0785 está codificado por SEQ ID NO: 110 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el fragmento funcional de un antígeno polipeptídico neumocócico SP0785 comprende aminoácidos de SEQ ID NO: 190 o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en S<e>Q ID NO: 190. Según la invención, la composición inmunogénica comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34 o un fragmento de la misma que comprende un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, o una porción inmunogénica de la misma.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico neumocócico SP1500. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1500 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SP1500. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1500 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID<n>O:51. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1500 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:51. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico SP1500 está codificado por SEQ ID NO: 127 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el fragmento funcional de un antígeno polipeptídico neumocócico SP1500 comprende aminoácidos de SEQ ID NO: 209 o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntico a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en S<e>Q ID NO:209.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico neumocócico SP0346. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0346 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SP0346. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0346 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:15. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0346 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:15. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico SP0346 está codificado por SEQ ID NO: 91 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el fragmento funcional de un antígeno polipeptídico neumocócico SP0346 comprende aminoácidos de SEQ ID NO: 166 o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en S<e>Q ID NO: 166.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico neumocócico SP1386. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1386 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SP1386. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1386 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID<n>O:46. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1386 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico SP1386 está codificado por SEQ ID NO: 122 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el fragmento funcional de un antígeno polipeptídico neumocócico SP1386 comprende aminoácidos de SEQ ID NO: 204 o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SeQ ID NO: 204.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico neumocócico SP0084. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0084 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SP0084. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0084 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en s Eq ID NO:4. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP0084 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico SP0084 está codificado por la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 80 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el fragmento funcional de un antígeno polipeptídico neumocócico SP0084 comprende aminoácidos de SEQ ID NO: 156 o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 156.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico neumocócico SP1479. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1479 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SP1479. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1479 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID n O:50. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP1479 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:50. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico SP1479 está codificado por la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 126 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el fragmento funcional de un antígeno polipeptídico neumocócico SP1479 comprende aminoácidos de SEQ ID NO: 208 o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 208.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico neumocócico SP2145. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP2145 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de una secuencia de polipéptido SP2145. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP2145 comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en S<e>Q ID NO: 70. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico SP2145 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 70. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico SP2145 está codificado por la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 146 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el fragmento funcional de un antígeno polipeptídico neumocócico SP2145 comprende aminoácidos de SEQ ID NO: 70 o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% (p. ej., al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) idéntica a al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 aminoácidos consecutivos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 70.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende dos o más antígenos neumocócicos aislados. En algunas realizaciones, los dos o más antígenos aislados comprenden dos o más antígenos polipeptídicos seleccionados de la Tabla 1. En algunas realizaciones, los dos o más antígenos neumocócicos aislados comprenden tres o más antígenos polipeptídicos seleccionados de la Tabla 1. En algunas realizaciones, los dos o más antígenos neumocócicos aislados comprenden cuatro o más antígenos polipeptídicos seleccionados de la Tabla 1. En algunas realizaciones, los dos o más antígenos neumocócicos aislados comprenden cinco, seis, siete o más antígenos polipeptídicos seleccionados de la Tabla 1. En algunas realizaciones, los dos o más antígenos neumocócicos aislados comprenden ocho antígenos polipeptídicos seleccionados de la Tabla 1.

Los antígenos neumocócicos como se describen en el presente documento se pueden utilizar junto con otros antígenos neumocócicos tales como los conocidos en la técnica, tales como los divulgados en la patente de Estados Unidos WO/2000/037105, 7.217.791 y 7.585.669, US2006/0121058, US2012/0251577, US2011/0159040, US2012/0189649, y US20110020386. Otros antígenos de S.pneumoniaeapropiados para vacunas combinadas incluyen la Proteína A de superficie neumocócica (PspA); derivados de PspA, Proteína A de unión a colina (CbpA) y derivados de la misma; Adhesina A de superficie neumocócica (PsaA); proteasa caseinolítica; sortasa A (SrtA); adhesina RrgA asociada a pilus 1; PμmA; PrtA; PavA; Lyta; Stk-PR; PcsB; RrgB y derivados de las mismas. Para obtener más detalles, véase, p. ej., A.D Ogunniyi et al., "Protection against Streptococcus pneumoniae elicited by immunization with pneumolysin and CbpA", Infect Immun. Octubre de 2001; 69 (10):5997-6003.

Los derivados de PspA incluyen segmentos ricos en prolina con el bloque sin prolina (PR+NPB, descrito con más detalle a continuación así como por Daniels, CC et al. (2010) Infection and immunity 78:2163-72) y construcciones relacionadas que comprenden toda o un fragmento de la región rica en prolina de PspA (p. ej., regiones que contienen una o más de las secuencias PAPAP (SEQ ID NO: 262), PKP, PKEPEQ (SEQ ID NO: 402) y PEKP ( SEQ ID NO: 403) y opcionalmente que incluyen un bloque sin prolina). Un ejemplo del bloque sin prolina tiene la secuencia ilustrativa EKSADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ (SEQ ID NO: 239), que generalmente no tiene restos de prolina en una zona que de otro modo sería rica en prolina de la región no enrollada de PspA. PspA y sus derivados pueden incluir genes que expresan estructuras ricas en prolina similares (es decir, PKP, PKEPEQ (SEQ ID NO: 402) y PEKP (SEQ ID NO: 403)), con o sin NPB. Los aminoácidos en cada extremo del NPB marcan los límites de la región rica en prolina. En un ejemplo, el límite amino terminal de la región PR es DLKKAVNE (SEQ ID NO: 240), y el límite carboxi terminal es (K/G)TGW(K/G)QENGMW (SEQ ID NO: 241). Los péptidos que contienen NPB son particularmente inmunogénicos, lo que sugiere que el NPB puede ser un epítopo importante. Los polipéptidos inmunogénicos de PspA ilustrativos y sus derivados (p. ej., con y sin la estructura en bobina en espiral se describen, p. ej., en la publicación de patente internacional WO2013109995. Los polipéptidos inmunogénicos de PspA incluyen secuencias PR y NPB (PR+NPB). Los polipéptidos inmunogénicos de PspA pueden incluir sólo una secuencia PR (solo PR) y carecer de NPB.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende un antígeno polipeptídico neumocócico aislado seleccionado de la Tabla 1. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos polipeptídicos neumocócicos aislados seleccionados de la Tabla 1. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico aislado se selecciona de la Tabla 1. El antígeno se fusiona con un polipéptido heterólogo (p. ej., una etiqueta epitópica). En algunas realizaciones, una composición inmunogénica que comprende un antígeno neumocócico incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Si bien los antígenos neumocócicos se divulgan en el documento WO/2000/037105, a diferencia de la presente invención, en el documento WO/2000/037105 su capacidad para inducir una respuesta de las células Th 17 no se evaluó ni se conoció. Además, los antígenos neumocócicos también se divulgan en las solicitudes de Estados Unidos 2012/0189649 y US2012/0251577. Sin embargo, a diferencia de la presente invención, en las solicitudes '649 y '577, se utilizó una biblioteca de genoma completo en lugar de proteínas purificadas para escrutar antígenos que provocaron una respuesta de Th17, por lo que es probable que se requieran altos niveles de expresión de los antígenos para un efecto inmunogénico o para provocar una respuesta de Th17. En la presente invención, se utilizan proteínas de antígeno neumocócico purificadas y, por lo tanto, tiene la ventaja de tener un fondo muy bajo y requiere niveles de expresión más bajos de cada antígeno neumocócico para inducir un efecto inmunogénico y provocar una respuesta de Th17, como se demuestra en los ejemplos.

Los antígenos neumocócicos como se describen en el presente documento pueden prepararse utilizando tecnología de ADN recombinante, purificarse a partir de fuentes naturales o sintetizarse químicamente. En algunas realizaciones, cuando un antígeno neumocócico como se describe en el presente documento se fusiona o conjuga con PdT, PdT puede diferir en la secuencia de aminoácidos de una proteína neumolisina de S.pneumoniaede origen natural.

Los ácidos nucleicos que codifican formas truncadas y/o mutadas de un antígeno neumocócico como se describe en el presente documento se pueden preparar, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ácidos nucleicos que codifican tales proteínas se pueden elegir por tener codones, que son preferidos o no preferidos, para un sistema de expresión particular. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser uno en el que al menos un codón, preferiblemente al menos 10% o 20% de los codones se hayan alterado de modo que la secuencia esté optimizada para la expresión en células de E. coli, levadura, humanas, de insecto, o CHO.

Los ácidos nucleicos que codifican formas truncadas y/o mutadas de un antígeno neumocócico como se describe en el presente documento se pueden fusionar con secuencias de nucleótidos que codifican (1) otras proteínas neumocócicas, tales como autolisina, proteína A de superficie, neuraminidasa, producto lisado de hialuronato, proteína A de unión a colina, o (2) proteínas no neumocócicas de organismos tales como hemófilus influenza b, meningococos del grupo A, B o C, o estreptococos del grupo B. Los ácidos nucleicos que codifican tal proteína fusionada se expresan en los sistemas de expresión.

Los productos truncados de neumolisina pueden ser portadores útiles de polisacáridos, ya que los anfitriones pueden carecer de anticuerpos preexistentes contra dicho polipéptido portador. La neumolisina es un factor de virulencia en las infecciones neumocócicas y existe poca variación antigénica de la neumolisina entre neumococos con diferentes subtipos.

Un antígeno neumocócico como se describe en el presente documento, cuando se administra a un mamífero tal como un ser humano, cuando se fusiona a un polisacárido induce una respuesta inmunitaria que excede en magnitud, tipo y/o duración la respuesta inmunitaria inducida por la administración a un mamífero de sólo el componente polisacárido. En consecuencia, el componente de antígeno neumocócico debe tener una longitud suficiente para inducir tal respuesta inmunitaria mejorada. Para fragmentos de un antígeno neumocócico natural como se describe en el presente documento, los fragmentos tienen al menos 8, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 425, 450, 460, 465, 460, 465 o más aminoácidos de longitud. Para los antígenos neumocócicos, cuya secuencia varía de antígenos de S.pneumoniaede origen natural como se describe en el presente documento, el polipéptido puede ser al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más idéntico a un antígeno de S.neumococode origen natural como se describe en el presente documento en la Tabla 1.

El componente polisacárido que se puede conjugar con uno o más antígenos neumocócicos como se describe en el presente documento puede ser cualquier polisacárido capsular de S.pneumoniae,que incluye, pero sin limitarse a, cualquiera de los subtipos 1,2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 19A, 20, 22F, 23A, 23F, 24F, 27, 33F o 34. En algunas realizaciones, el polisacárido capsular se selecciona entre los subtipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F o 23F. En algunas realizaciones, el polisacárido es el serotipo 14. En otras realizaciones, el polisacárido es el serotipo 18C. Se pueden conjugar uno o más de diferentes polisacáridos capsulares con un único polipéptido o una pluralidad de polipéptidos. Por ejemplo, un producto conjugado multivalente puede incluir al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polisacáridos capsulares diferentes. Los polisacáridos se pueden conjugar con polipéptidos, por ejemplo, mediante una conexión monomérica (solo un extremo del polisacárido está anclado al polipéptido), una conexión en bucle (un único polipéptido está anclado a polisacáridos en bucle) o entrecruzado (múltiples polisacáridos anclados a múltiples polipéptidos).

Los métodos para la purificación de polipéptidos, p. ej., un antígeno neumocócico como se describe en el presente documento, pueden ser realizados por un experto en la técnica, y los procedimientos de purificación y conjugación de polipéptidos o polisacáridos se describen, p. ej., en, las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.242.501; 4.686,102; 5.623.057; y 5.565.204.

Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se pueden administrar a un mamífero para provocar una respuesta inmunitaria (una respuesta inmunitaria profiláctica y/o terapéutica) contraS. pneumoniaeen el mamífero. Una composición farmacéutica que contiene un antígeno neumocócico, solo o como producto conjugado, puede suministrarse en un vehículo, tampón o conservante farmacéuticamente aceptables que sean adecuados para una vacuna que incluye, pero sin limitarse a, solución salina fisiológica u otros líquidos inyectables. También pueden estar presentes aditivos habituales en las vacunas, por ejemplo, estabilizadores tales como lactosa o sorbitol, y adyuvantes para mejorar la respuesta inmunogénica tales como fosfato, hidróxido o sulfato de aluminio y estearil tirosina. La vacuna producida también puede utilizarse como componente de vacunas multivalentes que provocan una respuesta inmunitaria contra una pluralidad de agentes infecciosos.

Las composiciones se pueden administrar de cualquier manera conocida en la técnica, p. ej., por vía oral, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intratecal, intradérmica, intraperitoneal, intranasal, intrapulmonar, intraocular, intravaginal, intrarrectal o subcutánea. Pueden introducirse en el tracto gastrointestinal o en el tracto respiratorio, p. ej., mediante inhalación de una solución o polvo que contiene los productos conjugados. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden administrar mediante un parche cutáneo.

Se administra una composición farmacéutica (p. ej., una vacuna) en una cantidad suficiente para provocar la producción de anticuerpos como parte de una respuesta inmunogénica. La dosificación para cualquier paciente determinado depende de muchos factores, incluido el tamaño del paciente, su salud general, su sexo, su superficie corporal, su edad, el compuesto particular que vaya a administrar, el momento y la vía de administración y otros fármacos que se administran simultáneamente. La determinación de la dosificación óptima está dentro de las capacidades de un farmacólogo con experiencia normal.

La capacidad de una composición para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero anfitrión puede ensayarse utilizando métodos para medir respuestas inmunitarias que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la generación de células T citotóxicas se puede demostrar en un ensayo de liberación de 51Cr convencional, midiendo la expresión o secreción de citocinas intracelulares o utilizando tetrámeros del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Se pueden utilizar ensayos convencionales, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o de puntos inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISPOT), para medir los perfiles de citocinas atribuibles a la activación de las células T. La proliferación de células T se puede medir mediante ensayos tales como captación de 3H-timidina y otros ensayos conocidos en la técnica. Las respuestas de las células B se pueden medir utilizando ensayos reconocidos en la técnica tales como ELISA. También se pueden utilizar otras metodologías para evaluar los efectos de los productos conjugados sobre lesiones asociadas a patógenos o sobre otros niveles de patógenos en general (p. ej., eliminación de neumococos en ratones sensibilizados tratados con el producto conjugado).

La composición descrita en el presente documento se puede utilizar en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección por S.pneumoniaeo afecciones asociadas con tal infección.

Adyuvantes

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica que comprende un antígeno neumocócico incluye un adyuvante. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que contiene minerales. En algunas realizaciones, el adyuvante que contiene minerales incluye hidróxido de aluminio. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunomodulador. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye adyuvante IC31™ (Intercell AG). En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende una toxina. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende una endotoxina. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende un muramil dipéptido. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende una emulsión oleosa. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende una saponina. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende un complejo inmunoestimulante (ISCOM). En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende un copolímero en bloque no iónico. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye partículas similares a virus (VLP), p. ej., una toxina del cólera. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye replicones. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende liposomas. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende micropartículas. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende microesferas biodegradables. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende una citocina. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica incluye un adyuvante que comprende un lipopéptido.

Las composiciones inmunogénicas pueden contener adyuvantes. En algunas realizaciones, la toxina del cólera (CT) se puede utilizar como adyuvante para la administración intranasal, lo que da como resultado protección contra la colonización neumocócica. El alumbre es un adyuvante eficaz para la inyección subcutánea. Los adyuvantes son típicamente un grupo heterogéneo de sustancias que mejoran la respuesta inmunológica contra un antígeno que se administra simultáneamente. En algunos casos, se añaden adyuvantes a una vacuna para mejorar la respuesta inmunitaria, de modo que se necesite menos vacuna. Los adyuvantes sirven para poner en contacto el antígeno, la sustancia que estimula la respuesta inmunitaria protectora específica, con el sistema inmunitario e influyen en el tipo de inmunidad producida, así como en la calidad de la respuesta inmunitaria (magnitud o duración). Los adyuvantes también pueden disminuir la toxicidad de ciertos antígenos y proporcionar solubilidad a algunos componentes de la vacuna. Casi todos los adyuvantes utilizados hoy en día para mejorar la respuesta inmunitaria contra antígenos son partículas o forman partículas junto con el antígeno. En el libro "Vaccine Design - the subunit and adyuvant approach" (Ed: Powell & Newman, Plenum Press, 1995) se describen casi todos los adyuvantes conocidos tanto en lo que respecta a su actividad inmunológica como a sus características químicas. El tipo de adyuvantes que no forman partículas son un grupo de sustancias que actúan como sustancias de señal inmunológica y que en condiciones normales consisten en las sustancias que se forman por el sistema inmunológico como consecuencia de la activación inmunológica tras la administración de sistemas adyuvantes particulados.

Los adyuvantes para vacunas son bien conocidos en la técnica. Los adyuvantes adicionales adecuados incluyen, pero sin limitarse a: adyuvante completo de Freund (CFA), adyuvante incompleto de Freund (IFA), saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas o hidrocarbonadas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. La selección de un adyuvante depende del animal que se vaya a vacunar. Los ejemplos adicionales incluyen, pero sin limitarse a, monoglicéridos y ácidos grasos (p. ej., una mezcla de monooleína, ácido oleico y aceite de soja); sales minerales, p. ej., hidróxido de aluminio y geles de fosfato de aluminio o calcio; emulsiones oleosas y formulaciones con base de tensioactivos, p. ej., MF59 (emulsión de aceite en agua estabilizada con detergente microfluidizado), QS21 (saponina purificada), AS02 [SBAS2] (emulsión de aceite en agua MPL QS-21), Montanide ISA-51 e ISA-720 (emulsión de agua en aceite estabilizada); adyuvantes particulados, p. ej., virosomas (vehículos liposomales unilamelares que incorporan hemaglutinina de influenza), AS04 ([SBAS4] sal de Al con MPL), ISCOMS (complejo estructurado de saponinas y lípidos), polilactida coglicolida (PLG); derivados microbianos (naturales y sintéticos), p. ej., monofosforil lípido A (MPL), Detox (MPL esqueleto de la pared celular de M. Phlei), AGP [RC-529] (monosacárido acilado sintético), DC_Chol (inmunoestimuladores lipoidales capaces de autoorganizarse en liposomas), OM-174 (derivado de lípido A), motivos CpG (oligonucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG inmunoestimuladores), LT y CT modificados (toxinas bacterianas genéticamente modificadas para proporcionar efectos adyuvantes no tóxicos); inmunomoduladores humanos endógenos, p. ej., hGM-CSF o hIL-12 (citocinas que pueden administrarse como proteínas o codificadas por plásmidos), Immudaptin (matriz en tándem C3d) y vehículos inertes, tales como partículas de oro. Los adyuvantes más novedosos se describen en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.890.540, la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2005/0244420, y los documentos PCT/SE97/01003, y US2012/0135025. El adyuvante también se puede seleccionar del grupo que consiste en QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-aletina, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectina, Alumbre y MF59.

En algunas realizaciones, se pueden utilizar adyuvantes alternativos, tales como un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, no se deben utilizar adyuvantes de emulsiones oleosas o hidrocarbonadas para la vacunación humana. Un ejemplo de un adyuvante adecuado para su uso en seres humanos es el alumbre (gel de alúmina). Los detalles de los adyuvantes comunes que se contempla añadir a la vacuna que comprende un antígeno como se divulga en la Tabla 1 incluyen los que se analizan a continuación:

Adyuvante completo de Freund (CFA): un adyuvante de aceite mineral; utiliza una emulsión de agua en aceite que es principalmente aceite. Durante muchos años el adyuvante de elección fue el adyuvante completo de Freund. Este adyuvante, si bien es potente inmunogénicamente, también ha tenido un historial importante de producir con frecuencia abscesos, granulomas y descamaciones de tejido. Contiene aceite de parafina, micobacterias muertas y monooleato de manida. El aceite de parafina no se metaboliza; se expresa a través de la piel (a través de un granuloma o un absceso) o es fagocitado por los macrófagos. Las exposiciones múltiples a CFA provocarán reacciones de hipersensibilidad graves. La exposición accidental del personal a CFA puede provocar sensibilización a la tuberculina.

Adyuvante incompleto de Freund (IFA): También es un adyuvante de aceite mineral. Composición similar al CFA, pero no contiene micobacterias muertas, por lo que no produce reacciones tan graves. Se utiliza para las inmunizaciones de refuerzo después de la inyección inicial con antígeno CFA. Se puede utilizar IFA para la inyección inicial si el antígeno es fuertemente inmunogénico.

Montanide ISA (Adyuvante Séptico Incompleto): un adyuvante de aceite mineral. Utiliza oleato de manida como componente tensioactivo principal. La respuesta de anticuerpos es generalmente similar a la de IFA. Montanide ISA puede tener una disminución de la respuesta inflamatoria.

Sistema Adyuvante Ribi (RAS): una emulsión de aceite en agua que contiene endotoxinas destoxificadas y componentes de la pared celular micobacteriana en escualeno al 2%. Hay múltiples formulaciones disponibles comercialmente, dependiendo del uso. Es una alternativa al CFA. Menor viscosidad que CFA. A menudo, los resultados (títulos) son comparables a los de CFA. El aceite de escualeno es metabolizable. RAS tiene una menor incidencia de reacciones tóxicas.

TiterMax: Otra emulsión de agua en aceite, esta preparación combina un adyuvante sintético y sílice microparticulada con el aceite metabolizable escualeno. El copolímero es el componente inmunomodulador. El antígeno se une al copolímero y se presenta a las células inmunitarias en una forma altamente concentrada. Menos toxicidad que CFA. TiterMax normalmente produce los mismos resultados que CFA.

Formulación Adyuvante Syntex (SAF): una emulsión de aceite en agua preformada. Utiliza un copolímero en bloque como tensioactivo. Un derivado de muramil dipéptido es el componente inmunoestimulador. Todo en escualeno, un aceite metabolizable. SAF puede sesgar la respuesta humoral a IgG2a en ratón, pero es menos tóxico que CFA.

Adyuvantes de Sales de Aluminio: se utilizan con mayor frecuencia como adyuvantes para el suministro de antígenos de vacunas. Generalmente son adyuvantes más débiles que los adyuvantes en emulsión. Los Adyuvantes de Sales de Aluminio se utilizan mejor con antígenos fuertemente inmunogénicos, pero generalmente provocan reacciones inflamatorias leves.

Antígeno adsorbido en nitrocelulosa: la nitrocelulosa es básicamente inerte y casi no produce respuesta inflamatoria. La lenta degradación del papel de nitrocelulosa permite una liberación prolongada del antígeno. No produce una respuesta de anticuerpos tan drástica como CFA. El antígeno adsorbido en nitrocelulosa es bueno si sólo se puede recuperar una pequeña cantidad de antígeno de una banda de gel, p. ej., para la inmunización animal.

Antígenos encapsulados o atrapados: permite la liberación prolongada del antígeno a lo largo del tiempo; también puede tener inmunoestimuladores en preparación para una liberación prolongada. La preparación de antígenos encapsulados o atrapados es compleja.

Complejos inmunoestimulantes (ISCOM): micelas de saponina/colesterol modificadas con antígeno. Se forman estructuras estables que migran rápidamente a los ganglios linfáticos de drenaje. Se logran respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células. Baja toxicidad; los ISCOM pueden provocar una respuesta de anticuerpos significativa. Quil A es un ejemplo, QS-21 es otro.

Adyuvante GerbuR: un adyuvante en fase acuosa que utiliza inmunoestimuladores combinados con zinc - prolina. GerbuR no tiene efecto de depósito y tiene un efecto inflamatorio mínimo. GerbuR requiere refuerzos frecuentes para mantener títulos altos.

Otro grupo de adyuvantes incluye inmunoestimuladores tales como citocinas IL-12, IL-4 y moléculas coestimuladoras como B7. Se conoce una amplia gama de moléculas que tienen efectos estimulantes del sistema inmunológico, incluidas moléculas accesorias tales como ICAM y LFA. En algunas realizaciones, GM-CSF se administra al paciente antes de la administración inmunológica inicial. Se puede administrar GM-CSF utilizando un vector viral o una proteína aislada en una formulación farmacéutica. Se pueden utilizar combinaciones de adyuvantes tales como CM-CSF, ICAM y LFA. Si bien típicamente se genera una fuerte respuesta inmunitaria a los antígenos de enfermedades infecciosas, los antígenos asociados a tumores típicamente generan una respuesta inmunitaria más débil. Por tanto, con ellos se utilizan preferiblemente estimuladores inmunológicos tales como los descritos anteriormente.

En algunas realizaciones, una vacuna neumocócica puede contener varios antígenos neumocócicos y/o formularse con adyuvantes diferentes o novedosos, o incorporarse en armazones de vacuna, tales como un producto conjugado de fusión (p. ej., una fusión con un neumolisoide y conjugación con un polisacárido como proponen Lu et al, Infection and Immunity, 2009), o utilizando un armazón, como se divulga en los documentos PCT/US12/37412 y WO 2012/155007 para mejorar la inmunogenicidad y facilitar diferentes vías de administración. Por consiguiente, se puede utilizar una composición que comprende al menos 2, o al menos aproximadamente 3, o al menos aproximadamente 4, o al menos aproximadamente 5, o al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 7, o al menos aproximadamente 8, o al menos aproximadamente 9, o al menos aproximadamente 10, o al menos aproximadamente 12, o al menos aproximadamente 14, o al menos aproximadamente 16, o al menos aproximadamente 18, o al menos aproximadamente 20, o al menos aproximadamente 25, o cualquier número entero entre aproximadamente 2 y aproximadamente 26 antígenos diferentes o más de 25 antígenos diferentes, sola o combinada con un adyuvante y/o armazón de vacuna, tal como un polisacárido.

La divulgación proporciona métodos para provocar una respuesta inmunitaria contra neumococo en un mamífero. Los métodos incluyen, por ejemplo, administrar al mamífero una composición inmunogénica que comprende un antígeno polipeptídico neumocócico aislado seleccionado de la Tabla 1 o fragmentos y combinaciones de los mismos, p. ej., una composición inmunogénica descrita en el presente documento.

En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta inmunitaria contra neumococo. En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta de células T a un antígeno neumocócico (p. ej., una respuesta inmunitaria mediada por células T CD4+ y/o una respuesta inmunitaria mediada por células T CD8+). En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta de células T Th1. En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta de células T Th17. En algunas realizaciones, un método provoca la secreción de IFN-<y>por células T específicas de antígeno. En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta de anticuerpos (p. ej., una respuesta de IgG y/o una respuesta de IgA). En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta de células T citotóxicas (CTL). En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta inmunitaria mediada por células B. En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta mediada tanto por células T como por células B. En algunas realizaciones, un método provoca una respuesta inmunitaria innata.

En algunas realizaciones, un método reduce la incidencia de infección neumocócica en sujetos a los que se les administra la composición. En algunas realizaciones, un método reduce la probabilidad de infección del tracto inferior por neumococo. En algunas realizaciones, un método reduce la probabilidad de infección del tracto superior por un organismo neumocócico. En algunas realizaciones, un método reduce la probabilidad de infección crónica por un organismo neumocócico. En algunas realizaciones, un método reduce la probabilidad de sufrir enfermedad inflamatoria pélvica debido a una infección neumocócica. En algunas realizaciones, un método reduce la probabilidad de infertilidad posterior a una infección neumocócica.

En algunas realizaciones de un método, se administra una composición inmunogénica al mamífero al menos dos veces (p. ej., dos, tres, cuatro o cinco veces).

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica administrada después de una primera administración (es decir, como refuerzo) difiere de la composición administrada inicialmente, p. ej., la composición incluye un antígeno neumocócico diferente o un subconjunto diferente de antígenos neumocócicos, o una sustancia antigénica neumocócica diferente (polipéptido o ácido nucleico que lo codifica), o una dosis diferente de antígeno, o un adyuvante diferente, o una dosis diferente de adyuvante. En algunas realizaciones, un refuerzo se administra por una vía diferente a la de una administración anterior.

En algunas realizaciones, el mamífero tiene riesgo de infección por neumococo. En algunas realizaciones, el mamífero está infectado con una infección neumocócica. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica administrada en un método comprende un adyuvante. En algunas realizaciones, un adyuvante es un adyuvante que contiene minerales. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica administrada en un método comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, una composición de antígeno neumocócico incluye un adyuvante. En algunas realizaciones, el adyuvante incluye adyuvante que contiene minerales. Los adyuvantes que contienen minerales se pueden formular como geles, en forma cristalina, en forma amorfa, como partículas, etc. Los adyuvantes que contienen minerales incluyen, por ejemplo, sales de aluminio y/o sales de calcio (p. ej., hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, fosfato cálcico, etc.). En algunas realizaciones, una composición de antígeno neumocócico incluye hidróxido de aluminio. Alhidrogel™. es un ejemplo de un adyuvante en gel de hidróxido de aluminio.

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un oligonucleótido inmunomodulador. En algunas realizaciones, una secuencia de oligonucleótidos inmunomoduladores incluye motivos CpG (citosina-guanosina no metilada). Los oligonucleótidos que tienen motivos CpG pueden incluir análogos de nucleótidos y/o enlaces internucleosídicos de origen no natural (p. ej., enlaces fosforotioato). Para ver ejemplos de varios oligonucleótidos que incluyen motivos CpG, véanse Kandimalla, et al., Nuc. Acids Res. 31(9): 2393-2400, 2003; documentos WO02/26757; WO99/62923; Krieg, Nat. Med. 9(7): 831-835, 2003; McCluskie et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 32:179-185, 2002; documento WO98/40100; Patente de Estados Unidos Núm. 6.207.646; Patente de Estados Unidos Núm. 6.239.116 y Patente de Estados Unidos Núm. 6.429.199. Otras secuencias de nucleótidos inmunomoduladores:secuencias de ARN de doble hebra, secuencias palindrómicas y secuencias poli(dG).

En algunas realizaciones, un adyuvante comprende IC<31>™ (Intercell AG). IC<31>™ es un adyuvante sintético que incluye un péptido antimicrobiano, KLK, y un oligonucleótido inmunoestimulador, ODN1a, y actúa como agonista del receptor tipo Toll 9 (TLR9). En algunas realizaciones, un adyuvante incluye una toxina. En algunas realizaciones, la toxina es una toxina bacteriana ribosilante de ADP, p. ej., toxina del cólera (CT), toxina termolábil de E. coli o toxina de tos ferina. En algunas realizaciones, la toxina bacteriana es una forma destoxificada de una toxina ribosilante de ADP (véanse, p. ej., Beignon et al., Inf. Immun. 70(6):3012-3019, 2002; Pizza, et al., Vaccine 19:2534-2541, 2001; Pizza, et al., Int. J. Med. Microbiol. 290(4-5):455-461,2000; Scharton-Kersten et al., Inf. Inmun. 68(9):5306-5313, 2000; Ryan et al., Inf. Immun 67(12):6270-6280, 1999; Partidos et al., Immunol. Lett. 67(3):209-216, 1999; Peppoloni et al., Vaccines 2(2):285-293, 2003; y Pine et al., J. Control Release 85(1-3):263-270, 2002). En algunas realizaciones, un adyuvante incluye una endotoxina tal como monofosforil lípido A o monofosforil lípido A 3-Des-O-acilado (véanse las Patente de Estados Unidos Núm. 4.987.237 y el documento GB 2122204B).

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un muramil dipéptido (p. ej., N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-1-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-1-alanil-d-isoglutaminil-1-alanina-2-(1 '-2'-dipalmitoil-s- -n-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE). En algunas realizaciones, un adyuvante incluye una emulsión oleosa y/o un adyuvante con una base de emulsionante. En algunas realizaciones, un adyuvante de emulsión oleosa incluye un Adyuvante de Freund (p. ej., adyuvante de Completo Freund (CFA) o adyuvante incompleto de Freund (IFA)). En algunas realizaciones, un adyuvante de emulsión oleosa incluye una emulsión de agua y escualeno, tal como MF59 (Novartis; véase, p. ej., el documento WO9014837), o una formulación adyuvante Synex (SAF)). En algunas realizaciones, una emulsión oleosa incluye un agente dispersante, p. ej., un mono o di-éster de ácido graso C<12>-C<24>de sorbitán o manida, p. ej., monoestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán o monooleato de manida. Los ejemplos de emulsiones oleosas que incluyen escualeno y agentes dispersantes incluyen Arlacel<™>, Montanide<™>ISA-720 y Montanide<™>ISA-703. Otras emulsiones oleosas se describen, p. ej., en los documentos WO 95/17210 y EP 0399842.

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye una saponina. Las saponinas son glucósidos esteroides y/o triterpenoides derivados de plantas tales como Quillaja saponaria, Saponaria officianalis, Smilax ornata y Gypsophilla paniculata. Las fracciones de extractos que contienen saponina que se han descrito y que pueden utilizarse como adyuvantes para antígenos neumocócicos incluyen Quil.TM.A, Qs 21, QS7, QS17, QS18, QH-A, QH-B, QH-C y QuilA (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 5.057.540). En algunas realizaciones, QS21 se utiliza como adyuvante.

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un complejo inmunoestimulador (ISCOM). Los ISCOM son partículas que típicamente incluyen un glicósido (p. ej., una saponina) y un lípido. En algunas realizaciones, un ISCOM incluye una saponina y un colesterol. En algunas realizaciones, un ISCOM incluye una saponina, un colesterol y un fosfolípido (p. ej., fosfatidilcolina y/o fosfatidiletanolamina). En algunas realizaciones, un ISCOM incluye un copolímero en bloque no iónico. Los ISCOM pueden incluir adyuvantes adicionales, p. ej., sustancias adyuvantes adicionales descritas en el presente documento (véase, p. ej., el documento WO 05/002620). En algunas realizaciones, un ISCOM incluye una sustancia que lo dirige a una membrana mucosa (véase, p. ej., el documento WO97/030728). Otras composiciones de ISCOM y la preparación de las composiciones adecuadas para combinación con antígenos neumocócicos proporcionadas en el presente documento se describen, p. ej., en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm.

20060121065, el documento WO 00/07621, el documento WO 04/004762, el documento WO 02/26255, y el documento WO 06/078213. En algunas realizaciones, un adyuvante comprende un adyuvante AbISCO<®>(p. ej., Matrix-M<™>, Isconova). En algunas realizaciones, un adyuvante comprende AbISCO<®>-100. En algunas realizaciones, un adyuvante comprende AbISCO<®>-300.

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un copolímero en bloque no iónico. Los copolímeros en bloque no iónicos típicamente incluyen dos cadenas de polioxietilenos hidrófobos de diversas longitudes combinadas con un bloque de polioxipropileno hidrófobo. En algunas realizaciones, se formula un copolímero en bloque no iónico en una emulsión de aceite en agua (p. ej., con aceite y escualeno).

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye partículas similares a virus (VLP). Las VLP son partículas no replicantes y no infecciosas que incluyen típicamente una o más proteínas virales, opcionalmente formuladas con un componente adicional tal como un fosfolípido. En algunas realizaciones, una VLP incluye proteínas de uno o más de los siguientes: un virus de la influenza (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) o neuraminidasa (NA)), virus de la hepatitis B (p. ej., un polipéptido central o de la cápside), virus de la Hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, Rotavirus, virus de la Fiebre Aftosa, Retrovirus, Virus Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago Q13 (p. ej., una proteína de la cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205, un Ty (p. ej., proteína p1 del retrotransposón Ty). Véanse, p. ej., los documentos WO03/024480, WO03/024481, WO08/061.243, y WO07/098.186. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye replicones. Los replicones se parecen a las VLP en que son partículas no infecciosas que incluyen proteínas virales y adicionalmente incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido (p. ej., un antígeno). En algunas realizaciones, un replicón incluye proteínas de un alfavirus. Los alfavirus incluyen, p. ej., Virus de la Encefalitis Equina Oriental (EEE), Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), Virus de los Everglades, Virus Mucambo, Virus Pixuna, Virus de la Encefalitis Equina Occidental (WEE), Virus Sindbis, Virus del bosque Semliki, Virus Middleburg, Virus Chikungunya, Virus O'nyong-nyong, Virus del Río Ross, Virus del bosque Barmah, Virus Getah, Virus Sagiyama, Virus Bebaru, Virus Mayaro, Virus Una, Virus Aura, Virus Whataroa, Virus Babanki, Virus Kyzylagach, Virus Highlands J, Virus Fort Morgan, Virus Ndumu y Virus Buggy Creek. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un replicón que incluye un ácido nucleico que codifica uno o más antígenos neumocócicos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un replicón que codifica una citocina (p. ej., interleucina-12 (IL-12), IL-23 o factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF)). La producción y usos de replicones se describen, p. ej., en los documentos WO08/058.035, WO08/085.557, y WO08/033.966). En algunas realizaciones, un adyuvante de VLP o de replicón incluye uno o más antígenos neumocócicos (es decir, VLP o partículas de replicón incluyen un antígeno neumocócico como parte de las partículas). En algunas realizaciones, se administra conjuntamente un adyuvante de VLP o de replicón con un polipéptido de antígeno neumocócico.

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye liposomas, que son vesículas lipídicas esféricas construidas artificialmente (véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.053.585; 6.090.406; y 5.916.588). En ciertas realizaciones, un lípido que se va a utilizar en liposomas puede ser, pero sin limitarse a, uno o varios de los siguientes: fosfatidilcolina, lípido A, colesterol, dolicol, esfingosina, esfingomielina, ceramida, glicosilceramida, cerebrósido, sulfatida, fitoesfingosina, fosfatidil-etanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, cardiolipina, ácido fosfatídico y lisofosfátidos. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un liposoma y un ligando para un receptor tipo Toll (TLR; véanse, p. ej., los documentos WO/2005/013891, WO/2005/079511, WO/2005/079506, y WO/2005/013891). En algunas realizaciones, un adyuvante incluye JVRS-100. JVRS-100 comprende liposomas catiónicos combinados con oligonucleótidos o plásmidos no codificantes.

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye micropartículas compuestas de un polímero, p. ej., un polímero de ácido acrílico o metacrílico, polifosfacenos, policarbonatos, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido láctico o ácido glicólico, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, polianhídridos, polisiloxanos, policaprolactona, o un copolímero preparado a partir de los monómeros de estos polímeros. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye micropartículas compuestas de un polímero seleccionado del grupo que consiste en polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), metacrilato de polihidroxietilo, poliacrilamida, polimetacrilamida y polietilenglicol (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 5.500.161).

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye microesferas biodegradables (p. ej., microesferas compuestas de poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido D, L-glicólico), poli(epsilon.-caprolactona), poli(alfa-hidroxiactida), ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, etc.).

En algunas realizaciones, un adyuvante incluye una citocina. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye IL-12. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye IL-23. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye GM-CSF. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un lipopéptido. En algunas realizaciones, un adyuvante incluye un lipopéptido Pam-3-Cys. En algunas realizaciones, un adyuvante que incluye un lipopéptido activa los receptores tipo Toll (TLR).

Componentes adicionales de vacunas o composiciones inmunogénicas.

Además de los antígenos y los adyuvantes descritos anteriormente, una formulación de vacuna o composición inmunogénica pueden incluir uno o más componentes adicionales.

En ciertas realizaciones, la formulación de vacuna o composición inmunogénica pueden incluir uno o más estabilizadores tales como azúcares (tales como sacarosa, glucosa o fructosa), fosfato (tales como fosfato sódico dibásico, fosfato potásico monobásico, fosfato potásico dibásico o fosfato monosódico), glutamato (tal como L-glutamato monosódico), gelatina (tal como gelatina procesada, gelatina hidrolizada o gelatina porcina), aminoácidos (tales como arginina, asparragina, histidina, L-histidina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, fenilalanina, tirosina y sus ésteres alquílicos), inosina o borato de sodio.

En ciertas realizaciones, la formulación de vacuna o composición inmunogénica incluyen uno o más tampones tales como una mezcla de bicarbonato de sodio y ácido ascórbico. En algunas realizaciones, la formulación de vacuna se puede administrar en solución salina, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS), o agua destilada.

En ciertas realizaciones, la formulación de vacuna o composición inmunogénica incluyen uno o más tensioactivos tales como polisorbato 80 (Tween 80), Triton X-100, Polietilenglicol terc-octilfenil éter, t-Octilfenoxipolietoxietanol, 4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol (TRITON X-100); Monolaurato de polioxietilensorbitán, Monolaurato de polietilenglicol sorbitán (TWEEN 20); y polímero de 4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenol con formaldehído y oxirano (TYLOXAPOL). Un tensioactivo puede ser iónico o no iónico.

En ciertas realizaciones, la formulación de vacuna o composición inmunogénica incluyen una o más sales tales como cloruro de sodio, cloruro de amonio, cloruro de calcio o cloruro de potasio.

En ciertas realizaciones, se incluye un conservante en la vacuna o composición inmunogénica. En otras realizaciones, no se utiliza ningún conservante. Un conservante se utiliza con mayor frecuencia en los viales de vacunas de dosis múltiples y con menos frecuencia se necesita en los viales de vacunas de dosis única. En ciertas realizaciones, el conservante es 2-fenoxietanol, metil- y propilparabenos, alcohol bencílico y/o ácido sórbico.

En ciertas realizaciones, la formulación de vacuna o composición inmunogénica es una formulación de liberación controlada.

Modificaciones

En algunas realizaciones, la vacuna puede comprender al menos un inmunógeno de las secuencias enumeradas en la Tabla 1, o un inmunógeno que es un fragmento funcional o tiene una identidad sustancial con un inmunógeno enumerado en la Tabla 1. Adicionalmente los antígenos de S.pneumoniaedivulgados en el presente documento para vacunas combinadas incluyen polisacáridos de S.pneumoniaeconjugados. Los polisacáridos conjugados pueden ser, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.623.057, Patente de Estados Unidos Núm.

5.371.197, o en el documento PCT/US2011/023526.

En algunas realizaciones, los antígenos neumocócicos descritos en el presente documento se pueden utilizar con o sin modificación. En algunas realizaciones, se puede modificar un antígeno neumocócico para provocar la respuesta inmunitaria deseada. En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico se conjuga con un portador inmunogénico apropiado tal como toxina tetánica, neumolisina, hemocianina de lapa californiana o similares.

En algunas realizaciones, uno o más antígenos neumocócicos están presentes en un armazón, tal como un producto conjugado de fusión (p. ej., una fusión con un neumolisoide y conjugación con un polisacárido como proponen Lu et al, en Infection and Immunity, 2009), o utilizando un armazón, como se divulga en los documentos PCT/US12/37412, WO 2012/155007 y US2011/0206716.

En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico se fusiona con PdT. En algunas realizaciones, PdT representa una variante no hemolítica de neumolisina, o una variante no hemolítica de neumolisina (PdT) (W433F, D385N y C428G).

En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico puede existir como un producto conjugado para proporcionar una reacción inmunogénica sinérgica con un radical de azúcar antigénico. Por ejemplo, se podría utilizar el polisacárido Vi de Salmonella typhi. El polisacárido capsular Vi se ha desarrollado contra infecciones entéricas bacterianas, tales como la fiebre tifoidea (Robbins et al., 150(3) J. Infect. Dis. 436-49 (1984); Levine et al., 7 Baillieres Clin. Gastroenterol. 501-17 (1993)). Vi es un polímero de ácido a-1^4-galacturónico con un N-acetilo en la posición C-2 y O-acetilación variable en C-3. La virulencia de S. typhi se correlaciona con la expresión de esta molécula (Sharma et al., 101 P.N.A.S. USA 17492-97 (2004)). La vacuna de polisacárido Vide S. typhitiene varias ventajas: Los efectos secundarios son poco frecuentes y leves, una dosis única produce inmunogenicidad y eficacia consistentes. El polisacárido Vi puede normalizarse de manera fiable mediante métodos fisicoquímicos verificados para otras vacunas de polisacáridos, Vi es estable a temperatura ambiente y puede administrarse simultáneamente con otras vacunas sin afectar la inmunogenicidad y la tolerabilidad (Azze et al., 21 Vaccine 2758-60 (2003)).

Así, el polisacárido Vi deSalmonella typhipuede conjugarse con una proteína de fusión de un antígeno polipeptídico neumocócico, donde el antígeno polipeptídico neumocócico se fusiona con PdT u otra proteína, de modo que la vacuna resultante confiere inmunidad contra un patógeno, o dos patógenos diferentes: donde el antígeno polipeptídico neumocócico confiere protección contra neumococo, una construcción Vi-antígeno neumocócico:PdT genera una respuesta inmunogénica contra S.typhiy neumococo. Otros ejemplos incluyen la combinación de azúcares de bacterias encapsuladas (tales como meningococo, S.aureus,neumococo, etc.) y proteína tuberculosa, para proporcionar una vacuna que proteja contra dos patógenos diferentes.

Otros radicales de polisacáridos (PS) que se pueden utilizar en la presente divulgación como alternativa al dextrano, polisacárido de la pared celular neumocócica (CWPS), etc., incluyen antígenos carbohidratados de cánceres. Por ejemplo, el antígeno Tn, un oligosacárido expresado exclusivamente por células cancerosas (Buskus et al., 44 Angew Chem. Int’l Ed. 5985-88 (2005)). En alguna realización, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión de un antígeno neumocócico truncado y una proteína neumolisina PdT no hemolítica, conjugada con CWPS.

El polisacárido puede tener una masa molecular de <500 kDa. El PS puede tener una masa molecular de <70 kDa.

En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico como se divulga en el presente documento está presente en un sistema presentador de antígenos múltiples inmunogénico (MAPS) como se divulga en el documento WO 2012/155007, donde el antígeno neumocócico divulgado en el presente documento está presente en un complejo inmunogénico que comprende al menos un tipo de polímero, p. ej., un polisacárido, que puede, opcionalmente, ser antigénico; al menos un antígeno neumocócico divulgado en el presente documento; y al menos un par de moléculas de afinidad complementarias que comprende (i) una primera molécula de afinidad que se asocia con el polímero, y (ii) una molécula de afinidad complementaria que se asocia con la proteína o péptido; de modo que la primera y las moléculas de afinidad complementarias sirven como un enlace indirecto entre el polímero con la proteína o péptido antigénicos. Por consiguiente, el polímero puede unir al menos 1, o al menos 2, o una pluralidad de antígenos proteicos o peptídicos iguales o diferentes. En algunas realizaciones, el polímero es antigénico, p. ej., el polímero es un polisacárido capsular neumocócico. En algunas realizaciones, los antígenos neumocócicos son antígenos neumocócicos recombinantes. Por consiguiente, en el presente documento se describe una composición inmunogénica que comprende un polímero, al menos un antígeno neumocócico y al menos un par de moléculas de afinidad complementarias, donde el par de moléculas de afinidad complementarias comprende una primera molécula de afinidad que se asocia con el polímero y una molécula de afinidad complementaria. que se asocia con el antígeno neumocócico, de modo que cuando la primera molécula de afinidad se asocia con la molécula de afinidad complementaria, esta conecta indirectamente el antígeno al polímero.

En algunas realizaciones, una primera molécula de afinidad en un complejo inmunogénico se entrecruza con el polímero con un reactivo de entrecruzamiento, p. ej., un reactivo de entrecruzamiento seleccionado entre CDAP (tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio), EDC (Hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida), cianoborohidruro de sodio; bromuro de cianógeno; o bicarbonato de amonio/ácido yodoacético. En algunas realizaciones, la primera molécula de afinidad está entrecruzada con grupos funcionales carboxilo, hidroxilo, amino, fenoxilo, hemiacetal y mecapto del polímero. En algunas realizaciones, la primera molécula de afinidad está unida covalentemente al polímero. En algunas realizaciones, la primera molécula de afinidad es biotina o un derivado de la misma, o una molécula con estructura o propiedad física similares a la biotina, por ejemplo, una amina-PEG3-biotina ((+)-biotinilación-3-6,9-trixaundecanodiamina) o derivado de la misma.

En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico del complejo inmunogénico es una proteína de fusión que comprende una proteína o péptido antigénicos neumocócicos fusionados a la molécula de unión por afinidad complementaria. La fusión puede ser una construcción genética, es decir, un péptido o proteína de fusión recombinantes. En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico se puede anclar covalentemente como una proteína de fusión a la molécula de afinidad complementaria. En realizaciones alternativas, el antígeno está anclado de forma no covalente a la molécula de afinidad complementaria.

En algunas realizaciones, una molécula de afinidad complementaria en un complejo inmunogénico es una proteína de unión a biotina o un derivado o una porción funcional de la misma. En algunas realizaciones, una molécula de afinidad complementaria es una proteína similar a avidina o un derivado o una porción funcional de la misma, por ejemplo, pero sin limitarse a, rizavidina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, una molécula de afinidad complementaria es avidina o estreptavidina o un derivado o una porción funcional de las mismas.

En algunas realizaciones, un polímero del complejo inmunogénico es un polímero de cadena ramificada, p. ej., un polisacárido ramificado, o alternativamente, puede ser un polímero de cadena lineal, p. ej., un polímero de cadena sencilla, p. ej., un polisacárido. En algunas realizaciones, el polímero es un polisacárido, por ejemplo, dextrano o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, un polímero, p. ej., polisacárido de dextrano, puede tener un peso molecular medio de 425 kD-500 kDa, inclusive, o en algunas realizaciones, superior a 500 kDa. En algunas realizaciones, un polímero, p. ej., polisacárido de dextrano, puede tener un peso molecular promedio de 60 kD-90 kDa, inclusive, o en algunas realizaciones, menor que 70 kDa. El polímero de dextrano se puede obtener de una bacteria, tal como Leuconostoc mesenteroides.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende al menos 2 antígenos, o al menos 3 antígenos, o al menos 5 antígenos, o entre 2-10 antígenos, o entre 10-15 antígenos, o entre 15-20 antígenos, o entre 20-50 antígenos, o entre 50-100 antígenos, o más de 100 antígenos, inclusive. En algunas realizaciones, cuando una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende al menos 2 antígenos, los antígenos pueden ser el mismo antígeno o al menos 2 antígenos diferentes. En algunas realizaciones, los antígenos pueden ser del mismo o de diferentes patógenos, o pueden ser diferentes epítopos o partes de la misma proteína antigénica, o pueden ser el mismo antígeno que es específico de diferentes serotipos o variaciones estacionales del mismo patógeno (p. ej., virus de la influenza A, B y C).

Un antígeno neumocócico como se divulga en el presente documento, cuando está presente solo o en un complejo inmunogénico, puede provocar respuestas tanto humorales como celulares a uno o múltiples antígenos al mismo tiempo. Las composiciones inmunogénicas proporcionan una respuesta de memoria duradera, protegiendo potencialmente al sujeto de futuras infecciones. Esto permite una composición inmunogénica única que aumenta un título alto de anticuerpo antipolisacárido funcional y es similar o se compara favorablemente con el nivel de anticuerpo inducido por la vacuna conjugada convencional.

En otra realización de la presente divulgación, una composición inmunogénica puede comprender un producto conjugado de polisacárido y proteína de fusión, que consiste en un antígeno neumocócico seleccionado de la Tabla 1, fusionado con PdT, donde la proteína de fusión de antígeno neumocócico:PdT está conjugada con un polisacárido, de manera que la inmunidad contra el antígeno neumocócico aumenta. El polisacárido puede ser dextrano, un polisacárido Vi deSalmonella typhi,o polisacárido de la pared celular neumocócica (CWPS), u otro polisacárido de origen procariótico o eucariótico.

Los ácidos nucleicos que codifican formas truncadas y/o mutadas de antígenos proteicos de S.pneumoniaese pueden fusionar a secuencias de nucleótidos que codifican (1) otras proteínas neumocócicas, tales como autolisina, proteína A de superficie, neuraminidasa, producto lisado de hialuronato, proteína A de unión a colina, o (2) proteínas no neumocócicas de organismos tales como hemófilus influenza b, meningococo del grupo A, B o C, o estreptococo del grupo B. Los ácidos nucleicos que codifican tal proteína fusionada se expresan en los sistemas de expresión.

Los productos truncados de neumolisinas pueden ser portadores útiles de polisacáridos, ya que los anfitriones pueden carecer de anticuerpos preexistentes contra tal polipéptido portador. La neumolisina es un factor de virulencia en las infecciones neumocócicas y existe poca variación antigénica de la neumolisina entre neumococos con diferentes subtipos.

El producto conjugado de polisacárido-proteína, cuando se administra a un mamífero tal como un ser humano, induce una respuesta inmunitaria que excede en magnitud, tipo y/o duración la respuesta inmunitaria inducida por la administración a un mamífero de sólo el componente polisacárido. Por consiguiente, el componente polipeptídico debe tener una longitud suficiente para inducir tal respuesta inmunitaria mejorada. Para fragmentos de un antígeno neumocócico de origen natural, los fragmentos tienen una longitud de al menos 8, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 425, 450, 460, 465, 460, 465 o más aminoácidos. Para polipéptidos, cuya secuencia varía a partir de antígenos neumocócicos de origen natural, el polipéptido puede ser al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más idéntico a los antígenos neumocócicos naturales enumerados en la Tabla 1.

El componente polisacárido del producto conjugado puede ser cualquier polisacárido capsular de S.pneumoniae,que incluye, pero sin limitarse a, cualquiera de los subtipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12<f>, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 19A, 20, 22F, 23A, 23F, 24F, 27, 33F o 34. En algunas realizaciones, el polisacárido capsular se selecciona de los subtipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F o 23F. En algunas realizaciones, el polisacárido es el serotipo 14. En otras realizaciones, el polisacárido es el serotipo 18C. Se pueden conjugar uno o más de diferentes polisacáridos capsulares con un único polipéptido o una pluralidad de polipéptidos. Por ejemplo, un producto conjugado multivalente puede incluir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polisacáridos capsulares diferentes. Los polisacáridos se pueden conjugar con polipéptidos, por ejemplo, mediante una conexión monomérica (solo un extremo del polisacárido está anclado al polipéptido), una conexión en bucle (un único polipéptido está anclado a polisacáridos en bucle) o entrecruzado (múltiples polisacáridos anclados a múltiples polipéptidos).

Los métodos para la purificación de polipéptidos, p. ej., polipéptidos de antígenos neumocócicos descritos en los ejemplos y en la Tabla 1, y la conjugación de polisacáridos con polipéptidos se describen, p. ej., en, las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.242.501; 4.686.102; 5.623.057; y 5.565.204.

Los productos conjugados o polipéptidos descritos en el presente documento se pueden administrar a un mamífero para provocar una respuesta inmunitaria (una respuesta inmunitaria profiláctica y/o terapéutica) contra S.pneumoniaeen el mamífero. Una composición farmacéutica que contiene un producto conjugado o polipéptido se puede suministrar en un portador, tampón o conservante farmacéuticamente aceptables que sean adecuados para una vacuna que incluye, pero sin limitarse a, solución salina fisiológica u otros líquidos inyectables. También pueden estar presentes aditivos habituales en las vacunas, por ejemplo, estabilizadores tales como lactosa o sorbitol, y adyuvantes para mejorar la respuesta inmunogénica tales como fosfato, hidróxido o sulfato de aluminio y estearil tirosina. La vacuna producida también puede utilizarse como componente de vacunas multivalentes que provocan una respuesta inmunitaria contra una pluralidad de agentes infecciosos.

En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico se modifica postraduccionalmente, p. ej., mediante fosforilación, miristoilación, acilación, glicosilación, glicación y similares. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico está lipidado. La conjugación con el radical lipídico puede ser directa o indirecta (p. ej., mediante un conector). El radical lipídico puede ser sintético o producido de forma natural. En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico se conjuga químicamente con un radical lipídico. En algunas realizaciones, una construcción de ADN que codifica un antígeno polipeptídico neumocócico comprende una secuencia de lipidación.

Una secuencia de lipidación puede ser N-terminal o C-terminal con respecto al polipéptido, y puede estar incluida en una señal u otra secuencia. Una secuencia de lipidación ilustrativa es la secuencia señal del gen RlpB de E. coli.

En algunas realizaciones, un antígeno polipeptídico neumocócico está unido covalentemente a otra molécula. Esto puede, por ejemplo, aumentar la semivida, la solubilidad, la biodisponibilidad o la inmunogenicidad del antígeno. Las moléculas que pueden unirse covalentemente al antígeno incluyen un carbohidrato, biotina, polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, ácido polisiálico N-propionilado, ácidos nucleicos, polisacáridos y PLGA. En algunas realizaciones, la forma producida naturalmente de un polipéptido está unida covalentemente a un radical que estimula el sistema inmunitario. Un ejemplo de tal radical es un radical lipídico. En algunos casos, los radicales lipídicos son reconocidos por un receptor tipo Toll (TLR), tal como TLR2 o TLR4, y activan el sistema inmunitario innato.

Vacunas de ADN; Composiciones de ácido nucleico y expresión de antígenos.

La vacuna puede comprender uno o más de los ácidos nucleicos divulgados en el presente documento o correspondientes a los polipéptidos descritos en el presente documento. Cuando se administra una vacuna de ácido nucleico a un paciente, el producto genético correspondiente (tal como un antígeno deseado) se produce en el organismo del paciente. En algunas realizaciones, los vectores de vacuna de ácido nucleico que incluyen polinucleótidos recombinantes optimizados pueden suministrarse a un mamífero (incluidos seres humanos) para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica. El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN, ARN o un ácido nucleico sintético. El ácido nucleico puede ser de hebra sencilla o de doble hebra.

Diversos tipos de vectores son adecuados para la expresión de antígenos neumocócicos en un sistema de expresión (p. ej., en una célula anfitriona). En algunas realizaciones, una composición incluye un vector adecuado para la expresión in vitro (ya sea en una célula o en un sistema libre de células), p. ej., para producir una composición polipeptídica. El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha conectado y puede incluir, por ejemplo, un plásmido, cósmido o vector viral. El vector puede ser capaz de replicarse de forma autónoma o puede integrarse en el ADN del anfitrión. Los vectores virales incluyen, p. ej., retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados de replicación defectuosa. Se conocen en la técnica otros tipos de vectores virales.

Los vectores de vacuna de ácido nucleico (p. ej., adenovirus, liposomas, papilomavirus, retrovirus, etc.) se pueden administrar directamente al mamífero para la transducción de células in vivo. Las vacunas de ácido nucleico pueden formularse como composiciones farmacéuticas para administración de cualquier manera adecuada, incluida la administración parenteral. Los vectores plasmídicos son típicamente más eficaces para la transferencia de genes al tejido muscular. También se ha informado del potencial para suministrar vectores de ADN a superficies mucosas mediante administración oral (rotavirus y hepatitis B encapsulados en PLGA) y se han utilizado plásmidos de ADN para la introducción directa de genes en otros tejidos. Las vacunas de ADN se han introducido en animales principalmente mediante inyección intramuscular, mediante pistola genética o mediante electroporación. Después de ser introducidos, los plásmidos generalmente se mantienen episomalmente sin replicación. Se ha demostrado que la expresión de las proteínas codificadas persiste durante períodos de tiempo prolongados, proporcionando estimulación de células B y T.

Para determinar la cantidad eficaz del vector que se va a administrar en el tratamiento o profilaxis de una infección u otra afección, el médico evalúa la toxicidad del vector, la progresión de la enfermedad y la producción de anticuerpos anti-vector, si los hubiera. A menudo, la dosis equivalente de un ácido nucleico desnudo de un vector es de aproximadamente 1 μg a 1 mg para un paciente típico de 70 kilogramos, y las dosis de los vectores utilizados para suministrar el ácido nucleico se calculan para producir una cantidad equivalente de ácido nucleico terapéutico. La administración se puede realizar mediante dosis únicas o divididas. La toxicidad y eficacia terapéutica de los vectores de vacunas de ácido nucleico se pueden determinar utilizando procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación.

Una vacuna de ácido nucleico puede contener ADN, ARN, un ácido nucleico modificado o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la vacuna comprende uno o más vectores de clonación o expresión; por ejemplo, la vacuna puede comprender una pluralidad de vectores de expresión, cada uno de ellos capaz de expresar de forma autónoma una región codificante de nucleótidos en una célula de mamífero para producir al menos un polipéptido inmunogénico. Un vector de expresión incluye a menudo una secuencia promotora eucariótica, tal como la secuencia de nucleótidos de un promotor eucariótico fuerte, conectada operablemente a una o más regiones codificantes. Las composiciones y métodos del presente documento pueden implicar el uso de cualquier promotor eucariótico particular, y se conoce una amplia variedad; tal como un promotor de CMV o RSV. El promotor puede ser heterólogo con respecto a la célula anfitriona. El promotor utilizado puede ser un promotor constitutivo.

Un vector útil en las presentes composiciones y métodos puede ser circular o lineal, de hebra sencilla o de doble hebra y puede ser un plásmido, cósmido o episoma. En una realización adecuada, cada región codificante de nucleótidos está en un vector separado; sin embargo, debe entenderse que pueden estar presentes una o más regiones codificantes en un único vector, y estas regiones codificantes pueden estar bajo el control de uno o múltiples promotores.

Se pueden utilizar numerosos plásmidos para la producción de vacunas de ácido nucleico. Las realizaciones adecuadas de la vacuna de ácido nucleico emplean construcciones que utilizan los plásmidos VR1012 (Vical Inc., San Diego Calif.), pCMVI.UBF3/2 (S. Johnston, Universidad de Texas) o pcDNA3.1 (InVitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) como vector. Además, la construcción del vector puede contener secuencias inmunoestimuladoras (ISS), tales como motivos dCpG no metilados, que estimulan el sistema inmunológico del animal. La vacuna de ácido nucleico también puede codificar un producto de fusión que contiene el polipéptido inmunogénico. El ADN plasmídico también se puede suministrar utilizando bacterias atenuadas como sistema de suministro, un método adecuado para vacunas de ADN que se administran por vía oral. Las bacterias se transforman con un plásmido que se replica de forma independiente, que se libera en el citoplasma de la célula anfitriona tras la muerte de la bacteria atenuada en la célula anfitriona.

Las vacunas de ADN, incluido el ADN que codifica el antígeno deseado, pueden introducirse en una célula anfitriona en cualquier forma adecuada, incluido el fragmento solo, un plásmido linealizado, un plásmido circular, un plásmido capaz de replicarse, un episoma, ARN, etc. Preferiblemente, el gen está contenido en un plásmido. En ciertas realizaciones, el plásmido es un vector de expresión. Se pueden producir vectores de expresión individuales capaces de expresar el material genético utilizando técnicas recombinantes convencionales. Véase, p. ej., Maniatis et al., 1985 Molecular Cloning: A Laboratory Manual or DNA cloning, vol. I y II (D. N. Glover, ed., 1985) para métodos generales de clonación.

Las vías de administración incluyen, pero sin limitarse a, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular y oral, así como tópica, transdérmica, por inhalación o supositorio o al tejido mucoso tal como mediante lavado de tejido vaginal rectal, uretral, bucal y sublingual. Las vías de administración típicas incluyen inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. Las construcciones genéticas se pueden administrar mediante medios que incluyen, pero sin limitarse a, jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin aguja, "pistolas genéticas de bombardeo de microproyectiles" u otros métodos físicos tales como electroporación ("EP"), "método hidrodinámico" o ultrasonido. Las vacunas de ADN se pueden suministrar mediante cualquier método que se pueda utilizar para suministrar ADN, siempre que el ADN se exprese y se produzca el antígeno deseado en la célula.

En algunas realizaciones, una vacuna de ADN se suministra a través de reactivos de transfección conocidos tales como liposomas catiónicos, emulsión de fluorocarbono, cocleato, túbulos, partículas de oro, microesferas biodegradables o polímeros catiónicos. Los vehículos de suministro de cocleato son precipitantes estables de fosfolípidos cálcicos que consisten en fosfatidilserina, colesterol y calcio; este reactivo de transfección no tóxico y no inflamatorio puede estar presente en el sistema digestivo. Las microesferas biodegradables comprenden polímeros tales como poli(lactida-co-glicólido), un poliéster que se puede utilizar para producir microcápsulas de ADN para la transfección. Los microtubos basados de lípidos a menudo consisten en un lípido de dos capas enrolladas en espiral empaquetadas con sus bordes unidos entre sí. Cuando se utiliza un túbulo, el ácido nucleico puede disponerse en la parte hueca central del mismo para su suministro y liberación controlada en el cuerpo de un animal.

En algunas realizaciones, la vacuna de ADN se suministra a las superficies mucosas a través de microesferas. Las microesferas bioadhesivas se pueden preparar utilizando diferentes técnicas y se pueden adaptar para adherirse a cualquier tejido mucoso, incluidos los que se encuentran en los ojos, la cavidad nasal, el tracto urinario, el colon y el tracto gastrointestinal, ofreciendo posibilidades de liberación controlada de vacunas tanto localizada como sistémica. La aplicación de microesferas bioadhesivas a tejidos mucosos específicos también se puede utilizar para la acción vacunal localizada. En algunas realizaciones, un enfoque alternativo para el suministro de vacunas a las mucosas es la administración directa a las superficies mucosas de un vector de expresión de ADN plasmídico que codifica el gen para un antígeno proteico específico.

Las vacunas de ADN plasmídico según la presente divulgación se formulan según el modo de administración que se vaya a utilizar. En algunas realizaciones en las que las vacunas de plásmidos de ADN son composiciones inyectables, estas son estériles y/o están libres de pirógenos y/o de partículas. En algunas realizaciones, se utiliza preferiblemente una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunas realizaciones, se prefieren soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. En algunas realizaciones, los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. En algunas realizaciones, se añade un agente vasoconstrictor a la formulación. En algunas realizaciones, se añade a la formulación un agente estabilizante que permite que la formulación sea estable a temperatura de la sala o temperatura ambiente durante períodos de tiempo prolongados, t al como LGS u otros policationes o polianiones.

En algunas realizaciones, la vacuna de ADN puede comprender adicionalmente un portador o diluyente farmacológicamente aceptables. Los portadores adecuados para la vacuna son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, proteínas, azúcares, etc. Tales portadores pueden ser soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de portadores no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluidos medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer y cloruro de sodio, Ringer con lactato añadido o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Los conservantes y antimicrobianos incluyen antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Los conservantes preferidos incluyen formalina, timerosal, neomicina, polimixina B y anfotericina B.

Un enfoque alternativo para administrar el ácido nucleico a un animal implica el uso de un vector viral o bacteriano. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen adenovirus, virus de la polio, virus de la viruela tales como vaccinia, viruela de canarios y viruela aviar, virus del herpes, incluido el virus del herpes del bagre, vectores asociados a adenovirus y retrovirus. Los vectores bacterianos ilustrativos incluyen formas atenuadas de Salmonella, Shigella, Edwardsiella ictaluri, Yersinia ruckerii y Listeria monocytogenes. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un vector, tal como un plásmido, que es capaz de expresión autóloga de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico.

Un vector puede incluir un ácido nucleico que codifica un antígeno neumocócico en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula anfitriona. Un vector de expresión recombinante típicamente incluye una o más secuencias reguladoras conectadas operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Las secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, así como secuencias reguladoras y/o inducibles específicas de tejido. Una secuencia que codifica un antígeno neumocócico puede incluir una secuencia que codifica un péptido señal (p. ej., un péptido señal heterólogo) de manera que el antígeno se secrete a partir de una célula anfitriona. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se vaya a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada y similares.

Se pueden diseñar vectores de expresión recombinantes para la expresión y producción de antígenos neumocócicos en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, los antígenos se pueden expresar en E. coli, células de insecto (p. ej., utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células anfitrionas adecuadas son analizadas con más detalle por Goeddel, Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. Alternativamente, se puede transcribir y traducir in vitro un vector de expresión recombinante, por ejemplo, utilizando secuencias reguladoras del promotor t 7 y polimerasa T7.

La expresión de polipéptidos en procariotas se lleva a cabo a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, p. ej., al extremo amino o carboxi de la proteína recombinante, p. ej., para aumentar la expresión de la proteína recombinante; aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y/o ayudar en la purificación del antígeno recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del radical de fusión y el antígeno recombinante para permitir la separación del antígeno recombinante del radical de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. Gene 67:31-40, 1988), μMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRITS (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. Los vectores de expresión de antígenos neumocócicos proporcionados en el presente documento incluyen vectores de expresión de levadura, vectores para expresión en células de insecto (p. ej., un vector de expresión de baculovirus) y vectores adecuados para expresión en células de mamífero.

Un vector de expresión para uso en células de mamíferos puede incluir elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simio 40. Un vector puede incluir un promotor inducible, p. ej., un promotor regulado por una hormona esteroide, por una hormona polipeptídica (p. ej., mediante una vía de transducción de señales), o por un polipéptido heterólogo (p. ej., los sistemas inducibles por tetraciclina, "Tet-On" y "Tet-Off"; véanse, p. ej., Clontech Inc., CA, Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547, 1992, y Paillard, Human Gene Therapy 9:983, 1989).

Una célula anfitriona puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un antígeno neumocócico puede expresarse en células bacterianas (tales como E. coli), células de insecto, células de levadura o mamífero (tales como Células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS (Células de riñón de mono verde africano de células CV-1 en origen que contienen SV40; Gluzman, Cell 23: 175-182, 1981). Los expertos en la técnica conocen otras células anfitrionas adecuadas.

El ADN vector puede introducirse en células anfitrionas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se emplean en el presente documento, se pretende que los términos "transformación" y "transfección" se refieran a una variedad de mecanismos reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (p. ej., ADN) en una célula anfitriona, incluida coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, pistola genética o electroporación.

Se puede utilizar una célula anfitriona para producir (es decir, expresar) un antígeno neumocócico. Por consiguiente, la divulgación proporciona adicionalmente métodos para producir un antígeno neumocócico utilizando células anfitrionas. En una realización, el método incluye cultivar una célula anfitriona (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un antígeno neumocócico) en un medio adecuado de modo que se produzca un antígeno neumocócico. En otra realización, el método incluye adicionalmente aislar un antígeno neumocócico del medio o de la célula anfitriona. Se pueden utilizar antígenos neumocócicos purificados para administración a mamíferos para inducir una respuesta inmunitaria y/o generar anticuerpos específicos para los antígenos.

La presente divulgación también proporciona composiciones de ácidos nucleicos que codifican antígenos neumocócicos para administración a un sujeto in vivo, p. ej., para provocar una respuesta inmunitaria al antígeno. En algunas realizaciones, una composición de ácido nucleico para administración in vivo incluye un plásmido de ADN desnudo que codifica un antígeno neumocócico. También se pueden utilizar vectores bacterianos, vectores replicones, bacterias vivas atenuadas y vectores virales para la expresión de genes heterólogos. Los vectores virales vivos atenuados (p. ej., vaccinia recombinante (p. ej., vaccinia modificada Ankara (MVA), IDT Alemania), adenovirus recombinantes, poxvirus aviar (p. ej., viruela del canario (p. ej., ALVAC™, Aventis Pasteur) o viruela aviar), poliovirus y vectores viriónicos de alfavirus) han tenido éxito en la inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células a antígenos. Los poxvirus aviares son defectuosos en anfitriones mamíferos, pero pueden expresar genes heterólogos insertados bajo promotores tempranos. Los vectores de adenovirus y poliovirus recombinantes pueden prosperar en el intestino y, por lo tanto, estimular respuestas inmunitarias por vía mucosa eficientes. Por último, las bacterias atenuadas también se pueden utilizar como vehículo para el suministro de vacunas de ADN. Los ejemplos de bacterias adecuadas incluyen S. enterica, S. tymphimurium, Listeria y BCG. El uso de bacterias mutantes con paredes celulares débiles puede ayudar a la salida de los plásmidos de ADN de la bacteria.

Las composiciones de ácido nucleico utilizadas para la inmunización pueden incluir un adyuvante (p. ej., un adyuvante tal como un polímero, una saponina, dipéptido muramil, liposomas, oligonucleótido inmunomodulador u otro adyuvante descrito en el presente documento) para promover la absorción de ácido nucleico. Independientemente de la vía, los adyuvantes se pueden administrar antes, durante o después de la administración del ácido nucleico. En algunas realizaciones, un adyuvante aumenta la absorción de ácido nucleico en las células anfitrionas y/o aumenta la expresión del antígeno del ácido nucleico dentro de la célula, induce a las células presentadoras de antígeno a infiltrarse en la región del tejido donde se expresa el antígeno, o aumenta la respuesta específica de antígeno proporcionada por los linfocitos.

Los términos "homología", "identidad" y "similitud" se refieren al grado de similitud de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico óptimamente alineadas. La homología y la identidad pueden determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Por ejemplo, se basa en utilizar un soporte lógico de homología convencional en la posición por defecto, tal como BLAST, versión 2.2.14. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base o aminoácido, las moléculas son idénticas en esa posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por restos de aminoácidos similares (p. ej., similares en naturaleza estérica y/o electrónica tal como, p. ej., sustituciones de aminoácidos conservativas), las moléculas pueden denominarse homólogas (similares) en esa posición. La expresión como porcentaje de homología/similitud o identidad se refiere a una función del número de aminoácidos similares o idénticos en posiciones compartidas por las secuencias comparadas, respectivamente. Una secuencia que "no está relacionada" o "no es homóloga" comparte menos del 40% de identidad, aunque preferiblemente menos de 25% de identidad con las secuencias divulgadas en el presente documento.

En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico es una variante de un antígeno neumocócico de la Tabla 1 que es sustancialmente idéntica a una secuencia de SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234. El término "identidad sustancial" como se emplea en el presente documento denota una característica de una secuencia del polinucleótido o aminoácidos, en donde los polinucleótidos o aminoácidos comprenden una secuencia que tiene al menos 85% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90% a 95% de identidad de secuencia, más usualmente al menos 99% de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia en una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente en una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que totalizan 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande. El término "similitud", cuando se emplea para describir un polipéptido, se determina comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

En algunas realizaciones, un antígeno neumocócico es homólogo a una secuencia de SEQ ID NO: 1 -76 o SEQ ID NO: 153-234. Como se emplean en el presente documento, los términos "homólogo" u "homólogos" se utilizan indistintamente, y cuando se utilizan para describir un polinucleótido o polipéptido, indican que dos polinucleótidos o polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan de manera óptima, por ejemplo utilizando BLAST, la versión 2.2.14 con parámetros por defecto para un alineamiento (véase el presente documento) son idénticos, con inserciones o deleciones de nucleótidos o inserciones o eliminaciones de aminoácidos apropiadas, en al menos 60% de los nucleótidos, usualmente de aproximadamente 75% a 99%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98 a 99% de los nucleótidos. Los términos "homólogo" u "homólogos" como se emplea en el presente documento también se refieren a homología con respecto a la estructura y/o función. Con respecto a la homología de secuencia, las secuencias son homólogas si son al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% idénticas, al menos 97% idénticas o al menos 99% idénticas. El experto en la técnica puede lograr fácilmente la determinación de homólogos de los genes o péptidos de la presente divulgación.

En algunos casos, puede resultar ventajoso diseñar vacunas basadas en antígenos que se "expresen en la superficie" en lugar de en el citoplasma. Los genomas anotados a menudo describen la ubicación de las proteínas basándose en la homología con otras proteínas identificadas, pero esto puede ser un enfoque imperfecto o a menudo incorrecto, ya que las proteínas homólogas de dos organismos diferentes pueden no necesariamente estar ubicadas en el mismo sitio (ni tener la misma función) en ambos. Por lo tanto, una herramienta adicional para determinar la ubicación de la proteína (superficie versus otra) puede ser muy útil y también puede utilizarse en el método del cloroformo descrito en el presente documento.

Una realización del presente método comprende identificar una proteína, "X" de interés, a continuación, retirar el gen que codifica X del organismo, después reemplazar ese gen con un gen que codifica una versión etiquetada de la proteína X (p. ej., etiquetada con His, HA, péptido OVA, entre otros), que puede detectarse fácilmente con anticuerpos monoclonales o policlonales. Después de la confirmación de la construcción genética, el organismo se cultiva y se tiñe con un anticuerpo que reconoce la etiqueta (y también se fusiona con un fluoróforo). A continuación, se utiliza la citometría de flujo para evaluar si los anticuerpos están adheridos a la superficie del organismo, en cuyo caso, se puede deducir que el antígeno se expresa en la superficie. También se pueden utilizar estrategias similares que utilizan anticuerpos adheridos a cuentas magnéticas. En el caso del neumococo, por ejemplo, el organismo puede evaluarse en su forma encapsulada o no encapsulada. Un antígeno puede expresarse en la superficie, pero estar oculto debajo de la cápsula; para fines de selección del antígeno, puede ser ventajoso seleccionar un antígeno que se exprese en la superficie y sea accesible a pesar de la encapsulación.

Las proteínas inmunogénicas identificadas o mezclas de las mismas se pueden utilizar en una vacuna multivalente o individual, que se puede administrar de muchas formas (por vía intramuscular, subcutánea, mucosa, transdérmica). Por ejemplo, combinaciones o permutaciones de los doce inmunógenos neumocócicos pueden ser más eficaces contra la colonización que contra la enfermedad. Una combinación de varios inmunógenos con ambas características puede proporcionar una vacuna superior.

Anticuerpos

Los anticuerpos dirigidos contra un antígeno neumocócico o fragmento funcional del mismo como se divulga en la Tabla 1 se pueden utilizar en una aplicación profiláctica o terapéutica para conferir inmunidad de un primer individuo a un segundo individuo (p. ej., para aumentar la respuesta inmunitaria del segundo individuo contra S.pneumoniaeo para proporcionar una respuesta si el segundo individuo es un paciente inmunocomprometido). Los anticuerpos dirigidos contra un antígeno neumocócico como se divulga en el presente documento pueden generarse en un anfitrión inmunocompetente (p. ej., administrando al anfitrión inmunocompetente un producto conjugado descrito en el presente documento), recolectarse del anfitrión y transfundirse a un receptor que necesita tratamiento o profilaxis, confiriendo así resistencia al receptor no sólo contra la toxina neumolisina, sino también contra S.pneumoniaey posiblemente cualquier otra bacteria que se una a los anticuerpos provocados por el antígeno neumocócico.

Los anticuerpos provocados por una composición descrita en el presente documento se pueden formular como una composición farmacéutica y utilizar para conferir una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica a un individuo. En el presente documento se describen componentes y métodos de administración adecuados para composiciones farmacéuticas. Para provocar inmunidad pasiva, la composición farmacéutica puede contener anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales o sus derivados de fragmentos. Una composición farmacéutica contiene una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento o derivado, según se determina mediante técnicas clínicas convencionales.

En consecuencia, esta divulgación proporciona, entre otros, anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, contra un nuevo antígeno neumocócico descrito en el presente documento, p. ej., los enumerados en la Tabla 1, o un antígeno polipeptídico SP0785, un antígeno polipeptídico SP1500, un antígeno polipeptídico SP0346, un antígeno polipeptídico SP1386, un antígeno polipeptídico SP0084, un antígeno polipeptídico SP1479, un antígeno polipeptídico CT067, un antígeno polipeptídico CT476, un antígeno polipeptídico p6, un antígeno polipeptídico SP2145 o cualquier antígeno neumocócico enumerado en la Tabla 1, p. ej., SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234), o fragmentos funcionales o variantes de los mismos. Los anticuerpos pueden ser de diversos isotipos, que incluyen: IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD o IgE. En algunas realizaciones, un anticuerpo es un isotipo de IgG, p. ej., IgG1. Un anticuerpo contra un antígeno neumocócico puede ser de longitud completa (p. ej., un anticuerpo IgG1 o IgG4) o puede incluir sólo un fragmento de unión al antígeno (p. ej., un fragmento Fab, F(ab)2, Fv o Fv de cadena sencilla). Estos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados, así como fragmentos de unión a antígeno de los anteriores.

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluida la metodología de anticuerpos monoclonales convencional, p. ej., la técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495, 1975. Los anticuerpos policlonales pueden producirse mediante inmunización de sujetos animales o humanos. Véase en general, Harlow, E. y Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988. Los anticuerpos contra antígenos neumocócicos descritos en el presente documento se pueden utilizar, p. ej., para ensayos de diagnóstico o para aplicaciones terapéuticas.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la respuesta de un sujeto a una composición inmunogénica descrita en el presente documento se evalúa, p. ej., para determinar la eficacia de la composición y/o para comparar las respuestas provocadas por la composición con las respuestas provocadas por una composición diferente.

Ácidos nucleicos que codifican antígenos polipeptídicos neumocócicos

Los ácidos nucleicos que codifican un antígeno polipeptídico neumocócico o un fragmento o variante de polipéptido neumocócico se pueden administrar a un mamífero (p. ej., un ser humano) para generar una respuesta inmunitaria profiláctica y/o terapéutica en el mamífero. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria humoral y/o celular antineumocócica.

Los polipéptidos que pueden codificarse por las construcciones de ácido nucleico incluyen uno o más antígenos polipeptídicos neumocócicos, solos o fusionados a un polipéptido de fusión, p. ej., PdT y/o un polisacárido y/u otro antígeno, p. ej., Vi. Además, un ácido nucleico puede codificar una combinación de dos o más de tales polipéptidos, fragmentos o variantes.

Las construcciones de expresión de ácidos nucleicos se pueden preparar utilizando métodos de ADN recombinante convencionales. Se pueden incluir elementos reguladores en una construcción para facilitar la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Estos elementos incluyen secuencias para mejorar la expresión en células humanas o de otros mamíferos, p. ej., promotores, secuencias de estabilización de ARN en 5' y/o 3' con respecto a la secuencia codificante, intrones (que pueden colocarse en cualquier ubicación dentro o adyacente a la secuencia codificada) y sitios de adición de poli(A), así como un origen de replicación y uno o más genes que codifican marcadores seleccionables que permiten que las construcciones repliquen y sean seleccionadas en anfitriones procarióticos y/o eucarióticos. Un promotor de la polimerasa T7 u otro tipo de promotor (p. ej., un promotor específico de tejido o un promotor específico de célula tal como un promotor específico de músculo) está opcionalmente presente en el extremo 5' de la secuencia codificante, y una secuencia que codifica un FLAG u otro determinante de mAb está opcionalmente presente en el extremo 3' de la secuencia codificante. La construcción también puede contener otras señales transcripcionales y traduccionales, tales como una secuencia de Kozak.

La construcción puede incluir además una secuencia que codifica una señal de direccionamiento que dirige el polipéptido codificado a un compartimento intracelular deseado, estando unida la señal de direccionamiento al polipéptido. Las señales de dirección pueden dirigir el polipéptido codificado al retículo endoplásmico (ER), el aparato de Golgi, el núcleo, un lisosoma, un compartimento de carga de péptidos de clase II o un endosoma, e incluyen péptidos señal, péptidos de retención en ER y péptidos de direccionamiento a lisosomas.

Los ácidos nucleicos se pueden utilizar en cualquier vector que permita la expresión en células de un mamífero. El vector puede ser, p. ej., un vector no viral tal como un vector plasmídico o bacteriano, un vector viral integrante o un vector viral no integrante. Un ejemplo de un vector adecuado es la familia de vectores de expresión de mamíferos pcDNA (Invitrogen), que permiten la clonación directa y rápida de productos de PCR.

Pueden utilizarse diversos sistemas de suministro para suministrar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos en células apropiadas. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos se pueden suministrar en un portador farmacéuticamente aceptable tal como solución salina, o como suspensiones coloidales, o como polvos, con o sin diluyentes. Los ácidos nucleicos pueden estar "desnudos" o asociados con vehículos de suministro y se pueden suministra utilizando sistemas de suministro conocidos en la técnica, tales como lípidos, liposomas, microesferas, micropartículas o microcápsulas, partículas de oro, ISCOMS, nanopartículas, polímeros, agentes de condensación, polisacáridos, poliaminoácidos, dendrímeros, saponinas, QS21, materiales mejoradores de la adsorción, adyuvantes o ácidos grasos. Los ácidos nucleicos también se pueden suministrar a una célula, p. ej., una célula de músculo esquelético, ya sea in vitro o in vivo, mediante electroporación.

Los ácidos nucleicos se pueden administrar utilizando métodos convencionales, p. ej., los descritos por Donnelly et al., J. Immunol. Methods 176:145, 1994, y Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995 y se puede suministrar a sujetos de cualquier manera conocida en la técnica, p. ej., por vía oral, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intratecal, intradérmica, intraperitoneal, intranasal, intrapulmonar, intraocular, intravaginal, intrarrectal o subcutánea. Pueden introducirse en el tracto gastrointestinal o en el tracto respiratorio, p. ej., mediante inhalación de una solución o polvo que contiene los ácidos nucleicos. La administración puede ser local o sistémica.

Se espera que se administre a un individuo una dosificación de aproximadamente 100-2000 μg de ácido nucleico. Cuando el paciente es un ser humano adulto, los regímenes de vacunación pueden incluir, p. ej., administraciones intramusculares, intradérmicas, por inhalación o subcutáneas de 10-1000 μg de un ADN plasmídico cuando se suministra en una micropartícula, o de aproximadamente 10-2500 μg, p. ej., 100 a 2000, o de 500 a 1000 μg, de ADN plasmídico desnudo suministrado por vía intramuscular o intradérmica, repetido de 3 a 6 veces. Como es bien conocido en la técnica médica, la dosificación para cualquier paciente determinado depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, su salud general, su sexo, su superficie corporal, su edad, el compuesto particular que va a administrarse, el tiempo y la vía de administración, y de otros medicamentos que se administran simultáneamente. La determinación de la dosificación óptima está dentro de las capacidades de un farmacólogo con experiencia normal.

También se pueden utilizar otros métodos de suministro convencionales, p. ej., transferencia biolística o tratamientoex-vivo.En el tratamiento ex vivo, las células presentadoras de antígenos (APC), tales como las células dendríticas, las células mononucleares de sangre periférica o las células de la médula ósea, pueden obtenerse de un paciente o de un donante apropiado y activarse ex vivo con el ácido nucleico, y luego implantarse o reinfundirse en el paciente.

Los ácidos nucleicos se pueden administrar solos o combinados con otras terapias conocidas en la técnica, p. ej., agentes antimicrobianos. Además, los ácidos nucleicos se pueden administrar combinados con otros tratamientos diseñados para mejorar las respuestas inmunitarias, p. ej., mediante administración conjunta con adyuvantes, citocinas (o ácidos nucleicos que codifican citocinas) u oligonucleótidos CpG, como se conoce bien en la técnica.

La capacidad de un ácido nucleico para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero anfitrión se puede analizar utilizando métodos para medir respuestas inmunitarias que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la generación de células T citotóxicas se puede demostrar en un ensayo de liberación de 51Cr convencional, midiendo la expresión o secreción de citocinas intracelulares o utilizando tetrámeros de MHC. Se pueden utilizar ensayos convencionales, tales como ELISA o ELISPOT, para medir los perfiles de citocinas atribuibles a la activación de las células T. La proliferación de células T se puede medir utilizando ensayos tales como la absorción de 3Htimidina y otros ensayos conocidos en la técnica. Las respuestas de las células B se pueden medir utilizando ensayos reconocidos en la técnica tales como ELISA. También se pueden utilizar otras metodologías para evaluar los efectos de los ácidos nucleicos sobre lesiones asociadas a patógenos o sobre otros niveles de patógenos en general (p. ej., eliminación de neumococos en ratones sensibilizados tratados con el producto conjugado).

Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección con S.pneumoniaeo afecciones asociadas con tal infección.

Ensayos para la activación de células T

En algunas realizaciones, se pueden utilizar diversos ensayos para caracterizar un antígeno o composición y/o determinar si se ha estimulado una respuesta inmunitaria en una célula T o grupo de células T. En algunas realizaciones, se utilizan ensayos para caracterizar una respuesta de células T en un sujeto al que se le ha administrado una composición inmunogénica para provocar una respuesta antineumocócica (p. ej., para evaluar si se ha provocado una respuesta de células T detectable y/o para evaluar la potencia de la respuesta). Los nuevos antígenos neumocócicos descritos en el presente documento también proporcionan agentes de diagnóstico para evaluar la exposición a infecciones neumocócicas (p. ej., en sujetos no vacunados). En algunas realizaciones, se utilizan ensayos para caracterizar una respuesta de células T en un sujeto para determinar si el sujeto ha sido infectado con un organismo neumocócico. El sujeto puede ser un sujeto sospechoso de exposición reciente a un organismo neumocócico (es decir, se puede realizar un ensayo para detectar una respuesta con una muestra tomada del sujeto aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 30 o más días después de la sospecha de exposición al organismo neumocócico). El sujeto puede ser un sujeto sospechoso de exposición a un organismo neumocócico semanas, meses o años antes del ensayo. Los nuevos antígenos neumocócicos descritos en el presente documento también proporcionan agentes pronósticos para evaluar los resultados de la exposición a un organismo neumocócico (p. ej., en sujetos que se sabe que están, o que han estado, infectados con un organismo neumocócico). En algunas realizaciones, se utilizan ensayos para caracterizar una respuesta de células T en un sujeto para evaluar la probabilidad de secuelas (p. ej., sepsis) de la infección con un organismo neumocócico.

En algunas realizaciones, la estimulación de una respuesta inmunitaria en las células T se determina midiendo la producción de citocinas inducida por antígenos por parte de las células T. En algunas realizaciones, la estimulación de una respuesta inmunitaria en células T se puede determinar midiendo la producción inducida por antígeno de IFN-Y, IL-4, IL-2, IL-6, IL-10, IL-17 y/o TNF-a por parte de las células T. En algunas realizaciones, la producción de citocinas inducida por antígenos por parte de las células T se puede medir mediante tinción de citocinas intracelulares seguida de citometría de flujo. Otros métodos adecuados incluyen tinción de captura de superficie seguida de citometría de flujo o métodos que determinan la concentración de citocinas en sobrenadantes de cultivos de células T activadas, tales como ensayos ELISA o ELISPOT.

En algunas realizaciones, la producción de citocinas producida por antígenos por parte de las células T se mide mediante el ensayo ELISPOT. Los ensayos ELISPOT emplean típicamente una técnica muy similar a la técnica del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) tipo sándwich. Se aplica como recubrimiento asépticamente un anticuerpo (p. ej., anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, etc.) sobre una microplaca con soporte de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno). Los anticuerpos se eligen por su especificidad por la citocina de interés. La placa está bloqueada (p. ej., con una proteína sérica que no reacciona con ninguno de los anticuerpos del ensayo). Las células que se van a probar para determinar la producción de citocinas se siembran en placas con diferentes densidades, junto con antígeno o mitógeno, y después se colocan en una incubadora con CO2a 37°C humidificada durante un período de tiempo específico. La citocina secretada por las células activadas es capturada localmente por el anticuerpo aplicado como recubrimiento sobre la membrana de PVDF de alta área de superficie. Después de lavar los pocillos para eliminar las células, los desechos y los componentes del medio, se añade a los pocillos un anticuerpo secundario (p. ej., un anticuerpo policlonal biotinilado) específico para la citocina. Este anticuerpo reacciona con un epítopo distinto de la citocina diana y, por tanto, se emplea para detectar la citocina capturada. Después de un lavado para eliminar cualquier anticuerpo biotinilado no unido, la citocina detectada se visualiza utilizando avidina-HRP y un sustrato precipitante (p. ej., AEC, BCIP/NBT). El producto final coloreado (un punto, usualmente de color rojo o azul) típicamente representa una célula individual productora de citocinas. Los puntos se pueden contar manualmente (p. ej., con un microscopio de disección) o utilizando un lector automatizado para capturar las imágenes de los micropocillos y analizar el número y el tamaño de los puntos. En algunas realizaciones, cada punto se correlaciona con una única célula productora de citocinas.

En algunas realizaciones, se dice que se estimula una respuesta inmunitaria en las células T si entre aproximadamente 1% y aproximadamente 100% de las células T específicas de antígeno producen citocinas. En algunas realizaciones, se dice que se estimula una respuesta inmunitaria en células T si al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% de las células T específicas de antígeno producen citocinas.

En algunas realizaciones, se dice que se estimula una respuesta inmunitaria en células T si los sujetos inmunizados comprenden al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 500 veces, al menos aproximadamente 1.000 veces, al menos aproximadamente 5.000 veces, al menos aproximadamente 10.000 veces, al menos aproximadamente 50.000 veces, al menos aproximadamente 100.000 veces o más de al menos aproximadamente 100.000 veces más células productoras de citocinas que los controles no tratados previamente.

En algunas realizaciones, la estimulación de una respuesta inmunitaria en células T se puede determinar midiendo la proliferación de células T inducida por antígeno. En algunas realizaciones, la proliferación inducida por antígeno se puede medir como la absorción de H3-timidina en células T en división (a veces denominada "prueba de transformación de linfocitos o "LTT"). En algunas realizaciones, se dice que se ha producido proliferación inducida por antígeno si la absorción de 3H-timidina (proporcionada como número de recuentos de un contador<y>) es al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 500 veces, en al menos aproximadamente 1.000 veces, al menos aproximadamente 5.000 veces, al menos aproximadamente 10.000 veces o más que al menos aproximadamente 10.000 veces mayor que un control no tratado previamente.

En algunas realizaciones, la proliferación inducida por antígeno se puede medir mediante citometría de flujo. En algunas realizaciones, la proliferación inducida por antígeno se puede medir mediante un ensayo de dilución de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). CFSE es un colorante no tóxico, fluorescente y permeable a la membrana que une los grupos amino de las proteínas citoplasmáticas con su grupo reactivo succinimidilo (p. ej., proteínas de células T). Cuando las células se dividen, las proteínas marcadas con CFSE se distribuyen equitativamente entre las células hijas, reduciendo así a la mitad la fluorescencia celular con cada división. Por consiguiente, las células T específicas de antígeno pierden su fluorescencia después del cultivo en presencia del antígeno respectivo (CFSEbaja) y se distinguen de otras células en cultivo (CFSEalta). En algunas realizaciones, se dice que se ha producido proliferación inducida por antígeno si la dilución de CFSE (proporcionada como el porcentaje de células CFSEbaja de todas las células CFSE+) es al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 100%.

En algunas realizaciones, se dice que se estimula una respuesta inmunitaria en las células T si los marcadores celulares de activación de las células T se expresan en diferentes niveles (p. ej., niveles más altos o más bajos) con relación a las células no estimuladas. En algunas realizaciones, CD11a, CD27, CD25, CD40L, CD44, CD45<r>O y/o CD69 se expresan más en células T activadas que en células T no estimuladas. En algunas realizaciones, L-selectina (CD62L), CD45RA y/o CCR7 se expresan menos en células T activadas que en células T no estimuladas.

En algunas realizaciones, una respuesta inmunitaria en células T se mide analizando la citotoxicidad de las células T CD8+ efectoras contra células diana pulsadas con antígeno. Por ejemplo, se puede realizar el ensayo de liberación de 51cromo (51Cr). En este ensayo, las células T CD8+ efectoras se unen a las células infectadas que presentan el péptido viral en el MHC de clase I y les indican a las células infectadas que experimenten apoptosis. Si las células están etiquetadas con 51Cr antes de que se añadan las células T CD8+ efectoras, la cantidad de 51Cr liberado al sobrenadante es proporcional al número de dianas destruidas. En algunas realizaciones, una respuesta inmunitaria en células T se mide mediante un ensayo de citotoxicidadin vivoen el que las células diana se pulsan con antígeno y se marcan con un colorante fluorescente, a continuación, se transfieren a animales inmunizados. Las células T citolíticas específicas provocan la desaparición de las células marcadas con fluorescencia que reciben un pulso con un antígeno relevante, pero no disminuyen las células pulsadas con un antígeno de control. Véase, p. ej., Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 3.11.14-16, John Wiley & Sons, Inc., 2007. En algunas realizaciones, una respuesta inmunitaria en células T se mide detectando la expresión de uno o más de Perforina, Granzima B o CD107a (p. ej., mediante ELISPOT o citometría de flujo). Véase, p. ej., Betts et al., J. Immunol. Meth. 281 (1-2):65-78, 2003.

E n sa yo s in vivo

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica se puede caracterizar (p. ej., para evaluar la eficacia en la inducción de una respuesta beneficiosa en modelos animales) infectando grupos de ratones inmunizados y no inmunizados (p. ej., 3 o más semanas después de la vacunación) con una dosis de un organismo clamidia que típicamente produce una patología particular (p. ej., infección del tracto urogenital superior) o carga bacteriana. Se verifica y compara la magnitud y duración de la patología o carga bacteriana debida a la infección de ambos grupos. En un ejemplo, las respuestas de las células B se caracterizan por la transferencia de suero de ratones inmunes como una "vacuna pasiva" para evaluar la protección de ratones no inmunes contra efectos patológicos o carga de infección. En algunas realizaciones, se caracterizan poblaciones de leucocitos infiltrantes (p. ej., para evaluar el número y tipo de células en una región de infección, p. ej., si están presentes células T CD4+, células T CD8+ u otros tipos de células). Se han descrito modelos animales para la infección urogenital por clamidia. En algunas realizaciones, se aplica un organismo clamidia como inóculo intravaginal y se caracterizan la infección y patología de uno o más de los tractos genitales superior e inferior del animal infectado. Véase, p. ej., Barron et al. (J. Infect. Dis. 143(1) :63-6, 1981), que describe un modelo de infección intravaginal en ratones. En algunas realizaciones, la eliminación de la infección primaria es una medida de inmunidad protectora en este modelo. En algunas realizaciones, la detección de respuestas de células T CD4+ de un subtipo Th1 se correlaciona con la protección (Morrison et al., Infect. Immun 70:2741 -2751, 2002).

En algunas realizaciones, se evalúa una composición inmunogénica en un modelo animal de infección neumocócica. En algunas realizaciones, la infección del tracto urogenital inferior por neumococo se evalúa en el modelo (p. ej., se evalúan la carga bacteriana del tracto inferior y/o la inflamación debida a la infección). En algunas realizaciones, la infección del tracto superior por clamidia se evalúa en el modelo (p. ej., se evalúan una o más de la carga bacteriana del tracto superior, inflamación, infertilidad, depósito de colágeno, cicatrices debidas a infección). En algunas realizaciones, se evalúa la capacidad para prevenir el ascenso de una infección por clamidia desde el tracto inferior hasta el tracto genital superior. En algunas realizaciones, se evalúa la tasa de eliminación bacteriana del tracto inferior. En algunas realizaciones, se evalúa la tasa de eliminación bacteriana del tracto superior. En alguna realización, se evalúa la tasa de eliminación bacteriana de la nariz. En algunas realizaciones, se evalúa una composición inmunogénica en un modelo animal en múltiples cepas del animal de interés (p. ej., múltiples cepas de ratón). En algunas realizaciones, se evalúa la presencia y el tamaño de hidrosálpinx (obstrucción de líquido de las trompas de Falopio).

En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas deseables se caracterizan por tener uno o más de los efectos anterioresin vivo(p. ej., en un modelo animal). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición inmunogénica reduce la infección del tracto urogenital inferior por la bacteria clamidia. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica reduce la carga bacteriana del tracto inferior. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica reduce la inflamación del tracto inferior debida a una infección. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica reduce la infección del tracto superior por neumococo. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica reduce el ascenso de una infección neumocócica desde el tracto inferior hasta el tracto genital superior. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica aumenta la tasa de eliminación bacteriana del tracto inferior y/o del tracto superior. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica tiene uno o más de los efectos anteriores en múltiples cepas de animales (p. ej., múltiples cepas de ratón).

En algunas realizaciones, los antígenos neumocócicos de la Tabla 1 o fragmentos funcionales de los mismos para su uso en las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento provocan una respuesta de IL-17A en esplenocitos de ratón o PBMC humanasin vitrocomo se divulga en el Ejemplo 2, y/o protege de la colonizaciónin vivoen un modelo de colonización de ratón, donde los ratones se exponen a un serotipo de cepa neumocócica (p. ej., serotipos 6B, 14F o 19F) después de una inmunización quincenal con un antígeno neumocócico (o fragmento funcional), y se evalúa la presencia de colonización neumocócica en la nariz, como se divulga en el Ejemplo 3.

Un experto en la técnica reconocerá que los ensayos descritos anteriormente son sólo métodos ilustrativos que podrían utilizarse para determinar si se ha producido activación de células T y/o activación de células B. Cualquier ensayo conocido por un experto en la técnica que pueda utilizarse para determinar si se ha producido activación de células T y/o B está dentro del alcance de esta invención. Los ensayos descritos en el presente documento, así como ensayos adicionales que podrían utilizarse para determinar si se ha producido activación de células T y/o B, se describen en Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Hoboken, N.Y., 2007).

Los estudios en curso evalúan la inmunogenicidad en cepas animales exógenas y caracterizan la eficacia de estas proteínas en la protección contra enfermedades invasivas en modelos de aspiración/sepsis. En algunas realizaciones, se puede probar la capacidad de un antígeno neumocócico, p. ej., un antígeno enumerado en la Tabla 1, o un homólogo o fragmento funcional o variante de un antígeno enumerado en la Tabla 1 para provocar una respuesta inmunitariain vivo,midiendo una respuesta CMI al antígeno diana. Los ensayos de CMI son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2005/0014205, el documento WO/1987/005400, la Patente de Estados Unidos Núm. 5.674.698 y kits disponibles comercialmente tales como IMMUNKNOW® de CYLEX Ensayo de función de células inmunitarias Núm. de Producto 4400.

Aplicaciones y uso de las composiciones inmunogénicas.

Las vacunas de S.pneumoniaedescritas en el presente documento se pueden utilizar para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de S.pneumoniae.En consecuencia, esta solicitud proporciona un método para tratar a un sujeto que padece o es susceptible a infección por S.pneumoniae, que comprende administrar una cantidad eficaz de cualquiera de las formulaciones de vacuna descritas en el presente documento. El método puede inhibir la colonización por S.pneumoniaeen un individuo. El método puede inhibir los síntomas o secuelas de S.pneumoniae, tales como sepsis. El sujeto que recibe la vacuna puede ser un hombre o una mujer, y puede ser un niño o un adulto. En algunas realizaciones, el sujeto que se está tratando es un ser humano. En otras realizaciones, el sujeto es un animal no humano.

Por consiguiente, las composiciones y métodos inmunogénicos descritos en el presente documento se pueden utilizar para la profilaxis y/o tratamiento de cualquier infección neumocócica, enfermedad, trastorno y/o afección neumocócicos, o una infección neumocócica, tal como sepsis. Como se emplea en el presente documento, "profilaxis" se refiere a usos antes de la aparición de síntomas debidos a una infección neumocócica, enfermedad, trastorno y/o afección neumocócicos y/o antes de la exposición conocida a un organismoStreptococcus pneumoniae.Los sujetos incluyen, pero sin limitarse a, seres humanos y/u otros primates; y otros animales susceptibles a la infección por organismos S.pneumoniae,incluidos mamíferos comercialmente relevantes tales como ganado vacuno, cerdos, caballos, ovejas, gatos y/o perros; y/o aves, incluidas aves comercialmente relevantes tales como pollos, patos, gansos y/o pavos.

1. Uso profiláctico

En realizaciones profilácticas, una vacuna o composición inmunogénica como se divulgan en el presente documento se administran a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria que puede ayudar a proteger contra el establecimiento de S.pneumoniae,por ejemplo, protegiendo contra la colonización, el primer y necesario paso en la enfermedad. El método puede inhibir la infección por S.pneumoniaeen un sujeto no colonizado o no infectado. El método puede reducir la duración de la colonización en un individuo que ya está colonizado.

En algunas realizaciones, una vacuna o composición inmunogénica como se divulga en el presente documento confieren inmunidad protectora, lo que permite que un individuo vacunado presente un inicio retardado de los síntomas o secuelas, o una reducción de la gravedad de los síntomas o secuelas, como resultado de su exposición a la vacuna. En ciertas realizaciones, la reducción de la gravedad de los síntomas o secuelas es al menos de 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o incluso 90%. En realizaciones particulares, los individuos vacunados pueden no mostrar síntomas o secuelas al entrar en contacto con S.pneumoniae,no ser colonizado por S.pneumoniae,o ambos. La inmunidad protectora se logra típicamente mediante uno o más de los siguientes mecanismos: inmunidad de la mucosa, humoral o celular. La inmunidad de las mucosas es principalmente el resultado de anticuerpos IgA secretores (sIGA) en las superficies mucosas de los tractos respiratorio, gastrointestinal y genitourinario. Los anticuerpos sIGA se generan después de una serie de eventos mediados por células procesadoras de antígenos, linfocitos B y T, que dan como resultado la producción de sIGA por parte de los linfocitos B en los tejidos recubiertos de mucosa del organismo. La inmunidad humoral es típicamente el resultado de los anticuerpos IgG y los anticuerpos IgM en el suero. La inmunidad celular se puede lograr a través de linfocitos T citotóxicos o mediante hipersensibilidad de tipo retardado que implica macrófagos y linfocitos T, así como otros mecanismos que implican a células T sin necesidad de anticuerpos. En particular, la inmunidad celular puede estar mediada por células TH1 o TH17.

Básicamente, cualquier individuo tiene un cierto riesgo de infectarse con S.pneumoniae.Sin embargo, ciertas subpoblaciones tienen un mayor riesgo de infección. En algunas realizaciones, se administra una formulación de vacuna como se describe en el presente documento (p. ej., una composición que comprende uno o más polipéptidos de la Tabla 1 o 2, o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, o anticuerpos reactivos con los polipéptidos) a pacientes que están inmunocomprometidos.

Es probable que una afección inmunocomprometedora derivada de un tratamiento médico exponga al individuo en cuestión a un mayor riesgo de infección por S.pneumoniae.Es posible tratar una infección de forma profiláctica en un individuo que tiene una afección inmunocomprometida antes o durante tratamientos que se sabe que comprometen la función inmunológica. Mediante tratamiento profiláctico con una composición antigénica (p. ej., dos o más antígenos de las Tablas 1 o 2, o ácidos nucleicos que codifican los antígenos), o con anticuerpos reactivos a dos o más antígenos de las Tablas 1 o 2, antes o durante un tratamiento que se sabe que compromete la función inmunológica, es posible prevenir una posterior infección por S.pneumoniaeo reducir el riesgo de que el individuo contraiga una infección debido a la afección inmunocomprometida. En caso de que el individuo contraiga una infección por S.pneumoniae,p. ej., después de un tratamiento que conduce a una condición inmunocomprometida, también es posible tratar la infección administrando al individuo una composición antigénica.

Los siguientes grupos tienen un mayor riesgo de enfermedad neumocócica o sus complicaciones y, por lo tanto, es ventajoso que los sujetos que pertenecen a uno o más de estos grupos reciban una formulación de vacuna descrita en el presente documento: niños, especialmente aquellos de 1 mes a 5 años o 2 meses a 2 años; niños que tengan al menos 2 años de edad con asplenia, disfunción esplénica o anemia de células falciformes; niños que tengan al menos 2 años de edad con síndrome nefrótico, fuga crónica de líquido cefalorraquídeo, infección por VIH u otras afecciones asociadas con inmunosupresión.

En otra realización, al menos una dosis de la composición de antígeno neumocócico se administra a adultos de los siguientes grupos con mayor riesgo de enfermedad neumocócica o sus complicaciones: todas las personas de 65 años de edad; adultos con asplenia, sujetos con síndrome de Job (un sujeto que carece de respuesta mediada por células Th-17), sujetos con agammaglobulinemia (un sujeto que carece de respuesta mediada por anticuerpos), disfunción esplénica o anemia falciforme; adultos con las siguientes afecciones: enfermedad cardiorrespiratoria crónica, cirrosis, alcoholismo, enfermedad renal crónica, síndrome nefrótico, diabetes mellitus, fuga crónica de líquido cefalorraquídeo, infección por VIH, SIDA y otras afecciones asociadas con la inmunosupresión (enfermedad de Hodgkin, linfoma, mieloma múltiple, inmunosupresión para trasplante de órganos), personas con implantes cocleares; personas con problemas de salud a largo plazo, tales como enfermedades cardíacas y pulmonares, así como personas que están tomando algún medicamento o tratamiento que reduzca la resistencia del organismo a las infecciones, tales como esteroides a largo plazo, ciertos medicamentos contra el cáncer, radioterapia; Nativos de Alaska y ciertas poblaciones de Nativos Americanos.

2. Uso terapéutico

En aplicaciones terapéuticas, se puede administrar una vacuna o composición inmunogénica como se divulga en el presente documento a un paciente que padece infección por S. pneumoniae, en cantidad suficiente para tratar al paciente. Tratar al paciente, en este caso, se refiere a reducir los síntomas y/o carga bacteriana y/o secuelas en un individuo infectado por S.pneumoniae.En algunas realizaciones, tratar al paciente se refiere a reducir la duración de los síntomas o secuelas, o reducir la intensidad de los síntomas o secuelas. En algunas realizaciones, la vacuna reduce la transmisibilidad de S.pneumoniaedel paciente vacunado. En ciertas realizaciones, las reducciones descritas anteriormente son de al menos 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o incluso 90%.

En realizaciones terapéuticas, la vacuna se administra a un individuo después de la infección. La vacuna puede administrarse poco después de la infección, p. ej., antes de que se manifiesten los síntomas o secuelas, o puede administrarse durante o después de la manifestación de los síntomas o secuelas.

La vacuna terapéutica contra S.pneumoniaepuede reducir la intensidad y/o duración de los diversos síntomas o secuelas de la infección por S.pneumoniae.Los síntomas o secuelas de la infección por S.pneumoniaepuede adoptar muchas formas. Las enfermedades neumocócicas invasivas incluyen sinusitis aguda, otitis media, meningitis, bacteriemia, sepsis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, peritonitis, pericarditis, celulitis y absceso cerebral. En consecuencia, en algunos casos, un paciente infectado desarrolla neumonía, sinusitis aguda, otitis media (infección de αdo), meningitis, bacteriemia, sepsis, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, peritonitis, pericarditis, celulitis o absceso cerebral.

La sepsis es una complicación rara pero potencialmente mortal de la infección S.pneumoniae,donde la bacteria invade el torrente sanguíneo y se produce una inflamación sistémica. Típicamente, se observa fiebre y aumenta el recuento de glóbulos blancos. Una descripción más detallada de la sepsis se encuentra en Goldstein, B. et al., "International pediatric sepsis consensus conference: definitions for sepsis and organ dysfunction in pediatrics". Pediatr Crit. Care Med. enero de 2005; 6 (1):2-8.

En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la presente divulgación se pueden utilizar para tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir el riesgo de infección y reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección neumocócicos. En algunas realizaciones, se puede utilizar una composición inmunogénica para tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de la infección neumocócica (p. ej., pero sin limitarse a sepsis, neumonía, otitis media aguda, bacteriemia y meningitis bacteriana).

Se proporciona un método para la profilaxis y/o tratamiento de la infección neumocócica. En algunas realizaciones, la profilaxis y/o tratamiento de la infección neumocócica comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica descrita en el presente documento a un sujeto que la necesita, en las cantidades y durante el tiempo que sea necesario para lograr el resultado deseado. En ciertas realizaciones de la presente divulgación, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición inmunogénica es la cantidad eficaz para reducir el riesgo de infección, o tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad de, y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de la infección neumocócica. Una cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar en función de la población y no es necesario que sea una cantidad que induzca naturalmente una respuesta protectora en un sujeto particular.

En algunas realizaciones, los protocolos profilácticos y/o terapéuticos implican administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones inmunogénicas a un sujeto sano (es decir, un sujeto que no presenta ningún síntoma de infección por clamidia y/o que no ha sido diagnosticado de infección neumocócica). Por ejemplo, se pueden vacunar individuos sanos utilizando composiciones inmunogénicas antes del desarrollo de la infección neumocócica y/o la aparición de los síntomas de la infección neumocócica; se pueden tratar individuos en riesgo (p. ej., pacientes expuestos a individuos que sufren de infección neumocócica, pacientes con VIH o un sistema inmunológico comprometido, o un sujeto que es susceptible a la infección neumocócica tal como un sujeto con síndrome de Job (sujeto que carece de respuesta mediada por células Th-17) o un sujeto con agammaglobulinemia (un sujeto que carece de respuesta mediada por anticuerpos)) sustancialmente al mismo tiempo que (p. ej., dentro de las 48 horas, dentro de las 24 horas o dentro de las 12 horas posteriores a) la aparición de los síntomas y/o la exposición a la infección neumocócica. Por supuesto, los individuos que se sabe que tienen infección o sepsis neumocócicas pueden recibir tratamiento en cualquier momento.

En algunas realizaciones, los protocolos profilácticos y/o terapéuticos implican administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones inmunogénicas a un sujeto de manera que se estimule una respuesta inmunitaria tanto en células T como en células B.

En algunas realizaciones, combinando uno o más antígenos neumocócicos y adyuvantes, las respuestas inmunitarias (p. ej., respuestas de células T y/o células B) se pueden adaptar para provocar preferentemente el tipo de respuesta inmunitaria más deseable para una indicación determinada, p. ej., respuesta humoral, respuesta de células T Th1, respuesta de células T Th17, secreción de IFN-y por células T específicas de antígeno, respuesta de células T citotóxicas, respuesta de anticuerpos, respuesta de células B, respuesta inmunitaria innata o una combinación de estas respuestas.

Ensayo de la eficacia de vacunación

La eficacia de la vacunación con una vacuna o composición inmunogénica como se divulga en el presente documento se puede determinar de varias maneras, además de los resultados clínicos descritos anteriormente. En primer lugar, se pueden analizar los niveles de IL-17 (particularmente IL-17A) estimulando las células T obtenidas del sujeto después de la vacunación. Los niveles de IL-17 pueden compararse con los niveles de IL-17 en el mismo sujeto antes de la vacunación. El aumento de los niveles de IL-17 (p. ej., IL-17A), tal como un aumento de 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces o más, indicaría un aumento de respuesta a la vacuna. Alternativamente (o de manera combinada), se pueden analizar los neutrófilos en presencia de células T o anticuerpos del paciente para determinar la destrucción neumocócica. Un aumento de la destrucción neumocócica, tal como un aumento de 1,5, 2, 5, 10, 20, 50 o 100 veces o más, indicaría una mayor respuesta a la vacuna. Además, se puede medir la activación de las células TH17, donde el aumento de activación de las células TH17, tal como un aumento de 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces o más, se correlaciona con una mayor respuesta a la vacuna. También se pueden medir los niveles de un anticuerpo específico para la vacuna, donde el aumento de los niveles del anticuerpo específico, tal como un aumento de 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces o más, se correlaciona con una mayor eficacia de la vacuna. En ciertas realizaciones, se utilizan dos o más de estos ensayos. Por ejemplo, se pueden medir los niveles de IL-17 y los niveles de anticuerpos específicos de la vacuna. Alternativamente, se pueden seguir marcadores epidemiológicos tales como la incidencia, la gravedad o la duración de la infección neumocócica en individuos vacunados en comparación con individuos no vacunados.

La eficacia de la vacuna también se puede analizar en varios sistemas modelo, tales como el modelo de ratón. Por ejemplo, se pueden utilizar cepas de ratones BALB/c o C57BL/6. Después de administrar la vacuna de prueba a un sujeto (como dosis única o dosis múltiples), el experimentador administra una dosis de sensibilización de S. pneumoniae. En algunos casos, una dosis de sensibilización administrada por vía intranasal es suficiente para provocar colonización por S. pneumoniae (especialmente colonización nasal) en un animal no vacunado y, en algunos casos, una dosis de sensibilización administrada por vía aspiración es suficiente para provocar sepsis y una alta tasa de letalidad en animales no vacunados. A continuación, se puede medir la reducción de la colonización o la reducción de la letalidad en animales vacunados. Como se demuestra en los Ejemplos 1-3, la eficacia de los polipéptidos de la Tabla 1 para inhibir la colonización nasal por S.pneumoniaese puede evaluar después de la sensibilización intranasal en el modelo de ratón. Los Ejemplos 3 y 4 muestran la eficacia de los polipéptidos de la Tabla 1 en la protección contra la sepsis y la muerte después de la infección por S.pneumoniaemediante aspiración en el modelo de ratón.

Composiciones y formulaciones inmunogénicas

En una realización, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento, p. ej., una vacuna o composición inmunogénica descritas en el presente documento, puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición de vacuna descrita en el presente documento se formula para administrarse a un mamífero. Las formulaciones adecuadas se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a y 18a ediciones, Mack Publishing, Easton, Pa. (1980 y 1990), e Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, cuarta edición, Lea & Febiger, Filadelfia (1985).

En una realización, las composiciones de vacuna como se describen en el presente documento comprenden portadores farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales portadores incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa y polietilenglicol. Para todas las administraciones, se utilizan adecuadamente formas de depósito convencionales. Tales formas incluyen, p. ej., microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, apósitos, formas para inhalación, pulverizaciones nasales, comprimidos sublinguales y preparaciones de liberación sostenida. Para ejemplos de composiciones de liberación sostenida, véanse las Patentes de Estados Unidos Núm. 3.773.919, 3.887.699, el documento EP 58.481A, el documento EP 158.277A, la Patente de Canadá Núm. 1176565; U. Sidman et al., Biopolymers 22:547 (1983) y R. Langer et al., Chem. Tech. 12:98 (1982). Las proteínas normalmente se formularán a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml por aplicación por paciente.

En una realización, se pueden añadir otros ingredientes a las formulaciones de vacunas, incluidos antioxidantes, p. ej., ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez restos), p. ej., poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; y alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol.

En una realización, una composición de vacuna como se describe en el presente documento para su administración debe ser estéril. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej., membranas de 0,2 micras).

En algunas realizaciones, una composición de vacuna como se describe en el presente documento comprende adicionalmente excipientes farmacéuticos que incluyen, pero sin limitarse a, aceites biocompatibles, soluciones salinas fisiológicas, conservantes, carbohidratos, proteínas, aminoácidos, agentes de control de la presión osmótica, gases portadores, agentes de control del pH, disolventes orgánicos, agentes hidrófobos, inhibidores de enzimas, polímeros absorbentes de agua, tensioactivos, promotores de la absorción y agentes antioxidantes. Los ejemplos representativos de carbohidratos incluyen azúcares solubles tales como hidropropilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboxilcelulosa sódica, ácido hialurónico, quitosano, alginato, glucosa, xilosa, galactosa, fructosa, maltosa, sacarosa, dextrano, sulfato de condroitina, etc. Los ejemplos representativos de proteínas incluyen albúmina, gelatina, etc. Los ejemplos representativos de aminoácidos incluyen glicina, alanina, ácido glutámico, arginina, lisina y sus sales.

En algunas realizaciones, los inmunógenos como se describen en el presente documento pueden solubilizarse en agua, un disolvente tal como metanol o un tampón. Los tampones adecuados incluyen, pero sin limitarse a, solución salina tamponada con fosfato libre de Ca2+/Mg2+ (PBS), solución salina normal (NaCl 150 mM en agua) y tampón Tris. El antígeno no soluble en tampón neutro puede solubilizarse en ácido acético 10 mM y a continuación diluirse hasta el volumen deseado con un tampón neutro tal como PBS. En el caso del antígeno soluble sólo a pH ácido, se puede utilizar acetato-PBS a pH ácido como diluyente después de la solubilización en ácido acético diluido. El glicerol puede ser un tampón no acuoso adecuado para su uso en la presente divulgación.

Si el inmunógeno como se divulga en el presente documento no es solubleper se,el inmunógeno puede estar presente en la formulación en forma de suspensión o incluso como un agregado. En algunas realizaciones, el antígeno hidrófobo se puede solubilizar en un detergente, por ejemplo, un polipéptido que contiene un dominio que atraviesa la membrana. Además, para formulaciones que contienen liposomas, se puede mezclar un antígeno en una solución detergente (p. ej., un extracto de membrana celular) con lípidos, y a continuación, se pueden formar liposomas eliminando el detergente mediante dilución, diálisis o cromatografía en columna.

En algunas realizaciones, una composición de vacuna se administra combinada con otros ingredientes terapéuticos que incluyen, p. ej., interferón<y>, citocinas, agentes quimioterapéuticos o agentes antiinflamatorios o antivirales.

En algunas realizaciones, una composición de vacuna se administra en forma pura o sustancialmente pura, pero es preferible presentarla como una composición, formulación o preparación farmacéuticas. Tal formulación comprende polipéptidos descritos en el presente documento junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Otros ingredientes terapéuticos incluyen compuestos que mejoran la presentación de antígenos, p. ej., interferón gamma, citocinas, agentes quimioterapéuticos o agentes antiinflamatorios. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, Plotkin y Mortimer (en 'Vaccines', 1994, W. B. Saunders Company; 2.a edición) describen la vacunación de animales o seres humanos para inducir una respuesta inmunitaria específica para patógenos particulares, así como métodos para preparar antígenos, determinar una dosis adecuada de antígeno y analizar la inducción de una respuesta inmunitaria.

En algunas realizaciones, una composición de vacuna como se describe en el presente documento comprende adicionalmente un adyuvante, como se describe en el presente documento.

Las formulaciones de composiciones de vacunas adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, intranasal, oral, subcutánea o intraperitoneal comprenden convenientemente soluciones acuosas estériles del ingrediente activo con soluciones que son preferiblemente isotónicas con la sangre del receptor. Tales formulaciones se pueden preparar convenientemente disolviendo el ingrediente activo sólido en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles tales como cloruro de sodio (p. ej., 0,1-2,0 M), glicina y similares, y que tienen un pH tamponado compatible con las condiciones fisiológicas para producir una solución acuosa y esterilizar la solución. Estos pueden estar presentes en envases unitarios o multidosis, p. ej., ampollas o viales sellados.

También se pueden utilizar suspensiones liposomales como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 4.522.811.

Las formulaciones para suministro intranasal se describen en las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.427.782, 5.843.451 y 6.398.774. También se incluyen en el presente documento otros medios de administración a través de la mucosa.

Las formulaciones de una composición de vacuna como se divulga en el presente documento también pueden incorporar un estabilizador. Los estabilizadores ilustrativos son polietilenglicol, proteínas, sacáridos, aminoácidos, ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos que se pueden utilizar solos o como mezclas. Se pueden utilizar dos o más estabilizadores en soluciones acuosas a la concentración y/o pH apropiados. La presión osmótica específica en tal solución acuosa está generalmente en el intervalo de 0,1 a 3,0 ósmosis, preferiblemente en el intervalo de 0,80 a 1,2. El pH de la solución acuosa se ajusta para que esté dentro del intervalo de 5,0 a 9,0, preferiblemente dentro del intervalo de 6 a 8.

Cuando se desean preparaciones orales, una composición de vacuna se puede combinar con portadores típicos, tales como lactosa, sacarosa, almidón, talco, estearato de magnesio, celulosa cristalina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, glicerina, alginato de sodio o goma arábiga, entre otros.

La presente divulgación proporciona composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden un nuevo antígeno neumocócico, p. ej., uno o más de un antígeno polipeptídico seleccionado de la Tabla 1 o fragmentos funcionales del mismo y cualquier combinación de los mismos, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. De acuerdo con algunas realizaciones, se proporciona un método para administrar una composición inmunogénica a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, las composiciones se administran a seres humanos. Para los fines de la presente divulgación, la frase "ingrediente activo" generalmente se refiere a una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno de clamidia y que opcionalmente comprende uno o más agentes adicionales, tales como un adyuvante.

Aunque las descripciones de composiciones inmunogénicas proporcionadas en el presente documento se dirigen principalmente a composiciones que son adecuadas para la administración a seres humanos, el experto entenderá que tales composiciones son generalmente adecuadas para la administración a animales de todo tipo. Se comprende bien la modificación de composiciones inmunogénicas adecuadas para administración a seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para administración a diversos animales, y el farmacólogo veterinario con experiencia habitual puede diseñar y/o realizar tal modificación con experimentación simplemente ordinaria, si la hubiera. Los sujetos para los que se contempla la administración de las composiciones inmunogénicas de la divulgación incluyen, pero sin limitarse a, seres humanos y/u otros primates; mamíferos, incluidos mamíferos comercialmente relevantes tales como animales domésticos, ganado vacuno, cerdos, caballos, ovejas, gatos y/o perros; y/o aves, incluidas aves comercialmente relevantes tales como pollos, patos, gansos y/o pavos.

Las formulaciones de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier método conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de las vacunas. En algunas realizaciones, tales métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el o los antígenos (o los ácidos nucleicos que codifican los antígenos, para aplicaciones basadas en ácidos nucleicos) con uno o más excipientes y/o uno o más ingredientes accesorios, y a continuación, si fuera necesario y/o deseable, dar forma y/o envasar el producto en una unidad deseada de dosis única o múltiple.

Una composición inmunogénica de la divulgación se puede preparar, envasar y/o comercializar a granel, como una dosis unitaria única y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se emplea en el presente documento, una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición inmunogénica que comprende una cantidad predeterminada de antígeno o antígenos.

Las cantidades relativas de antígeno o antígenos, excipiente o excipientes farmacéuticamente aceptables y/o cualquier ingrediente adicional (p. ej., adyuvante) en una composición de la divulgación variarán, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o el estado del sujeto tratado y dependiendo adicionalmente de la vía por la cual se va a administrar la composición.

Las formulaciones inmunogénicas de la presente divulgación pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, como se emplea en el presente documento, incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006) divulga diversos excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para su preparación. Excepto en la medida en que cualquier excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, como por ejemplo produciendo cualquier efecto biológico indeseable o interactuando de otra manera de manera perjudicial con cualquier otro componente de la composición inmunogénica, se contempla que su uso esté dentro del alcance de esta invención.

En algunas realizaciones, el excipiente farmacéuticamente aceptable es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% puro. En algunas realizaciones, el excipiente está aprobado para uso en seres humanos y para uso veterinario. En algunas realizaciones, el excipiente está aprobado por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos. En algunas realizaciones, el excipiente es de calidad farmacéutica. En algunas realizaciones, el excipiente cumple con las normas de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP), la Farmacopea Europea (EP), la Farmacopea Británica y/o la Farmacopea Internacional.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la fabricación de composiciones inmunogénicas incluyen, pero sin limitarse a, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o de granulación, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en las formulaciones.

Las formulaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, pueden formularse según la técnica conocida utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. Una preparación inyectable estéril puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites fijados estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijado suave, incluidos monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se utilizan ácidos grasos tales como el ácido oleico.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Para prolongar la liberación de una composición inmunogénica y estimular la absorción máxima por parte de las células presentadoras de antígenos en las proximidades de un sitio de inyección, a menudo es deseable retardar la absorción de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se puede lograr disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.

En algunas realizaciones, se administra una composición inmunogénica a una superficie mucosa. Las composiciones para administración rectal o vaginal pueden incluir supositorios que se pueden preparar mezclando composiciones inmunogénicas de esta divulgación con excipientes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios, que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan antígeno.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica se administra por vía oral. Las formas farmacéuticas sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólida, el antígeno se puede mezclar con al menos un excipiente inerte farmacéuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o a) cargas o expansores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y acacia, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregrantes tales como agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de la solución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación puede comprender agentes tamponadores.

Los dispositivos adecuados para su uso en el suministro de composiciones inmunogénicas por una ruta intradérmica descrita en el presente documento incluyen dispositivos de agujas cortas tales como los descritos en las Patentes de Estados Unidos Núm.4.886.499; 5.190.521; 5.328.483; 5.527.288; 4.270.537; 5.015.235; 5.141.496; y 5.417.662. Son adecuados los dispositivos de inyección a chorro que suministran composiciones inmunogénicas líquidas a la dermis mediante un inyector de chorro líquido y/o mediante una aguja que perfora el estrato córneo y produce un chorro que llega a la dermis. Los dispositivos de inyección a chorro se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.480.381; 5.599.302; 5.334.144; 5.993.412; 5.649.912; 5.569.189; 5.704.911; 5.383.851; 5.893.397; 5.466.220; 5.339.163; 5.312.335; 5.503.627; 5.064.413; 5.520.639; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 4.940.460; y en las publicaciones PCT WO 97/37705 y WO 97/13537. Son adecuados los dispositivos balísticos de suministro de polvo/partículas que utilizan gas comprimido para acelerar una composición inmunogénica en forma de polvo a través de las capas exteriores de la piel hasta la dermis. Alternativa o adicionalmente, se pueden utilizar jeringas convencionales en el método mantoux clásico de administración intradérmica.

Las consideraciones generales en la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

La formulación de vacuna o composición inmunogénica pueden ser adecuadas para administración a un paciente humano, y la preparación de vacuna o composición inmunogénica puede ajustarse a las directrices de la USFDA. En algunas realizaciones, la formulación de vacuna o composición inmunogénica son adecuadas para administración a un animal no humano. En algunas realizaciones, la vacuna o composición inmunogénica están sustancialmente libres de endotoxinas o exotoxinas. Las endotoxinas pueden incluir pirógenos, tales como moléculas de lipopolisacáridos (LPS). La vacuna o composición inmunogénica también pueden estar sustancialmente libres de fragmentos de proteínas inactivas que pueden causar fiebre u otros efectos secundarios. En algunas realizaciones, la composición contiene menos de 1%, menos de 0,1%, menos de 0,01%, menos de 0,001% o menos de 0,0001% de endotoxinas, exotoxinas y/o fragmentos de proteínas inactivas. En algunas realizaciones, la vacuna o composición inmunogénica tienen niveles más bajos de pirógenos que el agua industrial, el agua del grifo o el agua destilada. Se pueden purificar otros componentes de vacunas o composiciones inmunogénicas utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración o destilación. En otras realizaciones, los pirógenos pueden inactivarse o destruirse antes de la administración a un paciente. Las materias primas para las vacunas, tales como agua, tampones, sales y otras sustancias químicas, también se pueden escrutar y despirogenar. Todos los materiales de la vacuna pueden ser estériles y se puede probar la esterilidad de cada lote de la vacuna. Por tanto, en ciertas realizaciones los niveles de endotoxinas en la vacuna caen por debajo de los niveles establecidos por la USFDA, por ejemplo 0,2 endotoxinas (UE)/kg de producto para una composición inyectable intratecal; 5 UE/kg de producto para una composición inyectable no intratecal, y 0,25-0,5 UE/mL para agua estéril.

En ciertas realizaciones, la preparación comprende menos de 50%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína contaminante. En ciertas realizaciones, la molécula deseada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas, tales como otras proteínas (particularmente otras proteínas que pueden enmascarar, disminuir, confundir o alterar sustancialmente las características de las proteínas componentes, ya sea como preparaciones purificadas o en su función en la mezcla reconstituida en cuestión). En ciertas realizaciones, está presente al menos 80%, 90%, 95%, 99% o 99,8% (en peso seco) de macromoléculas biológicas del mismo tipo (pero pueden estar presentes agua, tampones y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular de menos de 5.000). En algunas realizaciones, la vacuna o composición inmunogénica que comprenden proteínas de subunidades purificadas contienen menos de 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1% de proteína de células anfitrionas en las que se expresaron las proteínas de subunidades, con respecto a la cantidad de subunidades purificadas. En algunas realizaciones, los polipéptidos deseados están sustancialmente libres de ácidos nucleicos y/o carbohidratos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la vacuna o composición inmunogénica contiene menos de 5%, menos de 2%, menos de 1%, menos de 0,5%, menos de 0,2% o menos de 0,1% de ADN y/o ARN de la célula anfitriona. En ciertas realizaciones, está presente en la preparación al menos 80%, 90%, 95%, 99% o 99,8% (en peso seco) de macromoléculas biológicas del mismo tipo (pero agua, pueden estar presentes tampones y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas con un peso molecular de menos de 5.000).

Se prefiere que la vacuna o composición inmunogénica tenga una toxicidad baja o nula, dentro de una razón riesgobeneficio razonable. En ciertas realizaciones, la vacuna o composición inmunogénica comprenden ingredientes a concentraciones que son inferiores a las mediciones de DL50 para el animal que se vacuna. Las mediciones de DL50 se pueden obtener en ratones u otros sistemas modelo experimentales y extrapolarse a seres humanos y otros animales. Los métodos para estimar la DL50 de compuestos en seres humanos y otros animales son bien conocidos en la técnica. Una formulación de vacuna o composición inmunogénica, y cualquier componente que contengan, podrían tener un valor de DL50 en ratas superior a 100 g/kg, superior a 50 g/kg, superior a 20 g/kg, superior a 10 g/kg, superior a 5 g/kg, superior a 2 g/kg, superior a 1 g/kg, superior a 500 mg/kg, superior a 200 mg/kg, superior a 100 mg/kg, superior a 50 mg/kg, superior a 20 mg/kg, o superior a 10 mg/kg. Una formulación de vacuna o composición inmunogénica que comprenden una toxina tal como la toxina botulínica (que se puede utilizar como adyuvante) deben contener significativamente una DL50 menor que la de la toxina botulínica.

Las formulaciones adecuadas para la introducción de las formulaciones de vacuna o composición farmacéutica varían según la vía de administración. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, tal como, por ejemplo, por vía intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intranasal y subcutánea, incluyen soluciones para inyección estériles, isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases sellados monodosis o multidosis, tales como ampollas y viales.

Las soluciones y suspensiones inyectables se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente. En el caso de una transferencia adoptiva de células T terapéuticas, las células se pueden administrar por vía intravenosa o parenteral.

Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz de polipéptidos o ácidos nucleicos envasados suspendidos en diluyentes, tales como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, sobres o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo, en forma de líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de comprimidos pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de patata, tragacanto, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, cargas, aglutinantes, diluyentes, agentes tamponadores, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes, agentes disgregrantes y portadores farmacéuticamente compatibles. Las formas de píldoras pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o emulsiones, geles y similares de sacarosa y acacia, que contienen, además del ingrediente activo, portadores conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas pueden encapsularse, p. ej., en liposomas o en una formulación que proporcione una liberación lenta del ingrediente activo.

Los antígenos, solos o combinados con otros componentes adecuados, se pueden convertir en formulaciones de aerosol (p. ej., pueden "nebulizarse") para administrarse mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol se pueden colocar en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. Las formulaciones en aerosol se pueden suministrar por vía oral o nasal.

Las formulaciones adecuadas para administración vaginal o rectal incluyen, por ejemplo, supositorios, que consisten en polipéptidos o ácidos nucleicos empaquetados con una base de supositorio. Las bases para supositorios adecuadas incluyen triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos de parafina. Además, también es posible utilizar cápsulas rectales de gelatina que consisten de una combinación de polipéptidos o ácidos nucleicos empaquetados con una base, que incluye, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles e hidrocarburos de parafina.

Dosis y Vías de Administración

1. Formas de dosificación, cantidades y programación

La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna o composición inmunogénica se selecciona como una cantidad eficaz, que induce una respuesta profiláctica o terapéutica, como se describió anteriormente, ya sea en una dosis única o en dosis múltiples. Preferiblemente, la dosis no tiene efectos secundarios adversos significativos en los vacunados típicos. Tal cantidad variará dependiendo de qué antígeno específico se emplee. Generalmente, se espera que una dosis comprenda entre 1 y 1.000 gg de cada proteína, en algunos casos entre 2 y 100 gg, por ejemplo, entre 4 y 40 gg. La formulación de vacuna puede comprender entre 1 y 1.00 gg del polipéptido y 1 y 250 gg del adyuvante. En algunas realizaciones, la cantidad adecuada de antígeno que se suministrará dependerá de la edad, el peso y la salud (p. ej., estado inmunocomprometido) de un sujeto. Cuando esté presente, típicamente un adyuvante estará presente en cantidades de 1 gg a 250 gg por dosis, por ejemplo, de 50 a 150 gg, de 75 a 125 gg o 100 gg.

En algunas realizaciones, solo se administra una dosis de la vacuna para lograr los resultados descritos anteriormente. En otras realizaciones, después de una vacunación inicial, los sujetos reciben una o más vacunaciones de refuerzo, para un total de dos, tres, cuatro o cinco vacunaciones. Ventajosamente, el número es tres o menos. Se puede administrar una vacunación de refuerzo, por ejemplo, aproximadamente 1 mes, 2 meses, 4 meses, 6 meses o 12 meses después de la vacunación inicial, de modo que un régimen de vacunación implique la administración a los 0, 0,5-2 y 4-8 meses. Puede resultar ventajoso administrar dosis divididas de vacunas que se pueden administrar por la misma o por diferentes vías.

Las vacunas y composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden adoptar una variedad de formas de dosificación. En ciertas realizaciones, la composición se proporciona en forma sólida o en polvo (p. ej., liofilizada); también se puede proporcionar en forma de solución. En ciertas realizaciones, se proporciona una forma de dosificación como una dosis de composición liofilizada y al menos un recipiente estéril separado de diluyente.

En algunas realizaciones, la composición se administrará en una forma de dosis escalonada, de modo que las administraciones sucesivas de la composición contengan una mayor concentración de composición que las administraciones anteriores. En algunas realizaciones, la composición se administrará de manera tal que las administraciones sucesivas de la composición contengan una concentración de composición menor que las administraciones anteriores.

La dosis precisa que se empleará en la formulación dependerá también de la vía de administración y deberá decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Por ejemplo, se puede administrar por vía intradérmica un intervalo de 25 gg - 900 gg de proteína inmunogénica total, mensualmente durante 3 meses. En última instancia, el médico a cargo decidirá la cantidad de proteína o composición de vacuna que se administrará a individuos concretos.

En algunas realizaciones, se suministra a un paciente y/o animal una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica antes, simultáneamente y/o después de la exposición a un organismo clamidia o del diagnóstico de una enfermedad, trastorno y/o afección por clamidia. En algunas realizaciones, se suministra una cantidad terapéutica de una composición a un paciente y/o animal antes, simultáneamente y/o después de la aparición de los síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección por clamidia. En algunas realizaciones, la cantidad de una composición inmunogénica es suficiente para reducir el riesgo de infección, o tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de la enfermedad, trastorno y/o afección por clamidia.

Las composiciones inmunogénicas, según el método de la presente divulgación, se pueden administrar utilizando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para el tratamiento. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad y estado general del sujeto, la gravedad de la infección, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. El nivel de dosis eficaz específico para cualquier sujeto u organismo particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la inmunogenicidad de la composición antigénica empleada; la composición específica empleada; la naturaleza del adyuvante utilizado; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; el momento de la administración, la vía de administración y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que padece una enfermedad en una cantidad suficiente para tratar al paciente. Las aplicaciones terapéuticas de una composición descrita en el presente documento incluyen reducir la transmisibilidad, retardar la progresión de la enfermedad, reducir la viabilidad o replicación bacteriana o inhibir la expresión de proteínas requeridas para la toxicidad, tal como en 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10% con respecto a los niveles en los que se producirían en individuos que no son tratados con la composición.

En realizaciones profilácticas, las composiciones se administran a un ser humano u otro mamífero para inducir una respuesta inmunitaria que puede inhibir el establecimiento de una enfermedad infecciosa u otra afección. En algunas realizaciones, una composición puede impedir parcialmente que la bacteria establezca una infección.

En algunas realizaciones, las composiciones se administran combinadas con antibióticos. Esta administración conjunta es particularmente apropiada cuando la composición farmacéutica se administra a un paciente que ha estado expuesto recientemente (o se sospecha que ha estado expuesto recientemente) a S. pneumoniae. Se utilizan muchos antibióticos para tratar las infecciones neumocócicas, incluyendo penicilina, amoxicilina, amoxicilina/clavulanato, cefuroxima, cefotaxima, ceftriaxona y vancomicina. El antibiótico apropiado se puede seleccionar según el tipo y la gravedad de la infección, así como según cualquier resistencia conocida a los antibióticos de la infección (Jacobs M R "Drug-resistant Streptococcus pneumoniae: rational antibiotic choices" Am J. Med. 3 de mayo de 1999; 106 (5A): 19S-25S).

2. Administración

Un método de inmunización o vacunación de un mamífero contra infecciones neumocócicas comprende administrar una composición de vacuna descrita en el presente documento.

En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas o composiciones de vacunas como se describen en el presente documento se pueden administrar por vía intravenosa, intranasal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal u oral. Una vía de administración preferida es la intranasal o por otra vía mucosa.

La vacunación puede realizarse mediante métodos convencionales. Por ejemplo, se puede utilizar un inmunógeno como polipéptido como se divulga en la Tabla 1 en un diluyente adecuado tal como solución salina o agua, y opcionalmente con adyuvantes completos o incompletos. La vacuna se puede administrar por cualquier vía apropiada para provocar una respuesta inmunitaria. La vacuna se puede administrar una vez o a intervalos periódicos hasta que se provoque una respuesta inmunitaria. Las respuestas inmunitarias se pueden detectar mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse a, producción de anticuerpos, ensayo de citotoxicidad, ensayo de proliferación y ensayos de liberación de citocinas. Por ejemplo, se pueden extraer muestras de sangre del mamífero inmunizado y analizar la presencia de anticuerpos contra la proteína inmunogénica utilizada en la vacunación mediante ELISA y el título de estos anticuerpos se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica.

Las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación se pueden administrar por cualquier vía que provoque una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica se administra por vía intramuscular. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación se administran mediante una variedad de vías, que incluyen oral, intravenosa, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas, cremas y/o gotas), transdérmica, mucosa, nasales, bucal, entérica, sublingual; mediante instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; y/o como pulverización oral, pulverización nasal y/o aerosol.

Las formulaciones de vacuna y composiciones farmacéuticas del presente documento se pueden suministrar mediante administración a un individuo, típicamente mediante administración sistémica (p. ej., vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, subcutánea, subdérmica, transdérmica, intracraneal, intranasal, mucosa, anal, vaginal, oral, bucal o pueden ser inhaladas) o se pueden administrar mediante aplicación tópica. En algunas realizaciones, la vía de administración es intramuscular. En otras realizaciones, la vía de administración es subcutánea. En otras realizaciones más, la vía de administración es mucosa. En ciertas realizaciones, la vía de administración es transdérmica o intradérmica.

Ciertas vías de administración son particularmente apropiadas para formulaciones de vacunas y composiciones inmunogénicas que comprenden adyuvantes específicos. En particular, la administración transdérmica es una vía de administración adecuada para vacunas de S. pneumoniae que comprenden toxinas (p. ej., toxina del cólera o toxina lábil); en otras realizaciones, la administración es intranasal. Las vacunas formuladas con replicones de Alfavirus se pueden administrar, por ejemplo, por vía intramuscular o subcutánea. Las vacunas que comprenden Monofosforil Lípido A (MPL), Dicoinomicolato de Trehalosa (TDM) y bromuro de dioctadecildimetilamonio (DDA) son adecuadas (entre otras) para administración intramuscular y subcutánea. Una vacuna que comprende resiquimod se puede administrar por vía tópica o subcutánea, por ejemplo.

En ciertas realizaciones, una composición inmunogénica de la divulgación se puede administrar en cantidades que incluyen un antígeno proteico en intervalos de 1 gg a 500 gg. En algunas realizaciones, se administra a un ser humano una dosis de aproximadamente 10 gg, 20, 30 gg, 50 gg o 100 gg.

En algunas realizaciones, una composición inmunogénica se administra más de una vez (p. ej., dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces). En algunas realizaciones, se administra un refuerzo aproximadamente una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, tres meses, seis meses, un año o más después de una inmunización inicial.

P re p a ra c ió n y a lm a c e n a m ie n to d e fo rm u la c io n e s d e v a c u n a s y c o m p o s ic io n e s in m u n o g é n ic a s .

Las vacunas y composiciones inmunogénicas de S. pneumoniae descritas en el presente documento se pueden producir utilizando una variedad de técnicas. Por ejemplo, se puede producir un polipéptido utilizando tecnología de ADN recombinante en una célula anfitriona adecuada. Una célula anfitriona adecuada puede ser una célula bacteriana, de levadura, de mamífero u otro tipo de célula. La célula anfitriona puede modificarse para expresar una copia exógena de uno de los genes polipeptídicos relevantes. Típicamente, el gen está conectado operablemente a secuencias reguladoras apropiadas tales como un promotor fuerte y una secuencia de poliadenilación. En algunas realizaciones, el promotor es inducible o reprimible. Otras secuencias reguladoras pueden proporcionar la secreción o excreción del polipéptido de interés o la retención del polipéptido de interés en el citoplasma o en la membrana, dependiendo de cómo se desee purificar el polipéptido. El gen puede estar presente en un plásmido extracromosómico o puede estar integrado en el genoma del anfitrión. Un experto en la técnica reconocerá que no es necesario utilizar un ácido nucleico 100% idéntico a la secuencia natural. Más bien, se toleran y pueden ser deseables algunas alteraciones de estas secuencias. Por ejemplo, el ácido nucleico puede alterarse para aprovechar la degeneración del código genético de modo que el polipéptido codificado siga siendo el mismo. En algunas realizaciones, el gen tiene codones optimizados para mejorar la expresión en un anfitrión particular. El ácido nucleico puede producirse, p. ej., mediante PCR o mediante síntesis química.

Una vez que se ha producido una línea celular recombinante, se puede aislar un polipéptido a partir de ella. El aislamiento se puede lograr, por ejemplo, mediante técnicas de purificación por afinidad o mediante técnicas de separación física (p. ej., una columna de exclusión por tamaño).

Se proporciona un método de fabricación que comprende mezclar uno o más polipéptidos o un fragmento inmunogénico o variante del mismo con un portador y/o un adyuvante.

En algunas realizaciones, los antígenos para su inclusión en las formulaciones de vacunas y composiciones inmunogénicas se pueden producir en cultivos celulares. Un método comprende proporcionar uno o más vectores de expresión y clonar nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos seleccionados entre polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de la Tabla 1, tal como SEQ ID NO: 1-76 o 153-234, y a continuación, expresar y aislar los polipéptidos.

Los polipéptidos inmunogénicos descritos en el presente documento y las composiciones de ácidos nucleicos que expresan los polipéptidos se pueden envasar en paquetes, dispositivos dispensadores y kits para administrar composiciones de ácidos nucleicos a un mamífero. Por ejemplo, se proporcionan paquetes o dispositivos dispensadores que contienen una o más formas de dosificación unitaria. Típicamente, las instrucciones para la administración de los compuestos se proporcionarán con el envase, junto con una indicación adecuada en la etiqueta de que el compuesto es adecuado para el tratamiento de una afección indicada, tal como las divulgadas en el presente documento.

U s o d e c o m p o s ic io n e s in m u n o g é n ic a s

1. D e fen sa c o n tra la in fecc ió n p or S. pneumoniae

Las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación están diseñadas para provocar una respuesta inmunitaria contra S. pneumoniae. Las composiciones descritas en el presente documento (p. ej., las que comprenden uno o más polipéptidos de la Tabla 1 o 2, o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos) pueden estimular una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmunitaria mediada por células, o ambas, en el mamífero al que se administra. En algunas realizaciones, la composición estimula una respuesta de células T CD4+ predispuesta a TH1, una respuesta de células T CD4+ predispuesta a TH17 y/o una respuesta de células T CD8+. En algunas realizaciones, la composición estimula una respuesta de anticuerpos. En algunas realizaciones, la composición estimula una respuesta de células T CD4+ predispuesta a TH1, una respuesta de células T CD4+ predispuesta a TH17 y/o una respuesta de células T CD8+, y una respuesta de anticuerpos.

En ciertas realizaciones, la composición (p. ej., una que comprende uno o más polipéptidos de la Tabla 1 o 2, o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, o anticuerpos reactivos con los péptidos) incluye una citocina o una región codificante de nucleótidos que codifica una citocina tal como IL-17, para proporcionar estimulación adicional al sistema inmunológico del mamífero. En ciertas realizaciones, la composición comprende una citocina tal como IL-17.

Si bien no se desea vincularse a ninguna teoría, en algunas realizaciones es deseable una respuesta de células Th17 para generar una respuesta inmunitaria a las composiciones divulgadas en el presente documento, p. ej., aquellas que comprenden uno o más polipéptidos de la Tabla 1 o 2. En ciertas realizaciones, una respuesta activa de TH17 es beneficiosa para eliminar una infección neumocócica. Por ejemplo, los ratones que carecen del receptor de IL-17A muestran una menor protección basada en la vacuna de células completas frente a una sensibilización neumocócica (Lu et al., "Interleukin-17A mediates acquired immunity to pneumococcal colonization". PLoS Patog. 19 de septiembre de 2008; 4 (9)).

Por tanto, en el presente documento se proporciona un método para aumentar la producción de IL-17 mediante la administración de las composiciones descritas en el presente documento (p. ej., aquellas que comprenden uno o más polipéptidos de la Tabla 1 o 2) a un sujeto. Además, esta solicitud proporciona un método para activar células T<h>17 administrando dichas composiciones a un sujeto. En ciertas realizaciones, los niveles elevados de IL-17A dan como resultado una mayor destrucción de neumococos por parte de neutrófilos o células similares a neutrófilos, por ejemplo, al inducir el reclutamiento y la activación de neutrófilos o células similares a neutrófilos. En ciertas realizaciones, esta destrucción neumocócica es independiente de los anticuerpos y el complemento. Sin embargo, la producción de anticuerpos específicos y la activación del complemento pueden ser mecanismos adicionales útiles que contribuyen a la eliminación de una infección neumocócica.

También se proporcionan composiciones inmunogénicas que contienen polipéptidos inmunogénicos o polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunogénicos junto con un portador farmacéutico.

En algunos casos, la composición inmunogénica comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de SEQ ID NO: 1-76, tal como uno o más ácidos nucleicos seleccionados entre SEQ ID NO: 77-152. En algunas realizaciones, estos ácidos nucleicos se expresan en el individuo inmunizado, produciendo los antígenos de S. pneumoniae codificados, y los antígenos de S. pneumoniae así producidos pueden producir un efecto inmunoestimulador en el individuo inmunizado.

Tal composición inmunoestimuladora que contiene ácido nucleico puede comprender, por ejemplo, un origen de replicación y un promotor que impulsa la expresión de uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de SEQ ID NO: 1-76. Tal composición también puede comprender un vector plasmídico bacteriano en el que se insertan un promotor (a veces un promotor viral fuerte), uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de SEQ ID NO: 1-76, y una secuencia de poliadenilación/terminación transcripcional. En algunos casos, el ácido nucleico es ADN.

Usos diagnósticos

Esta solicitud proporciona, entre otros, un método rápido, económico, sensible y específico para la detección de S. pneumoniae en pacientes. A este respecto, debería ser útil para todos los hospitales y médicos que examinan y tratan pacientes con o en riesgo de infección por S. pneumoniae. Los kits de detección pueden ser lo suficientemente simples como para instalarlos en el laboratorio de cualquier hospital local, y los anticuerpos y sus porciones de unión a antígeno pueden ponerse fácilmente a disposición de todos los hospitales que tratan a pacientes con o en riesgo de infección por S. pneumoniae. Como se emplea en el presente documento, "paciente" se refiere a un individuo (tal como un ser humano) que tiene una infección por S. pneumoniae o tiene el potencial de contraer una infección por S. pneumoniae. Un paciente puede ser un individuo (tal como un ser humano) que tiene una infección por S. pneumoniae, tiene el potencial de contraer una infección por S. pneumoniae, que se ha recuperado de una infección por S. pneumoniae y/o un individuo cuyo estado de infección se desconoce.

En algunas realizaciones, se puede realizar un ensayo de diagnóstico utilizando dos o más anticuerpos, cada uno de los cuales se une a uno de los antígenos de la Tabla 1 para detectar S. pneumoniae en un individuo. Como se divulga en el Ejemplo 5, los sueros de un ratón inmunizado con SP0785 detectaron la presencia de la cepa TIGR4 de S. pneumoniae tipo 4. Por consiguiente, en alguna realización, uno de los antígenos para su uso en un diagnóstico es cualquier antígeno neumocócico seleccionado entre SEQ ID NO: 1-76. La presente divulgación también proporciona un método para fenotipificar muestras biológicas de pacientes sospechosos de tener una infección por S. pneumoniae: (a) obteniendo una muestra biológica de un paciente; (b) poniendo en contacto la muestra con dos o más anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos específicos de S. pneumoniae en condiciones que permitan la unión del anticuerpo o porción de unión a antígeno a un epítopo de S. pneumoniae; donde la unión indica la presencia de S. pneumoniae en la muestra. En algunas realizaciones, la unión a la muestra biológica se compara con la unión del mismo anticuerpo a un tejido de control negativo, en donde si la muestra biológica muestra la presencia de S. pneumoniae en comparación con el tejido de control negativo, se identifica que el paciente presenta probabilidad de tener una infección por S. pneumoniae. En algunos casos, la unión de un anticuerpo indica la presencia de S. pneumoniae; en otros casos, la unión de dos o más anticuerpos indica la presencia de S. pneumoniae. La prueba antes mencionada se puede ajustar apropiadamente para detectar otras infecciones bacterianas, por ejemplo, utilizando un anticuerpo inmunorreactivo, un homólogo (de otra especie bacteriana) de una de las proteínas descritas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos generados contra la proteína de S. pneumoniae de la Tabla 1 también se unirá al homólogo de otra especie de Streptococcus, especialmente si los homólogos tienen un alto porcentaje de identidad de secuencia.

Alternativamente, se puede utilizar un antígeno de la Tabla 1 (tal como SEQ ID NO: 1-76) para detectar anticuerpos anti-S. pneumoniae en un individuo. La presente divulgación también proporciona un método para fenotipificar muestras biológicas de pacientes sospechosos de tener una infección por S. pneumoniae: (a) obteniendo una muestra biológica de un paciente; (b) poniendo en contacto la muestra con dos o más antígenos específicos de S. pneumoniae seleccionados de la Tabla 1 o porciones o fragmentos funcionales de los mismos en condiciones que permitan la unión del antígeno (o porción del mismo) a cualquier anticuerpo del anfitrión presente en la muestra; donde la unión indica la presencia de anticuerpos anti-S. pneumoniae en la muestra. En algunas realizaciones, la unión a la muestra biológica se compara con la unión del mismo antígeno a un tejido de control negativo, en donde si la muestra biológica muestra la presencia de anticuerpos anti-S. pneumoniae en comparación con el tejido de control negativo, se identifica que el paciente presenta (1) probabilidad de tener una infección por S. pneumoniae o (2) probabilidad de haber tenido una infección por S. pneumoniae en el pasado. En algunos casos, la detección de un anticuerpo indica una infección actual o pasada por S. pneumoniae; en otros casos, la detección de dos o más anticuerpos indica una infección actual o pasada por S. pneumoniae. La prueba antes mencionada se puede ajustar apropiadamente para detectar otras infecciones bacterianas, por ejemplo, utilizando un homólogo (de otra especie bacteriana (p. ej., una especie de estreptococo) de las proteínas descritas en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, la respuesta de las células inmunitarias de una célula de mamífero se puede cuantificarex vivo.Un método para dicha cuantificación comprende administrar las composiciones divulgadas en el presente documento a una célula T de mamíferoex-vivo,y cuantificar el cambio en la producción de citocinas de la célula T de mamífero en respuesta a la composición. En estos métodos, la citocina puede ser, por ejemplo, IL-17.

La unión de un anticuerpo de S. pneumoniae a un antígeno (p. ej., un polipéptido de la Tabla 1, tal como SEQ ID NO: 1-76) se puede medir utilizando cualquier método apropiado. Tales métodos incluyen ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), transferencia Western, ensayo de competencia y transferencia puntual. La etapa de detección puede ser, por ejemplo, quimioluminiscente, fluorescente o colorimétrica. Un método adecuado para medir la unión anticuerpo-proteína es el sistema Luminex xMAP, donde los péptidos se unen a una microesfera que contiene colorante. Ciertos sistemas, incluido el sistema xMAP, pueden medir varios marcadores diferentes en múltiplex y podrían utilizarse para medir niveles de anticuerpos a la vez. En algunas realizaciones, se utilizan otros sistemas para analizar una pluralidad de marcadores en múltiplex. Por ejemplo, la creación de perfiles se puede realizar utilizando cualquiera de los siguientes sistemas: micromatrices de antígenos, micromatrices de cuentas, tecnología de partículas con nanocódigos de barras, proteínas en matriz de bibliotecas de expresión de ADNc, matriz de proteínas in situ, matrices de proteínas de transformantes vivos, matriz de proteínas universal, dispositivos de laboratorio de microfluidos dentro de un chip (“lab-on-a-chip”) y péptidos en pines. Otro tipo de ensayo clínico es un ensayo quimioluminiscente para detectar la unión de anticuerpos. En algunos de estos ensayos, incluido el ensayo VITROS Eci anti-VHC, los anticuerpos se unen a un soporte en fase sólida formado por micropartículas en suspensión líquida y se utiliza un fluorómetro de superficie para cuantificar la generación enzimática de un producto fluorescente.

En algunas realizaciones, si la muestra biológica muestra la presencia de S. pneumoniae (p. ej., detectando uno o más polipéptidos de la Tabla 1, tal como SEQ ID NO: 1-76, o un anticuerpo que se une a uno de dichos polipéptidos), se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones y terapias descritas en el presente documento al paciente. La muestra biológica puede comprender, por ejemplo, sangre, semen, orina, fluido vaginal, moco, saliva, heces, orina, líquido cefalorraquídeo o una muestra de tejido. En algunas realizaciones, la muestra biológica es un órgano destinado a trasplante. En ciertas realizaciones, antes de la etapa de detección, la muestra biológica se somete a condiciones de cultivo que promueven el crecimiento de S. pneumoniae.

Las pruebas de diagnóstico del presente documento (p. ej., aquellas que detectan un polipéptido de la Tabla 1, tal como SEQ ID NO: 1 -76, o un anticuerpo que se une a uno de dichos polipéptidos) se pueden utilizar para detectar S. pneumoniae en una variedad de muestras incluidas muestras tomadas de pacientes y muestras obtenidas de otras fuentes. Por ejemplo, las pruebas de diagnóstico se pueden utilizar para detectar S. pneumoniae en alimentos, bebidas o ingredientes de alimentos y bebidas; sobre objetos tales como instrumental médico, dispositivos médicos tales como implantes cocleares y marcapasos, zapatos, ropa, mobiliario, incluido mobiliario de hospital, y cortinas, incluidas cortinas de hospital; o en muestras tomadas del medio ambiente, tales como muestras de plantas. En algunas realizaciones, las pruebas del presente documento se pueden realizar en muestras tomadas de animales tales como animales agrícolas (vacas, cerdos, pollos, cabras, caballos y similares), animales de compañía (perros, gatos, pájaros y similares) o animales salvajes. En ciertas realizaciones, las pruebas del presente documento se pueden realizar en muestras tomadas de cultivos celulares, tales como cultivos de células humanas que producen una proteína terapéutica, cultivos de bacterias destinadas a producir una molécula biológica útil o cultivos de células desarrollados con fines de investigación.

Esta divulgación también proporciona un método para determinar la ubicación de una infección por S. pneumoniae en un paciente que comprende: (a) administrar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo contra S. pneumoniae marcado o una porción de unión al antígeno del mismo al paciente, y (b) detectar la etiqueta, en la que la unión indica una infección por S. pneumoniae en una ubicación particular del paciente. Un diagnóstico de este tipo también puede comprender comparar los niveles de unión en el paciente con un control. En ciertas realizaciones, el método comprende adicionalmente, si el paciente tiene una infección por S. pneumoniae, tratar la infección administrando al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de unión a S. pneumoniae o una porción de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, el método comprende adicionalmente, si el paciente tiene una infección por S. pneumoniae, tratar la infección administrando al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de S. pneumoniae de la Tabla 1 o 2, o una porción inmunogénica de la misma. El método puede comprender adicionalmente determinar la ubicación y/o el volumen de S. pneumoniae en el paciente. Este método puede utilizarse para evaluar la propagación de S. pneumoniae en el paciente y determinar si una terapia localizada es apropiada.

En algunas realizaciones, los anticuerpos o las células anti-S. pneumoniae T descritos en el presente documento se pueden utilizar para hacer un pronóstico del curso de la infección. En algunas realizaciones, los anticuerpos o las células T anti-S. pneumoniae del presente documento se pueden detectar en una muestra tomada de un paciente. Si los anticuerpos o las células T están presentes a niveles normales, esto indicaría que el paciente ha generado una respuesta inmunitaria anti-S. pneumoniae. Si los anticuerpos o las células T están ausentes o presentes a niveles reducidos, esto indicaría que el paciente no logra generar una respuesta suficiente anti-S. pneumoniae y se recomendaría un tratamiento más agresivo. En algunas realizaciones, los anticuerpos o células T presentes a niveles reducidos se refieren a anticuerpos que están presentes en menos de 50%, 20%, 10%, 5%, 2% o 1% del nivel de anticuerpos o células T típico en un paciente con un sistema inmunológico normal. Los anticuerpos se pueden detectar por afinidad para cualquiera de los antígenos descritos en el presente documento (p. ej., los de las Tablas 1 y/o 2), por ejemplo, utilizando ELISA. Las células T se pueden detectar mediante respuestas ex vivo para cualquiera de los antígenos descritos en el presente documento (p. ej., los de las Tablas 1 y/o 2), por ejemplo, utilizando ensayos ELISA o ELISPOT.

En algunas realizaciones, la detección de antígenos específicos de S. pneumoniae (p. ej., los de las Tablas 1 y/o 2, tales como SEQ ID NO: 1-76 y/o SEQ ID NO: 153-234) se puede utilizar para predecir el progreso y los síntomas de la infección por S. pneumoniae en un paciente. Un experto en la técnica entenderá que los métodos del presente documento no se limitan a la detección de S. pneumoniae. Otras realizaciones incluyen la detección de bacterias relacionadas, incluidas bacterias con proteínas homólogas a las proteínas descritas en las Tablas 1 o 2. Tales bacterias relacionadas incluyen, por ejemplo, otras cepas de Streptococcus. Por consiguiente, en algunas realizaciones, tales proteínas antigénicas neumocócicas de la Tabla 1 o mezclas de inmunógenos pueden ser útiles en el diagnóstico.

Kits

La divulgación también proporciona una variedad de kits que comprenden uno o más de los antígenos neumocócicos como se describen en el presente documento. Por ejemplo, la divulgación proporciona un kit que incluye un nuevo antígeno neumocócico e instrucciones de uso. Un kit puede incluir varios antígenos neumocócicos diferentes. Un kit puede incluir cualquiera de varios componentes o reactivos adicionales en cualquier combinación. Todas las diversas combinaciones no se establecen explícitamente, pero cada combinación está incluida en el alcance de la divulgación.

Según ciertas realizaciones de la divulgación, un kit puede incluir, por ejemplo, (i) una composición inmunogénica que incluye al menos uno de los siguientes antígenos de clamidia: antígenos polipeptídicos SP0785, SP1500, SP0346, SP1386, SP0084, SP1479 y SP2145; y (ii) instrucciones para administrar la composición a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, el kit incluye además un adyuvante.

También se proporcionan kits que incluyen ácidos nucleicos que codifican antígenos de clamidia. En ciertas realizaciones, un kit puede incluir, por ejemplo, (i) una composición que incluye un ácido nucleico que codifica un antígeno neumocócico; (ii) instrucciones para el uso de la composición de ácido nucleico (p. ej., instrucciones para expresar el ácido nucleico para producir el antígeno, o instrucciones para administrar la composición a un sujeto que lo necesite para provocar una respuesta contra neumococo).

Las instrucciones incluidas con los kits pueden, por ejemplo, incluir protocolos y/o describir condiciones para la producción de composiciones inmunogénicas y/o la administración de composiciones inmunogénicas, a un sujeto que lo necesite, etc. Los kits generalmente incluyen uno o más recipientes o contenedores para que algunos o todos los componentes y reactivos individuales puedan alojarse por separado. Los kits también pueden incluir un medio para encerrar contenedores individuales en un confinamiento relativamente estrecho para la venta comercial, p. ej., una caja de plástico, en la que se pueden incluir instrucciones, materiales de embalaje tales como espuma de poliestireno, etc. Puede estar presente en o sobre el kit o en uno o más de los recipientes o contenedores incluidos en el kit un identificador, p. ej., un código de barras, una etiqueta de identificación por radiofrecuencia (ID), etc. Se puede utilizar un identificador, p. ej., para identificar de forma única el kit con fines de control de calidad, control de inventario, seguimiento, movimiento entre estaciones de trabajo, etc.

Algunas realizaciones de la tecnología descrita en el presente documento se pueden definir según cualquiera de los siguientes párrafos numerados:

1. Una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno neumocócico aislado o un fragmento del mismo con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234, y en donde la composición provoca una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaecuando se administra a un mamífero.

2. La composición inmunogénica del párrafo 1, en donde el antígeno neumocócico o fragmento del mismo existen como un producto conjugado de fusión.

3. La composición inmunogénica del párrafo 2, en donde el producto conjugado de fusión es un producto conjugado de polisacárido.

4. La composición inmunogénica del párrafo 3, en donde el producto conjugado de fusión comprende el antígeno neumocócico o fragmento del mismo fusionados a un neumolisoide neumocócico PdT, en donde el neumolisoide neumocócico PdT está conjugada con el polisacárido.

5. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 2 a 4, en donde el polisacárido es dextrano, polisacárido Vi deSalmonella typhi,o polisacárido de la pared celular de neumococo (CWPS), u otro polisacárido de origen procariótico o eucariótico.

6. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 5, en donde la composición inmunogénica induce una respuesta de IL-17A (células Th17) en un sujeto.

7. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 6, en donde la composición inmunogénica se prepara adicionalmente como una vacuna que reduce o protege a un mamífero contra la colonización neumocócica.

8. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 7, en donde la composición inmunogénica comprende adicionalmente un adyuvante.

9. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 8, en donde dicha composición inmunogénica se administra por vía mucosa.

10. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 9, en donde la composición inmunogénica comprende al menos 2 antígenos o fragmentos neumocócicos con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234.

11. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 10, en donde la composición inmunogénica comprende al menos 3 antígenos o fragmentos neumocócicos con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234.

12. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 11, en donde la composición inmunogénica comprende al menos 5 antígenos o fragmentos neumocócicos con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234.

13. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 12, en donde la composición inmunogénica comprende entre 5 y 20 antígenos neumocócicos o fragmentos de los mismos con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1 -76 o SEQ ID NO: 153-234.

14. La composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 a 13, en donde la composición inmunogénica comprende más de 20 antígenos neumocócicos o fragmentos de los mismos con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1 -76 o SEQ ID NO: 153-234.

15. El método de cualquiera de los párrafos 1 a 14, en donde una proteína o un fragmento de proteína neumocócicos son al menos una de las proteínas neumocócicas SP0785, SP1500 y SP2145.

16. El método de cualquiera de los párrafos 1 a 15, en donde la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria humoral.

17. El método de cualquiera de los párrafos 1 a 15, en donde la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria celular.

18. Un método para inducir una respuesta de IL-17A en un sujeto, que comprende administrar al sujeto al menos una composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 - 17 eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen el sujeto.

19. Un método para proteger contra la colonización neumocócica, que comprende administrar al sujeto al menos una composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 - 17.

20. Un método para provocar una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero al menos una composición inmunogénica que comprende uno o más antígenos neumocócicos aislados o fragmentos de los mismos con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 1-76 o SEQ ID NO: 153-234 en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen el sujeto.

21. Un método para protegerse contra la colonización porStreptococcus penumoniaeoSalmonella typhien un mamífero, que comprende administrar al mamífero al menos una composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 - 17 en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen el sujeto.

22. El método de cualquiera de los párrafos 18-21, en donde la composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno neumocócico aislado o un fragmento del mismo es SP0785 o SP1500.

23. El método del párrafo 22, en donde el antígeno neumocócico o fragmento del mismo tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 34 (SP0785) o SEQ ID NO: 51 (SP 1500).

24. Un método para proteger contra una enfermedad invasiva porStreptococcus pneumoniaeen un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición inmunogénica de cualquiera de los párrafos 1 - 17 en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniaeen el sujeto.

25. El método del párrafo 24, en donde la enfermedad invasiva es sepsis.

26. El método del párrafo 24, en donde la composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno neumocócico aislado o un fragmento del mismo es SP1386, SP1500, SP0084 y SP1479 y SP0346.

27. El método del párrafo 26, en donde el antígeno neumocócico o fragmento del mismo tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 46 (SP1386), SEQ ID NO: 51 (SP1500), SEQ ID NO: 4 (SP0084), SEQ ID NO: 50 (SP1479) y SEQ ID NO: 15 (SP0346).

28. El método de cualquiera de los párrafos 18-27, en donde el antígeno neumocócico o fragmento del mismo se conjugan con el neumolisoide neumocócico PdT.

29. El método de cualquiera de los párrafos 18-27, en donde el antígeno neumocócico o fragmento del mismo se conjugan con el polisacárido Vi deSalmonella typhi.

30. El método de cualquiera de los párrafos 18-29, en donde el antígeno neumocócico o fragmento del mismo se conjugan con el neumolisoide neumocócico PdT y el polisacárido Vi deSalmonella typhi.

31. El método de cualquiera de los párrafos 18-30, en donde la administración es administración a través de la mucosa.

32. El método de cualquiera de los párrafos 18-31, en donde la administración es administración intravenosa, subcutánea o intraperitoneal (IP).

33. El método de cualquiera de los párrafos 18-32, en donde la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria humoral.

34. El método de cualquiera de los párrafos 18-32, en donde la respuesta inmunitaria comprende una respuesta inmunitaria celular.

Ejemplos

Materiales y métodos:

Materiales:El hidróxido de aluminio (alumbre) era de Brenntag North America (Alhydrogel al 2%). La resina Ni-NTA se adquirió de Qiagen. El kit de clonación por PCR CloneEZ se obtuvo de Genscript Inc. Todos los demás reactivos se obtuvieron de Sigma o Thermo Fisher Scientific.

Construcción de bibliotecas de expresión.

Los dominios extracelulares de las proteínas seleccionadas se amplificaron utilizando ADN genómico TIGR4 como molde mediante PCR y a continuación, se integraron en vectores de expresión pET21b utilizando el kit de clonación CloneEZ PCR. Las secuencias señal y transmembrana se excluyeron de la clonación. La región de clonación detallada y las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla I. Para las proteínas que son inusualmente grandes (SP0648, SP0664 y SP1154, mayores de 250 kDa) y resultaron difíciles de purificar en su totalidad, los autores de la presente invención dividieron su secuencia en 3 partes y purificaron cada una por separado. Eligieron dividir las proteínas basándose en la predicción de su estructura secundaria mediante BCL::Jufo (http://meilerlab.org/index.php/servers/show?s_id=5), realizando truncamientos en zonas que no están conservadas por secuencia de aminoácidos. Por tanto, la biblioteca de proteínas final consiste en 80 proteínas/péptidos. Las secuencias de plásmidos fueron verificadas por Genewiz Inc.

Purificación de proteínas.Los transformantes deE. colique contenían las proteínas clonadas relevantes se cultivaron hasta una DO600 = 0,6 y la expresión de proteínas se indujo con IPTG 0,2 mM a 16°C durante la noche. Las células se centrifugaron y los sedimentos se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0) y a continuación, se lisaron mediante sonicación. Las proteínas de interés se purificaron del sobrenadante en una columna de Ni-NTA; las proteínas se eluyeron en tampón de imidazol. Las eluciones que contenían proteínas se combinaron, se purificaron sobre una columna de filtración en gel y se eluyeron en tampón PBS.

Generación de los productos conjugados de Vi.Se resuspendió Vi a 5 mg/ml en tampón A (MES 0,2 M, NaCl 150 mM, pH 5,9) y se añadieron 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y NHS-Sulfo a la solución en forma de polvo durante 30 minutos a 4°C. El tampón de reacción se elevó a pH 7,5 mediante la adición de Na2HPO41 M. A continuación, se añadieron proteínas a la reacción como 2 mg/mg de proteína/azúcar. La reacción se llevó a cabo a 4°C durante 48 horas con rotación. Los productos conjugados se separaron mediante elución a través de una columna de filtración en gel Sephacryl S500 y recolección de las fracciones de volumen vacío.

Estimulación de esplenocitos de ratones y células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Los bazos recogidos de ratones C57BL/6 inmunizados con vacuna de células completas (WCV) o de ratones que se colonizaron repetidamente con S.pneumoniaese procesaron en una suspensión celular y se estimularon con diferentes concentraciones de proteínas recombinantes. Los esplenocitos se incubaron durante 3 días; a continuación, se centrifugaron las placas para sedimentar las células, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para determinar IL-17A utilizando un kit ELISA de IL-17A de ratón (R&D Systems, Inc).

Se separaron PBMC humanas de voluntarios adultos sanos y se cultivaron en placas de 96 pocillos. Las células se estimularon con diferentes concentraciones de proteínas recombinantes durante 4 días y a continuación, se analizaron para determinar IL-17A en el sobrenadante utilizando un kit ELISA de IL-17A humana (ebioscience).

Preparaciones de antígenos.

Para inmunización intranasal (i.n.): Las vacunas se prepararon el mismo día de la inmunización mezclando proteínas purificadas (5 μg) con 1 μg de toxina del cólera (CT) por ratón en 20 μl finales de solución salina. Para inmunización subcutánea (s.c.): Un día antes de la inmunización, las vacunas se prepararon de la siguiente manera. Se descongelaron alícuotas congeladas o se reconstituyeron viales liofilizados con agua estéril, se diluyeron hasta la concentración adecuada y se mezclaron con hidróxido de aluminio (alumbre) a la concentración indicada en un tubo cónico de 15 ml, que después se volteó durante la noche a 4°C para permitir la adsorción.

Inmunización y sensibilización de ratones.En todos los experimentos se utilizaron ratones C57BL/6J. La edad en el momento de la primera inmunización fue entre 4 y 6 semanas. La inmunización i.n. se realizó mediante la instilación atraumática de 20 μl de solución salina, adyuvante solo o adyuvante mezclado con antígeno como se especifica en ratones no anestesiados, un procedimiento que no introduce ningún inmunógeno en los pulmones; las inmunizaciones secundarias se administraron después de una semana. La inmunización s.c. se realizó 3 veces cada dos semanas. Los ratones ligeramente inmovilizados y no anestesiados recibieron inyecciones de 200 μl que contenían adyuvante con o sin antígeno en la parte inferior del dorso a intervalos de 2 semanas. Se extrajo sangre 2 semanas después de la última inmunización y se analizó la producción de anticuerpos y de IL-17Ain vitrotras la estimulación con WCA. La colonización nasofaríngea con el producto aislado neumocócico clínico 0603 (serotipo 6B) se llevó a cabo como se describió anteriormente [4]. Para la sensibilización intraperitoneal (IP) se administraron 1000 ufc de la cepa WU2-ply (una cepa modificada genéticamente que reemplazaplyporplyetiquetado con His) en 200 μl de PBS, y se controlaron la enfermedad o muerte de los ratones dos veces al día durante 14 días. Todos los estudios con animales fueron aprobados por los comités locales de ética animal de los autores de la presente invención.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y producción de IL-17A en muestras de sangre completa. Los ensayos de anticuerpos murinos para la producción de proteínas individuales y de IL-17A en sangre completa se llevaron a cabo como se describió anteriormente [2].

Unión de anticuerpos a cepas Tigr4 encapsuladas.La cepa Tigr4 de S.pneumoniaese cultivó hasta una DO600 = 0,8 y se recogió mediante centrifugación. Las bacterias se mataron a 58°C durante 1 hora y se lavaron con PBS dos veces. Las bacterias se bloquearon con 1 ml de PBS/BSA al 1% rotando durante la noche a 4°C. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 250 μl de PBS-Tween/BSA al 1% con una dilución 1:50 de suero de ratón inactivado por calor. Las muestras se rotaron a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora y se lavaron con PBS-Tween/BSA al 1% dos veces. Se añadieron a las células 250 μl de PBS-Tween/BSA al 1% con una dilución 1:50 de alexa Fluor 488 anti-ratón y las muestras se rotaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las muestras se lavaron con PBS-Tween/BSA al 1% dos veces y a continuación, se resuspendieron en 500 μl de PBS. La citometría de flujo se realizó en el Children's Hospital Boston.

Análisis estadístico.Las concentraciones de anticuerpos e IL-17A y las densidades de colonización de NP se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney utilizando PRISM (versión 4.0a, GraphPad Software, Inc). Las diferencias en supervivencia se analizaron con la prueba de Kaplan-Meier, utilizando también PRISM.

Ejemplo 1

Selección de proteínas candidatas mediante análisis bioinformático.

En la actualidad hay al menos 42 secuencias de S.pneumoniaedisponibles en el sitio web de genomas microbianos integrados (worldwide web:Himg.jgi.doe.gov/cgi-bin/w/main.cgi"). Comenzando con la cepa TIGR4 secuenciada, los autores de la presente invención analizaron el genoma en busca de péptidos señal de secreción previstos y motivos de anclaje de la pared celular. Los autores de la presente invención identificaron 335 proteínas con un péptido señal de secreción en TIGR4 y 15 proteínas con posibles motivos de anclaje a la pared celular.

La biblioteca de proteínas se redujo adicionalmente a 76 proteínas según los siguientes parámetros que se eligierona priori:

(a) Conservación en todos los neumococos secuenciados (>90% de identidad a nivel de aminoácidos).

(b) Exclusión de cualquier proteína que tenga >40% de homología con proteínas del genoma humano

(c) Exclusión de proteínas que contengan un dominio extracelular menor de 100 aminoácidos.

El desglose de las 76 proteínas es el siguiente: 23 proteínas hipotéticas, 17 proteínas que desempeñan un papel en la unión y el transporte del sustrato, 17 proteínas con actividades enzimáticas y otras 19 de función desconocida o hipotética. En la Tabla 2 se muestra una lista completa de las proteínas y su secuencia.

Tabla 2:Una lista de las proteínas neumocócicas de SEQ ID NO: 1 -83 y las secuencias de cebadores para aislamiento y amplificación. * restos de aminoácidos utilizados para la clonación; extremo se refiere al extremo C terminal.

Ejemplo 2

Escrutinio de antígenos de esplenocitos de ratón y células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).

Se clonaron y expresaron con éxito 60 proteínas de 80 construcciones genéticas y a continuación, se purificaron deE. coli.Después, estas proteínas se utilizaron en experimentos de estimulación con esplenocitos de ratón o PBMC humanas para evaluar la capacidad de estas proteínas para recordar una potente respuesta de IL-17A (la provocación de respuestas de IL-17A es un predictor de inmunogenicidad y protección contra la colonización por un antígeno neumocócico - (véase Moffitt KL, Gierahn TM, Lu YJ, et al. T(H)17-Based Vaccine Design for Prevention of Streptococcus pneumoniae Colonization. Cell Host Microbe 2011; 9:158-65).

Los esplenocitos de ratón se obtuvieron de tres fuentes: 1. Ratones previamente inmunizados con una vacuna de células completas (WCV); 2. Ratones previamente colonizados con una única cepa de S.pneumoniaedurante 10 días y 3. Ratones colonizados secuencialmente con cepas de serotipo 6B, 14F y 19F de S.pneumoniae.Estos tres modelos diferentes se utilizaron para identificar antígenos de superficie putativos protectores, ya que los autores de la presente invención evaluaron si estos antígenos se expresan lo suficiente durante la colonización para provocar una respuesta de las células inmunitarias después de la colonización. Además, los autores de la presente invención evaluaron si algunas de las proteínas de superficie también conferirían protección contra la colonización y/o enfermedades invasivas en ratones. Cualquier proteína determinada puede brindar protección contra la colonización, enfermedades invasivas o ambas; dado que la prevención tanto de la colonización como de las enfermedades invasivas son objetivos importantes de la vacunación, se incluyó la evaluación de la capacidad de conferir protección en cualquiera de los modelos. Los autores de la presente invención también evaluaron si los seres humanos, que están naturalmente expuestos a los neumococos durante su vida, también eran capaces de responder a las proteínas, como evidencia ulterior de que esta proteína puede expresarse durante la colonización humana. Las respuestas a cada proteína en los diferentes escrutinios se resumen en la Tabla 3 (que también incluye si la proteína protege contra la colonización, lo que se discutirá más adelante).

Tabla 3:Resumen de la respuesta de IL-17A a la estimulación proteica y la protección contra la colonización. *, producción de IL-17A en respuesta a la estimulación proteica: -, <25 μg/ml, , >25 μg/ml, +, >100 μg/ml, ++, >250 μg/ml, ** ND, no determinado

Ejemplo 3

SP0785 y SP1500 brindan protección contra la colonización

A continuación, los autores de la presente invención probaron los 14 antígenos para ver si podían proporcionar protección en un modelo de colonización con ratones. Para cada proteína probada, se mezclaron 5 gg de cada antígeno con adyuvante CT y se utilizaron para inmunizar ratones dos veces por semana. Los ratones fueron sensibilizados una cepa neumocócoca de serotipo 6B y se accedió a la protección 7 días después para la colonización neumocócica en la nariz. Dos proteínas, SP0785 y SP1500, mostraron una protección significativa en comparación con el grupo de adyuvante solo (p=0,0023 y p=0,0009 para SP0785 y SP1500, respectivamente) (Figura 1). Los otros 12 antígenos probados no resultaron protectores en este modelo de colonización.

Ejemplo 4

Protección contra la sepsis

Al mismo tiempo, los autores de la presente invención evaluaron si estas proteínas podrían conferir protección, cuando se utilizan como inmunógenos, contra enfermedades invasivas. Se inmunizaron grupos (n=10 ratones por grupo) de ratones C57/BL6 con una de las 15 proteínas por vía subcutánea con hidróxido de aluminio como adyuvante y a continuación, se sensibilizaron en un modelo de infección intraperitoneal (IP) con una cepa WU2 modificada genéticamente (plyde tipo salvaje reemplazado porplyetiquetado). Esta infección provoca la muerte de 80% de los ratones de control a partir de los 3-4 días posteriores a la infección. Como se resume en la Tabla 4, la proteína SP0346 protegió 60% de los ratones inmunizados en comparación con 20% del grupo de alumbre (p=0,0254). Cuatro proteínas protegieron 50% de los ratones, tales como SP1386, SP1500, SP0084 y SP1479. La protección de las 10 proteínas restantes fue inferior a 50%.

Tabla 4: Protección contra la sepsis tras la inmunización por vía subcutánea, utilizando hidróxido de aluminio como adyuvante.

Ejemplo 5

Protección contra la sepsis mediante proteínas que se fusionan con PdT

Los autores de la presente invención han demostrado previamente que la inmunización con un producto conjugado de fusión, en la que una proteína neumocócica se fusiona genéticamente con el neumolisoide neumocócico PdT y a continuación, se acopla covalentemente a un polisacárido, puede mejorar las respuestas y la protección inmunitarias (Lu YJ et al., Protection against Pneumococcal colonization and fatal pneumonia by a trivalent conjugate of a fusion protein with the cell wall polysaccharide. Infect Immun 2009; 77:2076-83.; Lu et al., A bivalent vaccine to protect against Streptococcus pneumoniae and Salmonella typhi. Vaccine 2012; 30:3405-12). A continuación, los autores de la presente invención probaron algunos antígenos en proteínas de fusión con PdT y también proteínas de fusión conjugadas con el polisacárido deSalmonella typhi,Vi (la nomenclatura de los autores de la presente invención para una proteína de fusión de proteína X y PdT, después conjugada con Vi es X-PdT-Vi). Como se muestra en la Figura 2, la inmunización con una proteína de fusión que consiste en SP0785-PdT protegió 80% de los ratones contra la sepsis y la proteína de fusión SP2145-PdT protegió 90%. La protección no se debe únicamente a PdT, que sólo protege 30% de los ratones infectados, lo que no es estadísticamente diferente de la tasa de mortalidad de los ratones de control. Las proteínas de fusión SP0785-PdT, SP2145-PdT y SP1500-PdT se conjugaron con el polisacárido Vi como se describió anteriormente. Estos ratones produjeron niveles elevados de IL-17A cuando se estimularon con la vacuna de células completas (WCV) (Figura 3A), lo que plantea una gran posibilidad de que estas dos construcciones puedan proteger tanto contra la colonización como contra la enfermedad neumocócicas. La Figura 3B muestra que estos productos conjugados de fusión también provocan anticuerpos robustos contra el polisacárido Vi, lo que también predice la protección contra S.typhi.

De manera similar a las proteínas de fusión, SP2145-PdT-Vi y SP0785-PdT-Vi protegieron significativamente los ratones en comparación con la inmunización con alumbre solo (80% de supervivencia en cualquiera de los grupos en comparación con 20% de supervivencia en el grupo de alumbre, P <0,006 para cualquiera de las comparaciones; Fig.4).

Ejemplo 6

El suero de ratones inmunizados con SP0785 se une a una cepa Tigr4 encapsulada.

Se realizó un ensayo de citometría de flujo para probar si los anticuerpos contra estos antígenos (SP0785, SP1500, SP2145) pueden unirse a la superficie de la cepa neumocócica encapsulada. La cepa TIGR4 aislada clínica de tipo 4 se cultivó hasta la fase logarítmica tardía y se fijó con calor. La unión de antisueros de ratón se detectó mediante IgG anti-ratón marcada con FITC. Como se muestra en la Figura 5, el suero de ratones inmunizados con SP0785 (color negro) puede marcar las bacterias en comparación con el suero obtenido de ratones inmunizados con alumbre solo (color gris), lo que indica que el anticuerpo anti-SP0785 puede unirse a la cepa de neumococo encapsulada.

En resumen, los autores de la presente invención han identificado dos proteínas SP0785 y SP1500 que protegen contra la colonización neumocócica, y SP0346 que protege contra la sepsis. Las proteínas de fusión SP0785-PdT y SP2145-PdT o la conjugación de estas dos proteínas con Vi protegieron los ratones contra la sepsis.

Ejemplo 7

Los complejos MAPS se elaboraron utilizando polisacárido neumocócico biotinilado tipo 1 anclado a una proteína de fusión que consiste en rizavidina y SP0785, SP1500, SP0435 o PdT. Se inmunizaron ratones C57/BL6 con una mezcla de 3 complejos MAPS que contenían SP0785, SP1500 y PdT, o una mezcla de los 4 complejos MAPS descritos anteriormente, sobre hidróxido de aluminio, a una dosificación de 6,7 gg de cada antígeno. Los ratones de control recibieron hidróxido de aluminio solo (alumbre, control negativo) o una vacuna de células completas en alumbre (como control positivo). La inmunización se administró por vía subcutánea tres veces, con dos semanas de diferencia. Se extrajo sangre después de la tercera inmunización y se estimuló con 10 gg/ml de antígeno de células completas de S. pneumoniae o 5 gg/ml de proteína purificada SP0785, SP1500 o PdT. La producción de IL-17A específica de antígeno o de células completas (WCB) se midió 7 días después de la estimulación mediante ELISA (Figura 6A). Una semana después de la recolección de sangre, los ratones fueron sensibilizados con la cepa neumocócica 603B y se determinó la tasa de colonización bacteriana en la nariz 10 días después de la sensibilización (Figura 6B). Los ratones que recibieron inmunizaciones con 3 o 4 complejos MAPS quedaron protegidos contra la colonización neumocócica.

Se inmunizaron ratones C57BL/6 con vacunas que contenían 5 gg de antígeno proteico (una proteína de fusión de SP0785, SP1500 y PdT conjugada con polisacárido Vi deSalmonella typhi)adsorbido sobre alumbre, por vía subcutánea tres veces, con dos semanas de diferencia. Los ratones de control recibieron alumbre solo. Dos semanas después de la última inmunización, los ratones fueron sensibilizados por vía intranasal a la cepa neumocócica 603B y se determinó la tasa de colonización bacteriana en la nariz mediante lavado nasal. Los ratones que fueron inmunizados con el producto conjugado de fusión estaban significativamente protegidos contra la colonización neumocócica en comparación con los ratones del grupo de control (Figura 7).

Se inmunizaron conejos blancos New Zealand con SP0785, SP1500 o PdT purificadas. Se administró una mezcla igual de cada suero de conejos antes de la inmunización y después de la inmunización (en este caso, 67 gl cada uno) a grupos de 10 ratones por vía intraperitoneal. A continuación, los ratones se infectaron por vía intraperitoneal con una cepa del serotipo 3 a las 24 horas y se controló la supervivencia de los ratones durante 8 días. El grupo que recibió suero post-inmunización tuvo una supervivencia de 60% en comparación con una supervivencia de 0% en el grupo previo al suero, una diferencia que fue altamente significativa desde el punto de vista estadístico, lo que demuestra la capacidad protectora de los anticuerpos contra estas proteínas para la enfermedad invasiva neumocócica (Figura 8).

Referencias

1. Moffitt KL, Gierahn TM, Lu YJ, et al. T(H)17-Based Vaccine Design for Prevention of Streptococcus pneumoniae Colonization. Cell Host Microbe 2011; 9:158-65).

2. Lu YJ, Forte S, Thompson CM, Anderson PW, Malley R. Protection against Pneumococcal colonization and fatal pneumonia by a trivalent conjugate of a fusion protein with the cell wall polysacaride. Infect Immun 2009; 77:2076-83.

3. Lu YJ, Zhang F, Sayeed S, et al. A bivalent vaccine to protect against Streptococcus pneumoniae and Salmonella typhi. Vaccine 2012; 30:3405-12.

Secuencias:

SEQ ID NO 153 /SP0010 (23-extremo)

SEQ ID NO 154 /SP0043 (42-extremo)

SEQ ID NO 155 /SP0079 (24-extremo)

SEQ ID NO 156/SP0084 (110-extremo)

SEQ ID NO 157/ SP0092 (30-extremo)

SEQ ID NO 158 /SP0098 (30-extremo)

SEQ ID NO 159 /SP0106 (29-extremo)

SEQ ID NO 160 /SP0107 (30-extremo)

SEQ ID NO 161 /SP0127 (26 extremos)

SEQ ID NO 162 /SP0149 (25-extremo)

SEQ ID NO 163 /SP0191 (26-extremo)

SEQ ID NO 164 /SP0198 (45 extremos)

SEQ ID NO 165 /SP0249 (26 extremos)

SEQ ID NO 14 /SP0321 (1-extremo)

SEQ ID NO 166/SP0346 (98-extremo)

SEQ ID NO 167/ SP0402 (29-extremo)

SEQ ID NO 168 /SP0453 (25-298)

SEQ ID NO 169 /SP0564 (21 -extremo)

SEQ ID NO 170 /SP0582 (92-extremo)

SEQ ID NO 171/ SP0589 (36-extremo)

SEQ ID NO 172/ SP0601 (36-297)

SEQ ID NO 173/SP0604 (223-extremo)

SEQ ID NO 174 /SP0617 (44-extremo)

SEQ ID NO 175/SP0620 (27-extremo)

SEQ ID NO 176/SP0629 (21-extremo)

SEQ ID NO 177/ SP0648 (40-776)

SEQ ID NO 178 /SP0648 (777-1676)

SEQ ID NO 179 /SP0648 (final 1677)

SEQ ID NO 180 /SP0659 (28-extremo)

SEQ ID NO 181/ SP0662 (29-276)

SEQ ID NO 182 /SP0662 (300-extremo)SEQ ID NO 183/SP0664 (103-629)

SEQ ID NO 184 /SP0664 (630-1200)

SEQ ID NO 185 /SP0664 (1201-extremo)

SEQ ID NO 186/SP0678 (23-extremo)

SEQ ID NO 187/ SP0724 (35-extremo)

SEQ ID NO 188 /SP0742 (43-extremo)

SEQ ID NO 189 /SP0757 (44-451)

SEQ ID NO 190/SP0785 (33-extremo)

SEQ ID NO 191/ SP0787 (43-290)

SEQ ID NO 192/ SP0872 (30-extremo)

SEQ ID NO 193/SP0878 (245-extremo)

SEQ ID NO 194/SP0899 (31-extremo)

SEQ ID NO 195/SP1002 (22-extremo)

SEQ ID NO 196/SP1026 (24-extremo)

SEQ ID NO 197/SP1032 (22-extremo)

SEQ ID NO 198/SP1069 (34-extremo)

SEQ ID NO 199 /SP1154 (155-694)

SEQ ID NO 200/SP1154 (695-1374)

SEQ ID NO 201/SP1154 (1375-extremo)

SEQ ID NO 202/SP1267 (25-extremo)

SEQ ID NO 203/SP1376 (32-extremo)

SEQ ID NO 204/SP1386 (33 extremos)

SEQ ID NO 205/SP1404 (31-extremo)

SEQ ID NO 206/SP1405 (19-extremo)

SEQ ID NO 207/SP1419 (27-extremo)

SEQ ID NO 208/SP1479 (40-extremo)

SEQ ID NO 209/SP1500 (27-extremo)

SEQ ID NO 210 /SP1545 (29-extremo)

SEQ ID NO 211/ SP1560 (28-extremo)

SEQ ID NO 212 /SP1624 (1-217)

SEQ ID NO 213/ SP1652 (62-397)

SEQ ID NO 214 /SP1683 (65-extremo)

SEQ ID NO 215 /SP1826 (36-extremo)

SEQ ID NO 216 /SP1872 (40-extremo)

SEQ ID NO 217 /SP1891 (40-extremo)

SEQ ID NO 218 /SP1897 (30-extremo)

SEQ ID NO 219 /SP1942 (37-extremo)SEQ ID NO 220/SP1966 (25-extermo)

SEQ ID NO 221 /SP1967 (30-extremo)

SEQ ID NO 222 /SP1998 (51 -extremo)

SEQ ID NO 223/SP2048 (40-extremo)

SEQ ID NO 224 /SP2050 (35-extremo)

SEQ ID NO 225/SP2083 (192-extremo)

SEQ ID NO 226/SP2084 (30-extremo)

SEQ ID NO 227/ SP2088 (30-extremo)

SEQ ID NO 70/SP2145 (1 -extremo)

SEQ ID NO 228 /SP2151 (25-extremo)

SEQ ID NO 229 /SP2187 (32-extremo)

SEQ ID NO 230/SP2192 (224-extremo)

SEQ ID NO 231 /SP2197 (30-extremo)

SEQ ID NO 232 /SP2207 (30-extremo)

SEQ ID NO 234 /SP2218 (106-extremo)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión que comprende (i) una proteína de unión a biotina o una porción funcional de la misma, y (ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34 o un fragmento de la misma que comprende un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190, o una porción inmunogénica de la misma en donde la composición inmunogénica, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria de IL-17A en el sujeto.

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde la proteína de unión a biotina es rizavidina.

3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o una porción inmunogénica de SEQ ID NO: 34 que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 190.

4. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente un polisacárido biotinilado.

5. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en donde el polisacárido es un polisacárido neumocócico.

6. La composición inmunogénica de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde el polisacárido biotinilado forma un complejo de afinidad con la proteína de fusión.

7. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, que comprende adicionalmente un adyuvante.

8. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior para su uso en medicina.

9. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, trastorno y/o afección por neumococo debidos a una infección neumocócica.