MXPA01003073A - Polipeptido que degrada la proteina c3 complementaria humana a partir de streptococcus pneumoniae. - Google Patents
Polipeptido que degrada la proteina c3 complementaria humana a partir de streptococcus pneumoniae.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a la identificacion y uso de una familia de los polipeptidos que degradan la C3 complementaria humana expresados por la S. pneumoniae. Los polipeptidos tienen pesos moleculares de manera aproximada de 15 kD hasta aproximadamente 25 kD o de manera aproximada 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa, por ejemplo. Los polipeptidos preferidos de esta invencion incluyen las secuencia de aminoacidos de la SEC. ID NO: 2 y SEC. ID NO: 5.
Description
POLIPEPTIDO QUE DEGRADA LA PROTEINA C3 COMPLEMENTARIA HUMANA A PARTIR DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al Streptococcus pneumoniae y en particular esta invención se refiere a la identificación de un polipéptido de S. pneumoniae que es capaz de degradar la proteína C3 complementaria humana. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La infección respiratoria con la bacteria
Streptococcus pneumoniae { S . pneumoniae) lleva a un estimado de 500,000 casos de neumonía y a 47,000 muertes al año. Aquellas personas con alto riesgo de infección por neumococos bacterémicos, son los infantes menores de dos años de edad, individuos con sistema el inmune comprometido y las personas de edad avanzada. En estas poblaciones, la S . pneumoniae es la causa principal de la neumonía bacteriana y la meningitis. Además, la S . pneumoniae es la bacteria principal que causa las infecciones en los oídos en niños de todas las edades. Tanto niños como personas de edad avanzada comparten defectos en la síntesis de los anticuerpos protectores para el polisacárido capsular del neumococo después de cualquier colonización bacteriana, infección
REF. NO. 128155 local o sistémica, o vacunación con polisacáridos purificados. La S . pneumoniae es la causa principal del padecimiento respiratorio, principal, invasivo, tanto en adultos como en niños con infecciones por VIH y produce infecciones hematógenas aquellos pacientes (Connor et al. Current Topics in AIDS 1987; 1:185-209 y Janoff et al. Ann . Intern . Med. 1992; 117 (4 ): 314-324) . Los individuos que demuestran el riesgo más grande de infecciones severas no son capaces de crear anticuerpos para las vacunas actuales del polisacárido capsular. Como resultado, hay ahora cuatro vacunas del conjugado en ensayos clínico. Las vacunas del conjugado consisten de los polisacáridos capsulares del neumococo unidas a los portadores o adyuvantes de las proteínas en un intento para incrementar la respuesta de los anticuerpos. Sin embargo, actualmente existen otros problemas potenciales con las vacunas del conjugado en los ensayos clínicos. Por ejemplo, los serotipos de neumococos que son más prevalentes en los Estados Unidos son diferentes de los serotipos más comunes en lugares tales como Israel, Europa del Este, Sudáfrica, o Escandinavia. Por lo tanto, las vacunas que pueden ser útiles en una localidad geográfica pueden no ser útiles en otra. La necesidad potencial de modificar las vacunas de los polisacáridos capsulares actualmente disponibles o de desarrollar conjugados de la proteína para vacunas capsulares que se adecúen a la variabilidad de los serotipos geográficos conlleva complicaciones financieras y técnicas. Así, la búsqueda de proteínas expuestas a la superficie, inmunogénicas, que se conserven en todo el mundo entre una variedad de serotipos virulentos es de vital importancia para la prevención de infecciones por neumococos y para la formulación de vacunas de neumococos ampliamente protectores. Además, el surgimiento de neumococos resistentes a la penicilina y a la cefalosporina en una base mundial hace necesarias las vacunas efectivas aún más exigentes (Baquero et al. J. Antimicrob . Chemother. 1991; 28S, 31-8) . Se han propuesto varias proteínas de neumococos para la conjugación con polisacáridos capsulares del neumococo o como inmunógenos simples para estimular la inmunidad contra la S . pneumoniae . Las proteínas superficiales que se reportan involucradas en la adhesión de la S . pneumoniae a las células epiteliales del tracto respiratorio incluyen PsaA, PspC/CB112, y proteinasa IgAl (Sampson et al. Infect . Immun . 1994; 62:319-324, Sheffield et al. Microb. Pa thogen . 1992; 13: 261-9, y Wani, et al. Infect . Immun . 1996;
64:3967-3974). Los anticuerpos para estas adhesinas podrían inhibir el enlace de los neumococos a las células epiteliales y por lo tanto reducir la colonización. Otras proteínas de neumococo citosólicas tales como neumolisina, autolisina, neuraminidasa, o hialuronidasa se proponen como antígenos de vacunas porque los anticuerpos podrían bloquear potencialmente los efectos tóxicos de estas proteínas en pacientes infectados con S . pneumoniae . Sin embargo, estas proteínas no están localizadas típicamente en la superficie de la S . pneumoniae, sino que se secretan o se liberan de la bacteria cuando la célula sufre de lisis y muere (Lee et al. Vaccine 1994; 12:875-8 y Berry et al. Infec . Immun . ' 1994; 62:1101-1108). Mientras que el uso de estas proteínas citosólicas como inmunógenos podría mejorar las consecuencias posteriores de la infección por S . pneumoniae, los anticuerpos para estas proteínas no podrían promover la muerte por neumococo ni evitar la colonización inicial o subsecuente de los neumococos. Una proteína de superficie prototípica que está siendo probada como una vacuna de neumococos es la proteína A de superficie de neumococos (PspA) . La PspA es una proteína heterogénea de aproximadamente 70-140 kDa. La estructura de la PspA incluye una hélice alfa en el amino terminal, seguida por la secuencia rica en prolina, y termina en una serie de 11 repeticiones de enlace a la colina en el carboxi terminal. Aunque la mayor parte de la información con respecto a su estructura está disponible, la PspA no está estructuralmente conservada entre una variedad de serotipos de neumococos, y su función es completamente desconocida (Yother et al. J. Bacteriol . 1992; 174:601-9 y Yother J. Bacteriol . 1994; 176:2976-2985). Los estudios han confirmado la inmunogenicidad de la PspA en animales (McDaniel et al. Microb. Pa thogen . 1994; 17; 323-337) . A pesar de la inmunogenicidad de la PspA, la heterogeneidad de la PspA, su existencia en cuatro grupos estructurales (o revestimiento) , y su función no caracterizada complica su capacidad para ser usada como un antígeno de vacuna. En pacientes que no pueden crear anticuerpos protectores para la cápsula del polisacárido específica del tipo, el tercer complemento, la proteína C3, y las proteínas asociadas de la vía del complemento alternativo constituyen la primera línea de defensa del hospedero contra la infección por S . pneumoniae . Debido a que las proteínas del complemento no pueden penetrar la pared celular rígida de la S. pneumoníae, la deposición opsónica de C3b en la superficie de los neumococos es el principal mediador de la eliminación de los neumococos. Las interacciones de los neumococos con el plasma C3 se sabe que ocurren durante la bacteremia de neumococos, cuando el enlace covalente del C3b, el fragmento activo opsónicamente del C3, inicia el reconocimiento y la ingestión fagocítica (Johnston et al. J. Exp. Med 1969; 129:1275-1290, Hasin HE, J. Immunol . 1972; 109:26-31 y Hostetter et al. J. Infect . Dis . 1984; 150:653-61) . La C3b se deposita en la cápsula de los neumococos, así como en la pared de las células. Este método para controlar la infección por S . pneumoniae es bastante ineficiente. Los métodos para aumentar la opsonización del S . pneumoniae podrían mejorar el curso del padecimiento inducido por este organismo. Existe actualmente una fuerte necesidad de métodos y terapias para limitar la infección por S. pneumoniae. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la identificación y uso de una familia de polipéptidos que degradan la C3 complementaria humana (por ejemplo las proteínas) expresadas por S . pneumoniae . Los polipéptidos preferiblemente tienen un peso molecular de aproximadamente 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa, o de manera aproximada 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa, como se determina, por ejemplo, en un gel de poliacrilamida de SDS al 10%. La invención incluye un número de polipéptidos aislables de diferentes cepas que degradan al C3 de S . pneumoniae . En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con la SEC. ID NO: 2 ó la SEC. ID NO: 5. En una modalidad preferida, el polipéptido se aisla de la S . pneumoniae o alternativamente el polipéptido es un polipéptido recombinante. Preferiblemente, el polipéptido aislado degrada la proteína C3 complementaria humana. Un polipéptido preferido de esta invención es un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la SEC. ID NO: 2 ó SEC. ID NO: 5, y más preferiblemente, es la SEC. ID NO: 2 ó SEC. ID NO: 5. El término "aislado" como se utiliza aquí se refiere a una especie que se presenta de manera natural que ha sido removida de su medio ambiente natural, así como a las especies sintéticas. El término "polipéptido" como se utiliza aquí incluye péptidos, polipéptidos, y proteínas, sin considerar su longitud. Preferiblemente, los polipéptidos de la invención incluyen una o más unidades funcionales, que engloban los polipéptidos que degradan a la proteína C3 complementaria humana .
Así, la invención también se refiere a fragmentos de polipéptidos aislados de una proteína que degrada al C3 de esta invención. Tales fragmentos están englobados por el término "polipéptido" como se utiliza aquí. Preferiblemente, la invención proporciona polipéptidos de al menos 15 aminoácidos secuenciales derivados de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la SEC. ID NO: 2 ó la SEC. ID NO: 5, y más preferiblemente, polipéptidos de al menos 15 aminoácidos secuenciales de la SEC. ID NO: 2 ó SEC. ID NO: 5. En otro aspecto de esta invención, los polipéptidos preferidos son capaces de degradar la proteína C3 complementaria humana. En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que preferiblemente degrada la proteína C3 complementaria humana, en donde el ácido nucleico que codifica al polipéptido aislado hibridiza al menos una porción de la SEC. ID NO: 1 ó SEC. ID NO: 4 o sus hebras complementarias bajo las condiciones de hibridización altamente severas. Preferiblemente, el polipéptido incluye al menos 15 aminoácidos secuenciales los cuales, más preferiblemente, son de la SEC. ID NO: 2 o de la SEC. ID NO: 5. En un aspecto adicional, esta invención se refiere a los polipéptidos que tienen una actividad de degradación reducida de la C3 humana o que no degradan a la C3 humana; sin embargo, los ácidos nucleicos que codifican este grupo de polipéptidos que incluyen cada uno la secuencia de nucleótidos que hibridiza a ya sea los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que degradan la C3 humana, o las hebras complementarias de cada ácido nucleico. Este último grupo de polipéptidos tienen la actividad reducida o no tienen actividad de degradación de la C3 humana a los que se les hace referencia aquí como polipéptidos "no degradantes". Los polipéptidos no degradantes pueden diferir de los polipéptidos que degradan la C3 por uno o más aminoácidos. Este cambio de aminoácidos puede ser una substitución, alteración, o eliminación de uno o más aminoácidos. Varios tipos de cambios de aminoácidos se discuten aquí, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos no degradantes son modalidades alternativamente preferidas de esta invención. La invención también se refiere a una composición que estimula al sistema inmune (preferíblemente, una vacuna) que comprende una cantidad efectiva de un polipéptido estimulante del sistema inmune de la presente invención, la cual preferiblemente se aisla de S . pneumoniae, y un portador aceptable terapéuticamente. En una modalidad, la composición o vacuna que estimula al sistema inmune además comprende al menos otro polipéptido que estimula al sistema inmune aislado de S. pneumoniae. La invención se refiere a un anticuerpo capaz de enlazarse (típicamente, enlazarse de manera específica) a un polipéptido (al menos una porción del mismo) de la presente invención. En un modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y en otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otra modalidad el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo se pueden obtener de un ratón, una rata, una cabra, un pollo, un humano, o un conejo. La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada (es decir, un polinucleótido, que puede ser de una sola hebra o de doble hebra, y la cual puede ser una parte, o fragmento, de una molécula más grande tal como un vector) capaz de hibridizar al menos una porción de la SEC. ID NO: 1 ó SEC. ID NO: 4 o sus hebras complementarias bajo condiciones de hibridización altamente severas. Como se utilizó aquí, las condiciones de hibridización altamente severas incluyen, por ejemplo, SSC 6X, Denhardt 5X, SDS al 0.5%, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, hibridizado durante toda la noche a 65°C y lavado en SSC 2X, SDS al 0.1% una vez a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos seguido por una vez a 65°C durante aproximadamente 15 minutos, seguido por al menos un lavado en SSC 0.2x, SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante al menos 3-5 minutos. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico se aisla de S . pneumoniae y en otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido. En una modalidad, el polipéptido degrada la C3 complementaria humana. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que no degrada la C3 complementaria humana. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico es un vector (es decir, es un fragmento de un vector de ácido nucleico) . El vector puede ser un vector de expresión capaz de producir un polipéptido. Las células que contienen la molécula de ácido nucleico también están contempladas en esta invención. En una modalidad, la célula es una célula bacteriana o una célula eucariótica. La invención además se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID NO: 1 ó SEC. ID NO: 4, ó sus hebras complementarias. La invención además se refiere a una molécula de ARN transcrita por una secuencia de ADN de doble hebra que comprende la SEC. ID NO: 1 ó la SEC. ID NO: 4. En otro aspecto de esta invención, la invención se refiere a un método para producir una respuesta inmune para la S . pneumoniae en un mamífero (particularmente un humano) . El método incluye: administrar a un mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la presente invención, y un portador aceptable farmacéuticamente, para producir una respuesta inmune al polipéptido. La respuesta inmune puede ser una respuesta de las células B, una respuesta de las células T, una respuesta epitelial, o una respuesta endotelial. En una modalidad preferida, la composición es una composición de vacuna. Preferiblemente, el polipéptido es de al menos 15 aminoácidos de longitud y también preferiblemente la composición comprende además al menos otro polipéptido que estimula el sistema inmune del S . pneumoniae . En una modalidad, el polipéptido comprende al menos 15 aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 ó SEC. ID NO: 5. La invención además se refiere a un polipéptido aislado de aproximadamente 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa, o de manera aproximada 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa, del Streptococcus pneumoniae que es capaz de degradar la proteína C3 complementaria humana y a un método para inhibir la degradación de la proteína C3 mediada por Streptococcus pneumoniae . El método además incluye poner en contacto una bacteria de Streptococcus pneumoniae con el anticuerpo capaz de enlazarse al polipéptido (al menos una porción del mismo) de la presente invención. La invención también se refiere a un método para inhibir la inflamación y rechazo mediados por la C3 en el xenotransplante. El método incluye expresar sobre la superficie de un órgano de un animal utilizado en el xenotransplante un polipéptido de la presente invención. Este método es particularmente ventajoso para provocar, por ejemplo, que los riñones de los cerdos expresen el polipéptido descrito aquí y por lo tanto inhiban la inflamación mediada por C3 después del xenotransplante. La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una región de al menos 15 nucleótidos que se hibridizan bajo las condiciones de hibridización altamente severas a al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID NO: 1 ó SEC. ID NO: 4 o sus hebras complementarias. La invención también se refiere a las moléculas o cebadores de ADN aislados que tienen las secuencias de ácido nucleico como se muestra en la SEC. ID NO: 6, SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 8 y SEC. ID NO: 9. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 proporciona la secuencia de ácido nucleico de la porción traducida de un gen de polipéptido (aproximadamente 20 kDa) que degrada la C3 de esta invención (SEC. ID NO: 1) . La Figura 2 proporciona la secuencia de ácido nucleico de un polipéptido que degrada la C3
(aproximadamente 20 kDa) de esta invención (SEC. ID NO: 2). La Figura 3 es un diagrama de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que degrada la C3
(aproximadamente 20 kDa) colocada con la secuencia de ácido nucleico (de doble hebra) que codifica un polipéptido que degrada la C3 de acuerdo con la invención (SEC. ID NOS: 1-3 en donde la SEC. ID NO: 3 es el complemento de la SEC. ID
NO: 1) . La Figura 4 proporciona la secuencia de ácido nucleico para una secuencia de aminoácidos de 92 kDa predicha (SEC. ID NO: 4) . La Figura 5 proporciona la secuencia de aminoácidos de 92 kDa predicha (SEC. ID NO: 5) . La figura 6A-6B muestra las alineaciones de secuencia de la SEC. ID NO: 1 y una porción de la SEC. ID NO: 4.
La Figura 7 muestra la alineación de secuencia de la SEC. ID NO: 2 con una porción de la SEC. ID NO: 5. La Figura 8. El análisis por manchado Western de varios lisados celulares completos de neumococos con el suero policlonal anti-r de 20 kDa. Los marcadores de peso molecular se hicieron correr en el carril 1; el polipéptido recombinante de 20 kDa de pDF122 se hizo correr en el carril 2; el polipéptido recombinante de 92 kDa del Tipo 7 se hizo correr en el carril 3; el carril 4 fue una referencia; el lisado celular completo CP1200 se hizo correr en el carril 5; el lisado celular completo del Tipo 3 se hizo correr en el carril 6; y el lisado celular del Tipo 7 se hizo correr en el carril 7. El antisuero reconoce los polipéptidos recombinantes de aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 92 kDa, pero solamente reconoce al polipéptido más grande en lisados celulares completos. La Figura 9. Es un auto-radiograma que muestra la C3 biotinilada mediante los polipéptidos de 20 kDa y 92 kDa de la presente invención. La Figura 10. El análisis SDS-PGE al 7.5% Teñido con
Azul de Coomassie de la degradación de C3 mediante los polipéptidos de 20 kDa (Carril A8) y los polipéptidos de 92 kDa (Carril C8) de la presente invención.
La Figura 11 es un diagrama que muestra la sobrevivencia de los ratones CBA/CAHN xid/J inmunizados SC
(subcutáneamente) con la proteína r 79 kDa que contiene como adyuvante MPL y con una prueba de inmunidad IN (intranasal) con S . pneumoniae del Tipo 3. La Figura 12 es un gel de SDS-PAGE descrito en el Ejemplo 8. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se refiere a la identificación y aislamiento de un fragmento del polipéptido que degrada la proteína C3 complementaria humana de un polipéptido más grande de manera aproximada de 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa. Este fragmento tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa (± 5 kDa) en un gel de SDS-PAGE al 10%. También se refiere a los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que degradan la C3. Se ha observado que los cultivos que crecen exponencialmente de neumococos a partir de varios serotipos son capaces de degradar primero la cadena ß después de degradar la cadena a de la C3 sin producir fragmentos escindidos de C3 definidos (Ángel, et al. J. Infecí . Dis . 170:600-608, 1994). Este patrón de degradación sin escisión difiere substancialmente de aquel de otros productos microbianos tales como la enzima elastasa de Pseudomonas aeruginosa y la cisteína proteinasa de En tamoeba histolytica . El término "degradar" se utiliza aquí para referirse a la remoción de aminoácidos a partir de las moléculas proteínicas, que generan péptidos o polipéptidos. El polipéptido de esta invención degrada la C3 sin generar fragmentos de escisión conocidos como C3b, iC3b, o C3d. Hay al menos alguna preferencia de los polipéptidos que degradan la C3 de esta invención para C3 en que, por ejemplo, el polipéptido que degrada la C3 no parece degradar otras proteínas, tal como la albúmina. Un polipéptido que degrada la C3 de aproximadamente 20 kDa se aisló a partir de una biblioteca o genoteca de genes de neumococos interrumpidos insercionalmente, identificado aquellos clones que han disminuido la actividad de degradación de C3 comparado con la S. pneumoniae tipo salvaje. Un ensayo ejemplar para valorar la actividad de degradación de la C3 de los clones se proporciona en el Ejemplo 1. Los clones con actividad que degrada la C3 disminuida se identifica y un inserto Smal de 546 bp se selecciona, en base a la secuencia de los clones que habían demostrado la actividad de degradación de la C3 disminuida.
El fragmento Smal se utilizó para probar o sondear la biblioteca de S . pneumoniae hecha a partir de la cepa CP1200. Los clones positivos de la biblioteca o genoteca de S . pneumoniae que hibridizan al fragmento Smal se aislan y se identifica la estructura de lectura abierta del gen asociado con la actividad de degradación de C3. El siguiente oligonucleótido (SEC. ID NO: 10), que tiene la identidad de secuencia con una porción de la PspA, se utilizó para confirmar, mediante hibridización diferencial, que el gen que codifica la proteinasa que degrada la C3 fue distinta del gen que codifica la PspA. SEC. ID NO: 10 GAAAACAATAATGTAGAAGACTACTTTAAAGAAGGTTAGA Una estructura de lectura abierta de un polipéptido de 20 kDa ocupa un intervalo de un área de aproximadamente 500 pares base (SEC. ID NO: 1) que predice un polipéptido de peso molecular de aproximadamente 20 kDa (+/- 5 kDa) o aproximadamente 168 aminoácidos (SEC. ID NO: 2) . Una secuencia del gen ejemplar que codifica un polipéptido que degrada la C3 se proporciona en la Figura 1 como SEC. ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos del polipéptido se proporciona en la Figura 2 como SEC. ID NO: 2. La Figura 3 combina una secuencia del gen preferido con un polipéptido traducido preferido, correspondiente, como SEC. ID NOS: 1-3. Utilizando la SEC. ID NO: 2 , la secuencia de aminoácidos del polipéptido de aproximadamente 20 kDa, se determinó que no estaba relacionado con otros polipéptidos en las bases de datos de GenBank o Swiss Prot. El polipéptido predicho engloba una secuencia rica en prolina característica de los dominios de membrana en los procariotes, particularmente entre los aminoácidos 80-108 sugiriendo que el polipéptido se expresa en la superficie. La secuencia de aminoácidos no exhibe repeticiones de enlace de colina aparentes. La electroforesis de lisados de neumococos y sobrenadantes de los cultivos de CP 1200 en geles de SDS-PAGE impregnados con C3 identificaron una banda lítica en aproximadamente 20 kDa (± 5 kDa) en ambos los sobrenadantes y los lisados, confirmando que un polipéptido de un tamaño predicho por la SEC. ID NO: 2 tiene actividad de degradación de la C3 (ver Ejemplo 2) . Como se proporcionó en el Ejemplo 3, el gen que codifica al polipéptido que degrada la C3 es conservado en al menos dos docenas de aislados de neumococos que representan cinco serotipos (serotipos 1, 3, 14 y 19F) . La secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que degrada la C3 de esta invención se insertó en un vector del gen de expresión para la expresión en E. coli . El polipéptido que degrada la C3 recombinante se aisló como se describe en los ejemplos. Aquellos de habilidades ordinarias en la técnica reconocerán que, dada una secuencia de genes particulares tales como la proporcionada en la SEC. ID NO: 1, hay una variedad de vectores de expresión que se podrían utilizar para expresar el gen. Además, hay una variedad de métodos conocidos en la técnica que podrían ser utilizados para producir y aislar el polipéptido recombinante de esta invención y aquéllos de habilidades ordinarias en la técnica también reconocerán que el ensayo de degradación de la C3 de esta invención determinará si está funcionando o no un sistema de expresión particular, además para aquellos sistemas de expresión proporcionados en los ejemplos, está funcionando, sin requerir experimentación indebida. Una variedad de técnicas moleculares e inmunológicas se pueden encontrar en los textos técnicos básicos tales como aquéllos de Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Labora tory Manual , 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y Harlow et al. {Antibodies; A Labora tory Manual . Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) . El polinucleótido que codifica al polipéptido que degrada la C3 de esta invención se identificó utilizando una biblioteca de plásmidos hecha con fragmentos de ADN genómicos de neumococo de la cepa CP1200. Aunque hay una variedad de métodos conocidos para obtener una biblioteca de plásmidos, en una estrategia preferida, una biblioteca de plásmidos se construyó con los fragmentos de ADN genómico de neumococos digeridos con Sau 3A (0.5-4.0 kb) de la cepa de neumococos CP 1200 (obtenidos de D.A. Morrison, University of Illinois, Champagne-Urbana, Illinois y se describe en Havarstein LF, et al. Proc . Na ti . Acad. Sci . (USA) 1995; 92:11140-11144) y se inserta en el sitio Bam Hl del vector pVA 891 de transferencia integrativo (ermr, cmr; tiene origen de replicación para E. coli ) . Esta biblioteca se transformó en una cepa DH5a MCR de E. coli mediante electroporación. Las extracciones de plásmidos de algunos transformantes de E. coli seleccionados al azar revelaron que todos ellos contenían los plásmidos recombinantes. El ADN de la biblioteca del plásmidos se puede extraer de los transformantes de E. coli y se utiliza para transformar la cepa de neumococos origen CP 1200 utilizando mutagénesis insercional mediante recombinación homologa. Las células CP 12000 de la cepa de neumococo se pueden hacer competentes utilizando un pH de variación o transferencia con el procedimiento de HCl en el medio CTM. Las células competentes se congelan a -70°C en alícuotas pequeñas hasta que sean necesarias. El polipéptido aislado de esta invención se puede incubar con la C3 complementaria humana durante 4 horas o mayor a 37 °C en la presencia de PBS para detectar la degradación de C3. Las muestras de control sin el polipéptido de neumococo aislado se utilizan como controles para propósitos comparativos. Los polipéptidos de esta invención tienen un peso molecular aparente en un gel de SDS-poliacrilamida al 10% de manera aproximada ya sea 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa; y de manera preferible aproximadamente 20 kDa; o de manera aproximada 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa; y de manera preferible aproximadamente 92 kDa. Las secuencias de los polipéptidos ejemplares se proporcionan mediante la SEC. ID NO: 2 y SEC. ID NO: 5. Aquellos de habilidades ordinarias en la técnica reconocerán que alguna variabilidad en la secuencia de aminoácidos se espera y que esta variabilidad no deberá disminuir el alcance de la invención. Por ejemplo las mutaciones conservadas no se salen de esta invención ni lo hacen las variaciones en la identidad de secuencia de aminoácidos de menos de aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos y de manera preferible menos de aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos en donde el polipéptido es capaz de degradar la proteína C3 complementaria humana, y particularmente donde el polipéptido se aisla o se obtiene originalmente de una bacteria S . pneumoniae. Las proteínas y fragmentos de las mismas (todas referidos como polipéptidos) también están dentro del alcance de la presente invención, particularmente si las mismas son capaces de degradar la proteína C3 complementaria humana. Se espera alguna variabilidad de la secuencia de ácido nucleico entre las cepas y serotipos de neumococos como lo es con alguna variabilidad de aminoácidos. Se conocen las substituciones conservadas de aminoácidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, las substituciones de aminoácidos que utilizan otros miembros de la misma clase a la cual pertenecen los aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, y triptofano. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Tales alteraciones no se espera que afecten el peso molecular aparente como se determinó mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida o mediante el punto isoeléctrico. Las substituciones conservativas particularmente preferidas incluyen, pero no están limitadas a, Lys para Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu para Asp y viceversa para mantener una carga negativa, Ser para Thr de manera que se mantenga -OH libre; y Gln para Asn para mantener un NH2 libre. Los polipéptidos preferidos de esta invención incluyen polipéptidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 ó la SEC. ID NO: 5. Otros polipéptidos incluyen aquellos que degradan al polipéptido de la C3 complementaria humana y que tiene un ácido nucleico que codifica el polipéptido que se hibridiza a la SEC. ID NO: 1 ó SEC. ID NO: 4 bajo condiciones de hibridización altamente severas tales como SSC 6X, Denhardt 5X, SDS al 0.5% (dodecil sulfato de sodio) , y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, hibridizado durante toda la noche a 65°C y lavado en SSC 2X, SDS al 0.1% una vez a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos seguido por una vez a, 65 °C durante aproximadamente 15 minutos, seguido por al menos un lavado en SSC 0.2x, SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante al menos 3-5 minutos también se contemplan en esta invención. Típicamente una solución de SSC contiene cloruro de sodio, citrato de sodio, y agua para preparar una solución de reserva. Los polipéptidos de esta invención se pueden aislar o preparar como polipéptidos recombinantes. Esto es, el ácido nucleico que codifica una proteína, o una porción de la misma, se puede incorporar en un vector de expresión o incorporar en un cromosoma de una célula para expresar el polípéptido en una célula. El polipéptido puede ser purificado a partir de un bacteria u otra célula, preferiblemente una célula eucariótica y más preferiblemente una célula de animal. Alternativamente, el polipéptido se puede aislar a partir de una célula que expresa el polipéptido, tal como una célula de S . pneumoniae . Así, las proteínas, péptidos, o polipéptidos están considerados todos dentro del alcance de esta invención cuando se utiliza el término "polipéptido". Los polipéptidos son preferiblemente al menos 15 aminoácidos de longitud y los polipéptidos preferidos tienen al menos 15 aminoácidos secuenciales de la SEC. ID NO: 2 ó SEC. ID NO: 5. El ácido nucleico que codifica al polipéptido de aproximadamente 15 kDa hasta aproximadamente 20 kDa y al polipéptido de aproximadamente 75 kD hasta aproximadamente 95 kD también son parte de esta invención. Las SEC. ID NOS: 1 y 4 son las moléculas de ácido nucleico preferidas que codifican un polipéptido que degrada la C3. Aquéllos de habilidades ordinarias en la técnica reconocerán que alguna substitución no alterará la secuencia del polipéptido que degrada la C3 a un grado que el carácter o naturaleza del polipéptido que degrada la C3 se altere substancialmente. Por ejemplo, el ácido nucleico con una identidad de al menos 80% para la SEC. ID NO: 1 se contempla dentro en esta invención. Un método para determinar sí una secuencia de ácido nucleico particular cae dentro del alcance de esta invención se considera o no una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que degrada la C3 y tiene una identidad de ácido nucleico de al menos 80% cuando se compara con la SEC. ID NO: 1 ó SEC. ID NO: 4. Otras secuencias de ácido nucleico que codifican al polipéptido C3 incluyen el ácido nucleico que codifica al polipéptido C3 donde el polipéptido C3 tiene la misma secuencia o al menos una identidad de secuencia del 90% con la SEC. ID NO: 2 ó SEC. ID NO: 5 pero que incluye degeneración con respecto a la secuencia de ácido nucleico. Un codon degenerado significa que un codon de tres letras diferentes se utiliza para especificar al mismo aminoácido. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que los siguientes codones de ARN (y por lo tanto, los codones de ADN correspondientes con una T substituida por una U) se pueden utilizar para codificar intercambiablemente cada aminoácido específico: Fenilalanina (Phe o F) UUU, UUC, UUA o UUG Leucina (Leu o L) CUU, CUC, CUA o CUG Isoleucina (lie o I) AUU, AUC o AUA Metionina (Met o M) AUG Valina (Val o V) GUU, GUC, GUA, GUG Serina (Ser o S) AGU o AGC Prolina (Pro o P) CCU, CCC, CCA, CCG Treonina (Th o T) ACU, ACC, ACA, ACG Alanina (Ala o A) GCU, GCG, OCA, GCC Triptofano (Trp) UGG Tirosina (Tyr o Y) UAU o UAC Histidina (His o H) CAU o CAC Glutamina (Gln o Q) CAA o CAG Asparagina (Asn o N) AAU o AAC Lisina (Lys o K) AAA o AAG Acido Aspártico (Asp o D) GAU o GAC Acido Glutámico (Glu o E GAA o GAG Cisteína (Cys o C) UGU o UGC Arginina (Arg o R) AGA o AGG Glicina (Gly o G) GGU o GGC o GGA o GGG Codon de terminación UAA, UAG o UGA
Además, una secuencia de ADN particular puede ser modificada para emplear los codones preferidos para un tipo de célula particular. Por ejemplo, el uso del codon preferido para E. coli es conocido, pues se prefieren los codones para animales que incluyen los humanos. Estos cambios son conocidos por aquéllos de habilidades ordinarias en la técnica y por lo tanto estas secuencias de genes se consideran parte de esta invención. Otras secuencias de ácido nucleico incluye al menos 15, y preferiblemente, al menos 30 ácidos nucleicos de longitud desde la SEC. ID NO: 1 ó SEC. ID NO: 4 u otros fragmentos de ácido nucleico de al menos 15, y preferiblemente al menos 30 ácidos nucleicos de longitud en donde estos fragmentos hibridizan a la SEC. ID NO: 1 ó la SEC. ID NO: 4 bajo condiciones de hibridización altamente severas tales como SSC 6X, Denhardt 5X, SDS al 0.5%, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, hibridizado durante toda la noche a 65°C y lavado en SSC 2X, SDS al 0.1% una vez a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos seguido por una vez a, 65 °C durante aproximadamente 15 minutos, seguido por al menos un lavado en SSC 0.2X, SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante al menos 3-5 minutos.
Las moléculas de ácido nucleico de esta invención pueden codificar todos, ninguno (es decir, lo fragmentos que no se pueden transcribir, los fragmentos que incluyen porciones reguladoras del gen, o similares), o una porción de la SEC. ID NO: 2 ó SEC. ID NO: 5 y preferiblemente que contienen un fragmento de ácido nucleico contiguo que codifica al menos nueve aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 ó SEC. ID NO: 5. Debido a que las moléculas de ácido nucleico que codifican una porción de un polipéptido que degrada la C3, se contemplan en esta invención, se entenderá que no todas las moléculas de ácido nucleico codificarán una proteína o péptido o polipéptido con actividad de degradación de la C3. Además, el ácido nucleico de esta invención se puede mutar para remover o de otra manera inactivar la actividad de degradación de la C3 de este polipéptido. Por lo tanto, también se contemplan las moléculas de ácido nucleico que codifican a los polipéptidos sin la actividad de degradación de la C3 que llenan los requisitos de hibridización descritos. Los métodos para mutar o de otra manera alterar las secuencias de ácido nucleico están bien descritos en la técnica y la producción de un polipéptido inmunogénico, pero inactivo enzimáticamente se puede probar para utilidad terapéutica. Las moléculas de ácido nucleico de esta invención se pueden incorporar operablemente los vectores de ácido nucleico en los genomas hospederos para producir polipéptidos recombinantes que incluyen los polipéptidos quiméricos recombinantes. En una modalidad, el polipéptido que degrada la C3 está codificado por un gen en un vector y el vector está en una célula. Preferiblemente, la célula es una célula procariótica tal como una bacteria. Los genes y fragmentos de genes que existen como la fusión de todos o una porción del gen con otro gen y el polipéptido que degrada la C3 pueden existir como una proteína de fusión de una o más proteínas en donde la proteína de fusión se expresa como una sola proteína. Una variedad de vectores de ácido nucleico de esta invención son conocidos en la técnica e incluyen un número de plásmidos de expresión disponibles comercialmente. El uso de estos vectores también está dentro del alcance de lo que es habilidades ordinarias en la técnica. Los vectores ejemplares se emplean en los ejemplos, pero no se deberán considerar como limitantes del alcance de esta invención. Esta invención también se refiere a los anticuerpos capaces de enlazarse (típicamente, enlazarse de manera específica) a los polipéptidos de manera aproximada de 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa; y de manera preferible aproximadamente 20 kDa; y de manera aproximada 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa; y de manera preferible aproximadamente 92 kDa, de S . pneumoniae y preferiblemente en donde los polipéptidos son capaces de degradar a la C3 complementaria humana. Los anticuerpos policlonales o monoclonales se pueden preparar para todo o parte de los polipéptidos de la invención. Los métodos para preparar los anticuerpos para los polipéptidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, por Harlow et al., (An tibodies; A Labora tory Manual . Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) . En un ejemplo preferido, los anticuerpos pueden ser derivados de humanos, derivados de ratas, derivados de ratones, derivados de cabra, derivados de pollo, o derivados de conejo. Los fragmentos del anticuerpo que se enlaza al polipéptido y los fragmentos quiméricos también son conocidos y están dentro del alcance de esta invención. La invención también se refiere al uso de composiciones inmunoestimulantes. El término "inmunoestimulante" o composición de la "estimulación del sistema inmune" se refiere a las composición de proteína, péptido, o polipéptido de acuerdo a la invención que activan al menos un tipo de célula del sistema inmune en un sujeto, tal como un mamífero. Preferiblemente, la composición inmunoestimulante proporciona una respuesta inmunizante o profiláctica benéfica en un sujeto normal, es decir un sujeto no infectado, típicamente una vacuna. Sin embargo, cualquier respuesta inmune medible es benéfica en un sujeto en una aplicación o protocolo de terapia. Las células activadas preferidas del sistema inmune incluyen las células fagocíticas tales como neutrófilos o macrófagos, las células T, las células B, las células epiteliales y las células endoteliales. Las composiciones inmunoestimulantes comprenden los péptidos, polipéptidos o proteínas de la invención, se pueden utilizar para producir anticuerpos en un animal tal como un rata, ratón, cabra, pollo, conejo, o un humano o un animal de modelo para estudiar la infección por S . pneumoniae. Las composiciones inmunoestimulantes preferidas incluyen una cantidad inmunoestimulante, por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva, de al menos un péptido o polipéptido que incluye al menos 15 aminoácidos del polipéptido que degrada la C3. El término "vacuna" se refiere a una composición para la inmunización. Este proceso puede incluir la administración de una proteína, péptido, polipéptido, antígeno, secuencia de ácido nucleico o secuencia complementaria, por ejemplo, anti-sentido, o anticuerpo, o suspensiones de las mismas, en donde luego de la administración, la molécula producirá una inmunidad activa y proporcionará protección contra una infección o colonización por S . pneumoniae. Típicamente, tales vacunas se preparan como soluciones o suspensiones inyectables o ya sea como líquidos. Las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección también se pueden preparar. La preparación de la vacuna puede opcionalmente ser emulsificada, o encapsulada en liposomas. La composición inmunoestimulante (tal como vacuna) puede incluir además otros polipéptidos en un amortiguador o portador farmacéuticamente aceptable, tal como un PBS
(solución salina amortiguadora de fosfato) u otro amortiguador reconocido en la técnica como adecuado y seguro para la introducción de polipéptidos en un huésped para estimular el sistema inmune. Las composiciones inmunoestimulantes también pueden incluir otros polipéptido estimulantes del sistema inmune tales como adyuvantes o proteínas, péptidos, o polipéptidos inmunoestimulantes a partir de S . pneumoniae u otros organismos. Por ejemplo, una mezcla o cóctel de péptidos o polipéptidos puede ser más útil para controlar la infección por S . pneumoniae . Preferiblemente uno o más de los polipéptidos, o fragmentos del mismo, de esta invención se pueden utilizar en una preparación de vacuna para proteger contra o limitar la colonización con S . pneumoniae o las consecuencias patogénicas de la colonización por S . pneumoniae . Una "cantidad terapéuticamente efectiva", como se utiliza aquí, se refiere a aquella cantidad que es efectiva para la producción de un resultado deseado. Esta cantidad varía dependiendo de la condición física y de salud del sistema inmune de un sujeto, es decir, para sintetizar los anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación preparada y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un rango relativamente amplio que se puede determinar a través de los ensayos de rutina. Los ingredientes inmunoestimulantes activos a menudo se mezclan con los excipientes o diluyentes que son aceptables farmacéuticamente como portadores y compatibles con el ingrediente activo. El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador (es) que es "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de una composición y no nocivo al recipiente del mismo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición inmunoestimulante (incluye vacuna) puede contener pequeñas cantidades de substancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes de amortiguador de pH, y/o adyuvantes que mejoran la efectividad de la composición inmunoestimulante. Los ejemplos de adyuvantes o portadores que pueden ser efectivos incluyen pero no están limitados al hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) ; N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 ' -dipalmitol-sn-glicero-3-hidroxi-fosforiloxi) -etilamina (CGP 19835A, referida como MTP-PE) , y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de las bacterias, lípido A de monofosforilo, dimicolato de trehalosa y el esqueleto de las paredes celulares (MPL + TDM + CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween 80. Esta invención también se refiere a un método para inhibir la degradación de la C3 mediada por Streptococcus pneumoniae que comprende poner en contacto una bacteria de Streptococcus pneumoniae con un polipéptido, tal como un anticuerpo u otro polipéptido que es capaz de enlazarse a un polipéptido aislado (típicamente, al menos una porción del mismo) de manera aproximada de 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa, o de manera aproximada de 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa, del Streptococcus pneumoniae . La proteína capaz de enlazarse a un polipéptido aislado de manera aproximada de 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa, o de manera aproximada de 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, o la proteína puede ser una proteína quimérica que incluye el dominio de enlace del anticuerpo, tal como un dominio variable que es capaz de reconocer específicamente un polipéptido aislado de manera aproximada de 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa, o de manera aproximada 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa, del Streptococcus pneumoniae que tiene una actividad de degradación de la C3. El polipéptido S . pneumoniae aislado de esta invención se puede aislar, y opcionalmente purificar y el polipéptido aislado o fragmentos inmunogénicos del mismo se pueden utilizar para producir una respuesta inmunológica, que incluye, en un ejemplo, una respuesta del anticuerpo en un humano o un animal experimental. Los polipéptidos sin la capacidad de degradar la C3 se pueden probar para su capacidad de limitar los efectos de la infección por 5. pneumoniae . Similarmente, los polipéptidos de esta invención se pueden modificar, tal como a través de la mutación para interrumpir o inactivar la actividad de degradación de la C3 de los polipéptidos. El anticuerpo capaz de inhibir la actividad de degradación de la C3 de los polipéptidos de esta invención se puede utilizar como una estrategia para evitar la degradación de la C3 y para promover la eliminación del S. pneumoniae a través de la vía opsónica. Los polipéptidos aislados se pueden utilizar en ensayos para detectar anticuerpos para el S. pneumoniae o como parte de una vacuna o una vacuna que contiene el proteína, péptido o polipéptido multi-valente o múltiple, para la terapia del S. pneumoniae . Así, el término "tratamiento", como se utiliza aquí, se refiere a la profilaxis y/o terapia de cualquier sujeto mamífero normal o sujetos mamíferos colonizados con, diagnosticados con, o que exhiben características o síntomas de varias infecciones por S . pneumoniae. El término "terapia" se refiere a proporcionar un efecto terapéutico para un sujeto mamífero tal que el sujeto muestre pocos o ningún síntoma de una infección por neumococos u otro padecimiento relacionado. Tal tratamiento se puede complementar por la administración de moléculas de ácido nucleico (sentido o antisentido) , proteínas, péptidos o polipéptidos o anticuerpos de la presente invención. Se contempla además que los polipéptidos de esta invención pueden ser expresados en la superficie en células de vertebrados y utilizarse para degradar la C3, por ejemplo, en donde la deposición del complemento (o activación) llegue a ser un problema, tal como en el xenotransplante o en la glomérulonefritis mediada por complementos. Por ejemplo, el polipéptido de neumococos completo, un polipéptido recombinante, o una porción de cualquiera, se puede incorporar en células de xenotransplante y expresar como un polipéptido de superficie o como un polipéptido secretado para evitar minimizar la deposición del completo (y/o la inflamación mediada por el complemento) . Otro aspecto específico de la presente invención, se refiere a utilizar un vector de la vacuna que expresa una proteína aislada, y péptidos o polipéptidos del mismo. De acuerdo con esto, en un aspecto adicional esta invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un mamífero, que comprende proporcionar a un mamífero un vector de vacuna que expresa al menos uno, o una mezcla de una proteína aislada y/o péptido o polipéptido de la invención. La proteína y péptidos o polipéptidos de la presente invención se pueden suministrar a un mamífero que utiliza un vector de vacuna vivo, en particular que utiliza bacterias recombinantes vivas, virus u otros agentes vivos, que contienen el material genético necesario para la expresión de la proteína y/o péptidos o polipéptidos como un polipéptido extraño. Particularmente, las bacterias que colonizan el tracto gastrointestinal, tal como Salmonella, Shigella, Yersinia, Vibrio, Escherichia y BCG han sido desarrolladas como vectores de vacuna, y estos y otros ejemplos se discuten por J. Holmgren et al., Immunobiol. , 184, 157-179 (1992) y J. McGhee et al., Vaccine, 10, 75-88 (1992) . Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, que comprende administrar a un sujeto una cantidad de una molécula de ADN que codifica una proteína y/o péptido o polipéptido de la misma, de esta invención, opcionalmente con un agente que facilita la transfección, en donde la proteína y/o los péptidos o polipéptidos retienen la inmunogenicidad y, cuando se incorporan en una composición inmunoestimulante, por ejemplo, vacuna, y se administra a un humano, proporciona protección sin inducir un padecimiento mejorado luego de la infección subsecuente del humano con el patógeno de S. pneumoniae. Los agentes que facilitan la transfección son conocidos en la técnica. Se contempla además que la secuencia antisentido del gen que codifica al polipéptido de manera aproximada' de 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa, y el polipéptido de manera aproximada 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa se puede utilizar como una vacuna o como un tratamiento terapéutico para la infección por neumococos. El ADN antisentido se define como una secuencia no codificante que es complementaria, es decir, una hebra complementaria, para todo o una porción de la SEC. ID NO: 1 ó SEC. ID NO: 4. Por ejemplo, la secuencia antisentido para 5 ' -ATGTCAAGC-3 ' es 3' -TACAGTTCG-5' . El suministro de la secuencia antisentido o los oligonucleótidos en un animal pueden dar como resultado la producción de un anticuerpo por el animal o en la incorporación de la secuencia en bacterias vivas u otras células por lo que la transcripción y/o traducción de toda o una porción del producto del gen de 92 kDa se inhibe. La introducción de una secuencia de ácido nucleico antisentido se puede completar, por ejemplo, cargando el ácido nucleico antisentido en un portador adecuado, tal como un liposoma, para la introducción en células de neumococos o infectadas. Típicamente, una secuencia de ácido nucleico antisentido que tiene ocho o más nucleótidos es capaz de enlazarse al ácido nucleico bacteriano o al ARN mensajero bacteriano. La secuencia de ácido nucleico antisentido, típicamente contiene al menos de manera aproximada de 15 nucleótidos, de manera preferible al menos aproximadamente 30 nucleótidos o más nucleótidos para proveer la estabilidad necesaria de un producto de hibridización del ácido nucleico bacteriano o ARN del mensajero bacteriano. La introducción de las secuencias preferiblemente inhiben la transcripción o traducción de al menos una secuencia de ácido nucleico endógena de S . pneumoniae . Los métodos para cargar el ácido nucleico antisentido, son conocidos en la técnica como se ejemplifica por la Patente Norteamericana No. 4,242,046. La presente invención también proporciona el ácido nucleico que tiene una estructura de lectura abierta de 2478 bases (SEC. ID NO: 4) que engloba la estructura de lectura abierta de una secuencia de ácido nucleico (SEC. ID NO: 1) que codifica un polipéptido que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa (SEC. ID NO: 2). El polipéptido de 20 kDa, descrito aquí, se caracteriza además como un polipéptido que degrada la C3. La estructura de lectura abierta grande, por ejemplo, 2163 bp (SEC. ID NO: 4), codifica un polipéptido putativo de aproximadamente 92 kDa (SEC. ID NO: 5) . Todas las referencias y publicaciones citadas aquí se incorporan expresamente por referencia en esta descripción. Hay una variedad de técnicas y procedimientos alternativos disponibles para aquellos con habilidades en la técnica que podrían permitir de manera similar a alguien realizar exitosamente la invención pretendida en vista de la presente descripción. Se apreciará por un experto en la técnica que mientras la invención ha sido descrita anteriormente en relación con las modalidades y ejemplos particulares, la invención no está necesariamente limitada y que las numerosas otras modalidades, ejemplos, usos, modificaciones y partidas de modalidades, ejemplos y usos se pueden hacer sin alejarse del alcance inventivo de esta solicitud.
Ejemplo 1 Identificación de Mutantes Insercionales con Actividad Reducida de Degradación de la C3 Los mutantes insercionales se recibieron del Dr. Elaine Tuomanen, (Rockefeller Inst., New York, New York).
Los clones con inserciones se probaron en un ensayo para detectar la actividad reducida de degradación de la C3. Se probaron 137 clones haciendo crecer las células en un caldo
Todd Hewitt durante toda la noche a temperatura ambiente en placas de microtitulación. Las células se diluyeron 1:10 en un medio sintético para los neumococos (ver Sicard A. M.,
Genetics 50:31-44, 1984) y el resto de las células se congelaron en la placa de microtitulación. Ya sea 63 ng u 83 ng de C3 (purificada del plasma humana de acuerdo al método de Tack et al., Meth . Enzymol . 80:64-101, 1984) por 100 µl del medio que contenia 1 mg/ml de BSA al 0.1% en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) se agregan aproximadamente 200 µl de células diluidas. Las células se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Cien µl de la mezcla se agregaron a las placas ELISA y se incubaron durante toda la noche. Las placas se lavaron tres veces con amortiguador de lavado y los pozos se llenaron con Tween 20 al 0.05% en PBS con incubaciones de cinco minutos entre los lavados. Cien µl del anticuerpo para C3 (anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano policlonal específico para la fracción IgG de C3 humana, ICN Cappel, Costa Mesa, CA) se diluye 1:1200 con BSA al 3% en PBS. La placa ELISA se incubo a 37°C durante aproximadamente 30 minutos a 1 hora en la obscuridad y se lavó con amortiguador de lavado como se indico anteriormente. El ensayo se desarrolló utilizando 12 mg de OPD en 30 del amortiguador de citrato de sodio O.lM con 12 µl de peróxido de hidrógeno al 30%. Los resultados de los ensayos se determinaron mediante lecturas de densidad óptica a 490 nm en un lector de placas ELISA. Cada clon se probó cuatro veces. Se seleccionaron diecinueve clones los cuales tenían menos del 40% de degradación de la C3 comparado con los controles no mutados. Estos 19 clones se seleccionaron 6 veces mediante el ensayo descrito anteriormente y de estos clones resultantes se seleccionaron con menos del 30% de actividad de degradación de la C3 como se comparó para los controles. Estos 6 clones se seleccionaron once veces cada uno y los dos clones con la actividad de degradación de la C3 más baja se seleccionaron para un estudio posterior. Se recibió una secuencia parcial de uno de los clones y se etiquetó un fragmento Smal de 546 bp con 32P mediante etiquetado del cebador aleatorio (equipo disponible de Stratagene, La Jolla, CA) . El fragmento Smal de 546 bp de la SEC. ID NO: 1 se hibridizó para EcoRI y los digestos de Kpnl de numerosas cepas de neumococos en los análisis de manchado Western. Este mismo fragmento se usó también para seleccionar una biblioteca de fragmentos Sau3A del ADN genómico a partir de la cepa CP1200 de S. pneumoniae. Un inserto de 3.5 kb se identificó a partir de la biblioteca CP1200. El inserto se secuenció y se identificó una estructura de lectura abierta de 492 pares base, que incluyen el codon de detención. La estructura de lectura abierta codificada para un polipéptido de 168 aminoácidos y un peso molecular predicho de aproximadamente 18,500 daltons . Los cebadores PCR se construyeron para amplificar la estructura de lectura abierta; el cebador de PCR 5' incorporó un sitio BamHI; el cebador 3' incorporó un sitio PstI. El inserto amplificado se ligó en una estructura a un vector de expresión pQE30 de E. coli etiquetado con His (Qiagen, San Diego, CA) . El plásmido resultante se utilizó para transformar la cepa BL21 de E. coli (Novagen, Madison, Wl) que contiene el plásmido pREP4 represor de lac (Qiagen) . Los cultivos de E. coli se indujeron para expresar al polipéptido Etiquetado con His y el polipéptido se purificó en columna con la resina Ni-NTA (Qiagen) . El polipéptido purificado se confirmó mediante gel de SDS-PAGE. Ejemplo 2 Identificación de un Polipéptido que Degrada la C3 de 20 kDa
Para determinar la capacidad de degradación de la C3 del polipéptido de 20 kDa, 0.5 mg/ml de C3 (preparada de acuerdo a Tack et al., Meth . Enzymol . 80:64-101, 1984) se copolimerizó en acrilamida al 15% que contiene un gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) (gel de SDS-PAGE) (gel de SDS-PAGE al 15%) . Los neumococos sobrenadantes se obtuvieron a partir de la cepa CP1200 de S. pneumoniae y se hicieron crecer a una fase exponencial en el caldo de Todd Hewitt; los lisados de neumococos se obtuvieron incubando 5 x 108 células con SDS al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. El lisado se concentró 10 veces utilizando un dispositivo de filtración Centricon con un corte de peso molecular de 10,000 (Amicon, Beverly, MA) . las muestras no se calentaron antes de la electroforesis. Las muestras de los sobrenadantes y lisados se agregaron a los geles de SDS-PAGE que contienen la C3 al 15% y se realizó la electroforesis a 4°C a 150 V hasta que el colorante se hizo correr. El gel se lavó sucesivamente con 50 ml de Tritón X-100 al 2.5% en agua (2 veces, 10 minutos), Tritón X-100 al 2.5% en Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 (2 veces, 10 minutos), y Tris-HCl 50 mm, pH 7.4 (2 veces, 10 minutos) para eliminar el SDS. Después de los lavados, se vertieron 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, en los platos que contenían los geles, y los platos se cubrieron y se incubaron a 37 °C durante 1.5 horas y durante toda la noche (aproximadamente 16 horas) . Los geles se tiñeron con azul de Coomassie durante 10 minutos y destiñeron totalmente. Se visualizaron dos bandas líticas, una de las cuales era de aproximadamente 20 kDa en tamaño, contra el fondo azul obscuro en ambos, los lisados y el sobrenadante. Se observaron las actividades degradantes de la C3 en los lisados después de 1.5 horas de incubación a 37 °C, mientras que las actividades de degradación de la C3 en el sobrenadante Pn se observaron después de una incubación durante toda la noche. Por lo tanto, las actividades de degradación de la C3 parecen estar asociadas a la célula principalmente . Ejemplo 3 El gen que codifica al polipéptido de 20 kD se conserva en un número de cepas de S . pneumoniae. El ADN se obtuvo a partir de una variedad de cepas de S . pneumoniae (Aislados clínicos del Tipo 1, Tipo 3, L002 y L003 (tipo 3), Tipo 4, Tipo 14 y Aislados de Laboratorio CP1200, WU2, R6X, 6303, 109, 110, JY1119, JY182, y JY53) y la SEC. ID NO: 3 se utilizó como una sonda para detectar la presencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido de 20 kD en el ADN de estas cepas. El ADN cromosómico aislado se digirió con EcoRI y se separó mediante electroforesis. El ADN se transfirió a un soporte sólido y se hibridizó a la SEC. ID NO: 3 con etiqueta final bajo hibridización y las condiciones de lavado de SSC 6X, Denhardt 5X, SDS al 0.5%, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, fragmentado, hibridizado a 65 °C y lavado en SSC 2X, una vez a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos y en SSC 2X, SDS al 0.1% 1 vez a 65 °C durante aproximadamente 15 minutos, seguido por dos lavados en SSC 0.2X, SDS al 0.1% durante 3 minutos cada uno a temperatura ambiente. Los resultados indican que la SEC. ID NO: 3 se hibridizó idénticamente en cada una de las muestras de ADN probadas indicando que el polipéptido parece conservarse entre las cepas. En algunas cepas, el ADN que codifica al polipéptido que degrada la C3 de 20 kDa parece ser parte de una estructura de lectura abierta más grande 2479 bp que codifica putativamente un polipéptido de 92 kDa.
Ejemplo 4 Manchado o Transferencia Southern de la sonda de ADN de S . pneumoniae Se obtuvieron muestras de 5 ug de ADN genómico a partir de 11 cepas de S. pneumoniae . Cada muestra se digirió con la enzima de restricción Kpnl. Las muestras se cargaron subsecuentemente en el gel de agarosa y se resolvieron mediante electroforesis. Las muestras contenidas en el gen se transfirieron subsecuentemente a una membrana Hybond-N+ disponible de Amersham (Upsalla, Suecia) mediante transferencia capilar. Un fragmento Smal de 540 bp de la estructura de lectura abierta se etiquetó al cebador aleatoriamente con P32 utilizando un equipo t7QuickPrime
(Pharmacia, Piscathaway, NJ) y se purificó a partir de nucleótidos no incorporados utilizando la columna NucTrap
(Stratagene, La Jolla, CA) y se hibridizó. Las condiciones de hibridización fueron SSC 6X, Denhardt 5X, SDS al 0.5%, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, hibridizado durante toda la noche a 65°C y lavado en SSC 2X, SDS al 0.1% una vez a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos seguido por una vez a, 65°C durante aproximadamente 15 minutos, seguido por al menos un lavado en SSC 0.2X, SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante al menos 3-5 minutos. El manchado demostró que el gen de 20 kDa estuvo presente en todas las cepas probadas de S. pneumoniae . Ejemplo 5 Se prepararon dos cebadores de ADN a partir de la
SEC. ID NO: 1 y se utilizaron para amplificar la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido de 20 kDa a partir del ADN genómico de S . pneumoniae (serotipo 3) . El primer cebador, un cebador 51, de la SEC. ID NO: 6, incluye un codon de inicio ATG del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos, se inserta un sitio Ncol, y tuvo un residuo Ala insertado después del codon de inicio ATG para mantener una estructura de lectura correcta. El segundo cebador, un cebador 3', SEC. ID NO: 7 incluye un codon de terminación en el extremo 31 de la secuencia de nucleótidos e inserta un sitio BamHI. 5'-GGGGG CCA TGG CC TCA AGC CTT TTA CGT GAA TGG-3; (SEC. ID NO: 6) 5'-GGGGG GGA TCC CTA GCT ATA TGA GAT AAA CTT TCC TGC T-3'; (SEC. ID NO: 7) Los dos cebadores se sintetizaron en un sintetizador de ADN Applied Biosystems 380A (Foster City, CA) utilizando reactivos comprados de Glen Research (Sterling, VA) . Las amplificaciones se realizaron utilizando un Formador de Ciclos Térmicos Perkin Elmer (ABl) de acuerdo a las direcciones del fabricante. El producto PCR identificado estuvo ligado en el vector de clonación PCR con una cola de TA PCR2.1, disponible de Invitrogen, Carlsbad, CA, y utilizó para transformar las células competentes OneShot ToplOF' (Invitrogen) . Los transformantes resistentes de kanamicina se seleccionaron por el análisis de enzima de restricción del ADN del plásmido mediante la lisis alcalina. Un fragmento del inserto de aproximadamente 500 bp se identificó y subsecuentemente se escindió con las enzimas de restricción Ncol y BamHl . El fragmento de 500 bp se purificó a partir de un gel de agarosa de bajo punto de fusión, y subsecuentemente se ligó en los sitios Ncol-BamHl del vector pET 28a de expresión promovido con T7, disponible de Novagen (Madison, Wl) . La mezcla de ligación se transformó subsecuentemente en las células de ToplOF' (Invitrogen), y los transformantes resistentes a la kanamicina se seleccionaron mediante el análisis de la enzima de restricción del ADN del plásmido preparado mediante lisis alcalina. Se transformó subsecuentemente un plásmido recombinante (pLP505) en las células BL21 (Novagen) y se hicieron crecer en un medio SOB suplementado con 30 µg/ml de kanamicina. Se hicieron crecer las células a un O.D.6oo de 0.6, y se indujeron subsecuentemente con IPTG 0.4 mM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) durante 2-4 horas. Los lisados celulares completos se prepararon y se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE al 14%. El gel se manchó con Coomassie y se detectó el producto de expresión. El gel teñido con Coomassie reveló una banda entre los marcadores de peso molecular de 28 kDa y 18 kDa, y se determinó que era de aproximadamente 20 kDa. La secuencia de ADN del inserto en el plásmido pLP505 recombinante se obtuvo utilizando el secuenciador de ADN ABl 370A. La secuencia de ADN se alineó con la secuencia de ADN de la SEC. ID NO: 1, utilizando la característica de gráfica de matriz de ADN Pustell de MacVector (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) . La alineación de la secuencia de ADN obtenida del plásmido pLP505, SEC. ID NO: 1, y el genoma de S . pneumoniae (serotipo 4), reveló que la estructura de lectura abierta (ORF) que codifica para el polipéptido de 20 kDa podía ser parte de un ORF más grande, es decir, uno de 2478 bp en el genoma del serotipo 4, que codifica para un polipéptido con un peso molecular predicho de aproximadamente 92 kDa (SEC. ID NO: 4). La SEC. ID NO: 4 del ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos predicha como se muestra en la SEC. ID NO: 5. Se obtuvo la secuencia del genoma de S. pneumoniae (serotipo 4) del Instituto de Investigación Genómica en www.tigr.org y/o a través de NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov, utilizando la característica clustalW de MacVector (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) . Se hizo una comparación de secuencias entre la secuencia de aminoácidos de 20 kDa (SEC. ID NO: 2) y la secuencia de aminoácidos de 92 kDa predicha (SEC. ID NO: 5) . En base a la secuencia de ADN genómico disponible (serotipo 4), se diseñaron dos cebadores flanqueantes de la ORF de 2478 bp y se sintetizaron subsecuentemente utilizando el sintetizador de ADN ABl 380A (SEC. ID NOS: 8 y 9) . La SEC. ID NO: 8 fue un cebador 5' de S. pneumoniae que tiene un sitio Ncol insertado y un residuo "Glu" agregado después del codon de inicio ATG para mantener una estructura de lectura correcta. La SEC. ID NO: 9, fue un cebador 3' de S . pneumoniae que tenía un sitio HindIII insertado. 5' -CCC GGG CCA TGG CTA AAA TTA ATA AAA AAT ATC TAG-3'; (SEC. ID NO: 8) 5'- CCG GGC AAG CTT TTA CTT ACT CTC CT-3'; (SEC. ID NO: 9) Se amplificó entonces un fragmento de ADN de aproximadamente 2400 bp a partir de 4 diferentes serotipos de S. pneumoniae (serotipo 3, 5, 6B y 7) dando como resultado 4 fragmentos. Cada uno de los 4 fragmentos se ligó subsecuentemente en el vector de clonación de PCR PCR2.1
(Invitrogen) y se utilizaron para transformar las células
OneShot ToplOF' (Invitrogen) . Se seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina mediante el análisis de restricción del ADN del plásmido preparado mediante lisis alcalina. Un plásmido recombinante que contenía el producto de PCR del serotipo 7 se identificó, por ejemplo, pLP512. La secuencia de ADN se obtuvo a partir del clon del serotipo 7 utilizando el secuenciador de ADN
ABl modelo 370A. La secuencia de ADN fue esencialmente idéntica a la SEC. ID NO: 4 y codificó una secuencia de aminoácidos predicha esencialmente idéntica a la SEC. ID
NO: 5. Ejemplo 6 Detección del Manchado Western del Polipéptido de 92 kDa en los Neumococos Completos El polipéptido que degrada la C3 de~ aproximadamente 20 kDa, recombinante, se purificó a partir de la cepa BLR de Escherichia coli que contiene el plásmido pDF122. El plásmido pDF122 contiene el polinucleótido mostrado en la SEC. ID NO: 1 expresado bajo el control del sistema del promotor del fago T7. Las células bacterianas se hicieron crecer a una fase semi-logarítmica en el medio de Hy-Soy/Extracto de soya que contenía ampicilina para seleccionar el plásmido. La expresión del polipéptido recombinante se indujo agregando IPTG a una concentración de 1 mM y se continuo la incubación durante 3 horas adicionales. Las células bacterianas se cosecharon mediante centrifugación y se resuspendieron en solución salina amortiguada con Tris, pH 7.2 Las células se usaron mecánicamente una Celda de presión francesa y el material insoluble que incluye cuerpos de inclusión se convirtió a pelotillas en una centrífuga. Las pelotillas o pellets se solubilizaron en una Urea 3 M amortiguada con NaP04 100 mM, pH 8.0 que contenía Tritón X-100 al 0.1%. Después de formar las pelotillas y descargar el material insoluble (centrifugado a aprox. 100,000 x g) , el polipéptido soluble r de 20 kDa se intercambió en el Zwittergent 3-12 al 0.1% (Calbiochem-Behrng) reemplazando la Urea y luego en NaP04 100 mM pH 8.0 reemplazando el detergente. El análisis de SDS-PAGE confirmó que el material de aprox. 20 kDa permanecía soluble. El polipéptido recombinante etiquetado con His se dializó en amortiguador de NaP04 50 mM, pH 8.0 y se absorbió en una columna Ni equilibrada con el mismo amortiguador. La columna se lavó secuencialmente con NaP04 50 mM a pH 7.0, 6.6 y 5.5 hasta que se alcanzaron las absorbancias de la línea base (OD2so) con cada amortiguador. El polipéptido de aprox. r 20 kDa enlazado se eluyó con NaP04 50 mM, pH 4.5. El polipéptido eluido fue aproximadamente 90% homogéneo en el análisis SDS-PAGE. Este polipéptido se utilizó para inmunizar los ratones Swiss-Webster. Una dosis de cinco µg del polipéptido se mezclaron con 50 µg del Lípido A de monofosforilo (Ribi Immunochemicals) y se inyectaron intramuscularmente a los ratones. Los animales se inmunizaron en las semanas 0, 4 y 6 y se extrajo la sangre a la semana 8. El suero se conjuntó y se encontró que contenía antisuero altamente titulado contra el inmunógeno. Las cepas de neumococos CP1200, T3, y T7 se hicieron crecer en un caldo Todd-Hewitt que contiene Extracto de levadura y las células se sometieron a centrifugación para obtener pelotillas. Las células de neumococos se lisaron en un amortiguador mejorado con SDS-PAGE bajo condiciones reductoras mediante ebullición durante 5 minutos. Los lisados se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 10% y se sometieron a electroforesis. Los polipéptidos separados se electromancharon en Nitrocelulosa y el filtro se bloqueó con BLOTTO al 5% en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4. El antisuero policlonal se diluyó 1:2000 en BLOTTO y se utilizó para someter a examen por sonda los polipéptidos separados. Los anticuerpo enlazados se detectaron con el IgG de anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. El manchado Western se muestra en la Figura 8 y se describe además en la breve descripción de las figuras. Ejemplo 7 Evidencia de que los Polipéptidos de 20 kDa y 92 kDa Degradan a la C3 El gel mostrado en la Figura 9 es un manchado Western. Los datos se obtuvieron incubando un polipéptido de 20 kDa y un polipéptido de 92 kDa con C3 tratado con metilamina y biotinilada como se muestra en la tabla a continuación. Estos polipéptidos se expresaron a partir de un vector T7 C3 TRATADA CON METILAMINA: Se incubaron 500 µl de C3 humana purificada a una concentración de 4.46 mg/ml
(preparada de acuerdo al método de Tack et al., Meth.
Enzymol. 80:64-101, 1984) con 5.5 µl de metilamina 1 M
(CH3NH2) en TRIS 0.1 M/EDTA 0.01 M, pH 8.0 durante 80 minutos a 37 °C, luego se dializaron durante toda la noche en TRIS 0.1 M/EDTA 0.01 M, pH 8.0, a 4°C. Al día siguiente, la C3 se incubó de nuevo con 60 µl de metilamina 1 M en TRIS 0.1 M/EDTA 0.01 M durante 80 minutos a 37 °C, luego se dializó durante toda la noche en NaHC03 50 mM a 4°C. BIOTINILACION DE LA C3 TRATADA CON METILAMINA: 2 mg de la C3 tratada con metilamina, preparada como se describió arriba, se incubó con 75 µl de NSC-biotina (Pierce) hecha como biotina de NSC 1 mg en 1 ml H20 durante 30 minutos a temperatura ambiente. La C3 biotinilada se dializó durante toda la noche en NaHC03 50 mM, pH 8.0 a 4°C.
Las muestras de los Tubos A y C se eliminaron después de 66 horas de incubación, reducidas mediante ebullición durante 2 minutos en amortiguador de reducción con mercaptoetanol ß, se sometió en electroforesis en SDS-PAGE al 7.5%, y se transfirieron a papal de celulosa para manchado Western. El manchado Western se llevo a cabo durante una hora de acuerdo con los procedimientos estándar (Tobin et al. PNAS USA 76:4350-4354, 1979). Las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano-avidina (dilución 1:10,000) y se reveló con el Sistema de Substrato Supersignal CL-HRP (Amersham) para detectar los fragmentos de C3 biotinilados. En la Figura 9 carril 1, la C3 está sola (control) , los carriles 2 y 3 hay polipéptidos de 20 y 92 kDa, y en los carriles 4 y 5 está la C3 sola de nuevo (controles) . Junto con el margen derecho se muestra la posición de la cadena a de C3, la cadena ß de C3, y el fragmento C3 presente en las muestras de control. La posición de un fragmento C3 en el digerido de 20 kDa y varios fragmentos en el digerido de 92 kDa son identificados. El segundo experimento utilizó los reactivos del primero (polipéptido expresados, C3 biotinilado, y amortiguador) en la misma proporción que se muestra en la tabla anterior. Las muestras de control C3 se removieron a los tiempos 0, 2 horas, 8 horas, y 24 horas. Sin embargo, en lugar de hacer un manchado Western, las muestras se redujeron en SDS-PAGE al 7.5%, razonando que algunos fragmentos de degradación adicionales podrían no ser biotinilados y por lo tanto se mostrarían en un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie. En efecto, esto fue lo que se observó.
Solamente se analizaron los polipéptidos 20 (carril A8) y 92
(carril C8) kDa en este gel. El gel de la figura 10 muestra a lo largo del margen derecho la posición de la cadena a de
C3 y la cadena ß de C3, y el polipéptido de 92 kDa en el carril C8. En el carril C8 están al menos dos fragmentos en el rango de tamaño desde ~ 90 kDa hasta 75 kDa. Hay también varios fragmentos por debajo de la cadena ß a 75 kDa. En el carril A8 está un fragmento de degradación más grande justo debajo de la cadena ß de C3. Así, tanto el polipéptido de 92 kDa en el carril C8 y el polipéptido de 20 kDa en el carril
A8 degradan la C3. Ejemplo 8 Preparación de la proteína de 92 kDa recombinante y la generación de antisuero policlonal El inserto en el plásmido pLP512 (ver Ejemplo 5) se escindió con Ncol y HindIII. Un fragmento del tamaño esperado se purificó a partir de agarosa de bajo punto de fusión, y se ligó subsecuentemente en los sitios Ncol- HindlII del vector pET28a de expresión promovido con T7 (Novagen, Madison, Wl) . La mezcla de ligación se transformó subsecuentemente en las células ToplOF1 (Invitrogen) y se seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina como se describió previamente en el Ejemplo 5. Un plásmido recombinante
(pLP515) se transformó subsecuentemente en las células BL21
(Novagen) y se hizo crecer en un medio SOB suplementado con 30 µg/ml de kanamicina. Las células se hicieron crecer a una
O.D. eoo de 0.6, y se indujeron subsecuentemente con IPTG 0.4 mM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) durante 2-4 horas. Los lisados celulares completos se prepararon y se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE al 10%. El teñido con Coomassie del gel reveló una nueva banda de aproximadamente 80 kDa cuando se comparó con la muestra de pre-inducción. La proteína recombinante codificada por el ORF de aprox. 92 kDa se purificó a partir de la cepa BL21 de E. coli (Novagen) que contiene el plásmido pLP515. Las células bacterianas se hicieron crecer hasta una fase semi-logarítmica en un medio SOB que contenía 50 µg/ml de kanamicina para seleccionar el plásmido. La expresión del polipéptido recombinante se indujo mediante adición de IPTG a 0.4 mM y se continuó con la incubación durante 3 horas. Las células bacterianas se cosecharon mediante centrifugación y se resuspendieron en Solución Salina Amortiguada con Tris, pH 7.2. Las células se usaron mecánicamente en una Celda de Presión Francesa y el material insoluble que incluye los cuerpos de inclusión se convirtieron a pelotillas en una centrífuga a 7700 x g a 4 grados durante 10 minutos. Las pelotillas que contenían los cuerpos de inclusión se resolubilizaron y la proteína soluble se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico. La proteína recombinante se utilizó para generar los anticuerpos policlonales en ratones. De manera breve, se agregó adyuvante a 5 µg de la proteína para cada dosis con 20 µg de QS21 y se inyectó subsecuentemente en los cuellos de ratones Swiss Webster de 6-8 semanas. Los ratones se hicieron sangrar y se vacunaron a la semana 0, se vacunaron a la semana 4 luego se hicieron sangrar y se extrajo la sangre en la semana 6. Se vacunaron 10 ratones con la proteína de 92 kDa recombinante que contenía el adyuvante con QS21. El suero recombinante se utilizó en una dilución 1:1000 para examinar los lisados celulares completos y los sobrenadantes del cultivo concentrado de varios serotipos de S. pneumoniae en un Manchado Western. El suero se hizo reaccionar específicamente para una proteína en los lisados celulares completos y se concentraron los sobrenadantes del cultivo cuyo peso molecular fue de aproximadamente 90 kDa.
Ejemplo 9 El diagrama de la Figura 11 resume los resultados de una prueba de inmunidad intranasal (IN) de los ratones
CBA/CAHN xid/J vacunados con la proteína de r 92 kDa, preparados como se describe en el Ejemplo 8 (SEC. ID NO: 5) con un adyuvante con lípido A de monofosforilo (MPL) . 10 ratones por grupo se vacunaron subsecuentemente en la región de cuello a las semanas 0, 3 y 5, con ya sea 5 µg de la mezcla adyuvante con 92 kDa cada uno con 50 µg de MPL, 1 µg de cada cápsula Tipo 3 conjugada para el portador CRM197 de proteína con el coadyuvante con 100 µg de fosfato de aluminio, o solución salina amortiguada con fosfato sola (PBS), en un volumen de muestra de 10 µl. El CRM 197 es una versión destoxificada genéticamente de toxina de difteria. Cada ratón se sometió a la prueba de inmunidad en la semana 7 con 1 x 106 cfu de S . pneumoniae del Tipo 3 en un volumen de muestra de 10 µl. El tejido nasal se aisló 3 días después de la prueba de inmunidad y el número de unidades por gramo formadoras de colonias de S . pneumoniae tipo 3 del tejido nasal se determinó mediante la colocación de placas en un medio selectivo. El tipo 3 es la cápsula aislada del serotipo 3 de S . pneumoniae, y luego conjugado a un portador CRM 1977 del portador de proteína, a través de la animación reductiva (ver Patente Norteamericana No. 5,360,897 para la preparación del control Tipo 3; ver Patente Norteamericana No. 5,614,382 para la versión destoxificada genéticamente de toxina de difteria; ver Patente Norteamericana No. 4,902,506 con respecto al uso de CRM 197 como un portador) . La gráfica en la Figura 11 muestra que en este modelo, tanto los controles negativos, los ratones a los que se les agregó como adyuvante con MPL y a los ratones que no han sido expuestos previamente a las 6 semanas de edad, tiene cociente de supervivencia de aproximadamente el 30% cuando se aplicó la prueba de inmunidad intranasalmente, mientras que el control positivo, el conjugado Tipo' 3 que tenía como adyuvante fosfato de aluminio, ofreció protección del 100% contra la muerte al final del estudio, aproximadamente 14 días. Cuando los ratones se inmunizaron con r92 kDa se sometieron a prueba de inmunidad, 100% sobrevivieron al final del estudio, indicando que la proteína de r92 kDa ofrece protección contra la muerte de la prueba de inmunidad intranasal por el S. pneumoniae Tipo 3.
Ejemplo 10 MÉTODOS El polipéptido recombinante de 92 kDa (r92 kDa) (SEC. ID NO: 5) se incubó con C3 humana purificada durante 2 horas, 6 horas, y 26 horas a 37°C en las siguientes proporciones . Tubo A (Control) : C3 - 3 µl [7.2 x 10-12 moles] PBS/albúmina de suero de bovino al 0.01% (BSA) - 100 µl; Tubo B: r92 kDa - 50 µl [5.6 x 10-10 moles] C3 - 3 µl [7.2 x 10-12 moles] PBS/BSA al 0.01% - 50 µl. En cada punto del tiempo (2, 6, y 26 horas) , se removieron las muestras de 20 µl de los Tubos A y B reduciendo el amortiguador que se agregó, y las muestras se sometieron a ebullición a 100 °C durante 2 minutos. Después de la ebullición, las muestras se sometieron a electroforesis sobre SDS-PAGE al 7.5% bajo condiciones de reducción. El gel de SDS-PAGE se tiñó con azul de Coomassie. El gel resultante se muestra en la Figura 12. Carril 1 -estándares de peso molecular (lecturas de la parte superior del gel: 200 kDa, 116 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa); Carriles 2 y 4 - 2 horas de incubación; Carril 2 - control C3 (Tubo A) ; Carril 4 - muestra de r92 kDa (Tubo B) ; Carriles 5 y 7 -6 horas de incubación; Carril 5 - control C3 (Tubo A) ;
Carril 7 - muestra de r92 kDa (Tubo B) ; Carril 8 y 10 - 26 horas de incubación; Carril 8 - control C3 (Tubo A) ; Carril 10 - muestra de r92 kDa (Tubo B) . INTERCEPTACIÓN DEL GEL La cadena a de C3 corre a aproximadamente 115 kDa. La cadena ß de C3 corre a aproximadamente 75 kDa. Estas se marcaron sobre el gel. La banda en aproximadamente 66 kDa es albúmina. Los carriles 2 y 4 son las 2 horas de incubación. Comparado con el Carril 2 (control C3), el Carril 4 muestra escisión de la cadena a de C3 - nuevo fragmento a aprox. 97 kDa. Los Carriles 5 y 7 son a las 6 horas de incubación. Existe el mismo nuevo fragmento de escisión de 97 kDa en el Carril 7. Los Carriles 8 y 10 son la incubación de 26 horas. Comparado con el Carril 8 (control C3) , el Carril 10 muestra escisión continua de la cadena a. Se apreciará por aquellos hábiles en la técnica que mientras la invención ha sido descrita arriba en relación con las modalidades particulares y los ejemplos, la invención no necesariamente está limitada y que numerosas otras modalidades, ejemplos, usos, modificaciones e iniciativas de las modalidades, ejemplos y usos se pueden hacer sin apartarse del alcance inventivo de esta solicitud.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
LI STADO DE SECUENCIAS
<110> HOSTETTER, Margaret K . FINKEL, David J . CHENG, Qi MAS I , Amy W . REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA AMERICAN CYNAMID COMPANY <120> PO I PEPTIDO QUE DEGRADA LA PROTEÍNA C3 COMPLEMENTARIA HUMANA A PARTIR DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE <130> 11000570230 < 140> o Asignado <141> 1999-09-24 <150> 60/101 , 736 <151> 1998-09-24 <150> 09/283, 094 <151 > 1999-03-31 <160> 10 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 504 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 atgtcaagcc ttttacgtga attgtatgct aaacccttat cagaacgcca tgtagaatct 60 gatggcctta ttttcgaccc agcgcaaatc acaagtcgaa ccgccaatgg tgttgctgta 120 ccgcacggag accattatca ctttattcct tattcacaac tgtcaccttt ggaagaaaaa 180 ttggctcgta ttattcccct tcgttatcgt tcaaaccatt gggtaccaga ttcaagacca 240 gaacaaccaa gtccacaatc gactccggaa cctagtccaa gtccgcaacc tgcaccaaat 300 cctcaaccag ctccaagcaa tccaattgat gagaaattgg tcaaagaagc tgttcgaaaa 360 gtaggcgatg gttatgtctt tgaggagaat ggagttcctc gttatatccc agccaaggat 420 ctttcagcag aaacagcagc aggcattgat agcaaactgg ccaagcagga aagtttatct 480 cataagctgc agttagatcc atta 504
<210> 2 <211> 168 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 2 Met Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu Arg 1 5 10 15 His Val Glu Ser Asp Gly Leu lie Phe Asp Pro Ala Gln He Thr Ser 20 25 30 Arg Thr Ala Asn Gly Val Ala Val Pro His Gly Asp His Tyr His Phe 35 40 45 He Pro Tyr Ser Gln Leu Ser Pro Leu Glu Glu Lys Leu Ala Arg He 50 55 60 He Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro 65 70 75 80
Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gln 85 90 95 Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro He Asp Glu Lys 100 105 110 Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu 115 120 125 Glu Asn Gly Val Pro Arg Tyr He Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu 130 135 140 Thr Ala Ala Gly He Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu Ser 145 150 155 160
His Lys Leu Gln Leu Asp Pro Leu 165
<210> 3 <211> 504 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3 taatggatct aactgcagct tatgagataa actttcctgc ttggccagtt tgctatcaat 60 gcctgctgct gtttctgctg aaagatcctt ggctgggata taacgaggaa ctccattctc 120 ctcaaagaca taaccatcgc ctacttttcg aacagcttct ttgaccaatt tctcatcaat 180 tggattgctt ggagctggtt gaggatttgg tgcaggttgc ggacttggac taggttccgg 240 agtcgattgt ggacttggtt gttctggtct tgaatctggt acccaatggt ttgaacgata 300 acgaagggga ataatacgag ccaatttttc ttccaaaggt gacagttgtg aataaggaat 360 aaagtgataa tggtctccgt gcggtacagc aacaccattg gcggttcgac ttgtgatttg 420 cgctgggtcg aaaataaggc catcagattc tacatggcgt tctgataagg gtttagcata 480 caattcacgt aaaaggcttg acat 504
<210> 4 <211> 2478 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4 atgaaaatta ataaaaaata tctagcaggt tcagtggcag tccttgccct aagtgtttgt 60 tcctatgaac ttggtcgtca ccaagctggt caggttaaga aagagtctaa tcgagtttct 120 tatatagatg gtgatcaggc tggtcaaaag gcagaaaact tgacaccaga tgaagtcagt 180 aagagggagg ggatcaacgc cgaacaaatc gtcatcaaga ttacggatca aggttatgtg 240 acctctcatg gagaccatta tcattactat aatggcaagg tcccttatga tgccatcatc 300 agtgaagagc tcctcatgaa agatccgaat tatcagttga aggattcaga cattgtcaat 360 gaaatcaagg gtggttatgt tatcaaggta gatggaaaat actatgttta ccttaaggat 420 gcagctcatg cggataatat tcggacaaaa gaagagatta aacgtcagaa gcaggaacac 480 agtcataatc acgggggtgg ttctaacgat caagcagtag ttgcagccag agcccaagga 540 cgctatacaa cggatgatgg ttatatcttc aatgcatctg atatcattga ggacacgggt 600 gatgcttata tcgttcctca cggcgaccat taccattaca ttcctaagaa tgagttatca 660 gctagcgagt tagctgctgc agaagcctat tggaatggga agcagggatc tcgtccttct 720 tcaagttcta gttataatgc aaatccagct caaccaagat* tgtcagagaa ccacaatctg 780 actgtcactc caacttatca tcaaaatcaa ggggaaaaca tttcaagcct tttacgtgaa 840 ttgtatgcta aacccttatc agaacgccat gtggaatctg atggccttat tttcgaccca 900 gcgcaaatca caagtcgaac cgccagaggt gtagctgtcc ctcatggtaa ccattaccac 960 tttatccctt atgaacaaat gtctgaattg gaaaaacgaa ttgctcgtat tattcccctt 1020 cgttatcgtt caaaccattg ggtaccagat tcaagaccag p.caaccaag tccacaatcg 1080 actccggaac ctagtccaag tccgcaacr gcaccaaaí ctcaaccagc tccaagcaat 1140 ccaattgatg agaaattggt caaagaagct gttcgaaaag taggcgatgg ttatgtcttt 1200 gaggagaatg gagtttctcg ttatatccca gccaaggatc tttcagcaga aacagcagca 1260 ggcattgata gcaaactggc caagcaggaa agtttatctc ataagctagg agctaagaaa 1320 actgacctcc catctagtga tcgagaattt tacaataagg cttatgactt actagcaaga 1380 attcaccaag atttacttga taataaaggt cgacaagttg attttgaggc tttggataac 1440 ctgttggaac gactcaagga tgtcccaagt gataaagtca agttagtgga tgatattctt 1500 gccttcttag ctccgattcg tcatccagaa cgtttaggaa aaccaaatgc gcaaattacc 1560 tacactgatg atgagattca agtagccaag ttggcaggca agtacacaac agaagacggt 1620 tatatctttg atcctcgtga tataaccagt gatgaggggg atgcctatgt aactccacat 1680 atgacccata gccactggat taaaaaagat agtttgtctg aagctgagag agcggcagcc 1740 caggcttatg ctaaagagaa aggtttgacc cctccttcga cagaccatca ggattcagga 1800 aatactgagg caaaaggagc agaagctatc tacaaccgcg tgaaagcagc taagaagstg 1860 ccacttgatc gtatgcctta caatcttcaa tatactgtag aagtcaaaaa cggtagttta 1920 atcatacctc attatgacca ttaccataac atcaaatttg agtggtttga cgaaggcctt 1980 tatgaggcac ctaaggggta tactcttgag gatcttttgg cgactgtcaa gtactatgtc 2040 gaacatccaa acgaacgtcc gcattcagat aatggttttg gtaacgctag cgaccatgtt 2100 caaagaaaca aaaatggtca agctgatacc aatcaaacgg aaaaaccaag cgaggagaaa 2160 cctcagacag aaaaacctga ggaagaaacc cctcgagaag agaaaccgca aagcgagaaa 2220 ccagagtctc caaaaccaac agaggaacca gaagaatcac cagaggaatc agaagaacct 2280 caggtcgaga ctgaaaaggt tgaagaaaaa ctgagagagg ctgaagattt acttggaaaa 2340 atccaggatc caattatcaa gtccaatgcc aaagagactc tcacaggatt aaaaaataat 2400 ttactatttg gcacccagga caacaatact attatggcag aagctgaaaa actattggct 2460 ttattaaagg agagtaag 2478
<210> 5 <211> B26 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 5 Met Lys He Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Gly Ser Val Ala Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Ser Val Cys -Ser Tyr Glu Leu Gly Arg His Gln Ala Gly Gln Val 20 25 30 Lys Lys Glu Ser Asn Arg Val Ser Tyr He Asp Gly Asp Gln Ala Gly 35 40 45 Gln Lys Ala Glu Asn Leu Thr Pro Asp Glu Val Ser Lys Arg Glu Gly 50 55 60 He Asn Ala Glu Gln He Val He Lys He Thr Asp Gln Gly Tyr Val 65 70 75 80
Thr Ser His Gly Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro Tyr 85 90 95 Asp Ala He He Ser Glu Glu Leu Leu Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gln 100 105 110 Leu Lys Asp Ser Asp He Val Asn Glu He Lys Gly Gly Tyr Val He 115 120 125 Lys Val Asp Gly Lys Tyr Tyr Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ala His Ala 130 135 140 Asp Asn He Arg Thr Lys Glu Glu He Lys Arg Gln Lys Gln Glu His 145 150 155 160
Ser His Asn His Gly Gly Gly Ser Asn Asp üin Ala Val Val Ala Ala " 165 170 175 Arg Ala Gln Gly Arg Tyr Thr Thr Asp Asp Gly Tyr He Phe Asn Ala 180 185 190 Ser Asp He He Glu Asp Thr Gly Asp Ala Tyr He Val Pro His Gly 195 200 205 Asp His Tyr His Tyr He Pro Lys Asn Glu Leu Ser Ala Ser Glu Leu 210 215 220 Ala Ala Ala Glu Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Ser Arg Pro Ser 225 230 235 240 Ser Ser Ser Ser Tyr Asn Ala Asn Pro Ala Gln Pro Arg Leu Ser Glu 245 250 255 Asn His Asn Leu Thr Val Thr Pro Thr Tyr His Gln Asn Gln Gly Glu 260 265 270 Asn He Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu 275 280 285 Arg His Val Glu Ser Asp Gly Leu He Phe Asp Pro Ala Gln He Thr 290 295 300 Ser Arg Thr Ala Arg Gly Val Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His 305 310 315 320 Phe He Pro Tyr Glu Gln Met Ser Glu Leu Glu Lys Arg He Ala Arg 325 330 335 He He Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg 340 345 350 Pro Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro 355 360 365 Gln Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro He Asp Glu 370 375 380 Lys Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe 385 390 395 400 Glu Glu Asn Gly Val Ser Arg Tyr He Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala 405 410 415 Glu Thr Ala Ala Gly He Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu 420 425 430 Ser His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Tnr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg 435 440 445 Glu Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg He His Gln Asp 450 455 460 Leu Leu Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val Asp Phe Glu Ala Leu Asp Asn 465 470 475 480 Leu Leu Glu Arg Leu Lys Asp Val Pro Ser Asp Lys Val Lys Leu Val 485 490 495 Asp Asp He Arg Leu
ritttfMMiÉMnaf Gly Lys Pro Asn Ala Gln He Thr Tyr Thr Asp Asp Glu He Gln Val 515 520 525 Ala Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr He Phe Asp 530 535 540 Pro Arg Asp He Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr Val Thr Pro His 545 550 555 560
Met Thr His Ser His Trp He Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu 565 570 575
Arg Ala Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro 580 585 590
Ser Thr Asp His Gln Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu 595 600 605 Ala He Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg 610 615 620 Met Pro Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu 625 630 635 640
He He Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn He Lys Phe Glu Trp Phe 645 650 655
Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Thr Leu Glu Asp Leu 660 665 670 Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His 675 680 685 Ser Asp Asn Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp His Val Gln Arg Asn Lys 690 695 700 Asn Gly Gln Ala Asp Thr Asn Gln Thr Glu Lys Pro Ser Glu Glu Lys 705 710 715 720
Pro Gln Thr Glu Lys Pro Glu Glu Glu Thr Pro Arg Glu Glu Lys Pro 725 730 735
Gln Ser Glu Lys Pro Glu Ser Pro Lys Pro Thr Glu Glu Pro Glu Glu 740 745 750 Ser Pro Glu Glu Ser Glu Glu Pro Gln Val Glu Thr Glu Lys Val Glu 755 760 765 Glu Lys Leu Arg Glu Ala Glu Asp Leu Leu Gly Lys He Gln Asp Pro 770 775 780 He He Lys Ser Asn Ala Lys Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Asn Asn 785 790 795 800
Leu Leu Phe Gly Thr Gln Asp Asn Asn Thr He Met Ala Glu Ala Glu 805 810 815
Lys Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Lys 820 825
<210> 6 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
<220> <223> Incorpora un sitio Ncol y un codon de ADN para ala .
<400> 6 gggggccatg gcctcaagcc ttttacgtga attg 34
<210> 7 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
<220> <223> incorpora un sitio BamHl. <400> 7 gggggggatc cctagctata tgagataaac tttcctgct 39
<210> 8 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
<220> <223> Incorpora un sitio Ncol y un codon de ADN para Glu .
<400> 8 cccgggccat ggctaaaatt aataaaaaat atctag 36
<210> 9 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
<220> <223> Incorpora un sitio HindD III . <400> 9 ccgggcaagc ttttacttac tctcct 26
<210> 10 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda <220> <223> Oligonucleotido <400> 10. gaaaacaata atgtagaaga ctactttaaa gaaggttaga Q
Claims (35)
- 68
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. - Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos; caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido aislado, se hibridiza bajo condiciones de hibridización altamente severas en al menos una porción de ya sea (a) los nucleótidos en la SEC. ID NO: 1 ó una hebra complementaria de los mismos, o (b) los nucleótidos en la SEC. ID NO: 4 ó una hebra complementaria de los mismos. 2.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se aisla de S. pneumoniae.
- 3.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un polipéptido recombinante .
- 4.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un peso molecular de manera aproximada de 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa.
- 5.- El polipéptido de -conformidad con la 69 reivindicación 1, caracterizado porque tiene un peso molecular de manera aproximada de 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa.
- 6.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque degrada la proteína C3 complementaria humana.
- 7.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos 15 aminoácidos secuenciales.
- 8. - Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende al menos 15 aminoácidos secuenciales de la SEC. ID NO: 2 ó la SEC. ID NO: 5.
- 9.- Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende la SEC. ID NO: 2 ó la SEC. ID NO: 5.
- 10.- Una composición estimulante del sistema inmune, caracterizado porque comprende una cantidad efectiva del polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 y un portador terapéuticamente aceptable.
- 11.- La composición estimulante del sistema inmune de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido se aisla del S . pneumoniae .
- 12.- La composición estimulante del sistema inmune de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque 70 comprende además al menos otro polipéptido estimulante del sistema inmune aislado a partir del S . pneumoniae .
- 13.- La composición estimulante del sistema inmune de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido es efectivo para inmunizar o tratar un sujeto mamífero contra la infección o colonización por S. pneumoniae .
- 14.- La composición estimulante del sistema inmune de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido se proporciona en una cantidad efectiva para proporcionar un efecto terapéutico al sujeto mamífero.
- 15.- Un anticuerpo capaz de enlazarse al polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
- 16.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.
- 17.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se obtiene de un ratón, una rata, una cabra, un pollo, un humano, o un conejo.
- 18.- Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque se hibridiza bajo condiciones de hibridización altamente severas a al menos una porción de ya sea (a) los nucleótidos en la SEC. ID NO: 1 ó una hebra 71 complementaria de los mismos, o (b) los nucleótidos en la SEC. ID NO: 4 ó una hebra complementaria de los mismos.
- 19.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque se aisla de S . pneumoniae.
- 20.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque codifica un polipéptido que degrada la C3 complementaria humana.
- 21.- Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18.
- 22.- Una célula, caracterizada porque comprende el anticuerpo de la reivindicación 18.
- 23.- La célula de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque es una bacteria o una célula eucariótica.
- 24.- Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID NO: 1 ó su hebra complementaria o la SEC. ID NO: 4 ó su hebra complementaria.
- 25.- Una molécula de ARN transcrita mediante una secuencia de ADN de doble hebra, caracterizada porque comprende la SEC. ID NO: 1 ó la SEC. ID NO: 4.
- 26.- Un método para producir una respuesta inmune al 72 S . pneumoniae en un mamífero, el método está caracterizado porque comprende administrar a un mamífero una composición que comprende : (a) una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de la reivindicación 1; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.
- 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la respuesta inmune es una respuesta de las células B, una respuesta de las células T, una respuesta de las células epiteliales, o una respuesta de las células endoteliales.
- 28.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polipéptido es de al menos 15 aminoácidos de longitud.
- 29.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la composición además comprende al menos otro polipéptido estimulante del sistema inmune de S. pneumoniae.
- 30.- Un método para inhibir la degradación de la C3 mediada por S . pneumoniae, el método caracterizado porque comprende poner en contacto una bacteria de S . pneumoniae con un anticuerpo capaz de enlazarse al polipéptido de la reivindicación 1. 73
- 31.- Un método para inhibir la inflamación y el rechazo mediado por C3 en el xenotransplante, el método está caracterizado porque comprende expresar sobre la superficie de un órgano de un animal utilizado en el xenotransplante el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
- 32.- Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID NO: 6, SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 8 y la SEC. ID NO: 9.
- 33.- Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con respecto a la SEC. ID NO: 2 ó la SEC. ID NO: 5.
- 34.- Un polipéptido aislado de aproximadamente 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa a partir de la S . pneumoniae que degrada la proteína C3 complementaria humana.
- 35.- Un polipéptido aislado de aproximadamente 75 kDa hasta aproximadamente 95 kDa a partir de la S . pneumoniae que degrada la proteína C3 complementaria humana.
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