JPH11137249A - 新規ｂｍｒＵ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｂｍｒＵポリペプチドおよびｂｍｒＵポリペ
プチドをコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み
換え法によるかかるポリペプチドの製造方法、ならびに
抗細菌化合物のスクリーニングのためのｂｍｒＵポリペ
プチドの使用方法を提供する。 【解決手段】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、および配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少な
くとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一つには、新たに
同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、なら
びにそれらの製造および使用、ならびにそれらの変種、
アゴニストおよびアンタゴニスト、そしてそれらの使用
に関する。詳細には、これらの点および他の点に関し
て、本発明は、多剤排出系コーディング遺伝子（multid
rug export system encoding genes）ファミリーの新規
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（以下、ｂｍｒＵ
という）に関する。

【０００２】

【従来の技術】スタフィロコッカス属（Staphylococc
i）の遺伝子および遺伝子産物を抗生物質の開発に用い
ることは特に好ましい。スタフィロコッカス属は医学的
に重要な微生物属を形成している。それらは２つのタイ
プの疾病、すなわち、侵入的および毒素生成的疾病を引
き起こすことが知られている。一般的には、侵入的感染
は皮膚表面および深部組織の両方に影響する膿瘍形成に
より特徴づけられる。エス・アウレウス（S. aureus）
は癌患者における菌血症の第２の主要原因である。骨髄
炎、敗血性関節炎、敗血性の血栓性静脈炎および急性細
菌性心内膜炎も比較的よく見られる。スタフィロコッカ
ス属の毒素生成的特性により生じる３つの臨床的症状が
ある。これらの疾病の明らかな徴候は、組織侵入および
菌血症に対立するものとしてのエンドトキシンの作用に
より生じる。これらの症状は、スタフィロコッカス食品
汚染、熱傷皮膚症候群およびトキシンショック症候群を
包含する。

【０００３】スタフィロコッカス・アウレウス（Staphy
lococcus aureus）感染の頻度は過去２０年間に劇的に
上昇している。これは多重抗生物質耐性株の出現、およ
び免疫系が低下した人の集団の増加に起因している。い
くつかのまたはすべての標準的な抗生物質に対して耐性
を有するスタフィロコッカス・アウレウス株を単離する
ことはもはやめずらしいことではない。この現象がこの
生物に対する新しい抗菌剤、ワクチンおよび診断試験に
ついての必要性を形成した。

【０００４】バチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s）の主要な多剤排出系はｂｍｒ遺伝子ファミリーによ
りコードされる蛋白を含んでおり、ｂｍｒＵはそのファ
ミリーのメンバーである（M. Ahmed, C. M. Borsch, S.
S. Taylor, N. Vazquez-Laslop & A. A. Neyfakh (199
4). A protein that activates expression of multidr
ug efflux transporter upon binding the transported
substances. J. Biol. Chem. 269, 28506-28513参
照）。今世紀になって抗生物質の発見および開発の成功
において多大な努力がなされてきた。逆説的に言えば、
抗細菌剤は哺乳動物における感染を根絶するために工夫
されているが、我々は、宿主中の感染状態の細菌病原体
の生理学についてはほとんどわかっていない。スタフィ
ロコッカス・アウレウス染色体由来の配列を用いて、我
々はＲＴ−ＰＣＲに基づく方法を開発し、それにより、
感染のいずれかの段階さらに感染の異なる状態において
転写される細菌遺伝子の同定が可能となっている。かか
る情報から得られることは、宿主環境を補う細菌遺伝子
の全体的な応答を理解する最初の重要なステップであ
る。宿主中で広範に転写される細菌遺伝子の既知機能お
よび未知機能の両方についての知識から、真正細菌にの
み存在する遺伝子をデータベース検索により確認するこ
とが可能である。感染の維持に対する遺伝子産物の可能
な役割りならびに特徴づけされた遺伝子に対する相同性
により示される生化学的機能に対する阻害剤のスクリー
ニングをセットアップすることの容易さを考慮すること
により、有利なことに、かかる遺伝子は、遺伝学的欠失
または制御された調節法を用いる遺伝子必須性の研究の
ための候補の蓄積を可能にする。インビトロにおいてあ
るいは動物モデルにおける発病において増殖に必要であ
ることが示された遺伝子により発現される蛋白は、発病
を広範に抑制する作用剤を見いだすための抗細菌剤スク
リーニングのための新規標的を提供する。本発明は、感
染組織において、詳細には、急性および慢性両方の感染
における感染組織において転写されるエス・アウレウス
ＷＣＵＨ２９のポリヌクレオチドを提供する。

【発明が解決しようとする課題】

【０００５】明らかに、抗生物質活性に関して化合物を
スクリーニングするのに有用であるという目下の利益を
有する本発明新規化合物のごとき因子に対する必要性が
ある。かかる因子は、感染、機能不全および疾病の発生
におけるそれらの役割を調べるのにも有用である。感
染、機能不全または疾病の予防、改善または修正におい
て役割を果たしうる、かかる因子ならびにそれらのアン
タゴニストおよびアゴニストに対する必要性もある。

【０００６】本発明ポリペプチドは、既知のバチルス・
ズブチリスのBMRU BACSU BMRU PROTEIN蛋白に対してア
ミノ酸配列相同性を有する。

【０００７】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
表１（配列番号：２）に示すアミノ酸配列および既知ア
ミノ酸配列またはバチルス・ズブチリスのBMRU BACSU B
MRU PROTEIN蛋白のごとき他の蛋白の配列の間の相同性
により、新規ｂｍｒＵポリペプチドであると同定された
ポリペプチドを提供することが本発明の目的である。ｂ
ｍｒＵポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ド、詳細には本明細書でｂｍｒＵと命名されたポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチドを提供すること
が本発明のさらなる目的である。本発明の特に好ましい
具体例において、ポリヌクレオチドは、表１（配列番
号：１）に示す配列を含むｂｍｒＵポリペプチドをコー
ドする領域を含み、全長遺伝子またはその変種が包含さ
れる。本発明のもう１つの特に好ましい具体例におい
て、表１（配列番号：２）のアミノ酸配列を含むスタフ
ィロコッカス・アウレウス由来の新規ｂｍｒＵ蛋白、ま
たはその変種がある。本発明のもう１つの態様によれ
ば、寄託株に含まれるスタフィロコッカス・アウレウス
WCUH29株により発現可能な成熟ポリペプチドをコード
している単離核酸分子が提供される。

【０００８】本発明のさらなる態様は、ｂｍｒＵ、詳細
にはスタフィロコッカス・アウレウスのｂｍｒＵをコー
ドしている単離核酸分子が提供され、それにはｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明のさ
らなる具体例は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的
もしくは治療的に有用なその変種、およびそれらを含む
組成物を包含する。本発明のもう１つの態様によれば、
治療または予防を目的とした、特に遺伝学的免疫を目的
とした、本発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明の特に好ましい具体例には、ｂｍｒＵの天然の対
立遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチ
ドがある。

【０００９】本発明のもう１つの態様において、本明細
書においてｂｍｒＵと称されるスタフィロコッカス・ア
ウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断
学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なそのフラ
グメント、変種および誘導体、および前記したフラグメ
ントおよびアナログの変種および誘導体、およびそれら
を含む組成物が提供される。本発明の特に好ましい具体
例には、ｂｍｒＵ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコー
ドされるｂｍｒＵポリペプチドの変種がある。本発明の
好ましい具体例において、上記ｂｍｒＵポリペプチドの
製造方法がある。本発明のさらに別の態様によれば、例
えば、抗体を含め、抗細菌剤として有用なかかるポリペ
プチドの阻害剤が提供される。

【００１０】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
ｂｍｒＵ発現の評価、疾病の治療、例えば上気道感染
（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状
腺炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓
感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸感染（例えば、
分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例
えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、
角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、
腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周
囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染（例えば、敗血
症性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の治療、遺伝学的変
異のアッセイ、ならびに細菌、特にスタフィロコッカス
・アウレウス細菌に対する免疫学的応答を生起するため
の生物へのｂｍｒＵポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドの投与のための、製品、組成物および方法が提供され
る。

【００１１】本発明のこのおよび他の態様の特定の好ま
しい具体例によれば、特に、厳密な条件下でｂｍｒＵポ
リヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするポリ
ヌクレオチドが提供される。本発明の特定の好ましい具
体例において、ｂｍｒＵポリペプチドに対する抗体が提
供される。本発明の他の具体例において、本発明ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドの結合、あるいは相互作
用して、それらの活性を阻害または活性化する化合物の
同定方法が提供され、該方法は、化合物とポリペプチド
またはポリヌクレオチドとの間の結合あるいは他の相互
作用を可能にする条件下で、本発明ポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触
させて、化合物との結合あるいは他の相互作用を評価し
（かかる結合または相互作用は、ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互作用に応
答して検出可能なシグナルを提供することのできる第２
の化合物に関連している）、次いで、化合物とポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用か
ら生じるシグナルの存在または不存在を検出することに
より、化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドに
結合あるいは相互作用して、それらの活性を活性化また
は阻害するかどうかを決定することを含む。本発明のさ
らにもう１つの態様によれば、ｂｍｒＵアゴニストおよ
びアンタゴニスト、好ましくは静細菌性または殺細菌性
アゴニストおよびアンタゴニストが提供される。本発明
のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に投
与するための、ｂｍｒＵポリヌクレオチドまたはｂｍｒ
Ｕポリペプチドを含む組成物が提供される。開示した本
発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、
以下の記載を読むこと、および本明細書のその他の部分
を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろう。

【００１２】用語 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列によ
り形質転換もしくはトランスフェクションされた、また
は形質転換またはトランスフェクションすることのでき
る細胞である。

【００１３】当該分野にて周知であるように「同一性」
または「類似性」は、場合によっては、配列を比較して
測定されるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド
配列間または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配
列間の関係である。当該分野において、「同一性」とは
また、時には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により
決定されるような２つのポリペプチドまたはポリヌクレ
オチド配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」
および「類似性」は共に容易に算出できる（Computatio
nal Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォー
ド・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988
年；Biocomputing：Informatics and Genome Project
s，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、1993年；Computer Analysis of Sequence Data，パ
ートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマ
ナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Ana
lysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデ
ミック・プレス、1987年；およびSequence Analysis Pr
imer，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックト
ン・プレス、ニューヨーク、1991年）。２つのポリヌク
レオチドまたは２つのポリペプチド間の同一性および類
似性を測定するための多くの方法がある一方で、その両
方の用語は当業者に周知である（Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heinje,G.,Academic Press,1
987; Squence Analysis Primer, Gribskov,M.およびDev
ereux,J.,編、M Stockton Press, New York,1991;およ
びCarillo,H.,およびLipman,D.,SIAM J., Applied Mat
h., 48:1073(1988)）。２つの配列間で同一性または類
似性を測定するのに通常用いられる方法は、Carillo,H.
およびLipman,D., SIAM J. Applied Math.,48:1073(198
8)に開示されている方法を包含するが、これらに限定さ
れるものではない。同一性を決定するための好ましい方
法は、試験する２つの配列間で最も良く適合するように
設計される。同一性および類似性を測定する方法は、公
に利用できるコンピュータープログラムに集成されてい
る。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ま
しいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラム
パッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic AcidsResearch 1
2(1):387（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atsch
ul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：403（1990）））を包含
するが、これらに限定されるものではない。一例とし
て、配列番号：１の対照ヌクレオチド配列に対して、例
えば少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドを挙げると、そのポリヌク
レオチド配列が配列番号：１の対照ヌクレオチド酸配列
のヌクレオチド１００個ごとに５個までのヌクレオチド
の変化を含みうることを除き、そのポリヌクレオチドの
ヌクレオチド配列は対照配列と同一である。言い換える
と、対照酸配列に対して少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリペプチドを得るためには、
対照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失または別の
ヌクレオチドと置換されていてもよく、あるいは対照配
列中の全ヌクレオチドのうち５％までの数のヌクレオチ
ドが対照配列に挿入されたものであってもよい。対照配
列のこれらの変異は、対照ヌクレオチド配列の５’また
は３’末端位置に存在していてもよく、あるいはそれら
の末端位置の間のいずれかの位置に存在していてもく、
対照配列のヌクレオチドに散在していてもよく、あるい
は対照配列内の１個またはそれ以上の一連の群となって
いてもよい。同様に、配列番号：２の対照アミノ酸配列
に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを例に挙げると、そのポ
リペプチド配列が配列番号：２の対照アミノ酸配列のア
ミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含み
うることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対
照配列と同一である。言い換えると、対照アミノ酸配列
に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有
するポリペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ
酸の５％までが欠失または他のアミノ酸と置換していて
もよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸のうち５％ま
での数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであっ
てもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミ
ノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在して
もよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存
在してもよく、対照配列中に散在していてもよく、ある
いは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなし
ていてもよい。

【００１４】「単離」とは、「人の手によって」天然の
状態から変化させられた、すなわち、天然物の場合、そ
の本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行
われたことを意味する。例えば、天然において生体に存
在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単
離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書に用いる用語としての「単離」がなされて
いる。

【００１５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、また
は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリ
リボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド
をも意味する。従って、「ポリヌクレオチド」は、とり
わけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならび
に一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、また
は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮ
ＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、
これらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌ
クレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡと
ＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領域
における鎖は同一の分子または異なる分子由来のもので
よい。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の
全てを含んでいてもよいが、より典型的にはいくつかの
分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」なる用語
は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、前
記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安
定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも、本明細書が意図するろところの「ポリヌ
クレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない
塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡ
またはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、本明細書の用
語ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用
な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの
修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリヌ
クレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリ
ヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的
に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細
胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよ
びＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチ
ド」は、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）
と称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。

【００１６】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ペ
プチド結合により直鎖で互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうの
に用いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えば
ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称され
る短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に蛋
白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺
伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ
酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程によ
り、ならびに化学修飾によるものを包含する。かかる修
飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに
多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当
業者に周知である。同じタイプの修飾がポリペプチド中
にいくつかの部位に同程度または種々の程度で存在して
もよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末
端を包含するポリペプチドのいずれの場所にあってもよ
い。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、Ａ
ＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘ
ム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、
ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形
成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル
化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、
アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸
付加、およびユビキチネーションがある。例えば、Prot
eins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
（1993）に記載されている。例えば、Posttranslationa
l Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson
編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWo
ld,F., Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol. 182:626-646（1990）およびRattanら、Prote
in Synthesis：Posttranslational Modifications and
Aging，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62（1992）参
照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなし
の環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝状か
つ環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生
じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ
り製造されるものであってもよい。

【００１７】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。以下に論じるように、ヌクレオチ
ドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、
全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一なもの
に限られる。変種および対照ポリペプチドは、１または
それ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起こ
ることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコー
ドされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子変種
のような自然発生的なものでもよく、または自然発生す
ることが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変異技
術または直接的合成および当業者に知られた他の組み換
え法により製造できる。

【００１８】本発明は、とりわけ、以下に非常に詳細に
説明する、新規ｂｍｒＵポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドに関する。詳細には、本発明は、バチルス・ズブ
チリスのBMRU BACSU BMRU PROTEINポリペプチドに対す
るアミノ酸配列相同性により関連付けられる、スタフィ
ロコッカス・アウレウスの新規ｂｍｒＵのポリペプチド
およびポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、それ
ぞれ表１（配列番号：１）および表１（配列番号：２）
に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するｂ
ｍｒＵに関し、さらに寄託株中のＤＮＡのｂｍｒＵヌク
レオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配
列に関する。

【００１９】表１ ｂｍｒＵポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 (A) スタフィロコッカス・アウレウスのｂｍｒＵポリヌ
クレオチド配列由来の配列 [配列番号：1] 5'-1 ATGGAAAATA AATATACACA TGGTGTCCTC TTTTACCATG AACACAGTGG 51 ATTAAAAAAT ATTAATCAAG GTATTGGGGA AGTTACAACA GCATTAAGTT 101 CAATTTGTAA GCATCTTTCT ATTCAATTGA GTGAAAACGA AGGTGACATT 151 ATTAAATATT GCCAAGAAAT CAAAACTAAA AACTATGCAA AAGATGTAGA 201 TATATTATTT ATTCTTGGCG GTGATGGCAC GGTTAACGAA CTTATAAATG 251 GTGTTATGTC ACATGACCTT CAACTCCCTA TTGGCATTTT ACCAGGCGGT 301 ACTTTTAATG ATTTTACAAA AACGCTAAAT ATAGCACCTA ATCATAAACA 351 AGCTAGTGAA CAAATGATTT CTGCACAAGT TGGTACATAC GATGTAATTA 401 AAATAAATAA TCAATATGCA CTCAACTTTG TTGGCTTAGG TCTCATTGTT 451 CAAAACGCTG AAAACGTACA AGATGGTTCA AAAGATATAT TTGGTAAATT 501 GAGTTATATT GGATCAACTG TCAAAACACT GCTAAATCCA ACACAATTTA 551 ATTATCAATT ATCAATAGAT GATAAGACAT ATTCTGGCGA AACGCACATG 601 ATACTAACAG CAAATGGTCC ATTCATTGGT GGTAGTCGTA TACCATTGAC 651 TGATTTGTCT CCTCAAGATG GTGAACTGAA CACTTTCATT TTTAATGAAC 701 ACAGTTTCAG TATTTTAAAT GATATTTTTA AAAAGCGTGA TAGCATGAAT 751 TGGAATGAAA TTACTCAAGG TATTGAGCAT ATACCTGGTA AAAAGATTTC 801 ACTTACAACA GATCCAGCAA TGAAAGTTGA TATTGATGGC GAAATTTCAT 851 TAGAAACACC TATTGATATT GAGGTTATAC CAAATGCTAT TCAGTTACTT 901 ACTGTCAATG ATTTG -3'

【００２０】(B)この表中のポリヌクレオチド配列から
推定されるｂｍｒＵポリペプチド配列[配列番号：2] NH₂-1 MENKYTHGVL FYHEHSGLKN INQGIGEVTT ALSSICKHLS IQLSENEGDI 51 IKYCQEIKTK NYAKDVDILF ILGGDGTVNE LINGVMSHDL QLPIGILPGG 101 TFNDFTKTLN IAPNHKQASE QMISAQVGTY DVIKINNQYA LNFVGLGLIV 151 QNAENVQDGS KDIFGKLSYI GSTVKTLLNP TQFNYQLSID DKTYSGETHM 201 ILTANGPFIG GSRIPLTDLS PQDGELNTFI FNEHSFSILN DIFKKRDSMN 251 WNEITQGIEH IPGKKISLTT DPAMKVDIDG EISLETPIDI EVIPNAIQLL 301 TVNDL-COOH

【００２１】(C)ポリヌクレオチド配列の具体例 [配列
番号：1]. X-(R1)n-1 ATGGAAAATA AATATACACA TGGTGTCCTC TTTTACCATG AACACAGTGG 51 ATTAAAAAAT ATTAATCAAG GTATTGGGGA AGTTACAACA GCATTAAGTT 101 CAATTTGTAA GCATCTTTCT ATTCAATTGA GTGAAAACGA AGGTGACATT 151 ATTAAATATT GCCAAGAAAT CAAAACTAAA AACTATGCAA AAGATGTAGA 201 TATATTATTT ATTCTTGGCG GTGATGGCAC GGTTAACGAA CTTATAAATG 251 GTGTTATGTC ACATGACCTT CAACTCCCTA TTGGCATTTT ACCAGGCGGT 301 ACTTTTAATG ATTTTACAAA AACGCTAAAT ATAGCACCTA ATCATAAACA 351 AGCTAGTGAA CAAATGATTT CTGCACAAGT TGGTACATAC GATGTAATTA 401 AAATAAATAA TCAATATGCA CTCAACTTTG TTGGCTTAGG TCTCATTGTT 451 CAAAACGCTG AAAACGTACA AGATGGTTCA AAAGATATAT TTGGTAAATT 501 GAGTTATATT GGATCAACTG TCAAAACACT GCTAAATCCA ACACAATTTA 551 ATTATCAATT ATCAATAGAT GATAAGACAT ATTCTGGCGA AACGCACATG 601 ATACTAACAG CAAATGGTCC ATTCATTGGT GGTAGTCGTA TACCATTGAC 651 TGATTTGTCT CCTCAAGATG GTGAACTGAA CACTTTCATT TTTAATGAAC 701 ACAGTTTCAG TATTTTAAAT GATATTTTTA AAAAGCGTGA TAGCATGAAT 751 TGGAATGAAA TTACTCAAGG TATTGAGCAT ATACCTGGTA AAAAGATTTC 801 ACTTACAACA GATCCAGCAA TGAAAGTTGA TATTGATGGC GAAATTTCAT 851 TAGAAACACC TATTGATATT GAGGTTATAC CAAATGCTAT TCAGTTACTT 901 ACTGTCAATG ATTTG -(R2)n-Y

【００２２】(D)ポリペプチド配列の具体例 [配列番
号：2] X-(R1)n-1 MENKYTHGVL FYHEHSGLKN INQGIGEVTT ALSSICKHLS IQLSENEGDI 51 IKYCQEIKTK NYAKDVDILF ILGGDGTVNE LINGVMSHDL QLPIGILPGG 101 TFNDFTKTLN IAPNHKQASE QMISAQVGTY DVIKINNQYA LNFVGLGLIV 151 QNAENVQDGS KDIFGKLSYI GSTVKTLLNP TQFNYQLSID DKTYSGETHM 201 ILTANGPFIG GSRIPLTDLS PQDGELNTFI FNEHSFSILN DIFKKRDSMN 251 WNEITQGIEH IPGKKISLTT DPAMKVDIDG EISLETPIDI EVIPNAIQLL 301 TVNDL-(R2)n-Y

【００２３】（Ｅ）スタフィロコッカス・アウレウスの
ｂｍｒＵのポリヌクレオチドＯＲＦ配列由来の配列［配
列番号：３］ 5'- ATGGAAAATA AATATACACA TGGTGTCCTC TTTTACCATG AACACAGTGG 51 ATTAAAAAAT ATTAATCAAG GTATTGGGGA AGTTACAACA GCATTAAGTT 101 CAATTTGTAA GCATCTTTCT ATTCAATTGA GTGAAAACGA AGGTGACATT 151 ATTAAATATT GCCAAGAAAT CAAAACTAAA AACTATGCAA AAGATGTAGA 201 TATATTATTT ATTCTTGGCG GTGATGGCAC GGTTAACGAA CTTATAAATG 251 GTGTTATGTC ACATGACCTT CAACTCCCTA TTGGCATTTT ACCAGGCGGT 301 ACTTTTAATG ATTTTACAAA AACGCTAAAT ATAGCACCTA ATCATAAACA 351 AGCTAGTGAA CAAATGATTT CTGCACAAGT TGGTACATAC GATGTAATTA 401 AAATAAATAA TCAATATGCA CTCAACTTTG TTGGCTTAGG TCTCATTGTT 451 CAAAACGCTG AAAACGTACA AGATGGTTCA AAAGATATAT TTGGTAAATT 501 GAGTTATATT GGATCAACTG TCAAAACACT GCTAAATCCA ACACAATTTA 551 ATTATCAATT ATCAATAGAT GATAAGACAT ATTCTGGCGA AACGCACATG 601 ATACTAACAG CAAATGGTCC ATTCATTGGT GGTAGTCGTA TACCATTGAC 651 TGATTTGTCT CCTCAAGATG GTGAACTGAA CACTTTCATT TTTAATGAAC 701 ACAGTTTCAG TATTTTAAAT GATATTTTTA AAAAGCGTGA TAGCATGAAT 751 TGGAATGAAA TTACTCAAGG TATTGAGCAT ATACCTGGTA AAAAGATTTC 801 ACTTACAACA GATCCAGCAA TGAAAGTTGA TATTGATGGC GAAATTTCAT 851 TAGAAACACC TATTGATATT GAGGTTATAC CAAATGCTAT TCAGTTACTT 901 ACTGTCAATG ATTTG −3'

【００２４】（Ｆ）この表中のポリヌクレオチドＯＲＦ
配列から推定されるｂｍｒＵポリペプチド配列［配列番
号：４］ NH₂- 1 MENKYTHGVL FYHEHSGLKN INQGIGEVTT ALSSICKHLS IQLSENEGDI 51 IKYCQEIKTK NYAKDVDILF ILGGDGTVNE LINGVMSHDL QLPIGILPGG 101 TFNDFTKTLN IAPNHKQASE QMISAQVGTY DVIKINNQYA LNFVGLGLIV 151 QNAENVQDGS KDIFGKLSYI GSTVKTLLNP TQFNYQLSID DKTYSGETHM 201 ILTANGPFIG GSRIPLTDLS PQDGELNTFI FNEHSFSILN DIFKKRDSMN 251 WNEITQGIEH IPGKKISLTT DPAMKVDIDG EISLETPIDI EVIPNAIQLL 301 TVNDL-COOH

【００２５】寄託物質 スタフィロコッカス・アウレウス WCUH29株を含有する
寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド
（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカードラ
イブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに
１９９５年９月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１が付与された。寄託したことにより、寄託株をス
タフィロコッカス・アウレウス WCUH29株という。本明
細書においてスタフィロコッカス・アウレウス株の寄託
物を「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」という。寄託
株は全長のｂｍｒＵ遺伝子を含んでいる。寄託株中に含
まれるポリヌクレオチド配列ならびにそれによりコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列
に関する任意の記載に矛盾する事象において支配的であ
る。寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際
承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。
特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終
的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ
提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求される
ような、寄託が実施可能要件であることを承認するもの
ではない。寄託物を製造、使用または販売するためには
ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはこ
こでは賦与されていない。

【００２６】ポリペプチド 本発明ポリペプチドは表１［配列番号：２］のポリペプ
チド（詳細には、成熟ポリペプチド）ならびにポリペプ
チドおよびフラグメント、詳細にはｂｍｒＵの生物学的
活性を有するものを包含し、さらに表１［配列番号：２
および４］のポリペプチドまたはその重要部分に対して
少なくとも７０％、好ましくは表１［配列番号：２およ
び４］のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一
性を有するポリペプチドおよびフラグメント、より好ま
しくは表１［配列番号：２および４］のポリペプチドに
対して少なくとも９０％の類似性を有し（より好ましく
は、少なくとも９０％の同一性を有し）、さらにより好
ましくは表１［配列番号：２および４］のポリペプチド
に対して少なくとも９５％の類似性を有する（さらによ
り好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する）ポリ
ペプチドおよびフラグメント、さらに通常には少なくと
も３０個、より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸
を含むかかるポリペプチドの部分を包含する。

【００２７】また本発明は表１（Ｄ）に示す式のポリペ
プチドを包含し、式中のアミノ末端においてＸは水素で
あり、カルボキシル末端においてＹは水素または金属で
あり、Ｒ₁およびＲ₂はアミノ酸残基、ｎは１ないし１０
００の整数である。いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも多
い）により示されるアミノ酸残基の伸長部分はヘテロポ
リマーであってもホモポリマーであってもよく、好まし
くはヘテロポリマーである。

【００２８】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｂｍ
ｒＵポリペプチドについては、フラグメントは「独立し
て存在（free standing）」しているか、または一部分
もしくは領域を形成することにより、大型のポリペプチ
ド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続
した領域、すなわち大型の単一ポリペプチドとして含ま
れる。好ましいフラグメントは、表１［配列番号：２お
よび４］のアミノ酸配列の一部分を有する末端切断され
たポリペプチド、またはそれらの変種を包含するが、そ
の例としてはアミノ末端を含む一連の残基を切断、また
はカルボキシル末端を含む一連の残基を切断したものが
ある。宿主、とりわけスタフィロコッカス・アウレウス
における、本発明のポリペプチドの分解形態もまた好ま
しい。また、構造的または機能的属性により特徴づけら
れたフラグメント、例えばアルファーヘリックスおよび
アルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベ
ータシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コ
イルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、
アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領
域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標
領域を含むフラグメントなども好ましい。ｂｍｒＵ活性
を媒介し、あるいは活性を改善し、望ましくない活性を
減じられたフラグメントである生物学的に活性のあるフ
ラグメントも好ましい。動物、とりわけヒトにおいて抗
原的または免疫原的なフラグメントもまた含まれる。個
体、特にヒトにおけるスタフィロコッカス・アウレウス
の生存に必須の機能、あるいは疾病を開始または維持
する能力を付与する酵素の受容体またはドメインを含む
フラグメントが特に好ましい。本発明ポリペプチドのフ
ラグメントである変種を、ペプチド合成による対応全長
ポリペプチドの製造に使用してもよく、それゆえ、これ
らの変種を全長のポリペプチド製造のための中間体とし
て用いてもよい。本発明ポリヌクレオチドのフラグメン
トである変種を用いて本発明の全長のポリヌクレオチド
を合成してもよい。

【００２９】ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するもの
であり、それには表１［配列番号：２および４］の推定
アミノ酸配列を有するｂｍｒＵポリペプチドをコードす
る全長遺伝子およびそれに密接に関連するポリヌクレオ
チドおよびそれらの変種が包含される。本明細書に提供
される情報を用いて、例えば表１［配列番号：１および
３］に示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質スタ
フィロコッカス・アウレウス WCUH29細胞からの染色体
ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定する
ために用いるような標準的なクローニングおよびスクリ
ーニングを用いて、ｂｍｒＵポリペプチドをコードして
いる本発明ポリヌクレオチドを得て、次いで、全長のク
ローンを得てもよい。例えば、本発明ポリヌクレオチド
配列、例えば表１［配列番号：１および３］に示す配列
を得るために、イー・コリ（E.coli）またはいくつかの
他の適切な宿主におけるスタフィロコッカス・アウレウ
ス WCUH29の染色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブ
ラリーを、部分的配列に由来する、好ましくは１７量体
またはそれ以上の長さの放射性標識化オリゴヌクレオチ
ドにてプローブする。プローブのＤＮＡに同一であるＤ
ＮＡを担持するクローンは厳密な条件を用いて区別でき
る。元の配列から設計した配列決定プライマーを用いて
このように同定した個々のクローンを配列決定すること
により、両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝
子配列を決定できる。このような配列決定は便宜的にプ
ラスミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用い
て実施する。適切な技法については、Maniatis,T.、Fit
sch,F.F.およびSambrookら、MolecularCloning，A Labo
ratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・
ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている（Sc
reening By Hybridization 1.90およびSequencing Dena
tured Double-Stranded DNA Templates 13.70参照）。
本発明の典型例において、表１［配列番号：１］に示す
ポリヌクレオチドが、スタフィロコッカス・アウレウス
WCUH29由来のＤＮＡライブラリー中に見いだされた。

【００３０】表１［配列番号：１］に示すＤＮＡ配列
は、表１［配列番号：２］に示すアミノ酸残基数とほぼ
同数のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読み枠を
含んでおり、蛋白の推定分子量は、当該分野でよく知ら
れたアミノ酸の分子量を用いて算出できる。ヌクレオチ
ド番号１から９１５の間の配列番号：１のポリヌクレオ
チドは配列番号：２のポリペプチドをコードする。停止
コドンは配列番号：１のヌクレオチド番号９１６から開
始する。本発明ｂｍｒＵ蛋白は、寄託株のｂｍｒＵをコ
ードしているＤＮＡの配列決定結果により示されるよう
に、多剤排出系コーディング遺伝子ファミリーの他の蛋
白に構造的に関連している。本発明蛋白は、知られた蛋
白の中でもバチルス・ズブチリスのBMRU BACSU BMRU PR
OTEIN蛋白に対して最大の相同性を示す。表１［配列番
号：２］のｂｍｒＵ蛋白は、バチルス・ズブチリスのBM
RU BACSU BMRU PROTEINポリペプチドのアミノ酸配列に
対して、その全長にわたり約３７％の同一性、そしてそ
の全長にわたり約６２％の類似性を示す。

【００３１】本発明は、表１［配列番号：１］のコーデ
ィング配列に対して全長にわたり同一であるポリヌクレ
オチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列またはそれらのフラグメント、ならびにその他の
コーディング配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチド
のコーディング配列またはそのフラグメント、例えばリ
ーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列
をコードする配列も本発明により提供される。ポリヌク
レオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻
訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コーディ
ング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コ
ーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するの
ではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマー
カー配列をコードすることもできる。本発明のある好ま
しい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター
（Qiagen, Inc.）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチ
ジンペプチド（Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A， 86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ
（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現
を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定するも
のではない。

【００３２】本発明の好ましい具体例は、ｂｍｒＵポリ
ペプチドをコードいしている、表１の配列番号：１に示
すヌクレオチド１から９１５までを含むポリヌクレオチ
ドである。

【００３３】また本発明は、表１（Ｃ）に示す式のポリ
ヌクレオチドを包含し、式中の５’末端においてＸは水
素であり、３’末端においてＹは水素または金属であ
り、Ｒ₁およびＲ₂は核酸残基、ｎは１ないし１０００の
整数である。いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも多い）に
より示される核酸残基の伸長部分はヘテロポリマーであ
ってもホモポリマーであってもよく、好ましくはヘテロ
ポリマーである。

【００３４】上記した本明細書の用語「ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列を含むポリヌクレオチドを包含し、詳細には、
細菌のポリペプチド、より詳細には表１［配列番号：
２］に示すアミノ酸配列を有するスタフィロコッカス・
アウレウスのｂｍｒＵのポリペプチドを包含する。該用
語は、コーディング配列および／または非コーディング
配列を含んでいてもよいさらなる領域を伴った、ポリペ
プチドをコードしている単一の連続領域または不連続領
域（例えば、組み込まれたファージまたは配列の挿入ま
たは配列の編集により分断されたもの）を含むポリヌク
レオチドを包含する。さらに本発明は、表１［配列番
号：２］の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変
種をコードする上記ポリヌクレオチドの変種にも関す
る。本発明ポリヌクレオチドのフラグメントである変種
を用いて本発明の全長ポリヌクレオチドを合成してもよ
い。

【００３５】さらに特に好ましい具体例は、表１［配列
番号：２］のｂｍｒＵポリペプチドのアミノ酸配列を有
するｂｍｒＵ変種をコードするポリヌクレオチドであ
り、その中には、いくつか、少しの、５ないし１０、１
ないし５、１ないし３、２、１または０個のアミノ酸残
基を置換、欠損または付加を任意の組み合わせで施した
アミノ酸配列を有する。中でもとりわけ好ましいもの
は、ｂｍｒＵの特性および活性を変化させないサイレン
ト置換、付加および欠損である。

【００３６】本発明のさらに好ましい具体例は、表１
［配列番号：２および４］に示すアミノ酸配列を有する
ｂｍｒＵポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ドに対して、その全長にわたり少なくとも７０％の同一
性があるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオ
チドに対して相補的なポリヌクレオチドである。あるい
はまた、寄託株のｂｍｒＵポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくと
も８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およ
びそれに対して相補的なポリヌクレオチドが最も非常に
好ましい。この点に関して、全長で少なくとも９０％同
一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも
少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好まし
く、さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中
でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも
少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特
に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好
ましい。特に好ましい具体例は、表１［配列番号：１］
によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生
物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチドである。

【００３７】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／
ｍｌの変性し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶
液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続いて約６
５℃で０.１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するもので
ある。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知で
あり、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory
Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）、とりわけその第１１章に実例が示
されている。

【００３８】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で、配列番号：１または配列番号：３に示すポ
リヌクレオチド配列に関する完全遺伝子を含む適当なラ
イブラリーを、配列番号：１に示す上記ポリヌクレオチ
ド配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブ
でスクリーニングし、ＤＮＡ配列を単離することにより
得ることのできるポリヌクレオチド配列を本質的に含む
ポリヌクレオチドをも提供する。かかるポリヌクレオチ
ドを得るために有用なフラグメントには、例えば本明細
書の別の箇所において説明するプローブおよびプライマ
ー等がある。

【００３９】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドは、ｂｍｒＵをコードするｃＤＮＡ全長およ
びゲノムクローンを単離するための、およびｂｍｒＵ遺
伝子に高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーショ
ンプローブとして使用することができる。このようなプ
ローブは通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこ
のようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なく
とも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプ
ローブは少なくとも３０塩基を有し、５０塩基またはそ
れ以下である。例えば、ｂｍｒＵ遺伝子のコーディング
領域は、配列番号：１に示すＤＮＡ配列を用いてオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成してスクリーニングするこ
とにより単離できる。次いで、本発明の遺伝子の配列に
相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのス
クリーニングに用い、プローブがライブラリーのいずれ
のメンバーにハイブリダイゼーションするのかを決定す
る。

【００４０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のための研究試薬および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。配列番号：１および／または２
の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌク
レオチドを本明細書記載の方法に使用してもよいが、好
ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌ
クレオチドの全体または一部が感染した組織に転写され
るかどうかを決定する。かかる配列が、病原体が達成し
た感染段階および感染型の診断にも有用であることが理
解される。

【００４１】また本発明は、さらなるアミノもしくはカ
ルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペプチドに内
在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドを
コードできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟
形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。この
ような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッ
シングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半
減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイも
しくは製造のための蛋白の操作を容易にすることができ
る。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性
酵素によりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除か
れる。１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態
のポリペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不
活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常に
はこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列の
いくつかまたはすべてを活性化の前に除去できる。通
常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。要する
に、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配
列を加えた成熟蛋白（プレ蛋白と称することができ
る）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそれ以
上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダ
ー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ
蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコードしていてもよ
く、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態
を生成するプロセッシング段階で除去される。

【００４２】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）；S
ambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manua
l、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニ
ュアルに記載される方法により行うことができ、例えば
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染等がある。

【００４３】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッ
カス属（Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、スト
レプトミセス（Streptomyces）およびバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母
細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆
虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S2）お
よびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物
細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細
胞；ならびに植物細胞等がある。

【００４４】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。

【００４５】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。

【００４６】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。

【００４７】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のｂ
ｍｒＵポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物と
りわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｂｍｒＵの検出は、
疾患の診断のための診断法を提供する。ｂｍｒＵ遺伝子
を含む生物に感染した真核生物（本明細書において「個
体」とも称する）とりわけ哺乳動物、特にヒトを種々の
方法によりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸
は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、
筋肉、軟骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤ
ＮＡを直接検出に使用してもよく、あるいは分析の前に
ＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素
的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法
で用いることができる。増幅法を用いると、真核生物と
りわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を、原
核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすること
ができる。対照配列の遺伝子型と比較した場合の増幅産
物の大きさの変化により、欠損および挿入を検出でき
る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化ｂｍｒＵポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイズさせることにより同定
できる。完全に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、
または融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別
できる。変性剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
または直接的なＤＮＡの配列決定により、ＤＮＡ配列の
差を検出してもよい。例えばMeyersら、Science，230:1
242（1985）参照。また、特異的な位置での配列の変化
を、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよ
びＳ１保護または化学的切断法によって明らかにしても
よい。例えばCottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A， 85:4397-4401 （1985）参照。

【００４８】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞を、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、
例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
に用いてもよい。例を挙げると、ｂｍｒＵをコードする
核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然変異を同定お
よび分析するのに用いることができる。典型的なプライ
マーの例を下表２に示す。

【００４９】表２ ｂｍｒＵポリヌクレオチドの増幅のためのプライマー 配列番号 プライマー配列 5 5'-CAAG GTATTGGGGA AGTTAC-3' 6 5'-AAAAATATCATTTAAAATAC-3'

【００５０】本発明はまた、５'および／または３'末端
から１、２、３または４個のヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体
から単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供しても
よい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出
し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングおよ
び／または分類に使用することができる。

【００５１】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスに
よる感染、および最も好ましくは、上気道感染（例え
ば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺
炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感
染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸感染（例えば、分
泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例え
ば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角
膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎
および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲
膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染（例えば、敗血
症性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の診断方法を提供
し、該方法は、表１［配列番号：１］の配列を有するポ
リヌクレオチドのの発現レベルの上昇を個体由来の試料
から検出することを特徴とする。ｂｍｒＵポリヌクレオ
チドの発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定
量法として当該分野でよく知られたいずれかの方法、例
えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノ
ーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼー
ション法を用いて測定できる。

【００５２】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
て、ｂｍｒＵ蛋白の過剰発現を検出するための本発明診
断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出してもよ
い。宿主由来のサンプル中のｂｍｒＵ蛋白のレベルを決
定するために用いることができるアッセイ技法は、当業
者に周知である。かかるアッセイ法には、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。

【００５３】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により得ることができる。連続的細胞系培養により産生
される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モ
ノクローナル抗体を調製することができる。例として
は、Kohler， G.およびMilstein, C.，Nature， 256:49
5-497 （1975）； Kozborら、Immunology Today， 4:72
（1983）； Coleら、Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy, Alan R Liss, Inc.、77-96頁（1985）に記
載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生の
ために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）
を適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を
得ることができる。また、トランスジェニックマウスま
たはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒ
ト化抗体等の抗体を発現させてもよい。

【００５４】別法として、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーから、抗−ｂｍｒＵを有することにつ
いてスクリーニングされたヒトから、あるいは無処理の
ライブラリーから、ポリペプチドに対する結合活性を有
する抗体遺伝子を選別することもできる（McCafferty,
J.ら、Nature 348:552-554 （1990）； Marks, J.ら、B
iotechnology 10:779-783 （1992））。これらの抗体の
親和性はチェインシャフリング（chain shuffling）に
より改善することもできる（Clackson, T.ら、Nature 3
52:624-628 （1991））。

【００５５】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。上記抗体を用いてポリペプチド
を発現するクローンを単離または同定してもよく、上記
抗体を親和性クロマトグラフィーにより精製することが
できる。

【００５６】従って、とりわけｂｍｒＵに対する抗体
を、感染、とりわけ細菌感染、特に上気道感染（例え
ば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺
炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感
染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸感染（例えば、分
泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例え
ば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角
膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎
および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲
膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染（例えば、敗血
症性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の治療に用いてもよ
い。

【００５７】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。

【００５８】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチ
ドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合すること
により、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合
することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリペ
プチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価
なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。

【００５９】好ましくは、抗体またはそれらの変種を、
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラスミ
ドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gene
t.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。

【００６０】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細
胞、無細胞標品、化学ライブラリー、および天然産物混
合物中における小型分子基質およびリガンドの結合を評
価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然基質
およびリガンドであってもよく、構造上または機能上の
模倣物であってもよい。例えば、Coligan et al.,Curre
nt Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参
照。

【００６１】また本発明は、ｂｍｒＵポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニスト）または
阻害（アンタゴニスト）する化合物、詳細には、静菌性
および／または殺菌性化合物を同定するための、化合物
のスクリーニング方法をも提供する。該スクリーニング
方法は高処理量の方法である。例えば、アゴニストまた
はアンタゴニストをスクリーニングするために、ｂｍｒ
Ｕポリペプチドを含む、合成反応混合物、膜、細胞表面
膜もしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、また
はそれらのいずれかの調製物、およびこのようなポリペ
プチドの標識基質またはリガンドを、ｂｍｒＵアゴニス
トまたはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下ま
たは不在下でインキュベーションする。候補分子がｂｍ
ｒＵポリペプチドにアゴナイズまたは拮抗する能力は、
標識化リガンドの結合の低下またはこのような基質から
の生成物の産生の低下に反映される。結合しても影響を
及ぼさない分子、すなわちｂｍｒＵの効果を誘導しない
分子は、最も良好なアンタゴニストである可能性があ
る。結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高
める分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成
速度またはレベルはリポーターシステムを用いることに
より強調できる。この点に関して有用なリポーターシス
テムには、生成物に転換される比色測定用標識化基質、
ｂｍｒＵポリヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変
化に反応するリポーター遺伝子、および当該分野で周知
の結合アッセイ等があるが、これらに限定するものでは
ない。

【００６２】ｂｍｒＵアンタゴニストのアッセイのもう
１つの例は競争アッセイであり、競争阻害アッセイに適
した条件下で、ｂｍｒＵおよび潜在的アンタゴニスト
を、ｂｍｒＵ結合分子、組換えｂｍｒＵ結合分子、天然
基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模
倣物と混合する。例えば放射活性または比色測定用化合
物によりｂｍｒＵ分子を標識し、結合分子に結合した、
または生成物に変換されたｂｍｒＵ分子の数を正確に決
定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。

【００６３】潜在的アンタゴニストには、本発明ポリペ
プチドに結合し、そのことによりその活性を阻害し消失
させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗
体などがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に
関連した蛋白または抗体のごとき小型有機分子、ペプチ
ド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子の
同じ部位に結合するが、ｂｍｒＵにより誘導される活性
を誘導せず、それゆえｂｍｒＵを結合から排除すること
によりｂｍｒＵの作用を妨害する。潜在的アンタゴニス
トには、ポリペプチドの結合部位に結合し、およびそれ
を占領し、それにより細胞性結合分子への結合を防御し
て、正常の生物学的活性を防御する小型分子等がある。
小型分子の例としては、小型有機分子、ペプチド、ペプ
チド様分子等があるが、これらに限定するものではな
い。その他の潜在的アンタゴニストにはアンチセンス分
子等がある（これらの分子についての記載に関してはOk
ano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nucle
otides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（198
8）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、ｂｍ
ｒＵ関連化合物およびｂｍｒＵ変種等がある。

【００６４】本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。

【００６５】本発明は、感染の続発症に関与する病因お
よび哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害する
ための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻
害物質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在
デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白または傷
における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳細
にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チ
ロシンキナーゼのホスホリレーションを開始することに
よる、ｂｍｒＵ蛋白により媒介される哺乳動物細胞への
侵入のブロック（Rosenshine et al.,Infect.Immunol.6
0:2211(1992)）；哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と細
菌ｂｍｒＵ蛋白との間の、組織ダメージを媒介する細菌
付着のブロック；内在デバイスの移植または他の外科的
方法以外により開始される、感染における通常の病状の
進行のブロックに使用することができる。

【００６６】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、感染、とりわけ細菌感染、特に上気道感染
（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状
腺炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓
感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸感染（例えば、
分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例
えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、
角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、
腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周
囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染（例えば、敗血
症性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の抑制および治療に
用いてもよい。

【００６７】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘導する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはスタフィロコッカス・ア
ウレウス感染から個体を防御するための抗体および／ま
たはＴ細胞応答を生じさせるに十分なｂｍｒＵまたはそ
のフラグメントもしくは変種を個体に接種することを特
徴とする。かかる免疫学的応答が細菌の複製を遅らせる
方法も提供される。本発明のさらにもう１つの態様は、
個体における免疫学的応答の誘導方法に関し、該方法
は、疾病が個体においてすでに確立されているか否かに
かかわらず、インビボでｂｍｒＵ、またはそのフラグメ
ントもしくは変種を発現させるためにｂｍｒＵまたはそ
のフラグメントもしくは変種の発現を指令する核酸ベク
ターをかかる個体に送達して、例えば、抗体および／ま
たはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞
または細胞毒性Ｔ細胞）を生じさせる免疫学的応答を誘
導して、該個体を疾病から防御する抗体を産生させるこ
とを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中に投与する
方法としては、粒子上にコーディングすること等がある。
かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、また
はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいてもよい。

【００６８】本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を
宿主内に誘導できる、または誘導されたた宿主に導入し
た場合、ｂｍｒＵまたはそれによりコードされている蛋
白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組
成物に関し、その組成物は組換えｂｍｒＵまたはそれに
よりコードされている蛋白を含み、ｂｍｒＵまたはそれ
によりコードされている蛋白に対する抗原をコードし発
現するＤＮＡを含む。免疫学的応答を治療的または予防
的に用いてもよく、また免疫学的応答はＣＴＬまたはＣ
Ｄ４⁺Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞性免
疫の形態であってもよい。

【００６９】ｂｍｒＵポリペプチドまたはそれらのフラ
グメントを、それ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋
白を安定化し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋
白を産生する能力のある共存蛋白（co-protein）と融合
させてもよい。好ましくは、かかる融合組換え蛋白は、
抗原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフルエンザエ
（Hemophilus influenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベー
ターガラクトシダーゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化
してそれらの産生および精製を促進する比較的大きな共
存蛋白等を含む。さらに、共存蛋白は免疫系において普
遍的な刺激を提供するという意味で、アジュバントとし
て作用することができる。共存蛋白は第１の蛋白のアミ
ノまたはカルボキシル末端のどちらかに結合できる。

【００７０】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352 (19
66)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む
組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。

【００７１】また、本発明は、スタフィロコッカス・ア
ウレウスに感染した動物モデルにおいて、かかる遺伝的
免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面蛋
白の不変領域をコードすることが示されている、説明し
たポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグメン
トを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的また
は治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピトー
プを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動物、
とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロコッ
カス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の開発
のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成功した動
物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体をう
まく調製することを可能にすると思われる。

【００７２】ポリペプチドを宿主接種用抗原として用い
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。

【００７３】また本発明は、適切な担体と一緒になった
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば
皮下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好
ましい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性無菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性無菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に無
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。投与量
はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により
容易に決定できる。本発明を特定のｂｍｒＵ蛋白に関し
て説明したが、本発明は天然に存在する蛋白および、実
質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失
または置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含す
ることが理解されよう。

【００７４】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニス
トを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む
診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。

【００７５】本発明ポリペプチドおよびその他の化合物
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の
経路で医薬組成物を投与してもよい。治療において、ま
たは予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例
えば好ましくは等張の無菌水性分散物として個体に投与
できる。別法として、組成物を局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾ
ール等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加
物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならび
に軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ
い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよ
い。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％
であってよく、より通常には重量で処方の約８０％まで
とする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性
物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから
１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与
量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応性に応じ
て変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの典型
例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合
する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲内であ
る。

【００７６】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。この
ようなデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペース
メーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャ
ント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（contin
uous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カ
テーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与
し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全
身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存
在する期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手
技中に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわ
けスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御す
ることもできる。多くの整形外科医は、補てつ関節を有
するヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前
に抗生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅
延性の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻
な合併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴
う。それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に
代わるものとして、活性物質の使用を拡張することが可
能である。上述の治療に加え、一般的には本発明組成物
を創傷の治療薬として使用して、創傷組織に曝露したマ
トリックス蛋白に細菌が付着するのを防いでもよく、歯
科治療においては抗生物質による予防法に代えて、また
はそれと組み合わせて予防的に使用してもよい。

【００７７】別法として、本発明の組成物を用いて挿入
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。本明細書に開示した各文献を、
参照によりその全体が本明細書に記載されているものと
みなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願
も、参照によりその全体が本明細書に記載されているも
のとみなす。

【００７８】

【実施例】以下の実施例は、詳細に説明したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列
決定 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドを、イー・コリ（E.coli）中のスタフィロコッカス・
アウレウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーか
ら得た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのＤ
ＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローンからの配
列決定データを用いて配列番号：１の隣接ＤＮＡ配列を
構築した場合もある。通常の方法、例えば以下の方法１
および２によりライブラリーを製造できる。全細胞ＤＮ
Ａは、スタフィロコッカス・アウレウス WCUH29から、
標準法に準じて単離し、二つの方法のどちらかによりサ
イズ分画する。

【００７９】方法１ 標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーで大腸菌を
感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。 方法２ 全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒｓ
ａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを適切に生じる
１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加水
分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ分
画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメ
ントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベク
ターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラ
リーをパッケージングし、次いでパッケージングしたラ
イブラリーで大腸菌を感染させる。ライブラリーを標準
法により増幅する。

【００８０】実施例２ ｂｍｒＵの特徴づけ感染期間中のスタフィロコッカス・スレウス由来の遺伝
子の発現の決定 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９に感染し
た７２時間目のマウス鼠蹊部由来の壊死脂肪組織または
感染８日目の切除した腎臓を、カオトロピック剤および
ＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在下で効果的に破砕し処理して
動物ＲＮＡおよび細菌ＲＮＡの混合物を得る。安定な調
合物および高収率の細菌ＲＮＡを得るための破砕および
処理の最適条件は、その後のノーザンブロット上におけ
るスタフロコッカス・アウレウスエ １６Ｓ ＲＮＡに特
異的な放射性標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイ
ゼーションの使用にも用いる。得られたＲＮＡについて
のＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡおよび
蛋白不含の調合物は、スタフィロコッカス・アウレウス
ＷＣＵＨ２９の各遺伝子の配列から設計されたユニーク
なプライマーペアーを用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）に適する。

【００８１】ａ）感染のマウス動物モデル（鼠蹊部）か
らのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感染
組織の単離 体積１０ｍｌの滅菌栄養培地（No.2 Oxoid）に、寒天培
養プレートから単離した個々のスタフィロコッカス・ア
ウレウスＷＣＵＨ２９を撒く。３７℃で１６〜２０時間
培養物を好気的にインキュベーション（静置培養）す
る。このスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９
ブロス培養物（ブロス中に約１０⁸ｃｆｕ／ｍｌとなる
よう希釈）０．５ｍｌを右前足の大腿部（鼠蹊部）に皮
下注射することにより４週齢のマウス（メス、１８〜２
２ｇ、ＭＦ１株）をそれぞれ感染させる。感染後２４時
間は、マウスを定期的にモニターすべきであり、その
後、研究終了まで毎日モニターすべきである。全身感染
の徴候、すなわち、昏睡、逆立った毛、群れからの離脱
を示す動物を詳細にモニターすべきであり、徴候が瀕死
状態に至る場合には動物を即座に除去すべきである。傷
害進展を示す外部から目で見てわかる徴候は感染２４〜
４８時間後に現れるであろう。動物の腹部の試験によ
り、皮膚下の膿瘍の盛り上がった輪郭が示されるであろ
う。局所的な傷害は右の下大腿部にとどまるはずである
が、場合によっては左の下大腿部および上に広がって胸
部に至るかもしれない。場合によっては、膿瘍が皮膚層
から破裂してくるかもしれない。このような場合、感染
動物を即座に除去し、可能ならば組織をサンプリングす
る。動物を除去しないと、膿瘍を覆っている壊死皮膚組
織が脱落し、腹部筋肉壁が露出するかもしれない。感染
から約９６時間後に、二酸化炭素による窒息を用いて動
物を殺す。死亡と組織処理／保存との間の時間を最短に
するために、グループにおいてではなく、個々にマウス
を殺すべきである。死亡したマウスを仰向けに置き、７
０％アルコールで毛を横向けに拭く。左下大腿部から腹
部へと、はさみを用いる最初の皮膚の切開を行い、次い
で、胸部を切る。腹部から右の下大腿部への切開により
切開を完了する。腹膜を貫通しないように注意すべきで
ある。鉗子で皮膚を固定し、含むから皮膚を静かに引っ
張る。腹膜を覆っているが通常には筋肉シートを完全に
は貫通していない、露出した膿瘍を切除するが、内蔵を
傷つけないように注意する。液体窒素中での迅速凍結の
前に、膿瘍／筋肉シートおよび他の感染組織を切片化す
る必要があるかもしれない。切片化によりプラスチック
製収集バイアル中での保存が容易となる。

【００８２】ｂ）血液原性腎盂腎炎のネズミのモデルか
らのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９感染
組織の単離 エス・アウレウスＷＣＵＨ２９の一晩培養を、５ｍｌの
トリプリン消化ソイブロス（ＴＳＢ）中で開始し、振盪
しながら３７℃で増殖させる。次いで、滅菌金酸塩緩衝
化セイライン（ＰＢＳ）で培養物をを２回洗浄し、希釈
してＡ６００＝０．３とする。ツベルクリン用シリンジ
に装着した３０ｇの注射針を用いて尾の静脈に接種する
ことにより、オスのＣＤ−１マウス（体重１８〜２０
ｇ）をこの懸濁液０．２ｍｌで感染させる。このやり方
で各マウスは４ｘ１０⁷個の細菌を与えられる。疾病の
徴候についてマウスを毎日モニターし、通常には、４８
時間以内に昏睡状態、逆立った毛、不活発さの徴候が見
られ、実験終了前に瀕死と思われる動物を安楽死させ
る。感染７日後、二酸化炭素過剰摂取によりすべての動
物を安楽死させる。動物を仰向けに置き、エタノールで
拭き、次いで、ＲＮＡＺａｐで拭く。器具も同様に拭
く。腹腔を開き、腎臓を無菌的に取り、４片に切り、凍
結バイアルに入れ、即座に液体窒素で凍結する。

【００８３】ｃ）感染組織試料からのスタフィロコッカ
ス・アウレウスＷＣＵＨ２９の単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の４〜６個の感染組織試料
（各０．５〜０．７ｇ）を−８０℃の貯蔵庫からドライ
アイス−エタノール浴中に取り出す。微生物安全キャビ
ネット中で試料を破砕し、残った試料をドライアイス−
エタノール浴中で保存する。組織試料中の細菌を破砕す
るために、TRIzol Reagent（Gibco BRL,Life Technolog
ies）を添加し、次いで、０．１ｍｍジルコニア／シリ
カビーズをチューブにほとんどいっぱいになるまで満た
し、ネジの部分にビーズか付かないように注意してふた
をして、良好な密閉状態を保ち、エアロゾル発生をなく
す。次いで、試料をMini-BeadBeater Type BX-4（Biosp
ec Products）でホモジナイズする。壊死脂肪組織を５
０００ｒｐｍで１００秒間処理して細菌溶解物を得る。
インビボで増殖した細菌はインビトロで増殖したスタフ
ィロコッカス・アウレウス（３０秒のビーズ処理で破砕
される）よりも長時間処理を要する。ビーズ処理後、フ
ーム−フード（fume-hood）中で開栓する前に、氷でチ
ューブを冷却する。なぜなら、破砕中に熱が発生し、TR
Izolが分解され、シアニドが有利する可能性があるため
である。次いで、２００ｍｌのクロロホルムを添加し、
チューブを手で１５秒間振盪して完全に混合する。室温
で２〜３分後、チューブを１２０００ｘｇ、４℃で遠心
分離し、TRIzol Reagentの製造者による方法によりＲＮ
Ａ抽出を続行する。すなわち、約０．６ｍｌの水相を滅
菌エッペンドルフチューブに移し、０．５ｍｌのイソプ
ロパノールを添加する。室温で１０分後、試料を１２０
００ｘｇ、４℃で１０分遠心分離する。上清を取って捨
て、次いで、ＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％エタノー
ルで洗浄する。短時間ボルテックス撹拌して試料を混合
し、その後７５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離する。
エタノールを除去し、ＲＮＡペレットを５分以上減圧乾
燥する。次いで、試料を１００マイクロリットルのＤＥ
ＰＣ処理水中に繰り返しピペッティングすることにより
再懸濁し、次いで、５５℃で５〜１０分置く。最後に氷
上で少なくとも１分置いた後、２００ユニットのＲｎａ
ｓｉｎ（Promega）を添加する。ＲＮＡ調合物は−８０
℃で１カ月まで保存される。長期保存には、プロトコー
ルの洗浄段階における７５％エタノール中のＲＮＡ沈殿
は−２０℃で少なくとも１年保存できる。１％アガロー
スゲル上に試料を泳動することにより単離ＲＮＡの品質
を評価する。臭化エチジウム染色した１ｘＴＢＥゲルを
用いて収集全ＲＮＡを可視化する。感染組織からの細菌
ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、２．２Ｍホ
ルムアルデヒドゲルで泳動を行い、Hybond-N（Amersha
m）に減圧ブロッティングする。次いで、ブロットを、
スタフィロコッカス・スレウスの１６Ｓ ｒＲＮＡに特
異的な³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブ（K. Greis
en, M. Loeffelholz,A. Purohit and D. leong. J. Cli
n. (1994) Microbiol. 32 335-351）とハイブリダイゼ
ーションさせる。配列：５’−gctcctaaaaggttactccacc
ggc−３’のオリゴヌクレオチドをプローブとして使用
する。ハイブリダイゼーションしているバンドのサイズ
を、インビボ増殖したスタフィロコッカス・アウレウス
ＷＣＵＨ２９から単離された対照ＲＮＡのものとノーザ
ンブロットにおいて比較する。全ＲＮＡ試料中において
正しいサイズの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡバンドが検出で
き、ＴＢＥゲル上で可視化した場合、哺乳動物ＲＮＡの
分解が示される。

【００８４】ｄ）スタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９由来のＲＮＡからのＤＮＡの除去 最終体積９０マイクロリットルのバッファー（２００ユ
ニットのRnasin（Promega）を添加補足）中で、３ユニ
ットのＤＮＡａｓｅＩ（増幅グレード）（GibcoBRL, Li
fe Technologies）を用いて、氷上で１５分処理するこ
とにより、７３マイクロリットルのＲＮＡ試料からＤＮ
Ａを除去した。製造者のプロトコールに従ってTRIzol L
S試薬（Gibco BRL, Life Technologies）によりＤＮＡ
ａｓｅを不活性化し除去した。ＤＮＡａｓｅ処理したＲ
ＮＡを、Ｒｎａｓｉｎを添加したＤＰＥＣ処理水７３マ
イクロリットル中に再懸濁した。

【００８５】ｅ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤ
ＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの
試料１０マイクロリットルを、First Strand cDNA合成
キット用のSuperScript Preamplification System（Gib
co BRL, Life Technologies）を用いて逆転写する。１
ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始
する。SuperScripItI逆転写酵素を添加しない対照も反
応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処理
し、次いで、ＰＣＲ反応に供する。

【００８６】ｆ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるための
ＰＣＲの使用 下記成分を添加することにより氷上で０．２ｍｌのチュ
ーブにおいてＰＣＲ反応物をセットアップする：４５マ
イクロリットルのPCR SUPERMIX（Gibco BRL, Life Tech
nologies）；マクロリットルの５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂（最
終濃度２．５ｍＭとする）；１マイクロリットルのＰＣ
Ｒプライマー（最適には、１８〜２５塩基対の長さで、
類似のアニーリング温度を有するように設計されたも
の）（各プライマーは初発濃度１０ｍＭ）；および５マ
イクロリットルのｃＤＮＡ。Perkin Elmer GeneAmp PCR
System 9600においてＰＣＲ反応を行った：９５℃で５
分、次いでそれぞれ９４℃、５０℃そして７２℃で３０
秒を５０サイクル、その後７２℃で３分、次いで、保持
温度４℃とする（最適には、ＰＣＲ生成物の出現または
欠乏を決定するためのサイクル数は３０〜５０回、ＲＴ
反応からの初発ｃＤＮＡ量の評価を行う場合には、最適
には８〜３０サイクル）。次いで、１０マイクロリット
ルの部分試料を１％ １ｘＴＢＥゲルで泳動し、臭化エ
チジウム染色する。ＰＣＲ生成物については、存在する
ならば、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Gibco BRL, Life
Technologies）との比較によりサイズを評価する。別法
として、便利には、標識ＰＣＲプライマー（例えば、
５’末端を標識したもの）を用いてＰＣＲ生成物を標識
し、ＰＣＲ生成物の適当な部分試料をポリアクリルアミ
ドゲルで泳動し、適当なゲルスキャンニングシステム
（例えば、Perkin Elmerにより提供されるGeneScanTMソ
フトウェアを用いたABI PrismTM 377 Sequencer）を用
いてその存在および量を調べる。ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋
／−逆転写酵素反応物、非転写スタフィロコッカス・ア
ウレウスＷＣＵＨ２９ゲノム配列からＰＣＲ生成物を生
じるように設計された１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーもし
くはＤＮＡ特異的プライマーペアーを含んでいてもよ
い。プライマーペアーの効率を試験するために、それら
をスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９全ＤＮ
Ａを用いるＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応をセ
ットアップし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイクログラム
のＤＮＡを用いて上記のごとく３５サイクルのＰＣＲ反
応を行う。ＤＮＡ ＰＣＲまたはＰＴ／ＰＣＲのいずれ
においても予想サイズの生成物を生じないプライマーペ
アーはＰＣＲ反応できず、そのようなものとしては不均
一である。ＤＮＡ ＰＣＲで正しいサイズの生成物を生
じるものは２つのクラスに分類される：１．インビボで
転写されない遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲにおいて生
成物を生じる再現性がないもの；および２．インビボで
転写される遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲにおいて正し
いサイズの生成物を再現性をもって生じ、＋ＲＴ試料に
おいて−ＲＴ対照におけるシグナル（生じた場合には）
よりも強力なシグナルを生じるもの。

【００８７】

【配列表】

（１）一般的情報： （ｉ）出願人：Burnham, Martin Lonetto, Michael Warren, Patrick （ｉｉ）発明の名称：新規ｂｍｒＵ （ｉｉｉ）配列の数：４ （ｖｉ）連絡先： （Ａ）宛て名：Dechert Price & Phoads （Ｂ）通り名：997 Lenox Drive, Building 3, Suite 2
10 （Ｃ）都市名：Lawrenceville （Ｄ）州名：ニュージャージー （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：０８５４３ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）Windowsバージョン２．０用FastSEQ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：Bloom, Allen （Ｂ）登録番号：２９１３５ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０４４４−０１ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６０９−５２０−３２１４ （Ｂ）ファックス番号：６０９−５２０−３２５９ （Ｃ）テレックス：

【００８８】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATGGAAAATA AATATACACA TGGTGTCCTC TTTTACCATG AACACAGTGG ATTAAAAAAT 60 ATTAATCAAG GTATTGGGGA AGTTACAACA GCATTAAGTT CAATTTGTAA GCATCTTTCT 120 ATTCAATTGA GTGAAAACGA AGGTGACATT ATTAAATATT GCCAAGAAAT CAAAACTAAA 180 AACTATGCAA AAGATGTAGA TATATTATTT ATTCTTGGCG GTGATGGCAC GGTTAACGAA 240 CTTATAAATG GTGTTATGTC ACATGACCTT CAACTCCCTA TTGGCATTTT ACCAGGCGGT 300 ACTTTTAATG ATTTTACAAA AACGCTAAAT ATAGCACCTA ATCATAAACA AGCTAGTGAA 360 CAAATGATTT CTGCACAAGT TGGTACATAC GATGTAATTA AAATAAATAA TCAATATGCA 420 CTCAACTTTG TTGGCTTAGG TCTCATTGTT CAAAACGCTG AAAACGTACA AGATGGTTCA 480 AAAGATATAT TTGGTAAATT GAGTTATATT GGATCAACTG TCAAAACACT GCTAAATCCA 540 ACACAATTTA ATTATCAATT ATCAATAGAT GATAAGACAT ATTCTGGCGA AACGCACATG 600 ATACTAACAG CAAATGGTCC ATTCATTGGT GGTAGTCGTA TACCATTGAC TGATTTGTCT 660 CCTCAAGATG GTGAACTGAA CACTTTCATT TTTAATGAAC ACAGTTTCAG TATTTTAAAT 720 GATATTTTTA AAAAGCGTGA TAGCATGAAT TGGAATGAAA TTACTCAAGG TATTGAGCAT 780 ATACCTGGTA AAAAGATTTC ACTTACAACA GATCCAGCAA TGAAAGTTGA TATTGATGGC 840 GAAATTTCAT TAGAAACACC TATTGATATT GAGGTTATAC CAAATGCTAT TCAGTTACTT 900 ACTGTCAATG ATTTG 915

【００８９】（２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Glu Asn Lys Tyr Thr His Gly Val Leu Phe Tyr His Glu His Ser 1 5 10 15 Gly Leu Lys Asn Ile Asn Gln Gly Ile Gly Glu Val Thr Thr Ala Leu 20 25 30 Ser Ser Ile Cys Lys His Leu Ser Ile Gln Leu Ser Glu Asn Glu Gly 35 40 45 Asp Ile Ile Lys Tyr Cys Gln Glu Ile Lys Thr Lys Asn Tyr Ala Lys 50 55 60 Asp Val Asp Ile Leu Phe Ile Leu Gly Gly Asp Gly Thr Val Asn Glu 65 70 75 80 Leu Ile Asn Gly Val Met Ser His Asp Leu Gln Leu Pro Ile Gly Ile 85 90 95 Leu Pro Gly Gly Thr Phe Asn Asp Phe Thr Lys Thr Leu Asn Ile Ala 100 105 110 Pro Asn His Lys Gln Ala Ser Glu Gln Met Ile Ser Ala Gln Val Gly 115 120 125 Thr Tyr Asp Val Ile Lys Ile Asn Asn Gln Tyr Ala Leu Asn Phe Val 130 135 140 Gly Leu Gly Leu Ile Val Gln Asn Ala Glu Asn Val Gln Asp Gly Ser 145 150 155 160 Lys Asp Ile Phe Gly Lys Leu Ser Tyr Ile Gly Ser Thr Val Lys Thr 165 170 175 Leu Leu Asn Pro Thr Gln Phe Asn Tyr Gln Leu Ser Ile Asp Asp Lys 180 185 190 Thr Tyr Ser Gly Glu Thr His Met Ile Leu Thr Ala Asn Gly Pro Phe 195 200 205 Ile Gly Gly Ser Arg Ile Pro Leu Thr Asp Leu Ser Pro Gln Asp Gly 210 215 220 Glu Leu Asn Thr Phe Ile Phe Asn Glu His Ser Phe Ser Ile Leu Asn 225 230 235 240 Asp Ile Phe Lys Lys Arg Asp Ser Met Asn Trp Asn Glu Ile Thr Gln 245 250 255 Gly Ile Glu His Ile Pro Gly Lys Lys Ile Ser Leu Thr Thr Asp Pro 260 265 270 Ala Met Lys Val Asp Ile Asp Gly Glu Ile Ser Leu Glu Thr Pro Ile 275 280 285 Asp Ile Glu Val Ile Pro Asn Ala Ile Gln Leu Leu Thr Val Asn Asp 290 295 300 Leu 305

【００９０】（２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０５０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： ATGGAAAATA AATATACACA TGGTGTCCTC TTTTACCATG AACACAGTGG ATTAAAAAAT 60 ATTAATCAAG GTATTGGGGA AGTTACAACA GCATTAAGTT CAATTTGTAA GCATCTTTCT 120 ATTCAATTGA GTGAAAACGA AGGTGACATT ATTAAATATT GCCAAGAAAT CAAAACTAAA 180 AACTATGCAA AAGATGTAGA TATATTATTT ATTCTTGGCG GTGATGGCAC GGTTAACGAA 240 CTTATAAATG GTGTTATGTC ACATGACCTT CAACTCCCTA TTGGCATTTT ACCAGGCGGT 300 ACTTTTAATG ATTTTACAAA AACGCTAAAT ATAGCACCTA ATCATAAACA AGCTAGTGAA 360 CAAATGATTT CTGCACAAGT TGGTACATAC GATGTAATTA AAATAAATAA TCAATATGCA 420 CTCAACTTTG TTGGCTTAGG TCTCATTGTT CAAAACGCTG AAAACGTACA AGATGGTTCA 480 AAAGATATAT TTGGTAAATT GAGTTATATT GGATCAACTG TCAAAACACT GCTAAATCCA 540 ACACAATTTA ATTATCAATT ATCAATAGAT GATAAGACAT ATTCTGGCGA AACGCACATG 600 ATACTAACAG CAAATGGTCC ATTCATTGGT GGTAGTCGTA TACCATTGAC TGATTTGTCT 660 CCTCAAGATG GTGAACTGAA CACTTTCATT TTTAATGAAC ACAGTTTCAG TATTTTAAAT 720 GATATTTTTA AAAAGCGTGA TAGCATGAAT TGGAATGAAA TTACTCAAGG TATTGAGCAT 780 ATACCTGGTA AAAAGATTTC ACTTACAACA GATCCAGCAA TGAAAGTTGA TATTGATGGC 840 GAAATTTCAT TAGAAACACC TATTGATATT GAGGTTATAC CAAATGCTAT TCAGTTACTT 900 ACTGTCAATG ATTTG 915

【００９１】（２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： Met Glu Asn Lys Tyr Thr His Gly Val Leu Phe Tyr His Glu His Ser 1 5 10 15 Gly Leu Lys Asn Ile Asn Gln Gly Ile Gly Glu Val Thr Thr Ala Leu 20 25 30 Ser Ser Ile Cys Lys His Leu Ser Ile Gln Leu Ser Glu Asn Glu Gly 35 40 45 Asp Ile Ile Lys Tyr Cys Gln Glu Ile Lys Thr Lys Asn Tyr Ala Lys 50 55 60 Asp Val Asp Ile Leu Phe Ile Leu Gly Gly Asp Gly Thr Val Asn Glu 65 70 75 80 Leu Ile Asn Gly Val Met Ser His Asp Leu Gln Leu Pro Ile Gly Ile 85 90 95 Leu Pro Gly Gly Thr Phe Asn Asp Phe Thr Lys Thr Leu Asn Ile Ala 100 105 110 Pro Asn His Lys Gln Ala Ser Glu Gln Met Ile Ser Ala Gln Val Gly 115 120 125 Thr Tyr Asp Val Ile Lys Ile Asn Asn Gln Tyr Ala Leu Asn Phe Val 130 135 140 Gly Leu Gly Leu Ile Val Gln Asn Ala Glu Asn Val Gln Asp Gly Ser 145 150 155 160 Lys Asp Ile Phe Gly Lys Leu Ser Tyr Ile Gly Ser Thr Val Lys Thr 165 170 175 Leu Leu Asn Pro Thr Gln Phe Asn Tyr Gln Leu Ser Ile Asp Asp Lys 180 185 190 Thr Tyr Ser Gly Glu Thr His Met Ile Leu Thr Ala Asn Gly Pro Phe 195 200 205 Ile Gly Gly Ser Arg Ile Pro Leu Thr Asp Leu Ser Pro Gln Asp Gly 210 215 220 Glu Leu Asn Thr Phe Ile Phe Asn Glu His Ser Phe Ser Ile Leu Asn 225 230 235 240 Asp Ile Phe Lys Lys Arg Asp Ser Met Asn Trp Asn Glu Ile Thr Gln 245 250 255 Gly Ile Glu His Ile Pro Gly Lys Lys Ile Ser Leu Thr Thr Asp Pro 260 265 270 Ala Met Lys Val Asp Ile Asp Gly Glu Ile Ser Leu Glu Thr Pro Ile 275 280 285 Asp Ile Glu Val Ile Pro Asn Ala Ile Gln Leu Leu Thr Val Asn Asp 290 295 300 Leu 305

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ０７Ｋ 16/12 16/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 マーティン・カール・ラッセル・バーナム アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州ノ ーリスタウン、タングルウッド・レイン 2927番 (72)発明者 マイケル・アーサー・ロネット アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、ビクトリア・サークル18番 (72)発明者 パトリック・バーノン・ウォーレン アメリカ合衆国19136ペンシルベニア州フ ィラデルフィア、シェフィールド・アベニ ュー3507番 (72)発明者 マイケル・テレンス・ブラック アメリカ合衆国19425ペンシルベニア州チ ェスター・スプリングズ、ミルハウス・ウ ェイ502番 (72)発明者 ジョン・エドワード・ホッジソン アメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マ ルバーン、ラップ・ロード260番 (72)発明者 デイビッド・ジャスティン・チャールズ・ ノウルズ イギリス、アールエイチ１・６エルワイ、 サリー、レッドヒル、クロンクス・ヒル・ ロード45番、ダウンズビュー・ハウス (72)発明者 リチャード・オークリー・ニコラス アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、カーメン・ドライブ355番 (72)発明者 ジュリー・エム・プラット イギリス、ウィグストン・レスター、ハイ フィールド・ドライブ77番 (72)発明者 レイモンド・ウィンフィールド・レイチャ ード アメリカ合衆国18951ペンシルベニア州ク エイカータウン、クローバー・ミル・ロー ド2091番 (72)発明者 マーティン・ローゼンバーグ アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州ロ イヤーズフォード、ミンゴ・ロード241番 (72)発明者 ジュディス・エム・ワード イギリス、サリー、ドーキング、コトマー ンディーン19番、カーメル・コテージ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
   リペプチドコードしているポリヌクレオチドに対して少
   なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）寄託株のスタフィロコッカス・アウレウス中に含
   まれるｂｍｒＵ遺伝子により発現されるのと同じ成熟ポ
   リペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して
   少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも
   ７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
   ードしているポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   に対して相捕的であるポリヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオ
   チドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を
   含む単離ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
   ド。
3. 【請求項３】 ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
   ド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示す核酸配列を含む請求項
   ２のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号１に示すヌクレオチド１から９
   １５までを含む請求項２のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
   ペプチドをコードしている請求項２のポリヌクレオチ
   ド。
7. 【請求項７】 請求項１のポリヌクレオチドを含むベク
   ター。
8. 【請求項８】 請求項７のベクターを含む宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項８の宿主細胞から上記ＤＮＡによ
   りコードされているポリペプチドを発現させることを含
   む、ポリペプチドの製造方法。
10. 【請求項１０】 ｂｍｒＵポリペプチドまたはフラグメ
    ントの製造方法であって、該ポリペプチドまたはフラグ
    メントの生成に十分な条件下で請求項８の宿主を培養す
    ることを含む方法。
11. 【請求項１１】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して
    少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
    プチド。
12. 【請求項１２】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
    むポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１のポリペプチドに対する抗
    体。
14. 【請求項１４】 請求項１１のポリペプチドの活性また
    は発現を阻害するアンタゴニスト。
15. 【請求項１５】 治療上有効量の請求項１１のポリペプ
    チドを個体に投与することを含む、ｂｍｒＵポリペプチ
    ドを必要とする個体の治療方法。
16. 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１４のアンタゴ
    ニストを個体に投与することを含む、ｂｍｒＵポリペプ
    チドの阻害を必要とする個体の治療方法。
17. 【請求項１７】 個体における請求項１１のポリペプチ
    ドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であっ
    て、 （ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定
    すること、および／または （ｂ）個体由来の試料中の該ポリペプチドの存在または
    量について分析すること を含む方法。
18. 【請求項１８】 請求項１１のポリペプチドと相互作用
    して、その活性を阻害または活性化する化合物の同定方
    法であって、 化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条
    件下で、ポリペプチドとスクリーニングすべき化合物と
    を接触させて化合物の相互作用を評価し（かかる相互作
    用はポリペプチドと化合物との相互作用に応答した検出
    可能シグナルを提供しうる第２の成分に関連したもので
    ある）、 次いで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じ
    るシグナルの存在または不存在を検出することにより、
    化合物がポリペプチドと相互作用して、その活性を活性
    化または阻害するかどうかを決定することを含む方法。
19. 【請求項１９】 哺乳動物における免疫学的応答を誘導
    する方法であって、抗体および／またはＴ細胞を生じさ
    せて動物を疾病から防御するに十分な請求項１１のｂｍ
    ｒＵポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種
    を哺乳動物に接種することを含む方法。
20. 【請求項２０】 哺乳動物における免疫学的応答を誘導
    する方法であって、ｂｍｒＵポリペプチドまたはそのフ
    ラグメントもしくは変種をインビボで発現させて、抗体
    および／またはＴ細胞を生じさせる免疫学的応答を誘導
    して該動物を疾病から防御するするために、請求項１１
    のｂｍｒＵポリペプチドまたはそのフラグメントもしく
    は変種の発現を指令する核酸ベクターを送達することを
    含む方法。