JP2000509985A - 新規化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 応答レギュレーターポリペプチドおよび応答レギュレーターポリペプチドをコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法、ならびに抗微生物化合物のスクリーニングのための応答レギュレーターポリペプチドの使用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規化合物 本発明は、１９９６年５月１日出願の英国出願第９６０９０２１．２号の利益 を主張する。 発明の分野 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに それらの製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニ スト、そしてそれらの使用に関する。詳細には、これらの点および他の点に関し て、本発明は、応答レギュレーターファミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポ リペプチド（以下、「応答レギュレーター」という）に関する。 ストレプトコッカス属（Streptococci）は医学的に重要な微生物属を形成して おり、ヒトにおいて、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎 、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎を包 含する、いくつかの型の疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコッ カス属の単離から１００年以上も経過しているため、ストレプトコッカス・ニュ ーモニアエ（Streptococcus pneumoniae）は、より詳細な研究がなされた微生物 の一つである。例えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であるという初期の見解の大部 分は、この微生物を用いたGriffithならびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの 研究において述べられた。ストレプトコッカス・ニューモニアエに関する研究は 膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性に関しては多くの疑問が残されてい る。抗生物質の開発のための標的としてストレプトコッカス属の遺伝子および遺 伝子産物を用いるのはとりわけ好ましいことである。 ストレプトコッカス・ニューモニアエ感染の頻度は過去２０年間に劇的に上昇 している。これは多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の集団 の増加に起因している。いくつかのまたは全ての標準的な抗生物質に対して耐性 を有するストレプトコッカス・ニューモニアエ株を単離することはもはやめずら しいことではない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌剤、ワクチンおよび 診断試験についての必要性を形成した。 病原性に関連したある種のストレプトコッカスの因子、例えば、きよう膜多糖 、ペプチドグリカン、ニューモリシン、ＰｓｐＡ補体因子Ｈ結合成分、オートリ シン、ノイラミニダーゼ、ペプチドパーメアーゼ、過酸化水素、ＩｇＡ１プロテ アーゼが同定されているが、それらがすべてではない。さらに、哺乳動物宿主に おける感染および疾病の進行中におけるかかる遺伝子の一時的発現に関してはほ とんどわかっていない。細菌は感染の異なる段階、詳細には感染が確立された時 に発現される可能性がある細菌の遺伝子のセットを発見することは、発症を妨害 しうる新規抗微生物剤のスクリーニングおよび特徴づけに関する重要な情報を提 供する。かかるアプローチは、既知蛋白についてのより十分な理解を提供するこ とのほかに、従来認識されていなかった標的を同定するであろう。 多くの２成分シグナルトランスダクション系（ＴＣＳＴＳ）が細菌において同 定されている（Stock，J．B.，Ninfa，A．J．& Stock，A．M．（1989）Microbio l．Rev．53，450-490）。これらは周囲の環境をモニターし、その環境の変化に 対応する細菌の能力に関与している。これらの細菌のＴＣＳＴＳのいくつかは宿 主内の毒性および細菌性の発病に関与している。 応答レギュレーターはＴＣＳＴＳの成分である。これらの蛋白はヒスチジンキ ナーゼによりリン酸化され、次いで、一旦リン酸化されると、しばしばＤＮＡ結 合ドメインを介する応答が活性化される。応答レギュレーターは約１００個のア ミノ酸の保存されたＮ末端ドメインにより特徴づけられる。応答レギュレーター のＮ末端ドメインならびにＣｈｅＹ（Matsumura，P.，Rydel，J．J.，Linzmeier ，R．& Vacante，D．（1984）J．Bacteriol．160，36-41）におけるＤ１２、Ｄ １３、Ｄ５７、Ｔ８７およびＫ１０９に対応する５個の重要な残基を保持してい ることが、構造的特徴を形成している(Volz，K．(1993)Biochemistry 32，11741 −11753)。 Salmonella typhimurium(Stock，A．M.，Mottonen，J．M.，Stock，J．B．& Sch utt，C．E．(1989)Nature，337，745-749)およびEscherichia coli(Volz，K & M atsumura， P．(1991)J．Biol．Chem．266，15511-15519)由来のＣｈｅＹの３次元構造、お よびS.typhimurium由来の窒素調節蛋白ＣのＮ末端ドメイン（Volkman，B．F.，N ohaile，M．J.，Amy，N．K.，Kutsu，S．& Wemmer，D．E．(1995)Biochemistry ，34 1413-1424）が、Bacillus subtilis由来のＳｐｏＯＦの２次構造（Feher， V．A.，Zapf，J．W.，Hoch，J．A.，Dahlquist，F．W.，Whiteley，J．M．& Cav anagh，J．(1995)Protein Science，4，1801−1814）と同様に利用可能である。 これらの構造は（ａ／ｂ）５折り畳みを有する。異なる応答レギュレーター配列 間で、詳細にはβ−シート疎水性コアおよびα−ヘリックス由来の部位において いくつかの構造残基が保存されている。この応答レギュレーターのファミリーは 、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)のＹＹＣＦ蛋白を包含する。ＹＹＣ Ｆはビー・ズブチリス染色体のＲｏｃＲ−ＰｕｒＡ遺伝子間領域に見いだされる 仮定上の応答レギュレーターである（Ogasawara，N.，Nakai，S．& H．Yoshikaw a(1994)DNARes １：1-14）。 ヒスチジンキナーゼは、ヒスチジンを自己リン酸化するＴＣＳＴＳの成分であ る。次いで、リン酸基は同種の応答レギュレーターに転移される。ヒスチジンキ ナーゼは５つの短い保存されたアミノ酸配列を有している（Stock，J．B.，Ninf a，A．J．& Stock，A．M．(1989)Microbiol．Rev．53，450-490、Swanson，R．V .，Alex，L．A．& Simon，M．I．(1994)TIBS 19 485-491）。これらはリン酸化 されたヒスチジン残基であり、約１００残基後に保存されたアスパラギン残基が 続いている。さらに１５ないし４５残基後にＤＸＧＸＧモチーフが見られ、さら に１０〜２０残基後にＦＸＸＦモチーフがある。さらに１０〜２０残基行ったと ころにもう１つのグリシンモチーフＧＸＧが見られる。２つのグリシンモチーフ はヌクレオチド結合に関与していると考えられる。 毒性因子の生成、運動性、抗生物質耐性および細胞複製はＴＣＳＴＳにより調 節されるプロセスである。ＴＣＳＴＳ蛋白の阻害剤は、発症に必要な因子を生成 を妨害することにより細菌が宿主感染を確立し維持することを妨害し、それゆえ 、抗細菌療法において有用である。 明らかに、抗生物質活性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である という目下の利益を有する、本発明新規化合物のごとき因子に対する必要性があ る。かかる因子は、感染、機能不全および疾病の発生におけるそれらの役割を調 べるのにも有用である。感染、機能不全または疾病の予防、改善または修正にお いて役割を果たしうる、かかる因子ならびにそれらのアンタゴニストおよびアゴ ニストに対する必要性もある。 本発明ポリペプチドは、既知のバチルス・ズブチリスのＹＹＣＦ蛋白に対する アミノ酸配列相同性を有する。 本発明の概要 表１（配列番号：２）に示すアミノ酸配列および既知アミノ酸配列またはバチ ルス・ズブチリスのＹＹＣＦ蛋白のごとき他の蛋白の配列の間の相同性により、 新規応答レギュレーターポリペプチドであると同定されたポリペプチド提供する ことが本発明の目的である。 応答レギュレーターポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、詳細に は本明細書で応答レギュレーターと命名されたポリペプチドをコードしているポ リヌクレオチドを提供することが本発明のさらなる目的である。 本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、表１(配列番号 ：１)に示す配列を含む応答レギュレーターポリペプチドをコードする領域を含 み、全長遺伝子またはその変種が包含される。 本発明のもう１つの特に好ましい具体例において、表１（配列番号：２）のア ミノ酸配列を含むストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の新規応答レギュレ ーター蛋白、またはその変種がある。 本発明のもう１つの態様によれば、寄託株に含まれるストレプトコッカス・ニ ューモニアエ0100993株により発現可能な成熟ポリペプチドをコードしている単 離核酸分子が提供される。 本発明のさらなる態様は、応答レギュレーター、詳細にはストレプトコッカス ・ニューモニアエの応答レギュレーターをコードしている単離核酸分子が提供さ れ、それにはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明のさらな る具 体例は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なその変種 、およびそれらを含む組成物を包含する。 本発明のもう１つの態様によれば、治療または予防を目的とした、特に遺伝学 的免疫を目的とした、本発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明の特 に好ましい具体例には、応答レギュレーターの天然に存在する対立遺伝子変種お よびそれによりコードされるポリペプチドがある。 本発明のもう１つの態様において、本明細書において応答レギュレーターと称 されるストレプトコッカス・ニューモニアエの新規ポリペプチド、ならびに生物 学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なそのフラグメント、変 種および誘導体、および前記したフラグメントおよびアナログの変種および誘導 体、およびそれらを含む組成物が提供される。 本発明の特に好ましい具体例には、応答レギュレーター遺伝子の天然に存在す る対立遺伝子によりコードされる応答レギュレーターポリペプチドの変種がある 。 本発明の好ましい具体例において、上記応答レギュレーターポリペプチドの製 造方法がある。 本発明のさらに別の態様によれば、例えば、抗体を含め、抗細菌剤として有用 なかかるポリペプチドの阻害剤が提供される。 本発明の特定の好ましい具体例によれば、応答レギュレーター発現の評価、疾 病の治療、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸およ び心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎の治療、遺伝学 的変異のアッセイ、ならびに細菌、特にストレプトコッカス・ニューモニアエ細 菌に対する免疫学的応答を生起するための生物への応答レギュレーターポリペプ チドまたはポリヌクレオチドの投与のための、製品、組成物および方法が提供さ れる。 本発明のこのおよび他の態様の特定の好ましい具体例によれば、特に、厳密な 条件下で応答レギュレーターポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションす るポリヌクレオチドが提供される。 本発明の特定の好ましい具体例において、応答レギュレーターポリペプチドに 対する抗体が提供される。 本発明の他の具体例において、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの 結合、あるいは相互作用して、それらの活性を阻害または活性化する化合物の同 定方法が提供され、該方法は、化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドと の間の結合あるいは他の相互作用を可能にする条件下で、本発明ポリペプチドま たはポリヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、化合物との 結合あるいは他の相互作用を評価し（かかる結合または相互作用は、ポリペプチ ドまたはポリヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互作用に応答して検出可 能なシグナルを提供することのできる第２の化合物に関連している）、次いで、 化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用から生じ るシグナルの存在または不存在を検出することにより、化合物がポリペプチドま たはポリヌクレオチドに結合あるいは相互作用して、それらの活性を活性化また は阻害するかどうかを決定することを含む。 本発明のさらにもう１つの態様によれば、応答レギュレーターのアゴニストお よびアンタゴニスト、好ましくは静細菌性または殺細菌性アゴニストおよびアン タゴニストが提供される。 本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に投与するための、 応答レギュレーターポリヌクレオチドまたは応答レギュレーターポリペプチドを 含む組成物が提供される。 開示した本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載 を読むこと、および本明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易に 明らかとなろう。 用語 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用される特定の用語の理 解を容易にするために示すものである。 「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランス フェクションされた、または形質転換またはトランスフェクションすることので きる細胞である。 当該分野にて周知であるように「同一性」は、配列を比較して測定されるよう な、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間または二つまたはそれ以上のポリ ヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、時 には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により決定されるような２つのポリペプ チドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」お よび「類似性」はともに既知方法により容易に算出できる(Computational Molecul ar Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニ ューヨーク、1988年；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith ,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993年;Computer Analysis of Sequence Data,パートI,Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレ ス、ニュージャージー、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSequence Analysis Primer ，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、 1991年;およびCarillo,H.,およびLipman,D.,SIAM J.，Applied Math.，48:1073( 1988)があるがこれらに限らない)。同一性を決定するための好ましい方法は、試 験する２つの配列間で最も良く適合するように設計される。同一性および類似性 を測定する方法は、公に利用できるコンピュータープログラムに集成されている 。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータープログ ラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J．ら、Nucleic Acids Rese arch 12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec .Biol.215：403（1990）））を包含するが、これらに限定されるものではない。 一例として、配列番号：１の対照ヌクレオチド配列に対して、例えば少なくとも ９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを挙げると 、そのポリヌクレオチド配列が配列番号：１の対照ヌクレオチド酸配列のヌクレ オチド１００個ごとに５個までのヌクレオチドの変化を含みうることを除き、そ のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は対照配列と同一である。言い換えると 、対照酸配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポ リペプチドを 得るためには、対照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレオ チドと置換されていてもよく、あるいは対照配列中の全ヌクレオチドのうち５％ までの数のヌクレオチドが対照配列に挿入されたものであってもよい。対照配列 のこれらの変異は、対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置に存在して いてもよく、あるいはそれらの末端位置の間のいずれかの位置に存在していても く、対照配列のヌクレオチドに散在していてもよく、あるいは対照配列内の１個 またはそれ以上の一連の群となっていてもよい。同様に、配列番号：２の対照ア ミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有 するポリペプチドを例に挙げると、そのポリペプチド配列が配列番号：２の対照 アミノ酸配列のアミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含みうるこ とを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対照配列と同一である。言い換え ると、対照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有 するポリペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ酸の５％までが欠失また は他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸のうち ５％までの数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであってもよい。対照配 列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位 置に存在してもよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存在してもよ く、対照配列中に散在していてもよく、あるいは対照配列内で１個またはそれ以 上の一連の群をなしていてもよい。 「単離」とは、「人の手によって」天然の状態から変化させられた、すなわち 、天然物の場合、その本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行われ たことを意味する。例えば、天然において生体に存在するポリヌクレオチドまた はポリペプチドは、「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から 分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用いる用語 としての「単離」がなされている。 「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、一般に、修飾されていないＲＮＡも しくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリリボ ヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをも意味する。従って、「ポ リヌクレオチド」は、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖 領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一 本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮ Ａ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および 二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子 を包含するがこれらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌクレオチド 」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意 味する。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよい 。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、 より典型的にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一 つは、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。本明細書で用いる場合 、「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有 する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安定性または他の 理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書が意図するろと ころの「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基、ま たはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ(二つの例だけを示 す)も、本明細書での用語ポリペプチドである。当業者に既知の多くの有用な目 的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修飾がなされていることは、 明らかであろう。「ポリヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポ リヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾した形態、なら びにウイルス、とりわけ単純型細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤ ＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしば 、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称される短鎖ポリヌクレオチドを包含す る。 本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ペプチド結合により直鎖で互いに結合 している２個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうのに用 いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプチドお よびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に 蛋白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされ る２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、 プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程により、ならびに化学 修飾によるものを包含する。かかる修飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な 論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知 である。同じタイプの修飾がポリペプチド中にいくつかの部位に同程度または種 々の程度で存在してもよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨格、 アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末端を包含するポリペプチドの いずれの場所にあってもよい。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、 ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌ クレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有 結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結 合形成、脱メチル化、共有結合架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形 成、ホルミル化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、 ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水分解プ ロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アル ギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーシ ョンがある。例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties、第２版 、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1993）に記載され ている。例えば、Posttranslational Covalent Modification of Proteins、B.C .Johnson編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.，Posttra nslational Protein Modifications：Perspective and Prospects、1〜12頁；Se ifterら、Meth.Enzymol．182:626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthe sis：Posttranslational Modifications and Aging，Ann．N．Y．Acad．Sci．66 3:48-62(1992)参照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなしの環状 であってもよい。環状、分枝状、および分枝状かつ環状のポリペプチドは、翻訳 後の天然プロセスから生じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ り製造されるものであってもよい。 本明細書で用いる「変種」なる用語は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプ チドとは各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的な特 性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変種は、別の対照ポリヌクレオ チドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポ リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるも のであってもよく、変化させないものであってもよい。以下に論じるように、ヌ クレオチドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリペプチドにおけ るアミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断を招く。典型的なポリペプチ ドの変種は、別の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、差 異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に非常に類似しており、多 くの領域で同一なものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、１またはそ れ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配 列が変化し得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードにより コードされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチ ドの変種は、例えば対立遺伝子変種のような自然発生的なものでもよく、または 自然発生することが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリ ペプチドの非自然発生変種は、突然変異技術または直接的合成、および当業者に 知られた他の組み換え法により製造できる。 発明の説明 本発明は、とりわけ、以下に非常に詳細に説明する、新規応答レギュレーター ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、バチルス ・ズブチリスのＹＹＣＦポリペプチドに対するアミノ酸配列相同性により関連付 けられる、ストレプトコッカス・ニューモニアエの新規応答レギュレーターのポ リペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、それぞれ表１（配 列番号：１）および表１（配列番号：２）に示すヌクレオチド配列およびアミノ 酸配列を有する応答レギュレーターに関し、さらに寄託株中のＤＮＡの応答レギ ュレーターヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列に関す る。 表１ 応答レギュレーターのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 （Ａ）ストレプトコッカス・ニューモニアエの応答レギュレーターポリヌクレオ チド配列由来の配列[配列番号：１]. （Ｂ）この表中のポリヌクレオチド配列から推定される応答レギュレーターポリ ペプチド配列[配列番号：２].（Ｃ）ポリヌクレオチド配列の具体例[配列番号：1]. （Ｄ）ポリペプチド配列の具体例[配列番号：２]. （Ｅ）ストレプトコッカス・ニューモニアエの応答レギュレーターポリヌクレオ チドのＯＲＦ配列由来の配列[配列番号：３] （Ｆ）この表中のポリヌクレオチドＯＲＦ配列から推定される応答レギュレータ ーポリペプチド配列[配列番号：４] 寄託物質 ストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993株を含有する寄託物は、ナショ ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・ リミテッド（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカードライブ、アベル ディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに１９９６年４月１１日寄託し、ＮＣＩ ＭＢ受託番号４０７９４が付与された。寄託したことにより、寄託株をストレプ トコッカス・ニューモニアエ0100993株という。１９９６年４月１７日に、イー ・コリ（E．coli）中のストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993ＤＮＡライ ブラリーをＮＣＩＭＢに同様に寄託し、受託番号４０８００を付与された。スト レプトコッカス・ニューモニアエ株寄託物を、本明細書では「寄託株」または「 寄託株のＤＮＡ」という。 寄託株は全長の応答レギュレーター遺伝子を含んでいる。寄託株中に含まれる ポリヌクレオチド配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸 配列は、本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾する事象において支配的であ る。 寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条 約の条件下でなされている。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、 最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ. Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承 認するものではない。 寄託物を製造、使用または販売するためにはライセンスが必要であるが、その ようなライセンスはここでは賦与されていない。 ポリペプチド 本発明ポリペプチドは表１［配列番号：２］のポリペプチド（詳細には、成熟 ポリペプチド）ならびにポリペプチドおよびフラグメント、詳細には応答レギュ レーターの生物学的活性を有するものを包含し、さらに表１［配列番号：２およ び４］のポリペプチドまたはその重要部分に対して少なくとも７０％、好ましく は表１［配列番号：２および４］のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同 一性を有するポリペプチドおよびフラグメント、より好ましくは表１［配列番号 ：２および４］のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似性を有し（より 好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有し）、さらにより好ましくは表１［ 配列番号：２および４］のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性を有 する（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する）ポリペプチド およびフラグメント、さらに通常には少なくとも３０個、より好ましくは少なく とも５０個のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を包含する。 また本発明は表１（Ｄ）［配列番号：２］に示す式のポリペプチドを包含し、 式中のアミノ末端においてＸは水素であり、カルボキシル末端においてＹは水素 または金属であり、Ｒ₁およびＲ₂はアミノ酸残基、ｎは１ないし１０００の整数 である。いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも多い）により示されるアミノ酸残基の 伸長部分はヘテロポリマーであってもホモポリマーであってもよく、好ましくは ヘテロポリマーである。 フラグメントは、前述のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてではなく一部に 対して全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。応答レギ ュレーターポリペプチドについては、フラグメントは「独立して存在(free stand ing)」 しているか、または一部分もしくは領域を形成することにより、大型のポリペプ チド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続した領域、すなわち大 型の単一ポリペプチドとして含まれる。 好ましいフラグメントは、表１［配列番号：２および４］のアミノ酸配列の一 部分を有する末端切断されたポリペプチド、またはそれらの変種を包含するが、 その例としてはアミノ末端を含む一連の残基を切断、またはカルボキシル末端を 含む一連の残基を切断したものがある。宿主、とりわけストレプトコッカス・ニ ューモニアエにおける、本発明のポリペプチドの分解形態もまた好ましい。また 、構造的または機能的属性により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファ ーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータ シート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、 親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変 領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフラグメン トなども好ましい。 応答レギュレーター活性を媒介し、あるいは活性を改善し、望ましくない活性 を減じられたフラグメントである生物学的に活性のあるフラグメントも好ましい 。動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的なフラグメントもまた含ま れる。個体、特にヒトにおけるストレプトコッカス・ニューモニアエの生存に必 須の機能、あるいは疾病を開始または維持する能力を付与する酵素の受容体また はドメインを含むフラグメントが特に好ましい。 本発明ポリペプチドのフラグメントである変種を、ペプチド合成による対応全 長ポリペプチドの製造に使用してもよく、それゆえ、これらの変種を全長のポリ ペプチド製造のための中間体として用いてもよい。本発明ポリヌクレオチドのフ ラグメントである変種を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成してもよ い。 ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するものであり、それには表１ ［配列番号：２および４］の推定アミノ酸配列を有する応答レギュレーターポリ ペプチドをコードする全長遺伝子およびそれに密接に関連するポリヌクレオチド およびそれらの変種が包含される。 本明細書に提供される情報を用いて、例えば表１［配列番号：１および３］に 示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質ストレプトコッカス・ニューモニア エ0100993細胞からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定 するために用いるような標準的なクローニングおよびスクリーニングを用いて、 応答レギユレーターポリペプチドをコードしている本発明ポリヌクレオチドを得 て、次いで、全長のクローンを得てもよい。例えば、本発明ポリヌクレオチド配 列、例えば表１［配列番号：１および３］に示す配列を得るために、イー・コリ (E.coli)またはいくつかの他の適切な宿主におけるストレプトコッカス・ニュー モニアエ0100993の染色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブラリーを、部分的 配列に由来する、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さの放射性標識化オリ ゴヌクレオチドにてプローブする。プローブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持 するクローンは厳密な条件を用いて区別できる。元の配列から設計した配列決定 プライマーを用いてこのように同定した個々のクローンを配列決定することによ り、両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝子配列を決定できる。このよ うな配列決定は便宜的にプラスミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用 いて実施する。適切な技法については、Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およびSambro okら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリン グ・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュ ーヨーク(1989)に記載されている(Screening By Hybridization 1.90およびSequ encing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70参照）。本発明の典型 例において、表１［配列番号：１］に示すポリヌクレオチドが、ストレプトコッ カス・ニューモニアエ0100993由来のＤＮＡライブラリー中に見いだされた。 表１［配列番号：１］に示すＤＮＡ配列は、表１［配列番号：２］に示すアミ ノ酸残基数とほぼ同数のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読み枠を含んで おり、蛋白の推定分子量は、当該分野でよく知られたアミノ酸の分子量を用いて 算出できる。表１のＤＮＡのスタートコドンはヌクレオチド１３７番であり、ア ミノ酸をコードする最終コドンは８３８番であり、ストップコドンは、アミノ酸 をコードするこの最終コドンに続く次のコドンである。 本発明応答レギュレーター蛋白は、寄託株の応答レギュレーターをコードして いるＤＮＡの配列決定結果により示されるように、応答レギュレーターファミリ ーの他の蛋白に構造的に関連している。本発明蛋白は、知られた蛋白の中でもバ チルス・ズブチリスのＹＹＣＦ蛋白に対して最大の相同性を示す。表１［配列番 号：２］の応答レギュレーター蛋白は、バチルス・ズブチリスのＹＹＣＦポリペ プチドのアミノ酸配列に対して、その全長にわたり約６７％の同一性、そしてそ の全長にわたり約８０％の類似性を示す。 本発明は、表１［配列番号：１］のコーディング配列に対して全長にわたり同 一であるポリヌクレオチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコーディング配 列またはそれらのフラグメント、ならびにその他のコーディング配列を有する読 み枠中の成熟ポリペプチドのコーディング配列またはそのフラグメント、例えば リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列をコードする配列も本 発明により提供される。ポリヌクレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、 終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、 ポリアデニル化シグナル等の転写非翻訳配列、および付加アミノ酸をコードする 付加コーディング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コーディング 配列をも含有しうるが、これらに限定するのではない。例えば、融合ポリペプチ ドの精製を促すマーカー配列をコードすることもできる。本発明のある好ましい 態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen，Inc.）中に提供され るようなヘキサ−ヒスチジンペプチド(Gentzら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA ，86:821-824(1989)に記載される)またはＨＡタグ(Wilsonら、Cell,37:767(1984 ))である。本発明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現を調 節する天然の配列をも含むが、これらに限定するものではない。 本発明の好ましい具体例は、応答レギュレーターポリペプチドをコードいして いる、表１の配列番号：１に示すヌクレオチド１３７から８３８までを含むポリ ヌクレオチドである。 また本発明は、表１（Ｃ）［配列番号：１］に示す式のポリヌクレオチドを包 含し、式中の５’末端においてＸは水素であり、３’末端においてＹは水素また は金属であり、Ｒ₁およびＲ₂は核酸残基、ｎは１ないし１０００の整数である。 いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも多い）により示される核酸残基の伸長部分はヘ テロポリマーであってもホモポリマーであってもよく、好ましくはヘテロポリマ ーである。 上記した本明細書の用語「ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド」 は、本発明ポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含し 、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には表１［配列番号：２］に示すア ミノ酸配列を有するストレプトコッカス・ニューモニアエの応答レギュレーター のポリペプチドを包含する。該用語は、コーディング配列および／または非コー ディング配列を含んでいてもよいさらなる領域を伴った、ポリペプチドをコード している単一の連続領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファージまた は配列の挿入または配列の編集により分断されたもの）を含むポリヌクレオチド を包含する。 さらに本発明は、表１［配列番号：２］の推定アミノ酸配列を有するポリペプ チドの変種をコードする上記ポリヌクレオチドの変種にも関する。本発明ポリヌ クレオチドのフラグメントである変種を用いて本発明の全長ポリヌクレオチドを 合成してもよい。 さらに特に好ましい具体例は、表１［配列番号：２］の応答レギュレーターポ リペプチドのアミノ酸配列を有する応答レギュレーター変種をコードするポリヌ クレオチドであり、その中には、いくつか、少しの、５ないし１０、１ないし５ 、１ないし３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加を任意 の組み合わせで施したアミノ酸配列を有する。中でもとりわけ好ましいものは、 応答レギュレーターの特性および活性を変化させないサイレント置換、付加およ び欠失である。 本発明のさらに好ましい具体例は、表１［配列番号：２および４］に示すアミ ノ酸配列を有する応答レギュレーターポリペプチドをコードしているポリヌクレ オチドに対して、その全長にわたり少なくとも７０％の同一性があるポリヌクレ オチド、およびかかるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドであ る。あるいはまた、寄託株の応答レギュレーターポリペプチドをコードしている ポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくとも８０％同一である領域を 含むポリヌクレオチド、およびそれに対して相補的なポリヌクレオチドが最も非 常に好ましい。この点に関して、全長で少なくとも９０％同一であるポリヌクレ オチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特 に好ましく、さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中でも少なくとも ９７％であるのがより好ましく、中でも少なくとも９８％および少なくとも９９ ％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好ましい。 特に好ましい具体例は、表１［配列番号：１］のＤＮＡによりコードされる成 熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド をコードしているポリヌクレオチドである。 本発明はさらに本明細書上述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに 関する。この点に関して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌクレ オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる「厳 密な条件」および「厳密なハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の 同一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％である場合のみに起こ るハイブリダイゼーションを意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例 としては、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ7．6）、５ｘデンハ ーツ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性し、剪断され たサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続い て約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイブリダ イゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク （1989）、とりわけその第１１章に実例が示されている。 本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーション条件で、配列番号：１または配 列番号：３に示すポリヌクレオチド配列に関する完全遺伝子を含む適当なライブ ラリーを、配列番号：１に示す上記ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメン トの配列を有するプローブでスクリーニングし、ＤＮＡ配列を単離することによ り得ることのできるポリヌクレオチド配列を本質的に含むポリヌクレオチドをも 提供する。かかるポリヌクレオチドを得るために有用なフラグメントには、例え ば本明細書の別の箇所において説明するプローブおよびプライマー等がある。 本発明のポリヌクレオチドアッセイに関してここでさらに論じるが、例えば上 述の本発明のポリヌクレオチドを、応答レギュレーターをコードするｃＤＮＡ全 長およびゲノムクローンを単離するための、および応答レギュレーター遺伝子に 高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単 離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーショ ンプローブとして使用することができる。このようなプローブは通常少なくとも １５塩基を含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、 少なくとも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブは少なくと も３０塩基を有し、５０塩基またはそれ以下である。 例えば、応答レギュレーター遺伝子のコーディング領域は、配列番号：１に示 すＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成してスクリーニングす ることにより単離できる。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有す る標識オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブ ラリーのスクリーニングに用い、プローブがライブラリーのいずれのメンバーに ハイブリダイゼーションするのかを決定する。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、疾病とりわけヒト の疾病の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材料として使用でき 、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書でさらに論じる。 配列番号：１および／または２の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明 ポリヌクレオチドを本明細書記載の方法に使用してもよいが、好ましくはＰＣＲ に使用して、本明細書で同定したポリヌクレオチドの全体または一部が感染した 組織に転写されるかどうかを決定する。かかる配列が、病原体が達成した感染段 階および感染型の診断にも有用であることが理解される。 また本発明は、さらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸、または成 熟ポリペプチドに内在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドをコー ドできるポリヌクレオチドも提供する(例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチ ド鎖を有する場合)。このような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセ ッシングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半減期を延長もしくは短 縮し、またはとりわけアッセイもしくは製造のための蛋白の操作を容易にするこ とができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性酵素によりプロ セッシングされ、成熟蛋白から取り除かれる。 １またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態のポリペプチドを有する前駆 蛋白は、ポリペプチドの不活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常 にはこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列のいくつかまたはすべて を活性化の前に除去できる。通常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。 要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟 蛋白（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１ま たはそれ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および １またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコ ードしていてもよく、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態を生成 するプロセッシング段階で除去される。 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含むベク ター、本発明ベクターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技法による本発 明のポリペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用 い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋白を製造できる。 組換え体を製造するために、宿主細胞を遺伝子操作して、発現系もしくはそれ らの一部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌク レオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecula r Biology（1986）；Sambrookら、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第 ２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ス プリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニ ュアルに記載される方法により行うことができ、例えばリン酸カルシウムトラン スフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランス ベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクショ ン、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ負荷、バリステ ィック導入および感染等がある。 適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えばストレプトコッカス属（St reptococci）、スタフイロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッカス属 （Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、ストレプトミセス（Streptomyces） およびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母 細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフ ィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞 ；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２ ９３およびボウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞等がある。 本発明のポリペプチドを製造するために非常に多くの発現系を使用できる。こ のようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例 えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母 エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノ ウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイル ス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来するベクター、例 えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター 、例えばコスミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発現を制御お よび引き起こす調節領域を含有していてもよい。この点に関して、一般的には、 宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発現するのに、および／またはポ リ ペプチドを発現するのに適した任意の系またはベクターを発現に使用できる。周 知のおよび通常的な種々の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入 してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual（上 述）に記載されている。 翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペースまたは細胞外環境へ分泌 させるために、適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むことがで きる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的なものであってもく、あるいは 異種性のシグナルでもよい。 本発明のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および 精製でき、その方法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽 出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー 、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィ ー等がある。高速液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポ リペプチドが単離および／または精製中に変性した場合、再び活性なコンホーメ ーションにするために、蛋白再生のための周知の技法を用いることができる。 診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明の応答レギュレーターポリ ヌクレオチドの使用にも関する。真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおける 応答レギュレーターの検出は、疾患の診断のための診断法を提供する。応答レギ ュレーター遺伝子を含む生物に感染した真核生物（本明細書において「個体」と も称する）とりわけ哺乳動物、特にヒトを種々の方法によりＤＮＡレベルで検出 できる。 診断用の核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟 骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよく 、あるいは分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素的 に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。増 幅 法を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を、 原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることができる。対照配列の 遺伝子型と比較した場合の増幅産物の大きさの変化により、欠失および挿入を検 出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化応答レギュレーターポリヌクレオ チド配列にハイブリダイズさせることにより同定できる。完全に対合した配列は ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別 できる。変性剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度 の変化を検出することにより、または直接的なＤＮＡの配列決定により、ＤＮＡ 配列の差を検出してもよい。例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）参照 。また、特異的な位置での配列の変化を、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲ ＮアーゼおよびＳ１保護または化学的切断法によって明らかにしてもよい。例え ばCottonら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，85:4397-4401（1985）参照。 本発明の遺伝子の突然変異または多型性を担持する細胞を、種々の技術により 、ＤＮＡレベルで、例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。例え ば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲは自 動検出系、例えばGeneScan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮ ＡまたはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いてもよい。例を 挙げると、応答レギュレーターをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは 、突然変異を同定および分析するのに用いることができる。典型的なプライマー の例を下表２に示す。 表２ 応答レギュレーターポリヌクレオチド増幅用プライマー 配列番号：プライマー配列 本発明はまた、５'および／または３'末端から１、２、３または４個のヌクレ オチド除去したプライマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染個体から 単離された遺伝子を増幅してもよく、次いで、該遺伝子をＤＮＡ配列を調べるた めの種々の技法に供してもよい。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検 出し、感染の診断および感染性物質のセロタイピングおよび／または分類に使用 することができる。 本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感染、より好ましくはストレプトコッカ ス・ニューモニアエによる感染、および最も好ましくは、中耳炎、結膜炎、肺炎 、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄 液の感染のごとき髄膜炎のような疾病の診断方法を提供し、該方法は、表１［配 列番号：１］の配列を有するポリヌクレオチドのの発現レベルの上昇を個体由来 の試料から検出することを特徴とする。応答レギュレーターポリヌクレオチドの 発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野でよく知ら れたいずれかの方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノ ーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて測定で きる。 さらに、正常対照組織サンプルと比較して、応答レギュレーター蛋白の過剰発 現を検出するための本発明診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出して もよい。宿主由来のサンプル中の応答レギュレーター蛋白のレベルを決定するた めに用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。かかるアッセイ 法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析お よびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。 抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそれらを発現する細胞を 免疫源として用いて、かかるポリペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができ る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体 、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント が包含され、さらに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂフラグメ ン トも包含される。 本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ が付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動物に 通常の実験法を用いて投与することにより得ることができる。連続的細胞系培養 により産生される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モノクローナル 抗体を調製することができる。例としては、Kohler，G.およびMilstein，C.，Na ture，256:495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4:72（1983）；Col eら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss，Inc.、77-96 頁（1985）に記載されるような種々の技法がある。 一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を 適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を得ることができる。また、 トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用い てヒト化抗体等の抗体を発現させてもよい。 別法として、ファージディスプレイ技法を用いて、抗−ポリペプチドを有する ことにつきスクリーニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝子の レパートリーから、抗−応答レギュレーターを有することについてスクリーニン グされたヒトから、あるいは無処理のライブラリーから、ポリペプチドに対する 結合活性を有する抗体遺伝子を選別することもできる(McCafferty，J.ら、Natur e 348:552-554（1990）；Marks，J.ら、Biotechnology 10:779-783（1992））。 これらの抗体の親和性はチェインシャフリング（chain shuffling）により改善 することもできる（Clackson，T.ら、Nature 352:624-628（1991））。 二つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは「二特異性」抗体と称 する異なるエピトープに対して指向される。 上記抗体を用いてポリペプチドを発現するクローンを単離または同定してもよ く、上記抗体を親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。 従って、とりわけ応答レギュレーターに対する抗体を、感染、とりわけ細菌感 染、特に中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜 炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎のような疾病の治療に用 いてもよい。 ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ的または免疫学的に等価な変種等が あり、本発明の特定の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導体」 なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチドに対して生成した場合、病原 および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により 特異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含する。本明細書で用い る「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を産生させる のに適した処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間での即時的な物 理的相互作用を妨害するように作用するペプチドまたはその等価物を包含する。 ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に等価な誘導体、またはそれらの融合 蛋白は、マウスまたはその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫するた めの抗原として使用できる。融合蛋曲まポリペプチドに安定性を付与できる。抗 原は、例えば抱合することにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシアニン(keyhole limpe t haemocyanin：ＫＬＨ）に結合することができる。あるいはまた、蛋白もしく はポリペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチド の多重コピーを含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するための十分な抗原 性を有しているので、キャリヤーを使用しなくてすむ。 好ましくは、抗体またはそれらの変種を、個体における免疫原性を減じるため に修飾する。例えば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は「ヒト化 」されており；この場合、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域がヒト・ モノクローナル抗体に移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525 （1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273（1991）に記載されている 。 本発明のポリヌクレオチドを遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラ スミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363（1992）；Ma nthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡと の複合体の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リン酸カルシウ ムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS 83:9551（1986））、種々の形 態のリポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（1989））、微 粒子爆撃(Tangら、Nature 356:152(1992);Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791 (1993))およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染(Seeger ら、PNAS 81:5849(1984))等の適切な送達方法を用いるのが好ましい。 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標品、化学ライブラリー 、および天然産物混合物中における小型分子基質およびリガンドの結合を評価し てもよい。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガンドであってもよ く、構造上または機能上の模倣物であってもよい。例えば、Coligan et al.,Cur rent Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)参照。 また本発明は、応答レギュレーターポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作 用を増強（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物、詳細には、 静菌性および／または殺菌性化合物を同定するための、化合物のスクリーニング 方法をも提供する。該スクリーニング方法は高処理量の方法である。例えば、ア ゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、合成反応混合物、 膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、または応 答レギュレーターポリペプチドおよび標識基質もしくはかかるポリペプチドのリ ガンドを含むそれらの調合物を、応答レギュレーターアゴニストまたはアンタゴ ニストである可能性のある候補化合物の不存在下または存在下でインキュベーシ ョンする。候補分子が応答レギュレーターポリペプチドにアゴナイズまたはアン タゴナイズする能力は、標識化リガンドの結合の低下またはこのような基質から の生成物の産生の低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない分子、すなわ ち応答レギュレーターの効果を誘導しない分子は、最も良好なアンタゴニストで ある可能性がある。結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高める分子 はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度またはレベルはリポーターシ ステムを用いることにより強調できる。この点に関して有用なリポーターシステ ム には、生成物に転換される比色測定用標識化基質、応答レギュレーターポリヌク レオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当 該分野で周知の結合アッセイ等があるが、これらに限定するものではない。 応答レギュレーターアンタゴニストのアッセイのもう１つの例は競争アッセイ であり、競争阻害アッセイに適した条件下で、応答レギュレーターおよび潜在的 アンタゴニストを、応答レギュレーター結合分子、組換え応答レギュレーター結 合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模倣物と混合 する。例えば放射活性または比色測定用化合物により応答レギュレーターを標識 し、結合分子に結合した、または生成物に変換された応答レギュレーター分子の 数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。 潜在的アンタゴニストには、本発明ポリペプチドに結合し、そのことによりそ の活性を阻害し消失させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体な どがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に関連した蛋白または抗体のご とき小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子 の同じ部位に結合するが、応答レギュレーターにより誘導される活性を誘導せず 、それゆえ応答レギュレーターを結合から排除することにより応答レギュレータ ーの作用を妨害する。 潜在的アンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、およびそれを 占領し、それにより細胞性結合分子への結合を妨害して、正常の生物学的活性を 妨害する小型分子等がある。小型分子の例としては、小型有機分子、ペプチド、 ペプチド様分子等があるが、これらに限定するものではない。その他の潜在的ア ンタゴニストにはアンチセンス分子等がある（これらの分子についての記載に関 してはOkano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nucleotides as Anti sense Inhibitors of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロ リダ州（1988）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、応答レギュレータ ー関連化合物および応答レギュレーター変種等がある。 本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化合物の発見および開発に使用しても よい。コードされている蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニングのた めの標的として使用されうる。さらに、コードされている蛋白のアミノ末端領域 または各ｍＲＮＡのシャイン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコード しているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、目的コーディング配列 の発現を制御することもできる。 本発明は、感染の続発症に関与する病因および哺乳動物宿主間の最初の物理的 相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害物 質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在デバイス上の哺乳動物細胞外 マトリックス蛋白または傷における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳 細にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チロシンキナーゼのホス ホリレーションを開始することによる、応答レギュレーター蛋白により媒介され る哺乳動物細胞への侵入のブロック（Rosenshine et al.，Infect．Immunol．60 :2211(1992)）；哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と細菌応答レギュレーター蛋 白との間の、組織ダメージを媒介する細菌付着のブロック；内在デバイスの移植 または他の外科的方法以外により開始される、感染における通常の病状の進行の ブロックに使用することができる。 本発明アンタゴニストおよびアゴニストを、例えば、感染、とりわけ細菌感染 、特に中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎 、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎のような疾病の抑制および 治療に用いてもよい。 ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免疫学的反応を誘導する 方法に関し、該方法は、感染、詳細には細菌感染、最も詳細にはストレプトコッ カス・ニューモニアエ感染から個体を防御するための抗体および／またはＴ細胞 免疫応答を生じさせるに十分な応答レギュレーターまたはそのフラグメントもし くは変種を個体に接種することを特徴とする。かかる免疫学的応答が細菌の複製 を遅らせる方法も提供される。本発明のさらにもう１つの態様は、個体における 免疫学的応答の誘導方法に関し、該方法は、疾病が個体においてすでに確立され ているか否かにかかわらず、インビボで応答レギュレーター、またはそのフラグ メントもしくは変種を発現させるために応答レギュレーターまたはそのフラグメ ントもしくは変種の発現を指令する核酸ベクターをかかる個体に送達して、例え ば、抗体および／またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞また は細胞毒性Ｔ細胞）を生じさせる免疫学的応答を誘導して、該個体を疾病から防 御する抗体を産生させることを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中に投与す る方法としては、粒子上にコーディングすること等がある。 かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイ ブリッドを含んでいてもよい。 本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を宿主内に誘導できる、または誘導さ れたた宿主に導入した場合、応答レギュレーターまたはそれによりコードされて いる蛋白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組成物に関し、その 組成物は組換え応答レギュレーターまたはそれによりコードされている蛋白を含 み、応答レギュレーターまたはそれによりコードされている蛋白に対する抗原を コードし発現するＤＮＡを含む。免疫学的応答を治療的または予防的に用いても よく、また免疫学的応答はＣＴＬまたはＣＤ４⁺Ｔ細胞から生じるような抗体免 疫または細胞性免疫の形態であってもよい。 応答レギュレーターポリペプチドまたはそれらのフラグメントを、それ自身は 抗体を産生しないが、第１の蛋白を安定化し、免疫原的および保護特性を有する 融合蛋白を産生する能力のある共存蛋白（co-protein）と融合させてもよい。好 ましくは、かかる融合組換え蛋白は、抗原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフ ルエンザエ（Hemophilus influenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼのごとき共存蛋 白、蛋白を可溶化してそれらの産生および精製を促進する比較的大きな共存蛋白 等を含む。さらに、共存蛋白は免疫系において普遍的な刺激を提供するという意 味で、アジュバントとして作用することができる。共存蛋白は第１の蛋白のアミ ノまたはカルボキシいずれの末端に結合していてもよい。 本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよびSato Y.ら、 Science 273:352(1966)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む組成 物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供する。 また、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニアエに感染した動物モデル において、かかる遺伝的免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面蛋 白の不変領域をコードすることが示されている、説明したポリヌクレオチドまた はとりわけそれらのフラグメントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防 的または治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピトープを同定するのに 有用である。この研究は、哺乳動物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけス トレプトコッカス・ニューモニアエ感染の予防薬または治療的処置の開発のため に、感染に抵抗しこれを一掃するのに成功した動物の必須器官から特に価値ある モノクローナル抗体をうまく調製することを可能にすると思われる。 ポリペプチドを宿主接種用抗原として用いて、例えば損傷組織への細菌の付着 を阻害することにより細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよい。組 織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もしくは熱的ダメージにより、また は内在デバイスの埋め込みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等がある。 また本発明は、適切な担体と一緒になった免疫原性組換え蛋白を含有するワク チン処方を包含する。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば皮下、 筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ましい。非経口投与に適した処 方には、抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血 液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または非水性滅菌注射液、およ び懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等が ある。処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールしたアンプルおよび バイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾 燥状態として保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高めるアジュバ ント系を含有していてもよく、例えば水中油系または当該分野で周知のその他の 系等がある。投与量はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により容易 に決定できる。 本発明を特定の応答レギュレーター蛋白に関して説明したが、本発明は天然に 存在する蛋白および、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失 または置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含することが理解されよう。 組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそれらの アゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチ ドを、細胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌済み担体と混合 して、例えば対象への投与に適した医薬的担体と混合して用いることができる。 このような組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチ ド、および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む。このような担体には生 理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール およびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定するものではない。処方は 投与法に適したものにすべきである。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記 本発明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む診断用および医薬用 パックおよびキットにも関する。 本発明ポリペプチドおよびその他の化合物を、単独で、あるいは治療用化合物 等のその他の化合物と組み合わせて用いてもよい。 いずれかの有効かつ利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈 内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の経路で医薬組成物を投与 してもよい。 治療において、または予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例えば 好ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与できる。 別法として、組成物を局所適用用、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼軟 膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾー ル等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加物、例えば保存剤、薬物の浸 透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基 剤、およびローションにはエタノールまたはオレイルアルコールを含有していて もよい。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％であってよく、より 通常には重量で処方の約８０％までとする。 哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性物質の１日あたりの投与量は、 ０．０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与量を決定し、年齢、体重 および特に個体の反応性に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケース の典型例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合する個々の例もあ り、かかる例は本発明の範囲内である。 内在デバイスには外科的インプラント、補てつデバイスおよびカテーテル等が あり、即ち個体の体に導入し、長時間その位置に存在するものである。このよう なデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管 カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析 （continuous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテーテル等があ る。 本発明の組成物を注射により投与し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌 に対する全身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存在する期間中 、処置を続けてもよい。さらに、外科的手技中に広げるカバーに用いて、細菌性 創傷感染、とりわけストレプトコッカス・ニューモニアエの創傷感染を防御する こともできる。 多くの整形外科医は、補てつ関節を有するヒトについては、菌血症を生じうる 歯科的処置の前に抗生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性の重 篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のある罹 病率および死亡率を伴う。それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代 わるものとして、活性物質の使用を拡張することが可能である。 上述の治療に加え、一般的には本発明組成物を創傷の治療薬として使用して、 創傷組織において曝露されたマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いでもよ く、歯科治療においては抗生物質による予防法に代えて、またはそれと組み合わ せて予防的に使用してもよい。 別法として、本発明の組成物を用いて挿入直前の内在デバイスを浸してもよい 。創傷または内在デバイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１０ｍ ｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。 ワクチン組成物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバントを用 いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適した単位投与量は、抗原０．５〜 ５μｇ／ｋｇであり、このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが 好ましい。本発明化合物については、指示した投与量範囲では、適切な個体への 投与を妨げるような不利な毒性効果は観察されない。 本明細書に開示した各文献を、参照によりその全体が本明細書に記載されてい るものとみなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願も、参照により その全体が本明細書に記載されているものとみなす。 実施例 以下の実施例は、詳細に説明したこと以外は、当業者に周知で通常的な標準的 な技法を用いて実施する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を限定 するものではない。 実施例１：菌株の選択、ライブラリーの製造および配列決定 配列番号:１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを、イー・コリ(E.col i)中のストレプトコッカス・ニューモニアエの染色体ＤＮＡのクローンのライブ ラリーから得た。重複するストレプトコッカス・ニューモニアエのＤＮＡを含有 する２個またはそれ以上のクローンからの配列決定データを用いて配列番号：１ の隣接ＤＮＡ配列を構築した場合もある。通常の方法、例えば以下の方法１およ び２によりライブラリーを製造できる。 全細胞ＤＮＡは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993から、標準法 に準じて単離し、二つの方法のどちらかによりサイズ分画する。 方法１ 標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡを注射針に通して機械 的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼ およびＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化し、ＥｃｏＲＩリ ンカーを加える。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断されているベクターラムダ ＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、次いでパ ッケージングしたライブラリーでE．coliを感染させる。ライブラリーは標準法 により増幅する。 方法２ 全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、Ａｌ ｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクローニングするための一連のフラグメントを適切 に生じる１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加水分解し、かかる フラグメントを標準法に準じてサイズ分画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡ およびフラグメントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベクターラム ダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、次いで パッケージングしたライブラリーでE．coliを感染させる。ライブラリーを標準 法により増幅する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/32 Ｃ０７Ｋ 14/32 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｐ 33/50 Ｚ 33/53 Ｄ Ａ６１Ｋ 35/74 33/53 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/74 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ウォリス，ニコラ・ゲイル アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ ェイン、シュガータウン・ロード219番、 ラメゾン・アパートメンツ（ケイ203)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドコードしているポリ ヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に対して相捕的なポリヌクレオチド； （ｃ）寄託株のストレプトコッカス・ニューモニアエ中に含まれる応答レギュ レーター遺伝子により発現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコードしているポ リヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の 連続した塩基を含むポリヌクレオチド からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。 ２．ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ３．ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ４．配列番号１に示す核酸配列を含む請求項２のポリヌクレオチド。 ５．配列番号１に示すヌクレオチド１から１０６０までを含む請求項２のポリ ヌクレオチド。 ６．配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている請求項 ２のポリヌクレオチド。 ７．請求項１のポリヌクレオチドを含むベクター。 ８．請求項７のベクターを含む宿主細胞。 ９．請求項８の宿主細胞から上記ＤＮＡによりコードされているポリペプチド を発現させることを含む、ポリペプチドの製造方法。 １０．応答レギュレーターポリペプチドまたはフラグメントの製造方法であっ て、該ポリペプチドまたはフラグメントの生成に十分な条件下で請求項８の宿主 を培養することを含む方法。 １１．配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミ ノ酸配列を含むポリペプチド。 １２．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。 １３．請求項１１のポリペプチドに対する抗体。 １４.請求項１１のポリペプチドの活性または発現を阻害するアンタゴニスト 。 １５.治療上有効量の請求項１１のポリペプチドを個体に投与することを含む 、応答レギュレーターポリペプチドを必要とする個体の治療方法。 １６．治療上有効量の請求項１４のアンタゴニストを個体に投与することを含 む、応答レギュレーターポリペプチドの阻害を必要とする個体の治療方法。 １７．個体における請求項１１のポリペプチドの発現または活性に関連した疾 病の診断方法であって、 （ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定すること、および／ま たは （ｂ）個体由来の試料中の該ポリペプチドの存在または量について分析するこ と を含む方法。 １８．請求項１１のポリペプチドと相互作用して、その活性を阻害または活性 化する化合物の同定方法であって、 化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチド とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し（かか る相互作用はポリペプチドと化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを 提供しうる第２の成分に関連したものである）、 次いで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じるシグナルの存在また は不存在を検出することにより、化合物がポリペプチドと相互作用して、その活 性を活性化または阻害するかどうかを決定する ことを含む方法。 １９．哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法であって、抗体および／ またはＴ細胞免疫応答を生じさせて動物を疾病から防御するに十分な請求項１１ の応答レギュレーターポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種を哺乳 動物に接種することを含む方法。 ２０.哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法であって、応答レギュレ ーターポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種をインビボで発現させ て、抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせる免疫学的応答を誘導して該 動物を疾病から防御するするために、請求項１１の応答レギュレーターポリペプ チドまたはそのフラグメントもしくは変種の発現を指令する核酸ベクターを送達 することを含む方法。