TW202345888A - 治療顱腦損傷的方法 - Google Patents

Abstract

本公開提供了用膜聯蛋白A5或其變體治療顱腦損傷（TBI）的藥劑及方法。

Description

治療顱腦損傷的方法

本申請要求享有申請人2022年3月4日向美國專利和商標局提交的專利申請號為17/653,579，名稱為「METHODS OF TREATING A TRAUMATIC BRAIN INJURY」的在先申請的優先權權益，上述在先申請的全文透過引用的方式結合於本申請中。

本公開涉及治療顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的方法，具體涉及使用膜聯蛋白A5或其變體治療顱腦損傷的方法，以及膜聯蛋白A5或其變體用於治療顱腦損傷的用途、藥物組合物及其製劑，屬於生物醫藥領域。

顱腦損傷（TBI）是頭部受到破壞大腦功能的鈍擊、顛簸或爆震超壓所導致的結果。輕度TBI或mTBI亞型代表了較難診斷的TBI部分。在本公開中，mTBI是TBI的亞型。術語輕度TBI（mTBI）和腦震盪在本領域中通常可以互換使用，並且與創傷後應激障礙（PTSD）有關。頭部損傷的嚴重程度可以是精神狀態或意識的短暫變化，直至持續的無意識和健忘症。在嚴重或多發性腦震盪的情況下，人格改變可能會產生破壞性的結果。

每年有150萬至200萬美國人遭受顱腦損傷（Center for Disease Control and Prevention， National Center for Injury Prevention and Control，2003，Vol. 2003）。據估計，顱腦損傷在美國每年造成50,000人死亡和100,000人住院。每年有超過80,000人殘疾，其中約17,000人需要專門的生命護理（Kraus （1997）Head Injury， ed. Cooper （Williams & Wilkins Co., Baltimore） pp 1-19; Selecki et al. （1982） Australian & New Zealand Journal of Surgery 52（l）:93-102）。除了大腦突然創傷引起的初始損傷外，過度的生物力學力還會引發一系列繼發性有害事件，這些事件會在初始損傷後數天至數月內顯著增加病變的大小、發病率和死亡率（MchΛosh et al. （1996） Lab Invest, 74（2）:315-42; Stambrook et al. （1990） Can J Surg 33（2）:115-8）。儘管有如此嚴重的問題，但尚未確定針對人類顱腦損傷的有效的藥物治療方法。因此，仍然亟需用於治療顱腦損傷的新方法和治療劑。

膜聯蛋白A5（Annexin A5）是磷脂結合蛋白家族的一部分，分子量大約在35 kDa左右，能以鈣依賴的方式與質膜上的陽離子磷脂（例如磷脂醯絲胺酸）結合。膜蛋白A5最早於1970年被發現存在於人的胎盤，其基因位於染色體4q26-q28上，有13個外顯子和12個內含子，因其較大的分子量導致一般不會進入腦組織。

為改善上述技術問題，本公開提供了治療有需要患者的顱腦損傷（TBI）的方法，此方法包括： （a）確定患有顱腦損傷或疑似患有顱腦損傷的患者； （b）向患者施用治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體。

本公開提供了治療有需要的患者的顱腦損傷（TBI）的方法，此方法包括： （a）確定患有顱腦損傷或疑似患有顱腦損傷的患者； （b）向患者施用包含治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體的藥物組合物。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體包含的胺基酸序列與SEQ ID NO：1的胺基酸序列具有至少75%（例如，75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的序列同源性。

在一些實施方案中，顱腦損傷是輕度、中度或重度顱腦損傷。

在一些實施方案中，顱腦損傷是由頭部撞擊、穿透性頭部損傷、非穿透性頭部損傷、跌倒、顱骨骨折、突然加速或減速、腦震盪或挫傷導致的。

在一些實施方案中，患者是哺乳動物，例如人。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5、其變體或前述藥物組合物減少患有顱腦損傷的患者的彌漫性軸突損傷、行為障礙、腦組織損傷、腦萎縮、神經元細胞死亡或神經元細胞凋亡、小膠質細胞活化或神經元組織損失。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5、其變體或前述藥物組合物提高患有顱腦損傷的患者的腦血流量或腦葡萄糖攝取。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5、其變體或前述藥物組合物減輕了患者的與顱腦損傷相關的一種或多種症狀。在一些實施方案中，與顱腦損傷相關的一種或多種症狀包括意識水準損傷、認知損傷、認知處理速度損傷、語言損傷、運動活動損傷、記憶損傷、運動技能損傷、感覺技能損傷、腦缺血、水腫、顱內壓、聽力喪失、耳鳴、頭痛、癲癇發作、頭暈、噁心、嘔吐、視力模糊、嗅覺或味覺下降、體力下降或協調能力下降。

在一些實施方案中，在從顱腦損傷之時到4周的時間段內施用第一劑藥物，如，膜聯蛋白A5或其變體、或前述藥物組合物。在一些實施方案中，第一劑藥物在顱腦損傷發生後約0小時、約3小時、約6小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時內施用。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體的治療有效量在約0.01 mg/kg和約10 mg/kg之間。在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體的治療有效量在約0.01 mg/kg和約0.5 mg/kg之間。在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體的治療有效量為約0.02 mg/kg、0.06 mg/kg或0.2 mg/kg。

在一些實施方案中，本公開的方法還包括向患者施用第二劑藥物或治療。

在一些實施方案中，前述第二劑藥物或治療是心臟保護的藥物或治療，其中前述心臟保護的藥物或治療包括β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制劑、鈣通道阻滯劑、降脂療法、他汀類藥物、硝酸鹽、抗血小板、抗凝血劑（anticlotting agent）、抗凝劑（anticoagulation agent）中的一種或其組合，以及將上述藥物應用於治療。

在一些實施方案中，確定患有顱腦損傷的患者的步驟包括對患者進行電腦斷層掃描（CT）掃描或核磁共振成像（MRI）。

在一些實施方案中，基於改良的神經嚴重程度評分（mNSS）、旋轉杆測試、格拉斯哥昏迷評分（Glasgow Coma Scale score）或格拉斯哥預後評分（Glasgow Outcome Scale score），將患者鑑定為患有顱腦損傷。在一些實施方案中，mNSS或格拉斯哥昏迷評分在3和8之間、9和12之間或13和15之間。

在一些實施方案中，如果mNSS或格拉斯哥昏迷評分低於參考水準，則將患者鑑定為患有顱腦損傷。在一些實施方案中，參考水準是由未曾遭受頭部損傷的參考受試者獲得的。

在一些實施方案中，鑑定患有顱腦損傷的患者的步驟包括： 確定來自患者的樣品中生物標誌物的水準； 將生物標誌物的水準與生物標誌物的參考水準進行比較； 如果確定的生物標誌物水準與生物標誌物的參考水準相比增加，則將患者鑑定為患有顱腦損傷。

在一些實施方案中，前述的生物標誌物可以是IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-8、HMGB1、TGFβ、UCH-L1、NSE、GFAP、S100B、NF蛋白（L及H）、MBP、Tau或磷酸化Tau。

在一些實施方案中，前述樣品是在患者頭部受到物理震動、外部機械力或其他力的鈍性衝擊導致閉合或開放的頭部創傷、一次或多次跌倒、爆炸、爆破、固體爆炸、氣體爆炸或其他類型的鈍性創傷後獲得的。

在一些實施方案中，樣品選自全血樣品、血清樣品、腦脊液樣品及血漿樣品。

在另一方面，本公開還提供了降低顱腦損傷患者的生物標誌物水準的方法。前述方法包括： （a）確定患有顱腦損傷的患者； （b）向患者施用治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體，或包含治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體的藥物組合物； 其中，前述生物標誌物包含選自下列的細胞因數：IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-8、HMGB1、TGFβ、UCH-L1、NSE、GFAP、S100B、NF蛋白（L和H）、MBP、Tau和磷酸化Tau。

在一些實施方案中，前述膜聯蛋白A5或其變體的治療有效量為使膜聯蛋白A5或其變體將生物標誌物的水準增加或降低至少5%、10%、20%、30%、40%或50%的量。

本公開還提供膜聯蛋白A5或其變體在製備藥物中的用途。

本公開還提供藥物組合物，其中前述藥物組合物包含膜聯蛋白A5或其變體，優選治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體。

在一些實施方案中，前述藥物用於選自下列用途中的一種、兩種或更多種： 治療及/或預防顱腦損傷；例如，前述顱腦損傷是輕度、中度或重度顱腦損傷； 減少患有顱腦損傷的患者的彌漫性軸突損傷、行為障礙、腦組織損傷、腦萎縮、神經元細胞死亡或神經元細胞凋亡、小膠質細胞活化或患有顱腦損傷的患者的神經元組織丟失； 提高患有顱腦損傷的患者的腦血流量或腦葡萄糖攝取； 減輕患者的與顱腦損傷相關的一種或多種症狀，例如，前述與顱腦損傷相關的一種或多種症狀包括意識水準損傷、認知損傷、認知處理速度損傷、語言損傷、運動活動損傷、記憶損傷、運動技能損傷、感覺技能損傷、腦缺血、水腫、顱內壓、聽力喪失、耳鳴、頭痛、癲癇發作、頭暈、噁心、嘔吐、視力模糊、嗅覺或味覺下降、體力下降或協調能力下降； 降低患有顱腦損傷的患者中生物標誌物水準；例如，其中前述生物標誌物包含選自下列的細胞因數：IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-8、HMGB1、TGFβ、UCH-L1、NSE、GFAP、S100B、NF蛋白（L和H）、MBP、Tau和磷酸化Tau；例如，前述藥物將生物標誌物的水準增加或降低至少5%、10%、20%、30%、40%或50%的量。

例如，膜聯蛋白A5或其變體包含與SEQ ID NO： 1的胺基酸序列具有至少90%序列同源性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO： 1的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述顱腦損傷是輕度、中度或重度顱腦損傷；例如，其中前述顱腦損傷是由頭部撞擊、穿透性頭部損傷、非穿透性頭部損傷、跌倒、顱骨骨折、突然加速或減速、腦震盪或挫傷導致的；例如，前述患者是人；優選地，前述藥物為單位劑型；例如，前述藥物中膜聯蛋白A5或其變體的量在約0.01 mg/kg患者體重和約10 mg/kg患者體重之間，如約0.01 mg/kg患者體重和約0.5 mg/kg患者體重之間，如約0.02 mg/kg患者體重、0.06 mg/kg患者體重或0.2 mg/kg患者體重；例如，前述藥物為單位劑型，前述單位劑型中膜聯蛋白A5或其變體的量為0.025 mg-250 mg，例如0.1 mg-50 mg、0.1 mg-100 mg、0.1 mg-200 mg或0.1 mg-250 mg、1 mg-50 mg、1 mg-100 mg、1 mg-200 mg或1 mg-250 mg。

在一些實施方案中，前述藥物在從顱腦損傷之時到4周的時間段內施用，優選在顱腦損傷發生後約0小時、約3小時、約6小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時內施用。更優選在顱腦損傷後約12小時內向患者施用第一劑藥物；例如，前述藥物還包含心臟保護的藥物；例如，前述心臟保護的藥物選自β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制劑、鈣通道阻滯劑、降脂療法、他汀類藥物、硝酸鹽、抗血小板、抗凝血劑、抗凝劑中的一種或其組合。

上述內容並非旨在限定本公開的每個方面。在本文中的其他部分，例如以下具體實施方式還描述了本公開的其他方面。本申請的全文旨在作為統一且關聯的公開內容。應該理解，本文描述的所有特徵的任意組合都應當被認為是本公開描述的技術方案，即使其在本申請的同一句子、段落或章節中並未同時存在。透過以下詳細描述，本公開的其他特徵和優勢將被描述得更詳細。然而，應該理解，這些詳細的描述和具體的實例僅透過說明性的方式描述了本公開的具體實施例，在這些詳細的描述和具體實例的基礎上，本領域技術人員在本公開的構思和範圍內所作出的各種變化和修改，均應涵蓋於本申請申請專利範圍保護的範圍內。

下文透過參考附圖描述的實施方式是示例性的，旨在用於解釋本公開，而不能理解為對本公開的限制。

發明人意外發現，膜聯蛋白A5能夠減輕由顱腦損傷（TBI）引起的一種或多種症狀。因此，膜聯蛋白A5及其變體代表了治療患者顱腦損傷的有效方法。

顱腦損傷 的治療方法

在一方面，本公開提供了治療需要顱腦損傷的患者的方法，此方法包括： （a）確定患有顱腦損傷或疑似患有顱腦損傷的患者；及 （b）向患者施用治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體，或者包含治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體的藥物組合物。

在一些實施方案中，所述顱腦損傷是輕度、中度或重度顱腦損傷。

在一些實施方案中，顱腦損傷可以是由頭部撞擊、穿透性頭部損傷、非穿透性頭部損傷、跌倒、顱骨骨折、由於突然加速或減速引起的損傷、腦震盪或挫傷引起的。

在一些實施方案中，患者是哺乳動物，例如人。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體減少患有顱腦損傷的患者的彌漫性軸突損傷、行為障礙、腦組織損傷、腦萎縮、神經元細胞死亡或神經元細胞凋亡、小膠質細胞活化或神經元組織損失。在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體減輕彌漫性軸突損傷或與之相關的症狀。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體增加患有顱腦損傷的患者的腦血流量或腦葡萄糖攝取。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體減輕了患者與顱腦損傷相關的一種或多種症狀。在一些實施方案中，與顱腦損傷相關的一種或多種症狀包括意識水準損傷、認知損傷、認知處理速度損傷、語言損傷、運動活動損傷、記憶損傷、運動技能損傷、感覺技能損傷、腦缺血、水腫、顱內壓、聽力喪失、耳鳴、頭痛、癲癇發作、頭暈，噁心、嘔吐、視力模糊、嗅覺或味覺下降、體力下降或協調能力下降。

膜聯蛋白屬於磷脂結合蛋白家族，廣泛表達並具有許多重要功能。膜聯蛋白A5是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，與帶負電荷的磷脂表面結合。膜聯蛋白A5的分子量為35 kDa（見SEQ ID NO： 1），其主要存在於細胞膜和內質網中。

放射性標記的膜聯蛋白A5可作為顯影劑分佈在大腦中。此外，膜聯蛋白A5具有抗炎、抗凝、改善內皮損傷和器官功能障礙的功能。進入大腦的膜聯蛋白A5可用於治療腦部疾病，如顱腦損傷。

可用於所公開方法的膜聯蛋白A5包括但不限於全長天然人膜聯蛋白A5多肽或其變體/片段。A5多肽可以從任何來源或方法提供，例如天然分離物、重組、合成來源或上述的適當組合。膜聯蛋白A5的多肽序列可以基於完整、部分天然胺基酸序列、這些完整或部分天然胺基酸序列的變體。

術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可以互換使用，以指代任何鏈長的胺基酸聚合物。聚合物可以是直鏈的或支鏈的，其可以包含修飾的胺基酸，並且可以被非胺基酸插入而中斷。這些術語還包括例如透過二硫鍵成鍵、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化、聚乙二醇化或任何其他操作（例如與標記組分綴合）修飾的胺基酸聚合物。如本文所用，術語「胺基酸」包括天然的及/或非天然的或合成的胺基酸，包括甘胺酸和D或L光學異構體，以及胺基酸類似物和擬肽類物質。

本文所用的肽或多肽「片段」是指小於全長的肽、多肽或蛋白質。例如，肽或多肽片段可以具有至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約10個、至少約20個、至少約30個、至少約40個胺基酸的長度或其單位長度。例如，片段的長度可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多個胺基酸。對於肽片段的大小沒有上限。然而，在一些實施方案中，肽片段的長度可以小於約500個胺基酸、小於約400個胺基酸、小於約300個胺基酸或小於約250個胺基酸。

如本文所用，術語「變體」是指與第二組成（例如，第二分子，也稱為「母體」分子）相關的第一組成（例如，第一分子）。變體分子可以衍生自母體分子、從母體分子分離、基於母體分子或與母體分子同源。術語變體可用於描述多核苷酸或多肽。

當應用於多核苷酸時，變體分子可以與原始親本分子具有完整的核苷酸序列同源性，或者可以與親本分子具有小於100%的核苷酸序列同源性。例如，基因核苷酸序列的變體可以是與原始核苷酸序列相比在核苷酸序列中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更多相同的第二核苷酸序列。多核苷酸變體還包括包含整個親本多核苷酸的多核苷酸，並進一步包含其他融合核苷酸序列。多核苷酸變體還包括作為親本多核苷酸的一部分或子序列的多核苷酸；例如，本公開還包括本文公開的多核苷酸的獨特子序列（例如，透過標準序列比較和比對技術確定）。

當應用於蛋白質時，變體多肽可以與原始親本多肽具有完整的胺基酸序列同源性，或者可以與親本蛋白質具有小於100%的胺基酸同源性。例如，胺基酸序列的變體可以是第二胺基酸序列，其與原始胺基酸序列相比在胺基酸序列中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更多相同。

多肽變體包括包含整個親本多肽的多肽，並進一步包含其他融合胺基酸序列。多肽變體還包括作為親本多肽的部分或子序列的多肽；例如，本文公開的多肽的獨特子序列（例如，透過標準序列比較和比對技術確定）也包含在本公開中。

本文所用蛋白質的「功能變體」是指至少部分保留此蛋白質的活性的蛋白質變體。功能變體可以包括突變體（可以是插入、缺失或替換突變體），包括多晶型物等。功能變體中還包括這種蛋白質與另一種通常不相關的核酸、蛋白質、多肽或肽的融合產物。功能變體可能是天然存在的，也可能是人造的。

膜聯蛋白A5的變體可以是（i）其中一個或多個胺基酸殘基被保守胺基酸殘基或非保守胺基酸殘基取代的變體，例如保守胺基酸殘基取代的變體，並且這種取代的胺基酸殘基可以是由遺傳密碼編碼的也可以不是由遺傳密碼編碼的；（ii）其中存在一個或多個修飾胺基酸殘基的變體，例如，其中存在一個或多個透過連接取代基修飾的殘基的變體；（iii）前述變體中的多肽是本公開多肽的變異剪接變體；（iv）多肽的片段及/或（v）其中多肽與其他多肽融合的變體，前述其他多肽是例如前導序列或分泌序列或用於純化（例如His標籤）或用於檢測（例如Sv5表位標籤）的序列。這些片段包括透過原始序列的蛋白水解切割（包括多位點蛋白水解）產生的多肽。變體可以是轉譯後的，也可以是化學修飾的。應當理解，獲得並應用這些變體屬於本領域技術人員基於本文的教導所具有的能力範圍。

可以使用E.Meyers和W.Miller的演算法（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 （1988））確定兩個胺基酸序列之間的同源性百分比，前述演算法已被納入ALIGN程式（版本2.0），使用PAM120重量殘基表，間隙長度懲罰為12，間隙懲罰為4。此外，可以使用Needleman和Wunsch的演算法（J. Mol. Biol. 48:444-453 （1970））確定兩個胺基酸序列之間的同源性百分比，前述演算法已被納入GCG套裝軟體的GAP程式中（可在www.GCG.com上獲得），使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，GAP權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。

或者，本公開的蛋白質序列可以進一步用作「查詢序列」，以對公共資料庫進行搜索，以例如識別相關序列。這樣的搜索可以使用Altschul等人（1990） J. Mol. Biol. 215:403-10的XBLAST程式（2.0版）進行。可以使用XBLAST程式（分數（score）=50，字長=3）進行BLAST蛋白搜索，以獲得與本公開的抗體分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的的空位比對（gapped alignments），可以如Altschul等人（1997）Nucleic Acids Res. 25（17）:3389-3402中描述的Gapped BLAST。當使用BLAST和Gapped BLAST程式時，可以使用各個程式（例如XBLAST和NBLAST）的默認參數（參見www.ncbi.nlm.nih.gov）。為了確定蛋白質序列同源性，所包含的值是由NCBI定義為「同源性（identities）」的值，並且不考慮不保守但具有相似特性的殘基。

在一些實施方案中，可檢測的標籤可以與膜聯蛋白A5的N-及/或C-末端綴合或連接。可檢測標籤和親和標籤也可以被一個或多個胺基酸隔開。在一些實施方案中，可檢測標籤可以透過可切割元件與變體綴合或連接。在本公開的上下文中，術語「可切割單元」涉及易於被化學試劑或酶方式（例如蛋白酶）切割的肽序列。蛋白酶可以是序列特異性的（例如凝血酶）或可以具有有限的序列特異性（例如胰蛋白酶）。可切割單元I和II也可以被包括在檢測標籤或多肽的胺基酸序列中，特別是在檢測標籤或多肽的最後一個胺基酸是K或R的情況下也是如此。

如本文所用，本文所用的術語「共軛」或「連接」是指兩個或多個實體連接以形成一個實體。綴合物包括肽-小分子綴合物以及肽-蛋白質/肽綴合物。

術語「融合多肽」或「融合蛋白」是指透過將兩個或更多個多肽序列連接在一起而產生的蛋白質。本公開中包含的融合多肽包括嵌合基因構建體的轉譯產物，前述嵌合基因構建體將編碼第一多肽的核酸序列與編碼第二多肽的核酸序列連接以形成單個開放閱讀框。換言之，「融合多肽」或「融合蛋白」是兩種或更多種蛋白質的重組蛋白，這些蛋白質透過肽鍵或幾種肽連接。前述融合蛋白還可以包含兩個結構域之間的肽接頭。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5包含與SEQ ID NO： 1的胺基酸序列具有至少75%（例如，75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的序列同源性的胺基酸序列。在一些實施方案中，膜聯蛋白A5包含SEQ ID NO： 1的胺基酸序列。

（SEQ ID NO: 1）

AQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDWGDTSGYYQRMLWLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETIDRETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEIDLFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD

可以修復或減輕顱腦損傷等損傷的膜聯蛋白A5可以是天然人膜聯蛋白A5多肽的全長或部分胺基酸序列，也可以是天然人膜聯蛋白A5多肽的全長或部分胺基酸序列的變體。這些天然膜聯蛋白或變體的製備或獲得可以基於任何來源或方法，例如與天然存在的物質直接分離、直接人工合成或這些方法的任何組合。

例如，與人的天然的全長膜聯蛋白A5相比，可用的膜聯蛋白A5的序列同源性為至少97%或至少98%，例如至少在98.5%、至少98.8%或至少99%，例如至少99.3%、至少99.5%、或至少99.6%。這些與人的天然的全長膜聯蛋白A5相比，表現出同源性的胺基酸序列，可以表現為一個胺基酸的不同，兩個胺基酸的不同，三個胺基酸的不同，四個胺基酸的不同，甚至是五個胺基酸、六個胺基酸、七個胺基酸的不同。這些胺基酸的不同，可以是與人的天然的全長膜聯蛋白A5序列上的胺基酸發生的保守胺基酸取代。「保守胺基酸取代」可以指胺基酸被另一胺基酸發生生物學上、化學上或者結構上相似的殘基所取代。結構上相似指的是胺基酸具有相似長度的側鏈，如丙胺酸、甘胺酸或絲胺酸，或具有相似大小的側鏈。化學上相似指的是胺基酸具有相同的荷電、都是親水或者疏水的。例如疏水殘基異亮胺酸、纈胺酸、亮胺酸或者甲硫胺酸相互取代。或者用極性胺基酸例如用精胺酸取代賴胺酸、谷胺酸取代天冬胺酸、穀胺醯胺取代天冬醯胺、絲胺酸取代蘇胺酸等等。

上述表現出同源性的胺基酸序列或者表現出保守胺基酸取代的序列，可以透過人工設計合成獲得；也可以直接存在於自然界的其他物種中。經過研究發現，膜聯蛋白A5序列保守，在不同物種中表現出高的同源性。由於SEQ ID NO：1所示胺基酸序列與天然的人膜聯蛋白A5的胺基酸序列一致，區別僅在於經過SEQ ID NO：1所示序列N末端胺基酸為丙胺酸（A），而天然的人膜聯蛋白A5的N末端為乙醯化丙胺酸。因此下表1中示出的在不同物種中存在的變異位點以及變異胺基酸是以SEQ ID NO：1序列為例進行的比較，其也反應了在自然界的不同物種中，膜聯蛋白A5序列與天然的人膜聯蛋白A5的差異。與SEQ ID NO：1序列相比，在Gorilla大猩猩中發生變異，第三位胺基酸由纈胺酸突變為異亮胺酸。再例如，在文獻J. Mol. Biol. 223 （3），683-704 （1992）以及文獻J. Mol. Biol. 223 （3）， 683-704 （1992）中也有報導，在人中天然人膜聯蛋白也存在變異，即與天然的人膜聯蛋白A5相比，第76位胺基酸由谷胺酸突變為穀胺醯胺或者由谷胺酸突變為甘胺酸。下表1中列出了一些物種中與SEQ ID NO：1序列相比，存在的變異位點以及相應的變異胺基酸，這些序列均可以根據NCBI Access Number在NCBI中獲得，或者直接在相應的參考文獻中獲得。

表1 ：與SEQ ID NO：1相比，不同物種中存在的變異位點及變異胺基酸

物種	SEQ ID NO：1中的對應位點	變異	NCBI Access Number或參考文獻
Gorilla大猩猩	3	V→I	XP_004040389.1
人	76	E→Q	J. Mol. Biol. 223 (3), 683-704 (1992)
人	76	E→G	J. Mol. Biol. 223 (3), 683-704 (1992)
人	134	S→L	CAG38759.1
Lipotes vexillifer白鱀豚	53-54	SA→AV	XP_007464903.1
207	K→R
Orcinus orca虎鯨	53-54	SA→AV	XP_004265141.1
207	K→R
318	D→E
Tursiops truncatus寬吻海豚	53-54	SA→AV	XP_004321032.1
207	K→R
272	M→V
Lagenorhynchus obliquidens太平洋短吻海豚	53-54	SA→AV	XP_026959424.1
207	K→R
272	M→V
88	R→Q
白頰長臂猿 Nomascus leucogenys	141	G→E	XP_003271381.1
209	F→L
317-318	ED→GE
Delphinapterus leucas白鯨	1-3	AQV→SQA	XP_022451968.1
53-54	SA→AV
207	K→R
食蟹獼猴 Macaca fascicularis	105	N→D	NP_001270160.1
317-318	ED→GE
黑冠松鼠猴 Saimiri boliviensis	54	A→E	XP_010345019.1
51	E→K
315	C→CG

根據本公開的實施方案，其中膜聯蛋白A5是天然人膜聯蛋白A5。根據本公開的實施方案，其中膜聯蛋白A5或其功能等效物是在原核表達系統中表達的重組人膜聯蛋白A5。因此，重組人膜聯蛋白A5可以透過原核表達系統快速有效地獲得，且並不昂貴。此外，已經證明重組人膜聯蛋白A5沒有免疫毒性和非常低的免疫原性。A5蛋白在大鼠和食蟹猴中的耐受劑量高於4500 μg/kg，甚至在大鼠中高於9000 μg/kg。在本公開的一些實施方案中，由原核表達系統表達的膜聯蛋白A5的胺基酸序列顯示為SEQ ID NO： 1。SEQ ID NO： 1中顯示的胺基酸序列與天然人膜聯蛋白A5的胺基酸序列相同。

膜聯蛋白A5可以高效快速地獲得，並且已被證明非常安全，即使在高劑量下也不會引起藥物使用風險。它在顱腦損傷的治療中具有重要價值。此外，發現膜聯蛋白A5的序列是保守的，並且在不同物種中具有高度同源性，並且起著相似或相同的作用。這些高度同源或保守的膜聯蛋白A5序列可用於治療顱腦損傷或製備顱腦損傷藥物。例如，在本公開的一些實施方案中，與天然人膜聯蛋白A5相比，膜聯蛋白A5的序列同源性超過96%，或者與SEQ ID NO： 1中所示的序列相比，例如序列同源性超過96.5%、97%、97.5%、98%、98.3%、98.5%、98.8%、99%、99.3%或99.5%。在一些實施方案中，與SEQ ID NO： 1相比，膜聯蛋白A5包含一個保守的胺基酸取代，兩個保守胺基酸取代，三個保守胺基酸取代，四個保守胺基酸取代或五個保守胺基酸取代。這些高度同源或保守胺基酸取代的膜聯蛋白A5可以透過人工設計或密碼子優化合成，也可以從天然膜聯蛋白A5中分離或合成。

根據本公開的一些實施方案，其中膜聯蛋白A5或其功能等效物是注射形式。膜聯蛋白A5可以單次或多次使用。膜聯蛋白A5可以透過靜脈注射、肌肉注射、腹膜內注射、皮下注射、鞘內注射、鼻噴霧劑或口服噴霧劑給藥。膜聯蛋白A5也可以是短期快速用藥，包括但不限於快速靜脈注射、肌內注射、腹腔注射、皮下注射、鞘內注射、鼻噴霧劑、口服噴霧劑等。膜聯蛋白A5可以是持續暴露用藥，包括但不限於持續緩慢靜脈注射、肌內注射、腹腔注射、皮下注射、鞘內注射等。考慮到膜聯蛋白A5屬於蛋白質藥物，優選用凍乾粉或其他特定規格的注射藥物製備注射液，以實現體內快速治療和高生物利用度。

根據本公開的實施例，其中施用膜聯蛋白A5或其功能等效物。在一些實施方案中，膜聯蛋白A5或其變體的劑量為每天0.01 mg-500 mg，優選2 mg -200 mg。例如，劑量可以是0.01 mg-500 mg/天或0.01 mg-450 mg/天，例如0.01 mg-400 mg/天、0.01 mg-350 mg/天、0.01 mg-300 mg/天、0.01 mg-250 mg/天、0.01 mg-200 mg/天等。此外，在一些輕度顱腦損傷患者中，A5蛋白或其變體的劑量可以更少，例如0.01 mg-100 mg/天或0.01 mg-10 mg/天。在一個例子中，如果膜聯蛋白A5的日劑量約為0.05 mg-500 mg，則單位劑型中膜聯蛋白A5或其變體的含量可以適應性調整為0.025 mg-250 mg，例如0.1 mg-50 mg、0.1 mg-100 mg、0.1 mg-200 mg或0.1 mg-250 mg，或1 mg-50 mg、1 mg-100 mg、1 mg-200 mg或1 mg -250 mg，其實例可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200 mg。

透過製備適當的膜聯蛋白A5注射液，可以實現顱腦損傷的治療，並且是安全、非毒性且無副作用的。單位劑型藥物是指將藥物製備成不同劑型時設計的單位劑型。例如，如果片劑的尺寸設計為400毫克，那麼400毫克是單位劑型的藥物。例如，藥物設計為注射劑，每種注射劑獨立包裝為單位劑型。通常，單位劑型的藥物用作一天的日劑量或半天的日劑量。這些單位劑型中膜聯蛋白A5的含量可以在0.025 mg和250 mg之間波動，以及與其他藥物可用載體一起製備成單位劑型。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5的治療有效量在約0.01 mg/kg和約10 mg/kg之間。在一些實施方案中，膜聯蛋白A5的治療有效量在約0.01 mg/kg和約0.5 mg/kg之間。在一些實施方案中，膜聯蛋白A5的治療有效量為約0.02 mg/kg、0.06 mg/kg或0.2 mg/kg。

在一些實施方案中，在從顱腦損傷之時到4周的時間段內施用第一劑藥物，例如所述膜聯蛋白A5、其變體或所述藥物組合物。在一些實施方案中，第一劑藥物在顱腦損傷發生後約0小時、約3小時、約6小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時內施用。在一些實施方案中，在顱腦損傷後約12小時內向患者施用第一劑藥物。在一些實施方案中，在顱腦損傷後約12小時（例如12小時）向患者施用第一劑藥物。

在一些實施方案中，施用於患者的膜聯蛋白A5作為單劑量治療，三劑量QD（每天一次）治療，QD治療（例如，7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天），或BID（每天兩次）治療（例如，7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天）。

在一些實施方案中，前述藥物組合物包含第二劑藥物或療法，例如抗炎劑。

前述抗炎劑可選自醋氯芬酸、阿西美辛、乙醯水楊酸、5-氨基乙醯水楊酸、醛多芬酸、氨芬酸、苯達紮克、苯洛芬、柏莫洛芬、溴芬酸、5-溴醋酸水楊酸、丁氯酸、布替布芬 、咖啡酸、卡洛芬、色甘酸鹽、辛美辛、克林那酸、氯吡酸、雙氯芬酸鈉、二氟尼柳、3,4-二羥基苯甲酸、恩芬那酸、依託度酸、聯苯乙酸、芬布芬、芬氯酸、芬多沙、非諾洛芬、芬替唑、氟芬酸、氟滅酸、氟尼辛、氟氟沙洛芬、氟比洛芬、1-羥基萘甲酸、布芬酸、布洛芬、吲哚美辛、吲哚洛芬、三苯唑酸、伊索克酸、酮洛芬、酮咯酸、洛索洛芬、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美沙拉嗪、3,4-亞甲二氧肉桂酸、美噻嗪酸、莫非佐酸、孟魯司特、麥考酚酸、萘普生、尼氟酸、奧沙拉秦、奧沙丙利、奧沙普秦、吡唑酸、吡洛芬、普拉洛芬、普利替尼酸、舒林酸、舒洛芬、舒昔布松、噻洛芬酸 、替諾啶酸、托芬那酸、托美汀、托品辛、昔布星、昔莫洛芬、紮托洛芬和佐美吡酸。

在一些實施方案中，本公開的方法還包括向患者施用第二劑藥物或療法。在一些實施方案中，在施用膜聯蛋白A5之前，之後或伴隨施用第二劑藥物或療法。

在一些實施方案中，第二劑藥物或治療是心臟保護的藥物或治療，其中所述心臟保護的藥物或治療包括β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制劑、鈣通道阻滯劑、降脂療法、他汀類藥物、硝酸鹽、抗血小板、抗凝血劑（anticlotting agent）、抗凝劑（anticoagulation agent）中的一種或其組合，或將上述藥物應用於治療。

在一些實施方案中，確定患有顱腦損傷的患者的步驟包括對患者進行電腦斷層掃描（CT）掃描或核磁共振成像（MRI）。

在一些實施方案中，基於改進的神經嚴重程度評分（mNSS）、旋轉杆測試、格拉斯哥昏迷評分或格拉斯哥預後評分，將患者鑑定為患有顱腦損傷。在一些實施方案中，mNSS或格拉斯哥昏迷評分在3和8之間、9和12之間或13和15之間。

在一些實施方案中，鑑定患有顱腦損傷的患者的步驟包括：確定來自患者的樣品中生物標誌物的水準；將生物標誌物的水準與生物標誌物的參考水準進行比較；如果確定的生物標誌物水準與生物標誌物的參考水準相比增加，則將患者鑑定為患有顱腦損傷。

在一些實施方案中，生物標誌物可以是IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-8、HMGB1、TGFβ、UCH-L1、NSE、GFAP、S100B、NF蛋白（L和H）、MBP、Tau或磷酸化Tau。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5、其變體或前述藥物組合物（例如，膜聯蛋白A5及/或其變體與第二劑藥物或療法聯合使用）將生物標誌物的水準增加或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%或300%。

在一些實施方案中，樣品是在患者頭部受到物理震動、外部機械力或其他力的鈍性衝擊（導致閉合或開放的頭部創傷）、一次或多次跌倒、爆炸或爆炸或其他類型的鈍性創傷後獲得的。

在一些實施方案中，樣品選自全血樣品、血清樣品、腦脊液樣品和血漿樣品。

在另一方面，本公開還提供了一種降低顱腦損傷患者的生物標誌物水準的方法。前述方法包括：（a）確定患有顱腦損傷的患者；（b）向患者施用治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體，或包含治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體的藥物組合物；其中，前述生物標誌物包含選自IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-8、HMGB1、TGFβ、UCH-L1、NSE、GFAP、S100B、NF蛋白（L和H）、MBP、Tau和磷酸化Tau的細胞因數。

在一些實施方案中，前述藥物組合物包括第二劑藥物或治療劑，例如抗炎劑。

在一些實施方案中，本公開的方法還包括向患者施用第二劑藥物或療法。在一些實施方案中，在施用膜聯蛋白A5之前，之後或伴隨施用第二劑藥物或療法。

在一些實施方案中，膜聯蛋白A5、其變體或所述藥物組合物（例如，膜聯蛋白A5及/或其變體與第二劑藥物或治療劑聯合使用）將生物標誌物的水準增加或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%或300%。

在一些實施方案中，前述膜聯蛋白A5或其變體的治療有效量為使膜聯蛋白A5或其變體將生物標誌物的水準增加或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%的量。

組合物

在治療顱腦損傷時，可以提供包含膜聯蛋白A5及其變體的藥物組合物。根據本方法使用的藥物組合物可以使用一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑，以常規方式配製。因此，膜聯蛋白A5可以透過例如注射、吸入或吹入（透過口腔或鼻子）或口服、口腔、腸胃外或直腸給藥來配製用於給藥。在一個實施方案中，藥劑在局部施用，例如在存在靶細胞的部位施用，例如透過使用貼劑施用。

藥物組合物可以配製用於各種給藥量，包括全身或局部給藥。此類技術和製劑通常可以在Remmington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA找到。對於全身給藥，首選注射，包括肌內、靜脈內、腹膜內或皮下注射。對於注射，藥劑可以配製在液體溶液中，優選在生理相容的緩衝液中，例如漢克溶液（Hank’s solution）或林格溶液（Ringer’s solution）。此外，這些藥劑可以以固體形式配製，並在使用前立即重新溶解或懸浮。本公開的藥物組合物還包括凍乾形式。

對於口服給藥，藥物組合物可以採取例如片劑、錠劑或膠囊的形式。前述片劑、錠劑或膠囊透過常規手段用藥學上可接受的賦形劑如黏合劑（例如，預糊化玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素）製備；填料（例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣）；潤滑劑（例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化矽）；崩解劑（例如馬鈴薯澱粉或澱粉乙醇酸鈉）；或潤濕劑（例如十二烷基硫酸鈉）。片劑可以透過本領域眾所周知的方法包衣。口服給藥的液體製劑可以採取例如溶液，糖漿或懸浮液的形式，或者可以在使用前作為乾燥產品與水或其他合適的媒介物一起呈現。這種液體製劑可以透過常規方法用藥學上可接受的添加劑如懸浮劑（例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪）製備；乳化劑（例如卵磷脂或阿拉伯膠）；非水性載體（例如，陽離子油、油性酯、乙醇或分餾植物油）；和防腐劑（例如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯或山梨酸）。製劑還可酌情含有緩衝鹽、調味品、著色劑和甜味劑。口服給藥製劑可以適當配製以控制活性化合物的釋放。

對於可能氧化及失去生物活性的藥物組合物，特別是液體或半固體形式的藥物組合物，可以在氮氣氣氛中製備，或者密封在一種不含氧氣的膠囊及/或箔包裝中（例如Capsugel™）。

為了吸入給藥，可以使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體，方便地從加壓包裝或霧化器以氣溶膠噴霧形式遞送藥劑。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以透過提供一個閥門來輸送計量的量來確定。用於吸入器或吹入器的膠囊和藥筒（例如明膠膠囊和藥筒）可以配製成含有藥劑的粉末混合物和合適的粉末基質（例如乳糖或澱粉）的形式。

前述藥物組合物可以透過注射配製用於腸胃外給藥，例如透過推注或連續輸注。注射製劑可以單位劑型呈現，例如安瓿或多劑量容器中，並添加防腐劑。這些試劑可以在油或水性載體中以懸浮液、溶液或乳液的形式存在，並且可以含有製劑助劑，例如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，前述活性成分可以是粉末形式，以便在使用前用合適的載體（例如無菌無熱原水）混合。這些試劑也可以配製成直腸組合物，例如栓劑或保留灌腸劑，例如含有常規栓劑基質，例如可哥脂或其他甘油酯。

除了前面描述的製劑之外，藥物組合物也可以配製成長效製劑。這種長效製劑可以透過植入（例如皮下或肌內）或肌內注射給藥。因此，例如，試劑可以用合適的聚合物或疏水材料（例如作為可接受的油中的乳液）或離子交換樹脂或作為微溶性衍生物（例如作為微溶性鹽）配製。控釋製劑還包括貼劑，例如透皮貼劑。貼劑可以與聲波治療儀一起使用，前述超聲波治療儀以特有的波形組合部署超聲波，將通常無法有效透皮遞送的藥物分子引入皮膚。

在一些實施方案中，藥物組合物（包括化妝品製劑）可以包含按重量計的約0.00001至100%，例如0.001至10%或0.1%至5%的本公開所述的一種或多種試劑。

本文所述的藥物組合物也可以引入局部製劑中，此局部製劑含有通常適合於局部給藥的局部製劑輔料，並且包含本領域已知的任何此類材料。可以選擇局部載體以提供所需形式的組合物，例如軟膏、乳液、乳膏、微乳、凝膠、油、溶液，或類似物，並且可以由天然存在或合成來源的材料組成。優選所選載體不會對局部製劑的活性劑或其他組分產生不利影響。本文中使用的合適局部載體的實例包括水、醇和其他非毒性有機溶劑、甘油、礦物油、矽酮、凡士林、羊毛脂、脂肪酸、植物油、對羥基苯甲酸酯、蠟等。

在一些實施方案中，製劑可以是無色、無味的軟膏、乳液、乳膏、微乳和凝膠。藥物組合物可以摻入軟膏中，軟膏通常是半固體製劑，其通常基於凡士林或其他石油衍生物。如本領域技術人員所理解的，所使用的特定軟膏基質將提供最佳藥物遞送，並且優選地，還將提供其他期望的特性，例如潤膚劑等。與其他載體或載體一樣，軟膏基質應該是惰性、穩定、無刺激性和不敏感的。正如雷明頓（Remington）所解釋的，軟膏鹼可分為四類：油性鹼、乳化鹼、乳液基質和水溶性鹼。例如，含油軟膏基質包括植物油、從動物獲得的脂肪和從石油獲得的半固體碳氫化合物。乳化軟膏基質，也稱為吸收性軟膏基質，含有少量或不含水，包括例如羥基硬脂酸硫酸鹽，無水羊毛脂和親水性凡士林。乳液軟膏基質是油包水（W/O）乳液或水包油（O/W）乳液，包括例如十六醇，單硬脂酸甘油酯，羊毛脂和硬脂酸。示例性水溶性軟膏鹼由不同分子量的聚乙二醇（PEG）製備；請參閱上文雷明頓的書籍獲取更多資訊。

在一些實施方案中，藥物組合物可以摻入乳液中，此乳液通常是在沒有摩擦的情況下施用於皮膚表面的製劑，並且通常是液體或半液體製劑，其中包括活性劑在內的固體顆粒存在於水或醇基中。乳液通常是固體懸浮液，可以包含水包油型的液體油乳液。乳液是治療大面積身體的首選製劑，因為它易於塗抹更多的液體成分。通常有必要將洗液中的不溶物細分。乳液通常含有懸浮劑以產生更好的分散體，以及用於定位和保持活性劑與皮膚接觸的化合物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等。與本方法結合使用的示例性乳液製劑包含與親水性凡士林混合的丙二醇，例如可以自Beiersdorf，Inc. （Norwalk， Conn.）以商標Aquaphor™購得。

在一些實施方案中，藥物組合物可以摻入乳膏中，乳膏通常是黏稠的液體或半固體乳液，水包油或油包水。奶油基質可水洗，含有油相、乳化劑和水相。油相通常由凡士林和脂肪醇如十六烷基或硬脂醇組成；水相通常（儘管不一定）的體積超過油相，並且通常含有保濕劑。如上文雷明頓書籍所述，乳膏製劑中的乳化劑通常是非離子、陰離子、陽離子或兩性表面活性劑。

在一些實施方案中，藥物組合物可以摻入微乳中，微乳通常是熱力學穩定的，各向同性的兩種不混溶液體（例如油和水）的透明分散體，由表面活性劑分子的介面膜穩定（Encyclopedia of Pharmaceutical Technology （New York: Marcel Dekker，1992）， volume 9）。對於微乳液的製備，表面活性劑（乳化劑），助表面活性劑（助乳化劑），油相和水相是必需的。合適的表面活性劑包括可用於製備乳液的任何表面活性劑，例如通常用於製備乳膏的乳化劑。助表面活性劑（或「助乳化劑」）通常選自聚甘油衍生物，甘油衍生物和脂肪醇。優選的乳化劑/助乳化劑組合通常雖然不一定選自以下組：單硬脂酸甘油酯和硬脂酸聚氧乙烯酯；聚乙二醇和乙二醇棕櫚硬脂酸酯；辛酸和癸酸甘油三酯和油醯基聚乙二醇甘油酯。水相不僅包括水，而且通常還包括緩衝液，葡萄糖，丙二醇，聚乙二醇，優選較低分子量的聚乙二醇（例如PEG 300和PEG 400）及/或甘油等，而油相通常包括例如脂肪酸酯、改性植物油、矽油、單-二-和甘油三酯的混合物、PEG的單酯和二酯（例如油醯基聚乙二醇甘油酯）等。

在一些實施方案中，藥物組合物可以引入凝膠製劑中，凝膠製劑通常是由小無機顆粒（兩相體系）組成的懸浮液或在整個載液（單相凝膠）中基本均勻分佈的大有機分子組成的半固體體系。例如，可以透過將活性劑、載液和合適的膠凝劑如黃芪膠（2%-5%）、海藻酸鈉（2%-10%）、明膠（2%-15%）、甲基纖維素（3%-5%）、羧甲基纖維素鈉（2%-5%）、卡波姆（0.3%-5%）或聚乙烯醇（10%-20%）混合在一起，直到產生特徵性的半固體產物。其他合適的膠凝劑包括甲基羥基纖維素、聚氧乙烯-聚氧乙烯、羥乙基纖維素和明膠。雖然凝膠通常使用含水載液，但醇和油也可以用作載液。

本領域技術人員已知的各種添加劑可以包括在製劑中，例如局部製劑。添加劑的實例包括但不限於增溶劑、皮膚滲透促進劑、混濁劑、防腐劑（例如抗氧化劑）、膠凝劑、緩衝劑、表面活性劑（特別是非離子和兩性表面活性劑）、乳化劑、潤膚劑、增稠劑、穩定劑、保濕劑、著色劑、香料等。特別優選包含增溶劑及/或皮膚滲透促進劑以及乳化劑、潤膚劑和防腐劑。最佳局部製劑包含約：2重量%至60重量%，優選2重量%至50重量%的增溶劑及/或皮膚滲透促進劑；2重量%至50重量%，優選2重量%至20重量%的乳化劑；2重量%至20重量%的潤膚劑；和0.01至0.2重量%的防腐劑，其中活性劑和載體（例如水）構成製劑的剩餘部分。皮膚滲透促進劑用於促進治療水準的活性劑透過合理大小的未破裂皮膚區域。合適的增強劑在本領域是眾所已知的，並且包括例如：低級烷醇如甲醇、乙醇和2-丙醇；烷基甲基亞碸，如二甲基亞碸（DMSO）、癸基甲基亞碸（C ₁₀MSO）和十四烷基甲基亞碸；吡咯烷酮，如2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮和N-（羥乙基）吡咯烷酮；尿素；N, N-二乙基間甲苯醯胺；C _2-6烷二醇；其他溶劑，如二甲基甲醯胺（DMF）、N,N-二甲基乙醯胺（DMA）和四氫糠醇；和1-取代的氮雜環庚烷-2-酮類，特別是1-正十二烷基環氮雜環庚烷-2-酮（月桂氮䓬酮；可從維吉尼亞州里士滿的Whitby Research Incorporated以Azone ^RTM商標購得）。

增溶劑的實例包括但不限於下列物質：親水性醚，例如二甘醇單乙醚（乙氧基二甘醇，可以Transcutol™商購）和二乙二醇單乙醚油酸酯（可以Softcutol™商購）；聚乙烯蓖麻油衍生物，如聚氧基35蓖麻油、聚氧基40氫化蓖麻油等；聚乙二醇，特別是較低分子量的聚乙二醇，如PEG 300和PEG 400，以及聚乙二醇衍生物，如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯（可以Labrasol™商購）；烷基甲基亞碸如DMSO；吡咯烷酮如2-吡咯烷酮和N-甲基-2-吡咯烷酮；和DMA。許多增溶劑也可以作為吸收促進劑。可以將單一增溶劑摻入製劑中，或者可以將增溶劑的混合物摻入其中。

合適的乳化劑和助乳化劑包括但不限於關於微乳液製劑描述的那些乳化劑和助乳化劑。潤膚劑包括例如丙二醇、甘油、肉豆蔻酸異丙酯、丙二醇-2（PPG-2）肉豆蔻醚丙酸酯等。

在一些實施方案中，製劑中還可以包括其他活性劑，例如抗炎劑、鎮痛劑、抗菌劑、抗真菌劑、抗生素、維生素、抗氧化劑和防曬霜製劑中常見的防曬劑，包括但不限於鄰氨基苯甲酸鹽、二苯甲酮類（特別是二苯甲酮-3）、樟腦衍生物、肉桂酸酯（例如甲氧基肉桂酸辛酯）、二苯甲醯基甲烷（例如，丁基甲氧基二苯甲醯基甲烷），對氨基苯甲酸（PABA）及其衍生物，以及水楊酸鹽（例如，水楊酸辛酯）。在某些局部製劑中，活性劑的存在量在製劑的約0.25重量%至75重量%範圍內，優選在製劑的約0.25重量%至30重量%範圍內，更優選在製劑的約0.5重量%至15重量%範圍內，並且最優選在製劑的約1.0重量%至10重量%的範圍內。局部皮膚治療組合物可以包裝在合適的容器中以適合其黏度和消費者的預期用途。例如，洗液或乳膏可以包裝在瓶子或滾球塗抹器中，或推進劑驅動的氣溶膠裝置或裝有適合手指操作的泵的容器中。當組合物是奶油時，它可以簡單地儲存在不變形的瓶子或擠壓容器中，例如管或有蓋的罐子。此組合物也可以包含在諸如美國專利5,063,507中描述的那些膠囊中。因此，還提供了含有美容上可接受的組合物的封閉容器。

在一些實施方案中，提供了用於口服或腸胃外給藥的藥物製劑，在這種情況下，製劑可以包含如上所述的含有微乳的活化化合物，並且可以包含特別適合口服或腸胃外給藥的替代藥學上可接受的載體，載體，添加劑等。或者，基本上可以如上所述口服或腸胃外施用含有微乳的活化化合物，而不進行修飾。

定義

為了説明理解根據本公開的組合物和方法，本文提供了一些明確的定義，以便於明確地公開本公開的各個方面。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本公開所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

如本文所用，「患者」是指人類和非人類動物。非人動物的例子包括所有脊椎動物，例如哺乳動物，例如非人哺乳動物、非人靈長類動物（特別是高等靈長類動物）、狗、齧齒動物（例如小鼠或大鼠）、豚鼠、貓和兔，以及非哺乳動物，例如鳥類、兩棲動物、爬行動物等。在一個實施例中，患者是人。在另一個實施例中，患者是實驗動物或適合作為疾病模型的動物。

本文所用的「治療」是指向患有疾病的患者施用化合物或藥劑，目的是治癒、緩解、減輕、補救、延遲疾病的發作，預防或改善疾病、疾病的症狀、繼發於疾病的疾病狀態或對疾病的易感性。

「有效量」或「治療有效量」是指能夠在治療物件中產生醫學上期望的結果的化合物或藥物的量。治療方法可以在體內或離體，單獨或與其他藥物或療法聯合進行。治療有效量可以以一次或多次給藥、應用或劑量中給藥，並且不限於特定的製劑或給藥途徑。

如本文所用，術語「體外」是指在人造環境中發生的事件，例如在試管或反應容器中，在細胞培養等中，而不是在多細胞生物體內。

如本文所用，術語「體內」是指在多細胞生物體內發生的事件，例如非人類的動物。

本文中使用的術語「疾病」通常是同義詞，並且可以與術語「紊亂」和「狀況」（如在醫療狀況中）互換使用，因為所有這些都反應了人體或動物身體或其損害正常功能的一個部分的異常狀況，通常表現為明顯的體徵和症狀，並導致人類或動物的壽命或生活品質降低。

術語「減少」、「降低」、「減輕」或「抑制」在本文中通常都是指統計上顯著的減少量。然而，為免生疑問，「減少」、「降低」、「減輕」或「抑制」是指與參考水準相比減少至少10%，例如減少至少約20%，或至少約30%，或至少約40%，或至少約50%，或至少約60%，或至少約70%，或至少約80%，或至少約90%或高達並包括100%的降低（例如，與參考樣品相比不存在），或與參考水準相比在10%-100%之間的任何降低。

如本文所用，術語「調節」意指生物狀態的任何變化，即增加、減少等。

這裡使用的術語「增加」、「提高」、「增強」或「啟動」通常意味著靜態顯著量的增加；為避免任何疑問，術語「增加」、「提高」、「增強」或「啟動」是指與參考水準相比至少增加10%，例如增加至少約20%，或至少約30%，或至少約40%，或至少約50%，或至少約60%，或至少約70%，或至少約80%，或與參考水準相比至少約90%或高達並包括100%的增加或10%-100%之間的任何增加，或與參考水準相比至少約2倍，或至少約3倍，或至少約4倍，或至少約5倍或至少約10倍的增加，或2倍至10倍或更大的任何增加。

術語「有效量」或「有效劑量」定義為足以達到或至少部分達到所需效果的量。藥物或治療劑的「治療有效量」或「治療有效劑量」是指當單獨使用或與另一種治療劑聯合使用時，促進疾病消退的任何藥物量，其表現為疾病症狀的嚴重程度降低、無症狀期的頻率和持續時間增加，或預防由於疾病折磨而導致的損害或殘疾。藥物的「預防有效量」或「預防有效劑量」是指當單獨或與另一種治療劑聯合給處於疾病發展或疾病復發風險的患者時，抑制疾病發展或復發的藥物量。可以使用本領域已知的各種方法評估治療劑或預防劑促進疾病消退或抑制疾病發展或復發的能力，例如在臨床試驗期間的人類患者中，在預測人類功效的動物模型系統中，或透過在體外測定中測定藥劑的活性。

劑量通常與體重有關。因此，表示為[g，mg或其他單位]/kg（或g，mg等）的劑量通常是指[g，mg或其他單位]「每kg（或g，mg等）體重」，即使沒有明確提到「體重」一詞也應如此。

術語「試劑」、「藥劑」在本文中用於表示化合物、化合物混合物、生物大分子（例如核酸、抗體、蛋白質或其部分，例如肽）或由生物材料製成的提取物，例如細菌、植物、真菌或動物（特別是哺乳動物）細胞或組織。這些藥物的活性可能使其適合作為「治療劑」，這是一種在患者體內局部或全身起作用的生物，生理或藥理活性物質（或多種物質）。

術語「治療劑」、「能夠治療的藥物」或「治療劑」可以互換使用，是指在給患者服用時賦予某些有益效果的分子或化合物。有益的效果包括啟用診斷測定；疾病、症狀、紊亂或病理狀況的改善；減少或預防疾病、症狀、紊亂或病症的發作；通常對抗疾病、症狀、紊亂或病理狀況。

除非上下文另有明確說明，否則本文使用的「聯合」療法意味著包括以協調的方式施用兩種或更多種治療劑，並且包括但不限於同時給藥。具體而言，聯合治療包括共同給藥（例如，共同製劑的給藥或單獨治療組合物的同時給藥）和連續或順序給藥，前提是一種治療劑的給藥以某種方式取決於另一種治療劑的給藥。例如，只有在施用了不同的治療劑並允許其在規定的時間段內起作用後，才能施用一種治療劑。例如，參見Kohrt等人（2011）Blood 117：2423。

「樣品」、「測試樣品」和「患者樣品」可以在本文中互換使用。樣品可以是血清、尿血漿、羊水、腦脊液、細胞（例如產生抗體的細胞）或組織的樣品。這種樣品可以直接從患者那裡獲得，也可以透過過濾、蒸餾、提取、濃縮、離心、干擾成分滅活、添加試劑等方式進行預處理，以改變樣品的性質，如本文所述或本領域已知的其他方式。本文使用的術語「樣品」和「生物樣品」通常是指正在測試及/或懷疑含有感興趣的分析物（例如抗體）的生物材料。樣品可以是來自患者的任何組織樣品。樣品可能包含來自患者的蛋白質。

如本文所使用的術語「抑制」和「拮抗」是指以可測量的量減少分子、反應、相互作用、基因、mRNA及/或蛋白質的表達、穩定性、功能或活性或完全防止以上情況。抑制劑是例如結合、部分或完全阻斷刺激、減少、阻止、延遲啟動、失活、脫敏或下調蛋白質、基因和mRNA穩定性、表達、功能和活性的化合物，例如拮抗劑。

組合物的「腸胃外」給藥包括例如皮下（s.c.）、靜脈內（i.v.）、肌內（i.m.）或胸骨內注射或輸注技術。

如本文所用，術語「藥物組合物」是指本公開中使用的至少一種化合物與其他化學成分（例如載體、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑）的混合物。此藥物組合物有助於向生物體施用此化合物。

本領域存在多種施用化合物的技術，包括但不限於靜脈內、口服、氣霧劑、腸胃外、眼科、肺部和局部施用。

如本文所用，術語「藥學上可接受的」是指不消除組合物的生物活性或性質並且相對非毒性的材料，例如載體或稀釋劑。這些材料可以給個體施用，而不會引起不良的生物效應或以有害的方式與所含組合物的任何組分相互作用。

術語「藥學上可接受的載體」包括藥學上可接受的材料、組合物或載體，例如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，其涉及在患者內或向患者內攜帶或運輸本公開化合物，以使其可以執行其預期功能。通常，這些化合物從一個器官或身體的一部分攜帶或運輸到另一個器官或身體的一部分。每種鹽或載體必須在與製劑的其他成分相容的意義上是「可接受的」，並且不會對患者造成傷害。可以用作藥學上可接受的載體的材料的一些例子包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；黃芩粉；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，如可哥脂和栓劑蠟；花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油等油；乙二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格溶液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；稀釋劑；造粒劑；潤滑劑；黏合劑；崩解劑；潤濕劑；乳化劑；著色劑；脫模劑；塗層劑；甜味劑；調味劑；香料；防腐劑；抗氧化劑；增塑劑；膠凝劑；增稠劑；硬化劑；凝結劑；懸浮劑；表面活性劑；保濕劑；載體；穩定劑；和藥物製劑中使用的其他非毒性相容物質，或其任何組合。如本文所用，「藥學上可接受的載體」還包括與化合物的活性相容並且在生理上可被患者接受的任何和所有塗層、抗菌劑和抗真菌劑以及吸收延遲劑等。補充活性化合物也可以摻入組合物中。

如本文所用，語言「藥學上可接受的鹽」是指由藥學上可接受的非毒性酸（包括無機酸、有機酸、溶劑化物、水合物或其包合物）製備的給藥化合物的鹽。

這裡注意到，如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，除非上下文另有明確規定，否則單數形式也包括複數。

除非另有說明，術語「包括」、「包含」或「具有」及其變型意指包括其後列出的專案及其等價物以及其他主題。

短語「在一個實施方案中」、「在各種實施方案中」、「在一些實施方案中」等被重複使用。這些短語不應當理解為是指同一實施方案，但除非上下文另有規定，否則它們可能指代同一實施方案。

術語「及/或」或「/」是指與此術語相關的任何專案、專案的任何組合或所有專案。

「基本上」一詞並不排除「完全」，例如，「基本上沒有」Y的成分可以完全沒有Y。必要時，可以從本公開的定義中省略「基本上」一詞。

如本文所用，應用於一個或多個數值的術語「約」或「大約」是指類似於所述參考值的值。在一些實施方案中，術語「約」或「大約」是指在所述基準值的基礎上增加或減少25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%範圍內的值的範圍，除非另有說明或上下文另有說明（除非此數字超過可能值的100%）。除非本文另有說明，否則術語「約」或「大約」旨在包括接近所述範圍的值，例如重量百分比，這些值在單個成分、組合物或實施例的功能方面是等效的。

應當理解，在本文提供值和範圍的內容中，這些值和範圍所包含的所有值和範圍都意在包含在本公開的範圍內。此外，本申請還考慮了落在這些範圍內的所有值以及一系列值的上限或下限。

如本文所用，術語「每一個」當用於指代專案集合時，旨在識別集合中的單個專案，但不一定指集合中的每個專案。如果明確的披露或上下文明確規定了其他情況，則可能會發生例外。

除非另有要求，否則使用本文提供的任何和所有示例或示例性語言（例如「例如」或「如」）僅旨在更好地闡明本公開，並且不限制本公開的範圍。說明書中的任何描述都不應被解釋為表明任何未要求保護的技術特徵對於本公開的實踐至關重要。當在本檔中使用時，「示例性」一詞旨在表示「透過示例」，而不是表示優選或需要特定的示例性專案。

除非本文另有說明或上下文另有明確矛盾，否則本文所述的所有方法均以任何合適的順序進行。關於所提供的任何方法，此方法的步驟可以同時或順序發生。除非另有說明，否則當方法的步驟順序發生時，步驟可以以任何順序發生。

在方法包括步驟組合的情況下，除非本文另有說明，否則步驟的每個組合或子組合都包含在本公開的範圍內。

本文引用的每個出版物、專利申請、專利和其他參考文獻均透過引用整體合併，但其與本公開不一致。本文公開的出版物僅用於在本公開的申請日期之前公開。本文中的任何內容都不應被解釋為承認本公開無權憑藉先前的發明提前發佈。此外，提供的發佈日期可能與實際發佈日期不同，可能需要獨立確認。

應當理解，本文描述的示例和實施例僅用於說明目的，並且將向本領域技術人員建議根據其進行的各種修改或改變，並且將包括在本申請的精神和範圍以及所附申請專利範圍的範圍內。

實施例

實施例 1

此實施例描述了以下實施例中使用的實驗設計以及材料和方法。

按照如下方式進行實驗：

1.1實驗1

為了研究膜聯蛋白A5（A5）是否對顱腦損傷產生治療作用，在顱腦損傷（TBI）模型建立後立即給予A5，劑量為0.02 mg/kg、0.06 mg/kg和0.2 mg/kg。然後在顱腦損傷後6h、24h、30h和48h給予相同劑量的A5。假手術組和模型組平行用相同體積的載體處理。在受傷後24小時、48小時和72小時，使用改良的神經系統嚴重程度評分（mNSS）和旋轉杆試驗評估神經系統結局。用TUNEL法和免疫螢光觀察分別評估細胞凋亡和神經膠質啟動水準。

1.2實驗2

為了進一步評估A5對TBI動物的神經學保護作用的時間過程，將A5以單劑量治療，三劑量QD（每天一次）治療，QD治療7天和BID（每天兩次）治療各7天。所有A5治療首先在TBI建立後立即進行。在TBI後24小時、48小時、72小時和168小時進行mNSS評估和旋轉杆試驗。

1.3實驗3

治療時間窗（即TBI發作與開始治療之間的時間間隔）是治療TBI藥物的關鍵要素。大多數在動物TBI模型中測試過的藥物隨著損傷與首次治療時間間隔的增加而失去療效。例如，當大鼠在中度腦損傷後15分鐘首次給藥時，N型Ca ²⁺通道阻滯劑齊考諾肽（ziconotide）改善粒線體功能，但在損傷後1至10小時首次給藥時迅速失去功效。

將治療TBI的大鼠分為四個A5治療組，以確定A5的可能治療時間窗，其中在TBI後立即（0h）、3 h、6 h和12 h給予A5 0.2 mg/kg。在TBI後6小時、24小時、30小時和48小時給予相同劑量。在TBI後24小時、48小時和72小時進行mNSS測試和旋轉杆試驗。實驗結束時，透過ELISA方法評估同側半球的細胞因數水準。

1材料和方法

1.1 動物

所有動物護理和實驗程式均符合中華人民共和國衛生部動物管理條例（2001年第55號檔）的指導方針，並經中國醫學科學院實驗動物倫理委員會批准。成年雄性Sprague-Dawley大鼠（200 g~220 g）獲自Vital River Laboratories Technology Co., Ltd.（中國北京）。將動物保持在濕度為45%~70%，溫度受控（21 ℃~26 ℃）的房間中，進行12小時光照/黑暗迴圈，自由攝取標準的齧齒動物飼料和水。

1.2 手術程式和藥物管理

將經異氟醚麻醉的大鼠插管並置於立體定向框架（型號6801，RWD Life Science Co.，LTD，中國深圳）中。在右半球前囟後1 mm和矢狀縫線外側2 mm處進行直徑為5 mm的顱骨切除術，並使用可擕式鑽頭去除骨瓣。使用改良的Feeney落體打擊損傷（Feeney’s weight-drop injury，WDI）模型，透過將5毫米衝擊杆推進暴露的頂葉皮層，然後使40克體重從25釐米高度落下，來誘發TBI。假手術組大鼠接受外科手術，而沒有使用載體處理的影響。根據實驗設計部分的描述靜脈內施用測試物或載體（0.7%鹽水）。手術後，將動物飼養在上述相同條件下。

1.3 神經功能評估

使用改良的神經系統嚴重程度評分（mNSS）評估神經系統結局，這是由感覺、平衡、運動和反射測試組成的多功能評估量表（表2）。此測量由對個體治療不知情的觀察者進行。神經功能評分為0-18（正常評分為0；最大缺陷評分為18）。得分越高，神經損傷越嚴重。

表2：改良的神經系統嚴重程度評分（mNSS）

測試	點
運動測試
用尾巴提起老鼠
前肢屈曲	1
後肢屈曲	1
頭部移動超過10°（垂直軸）	1
將老鼠置於地面
無法筆直行走	1
向麻痹側旋轉	1
向麻痹側摔倒	1
感官測試
視覺和觸覺放置	1
本體感受測試（深層感覺）	1
光束平衡測試
抓住梁的側面	1
擁抱橫樑，一條腿從橫樑上掉下來	2
擁抱橫樑，兩條腿從橫樑上掉落或在橫樑上旋轉（＞60 s）	3
試圖在橫樑上保持平衡，但摔倒（＞40 s）	4
試圖在橫樑上保持平衡，但摔倒（＞20 s）	5
脫落：未試圖平衡或抓住橫樑（＜20 s）	6
反射（鈍性或尖銳刺激）缺乏：
耳廓反射（觸摸耳道時搖頭）	1
角膜反射（用棉花輕輕觸摸角膜時眨眼）	1
驚嚇反射（對短暫的大聲紙張噪音的運動反應）	1
癲癇發作、肌陣攣、肌營養不良	1
最大點數	18

*無法執行任務或缺乏測試反射，得一分。

1.4 旋轉杆試驗

進行旋轉杆測試以評估全身運動功能，尤其是協調和平衡。將大鼠放置在旋轉杆氣缸上，轉速在180秒內從5 rpm緩慢增加到25 rpm。將每隻大鼠留在旋轉杆上的時間記錄為跌倒潛伏期。將超過180秒的跌倒潛伏期記錄為180秒。每個實驗重複3次，並使用三次測試的平均值。

1.5 腦組織製備和TUNEL染色

將經異氟烷麻醉的大鼠心內灌注0.1 M PBS，然後在0.1 M PBS中灌注4%多聚甲醛（PFA）。取出整個大腦，進一步在4% PFA中固定48小時，並包埋在石蠟中。將冠狀切片（4 μm厚）安置在載玻片上，用於隨後的TUNEL染色。

簡言之，將腦組織切片脫石蠟並用梯度乙醇洗滌再水化。透過將切片在不含DNase的20 μg/ml蛋白酶K中於37℃孵育25分鐘來進行抗原修復。在搖床上以5分鐘的間隔在PBS中洗滌三次後，以80 μL/切片的體積加入TUNEL染色溶液，並在37℃的黑暗中孵育75分鐘。加入Hoechst33342在室溫下染色細胞核15分鐘。每隔5分鐘用PBS洗滌三次後，將切片固定。使用ECLIPSE 80i（尼康公司醫療保健業務部）螢光顯微鏡捕獲圖像。從受傷部位附近的區域每個部分拍攝三張分開的圖像。分析了總共3張圖像的TUNEL陽性細胞計數。

1.6 冷凍切片和免疫螢光染色

將經異氟烷麻醉的大鼠心內灌注0.1 M PBS，然後在0.1 M PBS中灌注4%多聚甲醛（PFA）。取出整個大腦，進一步在4% PFA中固定48小時，然後在10%、20%和30%蔗糖溶液中脫水，直到大腦依次沉入管底。將大腦從30%蔗糖溶液中取出，並在異戊烷中冷凍15秒。將冠狀冷凍切片（25 μm厚）保存在-80℃的冰箱中直至染色。將冷凍切片從-80℃冰箱中取出並用PBS洗滌三次。然後將切片與山羊血清在室溫下孵育1小時，然後在4℃下用第一抗體免疫染色過夜。每隔5分鐘用PBS洗滌三次後，將切片與二抗在室溫下孵育1小時，然後洗滌並固定。使用ECLIPSE 80i（尼康公司醫療保健業務部）透過螢光顯微鏡捕獲圖像。

1.7 血清細胞因數水準測量

透過心臟穿刺在大鼠終點收集血樣。血液樣本在室溫下放置40分鐘以凝結，然後在4 ℃下以5000 rpm離心5分鐘。將血清再次在4 ℃下以13000 rpm離心5分鐘，然後保存在-80 ℃的冰箱中直至使用。根據製造商的說明，使用基於珠子的LEGENDplex多分析物流式測定試劑盒（Biolegend，美國聖地牙哥）和BD FACSVerse流式細胞儀（BD Biosciences）測量血清中的IL-1β，TNF-α和IFN-γ水準。

1.8 酶聯免疫吸附測定（ELISA）

用異氟烷麻醉的大鼠用0.7%鹽水心內灌注。取出全腦，將同側腦組織稱重並在含有蛋白酶抑制劑混合物的冰冷PBS（pH7.4）中勻漿，然後在4℃下以13000 rpm離心30分鐘。收集上清液並再次在4℃下以13000 rpm離心30分鐘。收集上清液並用於評估IL-1β，TNF-α和IFN-γ的水準。

對於IL-1β和IFN-γ的測量，根據製造商的說明使用Peprotech ABTS ELISA開發試劑盒（美國新澤西州）。用ELISA酶標儀在405 nm波長下測量細胞因數濃度，波長校正設置為620 nm，並使用標準曲線進行定量。對於TNF-α的測量，根據製造商的說明使用Thermo未包被的ELISA試劑盒。簡言之，將捕獲抗體用包被緩衝液稀釋為1：250，並以100 μL/孔的濃度添加到96孔微孔板中。將微孔板在4℃的黑暗中孵育過夜。在室溫下用稀釋緩衝液封閉孔2小時並洗滌4次後，將標準品和樣品加入孔中並在室溫下孵育2小時。用洗滌緩衝液洗滌4次後，將檢測抗體（用包被緩衝液1稀釋1：250）加入孔中，並在室溫下孵育1小時。然後洗滌孔，依次加入抗生物素蛋白-HRP。用ELISA讀板儀在450 nm波長下測量細胞因數濃度，波長校正設置為570 nm，並使用標準曲線進行定量。

1.9統計分析

使用GraphPad Prism 7.00軟體進行分析。所有資料均以平均值±SEM表示。使用雙尾t檢驗來確定兩組之間的差異，並且對三個或更多組使用單向Dunnett事後檢驗。進行了雙因素方差分析（Two-Way ANOVA），然後進行了Bonferroni事後檢驗，以進行多重比較。 P＜0.05的值被認為具有統計學意義。

實施例2

2.1 膜聯蛋白A5的治療劑量依賴性地改善大鼠TBI後的神經功能缺損

使用改良的神經嚴重程度評分（mNSS）在大鼠中評估TBI後和膜聯蛋白A5治療後的神經功能，此評分包括運動（肌肉狀態和異常運動）、感覺（視覺、觸覺和本體感受）、反射和光束行走測試。所有測量均由對個體治療不知情的觀察者進行。mNSS評分越高，感覺運動功能越差。在損傷後24小時，模型組的所有大鼠的mNSS評分均高於11，表明本研究中Feeney的落體打擊模型導致神經功能缺損。在損傷後24~72小時，以0.02~0.2 mg/kg A5處理的TBI大鼠的mNSS評分以劑量依賴性方式顯著低於模型組（圖1A），表明功能性結果得到改善。

進行旋轉杆測試以評估運動和平衡協調性。如圖1B所示，旋轉杆測試結果顯示，在TBI後24至72小時，模型組的跌倒潛伏期顯著短於假手術組（ p＜0.001）。這些結果表明，Feeney的落體打擊模型導致了本研究中的運動和平衡協調缺陷。相比之下，在損傷後24小時，用0.02 mg/kg至0.2 mg/kg A5處理的TBI大鼠以劑量依賴的方式表現出明顯更長的跌倒潛伏期（ p＜0.05或 p＜0.001）。在TBI後48 h和72 h，0.06 mg/kg A5和0.2 mg/kg A5處理組的跌倒潛伏期明顯長於模型組（ p＜0.01或 p＜0.001）。然而，在損傷後48小時和72小時，與模型組相比，最低劑量（0.02 mg/kg）的膜聯蛋白A5未能顯示出明顯更長的跌倒潛伏期（ p＞0.05）（圖1B）。這些結果表明，在急性期用0.06 mg/kg至0.2 mg/kg A5治療可以挽救TBI損傷引起的運動和平衡缺陷。

上述結果表明，急性期時，膜聯蛋白A5的治療劑量依賴性地改善大鼠TBI後的神經功能缺損，在0.2 mg/kg時改善大鼠TBI後的神經功能缺損約60%，表明A5在臨床上對TBI的治療功效。

2.2 膜聯蛋白A5減弱TBI後的腦組織細胞凋亡

在TBI後72小時，透過TUNEL測試評估TBI後大腦中的凋亡細胞。假手術大鼠大腦手術側的TUNEL染色可忽略不計。模型組TBI後72小時觀察到凋亡細胞和細胞間凋亡片段顯著增加（ p＜0.001，與假手術組相比），表明TBI誘發腦組織顯著凋亡。與之相比，0.2 mg/kg膜聯蛋白A5處理組的凋亡細胞或片段數量顯著降低（與模型組相比， p＜0.05）。如透過TUNEL染色所表徵的，0.2 mg/kg膜聯蛋白A5的處理使得TBI後腦組織中細胞凋亡減少約42%。這些結果表明，以0.2 mg/kg膜聯蛋白A5治療可以減輕TBI誘發的腦細胞凋亡（圖2）。

2.3 膜聯蛋白A5抑制TBI後小膠質細胞的活化

免疫螢光法用於檢測星形膠質細胞活化標誌物膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達。假手術組僅計數到少量GFAP陽性細胞。TBI建立72小時後，與假手術組相比，模型組大鼠星形膠質細胞GFAP陽性染色數量增加，反應性星形膠質細胞顯著增加（ p＜0.001）。模型組表達GFAP的反應性星形膠質細胞也表現出以擴大和變形蟲形細胞體為特徵的形態。然而，膜聯蛋白A5的處理不抑制反應性星形膠質細胞，並且表達GFAP的細胞沒有顯著減少。

使用免疫螢光法檢測小膠質細胞特異性蛋白IBA-1，以觀察小膠質細胞的活化情況。假手術組可見少量IBA-1陽性細胞。TBI後72 h，模型組活性小膠質細胞數量明顯增加。模型組細胞體呈阿米巴狀增大。與假手術組相比，模型組IBA-1的表達顯著增加（ p＜0.001），表明TBI誘發的小膠質細胞活化。0.2 mg/kg膜聯蛋白A5的處理顯著降低了IBA-1的表達，在TBI後72小時以劑量依賴性方式降低了約60%（ p＜0.05，與模型組相比），表明膜聯蛋白A5的處理抑制了小膠質細胞的活化（圖3）。

2.4 膜聯蛋白A5治療大鼠TBI後神經功能缺損的時間過程

TBI導致mNSS的顯著早期缺陷和旋轉杆測試的跌倒潛伏期，並且兩種測試均顯示TBI誘發的損傷隨著時間的推移逐漸減少。

對於mNSS測試，如圖4頂部所示，A5 BID 7 d、A5 QD 7 d和A5 QD 3 d處理組的mNSS評分沒有差異。雙因素方差分析（Two-Way ANOVA）和Bonferroni調整的多重比較（Bonferroni adjusted multiple comparisons）顯示，與模型組相比，所有這3種治療均具有顯著的組主效應（ p＜0.001）。

對於圖4底部所示的旋轉杆試驗，對跌倒潛伏期的雙因素方差分析和Bonferroni調整後的多重比較顯示，與模型組相比，A5 BID 7 d組的表現更好（ p＜0.001）。與模型組相比，A5 QD 7 d和A5 QD 3 d治療組的跌倒潛伏期隨時間沒有顯著改善（ p＞0.05）。

這些結果表明，A5 BID治療是治療TBI誘發的大鼠神經功能缺損的更好方法。

2.5 膜聯蛋白A5在大鼠TBI發作後的治療時間視窗長達12小時

大多數用於TBI治療的藥物隨著損傷與首次給藥時間間隔的增加而失去療效。例如，當大鼠在中度TBI後15分鐘首次給藥時，N型Ca ²⁺通道阻滯劑齊考諾肽改善了粒線體功能，但在損傷後1小時首次給藥時迅速失去了功效。因此，用多種結局指標評估治療時間窗正在成為TBI治療藥物臨床前評估的標準組成部分。

TBI大鼠在TBI後0、3、6或12小時（n=5）給予載體或0.2 mg/kg A5，然後每天兩次給藥直至TBI後48小時，並在24、48和72小時，透過mNSS測試和旋轉杆測試評估治療的功效。旋轉杆測試後，根據上述方法獲得腦組織用於細胞因數水準測試。

模型組的mNSS評分顯著高於假手術組，跌倒潛伏期顯著短於假手術組，表明實驗性TBI模型導致神經功能缺損。雙因素方差分析顯示各組之間存在顯著差異（ p＜0.001）。Bonferroni事後檢驗顯示，與模型組相比，0 h、6 h和12組的mNSS評分顯著降低（圖5頂部）。在3h組和模型組之間未觀察到mNSS評分的顯著差異，這可能是由於此實驗中動物數量有限（n=5）。各組的跌倒潛伏期雙因素方差分析也有顯著性差異（p＜0.001）。進一步的Bonferroni事後檢驗還顯示，與模型組相比，0 h、3 h、6 h和12 h組的跌倒潛伏期顯著延長（圖5底部）。

治療時間窗實驗表明，在損傷後12小時給予0.2 mg/kg的膜聯蛋白A5治療，可將大鼠TBI後的神經功能缺損減輕約38%。這些結果表明，膜聯蛋白A5可以在TBI後12小時內給藥，並在此TBI大鼠模型中維持一定的治療效果。

上述結果表明，A5減輕了TBI誘發的神經功能缺損，並且在受傷後12小時內給藥可以發揮治療效果。因此，接下來研究了A5對TBI後72小時的TBI大鼠炎症反應的影響。使用ELISA法檢測同側大腦半球細胞因數IL-1β、TNF-α和IFN-γ的水準。與假手術組相比，模型組的IL-1β表達水準顯著升高（ p＜0.01），表明TBI誘發了大鼠的神經炎症反應。與模型組相比，6小時和12小時時間窗組的IL-1β水準顯著降低。在損傷後以0.2 mg/kg膜聯蛋白A5給藥12小時治療，大鼠TBI後的IL-1β表達降低約100%。對於TNF-α和IFN-γ水準，兩組之間沒有統計學差異（圖6）。

實施例 3

膜聯蛋白A5來源於人源的全長膜聯蛋白。透過構建重組載體，在原核生物大腸桿菌（ E. coli）體內大量表達。所表達的A5蛋白經過序列測定，其胺基酸序列為： AQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDVVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETIDRETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEIDLFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD（SEQ ID NO：1）

如SEQ ID NO：1所示，經過大腸桿菌表達系統所表達的A5蛋白含有319個胺基酸，其完成的cDNA序列由320個胺基酸的密碼子編碼，N末端的甲硫胺酸在表達過程中被切除。此SEQ ID NO：1胺基酸序列與天然的人膜聯蛋白A5的胺基酸序列一致，區別僅在於經過此系統所表達的A5蛋白的N末端胺基酸為丙胺酸（A），而天然的人膜聯蛋白A5的N末端為乙醯化丙胺酸。

然後利用實施例3所獲得的A5蛋白進行如下實驗。

實施例 4

參照文獻 Behavioral deficits and recovery following transient focal cerebral ischemia in rats： glutamatergic and GABAergic receptor densities（Jolkkonen J, Gallagher NP, Zilles K, Sivenius J.Behav Brain Res 2003;138:187–200）和文獻Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. （Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R.Stroke 1989;20:84–91）所記載的內容，採用頸內動脈線栓法製備大腦中動脈阻塞（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）腦缺血再灌注模型，分別設置A5 0.1 mg/kg，A5 1.0 mg/kg，A5 10.0 mg/kg組，以依達拉奉靜注給藥（6.0 mg/kg）為陽性對照組，另設模型組和假手術組。模型組和假手術組給予相同體積的0.9 %氯化鈉注射液。A5蛋白各劑量組於再灌時即可給藥一次，於再灌後1h再給藥一次，其餘各組於再灌後立即給藥一次。腦缺血24小時後進行神經行為缺陷症狀評價及腦梗死面積測定。

1. 試驗材料

（ 1 ）實驗動物

Sprague Dawley （SD）大鼠，SPF級，雄性，年齡在6-8周左右，體重250 g -280 g。

動物在實驗過程中出現以下情況將會被予以剔除：a) 麻醉過程中死亡；b) 腦缺血過程中死亡；c) 再灌後至指標評價前死亡；d) 取腦後發現顱底出血；e) TTC染色後右腦無梗塞區域。

（ 2 ）試劑

A5蛋白溶液，即將實施例3製備的A5蛋白用0.9%的氯化鈉水溶液稀釋製備。

對照品：依達拉奉注射液（購自於南京先聲東元製藥有限公司），按照1：1的比例將依達拉奉注射液和0.9%的氯化鈉注射液混合稀釋，作為陽性對照。

2. 試驗設計

（ 1 ）劑量設計

表3：A5蛋白藥效試驗劑量表

組別	受試物	給藥劑量（mg/kg）	配製濃度（mg/mL）	給藥體積（mL/kg）	主試驗動物數
A5 0.1 mg/kg組	A5蛋白	0.1	0.02	5	~20
A5 1.0 mg/kg組	A5蛋白	1.0	0.2	5	~20
A5 10.0 mg/kg組	A5蛋白	10.0	2	5	~20
依達拉奉	依達拉奉注射液	6.0	1.0	6	~20
模型組	模型組	-	-	5	~20
假手術組	假手術組	-	-	5	~10

（ 2 ）給藥

各組動物經尾靜脈靜注注射給藥，靜注給藥的速度約1.5 ~ 2.5 mL/分鐘。

針對各處理組，腦缺血24小時後進行神經行為缺陷症狀評價及腦梗死面積測定。

3. 評估方法

（ 1 ）神經缺陷症狀評分

參考文獻Rat middle cerebral artery occlusion, evaluation of the model and development of a neurologic examination（Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski H. 1986.Stroke 17: 472-476）中的方法，對動物於缺血24 h後採用改良Bederson 5分制法進行神經缺陷症狀評價。

（ 2 ）腦梗死程度的測定

參考文獻Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats（Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski HM. Stroke 1986;17:1304-8）和文獻Quantification of infarct size on focal cerebral ischemia model of rats using a simple and economical method（Yang Y, Shuaib A, Li Q. J Neurosci Methods 1998;84:9-16）中的內容，採用TTC染色法進行腦梗死程度的測定。

腦梗死面積的計算：照片用Image J軟體處理，根據公式計算左腦相應面積以及右腦非梗死灶面積，求出梗死範圍百分比。

梗死體積計算法： V=t （A1+ A2+ A3+ ………+An） t為切片厚度，A為梗死面積。 %I=（V _C-V _L）/V _C×100% %I為梗死範圍百分比，V _C為對照側（左腦半球）腦體積，V _L為梗死側（右腦半球）非梗死區域體積。

（ 3 ）評價指標

以腦梗死範圍和神經行為學評分作為主要評價指標，同時觀察動物臨床表現。

定量資料表示為均值±標準誤，各藥效指標採用GraphPad Prism （6.01）軟體進行單因素方差分析（one-way ANOVA），方差檢驗顯著後再採用Fisher’s LSD test檢驗組間差異。將 P＜0.05定義為具有顯著性差異。

4. 實驗結果

（ 1 ） A5 蛋白對神經缺陷症狀的影響

經單因素方差分析，各組之間不存在統計學差異（F _{(4. 69)}= 2.305， P= 0.0669）。但將各組分別與模型組進行T檢驗，依達拉奉6.0 mg/kg組（ P＜0.01）和A5 10.0 mg/kg組（ P＜0.05）能顯著改善缺血動物的神經行為缺陷症狀；A5 1.0mg/kg組和A5 0.1mg/kg組有改善缺血動物的神經行為缺陷症狀的趨勢，但是無統計學差異。A5蛋白對神經行為缺陷症狀的影響詳見表4和圖7。

表4：A5蛋白對大鼠腦缺血再灌急性損傷的影響（Mean±SEM）

組  別	樣本量（隻）	神經缺陷症狀評分	腦梗死範圍（%）
假手術組	10	0	0
模 型 組	15	2.47±0.22	42.53±3.27
依達拉奉 6.0 mg/kg	15	1.60±0.25 **	35.93±3.94
A5 10.0 mg/kg	14	1.64±0.20 *	28.97±5.08 #
A5 1.0 mg/kg	14	1.86±0.27	38.37±3.61
A5 0.1mg/kg	16	2.00±0.20	43.61±3.60

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01， # P＜0.05。

（ 2 ） A5 蛋白對腦梗死範圍的影響

經單因素方差分析，各組之間不存在統計學差異（F _{(4. 69)}= 2.240， P= 0.0735）。但將各組分別與模型組進行T檢驗，A5 10.0 mg/kg組（ P＜0.05）可顯著降低模型動物的腦梗塞面積；依達拉奉 6.0 mg/kg組、A5 1.0mg/kg組有降低模型動物腦梗塞面積的趨勢，但無統計學差異；A5 0.1mg/kg組沒有降低模型動物腦梗塞面積作用。A5蛋白對腦梗死面積的影響詳見表4和圖8。

在本次試驗中，模型組動物腦梗死範圍組內差異基本在均值1/3以內（Mean±SD，42.53±12.65），模型可用率69.81%（不含假手術組動物）；此實驗體系可靠，可用於藥效評價。

與模型組相比，A5 10.0 mg/kg組能顯著減少模型大鼠腦梗死面積（ P＜0.05）；依達拉奉6.0 mg/kg，A5 1.0 mg/kg組有減少模型大鼠的腦梗死面積的趨勢，但是無統計學差異；A5 0.1 mg/kg沒有降低模型動物腦梗塞面積作用。與模型組相比，依達拉奉6.0 mg/kg和A5 10.0 mg/kg組能顯著改善缺血動物的神經行為缺陷症狀（ p＜0.01， p＜0.05）；其餘各組在此指標未體現出明顯改善作用。

在本次實驗中，A5 10.0 mg/kg組能顯著降低缺血大鼠腦梗死面積，並改善缺血動物的神經行為缺陷症狀。使用膜聯蛋白A5治療的實驗組均未見出血風險。

實施例 5

小膠質細胞在中樞神經系統的炎症進程中發揮重要作用。小膠質細胞的適度啟動對神經元具有保護作用，但是過度啟動的小膠質細胞會釋放大量的神經毒性因數，如一氧化碳，而神經毒性因數會導致神經退行性疾病的發生。脂多糖（LPS）會啟動小膠質細胞，導致小膠質細胞過度活化，從而引起神經元的損傷。使用A5觀察對於LPS刺激導致的小膠質細胞過度活化的影響。

實驗過程中，採用LPS刺激原代純化的小膠質細胞作為對照組，同時添加A5蛋白作為實驗組。對於上述處理，分別採用MTT法檢測細胞活力，採用細胞免疫化學法觀察細胞形態變化。實驗結果表明，LPS可以明顯啟動原代小膠質細胞，但不影響細胞活力。A5蛋白對LPS刺激導致的小膠質細胞過度活化有抑制作用。由此A5蛋白可以用於抑制腦內免疫細胞的過度活化，例如抑制小膠質細胞的過度活化。

實施例 6

氧-糖剝奪（oxygen glucose deprivation /OGD）模型是在細胞水準上模擬缺血/低氧的刺激模型，透過對細胞培養條件的改變，例如將細胞放入低氧箱或者更換無糖的培養基，模擬細胞在缺血/低氧情況下的損傷。

選取大鼠原代皮層神經元建立OGD模型，A5蛋白檢測濃度分別為0、41.15、123.5、370.4、1111、3333、10000 nM。先用PBS將培養板中的細胞洗2遍，加入事先用95 %N ₂＋5 %CO ₂置換30 min的無糖DMEM，迅速置於37℃、94 %N ₂＋1 %O ₂＋5 %CO ₂低氧培養箱中。缺氧培養8 h後，加入相應含藥物培養基（即含有A5的DMEM培養基），重新放入37℃、5 %CO ₂細胞培養箱給予複氧24 h培養。恢復正常條件繼續培養24 h後倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化，CCK-8比色法檢測細胞存活率，流式細胞術檢測細胞凋亡率。同時設置常氧常糖的處理組作為對照組。細胞相對活力計算公式如下： 細胞相對活力（%）=（給藥組-本底組）/（對照組-本底組）×100% 與模型組相比，A5蛋白於41.15 nM -1111 nM 濃度範圍內未展示出對OGD造成神經元損傷的保護作用（ P＞0.05），且於3333 nM- 10000 nM濃度下會顯著降低OGD造成神經元損傷後的活性（ P＜0.05，圖9）。

實驗結果發現，A5蛋白3333 nM-10000 nM濃度下可以減輕氧糖剝奪對神經元細胞的損傷，具有神經保護作用。

實施例 7

實施例7研究了A5蛋白對NMDA（N-甲基-D-天（門）冬胺酸）誘導的大鼠皮質神經元興奮性毒性損害的神經保護作用。NMDA能夠啟動NMDA受體引起腦組織內Ca ²⁺含量增高，NOS大量被啟動，導致大量NO的合成等一系列生理或者病理性變化，造成對於腦內神經元的損傷。實驗透過預先採用A5蛋白對神經元進行預處理，觀察A5蛋白對於興奮性毒性對神經元損害的神經保護作用。

實驗選用胚胎17d的SD大鼠，取皮質神經元接種培養。然後將神經元分為對照組、NMDA染毒組以及A5預處理組，其中NMDA染毒組將神經元加入NMDA進行染毒，對照組不進行任何處理，A5預處理組預先將神經元與A5蛋白孵育一段時間，然後加入NMDA進行染毒。對於不同的處理組，透過台盼藍染色評估細胞活力、TUNEL染色檢測凋亡細胞及免疫螢光細胞化學技術測定神經元形態。細胞相對活力計算公式如下： 細胞相對活力（%）=（給藥組-本底組）/（對照組-本底組）×100%

如圖10所示，100 μM濃度的NMDA可以誘發大鼠原代皮層神經元細胞活性降低（ P＜0.001，與正常control相比），說明模型建立成功。A5蛋白在檢測濃度41.15 nM-3333 nM範圍內，未觀察到對NMDA引起的原代皮層神經元興奮性損傷有顯著減輕作用（ P＞0.05，與Model組相比），A5蛋白在檢測濃度10000 nM濃度下顯示出對NMDA引起的原代皮層神經元興奮性損傷有顯著減輕作用（ P＜0.05，與Model組相比）。

實驗結果發現相較於NMDA染毒組，A5預處理組在10000 nM檢測濃度下可以減輕興奮性毒性對神經元的損害。

實施例 8

血腦屏障是由腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞和基膜三種成分組成的。血腦屏障的損傷是卒中腦損傷的重要病理之一。

實驗過程中利用自發轉化的內皮細胞系和分離純化的大鼠星形膠質細胞共培養建立體外血腦屏障模型。體外血腦屏障（BBB）模型經刺激處理後產生損傷，然後用A5蛋白處理經過刺激處理的血腦屏障模型。

採用顱腦打擊致大鼠顱腦損傷模型評估血腦屏障的完整性，分別設置A5 10 mg/kg，A5 30 mg/kg，模型組。A5蛋白各劑量組及模型組於造模後1h、2h各給1次，共給藥兩次，給藥方式為尾靜脈注射給藥。造模23h後進行，麻醉大鼠，然後透過尾靜脈以4 ml/kg的劑量注射2 %EB（Evans blue）染料溶液，在處死前讓染料在大鼠體內迴圈1小時。透過大鼠左心室經鹽水灌注心臟直至獲得無色灌注。處死後，取出大腦，稱重，在甲醯胺（3 μl/mg）中勻漿，並在室溫下孵育48小時。離心後，收集上清液並在625 nm處測量光密度，用於確定EB染料的相對量，結果見表5及圖11。

表5：A5蛋白對顱腦打擊致大鼠血腦屏障損傷的影響（Mean±SD）

組別	樣本量（隻）	腦組織中EB 含量（μg/g）
模型組	5	101.87±8.63
A5 10 mg/kg	5	96.08 ± 4.33
A5 30 mg/kg	5	89.36 ± 5.51 *

與模型組相比，* P＜0.05。

結果顯示，與模型組相比，A5 10 mg/kg組腦組織中EB含量沒有顯著性差異（ P＞0.05），A5 30 mg/kg組腦組織中EB含量顯著減少（ P＜0.05）。在本次實驗中，A5 30 mg/kg組對顱腦打擊致大鼠血腦屏障損傷有修復作用。

實驗結果表明，經過刺激，已經建立的血腦屏障會受到顯著的破壞，而A5可以修復受到破壞的血腦屏障。

實施例 9 免疫毒性和免疫原性研究（伴隨 SD 大鼠和食蟹猴重複給藥毒性研究）

1. SD大鼠的毒性實驗研究

採用SD大鼠連續28天靜脈注射A5蛋白，並設4周恢復期，觀察大鼠產生的毒性反應及其嚴重程度，主要毒性靶器官及損害的可逆程度。給藥劑量分別為0（空白輔料）、30、150和750 μg/kg。採血進行免疫毒性（CD4 ⁺、CD8 ⁺T細胞）和免疫原性檢測。其中將試驗分為4組，每組8隻大鼠，樣本採集共4個時間點，即每隻大鼠採集4個時間點的血清樣本。

其中，免疫毒性結果可見試驗期間各劑量給藥組動物外周血T淋巴細胞亞群的比例及比值（CD4 ⁺、CD8 ⁺T細胞測定值）與對照組比較未見統計學上的顯著差異。

免疫原性結果如表6所示。其中，表6中每組樣品數代表每組8隻大鼠，分4個時間點採集血清，每組共計32個樣本數；陽性個體數為每組樣品數中檢出陽性樣品的個數。

表6：大鼠血清中A5蛋白抗藥抗體數據

組別	對照組	30 μg/kg劑量組	150 μg/kg劑量組	750 μg/kg劑量組
給藥劑量	0 μg/kg	30 μg/kg	150 μg/kg	750 μg/kg
每組樣品數	32	32	32	32
陽性樣品數	0	21	22	20
總樣品陽性率	0.0%	65.6%

從表6給出的結果可以看出，SD大鼠靜脈注射給予A5蛋白空白輔料後，未檢測到抗藥抗體（ADA）。靜脈注射不同劑量A5蛋白後，陽性樣品檢出率為65.6%。各劑量組之間無明顯區別，陽性樣品主要集中在末次給藥後和恢復期結束，符合抗藥性抗體在體內產生的過程。

2. 食蟹猴 的毒性實驗研究

本研究中，採用食蟹猴連續28天靜脈注射A5蛋白，並設4周恢復期，觀察食蟹猴產生的毒性反應及其嚴重程度，主要毒性靶器官及損害的可逆程度。給藥劑量分別為0（空白輔料）、15 μg/kg、75 μg/kg和375 μg/kg。進行免疫原性採血和免疫毒性（CD4 ⁺、CD8 ⁺T細胞）檢測。

免疫毒性結果可見試驗期間各劑量給藥組動物外周血T淋巴細胞亞群的比例及比值（CD4 ⁺、CD8 ⁺T細胞測定值）與對照組比較未見統計學上的顯著差異。

免疫原性結果如表7所示。採用與上述大鼠相同的分組和處理方式，不同的是，在取樣的時候，每組樣品數多了2個，即每組樣品數多了2個。

表7：猴血清中A5蛋白抗藥抗體數據

組別	對照組	15 μg/kg劑量組	75 μg/kg劑量組	375 μg/kg劑量組
給藥劑量	0 μg/kg	15 μg/kg	75 μg/kg	375 μg/kg
每組樣品數	34	34	34	34
陽性樣品數	0	7	6	13
總樣品陽性率	0.0%	25.5%

從表7給出的結果可以看出，食蟹猴靜脈注射給予A5蛋白空白輔料後，未檢測到ADA。靜脈注射不同劑量 A5蛋白後，陽性樣品檢出率為25.5%，陽性樣品集中出現在給藥4周後和恢復期結束，符合抗藥性抗體在體內產生的過程。

實驗結果表明：無論是在大鼠和食蟹猴中未發現免疫毒性。而免疫原性試驗中，食蟹猴相比較大鼠的陽性發生率明顯降低。考慮到A5蛋白屬於人源蛋白，預期其在人體上免疫原性發生率會顯著降低。

實施例 10 SD 大鼠和食蟹 猴靜脈注射 A5 蛋白單次給藥毒性研究

1. SD 大鼠靜脈注射 A5 蛋白單次給藥毒性研究

研究採用SD大鼠單次靜脈注射A5蛋白，觀察動物產生的急性毒性反應及其嚴重程度和主要毒性靶器官。給藥劑量分別為0（空白輔料）、1000 μg/kg、3000 　g/kg和9000 μg/kg。靜脈注射，給藥後連續觀察動物的姿勢、步態、反應狀態、神經活動、食欲、被毛、眼睛、耳、口、鼻、四肢、呼吸、糞便等臨床症狀。隨後繼續觀察至給藥後第14天，考察動物的毒性反應恢復情況。給藥後15天將動物解剖進行大體病理學檢查。試驗期間所有動物臨床症狀未見異常；給藥組雌性和雄性動物體重變化未見異常；大體病理學檢查中各組織器官均未見異常。本試驗條件下，A5蛋白單次靜脈注射耐受劑量（MTD）在9000 μg/kg以上。

2. 食蟹猴 靜脈注射 A5 蛋白單次給藥毒性研究

研究採用食蟹猴單次靜脈注射A5蛋白，觀察動物產生的急性毒性反應及其嚴重程度和主要毒性靶器官。給藥劑量分別為0（空白輔料）、500 μg/kg、1500 μg/kg和4500 μg/kg。單次靜脈注射給藥，給藥後對動物臨床症狀進行觀察（包括糞便、外觀、呼吸、神經反應、活動狀況等），至給藥後第15天。給藥後每天測定1次攝食量，每週測定1次體重。給藥當天分別在給藥前後測定動物的體溫、血壓和心電圖，給藥第1、7、15天再測定1次。給藥後第1、7、15天對全部動物進行血液學（含血液凝固）及血清生化檢查，給藥第14天進行尿液檢查。給藥後第15天將動物解剖進行大體病理學檢查，必要時進行組織病理學檢查。結果可見各組動物臨床症狀及注射部位觀察、體重、攝食量、體溫、血壓、心電圖、尿檢、血清生化和病理學檢查均未見與受試物相關的明顯改變。檢疫期第13天、給藥後第1天至給藥後第15天各組動物凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）和凝血酶時間（TT）未見明顯變化。本試驗條件下，食蟹猴動物耐受劑量（MTD）為4500 μg/kg以上。

以上實驗結果表明，無論是在SD大鼠中還是在食蟹猴中，對於A5蛋白的耐受劑量均在4500μg/kg以上，在SD大鼠中對於A5蛋白的耐受量甚至在9000 μg/kg以上。結果表明，在A5蛋白發揮腦卒中保護作用的等效劑量下，未見大鼠和猴的明顯毒性。由此提醒我們，A5蛋白用於治療腦卒中，安全性良好，而且即便在較高劑量用藥的情況下，也不會或者幾乎不會帶來用藥風險。

儘管上面已經示出和描述了本公開的實施例，但應當理解的是，上述實施例是示例性的，而不應理解為對本公開保護範圍的限制。本領域技術人員在本公開的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型，這些變化、修改、替換和變型應當涵蓋在本公開申請專利範圍的保護範圍之內。

無

圖1A及1B顯示了膜聯蛋白A5治療對TBI後神經結局的劑量依賴性影響。圖1A顯示了改良的神經嚴重程度評分（mNSS）的結果，圖1B顯示了旋轉杆試驗（rotarod test）的結果（### P＜0.001，與假手術組相比；* P＜0.05，與模型組相比；** P＜0.01，與模型組相比；*** P＜0.001，與模型組相比；n＝10）。其中mNSS score代表mNSS評分，Fall latency代表跌倒潛伏期，Sham代表假手術組，Model代表模型組。 圖2顯示，膜聯蛋白A5的施用顯著減少了TBI後損傷大鼠腦中的TUNEL陽性細胞（### P＜0.001，與假手術組相比；* P＜0.05，與模型組相比；t檢驗，n=5）。其中，TUNEL positive cells代表陽性細胞量，Sham代表假手術組，Model代表模型組。 圖3顯示，給予膜聯蛋白A5 0.2 mg/kg可顯著減少TBI後大鼠損傷腦中的GFAP陽性細胞（### P＜0.001，與假手術組相比；* P＜0.05，與模型組相比，t檢驗，n=5）。其中，Mean Fluorescence （arbitrary units）代表平均螢光（任意單位），Sham代表假手術組，Model代表模型組。 圖4顯示了膜聯蛋白A5治療對TBI後神經功能結果的影響。（頂部）MNS的結果；（底部）旋轉杆試驗的結果。（### P＜0.001，與假手術組相比；*** P＜0.001，與模型組相比；n=5）。其中，mNSS score代表mNSS評分，Fall latency代表跌倒潛伏期，Sham代表假手術組，Model代表模型組，A5 One Dose代表僅給予一劑量A5，Time代表時間。 圖5顯示了膜聯蛋白A5治療對TBI後神經功能結果的影響。（頂部）MNS的結果；（底部）旋轉杆試驗的結果。（### P＜0.001，與假手術組相比；*** P＜0.001，與模型組相比；n=5）。其中，mNSS score代表mNSS評分，Fall latency代表跌倒潛伏期，Sham代表假手術組，Model代表模型組，A5 One Dose代表一劑量A5，post-TBI代表TBI後。 圖6顯示了腦組織中的IL-1β、TNF-α和IFN-γ水準（### P＜0.001，與假手術組相比；** P＜0.01，與模型組相比，n=5）。其中，protein代表蛋白，Sham代表假手術組，Model代表模型組。 圖7是根據本發明的實施例提供的膜聯蛋白A5溶液對神經缺陷症狀的影響結果圖。 圖8是根據本發明的實施例提供的膜聯蛋白A5溶液對腦梗死範圍的影響結果圖。 圖9是根據本發明實施例提供的膜聯蛋白A5對原代皮層神經元OGD損傷的影響結果圖。 圖10是根據本發明實施例提供的膜聯蛋白A5對NMDA誘導大鼠原代皮層神經元興奮性損傷的保護作用結果圖。 圖11是根據本發明實施例提供的膜聯蛋白A5對腦組織EB含量檢測結果圖。

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Claims (11)

1. 一種治療有需要患者的顱腦損傷的方法，其中該方法包括： 確定患有顱腦損傷或疑似患有顱腦損傷的患者；及 向該患者施用治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體，或包含治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體的藥物組合物； 例如，根據該方法，其中該膜聯蛋白A5或其變體包含與SEQ ID NO：1的胺基酸序列具有至少90%序列同源性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列； 例如，其中該顱腦損傷是輕度、中度或重度顱腦損傷； 例如，其中該顱腦損傷是由頭部撞擊、穿透性頭部損傷、非穿透性頭部損傷、跌倒、顱骨骨折、突然加速或減速、腦震盪或挫傷導致的； 例如，該患者是人。
2. 如請求項1所述之方法，其中該膜聯蛋白A5或其變體： （i）減少患有該顱腦損傷的該患者的彌漫性軸突損傷、行為障礙、腦組織損傷、腦萎縮、神經元細胞死亡或神經元細胞凋亡、小膠質細胞活化或患有該顱腦損傷的該患者的神經元組織丟失；或 （ii）提高患有該顱腦損傷的該患者的腦血流量或腦葡萄糖攝取； 或者，該膜聯蛋白A5減輕了該患者的與該顱腦損傷相關的一種或多種症狀； 例如，與該顱腦損傷相關的一種或多種症狀包括意識水準損傷、認知損傷、認知處理速度損傷、語言損傷、運動活動損傷、記憶損傷、運動技能損傷、感覺技能損傷、腦缺血、水腫、顱內壓、聽力喪失、耳鳴、頭痛、癲癇發作、頭暈、噁心、嘔吐、視力模糊、嗅覺或味覺下降、體力下降或協調能力下降。
3. 如請求項1所述之方法，在從該顱腦損傷之時到4周的時間段內施用第一劑藥物，如，該膜聯蛋白A5或其變體，或該藥物組合物； 例如，其中該第一劑藥物在該顱腦損傷發生後約0小時、約3小時、約6小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時內施用； 例如，該膜聯蛋白A5或其變體的治療有效量在約0.01 mg/kg和約10 mg/kg之間，如約0.01 mg/kg和約0.5 mg/kg之間，如約0.02 mg/kg、0.06 mg/kg或0.2 mg/kg。
4. 如請求項1所述之方法，其中該方法還包括向該患者施用第二劑藥物或治療； 其中該第二劑藥物或治療是心臟保護的藥物或治療，其中該心臟保護的藥物或治療包括β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制劑、鈣通道阻滯劑、降脂療法、他汀類藥物、硝酸鹽、抗血小板、抗凝血劑、抗凝劑中的一種或其組合，以及將上述藥物應用於治療。
5. 如請求項1所述之方法，其中確定患有顱腦損傷的患者的步驟包括對該患者進行電腦斷層掃描（CT）掃描或核磁共振成像（MRI）； 例如，根據改良的神經嚴重程度評分（mNSS）、旋轉杆試驗、格拉斯哥昏迷量表評分或格拉斯哥預後量表評分，將該患者鑑定為患有顱腦損傷； 例如，其中該改良的神經嚴重程度評分或該格拉斯哥昏迷量表評分介於3和8之間、9和12之間或13和15之間； 例如，如果該改良的神經嚴重程度評分或該格拉斯哥昏迷量表評分低於參考水準，則將該患者鑑定為患有顱腦損傷； 例如，該參考水準是由未曾遭受頭部損傷的參考受試者獲得的。
6. 如請求項1所述之方法，其中鑑定患有顱腦損傷的患者的步驟包括： 確定來自該患者的樣品中生物標誌物的水準； 將生物標誌物的水準與生物標誌物的參考水準進行比較；及 如果確定的生物標誌物水準與生物標誌物的參考水準相比增加，則將該患者鑑定為患有該顱腦損傷。
7. 如請求項6所述之方法，其中該生物標誌物包含選自下列的細胞因數：IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-8、HMGB1、TGFβ、UCH-L1、NSE、GFAP、S100B、NF蛋白（L及H）、MBP、Tau或磷酸化Tau； 例如，該樣品是在該患者頭部受到物理震動、外部機械力或其他力的鈍性衝擊導致閉合或開放的頭部創傷、一次或多次跌倒、爆炸、爆破、固體爆炸、氣體爆炸或其他類型的鈍性創傷後獲得的； 例如，該樣品選自全血樣品、血清樣品、腦脊液樣品及血漿樣品。
8. 一種降低患有顱腦損傷的患者中生物標誌物水準的方法，包括： （a）確定患有顱腦損傷的患者；及 （b）向患者施用包含治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體，或包含治療有效量的膜聯蛋白A5或其變體的藥物組合物； 其中該生物標誌物包含選自下列的細胞因數：IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-8、HMGB1、TGFβ、UCH-L1、NSE、GFAP、S100B、NF蛋白（L及H）、MBP、Tau及磷酸化Tau； 例如，該膜聯蛋白A5或其變體的治療有效量為使該膜聯蛋白A5或其變體將生物標誌物的水準增加或降低至少5%、10%、20%、30%、40%或50%的量。
9. 一種膜聯蛋白A5或其變體用於製備藥物的用途，其中該藥物用於選自下列用途中的一種、兩種或更多種： 治療及/或預防顱腦損傷；例如，該顱腦損傷是輕度、中度或重度顱腦損傷； 減少患有該顱腦損傷的患者的彌漫性軸突損傷、行為障礙、腦組織損傷、腦萎縮、神經元細胞死亡或神經元細胞凋亡、小膠質細胞活化或患有該顱腦損傷的患者的神經元組織丟失； 提高患有該顱腦損傷的患者的腦血流量或腦葡萄糖攝取； 減輕患者的與顱腦損傷相關的一種或多種症狀，例如，該與顱腦損傷相關的一種或多種症狀包括意識水準損傷、認知損傷、認知處理速度損傷、語言損傷、運動活動損傷、記憶損傷、運動技能損傷、感覺技能損傷、腦缺血、水腫、顱內壓、聽力喪失、耳鳴、頭痛、癲癇發作、頭暈、噁心、嘔吐、視力模糊、嗅覺或味覺下降、體力下降或協調能力下降； 降低患有該顱腦損傷的患者中生物標誌物水準；例如，其中該生物標誌物包含選自下列的細胞因數：IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-8、HMGB1、TGFβ、UCH-L1、NSE、GFAP、S100B、NF蛋白（L及H）、MBP、Tau及磷酸化Tau；例如，該藥物將生物標誌物的水準增加或降低至少5%、10%、20%、30%、40%或50%的量； 例如，該膜聯蛋白A5或其變體包含與SEQ ID NO： 1的胺基酸序列具有至少90%序列同源性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO： 1的胺基酸序列。
10. 如請求項9所述之用途，其中該顱腦損傷是輕度、中度或重度顱腦損傷； 例如，其中該顱腦損傷是由頭部撞擊、穿透性頭部損傷、非穿透性頭部損傷、跌倒、顱骨骨折、突然加速或減速、腦震盪或挫傷導致的； 例如，該患者是人； 優選地，該藥物為單位劑型； 例如，該藥物中該膜聯蛋白A5或其變體的量在約0.01 mg/kg患者體重和約10 mg/kg患者體重之間，如約0.01 mg/kg患者體重和約0.5 mg/kg患者體重之間，如約0.02 mg/kg患者體重、0.06 mg/kg患者體重或0.2 mg/kg患者體重； 例如，該藥物為單位劑型，該單位劑型中該膜聯蛋白A5或其變體的量為0.025 mg-250 mg，例如0.1 mg-50 mg、0.1 mg-100 mg、0.1 mg-200 mg或0.1 mg-250 mg、或1 mg-50 mg、1 mg-100 mg、1 mg-200 mg或1 mg-250 mg。
11. 如請求項10所述之用途，其中該藥物在從該顱腦損傷之時到4周的時間段內施用，優選在該顱腦損傷發生後約0小時、約3小時、約6小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時內施用，更優選在該顱腦損傷後約12小時內向患者施用第一劑藥物； 例如，該藥物還包含心臟保護的藥物； 例如，該心臟保護的藥物選自β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制劑、鈣通道阻滯劑、降脂療法、他汀類藥物、硝酸鹽、抗血小板、抗凝血劑、抗凝劑中的一種或其組合。