ES2289820T3 - Dominios proteicos en la subunidad reguladora de glucogeno hepatico de la proteina fosfatasa 1 y sus metodos de produccion y utilizacion. - Google Patents
Dominios proteicos en la subunidad reguladora de glucogeno hepatico de la proteina fosfatasa 1 y sus metodos de produccion y utilizacion. Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto que es capaz de bloquear la interacción de fosforilasa alfa con la subunidad reguladora de glucógeno (GL) de la proteína fosfatasa para uso en medicina, donde el compuesto es (1) un anticuerpo o molécula de tipo inmunoglobulina o un fragmento de éstos que se enlaza específicamente a GL, donde el anticuerpo o molécula de tipo inmunoglobulina o fragmento de éstos se enlaza específicamente a la secuencia de aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY ó (2) un polipéptido compuesto por la secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY, o un fragmento de éste que es capaz de unirse específicamente a la fosforilasa alfa.
Description
Dominios protéicos en la subunidad reguladora de
glucógeno hepático de la proteína fosfatasa 1 y sus métodos de
producción y utilización.
La presente invención se refiere a compuestos
útiles en el tratamiento de trastornos asociados con niveles
anormales de glucosa en sangre, particularmente en la prevención del
enlace de fosforita-a con la subunidad reguladora
de glucógeno (G_{L}) de proteína fosfatasa 1 (PP1). Estos
compuestos son útiles para aumentar la síntesis de glucógeno y así
reducir los niveles de glucosa en sangre. Los compuestos encuentran
utilidad en el tratamiento de trastornos, tales como la diabetes
tipo I y tipo II, asociados con niveles de glucosa en sangre
superiores a los normales (hiperglucemia).
La mayoría de las consecuencias fisiológicas
adversas en la diabetes tipo I y tipo II son resultado de niveles de
glucosa en sangre superiores a los normales. Aunque los niveles
altos de glucosa en sangre pueden disminuirse con la administración
de insulina en la diabetes tipo I y con restricciones dietéticas en
el caso de la diabetes tipo II, un medicamento que contribuya a la
reducción de niveles de glucosa en sangre sería ventajoso en el
tratamiento de estos trastornos. El hígado, principal órgano que
regula la homeostasis de la glucosa, puede almacenar glucosa en
forma de glucógeno y la síntesis de glucógeno hepático de glucosa
está bajo el control de la glucógeno sintetasa hepática.
La proteína fosfatasa 1 es una serina/treonina
proteína fosfatasa fundamental en las células eucariotas, que
regula distintos procesos celulares. Esto se logra por la
interacción de la subunidad catalítica de PP1 con un rango diverso
de subunidades reguladoras que la conducen hacia sitios específicos
dentro de la célula, modulan su actividad con respecto a substratos
particulares y permiten que su actividad responda a señales
extracelulares [1,2].
La familia de proteínas que apuntan PP1 hacia el
glucógeno y regula su actividad hacia las enzimas del metabolismo
de glucógeno consta de cuatro miembros, G_{M}/PPP1R3,
G_{L}/PPP1R4, PPP1R5 y PPP1R6/PTG [3-8]. La
subunidad reguladora de glucógeno específica del hígado, G_{L}, es
una proteína de 33 kDa [5,9] que, cuando se une a PP1, mejora la
velocidad a la cual esta última se desfosforila y activa la enzima
que determina la velocidad en la síntesis del glucógeno, glucógeno
sintetasa, mientras reduce la velocidad a la que inactiva la
glucógeno fosforilasa. La estimulación de glucogenólisis hepática
por glucagón (que actúa a través de AMP cíclica y la Proteína
Quinasa A, PKA) y agonistas \alpha-adrenérgicos
(que actúan a través de Ca^{2+}) se logra por activación de
fosforilasa quinasa respectivamente, lo cual aumenta los niveles de
la forma fosforilada activa de glucógeno fosforilasa (fosforilasa
a). Además, la fosforilasa a se une a G_{L} e
inhibe potentemente la actividad de su glucógeno sintetasa fosfatasa
inhibiendo así la síntesis del glucógeno. La insulina disminuye los
niveles hepáticos MPc, provocando una reducción en el nivel de
fosforilasa a y alivio de la inhibición mediada por
fosforilasa a del complejo PP1G_{L}, mientras que el
enlace de glucosa con la fosforilasa a, aumenta la velocidad
a la que se inactiva la fosforilasa. Estos mecanismos contribuyen a
la estimulación de la síntesis de glucógeno por insulina y altos
niveles de glucosa en sangre [10]. La inhibición del complejo
PP1G_{L} por la fosforilasa a ocurre a concentraciones
nanomolares y se piensa sea a través de un mecanismo alostérico ya
que la K_{m} para la fosforilasa a como substrato se
encuentra en el rango micromolar [11]. Este criterio se refuerza
con el hallazgo de que la fosforilasa a (pero no fosforilasa
b) se enlaza directamente al G_{L} en experimentos de
transferencia de proteínas [5,9].
Estudios recientes identificaron regiones
conservadas entre las subunidades reguladoras de glucógeno,
G_{M}/PPP1R3 y G_{L}/PPP1R4 [5]. Se demostró que un péptido
correspondiente a una de estas regiones,
G_{M}63-75, se une a PP1 y también se demostró
que los residuos 38 amino terminales de la subunidad reguladora
miofibrilar de PP1 interactúa con PP1 [12]. El péptido
G_{M}63-75, que contiene un pequeño motivo común a
la subunidad de enlace miofibrilar y muchas otras de las
subunidades reguladoras de PP1, se ha cristalizado como complejo con
PP1, con una estructura de resolución 2,8 \ring{A} [2]. Este
motivo,
Lys/Arg-Val/Ile-Xaa-Phe/Trp,
que también ha sido identificado por un enfoque de la biblioteca de
péptidos aleatorios [13], se encuentra en las cuatro subunidades
reguladoras de glucógeno y está ubicado en los residuos
60-64 del G_{L}. Sin embargo, la incubación del
complejo purificado PP1G_{L} de partículas de las proteínas de
glucógeno hepático con un péptido que se une a PP1 de G_{M} no
pudo disociar el complejo PP1-G_{L} [12], aun
cuando el péptido abolió la supresión de la actividad fosforilasa
fosfatasa conferida sobre PP1 por asociación con G_{L}.
La presente invención busca ofrecer materiales y
compuestos biológicos que pueden ser útiles en el tratamiento de
trastornos, especialmente aquellos como la diabetes tipo I y tipo
II, asociados con niveles de glucosa en sangre superiores a los
normales.
Según un primer aspecto de la invención, se
ofrece un compuesto que es capaz de bloquear la interacción de
fosforilasa a con la subunidad reguladora de glucógeno
(G_{L}) de la proteína fosfatasa 1 para uso en medicina, donde el
compuesto es según se define en la reivindicación 1.
Preferentemente, el compuesto es para uso en la
fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de
trastornos asociados con niveles de glucosa en sangre superiores a
los normales. Preferentemente el medicamento es para uso en el
tratamiento de un trastorno seleccionado de la diabetes tipo I y/o
tipo II.
Preferentemente, el compuesto es un polipéptido
consistente en la secuencia de 16 aminoácidos
C-terminales de la secuencia G_{L} humana, o un
fragmento de éste del cual es capaz de unirse específicamente a la
fosforilasa a.
Así, la secuencia puede ser PEWPSYLGYEKLGPYY,
que puede ser la secuencia de los 16 aminoácidos
C-terminales de G_{L} de hígado de rata.
Por "fragmento" incluimos el significado
que el polipéptido comprende menos de la secuencia de 16
aminoácidos anteriormente citada, pero es capaz de específicamente
unirse a la fosforilasa a.
La identificación de fragmentos dentro del
alcance de la invención se puede realizar utilizando los métodos
descritos aquí.
Preferentemente el polipéptido aumenta la
actividad de la glucógeno sintetasa hepática.
Los polipéptidos en los que uno o más de los
residuos de aminoácidos se modifican químicamente, antes o después
de que el péptido del polipéptido se sintetiza, pueden ser
utilizados de acuerdo con la invención, suponiendo que la función
del péptido, específicamente el bloqueo de la interacción entre
G_{L} y fosforilasa a, permanezca sustancialmente
invariable. Tales modificaciones incluyen la formación de sales con
ácidos o bases, especialmente ácidos y bases orgánicos o
inorgánicos fisiológicamente aceptables, la formación de un éster o
amida de un grupo carboxilo terminal, y el enlace de grupos que
protegen a los aminoácidos tales como
N-t-butoxicarbonilo. Tales
modificaciones pueden proteger al péptido del metabolismo in
vivo.
En un segundo aspecto, la invención ofrece una
composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor tal
como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3 que es
capaz de bloquear la interacción de fosforilasa a con la
subunidad reguladora de glucógeno (G_{L}) de proteína fosfatasa
(PP1), junto con un excipiente o vehículo farmacéuticamente
aceptable. Preferentemente el compuesto inhibidor está formado por
la secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY o un fragmento de
ésta que es capaz de unirse específicamente a la fosforilasa
a.
En un tercer aspecto, la invención ofrece un
método de identificación de un compuesto inhibidor que es capaz de
bloquear la interacción de fosforilasa a con la subunidad
localizadora del glucógeno de PP1 que comprende: ofrecer un
polipéptido compuesto por la secuencia de 16 aminoácidos
PEWPSYLGYEKLGPYY, o un fragmento de éste que específicamente se une
a la fosforilasa a; ofrecer un compuesto experimental según
la reivindicación 7; y comparar el enlace del polipéptido por
fosforilasa a en presencia o ausencia del compuesto
experimental; un compuesto inhibidor que es identificado por un
enlace reducido en presencia del compuesto experimental.
El compuesto inhibidor puede ser un compuesto
similar a un medicamento o compuesto líder para el desarrollo de un
compuesto similar a un medicamento. De este modo, el método puede
ser un método para identificar un compuesto similar a un
medicamento o compuesto líder para el desarrollo de un compuesto
similar a un medicamento que es capaz de bloquear la interacción de
fosforilasa a con la subunidad reguladora de glucógeno de
PP1.
El término "compuesto similar a un
medicamento" es bien conocido para los expertos en la técnica, y
puede incluir el significado de un compuesto que tiene
características que lo pueden hacer conveniente para uso en
medicina, por ejemplo como ingrediente activo de un medicamento.
Así, por ejemplo, un compuesto similar a un medicamento puede ser
una molécula que puede sintetizarse por técnicas de química
orgánica, menos preferentemente por técnicas de bioquímica o
biología molecular, y es preferentemente una molécula pequeña, que
puede tener menos de 5000 daltones de peso molecular y que puede ser
soluble en agua. Un compuesto similar a un medicamento puede
adicionalmente exhibir características de interacción selectiva con
una proteína o proteínas particulares y encontrarse biodisponible
y/o capaz de penetrar las membranas celulares diana, pero se
apreciará que estas características no son esenciales.
El término "compuesto líder" es igualmente
bien conocido para los expertos en la técnica, y puede incluir el
significado que el compuesto, mientras no es en sí conveniente para
uso como medicamento (por ejemplo, debido a que sólo es débilmente
potente contra su blanco deseado, no es selectivo en su acción, es
inestable, pobremente soluble, difícil de sintetizar o tiene pobre
biodisponibilidad) puede ofrecer un punto de partida para el diseño
de otros compuestos que pueden tener características más
deseables.
Los compuestos identificados en el método pueden
por si solos ser útiles como medicamento o pueden representar
compuestos líderes para el diseño y la síntesis de compuestos más
eficaces.
El compuesto inhibidor puede ser un anticuerpo o
una molécula tipo inmunoglobulina o un fragmento de estos, también
conocido por aquellos expertos en la técnica. Un anticuerpo o
molécula tipo inmunoglobulina o un fragmento de estos que se une
específicamente a un polipéptido compuesto por la secuencia de 16
aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY o un fragmento de ésta que es capaz de
unirse específicamente a la fosforilasa a puede ser ese
compuesto inhibidor. Un anticuerpo o molécula tipo inmunoglobulina o
un fragmento de estos que se enlaza a la secuencia de aminoácidos
PEWPSYLGYEKL GPYY puede ser también ese compuesto inhibidor. Esos
anticuerpos o moléculas tipo inmunoglobulina o fragmentos de estos
pueden prepararse por métodos bien conocidos por los expertos en la
técnica.
Se apreciará que por "fosforilasa a"
se incluyen variantes, fragmentos y fusiones de fosforilasa a
que tienen interacciones o actividades las cuales son
sustancialmente las mismas que las de fosforilasa a con
G_{L} pero que puede ser más conveniente para uso en un ensayo.
Por ejemplo, una fusión de fosforilasa a puede ser útil ya
que dicha fusión puede contener una parte que permita la fusión para
ser purificada rápidamente. Se prefiere que la fosforilasa a
sea fosforilasa a de músculo esquelético de conejo. La
fosforilasa a puede obtenerse de Sigma,
Sigma-Aldrich Company Ltd, Fancy Road, Poole,
Dorset, BH12 4QH.
Preferentemente, la fosforilasa a está
marcada y el enlace de fosforilasa a con el polipéptido se
determina midiendo la cantidad de marcador cuantitativamente o
cualitativamente.
Convenientemente, la fosforilasa a está
marcada con un marcador seleccionado de digoxigenina, P^{33} y
P^{32}. La fosforilasa a marcada con P^{32} o P^{33}
puede obtenerse por fosforilación por fosforilasa quinasa, según se
describe en Cohen et al (1988) Meth Enzymol 159,
399-408. La fosforilasa quinasa puede obtenerse de
Sigma.
La ruptura de la interacción entre dicho
polipéptido y fosforilasa a se puede medir in vitro
utilizando métodos bien conocidos en la técnica de la bioquímica e
incluir cualquier método que pueda utilizarse para evaluar las
interacciones proteína-proteína.
Dicha interacción también puede medirse dentro
de una célula, por ejemplo utilizando el sistema de dos híbridos de
levadura según se conoce bien en la técnica.
Se apreciará que particularmente se preferirán
los ensayos de análisis (screening) capaces de operaciones de alto
rendimiento. Los ejemplos pueden incluir pruebas basadas en células
y pruebas de enlace proteína-proteína. Se puede
utilizar un sistema basado en el Análisis de Proximidad por
Centelleo (SPA); Amersham International). Por ejemplo, pueden
prepararse perlas que comprendan el centelleo y el polipéptido
compuesto por la secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY o un
fragmento de ésta que es capaz de unirse específicamente a la
fosforilasa a. Las perlas pueden mezclarse con una muestra
que comprenda fosforilasa a marcada con P^{32} o P^{33} y
con el compuesto experimental. Convenientemente esto se realiza en
un formato de 96 pozos. La placa entonces se cuenta utilizando un
contador de centelleo conveniente, usando parámetros conocidos para
las pruebas SPA de P^{32}. Sólo el P^{32} que está próximo al
centelleo, es decir, sólo ese atado al polipéptido, es detectado.
También pueden utilizarse variantes de esa prueba, por ejemplo en
la que el polipéptido se inmoviliza sobre las perlas de centelleo a
través del enlace con un anticuerpo.
Otros métodos de detección de las interacciones
polipéptido/polipéptido incluyen la ultrafiltración con métodos de
espectroscopia de masa/HPLC u otros métodos físicos y analíticos.
Por ejemplo, se pueden utilizar métodos de Transferencia de Energía
por Resonancia de Fluorescencia (FRET), bien conocidos por los
expertos en la técnica, en los que el enlace de dos entidades
fluorescentes marcadas puede medirse midiendo la interacción de los
marcadores fluorescentes cuando se encuentran en cercana proximidad
uno del otro.
La invención ofrece el uso de un compuesto
inhibidor según se define en una de las reivindicaciones 1 a la 6
en la fabricación de un medicamento para reducir el nivel de glucosa
en sangre de un animal mamífero.
Preferentemente el animal mamífero es un
humano.
Por "cantidad terapéuticamente efectiva"
incluimos el significado que suficiente cantidad del compuesto se
administre para producir un efecto beneficioso en el receptor, por
ejemplo una disminución beneficiosa en la hiperglucemia.
Ofrecemos un método de identificación de un
compuesto que imita el efecto de fosforilasa a sobre el
G_{L}, el método consiste en poner en contacto dicho compuesto
con G_{L} y determinar si, en presencia del compuesto, G_{L}
adopta las propiedades de G_{L} en presencia de fosforilasa
a.
Por "imita el efecto de fosforilasa
a" incluimos el significado que el compuesto modifica una
propiedad de G_{L} de tal manera que G_{L} actúa, en al menos
un aspecto, como el G_{L} que interactúa con fosforilasa
a.
Se apreciará que el G_{L} puede estar atado a
PP1c, es decir, puede estar en forma de PP1G_{L} y que el efecto
del compuesto puede evaluarse midiendo la actividad de PP1G_{L},
según se conoce bien por aquellos expertos en la técnica, por
ejemplo, según se describe en WO97/37224 y las referencias que allí
aparecen. Por tanto, puede medirse la desfosforilación de glucógeno
sintetasa por PP1G_{L}. Así puede seleccionarse un compuesto que
disminuya la actividad de PP1G_{L}. Se apreciará que el método
puede incluir un conducto de un pesquisaje (screen) o pesquisajes
(screens) para determinar que el compuesto interactúa con la
subunidad G_{L} y no con la subunidad PP1c.
Dicho compuesto puede ser un compuesto similar a
un medicamento o compuesto líder para el desarrollo de un compuesto
similar a un medicamento. Por tanto, el método puede ser un método
para identificar un compuesto similar a un medicamento o compuesto
líder para el desarrollo de un compuesto similar a un medicamento
que es capaz de imitar el efecto de fosforilasa a sobre
G_{L} (un compuesto de imitación).
Ofrecemos un kit de partes útiles para realizar
el método del tercer aspecto de la invención. De este modo ese kit
puede comprender fosforilasa a y un polipéptido que tenga la
secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY, o un fragmento de
ésta que se une a la fosforilasa a.
A continuación se describirán mediante ejemplos
las realizaciones preferidas de la invención, con referencia a las
figuras acompañantes.
Figura 1. Representación esquemática de G_{L}
y formas truncadas generadas por PCR o digestión de restricción. Se
indica la capacidad que tienen G_{L} y los fragmentos de G_{L}
para unirse a PP1, glucógeno y fosforilasa a. + indica que se
observó el enlace; - denota que el enlace se probó pero no se
detectó; a indica que la agregación de G_{L} y sus derivados
excluyeron la evaluación del enlace de glucógeno; las interacciones
que no se evaluaron se dejan en blanco.
Figura 2. Identificación de la región de G_{L}
requerida para la interacción con glucógeno. Las proteínas de fusión
GST-G_{L} que contienen regiones de codificación
G_{L} truncadas fueron examinadas por su capacidad de
cosedimentarse con glucógeno según se describe aquí en lo adelante.
Las fracciones de sobrenadante (S) y de pelet (P) obtenidas en
ausencia y presencia de glucógeno se sometieron a SDS/PAGE en geles
de 12,5% de poliacrilamida, se trasladaron a membranas de
nitrocelulosa y se analizaron por manchas inmunológicas
(immunoblotting) con anticuerpos de proteína
anti-G_{L} purificados afines. Se indica la
posición de las proteínas con marcador estándar, glucógeno
fosforilasa (97 kDa), albúmina sérica bovina (66 kDa), ovoalbúmina
(43 kDa), y anhidrasa carbónica (30 kDa).
Figura 3. La identificación del sitio de enlace
para la fosforilasa a radica en los 16 aminoácidos carboxi-
terminales de G_{L}. Las fusiones GST-G_{L}
(1-284) y GST que contienen regiones de codificación
G_{L} truncadas (2 \mug) se separaron en 12,5% geles
SDS-poliacrilamida y (A) se tiñeron con Azul
Coomassie o (B) se trasladaron a nitrocelulosa y se probaron con
100 nM fosforilasa a marcada con P^{32}. Las proteínas con
marcador estándar son como se muestran en la Fig. 2.
Figura 4. Identificación de la región que se
enlaza a PP1 en G_{L}. Las fusiones GST-G_{L}
(1-284) y GST que contienen regiones de
codificación G_{L} truncadas (2 \mug) se separaron en geles de
12,5% de SDS-poliacrilamida y (A) se tiñeron con
Azul Coomassie o (B) se trasladaron a nitrocelulosa y se probaron
con PP1y marcada con Digoxigenina. Las proteínas con marcador
estándar son como se muestran en la Fig. 2.
Figura 5. Comparación de las secuencias del
péptido M_{110} 1-38 de rata y el péptido G_{M}
63-93 de conejo con G_{L} en la región del motivo
RVSF (subrayado). Se subrayan doblemente tres residuos básicos (Lys
o Arg) que preceden al motivo RVSF que están conservados en
M_{110} y G_{L} pero no presentes en el péptido G_{M}
63-93. No fueron evidentes otras semejanzas claras
de secuencia entre el péptido M_{110} 1-38 y
G_{L} en la región que precede la mostrada.
Figura 6. Comparación del dominio de enlace del
polisacárido de las subunidades reguladoras de glucógeno de
mamífero, GAC1 S. cerevisiae, glucoamilasa (AMYL) Rhizopus
oryzae con el sitio de enlace (almacenamiento) de glucógeno
fosforilasa (PHOS). Las secuencias son G_{L}[5] de rata,
PPP1R5[6] humano, PPP1R6[7] humano, G_{M}[4]
humano, GAC1 [19] S. cerevisiae, glucoamilasa R.
oryzae [20] y glucógeno fosforilasa de músculo esquelético de
conejo [21]. Se muestra una secuencia de consenso para el dominio de
enlace del polisacárido de las subunidades reguladoras de glucógeno
y glucoamilasa. Los residuos conservados se subrayan y los residuos
idénticos se subrayan doblemente. Los residuos de enlace de
maltoheptosa en la fosforilasa están marcados con un asterisco.
Figura 7. Representación esquemática de los
dominios en G_{L} que interactúan con PP1, glucógeno y fosforilasa
a. PP1 se une al motivo
Arg-Val-Ser-Phe
ubicado en los residuos 61-64. También es probable
que la secuencia básica que precede a este motivo participe en el
enlace con PP1. Los residuos 134-231 incluyen los
residuos conservados entre las subunidades de glucógeno que radican
en el fragmento 94-257 de G_{L} que se
cosedimenta con glucógeno. La fosforilasa a se une a los 16
aminoácidos carboxi-terminales de G_{L}. Las
posiciones relevantes de aminoácidos se muestran antes.
La construcción de pGEX-G_{L}
que contiene la región completa de codificación de G_{L} [5] se
utilizó como plantilla en las reacciones en cadena de la polimerasa
usando pares de cebadores (primers) para generar una variedad
de fragmentos de la región de codificación de G_{L} (Fig. 1).
Todos los cebadores de codificación 5' contenían un sitio
NdeI y los cebadores inversos 3' contenían el codón de
terminación y un sitio XhoI tal como se describe en [5].
Luego los productos PCR fueron subclonados en el vector clonante
TOPO 2,1 PCR (Invitrogen, Leek, The Netherlands) y verificados
mediante secuencia en un secuenciador de ADN automatizado 373A de
Biosistemas Aplicados utilizando la secuenciación Taq dye
terminator cycle. Los fragmentos de la región de codificación de
G_{L} posteriormente fueron eliminados por escisión de
restricción con NdeI y XhoI y ligadas al vector
pGEX-AH digerido con las mismas enzimas de
restricción. Las truncaciones G_{L} 1-94 e I- 170
fueron generadas por escisión de un fragmento de restricción
SacI-SacI y uno
HindIII-HindIII respectivamente de la
construcción pGEX-G_{L} seguidas por
re-enlace del plásmido. La truncación G_{L}
94-170 fue generada por digestión
NdeI-HindIII de pGEX-G_{L}
94-257 seguida por enlace del fragmento en el
vector pGEX-AH digerido con las mismas enzimas. La
mutación dirigida al sitio de los mutantes simples N152A, K157A, el
mutante doble N152A + K157A y el mutante triple K149A + N152A +
L153A fue generada según se describe en [14] usando
pGEX-G_{L} 94-257 como plantilla.
Las construcciones resultantes codificaron glutationa
S-transferasa (GST) unida a los fragmentos de la
región de codificación de G_{L} con diversas longitudes. Se
obtuvieron proteínas de fusión GST-G_{L} mediante
cultivo de E. coli, transformado con las diversas
construcciones de eliminación de pGEX-G_{L}, en
medio Luria-Bertani que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina e inducía una expresión en el crecimiento de fase
exponencial a una A_{600}nm de 0,5 con 0,2 mM
isopropil-tio-\beta-D
galactopiranosida. Después de crecimiento adicional durante 16
horas a 26ºC-28ºC, se cosecharon los E. coli
y las proteínas de fusión GST-G_{L} se purificaron
en glutationa agarosa según se describe en [5].
Las proteínas de fusión
GST-G_{L} se separaron en SDS-PAGE
y se trasladaron a membranas de nitrocelulosa. Las mismas se
probaron con digoxigenina-PPI\gamma según se
describe [7]. Altemativamente se examinaron para determinar el
enlace de fosforilasa a marcada con P^{32}. Se bloqueó el
enlace no específico con las membranas mediante incubación en 5%
(p/v) de leche en polvo Marvel, 25 mM Tris/HCl pH 7,5, 500 mM NaCl
durante 16 horas. Luego las muestras se evaluaron durante 3 h con
fosforilasa a (100 nM) marcada con P^{32} en 25 mM Tris/HCl
pH 7,5, 250 mM NaCl, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina.
Posteriormente, las membranas se lavaron (3 x 30 min) con 25 mM
Tris/HCl pH 7,5 antes de autoradiografía.
Se preparó glucógeno libre de proteína mediante
el siguiente protocolo. Las partículas de proteína del glucógeno se
aislaron de hígados de conejos blancos de Nueva Zelanda [15]. Luego
la proteína se eliminó del glucógeno hirviendo durante 5 min en 1%
(p/v) de dodecil sulfato sódico (SDS). La suspensión se enfrió hasta
temperatura ambiente y se centrifugó durante 60 min a 100,000 x g.
El pelet 100,000 x g luego se resuspendió en agua, y el
procedimiento de centrifugación y resuspensión se repitió otras dos
veces para eliminar completamente el SDS y la proteína residuales.
Cualquier nucleótido contaminante se eliminó incubando el glucógeno
durante 15 min con resina de capa mezclada, AG
501-X8(D). La resina se eliminó por
filtración y la concentración de glucógeno se determinó por el
método fenol/ácido sulfúrico [16].
El glucógeno libre de proteínas (10 mg/ml) en 50
mM Tris/HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v)
2-mercaptoetanol, 0,02% (p/v)
Brij-35, 0,1 mg/ml albúmina sérica bovina se mezcló
con proteínas de fusión GST-G_{L} (50 nM).
Después de la incubación en hielo durante 30 min, las muestras se
centrifugaron durante 90 min a 100,000 x g. Las fracciones de
sobrenadante y pelet se desnaturalizaron en SDS, se sometieron a
electrofóresis SDS-gel de poliacrilamida y se
trasladaron a nitrocelulosa. Las membranas se incubaron durante la
noche en 25 mM Tris/HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 0,1% (p/v)
Tween-20, 10% leche en polvo antes de evaluar con
anticuerpos de proteína anti-G_{L} de oveja
purificados afines (100 ng/ml in 25 mM Tris/HCl pH 7,5, 250 mM NaCl,
0,1% (p/v) Tween-20, 3% (p/v) leche en polvo),
seguido por algunos lavados en la misma solución tampón (sin la
leche en polvo) e incubación con anticuerpos
anti-oveja conjugados con peroxidasa de rábano
picante (Pierce, RU). Se visualizaron bandas inmunorreactivas
utilizando el sistema mejorado de quimiluminiscencia (Amersham
International, Bucks, RU.)
GST-G_{L}, que contiene la
región de codificación de G_{L} con longitud completa, y algunas
de las truncaciones GST-G_{L}
{GST-G_{L} (94-216),
GST-G_{L} (94-170),
GST-G_{L} (134-170),
GST-G_{L} (134-216),
GST-G_{L} (134-257)) exhibieron
una fuerte tendencia a la agregación y se peletizaron a 100 000 x g
durante 1 h, incluso en ausencia de glucógeno. Por tanto, estas
construcciones no pudieron evaluarse para la sedimentación
dependiente de glucógeno. De las proteínas de fusión GST que no se
agregaron, GST-G_{L} (94-284) y
GST-G_{L} (94-257) fueron ambas
detectadas exclusivamente en el pelet de 100,000 x g obtenido por
centrifugación en presencia de glucógeno (Fig. 2). Por el
contrario, GST-G_{L} (170-216) y
GST-G_{L} (170-257) no se
enlazaron al glucógeno, siendo detectados exclusivamente en la
fracción del sobrenadante de 100,000 x g en presencia de glucógeno
(Fig. 2). Se encontró que
GST-G_{L}(94-257) que
portan la mutaciones simples N152A o K157A, la doble mutación N152A
+ K157A, o la triple mutación K149A + N152A + L153A se sedimentaron
todas en presencia de glucógeno (no se muestran datos).
Para identificar la región de G_{L}
responsable del enlace de fosforilasa a,
GST-G_{L} y sus formas truncadas se trasladaron a
membranas de nitrocelulosa y se evaluaron para determinar su
capacidad de enlace con fosforilasa a marcada con P^{32}.
Se encontró que la fosforilasa a marcada con P^{32} se
enlaza con GST-G_{L} que contiene la región de
codificación completa de G_{L} y con GST-G_{L}
(216-284), GST-G_{L}
(257-284) y GST-G_{L}
(269-284) pero no con
GST-G_{L}(1-216),
GST-G_{L} (1-257) y
GST-G_{L}(1-271) (Fig. 3 y
no se muestran datos). Estos resultados indican que el dominio de
enlace de la fosforilasa a radica en los 16 aminoácidos
carboxi-terminales de G_{L}.
También se evaluaron las truncaciones
GST-G_{L} para determinar su capacidad de enlace
con la PP1 y marcada con digoxigenina después del traslado a
membranas de nitrocelulosa. La Fig. 4 muestra que la
digoxigenina-PP1 se enlaza con
GST-G_{L}(1-284),
GST-G_{L} (1-94) y
GST-G_{L}(59-284) pero no
con GST-G_{L}(1-59) o
GST-G_{L}(94-284),
GST-G_{L}(134-284) o
GST-G_{L} (170-284). A partir de
estas interacciones, el principal dominio de enlace de PP1 debe
estar situado entre los residuos 59 y 94 de G_{L}. Algunos
fragmentos degradados proteolíticamente presentes en las
preparaciones también fueron reconocidos por la
digoxigenina-PP1, en particular una banda de tinción
secundaria de Azul Coomassie de 35 kDa que migró un poco más rápido
que GST-G_{L}(1-94) pero
más despacio que
GST-G_{L}(1-59). Como este
fragmento proteolítico fue retenido sobre
glutationa-sefarosa, es probable incluir a GST
ligado a los primeros 75-80 residuos de G_{L}. La
fuerte señal con digoxigenina-PP1 puede explicarse
por una renaturalización más efectiva de este fragmento de SDS
sobre membrana de nitrocelulosa.
Aquí hemos identificado tres dominios
funcionales distintos en la subunidad reguladora de glucógeno de
hígado de rata de proteína fosfatasa 1. La sección que comprende los
aminoácidos 59-94 es necesaria y suficiente para el
enlace con PP1. Esta región contiene la secuencia,
Arg-Val-Ser-Phe, que
se ajusta al motivo consenso de enlace con PP1 determinado para
otras subunidades que se unen a PP1. Los datos ofrecen evidencia
adicional para la importancia de este pequeño motivo en el enlace
de PP1 con sus subunidades reguladoras. Los resultados también
indican que ningún otro dominio fuera de los residuos
59-94 puede iniciar y mantener una interacción con
PP1 independientemente del motivo RVSF. Experimentos anteriores
[12] demostraron que un péptido que comprende los 38 residuos con
terminación amino de la subunidad M_{110} de la subunidad
reguladora de miosina de PP1 (M_{110} 1-38) podía
romper el complejo PP1G_{L}, mientras que un péptido que comprende
los residuos 63-93 de la subunidad reguladora de
glucógeno de músculo esquelético (G_{M} 63-93) no
suprimía el enlace de G_{L} con PP1. Este dato sugiere que es
probable que sitios secundarios de la interacción de PP1G_{L}
involucren a residuos que son idénticos en M_{110}
1-38 y G_{L} pero distintos (o no incluidos) en
G_{M}63-93. Una comparación de las secuencias del
péptido M_{110} 1-38 y el péptido G_{M}
63-93 con G_{L} en la región del motivo RVSF
identifica 3 residuos básicos (Lys o Arg) precediendo al motivo
RVSF que son idénticos en M_{110} y G_{L} pero no están
presentes en el péptido G_{M} 63-93 (Fig. 5). Los
residuos básicos en las posiciones -2, -4 y -5 con respecto al
motivo RVSF puede por tanto ofrecer interacciones secundarias de
G_{L} con PP1 que no son rotas por el péptido G_{M}
63-93. La estructura de cristal de PP1 combinada al
péptido G_{M} 63-75 revela la presencia de un
dominio acídico en PP1, que se une al extremo
N-terminal del motivo RVSF en el péptido atado y
así tiene el potencial para interactuar con los residuos básicos en
G_{L} y el péptido M_{110} [2]. La similitud de secuencia
anteriormente observada entre las subunidades reguladoras de
glucógeno de mamífero y glucoamilasa de Rhizopus Oryzae, la
cual se enlaza al almidón, despliega una región que comprende los
aminoácidos 134-231 de G_{L}[5,6] y (Fig.
6). El presente estudio demuestra que la región
94-257 de G_{L} es capaz de enlazarse al
glucógeno, mientras que las proteínas de fusión GST truncadas
GST-G_{L} (170-216) o
GST-G_{L} (170-257) no pueden
atarse al glucógeno. La interacción de GST-G_{L}
(94-170) o GST-G_{L}
(134-170) con glucógeno no se pudo probar debido a
la agregación de este fragmento. Sin embargo, los residuos
148-168 de G_{L} muestran algunas semejanzas de
secuencia (Fig. 6) con la región en fosforilasa que estudios
cristalográficos han identificado se enlaza con maltoheptosa y creen
se une al glucógeno in vivo [17, 181]. La estructura de
cristal de fosforilasa demuestra que las cadenas laterales de
aminoácidos hidrofóbicos conservados en esta sección forman
contactos internos y parecen estar involucradas en mantener la
orientación de la a-hélice que se une a la
maltoheptosa. De los residuos que se muestra se atan a la
maltoheptosa, sólo el Asn correspondiente a Asn152 en G_{L} es
idéntico en las subunidades reguladoras de glucógeno y fosforilasa.
Sin embargo, la mutación de N152A en GST-G_{L}
(94-257) no impidió el enlace de este fragmento con
glucógeno, ni la mutación doble de K157A + N152A. La triple mutación
K149A + N152A + L153A de los residuos que se conservan en las
subunidades reguladoras de glucógeno y que está alineada con las que
se atan a maltoheptosa en fosforilasa (Fig. 6) también no impidió
el enlace de GST-G_{L} (94-257)
con glucógeno. Los resultados sugieren que es probable que se
requieran todas las secciones conservadas en G_{L}
(134-231) para el enlace con glucógeno ya sea
haciendo contacto directo con glucógeno o contribuyendo con los
elementos estructurales requeridos para este enlace. Además señalan
que el sitio de enlace de la subunidad reguladora de glucógeno de
PP1 y glucoamilasa con los polisacáridos es diferente al sitio de
enlace (almacenamiento) del glucógeno de la fosforilasa.
La inhibición alostérica de la actividad de
glucógeno sintetasa fosfatasa de PP1G_{L} por la fosforilasa
a está mediada por el enlace de fosforilasa a con
G_{L} [5,9,11]. Los resultados presentados aquí demuestran que los
16 aminoácidos en el extremo C terminal de G_{L} son esenciales
para la interacción con fosforilasa a (Fig. 7). Sin embargo,
aunque esta pequeña región es suficiente para el enlace de
fosforilasa a, es probable que se requieran otras regiones
de G_{L} para transmitir el efecto alostérico de esta molécula al
sitio activo de PP1. No obstante, la identificación inesperada de
una pequeña secuencia en G_{L} tan crucial para el enlace de
fosforilasa a y por consiguiente, también para la inhibición
de la actividad de glucógeno sintetasa fosfatasa ofrece una
fundamentación para la búsqueda de pequeñas moléculas que podrían
bloquear esta inhibición.
Aumentar el nivel de glucógeno sintetasa
fosfatasa y por consiguiente glucógeno sintetasa puede ser útil en
trastornos, tales como la diabetes, donde la hiperglucemia es un
problema severo.
Las otras tres subunidades que se unen al
glucógeno, G_{M}/PPP1R3, PPP1R5 y PPP1R6 no muestran semejanzas de
secuencia significativas con el extremo
carboxi-terminal de G_{L} [7], lo cual explica por
qué G_{M} no se inhibe con fosforilasa a [10] y no se ha
encontrado que PPP1R5 y PPP1R6 se unan a la fosforilasa a
después del traslado a membranas de nitrocelulosa [5, 7]. Se ha
reportado que PTG, homólogo de ratón de la subunidad reguladora de
glucógeno humano, PPP1R5, se enlaza a la fosforilasa a, así
como a algunas otras enzimas reguladoras del metabolismo del
glucógeno [8]. Si éste es el caso, entonces la secuencia de
aminoácidos que se enlaza a fosforilasa a en PTG es
significativamente diferente a la de G_{L}.
Las formas GST-G_{L} que
contienen la secuencia de 16 aminoácidos [X] producidas de acuerdo
con los métodos anteriormente descritos se trasladan a membranas de
nitrocelulosa y se prueban para determinar su capacidad de enlace
con fosforilasa a marcada con P^{32} en presencia y
ausencia de un compuesto experimental. Una disminución en la
cantidad de enlace de fosforilasa a P^{32} en presencia del
compuesto experimental comparada con la cantidad de enlace en
ausencia del compuesto experimental es indicativo de un compuesto
inhibitorio de la invención.
Un compuesto que es capaz de bloquear la
interacción fosforilasa a G_{L} debe incrementar la
actividad de PP1-G_{L} y por consiguiente la de
glucógeno sintetasa, lo que lleva a la conversión aumentada de
glucosa en glucógeno. Por tanto, el compuesto debe ser un
medicamento efectivo en la disminución de glucosa en sangre
convirtiéndola en glucógeno hepático.
Anteriormente, era razonable asumir que como la
fosforilasa a es una molécula grande, podría atarse a muchos
sitios o a una región extensa de G_{L}. Por consiguiente, se pensó
que era muy baja la probabilidad de encontrar un medicamento que
pudiera bloquear esta interacción. La identificación inesperada de
que el sitio de enlace en G_{L} haya tenido una longitud de sólo
16 aminoácidos (o menor) incrementa la probabilidad de encontrar un
medicamento que impedirá la inhibición de fosforilasa a del
complejo PP1-G_{L} y por tanto aumentará la
síntesis del glucógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la invención o una formulación
de éstos, mencionados anteriormente, pueden administrarse por
cualquier método convencional que incluye inyección oral y
parenteral (ej. subcutánea o intramuscular). El tratamiento puede
consistir en una dosis única o varias dosis durante un período de
tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos ilustran las
formulaciones farmacéuticas según la invención en las que el
ingrediente activo es un compuesto de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las tabletas se preparan a partir de los
anteriores ingredientes mediante granulación húmeda seguida por
compresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes formulaciones A y B se preparan
por granulación húmeda de los ingredientes con una solución de
povidona, seguida por adición de estearato de magnesio y
compresión.
Las siguientes formulaciones, D y E, se preparan
por compresión directa de los ingredientes mezclados. La lactosa
utilizada en la formulación E es del tipo de compresión de
dirección.
\vskip1.000000\baselineskip
La formulación se prepara por granulación húmeda
de los ingredientes (abajo) con una solución de povidona seguida
por adición de estearato de magnesio y compresión.
La liberación del medicamento ocurre durante un
período de aproximadamente 6-8 horas y se completó
después de 12 horas.
Una formulación en cápsula se prepara mezclando
los ingredientes de la Formulación D en el Ejemplo C de arriba y
llenando en una cápsula de gelatina dura de dos partes. La
formulación B (infra) se prepara de manera similar.
Las cápsulas se preparan fundiendo el Macrogol
4000 BP, dispersando el ingrediente activo en el fundido y llenando
la cápsula de gelatina dura de dos partes con el fundido.
Las cápsulas se preparan dispersando el
ingrediente activo en la lecitina y el aceite araquis y llenando
cápsulas de gelatina elástica, blanda con la dispersión.
\vskip1.000000\baselineskip
La siguiente formulación en cápsula de
liberación sostenida se prepara por extrusión de los ingredientes a,
b, y c usando un extrusor, seguida por la esferonización del
extrudido y secado. Los pelets secados luego se revisten con
membrana que controla la liberación (d) y se vierten en una cápsula
de gelatina dura de dos partes.
Tampón fosfato estéril, libre de pirógenos (pH
7,0) hasta 10 ml
El ingrediente activo se disuelve en la mayor
parte del tampón fosfato (35-40ºC), luego se lleva
al volumen y se filtra a través de un filtro estéril de microporos
a un bulbo de cristal ámbar estéril de 10 ml (tipo 1) y se sella con
cierres estériles y sobresellos.
El ingrediente activo se disuelve en el
glucofurol. Luego se añade alcohol bencílico y se disuelve, y se
adiciona agua hasta 3 ml. La mezcla entonces se filtra a través de
un filtro estéril de microporos y se sella en bulbos de cristal
estériles de 3 ml (tipo 1).
El benzoato sódico se disuelve en una porción de
agua purificada y se añade la solución de sorbitol. El ingrediente
activo se adiciona y se dispersa. El espesante (celulosa
dispersable) se dispersa en el glicerol. Las dos dispersiones se
mezclan y se llevan al volumen requerido con agua purificada. Según
se requiera, se logra más espesamiento con movimiento extra de la
suspensión.
Una quinta parte del Witepsol H15 se derrite en
cubeta termostatada a 45ºC como máximo. El ingrediente activo se
criba a través de un tamiz de 200 \mum y se añade a la base
fundida con mezclado, utilizando una mezcladora Silverson equipada
con una cabeza cortante, hasta que se logra una dispersión suave.
Manteniendo la mezcla a 45ºC, el Witepsol H15 restante se agrega a
la suspensión y se agita para garantizar una mezcla homogénea. Toda
la suspensión se pasa por una pantalla de acero inoxidable de 250
\mum y, con agitación continua, se deja enfriar hasta 40ºC. A una
temperatura de 38ºC a 40ºC, 2,02 g de la mezcla se vierte en moldes
plásticos adecuados. Los supositorios se dejan enfriar a
temperatura ambiente.
Los ingredientes de arriba se mezclan
directamente y los óvulos se preparan por compresión directa de la
mezcla resultante.
Las formulaciones pueden convenientemente
presentarse en forma de dosis de unidad y se pueden preparar
mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de
farmacia. Tales métodos incluyen la asociación del ingrediente
activo (compuesto de la invención) con el vehículo que constituye
uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se
preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con
vehículos líquidos o vehículos sólidos divididos con precisión o
ambos, y luego, si es necesario, moldeando el producto.
Las formulaciones según la presente invención
convenientes para administración oral se pueden presentar como
unidades discretas tales como cápsulas, píldoras (cachets) o
tabletas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del
ingrediente activo; como un polvo o gránulos; como una solución o
una suspensión en líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una
emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en
aceite. El ingrediente activo también puede presentarse como bolo,
electuario o pasta.
Una tableta se puede elaborar por compresión o
moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las
tabletas comprimidas se pueden preparar comprimiendo en una máquina
adecuada el ingrediente activo en forma de fluido libre como polvo
o gránulos, opcionalmente mezclarse con un aglutinante (ej.,
povidona, gelatina, hidroxipropil-metilcelulosa),
lubricante, disolvente inerte, preservante, desintegrante (ej.,
glicolato de almidón sódico, povidona reticulada,
carboxi-metil celulosa sódica reticulada), agente
tensioactivo o agente dispersante. Las tabletas moldeadas pueden
elaborarse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del
compuesto en polvo humedecido con un diluente líquido inerte. Las
tabletas pueden opcionalmente revestirse o marcarse con una incisión
y se pueden formular de manera que ofrezcan una liberación lenta o
sostenida del ingrediente activo de la misma usando, por ejemplo,
hidroxipropil-metilcelulosa en proporciones diversas
para ofrecer el perfil de liberación deseado.
Las formulaciones convenientes para la
administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden
el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y
acacia o tragacanto; las pastillas compuestas por el ingrediente
activo en una base inerte como la gelatina y la glicerina, o la
sacarosa y la acacia; y los lavados bucales compuestos por el
ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.
Las formulaciones convenientes para la
administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles
acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones,
bacteriostáticos y solutos que vuelven isotónica la formulación con
la sangre del receptor seleccionado; y suspensiones estériles
acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y
agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en
recipientes unidosis o multidosis, por ejemplo ámpulas y bulbos
sellados, y se pueden almacenar en condiciones seca congelada
(liofilizadas) requiriendo solamente la adición del portador líquido
estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes
del uso. Las soluciones inyectables extemporáneas y las suspensiones
se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y tabletas
estériles del tipo previamente descrito.
Las formulaciones unidosis preferidas son
aquellas que contienen una dosis o unidad diaria, una
sub-dosis diaria o una fracción adecuada de éstas,
de un ingrediente activo.
Deberá entenderse que además de los ingredientes
particularmente mencionados arriba, las formulaciones de esta
invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica
considerando el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo
aquellas adecuadas para administración oral pueden incluir agentes
saborizantes.
Mientras es posible que un compuesto de la
invención sea administrado solo, es preferible presentarlo como una
formulación farmacéutica, junto con uno o más vehículos aceptables.
El vehículo (s) debe ser "aceptable" en el sentido de ser
compatible con el compuesto de la invención y no deletéreo para los
receptores del mismo.
Típicamente, los vehículos serán agua o salina
que serán estériles y estén libres de pirógenos.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet WO 9737224 A [0034]
\bulletCOHEN et al. Meth
Enzymol, 1988, vol. 159, 399-408
[0024]
<110> Consejo de Investigación Médica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Compuestos y métodos terapéuticos de
elaboración y uso de la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MEDW/P21404pc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Glu Trp Pro Ser Tyr Leu Gly Tyr Glu Lys
Leu Gly Pro Tyr Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Val Ser Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Pro Val Val Lys Arg Gln Lys Thr Lys Val
Lys Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Val Gln Glu Lys Lys Val Lys Lys Arg Val
Ser Phe Ala Asp Gln}
\sac{Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211>11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Arg Val Ser Phe Ala Asp Asn Phe
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 102
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 117
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<212> PRT
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<213> Saccharomyces cerevisiae
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 96
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<212> PRT
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<213> Rhizopus oryzae
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 40
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<212> PRT
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<213> conejo
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<400> 12
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Claims (11)
1. Un compuesto que es capaz de bloquear la
interacción de fosforilasa a con la subunidad reguladora de
glucógeno (G_{L}) de la proteína fosfatasa para uso en medicina,
donde el compuesto es (1) un anticuerpo o molécula de tipo
inmunoglobulina o un fragmento de éstos que se enlaza
específicamente a G_{L}, donde el anticuerpo o molécula de tipo
inmunoglobulina o fragmento de éstos se enlaza específicamente a la
secuencia de aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY ó (2) un polipéptido
compuesto por la secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY, o un
fragmento de éste que es capaz de unirse específicamente a la
fosforilasa a.
2. Uso de un compuesto según la reivindicación 1
en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de la
diabetes tipo I y/o tipo II.
3. El compuesto de la reivindicación 1 o uso de
la reivindicación 2, donde el polipéptido incrementa la actividad de
glucógeno sintetasa hepática.
4. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto (compuesto inhibidor) tal como se define en una de la
reivindicaciones 1 a la 3, junto con un excipiente o vehículo
farmacéuticamente aceptable.
5. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 4, donde el compuesto inhibidor es un polipéptido
compuesto por la secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY, o un
fragmento de ésta que es capaz de unirse específicamente a la
fosforilasa a.
6. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 5, donde el polipéptido está compuesto por un
fragmento de la secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY que es
capaz de unirse específicamente a la fosforilasa a.
7. Un método de identificación de un compuesto
inhibidor que es capaz de bloquear la interacción de fosforilasa
a con la subunidad reguladora de glucógeno de la proteína
fosfatasa 1, que comprende:
- ofrecer un polipéptido compuesto por la secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY, o fragmento de éste que se une específicamente a la fosforilasa a; o un polipéptido que se une a la fosforilasa a y es una fusión GST de un polipéptido compuesto por la secuencia de 16 aminoácidos PEWPSYLGYEKLGPYY, o de un fragmento de éste que se une específicamente a la fosforilasa a;
- ofrecer un compuesto experimental, donde el compuesto experimental es menor que 5000 dalton o es un anticuerpo o una molécula de tipo inmunoglobulina o fragmento de éstos; y
- comparar el enlace del polipéptido por la fosforilasa a en presencia o ausencia del compuesto experimental; un inhibidor que es identificado por un enlace reducido en presencia del compuesto experimental.
8. Un método según la reivindicación 7, donde la
fosforilasa a está marcada y el enlace de la fosforilasa
a con el polipéptido se determina midiendo la cantidad de
marcador.
9. Un método según la reivindicación 8, donde la
fosforilasa a está marcada con un marcador seleccionado a
partir de la digoxigenina y P^{32} o P^{33}.
10. Uso de un compuesto inhibidor tal como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6 en la
fabricación de un medicamento para reducir el nivel de glucosa en
sangre de un animal mamífero.
11. Uso según la reivindicación 10 donde el
animal mamífero es un humano.
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