HUT77030A

HUT77030A - Acilezett inzulinanalógok

Info

Publication number: HUT77030A
Application number: HU9701890A
Authority: HU
Inventors: Jeffrey Clayton Baker; Jose Michael Hanquier
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1995-11-14
Publication date: 1998-03-02
Also published as: MX9703508A; IL115973A; CA2205060A1; FI972031A0; PL320644A1; DE69530353D1; IL115973A0; AU4237396A; EP0712861A2; TR199501420A2; ATE237635T1; AU711282B2; JPH10511644A; FI972031A; BR9509653A; NZ297257A; US5922675A; EP0712861B1; RU2160118C2; EP0712861A3

Description

A jelen találmány tárgya a cukorbetegség területére tartozik. Pontosabban, a jelen találmány tárgyát hosszabb hatásidővel rendelkező, acilezett inzulin analógok képezik.

Az inzulinóhelyettesítő terápia hozzáférhetősége megakadályozza a cukorbetegség akut komplikációinak mortalitását és morbiditását. A krónikus cukorbetegség komplikációi azonban továbbra is súlyos egészségügyi problémát jelentenek, a továbbra is fennálló metabolizmus zavar miatt, ami főleg a vércukorszint rossz szabályozásából ered. A Cukorbetegség Kontroll és Komplikációk Vizsgálat (DCCT) azt mutatja, hogy a Hb Alc 1%-os csökkenése a retinopátia több mint 35%-os javulásával korrelál.

Ahhoz, hogy normális glikémiát érjünk el, a terápiát úgy kell megtervezni, hogy a lehető legjobban feleljen meg annak az endogén inzulin szekréciós lefutásnak, ami az egészséges egyedekben lejátszódik. Az inzulin iránti fiziológiás igény a nap folyamán változik, és két fázisra bontható: (a) abszorptív fázis, ami egy inzulin impulzust igényel ahhoz, hogy az étel elfogyasztásához kapcsolódó vércukorszint hullámzást rendezze, és (b) poszt-abszorptív fázis, ami állandó mennyiségű inzulint igényel ahhoz, hogy a máj glükózkibocsátását szabályozza, és optimális éhezési vércukorszintet tartson fenn.

Ennek megfelelően, a hatékony terápia két típusú éxogén inzulin kombinált alkalmazását foglalja magában: egy gyorsan ható, étkezéskor működő inzulinét és egy hosszan ható alapszintű inzulinét.

Ahhoz hogy hosszú ideig tartó alapszintű hatást érjenek el, az inzulint jelenleg olyan formában szerelik ki, ami előnyben részesíti hexamer képződését egy oldhatatlan, kristályos állapotban. Ezek a hosszan ható készítmények a következők: Ultralente, Lente és semiLente. Azonban a jelenleg alkalmazott hosszan ható készítmények oldhatatlanságáról kimutatták, hogy problémákat okoznak a dózis-hatás következetlensége, valamint az időbeli hatás megjósolhatatlansága miatt. Emellett a jelenleg hozzáférhető hosszú hatásidejű inzulin készítmények, például a szarvasmarha Ultralente, immunogén hatású. A szarvasmarha Ultralente immunogenicitása miatt jelenlevő ellenanyagok megváltoztatják a gyorsan ható inzulinok farmakokinetikáját.

Jóllehet az oldhatatlan Ultralente készítmény egy naponta egyszer kényelmesen beadható alapszintű inzulin, számos orvos inkább egy közepes hatásidejú inzulin beadását részesíti előnyben, ami egy általában inzulinNPH néven említett inzulin-protamin készítmény. Az inzulin-NPH-t naponta kétszer használják alapszintet biztosító inzulinként, mivel egy rövidebb hatásidejú gyógyszerrel viszonylag egyszerűbb beállítani az optimális dózist. Ennek eredményeképpen a közepes hatásidejú inzu4 linók adják az USA-ban a piac 70%-át, a japán piac 64%át, az európai piac 45%-át és a teljes világpiac 55%-át.

Azonban mind az oldhatatlan inzulin-NPH mind az oldhatatlan Ultralente inzulin szuszpenziós készítmény. Tehát a készítmények hatása kevésbé látható előre mint az oldható készítményeké, és ezért kevésbé jó a vércukorszint szabályozása, valamint nagyobb az érzékenysége az életveszéllyel járó hipoglikémiás epizódoknak. Ennek megfelelően továbbra is szükség van oldható, hosszú hatásidejű inzulin helyettesítési terápiára, hogy sikeres, intenzív inzulin helyettesítési terápiát lehessen alkalmazni. A jelen találmány tárgyát acilezett inzulin analógok képezik, amiket úgy lehet formulázni, hogy oldható, stabil, alap inzulinszintet biztosító terápiát kapjunk.

A sertés, szarvasmarha vagy humán inzulin acilezését Muranishi és Kiso írta le, az 1-254,699 japán szabadalmi bejelentésben. Az alábbi vegyületeket ismertetik: Β29-Ν^εpalmitoil inzulin (az ε-amino csoport acilezve van), BlN^a-palmitoil inzulin (az N-terminális α-amino csoport van acilezve), és B1, B29-N^a, N⁶-dipalmitoil inzulin (mind az εamino mind az N-terminális α-amino csoport acilezve van).

Muranishi és Kiso leírja, hogy az acilezett inzulin biológiai profilja hasonlít az inzulinéra; azonban egyikkel sem lehet elérni az in vivő modell dozírozását, beadási módját vagy egyéb állapotát, hogy ezzel lehetővé tegyék a

szakterületen jártas szakember számára hogy kiértékeljék áz acilezett inzulin aktivitását és hatásidejét.

Hasonlóképpen Hashimoto és munkatársai is leírják a Bl-N^ra-palmitoil inzulint (az N-terminális α-amino csoport van acilezve), és Bl, B29-N^a, N^E-dipalmitoil inzulint (mind az ε-amino mind az N-terminális α-amino csoport acilezve van) [Hashimoto és mtsai: Pharmaceutical Research 6, 171176 (1989)] . Hashimoto és munkatársai tanulmányozták a

Bl-N^w-palmitoil és a Bl, B29-N“, N^E-dipalmitoil inzulin hipoglikémiás hatását hím patkányokban, 25 E/ml mennyiségben, ami egy rendkívül nagy dózis. Az 5. ábrán látható, hogy ezeknél a dózisoknál nagyon alacsony az aktivitás, ha intravénásán adjuk be. Ha intramuszkulárisan adjuk be, akkor a Bl-N^a-palmitoil inzulinnak csak egy nagyon rövid hipoglikémiás hatását láthatjuk, a Bl,B29-N^a,N^E-dipalmitoil inzulinnak pedig elhanyagolható a hatása, amint az a

6. ábrán látható.

A Muranishi és Kiso, valamint a Hashimoto és munkatársai, in vivő hatásokat leíró közleménye mellett Walder és munkatársai leírják a WO 92/01476 számú PCT publikációjukban, hogy a fehérjék és peptidek felezési ideje in vívó meghosszabbítható, ha a fehérjét kémiailag egy apoláris csoporttal, pontosabban egy zsírsav-származékkal kapcsolják össze. A zsírsav egy hidat képez a fehérje és az albumin között. Walder és munkatársai továbbra is azt közük, hogy az apoláris csoportot előnyösen a fehérjének ···::

csak egy bizonyos pontjához vagy csak bizonyos pontjaihoz lehet hozzákötni, és erre a kötődésre a ciszteincsoportoknak a hemoglobinhoz való kötődése lehet a példa. A referencia általában az inzulin zsírsav-származékait írja le. Azonban az inzulinnak nem írják le semmilyen zsírsav származékát, nem adnak meg ilyen példát, és nem közölnek olyan adatokat, amik azt mutatnák, hogy az inzulin zsírsav-származékának megmarad a biológiai aktivitása.

Felfedezték, hogy a monomer inzulin analóg egy szabad aminocsoportjának a szelektív acilezése hatékony alapszintű inzulin-aktivitást biztosít. Az alábbiakban ismertetett nem-acilezett inzulin-analógokat úgy terveztük meg, hogy gyorsan hassanak és gyorsan kiürüljenek. Ezek az analógok a szakirodalomban monomer inzulin-analógokként ismertek. Az ilyen analógoknak az alapszintű aktivitást szolgáltató módosítása a legkevésbé várható.

A jelen találmány tárgya egy mono-acilezett inzulinanalóg, ami az alkalmazás során hosszabb hatásidőt eredményez. Az analógokat oldható formában lehet előállítani, és ez előnyt jelent a jelenleg alkalmazott alapszintű inzulin terápiával szemben. A jelen találmány szerinti analógok dózis-hatás tulajdonsága kiválóan megjósolható, ugyancsak jól megjósolható a hatásidejük, nincs egy erős csúcs az idő-hatás profilban, és ezért ideálisan alkalmasak arra, hogy keverék készítményeket állítsunk elő velük, amik egy inzulin-analógot és acilezett inzulinanalógot tartalmaznak.

A jelen találmány tárgyát egy alábbi szekvenciájú

mono-acilezett inzulin-analóg	képezi '	(1. számú szekven
cia) :
Xaa Ile Val Glu Gin	Cys Cys Thr	Ser Ile	Cys Ser Leu Tyr
1 5		10
Gin Leu Glu Asn Tyr	Cys Asn
15	20
megfelelő keresztkötéssel a 2.	számú	szekvenciához kap

csolva:

Xaa Val Asn 1

Gin

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Alá

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Xaa

15

20

25

Xaa

Thr

30

vagy ezeknek gyógyászatilag elfogadható sói;

aholis az 1. számú szekvencia (inzulin A-lánc) 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, vagy acilezett Gly, ha 2. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa Phe, a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, és a 2. számú szekvencia 29es pozíciójában levő Xaa jelentése Lys vagy Pro;

a 2. számú szekvencia (inzulin B-lánc) 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Phe, vagy acilezett Phe, ha az 1. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, és a 2. számú szekvencia 29-es pozíciójában levő Xaa jelentése

Lys vagy Pro;

a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val, Alá; vagy acilezett Lys, ha az 1. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, a 2. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Phe, és a 2. számú szekvencia 29-es pozíciójában levő Xaa jelentése Pro; és a 2. számú szekvencia 29-es pozíciójában levő Xaa jelentése Lys, Pro; vagy acilezett Lys, ha a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, az 1. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, és a 2. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Phe.

A találmány tárgyát képezik továbbá a hiperglikémia kezelésére szolgáló eljárások, a betegnek egy gyógyászati készítményt adva be, ami hatásos mennyiséget tartalmaz a találmány szerinti acilezett inzulin-analógból, egy vagy több gyógyászatilag elfogadható konzerválószerrel, izotóniás ágenssel vagy pufferrel együtt.

Az ebben a leírásban alkalmazott összes aminosav rövidítés a United States Patent and Trademark Office által elfogadott rövidítés [ 37 C.F.R. § 1.822(B) (2)] .

A keresztkötés szakkifejezés jelentése diszulfid hidak kialakulása a ciszteincsoportok között. Egy megfelelő keresztkötéseket tartalmazó inzulinban vagy inzulin···

analógban három diszulfid híd található. Az első diszulfid híd az A-lánc β-os és 11-es csoportja között alakul ki. A második diszulfid híd az A-lánc 7-es pozíciójában levő ciszteincsoportot köti össze a B-lánc 7-es pozíciójában levő ciszteincsoporttal. A harmadik diszulfid híd az A-lánc 20-as pozíciójában levő ciszteincsoportot kapcsolja össze a B-lánc 19-es pozíciójában levő ciszteincsoporttal .

Az acilezett Gly, acilezett Phe és acilezett Lys szakkifejezés jelentése C₆-C₂₁ zsírsavval acilezett Gly, Phe vagy Lys. Az acilező csoport szakkifejezés jelentése az inzulin-analóg α-amino csoportjához vagy εamino csoportjához kémiailag hozzákapcsolt zsírsav. Az Al és B1 pozíciókban levő szabad aminocsoportok α-amino csoportok. A B28 vagy B29 pozícióban levő Lys szabad aminocsoportja egy ε-aminocsoport.

Az acilezés szakkifejezés jelentése egy acilcsoport bevitelét jelenti, kovalens kötéssel a fehérje egy szabad aminocsoportjához kapcsolva. A szelektív acilezés szakkifejezés azt jelenti, hogy főleg az ε-aminocsoport(ok) acileződik az α-aminocsoportokkal szemben.

A zsírsav szakkifejezés jelentése telített vagy telítetlen, C₆-C₂i zsírsav. Az előnyben részesített zsírsavak telítettek, ide tartozik a mirisztilsav (C₁₄) , pentadecilsav (C₁₅) , palmitinsav (C₁₆) , heptadecilsav (C₁₇) és sztearinsav (C₁₈) . A legelőnyösebb zsírsav a palmitin10 sav. A jelen találmány szerinti vegyületek mono-acilezett inzulin-analógok. Az inzulin-analógok egy a-aminocsoportnál vagy egy ε-aminocsoportnál vannak acilezve egy C₆-C₂₁ zsírsavval. Az analógok előnyösen a lizin ε-aminocsoportjánál vannak mono-acilezve.

Az aktivált szabad zsírsavészter szakkifejezés jelentése olyan zsírsav, amit általánosan ismert technikákkal aktiváltak [Methods in Enzymology 25, 494-499 (1972); Lapidot és mtsai: J. of Lipid Rés. 8, 142-145 (1967)] . Az aktivált zsírsavészterek közé tartoznak az általánosan használt acilező ágensek származékai, azaz például a hidroxibenztriazol (HOBT), N-hidroxi-szukcinimid és ennek származékai. Az előnyben részesített észter az N-szukcinimidil-palmitát.

Az oldható szakkifejezés azt jelenti, hogy elegendő mennyiségű észter van jelen a folyadék-fázisban, az inzulin-analóg acilezésére. Előnyösen 1 vagy 2 mólekvivalens aktív észter per mól analóg van jelen a folyadékfázisban .

A monomer inzulin-analóg vagy inzulin-analóg szakkifejezés a továbbiakban olyan, gyorsan ható inzulint jelent, amely kevésbé érzékeny a dimerizációra vagy az önmagával való asszociálódásra. A monomer inzulin-analóg humán inzulin, amelyben a B28-as pozícióban levő Pro-t Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá helyettesíti, és a B29-es pozícióban levő Lys lizin vagy prolin. A monomer inzulinanalógokat Chance és munkatársai írják le a 07/388,201 ···· ϊ

II számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben (EPO publikációs szám 383 472), valamint Brange és munkatársai a 214 826 EPO publikációs számú bejelentésükben. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a monomer inzulin-analóg egyéb módosításai is lehetségesek, és ezek széles körben elfogadottak. Az ilyen módosítások közé tartozik a BlO-es pozícióban levő hisztidin csoport helyettesítése aszparaginsavval; a Bl pozícióban levő fenilalanin csoport aszparaginsavval való helyettesítése; a B30-as pozícióban levő treonin csoport alaninnal való helyettesítése; a B9-es pozícióban levő szerin csoport aszparaginsavval való helyettesítése; a Bl pozícióban levő aminosav levágása, csak önmagában, vagy a B2-es pozícióban levő aminosav deléciójával együtt; és a B30-as pozícióban levő treonin deléciója.

A bázikus körülmények szakkifejezés jelentése a reakcióelegy lúgosságát jelenti. Ahhoz, hogy egy inzulinanalógot szelektíven acilezzünk az ε-aminocsoporton, ahhoz az kell, hogy a reakciót úgy kell lejátszatni, hogy lényegében minden szabad aminocsoport protonmentesítve van. Vizes oldatban vagy ko-szolvensben a lúgos körülmény azt jelenti, hogy a reakciót 9-esnél nagyobb pH-η hajtjuk végre. Egy szerves oldószerben a reakciót bázis jelenlétében hajtjuk végre, aminek a bázicitása vízben mért 10,75 pK_a értékkel ekvivalens, vagy annál nagyobb.

Az 1. számú szekvencia jelentése egy első szekvencia, amit a szekvencia listában mutatunk be, és a humán inzulin A-lánc analógját jelenti, az alábbi szekvenciával :

Xaa Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

10

Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

20 az 1. számú szekvencia (inzulin A-lánc) 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, vagy acilezett Gly, ha 2. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa Phe, a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, és a 2. számú szekvencia 29es pozíciójában levő Xaa jelentése Lys vagy Pro.

A 2. számú szekvencia szakkifejezés jelentése a szekvencia listában bemutatott második szekvencia, és a humán inzulin B-láncát jelenti, az alábbi szekvenciával: Xaa Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Alá

10

Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa
15		20	25
Xaa	Thr
	30

aholis a 2. számú szekvencia (inzulin Β-lánc) 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Phe, vagy acilezett Phe, ha az 1. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, és a 2.

számú szekvencia 29-es pozíciójában levő Xaa jelentése Lys vagy Pro;

Amint azt az előzőkben megjegyeztük, a jelen találmány tárgya egy, az 1. számú szekvenciának megfelelő képletű mono-acilezett inzulin-analóg, megfelelő keresztkötésekkel a 2. számú szekvenciához kapcsolva, vagy ennek egy gyógyászatilag elfogadható sója. Az 1. számú szekvencia (inzulin A-lánc) 1-es pozíciójában az előnyben részesített aminosav csoport a Gly. A 2. számú szekvencia (inzulin B-lánc) 1-es pozíciójában az előnyben részesített aminosav csoport a fenilalanin. A 2. számú szekvencia 28as pozíciójában előnyben részesített szekvencia az Asp, vagy az acilezett Lys, ha a 2. számú szekvencia 29-es pozíciójában az aminosav csoport a Pro. A 2. számú szekvencia 29-es pozíciójában levő, előnyben részesített amino• · · · • · · · · • · · · · • · · • · · · · · · sav csoport a Lys, vagy Pro, akkor, ha a 2. számú szekvencia 28-es pozíciójában levő aminosav csoport acilezett Lys. A szakterületen jártas szakember számára ismert standard biokémiai kifejezéssel élve az előnyben részesített analóg a Lys Pro -humán inzulin. A leginkább előnyben részesített inzulin-analógok egy C₃-C₁₈zsírsavval, előnyösen egy C₁₄-C₁₆ zsírsavval vannak monoacetilezve. Tehát az előnyben részesített zsírsavak közé tartozik az oktanoil (C8), a nonanoil (C9), a dekanoil (CIO), az undekanoil (Cll), a lauroil (C12), a tridekanoil (C13) , a mirisztoil (C14) , a pentadekanoil (C15), és a palmitoil zsírsav. Tehát a jelen találmány szerinti előnyben részesített vegyületek közé tartozik a

B29-N'-Asp -palmitoil humán inzulin (a B jelentése Asp;

jelentése acilezett Lys); a B28-N^e-palmitoil,28

Lys^B28Pro^B29-humán inzulin (B^° jelentése acilezett Lys; B ε B28 B2 9 jelentése Pro); B28-N -oktanoil-Lys Pro -humán inzulin,

B28-N^E-dekanoil-Lys^B28Pro^B29-humán inzulin,

B28-N B2 8 B2 9 ε mirisztoil-Lys Pro -humán inzulin, és a B28-N B28 B29 undekanoil-Lys Pro -humán inzulin.

A fehérjék, beleértve az inzulint is, szabad aminosav csoportjainak acilezése ismert a szakterületen. Az acilezés általános módszerei megtalálhatók a szakirodalomban [Methods in Enzymology 25, 494-499 (1972)] , és ide tartozik az aktivált észterek, a savhalogenidek vagy savanhidridek alkalmazása. A zsírsavak aktivált észterei• · ·· ··· · • · · · · • · · · · • · · nek, főleg az N-hidroxiszukcinimid-észtereknek a használata különösen előnyös eszköz egy szabad aminosav zsírsavval való acilezésére [Lapidot és mtsai: J.of Lipid Rés. 8, 142-145 (1967)] . Lapidot és munkatársai leírják az N-hidroxiszukcinimid észterek készítését, valamint alkalmazásukat az N-lauroil-glicin, az N-lauroil-L-szerin és az N-lauroil-L-glutaminsav készítésében.

Az ε-amino csoport szelektív acilezéséhez különböző védőcsoportok használhatók arra, hogy a kapcsolás során megvédjük az α-aminocsoportot. A megfelelő védőcsoport megválasztása a szakterületen jártas szakember számára ismert, ide tartozik például a p-metoxibenzoxikarbonil (pmZ) . Az ε-amino csoportot előnyösen egylépéses szintézisben acilezzük, amino-védőcsoportok használata nélkül. Az acilezést úgy hajtjuk végre, hogy az aktivált zsírsavésztert bázikus körülmények között a fehérje εamino csoportjával reagáltatjuk egy poláros oldószerben. A reakcióelegy bázicitásának elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy az inzulin-analóg összes szabad amino-csoport ját protonmentesítse. Gyenge lúgos körülmények között nem deprotonálódik az összes szabad aminocsoport, és főleg az N-terminális vagy az α-amino csoportok acileződnek. Egy vizes oldószerben vagy ko-szolvensben a bázikus körülmény azt jelenti, hogy a reakciót 9-nél magasabb pH-η hajtjuk végre. Mivel a fehérjebomlás pH=12,0-nál magasabb pH értéken játszódik le, ezért a reakcióelegy ··· pH-ja előnyösen 10,0-11,5 között van, legelőnyösebb, ha 10,5. Egy kevert szerves és vizes oldószerben a pH értéke a vizes oldószernek az összekeverés előtti pH-ja.

Nem-vizes oldószerben az ε-amino csoport szelektív acilezését bázis jelenlétében végezzük, aminek a bázicitása ekvivalens vízben 10,75-nek vagy többnek mért pKa-val, azért, hogy eléggé protonmentesítsük az ε-amino csoporto(ka)t. Azaz, a bázisnak legalább olyan erősnek kell lennie mint a trietilaminnak. Előnyösen a bázis lehet tetrametilguanidin, diizporopiletilamin, vagy tetrabutilammónium-hidroxid. Egy gyengébb bázis alkalmazása az ot-amino csoport acilezését eredményezi.

Az oldószer megválasztása nem kritikus, és nagymértékben az inzulin-analóg és zsírsavészter oldhatóságától függ. Az oldószer lehet teljesen szerves. Általánosan elfogadott szerves oldószer lehet a DMSO, a DMF és a hasonlók. A vizes oldatok valamint a vizes és szerves oldatok keveréke is használható. A poláros oldószerek megválasztását csak a reagensek odhatósága korlátozza. Előnyös oldószerek a következők: DMSO; DMF; acetonitril és víz; aceton és víz; etanol és víz; izopropil-alkohol és víz. Az oldószer előnyösen acetonitril és víz elegye, a legelőnyösebb az 50%-os acetonitril. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy más poláros oldószerek is használhatók.

Általában az az előnyös, ha az aktivált zsírsavészter van mólfölöslegben. A reakciót előnyösen az észter 117 ·· ·· ····· • · · · · · • · · · · • · · · • · · · · · ·

4-es mólfölöslegével hajtjuk végre, a legelőnyösebb az 12 mólekvivalens fölösleg. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy az aktivált észter nagy mennyiségének jelenlétében bisz- vagy tri-acilezett termék is keletkezik jelentős mennyiségben.

A reakcióelegy hőmérséklete nem kritikus. A reakciót 20-40 Celsius fok közötti hőmérsékleten hajtjuk végre, és általában 15 perc valamint 24 óra közötti időtartam alatt lejátszódik.

Acilezés után a terméket standard módszerekkel tisztítjuk, azaz például fordított fázisú kromatográfiával vagy hidrofób kromatográfiával. Ezután a terméket standard módszerekkel nyerjük ki, azaz például fagyasztva szárítással vagy kristályosítással.

A jelen találmány szerinti monomer inzulin-analóg a számos különböző ismert peptid-szintézis módszer valamelyikével előállítható, beleértve a klasszikus (oldatban végzett) módszereket, a szilárd fázisos módszereket, a félszintetikus módszereket és legújabban a rekombináns DNS módszereket . Például Chance és munkatársai, valamint

Brange és munkatársai leírják különböző inzulin-analógok készítését [Chance és mtsai: 07/388,201 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, EPO publikációs száma 383,472; Brange és mtsai: EPO 214,826] amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. A jelen találmány szerinti inzulin-analógok A és B láncát előállíthatjuk egy proinzulin-szerű prekurzor molekulán • · * * · · · • · ····· · • · · ·· keresztül, rekombináns DNS technikák alkalmazásával [Frank és mtsai: Peptides: Synthesis-Structure-Function; Proc. Seventh Am. Pept. Symp., szerk. : D. Rich és E. Gross (1981)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.

Az alábbi példákat csak a találmány illusztrálása céljából adjuk meg. A találmány oltalmi körét az alábbi példa nem korlátozza.

1. Példa

B2 8 B2 9

A Lys -Pro -humán inzulin acilezése N-szukcinimidilpalmitáttal acetonitrilben és vízben

2,22 g Lys Pro -humán inzulin kristályokat oldunk 100 ml, 50 mmol/1 koncentrációjú bórsav oldatban, pH=2,5nél. Az oldat pH-ját 10% sósav alkalmazásával újra beállítjuk, majd az oldatot addig kevertetjük, ameddig a kristályok a vizuális megfigyelés szerint teljesen feloldódnak. Az aktivált észter (N-szukcinimidil-palmitát) oldatát úgy állítjuk elő, hogy 270 mg szilárd aktivált észtert adunk 27 ml acetonitrilhez, amit körülbelül 50 °C-ra melegítettünk, majd erősen kevertetjük, ameddig vizuális megfigyelés alapján minden aktivált észter-részecske feloldódik. Az oldat pH-ját körülbelül 10,22-re állítjuk 10% nátrium-hidroxid hozzáadásával, majd az oldatot 15 percig kevertetjük 4 °C-on. A beállított pH-jú oldathoz 73 ml acetonitrilt adunk, majd hozzáadjuk az előzőleg elkészített aktivált észter oldatot. Hagyjuk, hogy a • · • · » · · · • ··· · · · · ·«·«···* ···· ♦ · · · reakció 85 percig folyjon 4 °C-on, majd 600 ml 1 mol/l ecetsavat adunk hozzá, aminek eredményeképpen a pH értéke

2,85 lesz. A számított kitermelést a kioltott reakcióelegyben úgy számítjuk ki, hogy a B28-N^E-palmitoil

Lys Pro -humán inzulin mennyiségét osztjuk a B28 β ⁰ 9

Lys Pro “ -humán inzulin kiindulási mennyiségével, ez az érték 72,5%.

2. Példa

Q 9 Q D 9 Q

C8(B28)Lys Pro -humán inzulin

2,0 g Lys(B28), Pro(B29) humán inzulin (KPB) kristályokat oldunk 200 ml 50 mmol/1 koncentrációjú bórsav pufferben (pH=2,5). Az oldat pH-ját újra beállítjuk 10% sósav alkalmazásával, majd az oldatot addig kevertetjük, ameddig a vizuális megfigyelés alapján a kristályok teljesen feloldódnak. Az aktivált észter (1-oktanoil-N-hidroxiszukcinimid-észter) oldatát úgy állítjuk elő, hogy 175 mg szilárd aktivált észtert adunk 25,62 ml acetonitrilhez, majd erősen kevertetjük, ameddig a vizuális megfigyelés szerint az oldatban levő összes aktivált részecske feloldódik. A KPB oldat pH-ját 10%-os nátriumhidroxid hozzáadásával 10,4-re állítjuk, majd az oldatot 5 percig hagyjuk szobahőmérsékleten kevertetni. 176 ml acetonitril oldatot adunk a beállított pH-jú KPB oldathoz, majd hozzáadjuk az előzőleg elkészített aktivált észter oldatot. A reakciót 90 percig hagyjuk lejátszódni szobahőmérsékleten, majd 5,5 ml 10%-os sósav (2,75 • · · · • · · · · • · · · · · · térf/térf%) és három térfogat (1200 ml) hideg desztillált víz hozzáadásával állítjuk le, az így kapott oldat végső pH-ja 2,70. A reakció kitermelése, a leállított reakcióelegyben levő LysB29(C9)KPB mennyisége alapján, osztva a kiindulási BHI mennyiségével, számítva 75,5%. Ezt az oldatot két 800 ml-es alikvot részre osztjuk, hidrofób kromatográfiával (SP20SS) való tisztítás céljából. Az oszlopkromatográfiát ultraszűrés és liofilezés követi.

Amint az előzőkben megjegyeztük, a jelen találmány szerinti acilezett inzulin-analógok hatékonyan kezelik a hiperglikémiát, a kezelésre szoruló betegnek hatékony mennyiséget adva be egy mono-acilezett inzulin-analógból. A továbbiakban a hatékony mennyiség szakkifejezés jelentése egy vagy több, jelen találmány szerinti acilezett inzulin-analóg, amivel a vércukorszintet csökkenteni lehet, akár terápiásán, akár profilaktikusan. Ez a mennyiség általában 10 vagy több egység per nap (vagy körülbelül 0,3-3 mg, körülbelül 29 egységet feltételezve miligrammonként). Azt azonban meg kell jegyeznünk, hogy az éppen beadott acilezett analóg(ok) mennyiségét egy kezelőorvosnak kell meghatározni, a releváns körülmények fényében, beleértve a kezelendő állapotot (azaz a hiperglikémia okát) , az éppen beadott analógot, a beadás választott parenterális útját, az adott beteg korát, súlyát és reagálását, valamint a beteg tüneteinek súlyosságát. Ennek következtében a fenti dózistartományo• ♦ · kát nem azzal a céllal adtuk meg, hogy korlátozzuk a találmány oltalmi körét.

A találmány szerinti acilezett inzulin-analógokat a kezelésre szoruló betegnek (azaz a hiperglikémiában szenvedő betegnek) gyógyászati készítményekben adjuk be, amik legalább egy mono-acilezett inzulin-analóg hatékony mennyiségét tartalmazzák egy vagy több gyógyászatilag elfogadható töltőanyaggal vagy hordozóval kombinálva. Ezekre a célokra a gyógyászati készítmények tipikusan úgy szerelhetők ki, hogy körülbelül 100 egység per ml-t, vagy hasonló koncentrációkat tartalmazzanak, az inzulin-analóg (ok) ból hatékony mennyiséget tartalmazva. Ezek a készítmények általában, de nem szükségszerűen parenterális természetűek, és számos különböző technikával előállíthatok, a parenterális termékek előállításánál jól ismert szokványos töltőanyagokat vagy hordozókat alkalmazva th [ Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17 Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A parenterális beadáshoz készített dózisformákat például úgy állíthatjuk elő, hogy legalább egy mono-acilezett inzulin-analógból kívánt mennyiséget oldunk egy injekciózásra alkalmas, nem-toxikus folyékony hordozóban, azaz például vizes közegben, majd sterilezzük a szuszpenziót vagy az oldatot. Egy másik módszer szerint a vegyület mért mennyiségét tehetjük egy ampullába, majd az ampullát és tartalmát sterilezzük és lezárjuk. A beadás előtti keverés céljából kísérő ampullát vagy hordozót is adhatunk hozzá. A parenterális beadáshoz adaptált gyógyászati készítményekben higítószerek, töltőanyagok és hordozók lehetnek, azaz például víz és vízzel elegyedő szerves oldószerek, azaz például glicerin, szezámolaj, földimogyoróolaj, vizes propilénglikol, N,N-dimetilformamid és hasonlók. Ilyen gyógyászati készítmények lehetnek például a mono-acilezett inzulin-analóg steril, izotóniás, vizes sóoldata, amit gyógyászatilag elfogadható pufferrel pufferelni lehet, és pirogénmentesek. Emellett a parenterális gyógyászati készítmény tartalmazhat konzerválószereket, azaz például meta-krezolt vagy egyéb ágenseket a végtermék pH-jának beállítása céljából, azaz például nátrium-hidroxidot vagy sósavat.

A jelen találmány szerinti acilezett inzulin-analógok keverék formájában is kiszerelhetők. A keverék készítmények tartalmaznak acilezetlen inzulint vagy inzulin-analógot, és egy acilezett inzulin-analógot. Az inzulin-inzulin-analógnak az acilezett inzulin-analóghoz viszonyított aránya 1:99 és 99:1 között változhat, a súlyok alapján. Az arány előnyösen 75:25 és 25:75 között változik, előnyösebben 40:60 és 60:40 között, és legelőnyösebben 50:50 az arány. A keverék készítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy a kívánt térfogatú komponenseket standard kiszerelési higítószerben keverjük össze. A standard higítószerek közé tartozik például egy izotóniás ágens, a cink, a fiziológiásán elfogadható puffer és egy • · • ··· »···· ·······«· ···· · ♦ · · · · konzerválószer. A fiziológiásán elfogadható puffer előnyösen egy foszfátpuffér, mint például a dihidrogén-nátriumfoszfát. Egyéb fiziológiásán elfogadható puffer lehet például a TRIS vagy a nátrium-acetát. A puffer kiválasztása és koncentrációja jól ismert a szakterületen. A gyógyászatilag elfogadható konzerválószerek közé tartozik például a fenol, a m-krezol, a rezorcin, és a metil-paraben. A jelen találmány szerinti keverék készítmények különösen előnyösek, mivel mind a viszonylag gyorsan ható inzulin vagy inzulin-analóg és a mono-acilezett inzulinanalóg oldódik ebben a kiszerelési formában. Tehát megjósolható hatásprofillal rendelkeznek.

Az alábbi kiszerelési példa csak illusztratív, és nem szándékunk, hogy ezzel korlátozzuk a találmány oltalmi körét.

1. kiszerelési forma

Egy parenterális készítményt az alábbiak szerint állíthatunk elő:

Mennyiség

Fenol 30 mmol/1

Glicerin 16 mg/ml

Q?Q Ο O Q

Acilezett Lys Pro -humán inzulin 100 E

Cink 0,7% nátrium-acetát 3, 8 mg/ml • · · ·

A fenti adalékanyagok oldatát injekció formájában adjuk be egy kezelésre szoruló betegnek.

A jelen találmány szerinti vegyületek hatékonyε B28 B2 9 ságának igazolására a B28-N -palmitoil Lys Pro -humán inzulint vizsgáljuk éber kutya modellben. A kísérleteket éjszakán át éheztetett, éber, felnőtt (1-2 éves) hím és nőstény Beagle kutyákkal végezzük, súlyuk 8-15 kg. A vizsgálat előtt legalább tíz nappal az állatokat izofluránnal érzéstelenítjük, és a bal- vagy jobb lágyékban egy vágást teszünk. Szilikon katétereket teszünk a femorális artériában valamint a proximális kaudális femorális vénában, és 4-0 selyemöltéssel rögzítjük. A katéterek szabad végeit a bőr alatt a hátra vezetjük ki, trokár tű alkalmazásával. A katétereket azután glicerin/heparin oldattal (3:1 térf/térf; a végső heparin koncentráció 250 KlU/ml) töltjük fel, majd a szabad végeket lezárjuk és egy bőr alatti zsebbe tesszük, majd hagyjuk, hogy a bőr teljesen bezáródjon. Reflexet adunk be mind az operáció előtt (20 mg/kg intravénásán és 20 mg/kg intramuszkulárisan) , mind az operáció után (250 mg per os, naponta egyszer hét napig), a fertőzés megelőzésére. Torbugesicet (1,5 mg/kg intramuszkulárisan) adunk be az operáció után a fájdalom csökkentésére.

Közvetlenül a vizsgálat előtt vért veszünk, hogy meghatározzuk az állat egészségi állapotát. Csak a 38% fölötti hematokrit értékű és 16000/mm³ alatti leukocita számú állatokat használunk. A kísérlet előtti délután a ···· · ·· ·· katéterek szabad végeit kivesszük a bőr alatti zsebből, helyi érzéstelenítéssel (2% lidokain) kis vágást téve a bőrön, majd a kutyákat egy póráz-kabáttal és gallérral látjuk el.

A kísérlet reggelén az artériás katéter tartalmát leszívjuk (ezekben a vizsgálatokban csak az artériás vonalat használjuk), a katétert sóoldattal öblítjük, majd egy hosszabbítást (rozsdamentes acél csővel védve) csatolunk a katéterhez. A kutyát metabolikus ketrecbe tesszük, majd a katéter hosszabbítást és a cső borítást egy csuklós könyök rendszerhez kapcsoljuk, ami lehetővé teszi, hogy a kutya szabadon mozogjon a ketrecben. 15 perces pihenési periódus után (45 perc, kontrollok), 23,5 ml vért veszünk a plazma glükóztartalmának meghatározása céljából. Egy második, alapérték mintát veszünk 15 perccel később (0 időpont) . A tesztanyagot (foszfáttal puffereit sóoldat vagy 10,6 mmol/kg B28-N^E-palmitoil Lys Pro -humán inzulin; ez 1,75 E/kg humán inzulin mólekvivalense) a nyak dorzális részébe adjuk be szubkután .

(2-3,5 ml) veszünk (kontrollok) vagy hat inzulin) órában. A zó vákuumos vérvételi

Ezután artériás vérmintákat minden 30 percben a következő két (B2 8-N^t-palmitoil Lys^B28Pro^B29-humán mintákat EDTA-dinátrium sót tartalma csövekbe vesszük, majd azonnal jégre tesszük. A mintákat centrifugáljuk, majd a kapott plazmát polipropilén teszt• 9 ·· ····· · ···· ·· ·· « ··· · · · · · *«···«··· ······ · · ·· csövekbe tesszük és jégen vagy hűtve tároljuk a vizsgálat időtartama alatt.

A kísérlet kiértékelésekor az állatot elaltatjuk (izoflurán); a katétert friss sóoldattal átöblítjük, majd glicerin/heparin eleggyel feltöltjük; a katéter szabad végét lezárjuk, majd az előzőkben ismertetett módon bőr alá helyezzük; majd antibiotikumot adunk be az állatnak (300 mg Reflex, intramuszkulárisan). A plazma glükóz-koncentrációját a vizsgálat napján meghatározzuk, glükózoxidáz módszert alkalmalmazva egy Beckman glükóz-elemző berendezésben. Az értékeket átlag ± standard hiba formában adjuk meg.

A plazma glükóz-koncentrációja a foszfáttal puffereit sóoldat injekciózását követő kétórás megfigyelési periódusban nem tér el jelentősen az alapvonaltól (1. táblázat) . Ugyanazon időtartam alatt a B28-N^E-palmitoil Lys Pro -humán inzulin szubkután beadasa 15%-os (17 mg/dm³ csökkenést okoz a plazma glükóz-koncentrációjában.

A B28-N'-palmitoil Lys Pro -humán inzulinnal kezelt állatokban a plazma glükóz-koncentrációja fokozatosan csökken a következő négy órában, 41 mg/dm³ glükózszintre esve az alapvonal alá (35%-os csökkenés), az injekciózás után hat órával.

A szakirodalomban leírták, hogy normális kutyákban a plazma glükóz-koncentrációja nem esik jelentősen, még egyhetes éheztetés után sem. Az ebben a vizsgálatban megfigyelt glükóz-koncentráció csökkenés a B28-N^s-palmitoil ··· »*ι» I ·· • · · « • · » · · • ···« · · • · ··

Β2 8 Β2 9

Lys Pro -humán inzulin adagolasanak tulajdonítható, ezzel igazolva ennek a vegyületnek az inzulin-szerű aktivitását.

1. Táblázat

Plazma glükóz-koncentrációk foszfáttal puffereit sóoldat ε B2 8 B2 9 (kontrollok) vagy B28-N-palmitoil Lys Pro -humán inzu-

lin	szubkután injekciózását	követően
Idő (perc) -15	Kontroll (n=5) (mg/dm³) 114 ± 3	B28-N^E-palmitoil _τ B28- B29 , Lys Pro -humán inzulin (n=l) (mg/dm³) 115
0	112 ± 3	116
30	117 ± 4	114
60	114 ± 3	107
90	115 ± 3	102
120	117 ± 5	99
150		101
180		100
210		100
240		98
270		87
300		82
330		79
360		75

···« «« · · • · · · «··· · • · · ··«· * · ···· · * · · ··

Az alábbiakban ismertetjük a leírásban szereplő szekvenciákat.

A SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) BENYÚJTÓ: Baker és munkatársai (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Acilezett inzulin-analógok (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 2 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: Eli Lilly and Company Patent

(B)	UTCA:	Division/SPC Lilly Corporate Center
(C)	VÁROS:	Indianapolis
(D)	ÁLLAM:	IN
(E)	ORSZÁG	: USA

(v) SZÁMÍTÓGÉPES FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: FLOPPY LEMEZ (B) SZÁMÍTÓGÉP: Macintosh (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: Macintosh (D) PROGRAM: Microsoft Word (vi) A JELENLEGI BENYÚJTÁS ADATAI:

(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA:

(B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA:

(C) OSZTÁLYOZÁS:

(vii) A KORÁBBI BENYÚJTÁS ADATAI:

(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA:

(B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA:

(VIII) ÜGYVIVŐ/ÜGYNÖK INFORMÁCIÓ:

(A) NÉV: Steven P. Caltrider (B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 36467 (C) REFERENCIA/LAJSTROMSZÁM: X9720 (IX) TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:

(A) TELEFON: (317) 276-0757 (B) TELEFAX: (317) 277-1917 (C) TELEX:

1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: polipeptid (ix) Tulajdonság:

(A) Név/kulcs: variábilis hely (B) Lokalizáció: 1 (C) Azonosítási módszer:

(D) Egyéb információ: az 1. számú szekvencia 1es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, vagy acilezett Gly, ha 2. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa Phe, a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, és a 2. számú szekvencia 29-es pozíciójában levő Xaa jelentése Lys vagy

Pro.

(xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia

Xaa Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 30 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: polipeptid (ix) Tulajdonság:

(D) Egyéb információ: a 2. számú szekvencia 1es pozíciójában levő Xaa jelentése Phe, vagy acilezett Phe, ha az 1. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, és a 2 . számú szekvencia 29-es pozíciójában levő Xaa jelentése

Lys vagy Pro.

(ix) Tulajdonság:

(A) Név/kulcs: variábilis hely (B) Lokalizáció: 28 (C) Azonosítási módszer:

• · · · · · • · (D) Egyéb információ: a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val, Alá; vagy acilezett Lys, ha az 1. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, a 2. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Phe, és a 2. számú szekvencia 29-es pozíciójában levő Xaa jelentése

Pro (ix) Tulajdonság:

(A)	Név/kulcs: variábilis hely
(B)	Lokalizáció: 29
(C)	Azonosítási módszer:
(D)	Egyéb információ: a 2.	számú	szekvencia
29-es pozíciójában levő Xaa jelentése	Lys,	Pro; vagy
acilezett Lys	, ha a 2. számú szekvencia 28	-as pozí-

dójában levő Xaa jelentése Asp, Lys, Leu, Val vagy Alá, az 1. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Gly, és a 2. számú szekvencia 1-es pozíciójában levő Xaa jelentése Phe.

(xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia

Xaa Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Alá

10

Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Az 1. számú szekvenciának megfelelő képletű mono-acilezett inzulin-analóg, helyes keresztkötéssel a
2. számú szekvenciához kapcsolva, vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható sója.

2. Az 1. igénypont szerinti mono-acilezett inzulin-analóg, amelyben a 2. számú szekvencia 28-as pozíciójában levő Xaa acilezett Lys és a 2. számú szekvencia 29-es pozíciójában levő Xaa Pro.
3. A 2. igénypont szerinti mono-acilezett inzulinanalóg, amelyben az acilező csoport egy C-6 C₁₇ zsírsav.
4. A 2. igénypont szerinti mono-acilezett inzulinanalóg, amelyben az acilező csoport egy C13 C₁₇ zsírsav.
5. B28-N^E-palmitoil-Lys^B28Pro^B29-humán inzulin.

ε B2 8 B2 9
6. B28-N -mirisztoil-Lys Pro -humán inzulin.
7. Parenterális gyógyászati készítmény, amely az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti mono-acilezett inzulin-analógot tartalmaz, egy vagy több gyógyászatilag elfogadható konzerválószerrel, izotonicitási ágenssel vagy pufferrel.
8. Parenterális gyógyászati készítmény, amely egy inzulin vagy inzulin-analóg és egy, az 17. igénypontok bármelyike szerinti mono-acilezett inzulin-analógot tartalmaz, és amelyben a komponensek aránya 1-99 illetve 991 között változhat.
9. A 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ' B2 8 B2 9 ε amely a Lys Pro -humán inzulin és a B28-N -acilezettLys Pro -humán inzulin keverékét tartalmazza.
10. Eljárás hiperglikémiában szenvedő beteg kezelésére, azzal jellemezve, hogy az említett betegnek az 17. igénypontok bármelyike szerinti mono-acilezett inzulin-analógokból hatásos mennyiséget tartalmazó gyógyászati készítményt adunk be.
11. Eljárás egy parenterális gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy összekeverjük az 17. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet, egy izotonicitási ágenst és egy fiziológiásán tolerálható puffért.
12. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoacilezett inzulin-analóg, amit diabétesz mellitusz kezelésére lehet használni.
13. Lényegében ez előzőkben ismertetetteknek megfelelő mono-acilezett inzulin-analóg, bármelyik példát referenciának tekintve.