MXPA05007628A - Derivados de polimeros que tienen arreglos de atomos particulares. - Google Patents

Derivados de polimeros que tienen arreglos de atomos particulares.

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Abstract

La presente invencion se refiere a reactivos polimericos, comprendidos de una porcion de atomos arreglados en un orden especifico, en donde la porcion esta posicionada entre un polimero soluble en agua y un grupo reactivo. Los reactivos polimericos son utiles entre otras cosas, para formar conjugados de agentes activos de polimeros. Tambien se proporcionan metodos, composiciones, preparaciones y asi sucesivamente, relacionados.

Description

DERIVADOS DE POLÍMEROS QÜE TIENEN ARREGLOS DE ÁTOMOS PARTICULARES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere de manera general, a nuevos reactivos poliméricos que comprenden una orientación estructural interna particular, así como también a conjugados de estos nuevos reactivos poliméricos. Además, la invención se refiere a métodos para sintetizar los reactivos y métodos poliméricos para conjugar los reactivos de polímero a agentes activos y otras sustancias. Sin embargo, la invención también se refiere a preparaciones farmacéuticas así como también a métodos para administrar los conjugados a pacientes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Científicos y clínicos encaran un número de retos en sus intentos por desarrollar agentes activos en formas adecuadas para suministro a un paciente. Agentes activos que son polipéptidos , por ejemplo, son a menudo suministrados vía inyección preferentemente que por ruta oral. En esta forma, el polipéptido es introducido en la circulación sistémica sin exposición al ambiente proteolítico del estómago. La inyección de polipéptidos, sin embargo, tiene varias desventajas. Por ejemplo, muchos polipéptidos tienen una vida media relativamente corta, con ello, necesitan inyecciones repetidas las cuales a menudo son inconvenientes y dolorosas. Sin embargo, algunos polipéptidos pueden provocar una o más respuestas inmunes con la consecuencia que el sistema inmune del paciente pude ser activado para degradar el polipéptido. De este modo, el suministro de agentes activos tales como polipéptidos son a menudo problemáticos cuando estos agentes son administrados por inyección. Se han logrado algunos éxitos dirigiendo los problemas de suministro de agentes activos vía inyección. Por ejemplo, conjugar el agente activo a un polímero soluble en agua ha resultado en conjugados de agentes activos de polímeros que tienen inmunogenidad y antigenidad reducida. Además, estos conjugados de agentes activos de polímeros a menudo tienen vidas medias mayormente incrementadas comparadas con sus contrapartes no conjugadas, como un resultado de la separación disminuida a través del riñon y/o la degradación enzimática disminuida en la circulación sistémica. Como un resultado de tener vida media mayor, el conjugado de agente activo de polímero requiere menos dosificación frecuente, lo cual en cambio, reduce el número total de inyecciones dolorosas e inconvenientes visitas a un profesional al cuidado de la salud. Sin embargo, agentes activos que son solamente marginalmente solubles, a menudo demuestran un incremento significante en la solubilidad del agua cuando se conjugan a un polímero soluble en agua. Debido a su seguridad documentada, así como también a su aprobación por la FDA para uso tanto tópico como interno, el polietilenglicol ha sido conjugado a agentes activos. Cuando un agente activo es conjugado a un polímero de polietilen glicol o WPEG" , el agente activo conjugado es convenientemente referido por haber sido "PEGilado" . El éxito comercial de agentes activos PEGilados tales como alfa-2a interferona PEGilada PEGASYS® (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) , alfa-2b interferona PEGilada PEG-INTRON® (Schering Corp., Kennilworth, NJ) , y PEG-filgrastim NEULASTA™ (Amgen Inc . , Thousand Oaks , CA) , demuestran que la administración de una forma conjugada de un agente activo puede tener ventajas significantes sobre la contraparte no conjugada. Moléculas pequeñas tales como distearoilfosfatidiletanolamina (Zalipsky (1993) Bioconjug. Chem. 4(4) :296-299) y fluorouracilo (Ouchi et al. (1992) Drug Des. Discov. 9_(1) : 93-105) conjugada a poli (etilenglicol) también ha sido preparada. Harris efe al. ha proporcionado una revisión de los efectos de PEGilación en farmacéuticos. Harris et al. (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2(3): 214-221. Debido a estos sucesos, la conjugación de un polímero soluble en agua a un agente activo permanece sin cambio. Uno de tales cambios es la desactivación del agente activo después de la unión a una molécula de polietilenglicol relativamente larga. Aunque una molécula de polietilenglicol relativamente larga podrxa proporcionar el conjugado de polímero-agente activo correspondiente con mayor solubilidad al agua, conjugados que portan tales porciones de polietilen glicol largas han sido conocidos por ser substancialmente inactivos in vivo. Se ha hipotetizado que estos conjugados son inactivos debido a la longitud de la cadena de polietilenglicol relativamente larga, la cual efectivamente se "enrolla" la misma alrededor del agente activo completo, bloqueando con ello el acceso a ligandos potenciales requeridos para actividad. Se ha resuelto el problema asociado con conjugados inactivos que portan una porción de polietilenglicol relativamente grande, en parte, usando formas "ramificadas" de un polímero. Un ejemplo de tal polímero "ramificado" se describe en la Patente Estadounidense No. 5,932,462 por Harris et al. Como se describe ahí, "m-PEG2-N-hidroxisuccinimida" puede estar unida a un grupo amino accesible (por ejemplo, un grupo amino que no está físicamente bloqueado debido a la estructura conformacional) en una proteína biológicamente activa. Este polímero ramificado (que tiene un peso molecular de aproximadamente 40,000 Daltons) está disponible de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) y tiene la siguiente estructura: en donde mPEG2ok representa un derivado de polietilen glicol de extremo tapado metoxi que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Daltons. El acoplamiento de este polímero ramificado a alfa-2a interferona resulta en un conjugado que contiene un enlace amida enlazante a la alfa-2a interferona al polímero. Esquemáticamente, el conjugado puede ser representado como sigue: interferona Este conjugado, comercialmente disponible como la marca PEGASYS® de alfa-2a interferona PEGilada (Hoffman-La Roche, Nutley, NJ) , está indicado para el tratamiento de hepatitis C en adultos . Aunque utilizar un polímero ramificado puede resolver algunos problemas asociados con polímeros lineales relativamente grandes, persisten otros cambios para preparar conjugados útiles. Por ejemplo, la velocidad in vivo de degradación del conjugado es a menudo inaceptable ya sea también larga o también corta. Específ camente, la velocidad de degradación in vivo es de manera general (aunque no necesariamente) , parcialmente gobernada por la velocidad de hidrólisis que se origina en el mismo punto en las series de átomos que enlazan el agente activo al polímero. De este modo, una velocidad hidrolítica relativamente rápida puede resultar en un conjugado inaceptable que tiene también corta la vida media in vivo, mientras la hidrólisis relativamente lenta puede resultar en un conjugado inaceptable que también tiene larga la vida media in vivo. Consecuentemente, polímeros que tienen una serie única de átomos (tanto en el polímero mismos, así como también en el conjugado correspondiente) , pueden resultar en velocidades únicas de hidrólisis, las cuales en cambio, influencian la velocidad in vivo de degradación del conjugado. La Hidrólisis de conjugados de ciertos agentes activos y m-PEG2-N-hidroxisuccinimida ocurre en la cadena de átomos que conecta un mPEG "ramificado" con otro, dado que uno de los metabolitos tiene un peso molecular de aproximadamente veinte mil Daltons. Una ubicación probable en la cadena de átomos para tal desdoblamiento está dentro o H de la porción -o-c—N— ubicada inmediatamente adyacente a una o H de las porciones mPEG en el polímero. La porción -o-c—N— representa la ubicación más probable para el desdoblamiento debido a que solamente otros átomos en la cadena que conecta a un mPEG ramificado al otro, son una serie de átomos de carbono comprendido de grupos metileno, los cuales son relativamente más estables a degradación in vivo o H que la porción -o-c—N— - Después del desdoblamiento, la forma separada del polímero es mPEG-OH. De este modo, basado en al menos parte del favoritismo para formar mPEG-OH, resulta una única velocidad de hidrólisis. Podrá ser deseable, sin embargo, ser capaz de proporcionar polímeros de manera tal que sus velocidades de hidrólisis podrían ser "habituadas". Por ejemplo, con respecto a la administración semanal típica de alfa-2a interferona PEGilada, una velocidad más lenta de hidrólisis podría proporcionarse aún por periodos prolongados entre administraciones. Además, conjugados que tienen también prolongada la vida media in vivo, podrán ser mejorados incrementando la susceptibilidad de los conjugados a hidrólisis . Una paleta expandida de polímeros que tienen velocidades de hidrólisis únicas podrá permitir a investigadores y científicos, proporcionar conjugados de polímeros-agentes activos "habituales", para proporcionar (entre otras cosas) , el incremento deseado en solubilidad en agua y/o velocidad de degradación in vivo. Sin embargo, polímeros que tienen velocidades de hidrólisis únicas podrán ser usados no solamente para polímeros ramificados, sino para otras formas (por ejemplo, lineal o multiramas) , también. De este modo, existe una necesidad de polímeros que proporcionen (entre otras cosas) , una serie única de átomos para proporcionar velocidades de degradación "habituales". Al mejor conocimiento de los solicitante, los polímeros, conjugados, preparaciones, y métodos actualmente descritos, son nuevos y completamente no sugeridos por la técnica. Por consiguiente, es un objeto primario de esta invención, proporcionar un reactivo polimérico que comprende la siguiente estructura: R10 Polímero soluble en agua--\\-N—C-N\—Z Fórmula (I) en donde: el "polímero soluble en agua" es un polímero soluble en agua, cada "-\\-" representa independientemente un enlace covalente directo o una porción espadadora; R1 es H o un radical orgánico; y Z es un grupo reactivo. Como se representa en la Fórmula (I) , el polímero soluble en agua está próximo al átomo de nitrógeno R1 o de la porción -r!i-c- y el grupo reactivo, Z. está próximo R1 o al átomo de carbono carbonilo de la porción -N-C- . Aunque R1 o reactivos poliméricos que portan una porción -???-c- están abarcados por la presente invención, se prefiere tener un átomo de oxígeno adyacente al átomo de carbono carbonilo R o R1 o del -I!I-C- , con ello, resultando en una porción -N-C-O-a menudo referida como un grupo "carbamato" o "uretano" .
Otros grupos funcionales pueden también estar presentes dentro del reactivo polimérico. Es otro objeto de la invención, proporcionar tal reactivo polimérico en donde R1 es H. Es todavía otro objeto de la invención proporcionar tal reactivo polimérico, en donde un átomo de azufre está unido al átomo de carbono carbonilo de la R o porción -|!i-c- , con ello, resultando en una R1 o porción _j_{LS- . Es todavía otro objeto de la invención proporcionar tal reactivo polimérico, en donde una porción -N(R2)- está unida al átomo de carbono carbonilo de la 0 R1 o R2 porción -N-C- , con ello proporcionando una porción _N-C— N-en donde R2 es H o un radical orgánico. Es todavía otro objeto de la invención proporcionar un reactivo polimérico, en donde el polímero soluble en agua es un poli (óxido de alquileno) .
Es un objeto adicional de la invención, proporcionar un método para preparar los reactivos poliméricos descritos anteriormente, en donde el método comprende las etapas de (i) proporcionar una molécula precursora comprendida de un grupo reactivo protegido o un precursor a un grupo reactivo y uno o más grupos hidroxilo; (ii) activar al menos uno de uno o más grupos hidroxilo de la molécula precursora por reacción con un grupo amino para formar una molécula precursora activada; (iii) poner en contacto bajo condiciones de acoplamiento covalente, al menos uno de uno o más grupos hidroxilo activados con un polímero soluble en agua que tiene un grupo amino, con ello formando un polímero comprendido de una porción de polímero soluble en agua y el grupo reactivo protegido o el precursor a un grupo reactivo; y (iv) desproteger el grupo reactivo protegido cuando está presente. Es todavía un objeto adicional de la invención, proporcionar un conjugado de polímero que comprende un polímero soluble , y un agente farmacológicamente activo, en donde: (i) el polímero soluble en agua está ligado al átomo de nitrógeno de la R o porción -Ñ-c- a través de ya sea un enlace covalente directo o a través de una primera porción espaciadora; (ii) el agente farmacológicamente activo está ligado al átomo de R1 o carbono carbonilo de la porción -N-C- a través de ya sea un enlace covalente directo o una segunda porción espadadora; y (iii) R1 es H o un radical orgánico. Es un objeto adicional de la invención, proporcionar un método para preparar un conjugado que comprende la etapa de poner en contacto un reactivo polimérico como se proporciona en este documento, con un agente activo bajo condiciones adecuadas para con ello formar el conjugado. Típicamente, el agente activo se une covalentemente al polímero vía reacción entre un grupo reactivo en el reactivo polimérico con un grupo funcional (por ejemplo, una amina) , en el agente activo. Es todavía un objeto adicional de la invención, proporcionar una preparación farmacéutica que comprende el conjugado de polímero agente activo como se proporciona en este documento en combinación con un excipiente armacéutico. Es un objeto adicional, proporcionar un método para suministrar un agente farmacológicamente activo que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de polímero agente activo como se proporciona en este documento. Objetos adicionales, ventajas y nuevas características de la invención serán expuestos en la descripción que sigue, y en parte, llegarán a ser aparentes para aquellos expertos en la técnica después de lo siguiente, o pueden ser comprendidos por la práctica de la invención. En una modalidad entonces, se proporciona un R1 o reactivo polimérico que comprende una porción -Ñ-c-posicionada entre un polímero soluble en agua y un grupo reactivo. El arreglo estructural : interno es tal que (i) el nitrógeno en la porción -N-C- está próximo al polímero soluble en aqua, (ii) el átomo de carbono carbonilo de la R1 o porción -Ñ-c- está próximo al grupo reactivo, y (iii) R1 es H o un radical orgánico, en donde el radical orgánico es típicamente seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Los reactivos poliméricos de la invención también R1 o comprenden un polímero soluble en agua, una porción -N-C-y un grupo reactivo, en donde: (i) el polímero soluble en R o agua está ligado al átomo de nitrógeno de la porción -Ñ-c-a través de ya sea un enlace covalente directo o a través de una primera porción espaciadora; (ii) el grupo reactivo R o está ligado al átomo de carbono carbonilo de la porción -Ñ-c-a través de ya sea un enlace covalente directo o una segunda porción espaciadora; y (iii) R1 es como se define previamente . Para los reactivos poliméricos de la presente invención, cualquier polímero soluble en agua puede servir como el polímero soluble en agua en el reactivo polimérico y la invención no está limitada en este sentido. Polímeros preferidos, sin embargo, son de extremo tapado en un término. Además, polímeros que tienen un peso molecular promedio de masa de menos de aproximadamente 120,000 Daltons son preferidos . En otra modalidad, se proporciona un método para preparar los reactivos poliméricos de la invención. Brevemente, el método involucra proporcionar una molécula precursora comprendida de un grupo reactivo protegido o un precursor a un grupo reactivo y uno o más grupos hidroxilo . Al menos uno de uno o más grupos hidroxilo de la molécula precursora es activado (con ello formando una molécula precursora activada) , de manera tal que al menos uno de uno o más grupos hidroxilo reaccionará con un grupo amino. Posteriormente, la molécula precursora activada es colocada bajo condiciones de acoplamiento covalente y se deja contactar un polímero soluble en agua que tiene un grupo amino, permitiendo con ello a los dos reaccionar químicamente. La reacción que sobreviene resulta en la formación de un enlace covalente entre el polímero soluble en agua y la molécula precursora activada, la cual en cambio, forma un polímero comprendido de una porción de polímero soluble en agua y el grupo o precursor reactivo protegido a un grupo reactivo.
Típicamente, este polímero puede además, hacerse reaccionar con varios reactivos para funcionalizar el polímero con, por ejemplo, un grupo reactivo deseado. Cuando la molécula precursora comprende un grupo reactivo protegido, el método ventajosamente incluye una etapa de desprotección para remover el grupo protector al grupo reactivo. Opcionalmente, se forma una etapa para aislar el polímero, de manera que el polímero puede ser proporcionado en una forma más pura. En todavía otra modalidad de la invención, se comprende un polímero soluble y un agente activo, en donde: (i) el polímero soluble en agua está ligado al átomo de nitrógeno de la porción a través de ya sea un enlace covalente directo o a través de una primera porción espaciadora; (ii) el agente farmacológicamente activo está R1 o ligado al carbono carbonilo de la porción -Ñ-c- a través de ya sea un enlace covalente directo o una segunda porción espaciadora; y (iii) R1 es H o un radical orgánico. Ventajosamente, cualquier agente activo que puede ser acoplado a los reactivos poliméricos proporcionados en este documento, pueden ser usados y la invención no está limitada con respecto a los agentes activos específicos usados . En todavía otra modalidad de la invención, se proporciona un método para preparar un conjugado que comprende la etapa de poner en contacto un reactivo polimérico, proporcionado en este documento, con un agente activo bajo condiciones adecuadas para proporcionar un conjugado . En todavía otra modalidad de la invención, se proporcionan preparaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado de la invención en combinación con un excipiente farmacéutico. Las preparaciones farmacéuticas abarcan todos los tipos de formulaciones y en particular, aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos que pueden ser reconstituidos así como también suspensiones y soluciones . En una modalidad adicional de la invención, se proporciona un método para administrar un conjugado que comprende la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado proporcionado en este documento. Típicamente, aunque no necesariamente, el conjugado se proporciona como parte de una preparación farmacéutica. Puede ser usado cualquier procedimiento para administrar el conjugado y la invención no está limitada en este sentido. Se prefiere sin embargo, que el conjugado se administre vía inyección .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la presente invención en detalle, se entiende que esta invención no está limitada a los polímeros particulares, técnicas sintéticas, agentes activos y similares, como tales pueden variar. Se debe notar que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo indique de otro modo. De este modo, por ejemplo, referencia a un "polímero" incluye un polímero único, así como también dos o más de los mismos o diferentes polímeros, referencia a un "conjugado" se refiere a un conjugado único, asi como también dos o más de los mismos o diferentes conjugados, referencia a un "excipiente" incluye un excipiente único así como también dos o más de los mismos o diferentes excipientes y similares. Describiendo y reivindicando la presente invención, la terminología será usada de conformidad con las definiciones descritas abajo. "PEG" , "polietilenglicol" y "poli (etilen glicol" como se usan en este texto, significan abarcar cualquier poli (óxido de etileno) soluble en agua y pueden ser usados intercambiablemente. Típicamente, PEGs para uso de conformidad con la invención, comprenderá la siguiente estructura "- (OCH2CH20) m-" , o (CH2CH20) m-" en donde (m) es 2 hasta 4000, y los grupos terminales y arquitectura del PEG total pueden variar. Como se usa en este documento, PEG también incluye "-CHzCHz-O i CHsCHsO m- CHzCHs" y u- (CH2CH20) m-" -dependiendo de si o no los oxígenos terminales se han desplazado. Cuando el PEG además comprende una porción enlazadora (para ser descrita en más detalle abajo) , los átomos que comprenden la porción enlazadora, cuando se unen covalentemente a un polímero soluble en agua, no resultan en la formación de un enlace oxígeno-oxígeno (es decir, un "O-O" o enlace de peróxido) . A través de la especificación y reivindicaciones, se debe recordar que el término "PEG" incluye estructuras que tienen varios grupos de "extremo tapado" o terminales y así sucesivamente. El término PEG también significa un polímero que contiene una mayoría, esto es decir, mayor de 50% de subunidades monoméricas -CH2CH20- . Un PEG comúnmente empleado es el PEG de extremo tapado. Formas PEG específicas para uso en la invención, incluyen PEG que tienen una variedad de pesos moleculares, así como también estructuras o geometrías (por ejemplo PEGs ramificados, lineales, bifurcados, multifuncionales, multibrazos y similares) , a ser descritas en mayor detalle abajo. Los términos "extremo tapado" o "terminalmente tapado" son .usados intercambiablemente en este documento para referirse a un punto final o terminal de un polímero que tiene una porción de extremo tapado. Típicamente, con respecto al PEG, la porción de extremo tapado comprende un grupo hidroxi o alcoxi (¼.-20. De este modo, ejemplos de porciones de extremo tapado incluyen alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi y benciloxi) , así como también arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo y similares. Se debe recordar que los grupos hidroxi y alcoxi terminal pueden incluir el átomo de oxígeno terminal de un monómero de óxido de etileno de repetición cuando la estructura es retirada, dependiendo de como el monómero de óxido de etileno de repetición es definido [por ejemplo, w-(0CH2CH2," o w-CH2CH20(CH2CH20)m-CH2CH2-" . Además, se contemplan formas saturadas, insaturadas, sustituidas e insustituidas de cada uno de las porciones de extremo tapado mencionadas anteriormente. Sin embargo, el grupo de extremo tapado puede también ser un silano o un lípido (por ejemplo, un fosfolípido) . El grupo de extremo tapado puede también comprender ventajosamente una etiqueta detectable. Cuando el polímero tiene un grupo de extremo tapado que comprende una etiqueta detectable, la cantidad o ubicación del polímero y/o la porción (por ejemplo, agente activo) al cual el polímero está acoplado de interés, puede ser determinada usando un detector adecuado. Tales etiquetas incluyen, sin limitación, fluorescentes, quimioluminizadores, porciones usadas en etiquetación enzimática, colorimétrica (por ejemplo, tintes) , iones metálicos, porciones radioactivas y similares. Detectores adecuados incluyen fotómetros, películas, espectrómetros y similares . "Que no se origina naturalmente" con respecto a un polímero, significa un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Un polímero que no se origina naturalmente, puede sin embargo, contener una o más subunidades o porciones de una subunidad que están ocurriendo de manera natural, tan pronto como la estructura de polímero total no se encuentre en la naturaleza. El término "polímero soluble en agua" como en un "polímero soluble en agua" es cualquier polímero que es soluble en agua a temperatura ambiente. Típicamente, una solución de polímero soluble en agua, transmitirá al menos, aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de luz, transmitida por la misma solución después del filtrado. En una base en peso, un polímero o segmento soluble en agua del mismo, preferiblemente será al menos, aproximadamente 35% (en peso) soluble en agua, más preferiblemente al menos aproximadamente 50% (en peso) soluble en agua, todavía más preferiblemente aproximadamente 70% (en peso) soluble en agua, y todavía más preferiblemente aproximadamente 85% (en peso) soluble en agua. Es más preferido, sin embargo, que el polímero o segmento soluble en agua sea aproximadamente 95% (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua. Peso molecular en el contexto de un polímero soluble en agua de la invención, tal como PEG, puede ser expresado ya sea como un número de peso molecular promedio o un peso molecular promedio en peso. A menos que se indique de otro modo, todas las referencias a peso molecular en este documento, se refieren al peso molecular promedio en peso. Ambas determinaciones en peso molecular, número promedio y peso promedio, pueden ser medidas usando cromatografía de permeación en gel, u otras técnicas de cromatografía líquida. Otros métodos para medir los valores de peso molecular pueden también ser usados, tal como el uso de análisis de grupo final o la medición de las propiedades coligativas (por ejemplo depresión de punto de congelamiento, elevación de punto de ebullición o presión osmótica) , para determinar el número de peso molecular promedio o el uso de técnicas de dispersión de luz, ultracentrifugación o viscometría, para determinar el peso molecular promedio en peso. Los reactivos poliméricos de la invención son típicamente polidispersos (es decir, el número de peso molecular promedio y el peso molecular promedio en peso de polímeros no son iguales) , poseyendo valores de polidispersidad bajos de preferiblemente menos de aproximadamente 1.2, más preferiblemente menos de aproximadamente 1.15, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 1.10, aún todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 1.05, y más preferiblemente menos de aproximadamente 1.03. Como se usa en este texto, el término "ácido carboxílico" una porción que tiene un grupo funcional [también representado como n-COOH" o -C(0)OH], así como también porciones que son derivativas de un ácido carboxílico, tales derivados incluyen, por ejemplo, ácidos carboxílicos protegidos. De este modo, a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo, el término ácido carboxílico no incluye solamente la forma ácida, sino esteres correspondientes y formas protegidas también. Grupos protectores ejemplares para ácidos carboxílicos y otros grupos protectores se describe en Greene efe al. "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS" , Capítulo 6, 3era. Edición, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999 ( . 454-493). El término "reactivo" o "activado" cuando se usa en conjunto con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. Esto es contrario a aquellos grupos que requieren condiciones de reacción altamente imprácticas o catalizadores fuertes para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte") . Los términos "protegido" o "grupo protector" y "grupo protectivo" se refieren a la presencia de una porción (es decir, el grupo protector) que previene o bloquea la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular en una molécula bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo siendo protegido así como también las condiciones de reacción a ser empleadas y la presencia de grupos de protección o reactivos adicionales en la molécula, si es cualquiera. Grupos protectores conocidos en la técnica se pueden encontrar en Greene et al., supra. "Ácido carboxílico activado", significa un derivado funcional de un ácido carboxílico que es más reactivo que el ácido carboxílico original, en particular, con respecto a la sustitución acilo nucleofílica. Ácidos carboxílicos activados incluyen, pero no se limitan a haluros ácidos (tales como cloruros ácidos) , anhídridos, amidas y ésteres . Como se usa en este texto, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo, significa abarcar formas protegidas del mismo. El término "espaciador" o "porción espaciadora" es usado en este texto para referirse a un átomo o una colección de átomos opcionalmente usados para ligar porciones interconexión tales como un término de una porción de polímero soluble en agua y un grupo funcional. La porción espadadora puede ser hxdrolíticamente estable o puede incluir un enlace enzimáticamente degradable o fisiológicamente hidrolizable. "Alquilo" se refiere a una cadena hidrocarburo, típicamente que varía desde aproximadamente 1 hasta 20 átomos en longitud. Tales cadenas hidrocarburo son preferiblemente pero no necesariamente saturadas y pueden ser ramificadas o cadenas rectas, aunque típicamente se prefiere cadena recta. Grupos alquilo ejemplares incluyen etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilbutilo, (es decir, 2-pentilo), 1-etilpropilo (es decir, 3-pentilo) , 3-metilpentilo y similares. Como se usa en este texto, "alquilo" incluye cicloalquilo cuando son referenciados tres o más átomos de carbono. "Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, y puede ser cadena recta o ramificada, como se ejemplifica por metilo, etilo, n-butilo, iso-butilo y tere-butilo. "Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclica saturada o insaturada, que incluyen compuestos espiro cíclicos, fusionados, puenteados, preferiblemente elaborados de 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente 3 hasta aproximadamente 8. "Sustituyentes no interferentes" son aquellos grupos que, cuando se presentan en una molécula, típicamente no son reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula . El término "sustituido" como en por ejemplo, "alquilo sustituido" , se refiere a una porción (por ejemplo, un grupo alquilo) , sustituido con uno o más sustituyentes no interferentes, tales como, pero no limitados a: cicloalquilo C3-C8, por ejemplo ciclopropilo, ciclobutilo y similares; halo, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo y yodo; ciano; alcoxi, fenilo; fenilo sustituido; y similares. "Arilo sustituido" es arilo que tiene uno o más grupos no interferentes como un sustituyente. Para sustituciones en un anillo fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para) . "Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, en donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo CI-C2Q (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, benciloxi, etc.), preferiblemente Cx-C7 . Como se usa en este texto, "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado de 1 a 15 átomos de longitud, que contiene al menos un enlace doble, tal como etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-butenilo, isobutenilo, octenilo, decenilo, tetradecenilo y similares . El término "alquinilo" como se usa en este texto se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado de 2 a 15 átomos de longitud, que contiene al menos, un triple enlace, etinilo, n-propinilo, isopropinilo, n-butinilo, isobutinilo, octinilo, decinilo y así sucesivamente. "Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 o 6 átomos de carbono centrales . Arilo incluye anillos de arilo múltiples, que pueden ser fusionados, como en naftilo o no fusionado, como en bifenilo. Anillos arilo pueden también ser fusionados o no fusionados con uno o más hidrocarburos cíclicos, heteroarilo o anillos heterocíclicos . Como se usa en este texto, "arilo", incluye heteroarilo. "Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene desde uno a cuatro heteroátomos, preferiblemente N, O u S, o una combinación de los mismos. Anillos heteroarilo pueden también ser fusionados con uno o más anillos hidrocarburos cíclicos, heterocíclicos, arilo o heteroarilo. "Heterociclo" o "Heterocíclico" significan uno o más anillos de 5-12 átomos, preferiblemente 5-7 átomos, con o sin carácter de insaturación o aromáticos y que tienen al menos un átomo en el anillo el cual no es un carbono. Heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxigeno y nitrógeno. "Heteroarilo sustituido" es heteroarilo que tiene uno o más grupos no interferentes como sustituyentes. "Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes no interferentes . "Electrófilo" se refiere a un ión o átomo o colección de átomos los cuales pueden ser iónicos, que tienen un centro electrofílico, es decir, un centro que está buscando electrón, capaz de reaccionar con un nucleófilo. "Nucleófilo" se refiere a un ión o átomo o colección de átomos que pueden ser iónicos que tienen un centro nucleofílico, es decir, un centro que está buscando de un centro electrofílico o con un electrófilo. Un enlace "fisiológicamente desdoblable" o "hidrolizable" o "degradable" , es un enlace relativamente débil que reacciona con agua (es decir, es hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace para hidrolizar en agua dependerá no solamente en el tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales, sino también en los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Enlaces hidrolíticamente inestables o débiles apropiados, incluyen pero no se limitan a, éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acétales, cetales, aciloxialquil éter, iminas, orto esteres, péptidos y oligonucleótidos . Un "enlace enzimáticamente degradable" significa que es sujeto a degradación por una o más enzimas. Un enlace "hidrolíticamente estable" o unión se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, esto es, no se somete a hidrólisis bajo condiciones fisiológicas a cualquier extensión apreciable sobre un periodo prolongado de tiempo. Ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen pero no se limitan a los siguientes : enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alif ticas) , éteres, amidas, uretanos y similares. De manera general, un enlace hidrolíticamente estable es uno que exhibe una tasa de hidrólisis de menos de aproximadamente 1-2% por día bajo condiciones fisiológicas . Las tasas de hidrólisis de enlaces químicos representativos se pueden encontrar en la mayoría de libros estándares de química. Los términos "agente activo" , "agente biológicamente activo" y "agente farmacológicamente activo" son usados intercambiablemente aquí y son definidos para incluir cualquier agente, fármaco, compuesto, composición de materia o mezcla que proporciona algún efecto farmacológico, a menudo benéfico, que puede ser demostrado in vivo o in vitxo. Este incluye alimentos, suplementos alimenticios, nutrientes, nutricéuticos, fármacos, vacunas, anticuerpos, vitaminas, y otros agentes benéficos. Como se usa en este documento, estos términos además incluyen cualquier sustancia fisiológicamente o farmacológicamente activa que produce un efecto localizado o sistémico en un paciente . "Excipiente farmacéuticamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que puede ser incluido en las composiciones de la invención y que no causan efectos toxicológicos adversos significantes al paciente. "Cantidad farmacológicamente efectiva" , "cantidad fisiológicamente efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" son usados de manera intercambiable en este texto, por significar la cantidad de un conjugado de agente activo-polímero -típicamente presente en una preparación farmacéutica-- que es necesaria para proporcionar un nivel deseado de agente activo y/o conjugado en la corriente sanguínea o en tejido objetivo. La cantidad exacta dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el agente activo particular, los componentes y características físicas de la preparación farmacéutica, población de paciente propuesta, consideraciones del paciente y similares, y puede ser fácilmente determinada por uno de habilidades ordinarias en la técnica, basados en la información proporcionada en este texto y disponible en la literatura relevante. "Multifuncional" en el contexto de un polímero de la invención, significa un polímero que tiene 3 o más grupos funcionales contenidos en este, en donde los grupos funcionales pueden ser los mismos o diferentes. Polímeros multifuncionales de la invención típicamente contendrán desde aproximadamente 3-100 grupos funcionales, o desde 3-50 grupos funcionales, o desde 3-25 grupos funcionales, o desde 3-15 grupos funcionales, o desde 3 a 10 grupos funcionales, o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grupos funcionales dentro del polímero. Un "polímero "difuncional" significa un polímero que tiene dos grupos funcionales contenidos en este, ya sea el mismo (es decir, homodifuncional) o diferente (es decir, heterodifuncional) . "Bifuracado" con referencia a la geometría o estructura total de un polímero, se refiere a un polímero difuncional que tiene un "brazo" de polímero (es decir, un polímero soluble en agua único) , en donde ambos grupos funcionales están unidos (ya sea directamente o a través de uno o más átomos) a un átomo que sirve como un átomo de ramificación, el cual en cambio está unido (ya sea directamente o a través de uno o más átomos) al polímero soluble en agua. "Ramificado" en referencia a la geometría o estructura total de un polímero, se refiere a un polímero que tiene 2 o más "ramas" de polímero. Un polímero ramificado puede poseer 2 ramas de polímero, 3 ramas de polímero, 4 ramas de polímero, 6 ramas de polímero, 8 ramas de polímero o más. Un tipo particular de polímero altamente ramificado es un polímero dendrítico o dendrímero, el cual, para propósitos de la invención, es considerado por poseer una estructura distinta de aquella de un polímero ramificado. Un "dendrímero" o polímero dendrítico es un polímero monodisperso de tamaño globular, en el cual todos los enlaces emergen radialmente de un punto focal central o núcleo con un patrón de ramificación regular y con unidades repetidas que cada una contribuye a un punto ramificado. Dendrímeros exhiben ciertas propiedades de estado dendrítico tales como encapsulación de núcleo, haciéndolas únicas de otros tipos de polímeros, incluyendo polímeros ramificados. Un reactivo básico o acídico descrito en este documento incluye, formas de sal neutral, cargada y cualquier correspondiente de la misma. El término "paciente" se refiere a un organismo viviente que sufre de o propenso a una condición que puede ser prevenida o tratada por administración de un conjugado como se proporciona en este documento, e incluye tanto humanos como animales . Un "radical orgánico" es una porción que contiene carbono que puede estar unido vía un enlace covalente a otro átomo. Radicales orgánicos ejemplares incluye aquellos que son seleccionados del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. "Opcional" y "opcionalmente" , significa que la circunstancia subsecuentemente descrita puede o no puede ocurrir, de manera que la descripción incluye ejemplos en donde ocurren circunstancias e instancias en donde no. Como se usa en este documento, el designador "halo" (por ejemplo, fluoro, cloro, yodo, bromo y asi sucesivamente) se usa de manera general cuando el halógeno está unido a una molécula, mientras el sufijo "uro" (por ejemplo fluoruro, cloruro, yoduro, bromuro y así sucesivamente) , se usa cuando la forma iónica se usa cuando el halógeno existe en su forma iónica independiente (por ejemplo, tal como cuando un grupo saliente deja una molécula) . En el contexto de la presente discusión, se debe reconocer que la definición de una variable proporcionada con especto a una estructura o fórmula es aplicable a la misma variable repetida en una estructura diferente, a menos que el contexto lo dicte de otro modo. De este modo, por ejemplo, la definición de "POLY", "una porción espadadora", "(Z)", y así sucesivamente con respecto a un orto éster de un polímero soluble en agua es igualmente aplicable a un conjugado de polímero soluble en agua de este documento. Cambiando a una primera modalidad de la invención, se proporciona entonces un reactivo polimérico único. Aunque no se quiera ligar por teoría, los solicitantes creen que las propiedades distintivas de los reactivos poliméricos descritos en este documento son atribuibles a la orientación única de átomos. Por ejemplo, cuando un reactivo polimérico descrito en este documento es acoplado a un agente activo para formar un conjugado, la velocidad de hidrólisis del conjugado in vivo es diferente que la velocidad de hidrólisis de un conjugado que tiene los mismos átomos, pero arreglados en una secuencia diferente. Además de proporcionar velocidades de hidrólisis alternativas, los reactivos poliméricos proporcionados en este documento tienen ventajas adicionales sobre los reactivos poliméricos de la técnica anterior . Los polímeros de la invención comprenden tres componentes separados orientados en una manera específica. Los tres componentes son como siguen: un polímero soluble en agua que comprende unidades monoméricas de repetición; una porción que comprende un átomo de nitrógeno covalentemente unido al átomo de carbono de un carbonilo; y un grupo reactivo. Los tres componentes del polímero son específicamente orientados de manera tal que el átomo de nitrógeno de la porción mencionada anteriormente es próximo a la porción monomérica de repetición del polímero mientras el átomo de carbono es próximo al grupo reactivo. Se entenderá que el término "próximo" en el presente contexto se refiere a lo "más cercano" después de la trayectoria más cerrada de átomos enlazantes preferentemente más cercanos en términos de distancia espacial o absoluta. De este modo, los polímeros pueden ser esquemáticamente representados por la siguiente fórmula estructura: R1 O Polímero soluble en agua-—\\-N—C-N\—Z Fórmula (I) en donde: el "polímero soluble en agua" es un polímero soluble en agua que comprende unidades monoméricas de repetición: cada "-\\-"independientemente es un enlace covalente directo o una porción espaciadora; R1 es H o un radical orgánico; y Z es un grupo reactivo. Como se fj¡1 o representa en la Fórmula I, el nitrógeno de la porción -N-c-es próximo al polímero soluble en agua y el átomo de carbono de la porción carbonilo es próximo al grupo reactivo "Z" . Los reactivos poliméricos de la invención por lo R1 o tanto, comprenden una porción comprende una porción -N-C-posicionada entre un polímero soluble en agua y un grupo reactivo, en donde (i) el átomo de nitrógeno en la porción R1 o I II -N-C- está próximo al polímero soluble en agua átomo de carbono carbonilo de la porción está próximo grupo reactivo; y (iii) es como se define previamente. El polímero soluble en agua está ligado átomo de nitrógeno de la porción través de ya un enlace covalente directo o a través de una primera porción espaciadora. El grupo reactivo está ligado al átomo R1 o de carbono carbonilo de la porción a través de ya sea un enlace covalente directo o una segunda porción espaciadora. Además, los reactivos poliméricos de la invención pueden ser descritos por comprender un polímero soluble en agua, una porción , y un grupo reactivo, en donde: (i) el polímero soluble en agua está ligado al átomo de R1 o nitrógeno de la porción -N-C- a través de ya sea un enlace covalente directo o a través de una primera porción espaciadora; (ii) el grupo reactivo está ligado al átomo de R1 o carbono carbonilo de la porción I II -N-C- a través de ya sea un enlace covalente directo o una segunda porción espadadora; y (iii) R es como se define previamente. R1 o La porción -I ll N-C- (en donde R1 es H o un radical orgánico) , puede ser considerada una porción amida cuando se considera en aislamiento y aparte de átomos adyacentes . R1 o Se debe recordar, sin embargo, que la porción -¿-c- en el polímero es parte de una estructura más grande. Por ejemplo, un átomo de oxígeno puede ser -y es preferiblemente—directamente unido al átomo de carbono R1 o carbonilo de la porción --C- , con ello proporcionando una R1 o porción -N-C-O— que es a menudo referida como un "carbamato" o "uretano" . De manera similar, un átomo de azufre puede opcionalmente ser unido al átomo de carbono carbonilo de la R1 o porción -N-C- , con ello proporcionando una porción n -N-C-S-. Además, una porción -N(R2)- está unida al átomo de carbono carbonilo de , con ello proporcionando una porción es H o un radical orgánico .
Finalmente, en todos los casos en los cuales la referencia R1 o R s a la porción _?_"_ se hace, una porción -N-C- puede ser sustituida por lo tanto, y la invención no está limitada meramente a porciones De este modo, para propósitos de describir las estructuras químicas aquí posteriormente, se hará R1 o referencia de manera general a una porción -N—c-o-: . Para propósitos de la presente descripción, sin embargo, cada R o una de las porciones --C- (en donde un átomo de oxígeno no está unido al átomo de carbono carbonilo) , una porción UNA S R2 p II l p es referenciada. R1 o Con respecto a la porción _¿_c_o- un enlace del átomo de nitrógeno se une al átomo de carbono del carbono carbonilo adyacente (el "carbono carbonilo") , otro enlace se une ya sea directamente al polímero soluble en agua o a una porción espaciadora, y un tercer enlace se une a un sustituyente, "R1" . R1 es cualquier sustituyente no ínterférente . R1 es típicamente, aunque no necesariamente, H o un radical orgánico. Sin embargo, se prefiere que R1 sea H. en aquellos casos cuando R1 es un radical orgánico, radicales orgánicos preferidos incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Ejemplos específicos de radicales orgánicos preferidos incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, tere-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, terc-pentilo, y piperidonilo . Con respecto al grupo reactivo, "Z", este grupo puede ser cualquier grupo que reacciona con un reactivo adecuado bajo condiciones apropiadas. Porciones reactivas preferidas se seleccionan del grupo que consiste de electrófilos y nucleófilos. Ejemplos de tales grupos reactivos incluyen, pero no se limitan a aquellos seleccionados del grupo que consiste de hidroxilo (-0H) , éster, éster, ortoéster, carbonato, carbonato, acet l, acetaldehido, aldehido, hidrato, cetona, vinilcetona, cetona, hidrato de cetona, tiona, monotiohidrato, ditiohidrato, hemicetal, hemicetal de monotiocetal , ditiohemicetal, cetal, ditiocetal, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, amina, hidrazido, tiol, disulfuro, tiol hidrato, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, benzotriazol, , ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tiosulfonato, tresilato, silano, -(CH2)rC02H, - (CH2) r.C02NS, - (CH2) rC02Bt, -(CH2)rCH(OR)2, - (CH2)r(CH0) , -(CH2)2-NH2, -(CH2)r , -(CH2)r-S-S02-R, en donde (r) es 1-12, (r' ) es 0-5, R es arilo o alquilo, NS es N-succinimidilo, Br es 1-benzotriazolilo y M es N-maleimidilo y formas protegidas y activadas de cualquiera de los anteriores . Con respecto a cualquier grupo reactivo, y en particular a maleimida y aldehido, un enlazador opcional puede enlazar el grupo reactivo al polímero. De este modo, por ejemplo, el enlazador puede enlazar el grupo reactivo a una porción espaciadora o una porción de ramificación (cuando se presenta) . Además, cuando ni una porción espaciadora ni una porción de ramificación está presente, el enlazador puede enlazar el grupo reactivo directamente al átomo carbonilo comprender hidrocarburos acíclicos saturados de cadena recta que comprenden al menos cuatro átomos de carbono, tales como tetrametileno, pentametileno y hexametileno, así como también hidrocarburos acíclicos saturados ramificados que comprenden al menos cuatro átomos de carbono. En una modalidad, la porción de hidrocarburo del enlace tiene la estructura -(CR3R4)g-, en donde cada R3 es independientemente H, alquilo o cicloalquilo, cada R4 es independientemente H, alquilo o cicloalquilo, y (g) es 3 hasta aproximadamente 20, preferiblemente 4 hasta aproximadamente 12. En una modalidad preferida, cada R3 y R4 es H. En modalidades de hidrocarburos acíclicos ramificados, es preferible para la ramificación, que ocurra en uno o más de dos átomos de carbono más cercanos al grupo reactivo (por ejemplo, maleimida) , para maximizar la obstrucción estérica. En otra modalidad, la porción hidrocarburo del enlace incluye un hidrocarburo alicíclico bivalente saturado y tiene la estructura -(CR3R4)P-cicloalquilo C3-12- (CR3R4) q- , en donde p y q son cada uno independientemente 0 hasta aproximadamente 10, preferiblemente 0 hasta aproximadamente 6 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6) y R3 y R4 son como se definen previamente. El grupo cicloalquilo bivalente (por ejemplo, cicloalquileno) es preferiblemente cicloalquileno C3-8, tal como varias formas isoméricas de ciclopropadiilo (por ejemplo, 1,1-, cis-1,2-, o trans-1, 2-ciclopropileno) , ciclobutadiilo, ciclopentadiilo, ciclohexadiilo y cicloheptadiilo . El grupo cicloalquileno puede ser sustituido con uno o más grupos alquilo, preferiblemente grupos alquilo Ci-6. Con respecto al polímero soluble en agua, los reactivos poliméricos de la invención también comprenden al menos un segmento de polímero soluble en agua. Polímeros solubles en agua que son no peptidicos y solubles en agua, desde 2 hasta aproximadamente 300 términos, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros solubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a, poli (alquilen glicoles) , tales como poli (etilen glicol) ( "PEG" ) , copolímeros de etilenglicol y propilenglicol que tienen solubilidad en agua, poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli (sacáridos) , poli (a-hidroxiácido) , poli (alcohol vinílico) , polifosfaceno, polixazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , tal como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,629,384. En algunas aplicaciones en donde se desea solubilidad en agua relativamente alta, el polímero soluble en agua no es poli (óxido de propileno) . Las unidades de repetición en cada uno de los polímeros solubles en agua pueden tener un número de arreglos diferentes que incluyen, pero no se limitan a, aquellos seleccionados del grupo que consiste de homopolímero (en donde cada unidad monomérica que comprende el polímero soluble en agua es la misma) , copolímero alternante (en donde una primera unidad monomérica consistentemente alterna con una segunda unidad monomérica dentro del polímero soluble en agua) , copolímero aleatorio (en donde una primera unidad monomérica consistentemente alterna con una segunda unidad monomérica dentro del polímero soluble en agua) , copolímero de bloque, (en donde dos o más de las primeras unidades monoméricas alternan con dos o más segundas unidades monoméricas dentro del polímero soluble en agua) , tripolímero alternante, tripolímero aleatorio y tripolímero de bloque. El polímero soluble en agua es preferiblemente, aunque no necesariamente, un poli (etilenglicol) ("PEG") o un derivado del mismo. Se debe entender sin embargo, que polímeros relacionados son también adecuados para uso en la práctica de esta invención y que el uso del término "PEG" o "poli (etilenglicol) " está propuesto para ser inclusivo y no exclusivo en este sentido. Consecuentemente, el término "PEG" incluye poli (etilenglicol) en cualquiera de sus formas lineal, ramificada o de brazos múltiples, que incluyen PEG alcoxi, PEG bifuncional, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendiente o PEG con enlaces degradables en este, a ser más completamente descritos abajo. En la forma útil en la presente invención, PEG libre o no unido es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilos : HO-CH2CH20-(CH2CH20)m.-CH2CH2-OH (m' ) típicamente varía desde cero hasta aproximadamente 4,000. El polímero anterior, alfa-, omega-dihidroxilpoli (etilenglicol) , puede ser representado en forma breve como HO-PEG-OH en donde se entiende que el símbolo PEG puede representar la siguiente unidad estructural : -CH2CH20-(CH2CH20)m-CH2CH2- en donde (m' ) es como se define anteriormente. Otro tipo de PEG útil en la presente invención es metoxi-PEG-OH, o mPEG en corto, en el cual un término es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras el otro término es un grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se da abajo. CHsO-CHj^O-CCHzCHzO^-CHzCHa-OH | en donde (m' ) es como se describe anteriormente. Además de las formas de PEG descritas anteriormente, el polímero puede también ser preparado con uno o más enlaces débiles o degradables en el polímero, que incluyen cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, el PEG puede ser preparado con enlaces ésteres en el polímero que es sometido a hidrólisis. Como se muestra abajo, esta hidrólisis resulta en desdoblamiento del polímero en fragmentos de peso molecular inferior: -PEG-C02-PEG- + H20 -PEG-CO2H + HO-PEG- Otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como enlaces degradables dentro de una estructura de polímero incluyen: enlaces de carbonato; enlaces de imina que resultan por ejemplo, de reacción de una amina y un aldehido (véase por ejemplo, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38. ( D : 582-3) ; enlaces de éster de fosfato formados por ejemplo, haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona los cuales son típicamente formados por reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces acétales que son típicamente formados por reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces ortoéster que son, por ejemplo, formados por reacción entre un formiato y un alcohol; enlaces amida formados por un grupo amina, por ejemplo, al extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de otra cadena PEG; enlaces uretano formados de reacción de por ejemplo, un PEG con un grupo isocianato terminal y un alcohol PEG; enlaces péptidos formados por un grupo amina, por ejemplo, al extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleótidos formados mediante por ejemplo, un grupo fosforamidita por ejemplo, al extremo de un polímero y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleótido. Se entiende por aquellos de habilidades ordinarias en la técnica, que el término poli (etilenglicol) o PEG representa o incluye todas las formas anteriores de PEG. Aunque el peso molecular del polímero soluble en agua (así como también el reactivo polimérico) , puede variar, el peso molecular podría satisfacer uno o más de los siguientes valores: mayor de 100 Daltons; mayor de 200 Daltons; mayor de 400 Daltons; mayor de 500 Daltons; mayor de 750 Daltons; mayor de 900 Daltons; mayor de 1,000 Daltons, mayor de 1,400 Daltons; mayor de 1,500 Daltons; mayor de 1,900 Daltons; mayor de 2,000 Daltons; mayor de 2,200 Daltons; mayor de 2,500 Daltons; mayor de 3,000 Daltons; mayor de 4,000 Daltons; mayor de 4,900 Daltons; mayor de 5,000 Daltons; mayor de 6,000 Daltons; mayor de 7,000 Daltons; mayor de 7,500 Daltons, mayor de 9,000 Daltons; mayor de 10,000 Daltons; mayor de 11,000 Daltons; mayor de 14,000 Daltons; mayor de 15,000 Daltons; mayor de 16,000 Daltons; mayor de 19,000 Daltons; mayor de 20,000 Daltons; mayor de 21,000 Daltons; mayor de 22,000 Daltons, mayor de 25,000 Daltons; y mayor de 30,000 Daltons. Se entiende que el límite máximo de peso molecular para un segmento de polímero soluble en agua dado útil en este documento es aproximadamente 300,000 Daltons. El peso molecular del polímero soluble en agua (así como también el reactivo polimérico completo) , puede ser expresado por ser un valor dentro de un intervalo de pesos. Intervalos ejemplares incluyen: desde aproximadamente 100 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons; desde aproximadamente 500 Daltons hasta aproximadamente 80,000 Daltons; desde aproximadamente 1,000 Daltons hasta aproximadamente 60,000 Daltons; desde aproximadamente 2,000 Daltons hasta aproximadamente 50,000 Daltons; y desde aproximadamente 5,000 Daltons hasta aproximadamente 40,000 Daltons. Pesos moleculares ejemplares para cualquier polímero soluble en agua dado (así como también el reactivo polimérico completo) dentro de un reactivo polimérico incluyen aproximadamente 100 Daltons, aproximadamente 200 Daltons, aproximadamente 300 Daltons, aproximadamente 400 Daltons, aproximadamente 500 Daltons, aproximadamente 600 Daltons, aproximadamente 700 Daltons, aproximadamente 750 Daltons, aproximadamente 800 Daltons, aproximadamente 900 Daltons, aproximadamente 1,000 Daltons, aproximadamente 2,000 Daltons, aproximadamente 2,200 Daltons, aproximadamente 2,500 Daltons, aproximadamente 3,000 Daltons, aproximadamente 4,000 Daltons, aproximadamente 4,400 Daltons, aproximadamente 5,000 Daltons, aproximadamente 6,000 Daltons, aproximadamente 7,000 Daltons, aproximadamente 7,500 Daltons, aproximadamente 8,000 Daltons, aproximadamente 9,000 Daltons, aproximadamente 10,000 Daltons, aproximadamente 11,000 Daltons, aproximadamente 12,000 Daltons, aproximadamente 13,000 Daltons, aproximadamente 14,000 Daltons, aproximadamente 15,000 Daltons, aproximadamente 20,000 Daltons, aproximadamente 22,500 Daltons, aproximadamente 25,000 Daltons, aproximadamente 30,000 Daltons, aproximadamente 40,000 Daltons, aproximadamente 50,000 Daltons, aproximadamente 60,000 Daltons, aproximadamente 75,000 Daltons y aproximadamente 80,000 Daltons. Con respecto a EPG, en donde una estructura comprende un monómero de óxido de etileno de repetición, tal como (CH2CH20) m" o (OCH2CH2) m, se puede proporcionar, valores preferidos para (m) incluyen: desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 3,000; desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 3,000; desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 3, 000; desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 3, 000; desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 3, 000; desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 3, 000; desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 3, 000; desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 3, 000; desde aproximadamente 55 hasta aproximadamente 3,000; desde aproximadamente 75 hasta aproximadamente 3, 000; desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 3, 000; y desde aproximadamente 225 hasta aproximadamente 3, 000. Como se usa en este documento, el término "polímero soluble en agua" incluye aquellos polímeros solubles en agua que son biocompatibles y no inmunogénicos y específicamente excluyen cualquiera de los segmentos de polímeros solubles en agua que no son biocompatibles y no inmunogénicos. Con respecto a la biocompatbilidad, una sustancia es considerada biocompatible si los efectos benéficos asociados con el uso de la sustancia sola o con otra sustancia (por ejemplo, agente activo) en conjunto con tejidos vivientes (por ejemplo, administración a un paciente) , excede cualquier efecto perjudicial como se evalúa por un clínico, por ejemplo, un especialista. Con respecto a no inmunogenidad, una sustancia es considerada no inraunogénica si el uso propuesto de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmune indeseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmune, tal respuesta no parece clínicamente significante o importante como se evalúa por un clínico. Es particularmente preferido que los segmentos de polímeros solubles en agua descritos en este documento, así como también conjugados, sean biocompatibles y no inmunogénicos . Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica reconocerán que la discusión mencionada anteriormente que se refiere sustancialmente a polímeros solubles en agua, no es por medios exhaustivos y es meramente ilustrativa y que todos los materiales poliméricos que tienen las calidades descritas anteriormente están contemplados. Como se usa en este documento, el término "reactivo polimérico" se refiere de manera general a una molécula completa, la cual comprende un polímero soluble en agua y un grupo funcional . El término "polímero soluble en agua" es reservado de manera general, para uso en la discusión de una porción de una estructura molecular más grande tal como un reactivo polimérico, molécula precursora, conjugado, etc. Cada porción, (por ejemplo, grupo funcional, agente activo, polímero soluble en agua, etc.) del reactivo polimérico y otras estructuras descritas en este documento, pueden ser directamente unidas a otras vía un enlace covalente directo. Más típicamente, sin embargo, cada porción está unida a través de una porción espaciadora comprendida de uno o más átomos que sirven para unir cada porción en conjunto en un todo unificado. Porciones espaciadoras preferidas en las cuales las varias porciones de los reactivos poliméricos y otras estructuras descritas en este documento incluyen una cadena de átomos elaborada de átomos de carbono, oxígeno y/o azufre. Unida a esta cadena de átomos, puede estar uno o más de otros átomos tales como carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre e hidrógeno. La cadena puede ser corta y comprende tanto como una cadena de dos a cinco átomos . Cadenas más largas, por ejemplo, una cadena de átomos de diez, cincuenta o más en longitud está también contemplada. Además, la porción espaciadora puede comprender un anillo de átomos que puede ser saturado, insaturado, así como también siendo aromático. Cuando se presenta, una porción espaciadora preferiblemente comprende una secuencia de aproximadamente 1-20 átomos que excluyen cualquiera de los átomos de ramificación. Preferiblemente, los átomos que hacen la porción espaciadora (que incluyen cualquiera de los átomos de ramificación) , comprenden alguna combinación de átomos de oxígeno, carbono, nitrógeno, azufre e hidrógeno. Cada porción espaciadora (por ejemplo, una primer porción espaciadora, segunda porción espaciadora, tercera porción espaciadora, etc.) en el reactivo polimérico puede ser la mismo o diferente de cualquier otra porción espaciadora presente en el polímero. Ejemplos no limitantes de una porción espaciadora son aquellos seleccionados del grupo que consiste de -O- , -S-, -C(O)-, -0-C(0)-, -C(0)-0-, -C(0)-NH-, -NH-C (O) - H- , -0-C(0) -NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2- , -CH2-CH2-CH2-CH2-, -0-CH2-, -C¾-0-, -0-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-0-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2- , -CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-, -0-CH2-CH2-CH2-CH2- , -CH2-0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-CH2- , -CH2-CH2-CH2-CH2-0-, -C(O) -NH-CH2-, -C (O) -NH-C¾-CH2- , -CH2-C(0) -NH-CH2-, -CH2-CH2-C (O) -NH- , -C (O) -NH-CH2-CH2-CH2- , -CH2-C(0) -NH-C¾-CH2-, -CH2-CH2-C (O) -NH-CH2- , -CH2-CH2-C¾-C(0)-NH-, -C(O) - H-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-CH2- , -CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2- , -CH2-CH2-C¾-C (O) -NH-CH2- , -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2- , -CH2-CH2-CH2-CH2-C (O) -NH- , -C(O) -0-C¾-, -CH2-C(0) -0-CH2-, -CH2-CH2-C(0) -0-CH2-, -C(O)-0-CH2-CH2-, -NH-C (O) -CH2-, -CH2-NH-C (O) -CH2- , -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, -NH-C (O) -CH2-CH2-, -CH-NH-C (O) -CH-CH2- , -CH2-CH2-NH-C(0) -CH2-CH2-, -C (O) -NH-CH2- , -C (O) -NH-CH2-CH2- , -O-C(O) -NH-CHz-, -O-C(O) -NH-CH2-CH2-, -O-C (O) -NH-CH2-CH2-CH2- , -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2- , -CH2-C¾-NH-CH2- , -C(0)-CH2-, -C(O) -CH2-CH2-, -CH2-C (O) -CH2- , -CH2-CH2-C (O) - CH2-, -CH2-CH2-C(0) -CH2-CH2-, -CH2-CH2-C (O) - , -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH- , -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-C (O) - , -CH2-CH2-CH2-C (O) - H-CH2-CH2-NH-C (O) -CH2- , -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-C¾-NH-C (O) -CH2-CH2- , -O-C (O) -NH- [CH2] 0-6- (OCH2CH2) 0-2- , -C (O) -NH- (CH2) x-6-NH-C (O) - , -NH-C (O) -NH- (CH2) ?-g-NH-C (O) - , -O-C(O) -C¾-, -O-C(O) -CH2-CH2-, -O-C(O) -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-C (O) - , -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH-C (O) -CH2- , grupo cicloalquilo bivalente, -N (R2) - , -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-NH-C(0) -CH2-CH2-, O-C (O) -NH- [CH2] - (OCH2CH2)n-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, en donde (f) es 0 hasta 6, (n) es 0 hasta 20 (preferiblemente 0 a 10, por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, y más preferiblemente, 4), R2 es H o un radical orgánico . Grupos cicloalquilo bivalentes preferidos tienen la estructura -(CR6R4)P-cicloalquilo C3-12_ (CR3R4) q- , en donde p y q son cada uno independientemente 0 hasta aproximadamente 10, preferiblemente 0 hasta aproximadamente 6 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6), cada R3 es independientemente H, alquilo u otro cicloalquilo, y cada R4 es independientemente H, alquilo u otro cicloalquilo. Otros grupos cicloalquilos bivalentes (por ejemplo, cicloalquileno) incluyen cicloalquilo C3_8, tales como varios isómeros de ciclopropadiilo (por ejemplo, 1,1-, cis-11,2- o trans-1 , 2-ciclopropileno) , ciclobutadiilo, ciclopentadiilo, ciclohexadiilo, y cicloheptadiilo . El grupo cicloalquileno puede ser sustituido con uno o más grupos alquilo, preferiblemente grupos alquilo Ci-6. Para cualquier porción espadadora dada que comprende tanto un átomo de carbono como un carbonilo adyacente a esta, la porción espaciadora opcionalmente incluye un radical orgánico unido al átomo de carbono adyacente al carbonilo. Convencionalmente, el átomo de carbono inmediatamente adyacente al carbono carbonilo es llamado el carbono alfa. De este modo, un carbono alfa en cualquier porción espaciadora dada, puede tener un radical orgánico tal como un grupo alquilo menor (por ejemplo, grupo metilo) unido a esta. La estructura total del reactivo polimérico puede tomar cualquier número de diferentes formas. Por ejemplo, el reactivo polimérico puede ser lineal, ramificado, de ramas múltiples, dendrítico o bifurcado. Estructuras lineales de conformidad con la presente invención, corresponden a las Fórmulas II y lia abajo. Se prefiere sin embargo, que el reactivo polimérico tenga ya sea una estructura ramificada o de brazos múltiples . Hablando de manera general, tales polímeros poseen dos o más polímeros solubles en agua y crean un polímero más denso, más grande "agrupado" circundando un agente activo, con ello, reduciendo el número efectivo de sitios de unión disponibles para acoplamiento. Las fórmulas III, Illa, Il b y Illbi bajo estructuras ramificadas, comprenden dos o más polímeros solubles en agua. Estructuras ramificadas pueden también comprender tres polímeros solubles en agua. Polímeros de brazos múltiples por otro lado, comprenden cuatro o más polímeros solubles en agua. Formas dendríticas de los polímeros tienen varios (por ejemplo, 3 a 50) , polímeros solubles en agua separados, finalmente conectados a un núcleo que comprende uno o más átomos . Para cualquier reactivo polimérico particular que comprende dos o más polímeros solubles en agua, cada polímero soluble en agua puede ser el mismo o diferente. Sin embargo, combinaciones de los mismos o diferentes polímeros solubles en agua pueden ser usadas cuando el reactivo polimérico comprende tres o más polímeros solubles en agua, aunque se prefiere que cada polímero soluble en agua en el polímero sea el mismo como el (los) otro(s). Con respecto a formas ramificadas del reactivo polimérico, intervalos ejemplares de tamaños adecuados para el peso molecular total del polímero (basado esencialmente en los pesos combinados de las dos porciones de polímeros solubles en agua) , incluyen los siguientes (nuevamente expresados en términos de masa molecular) : desde aproximadamente 200 Daltons hasta aproximadamente 200,000 Daltons; desde aproximadamente 1,000 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons; desde aproximadamente 2,000 Daltons hasta aproximadamente 120,000 Daltons; desde aproximadamente 4,000 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons; desde aproximadamente 5,000 Daltons hasta aproximadamente 90,000 Daltons; desde aproximadamente 10,000 Daltons hasta aproximadamente 80,000 Daltons; desde aproximadamente 15,000 Daltons hasta aproximadamente 60 , OOODaltons . Más particularmente, la masa molecular total (en Daltons) de una versión ramificada del polímero de la invención, corresponde a una de las siguientes aproximadamente 400; aproximadamente 1, 000 aproximadamente 1,500; aproximadamente 2, 000 aproximadamente 3000; aproximadamente 4, 000 aproximadamente 10, 000; aproximadamente 15, 000 aproximadamente 20,000; aproximadamente 30, 000 aproximadamente 40, 000; aproximadamente 50, 000 aproximadamente 60, 000; aproximadamente 80, 000 aproximadamente 90, 000, aproximadamente 100, 000 aproximadamente 120, 000, aproximadamente 160, 000 aproximadamente 200,000. Considerando la estructura general de reactivos poliméricos descritos en este documento, uno reconocerá ciertas diferencias con respecto a reactivos poliméricos descritos en la técnica anterior. Por ejemplo, muchos de los reactivos poliméricos de la técnica anterior sufren de un número de problemas que los hacen inadecuados para acoplamiento a un agente activo. Por ejemplo, reactivos de polímeros de la técnica anterior, carecen de un grupo funcional fácilmente desplazable, tal como un grupo reactivo (por ejemplo, éster) . Aún si fuera un intento por acoplar un reactivo polimérico carente de un grupo funcional fácilmente desplazable (por ejemplo, un grupo metileno (-CH2)), las condiciones requeridas para hacerlo podrían ser muy duras (por ejemplo, condiciones fuertemente alcalinas) , con ello degradando probablemente el agente activo. Además, algunos reactivos poliméricos de la técnica anterior tienen dos grupos (por ejemplo, grupos carbonilo) , sustituidos en el sitio potencial de unión, el cual a menudo conduce a conjugación incompleta debido a efectos estéricos y/o reactividad reducida como una consecuencia de la proximidad de los grupos . Cuando solamente un polímero soluble en agua único está presente en la estructura total del polímero, la estructura del polímero preferiblemente corresponde a la Fórmula (II) : R10 POLI -(X1)a-N-C-0-(Xs)h-Z (Fórmula II) en donde: POLI1 es un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG o mPEG) ; (a) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (b) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; R1 es H o un radical orgánico (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido) ; X1, cuando se presenta, es una primera porción espaciadora; X2 cuando se presenta, es una segunda porción espaciadora; y Z es un grupo reactivo. Sin embargo, cuando el polímero comprende solamente una porción soluble en agua única en la estructura total, la estructura puede también corresponder a la Fórmula lia: O R1 R1 o Z—(X4)d—O—C—N—(X3)0—POLI 1 (X1)a-N-C-0—(X2)b—Z (Fórmula Ha) en donde: POLI1 es un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG o mPEG) ; (a) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (b) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (c) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (d) es O, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente O ó 1) ; Cada R1 es independientemente H o un radical orgánico (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; X1, cuando se presenta, es una primera porción espadadora; X2, cuando se presenta, es una segunda porción espaciadora; X3, cuando se presenta, es una tercera porción espaciadora; X4, cuando se presenta, es una cuarta porción espaciadora; y cada Z es independientemente un grupo reactivo. Además, cuando dos polímeros solubles en agua están presentes en la estructura total del reactivo polimérico, la estructura puede corresponder a la Fórmula III: (Fórmula III) en donde: POLI1 es un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG o mPEG) ; POLI2 es un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG o mPEG) ; (a) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (b) es 0, 1, 2 6 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (e) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (f) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (g') es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (h) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (j) es 0 hasta 20 (es decir, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Ó 20); Cada R1 es independientemente H o un radical orgánico (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; X1, cuando se presenta, es una primera porción espadadora; X2, cuando se presenta, es una segunda porción espadadora; Xs, cuando se presenta, es una quinta porción espaciadora; X6, cuando se presenta, es una sexta porción espaciadora; X7, cuando se presenta, es una séptima porción espadadora; X8, cuando se presenta, es una octava porción espadadora; R5 es una porción de ramificación; y Z es un grupo reactivo. Reactivos poliméricos preferidos que tienen estructuras abarcadas por las Fórmulas II, (lia) y III, son aquellas en donde cada polímero soluble en agua (es decir, POLI1 y/o POLI2), es un poli (óxido de alquileno) tal como poli (óxido de etileno) . Preferiblemente, aunque no necesariamente, el poli (óxido de etileno) será de extremo tapado en un término con un grupo tal como metilo, bencilo o hidroxilo. Un poli (óxido de etileno) de extremo tapado particularmente preferido, es uno que corresponde a una de las siguientes estructuras: H3C- (OCH2CH2)m- o H3C- (0CH2C¾) m-O-C (O) -NH- [CH2] f- (OCH2CH2) n- , en donde (m) es 2 hasta 4000, (f) es 0 hasta 6, (n) es 0 hasta 20. Cada porción espadadora (sea en su primera porción espadadora, segunda porción espadadora o tercera porción espaciadora) que aparece en un polímero y abarcada por las Fórmulas II, lia o III, es definida independientemente como anteriormente con respecto a porciones espaciadoras de manera general. Se prefiere, sin embargo, que tales porciones espaciadoras tales como aquellas designadas como "X1" y "X5", se seleccionen del grupo que consiste de -O-, -0-CH2-, -0-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-CH2-, y -0-C (O) -NH-CH2-CH2~ (OCH2CH2) 2- . Con respecto a porciones espaciadoras designadas como wx2" y "Xe", la porción espaciadora se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2 (OR2) - , -CH2-CH(OR2) -CH(OR2) -, -N(R2)-, y R2 es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Con respecto a una porción espaciadora designada como «X8" , la porción espaciadora se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de -O-, -0-CH2-, -0-CH2-CH2-, -0-CH2-CH2-CH2- , -0-CH2-CH2-CH2-C (O) - , -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (O) - , -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-NH-C(0) -CH2-CH2-, y -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH- (CH2CH20)n-CH2-CH2-CH2-, en donde (n) es 0 hasta 20. Opcionalmente, Xs puede incluir un punto de ramificación adicional o varios puntos de ramificación, en donde pueden estar presentes grupos reactivos adicionales, con ello proporcionando un arreglo "bifurcado" . Otros arreglos "bifurcados" que pueden ser usados en los presentes polímeros se describen más completamente en la Solicitud Internacional No. PCT/US99/05333. La porción de ramificación R5 en la Fórmula III puede ser cualquier porción de ramificación que puede proporcionar acoplamiento al menos a tres átomos . Preferiblemente, sin embargo, R5 se selecciona del grupo que consiste de alquilo saturado, alquilo saturado sustituido, en donde (p) es 1-10 ( por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) y (q) es 1-10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) . Aunque el grupo reactivo "Z" como se muestra en las Fórmulas II, lia y III puede ser cualquier grupo reactivo descrito anteriormente, se prefiere que el grupo reactivo se seleccione del grupo que consiste de ácido carboxílico, aldehido, sulfona, éster, succinimida y maleimida. Ejemplos ilustrativos de una porción espaciadora (por ejemplo, X2, X4 y X8) y combinaciones de Z incluyen CH2¾?_0_H ^ ^ -f"M$? ^ -ic¾t NH2 r A en donde (r) es 1-12 (por ejemplo, 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12), (r#) es 0-5 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4 ó 5), y R6 es arilo 1 alquilo. Como se apreciará por uno de habilidades ordinarias en la técnica, la presente invención abarca un gran número de polímeros. Ejemplos no limitantes de polímeros de conformidad con la presente invención se proporcionan abajo. Por ejemplo, partiendo con la Fórmula III y definiendo R como en donde cada uno de (p) y (q) es uno, y cada uno de (b) y (f) es cero, resulta en un polímero que tiene la estructura que corresponde a la Fórmula (Illa) abajo. en donde POLI1, POLI2, (a), (c) , (g' ) , (j), (h) , R1, X7, X8 y Z son como se definen previamente. La Fórmula Illa puede, en cambio, ser además definida para proporcionar un reactivo polimérico que tiene una estructura que corresponde a la Fórmula Illb . Específicamente, partiendo de la Fórmula Illa y definiendo cada R1 como H, cada POLI1 y POLI2 como ¾C- (0C¾CH2) m- en donde (m) es 2 a 4000, cada uno de (a) y (e) como uno, cada uno de X1 y Xs como -O-C (O) - H- [CH2] f- (OCH2CH2) n) - en donde (f) es 0 hasta 6 y (n) es 0 hasta 20, resulta en un reactivo polimérico que tiene una estructura que corresponde a la Fórmula Illb: en donde cada (m) es 2 hasta 4000, cada (f) es independientemente 0 hasta 6, y cada (n) es independientemente 0 hasta 20, y (g'), (h) , (j), X7 y X8 y Z son como se definen previamente. La Fórmula Illb, puede en cambio, ser definida además para proporcionar un reactivo polimérico que tiene una estructura que corresponde a la Fórmula lile. Específicamente, partiendo de la Fórmula Illb y definiendo cada uno de (g' ) y (j) como cero, (h) tiene un X8 como -CH2-CH2-CH2- , y Z como un ácido carboxilico, resulta en un polímero que tiene una estructura que corresponde a la Fórmula lile abajo. en donde cada (m) es 2 hasta 4000, cada (f) es independientemente 0 hasta 6, y cada (n) es independientemente 0 hasta 20 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20) . De manera opcional, la Fórmula lile puede también incluir un grupo alquilo conectado a ya sea el carbono alfa o beta del ácido carboxílico. Con respecto al grupo alquilo (por ejemplo, metilo) en el carbono alfa del ácido carboxílico de la estructura que corresponde a la Fórmula nibx.
(Fórmula Illbi) Además, la Fórmula Illa puede además ser definida para proporcionar otro polímero preferido. Específicamente, partiendo de la Fórmula Illa y definiendo cada uno de POLI1 y POLI2 como H3C- (OCH2CH2) m en donde (m) es 2 hasta 4000, cada uno de (a), (c) , (g' ) y (j) como cero, (h) es un Xs como -CH2-CH2-CH2-C(0) ~NH-CH2-CH2-NH- C (O) -CH2-CH2- , y Z como , resulta en un polímero que tiene la siguiente estructura: (Fórmula Illd) en donde cada (m) es 2 hasta 4000. Reactivos poliméricos adicionales de la invención son como sigue: 89 ?? en donde todas las variables son como previamente se definen, en donde cada (n' ) es 0-100, más preferiblemente 0-40, y más preferiblemente 0-20. En ciertos ejemplos, los reactivos poliméricos de la invención no incluyen una porción de cetona, es decir, una porción en donde dos átomos de carbono separados están cada uno unidos a un átomo de carbono de una porción de 1 o carbonilo. Además, se prefiere que la porción -N-C- no sea parte de una estructura anillada (tal como maleimida) en R o algunos ejemplos. Sin embargo, se prefiere que la -N—C—O- sea más cercana al polímero soluble en agua que el grupo reactivo, como se mide, por ejemplo, en términos de los números de átomos requeridos para alcanzar el grupo reactivo partiendo del átomo próximo en el polímero soluble en agua comparado al número de átomos para alcanzar el grupo reactivo partiendo del átomo próximo en el grupo reactivo. La invención también incluye un método para preparar los reactivos poliméricos proporcionados en este documento. El método comprende las etapas de (i) proporcionar una molécula precursora que comprende de un grupo reactivo protegido (o grupo reactivo no protegido es tal grupo reactivo que puede permanecer inalterado cuando se llevan a cabo las etapas del método) o un precursor para un grupo reactivo y uno o más grupos hidroxilo. Algunas moléculas precursoras que están comprendidas de un grupo reactivo protegido o un grupo reactivo precursor y uno o más grupos hidroxilo, pueden ser obtenidas comercialmente . Además, las formas no protegidas de la molécula precursora puede ser sintetizadas y después protegidas (si es necesario) usando técnicas convencionales. Aunque existen muchas formas de moléculas precursoras adecuadas, y la invención no se limita en este sentido, una molécula precursora preferida tiene dos grupos hidroxilo. Un ejemplo de una molécula precursora adecuada preferida corresponde a la Fórmula (IV) abajo.
(Fórmula IV) en donde PG es un grupo protector. Este reactivo puede ser preparado sintéticamente, como se describe, por ejemplo, el Ejemplo 1. Ejemplos de grupos protectores preferidos incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de metilo, etilo, t-butilo y bencilo. Un grupo protector preferido particularmente es metilo. Un método para preparar un reactivo polimérico de conformidad con la presente invención incluye la etapa de (ii) activar al menos uno de uno o más grupos hidroxilo de la molécula precursora por reacción con un grupo amino para formar una molécula precursora activada. Aunque cualquier reactivo de activación adecuado conocido en la técnica puede ser usado, se prefiere usar un agente de activación seleccionado del grupo que consiste de carbonato de di (N-succinimidilo) (DSC), ?,?' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) , ?,?' -diisopropilcarbodiimida, N- (3-dimetilaminopropil) - N' etilcarbodiimida, 1, 1' -carboniodiimidazol (CDI) , 1,1'-carbonil (1, 2 , 4-triazol) (CDT) , carbonato de bis(4~ nitrofenil) , clorocarbonato de p-nitrofenilo, 4- dimetilaminopiridina (DMPA) , fosgeno, trifósgeno, 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) , carbonato de dibenzotriazolilo (diBTC) , N-hidroxisuccinimida y DCC, N-hidroxiftalimida y DCC, y tiazolidin tiona. De forma típica se agrega el agente de activación a un recipiente que contiene la molécula precursora, de este modo, el agente de activación se deja entrar en contacto con uno o más de los grupos idroxilo de la molécula precursora. Otra etapa del método para preparar los reactivos poliméricos de la invención incluye (iii) poner en contacto bajo condiciones de acoplamiento covalente al menos uno de uno o más grupos de hidroxilo activado con un polímero soluble en agua que tiene un grupo amino, con ello formar un polímero que comprende de la porción del polímero soluble en agua y el grupo o precursor reactivo protegido para un grupo reactivo. Aquellos de habilidad ordinaria en la pueden determinar a través de la experimentación de rutina, dichas condiciones de pH, temperatura, y así sucesivamente apropiadas para lograr un acoplamiento covalente. Por ejemplo, la etapa de acoplamiento puede ser conducida varias veces, cada vez bajo una serie diferente de condiciones (por ejemplo, diferentes pH, diferentes temperaturas, solventes, etc.). Para determinar la cantidad del polímero comprendida de la porción de polímero soluble en agua y el grupo reactivo protegido (por, por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño) que resulta de cada serie de condiciones, es posible determinar dichas series de condiciones que son más apropiadas para llevar a cabo la etapa de acoplamiento. Aunque, pueden ser usados muchos más polímeros solubles en agua que tienen un grupo amina, se prefiere particularmente usar uno de los siguientes polímeros : O H3C-(OCH2CH2)-0-C- CH2|— N-H H ü - 2 I H HMN—- HCHHAn--OCHI-W2-(nOrCiHH2rC.lH-U2)- — -H M H , v m en donde (m) es 2 hasta 4000. Se pueden sintetizar polímeros solubles en agua que tienen un grupo amina de novo usando técnicas bien conocidas por aquellos expertos ordinarios en la técnica y pueden ser obtenidos comercialmente a través de proveedores tales como Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) . Cuando un grupo protector está presente en la molécula precursora, el método para preparar los reactivos poliméricos también incluye la etapa de (iv) desproteger el grupo reactivo protegido, con ello formar el polímero. La etapa de desprotección puede ser llevada a cabo usando cualquier procedimiento adecuado para remover al grupo protegido particular. Para cualquier grupo protegido específico, debe ser bien conocido un procedimiento de desprotección apropiado por aquellos expertos ordinarios en la técnica. Además, los procedimientos de desprotección adecuados se describen en la literatura relevante, tal como, por ejemplo, Greene et al., supra. Un método preferido para desproteger un grupo del ácido protegido como un grupo éster de alquilo (por ejemplo, un. éster de metilo) es exponer la molécula que porta el grupo protegido a una hidrólisis catalizada con una base. Ejemplos de bases adecuadas para agregarse al recipiente de reacción que contiene la molécula que porta el grupo reactivo protegido incluyen, sin limitación, hidróxidos orgánicos tales como un hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y sales metálicas de ácidos débiles tales como acetato de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, fosfato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, citrato de potasio, acetato de potasio, y así sucesivamente. La hidrólisis catalizada por ácido también puede ser afectada con orto ásteres a pesar que uno puede usar una combinación de hidrólisis catalizada por ácido seguida por hidrólisis catalizada por base con aquellos derivados. Con cetales, la hidrólisis catalizada por ácido es eficiente mientras que la hidrólisis catalizada por base es inefectiva. Con ésteres de bencilo o éteres de bencilo, la reducción catalítica es efectiva a pesar que la hidrólisis catalizada por ácido o base es también efectiva con los ésteres . El método para preparar los reactivos poliméricos opcionalmente comprende una etapa adicional de, aislar el reactivo polimérico una vez que se formó. Pueden ser usados métodos conocidos para aislar el polímero, pero es particularmente preferido usar la cromatografía, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de exclusión de tamaño. De forma alternativa o adicional, el método incluye la etapa de purificar el polímero una vez que se forma. Nuevamente, pueden ser usados métodos de purificación conocidos en la técnica estándar para purificar el polímero. Para cualquier polímero dado, preparado por el presente método, el método ventajosamente proporciona la capacidad de transformar adicionalmente al polímero (ya sea antes o subsecuentemente a cualquier etapa de desprotección) , de manera que porta un grupo reactivo específico. Así, usando técnicas bien conocidas en el arte, el polímero puede ser funcionalizado para incluir un grupo reactivo (por ejemplo, éster activo, tiol, maleimida, aldehido, cetona, etc.). Se llevan a cabo varias etapas para elaborar un reactivo polimérico en un solvente adecuado. Uno de habilidad ordinaria en la técnica puede determinar si cualquier solvente específico es apropiado para cualquier etapa de reacción proporcionada. A menudo, sin embargo, el solvente es preferiblemente un solvente no polar o un solvente polar. Ejemplos no limitantes de solventes no polares incluyen benceno, xileno y tolueno. Solventes no polares particularmente preferidos incluyen tolueno, xileno, dioxano, tetrahidrofurano y alcohol t-butílico. Solvente polares ejemplares incluyen, pero no se limitan a, dioxano, tetrahidrofurano (THF) , alcohol t-butílico, DMSO (sulfóxido de dimetilo) , HMPA (hexametilfosforamida) , DMF (dimetilformamida) , DMA (dimetilacetamida) y NMP (N- metilpirrolidinona) . La presente invención también puede incluir conjugados que comprende una porción del polímero soluble R1 o en agua, una porción -N I-cI!-o- y un agente farmacológicamente activo. Los conjugados tienen la siguiente orientación estructural interna: (i) la porción del polímero soluble en agua está enlazada al átomo de nitrógeno de la porción a través de un enlace covalente directo o a través de una primer porción espaciadora; (ii) el agente farmacológicamente activo está enlazado al átomo de carbón carbonilo de la porción -Ñ-c-o-| a través de ya sea un enlace covalente directo o una segunda porción espadadora; y (iii) 1 es H o un radical orgánico. Cuando únicamente un polímero soluble en agua único está presente en la estructura total del conjugado, la estructura del conjugado preferiblemente corresponderá a la Fórmula V: Activo (Fórmula V) en donde: POLI1 es un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG o mPEG) ; (a) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (b) es 0, 1, 2 ó 3 (preferiblemente 0 ó 1) ; R1 es H o un radical orgánico (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; X1, cuando está presente, es una primera porción espadadora; X2, cuando está presente, es una segunda porción espadadora; y Agente activo es un agente farmacológicamente activo . Además, cuando dos polímeros solubles en agua están presente es la estructura total del conjugado, la estructura del conjugado preferiblemente corresponderá a la Fórmula VI : (Fórmula (VI) en donde: POLI1 es un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG o mPEG) ; POLI2 es un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG o mPEG) ; (a) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (b) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (e) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (f) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (g') es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; (h) es 0, 1, 2 ó 3 (y preferiblemente 0 ó 1) ; es 0 hasta 20 (es decir, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Ó 20); cada R1 es independientemente H o un radical orgánico (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido) ; X1, cuando está presente, es una primera porción espadadora; X2, cuando está presente, es una segunda porción espadadora; X5, cuando está presente, es una quinta porción espaciadora; X6, cuando está presente, es una sexta porción espaciadora; X7, cuando está presente, es una séptima porción espaciadora; X8, cuando está presente, en una octava porción espaciadora; R5 es una porción ramificada; y Agente activo es un agente farmacológicamente activo. Los reactivos poliméricos descritos en este documento son útiles para conjugar agentes o superficies biológicamente activas . Grupos preferidos adecuados para reacción con los reactivos poliméricos descritos en este documento son grupos electrofílicos y nucleofílicos . Grupos ejemplares incluyen aminas primarias (por ejemplo, aminas primarias de la cadena lateral de un residuo de lisina o del N-término de un polipéptido) , alcoholes (por ejemplo, un alcohol primario de la cadena lateral de un residuo de serina o treonina) , troles, hidrazinas, hidrazidas y sulf idrilos . Tales grupos adecuados para reaccionar con los reactivos poliméricos descritos en este documento se conocen por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Así, la invención proporciona un método para elaborar un conjugado que comprende la etapa de poner en contacto, bajo condiciones de conjugación, un agente activo con un reactivo polimérico descrito en este documento. Condiciones de conjugación adecuadas son aquellas condiciones de tiempo, temperatura, pH, concentración del reactivo, grupo (s) funcionale (s) del reactivo, grupos funcionales disponibles en el agente activo, solvente y similares suficientes para efectuar la conjugación entre un reactivo polimérico y un agente activo. Como se conoce en la técnica, las condiciones específicas dependen de, entre otras cosas, el agente activo, el tipo de conjugación deseada, la presencia de otros materiales en la mezcla de reacción, y así sucesivamente. Las condiciones suficientes para efectuar la conjugación de cualquier caso particular pueden ser determinadas por uno de habilidades ordinarias en técnica después de leer la descripción en este documento, la referencia a la literatura relevante, y/o a través de experimentación de rutina. Por ejemplo, cuando el reactivo polimérico contiene un éster activo de N-hidroxisuccinimida (por ejemplo, succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo y butanoato de succinimidilo) , y el agente activo contiene un grupo amina (por ejemplo, un grupos amina terminal en un polipéptido y/o amina epsilon de un polipéptido que contiene lisina) , la conjugación puede ser efectuada a un pH de aproximadamente 7.5 hasta aproximadamente 9.5 a temperatura ambiente . Además, cuando el reactivo polimérico contiene un grupo reactivo de vinisulfona o un grupo de maleimida y el agente farmacológicamente activo que contiene un grupo sulfhidrilo (por ejemplo, un grupo sulfhidrilo de un polipéptido que contiene metionina o que contiene cisterna) , la conjugación puede ser efectuada a un pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8.5 a temperatura ambiente. Sin embargo, cuando el grupo reactivo está asociado con el reactivo polimérico es un aldehido o cetona y el agente farmacológicamente activo que contiene una amina primaria, la conjugación puede ser efectuada por aminación reductiva en donde la amina primaria del agente farmacológicamente activo reacciona con el aldehido o cetona del polímero. La aminación reductiva que toma lugar a pH de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 9.5, inicialmente resulta en un conjugado en donde el agente farmacológicamente activo y el polímero están enlazados vía un enlace de amina. El tratamiento subsecuente del conjugado que contiene imina con un agente de reducción adecuado tal como NaCNBH3 que reduce la imina a una amina secundaria. Para información adicional que concierne estas y otras reacciones de conjugación, se hace referencia a Hermanson "Bioconjugate Techniques," Academic Press, 1996. Las condiciones de conjugación ejemplares incluyen la reacción de conjugación que se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 10, a, por ejemplo, un pH de aproximadamente 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 ó 10.0. La reacción se deja proceder desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 72 horas, preferiblemente desde aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 48 horas, y m s preferiblemente, desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 24 horas. La temperatura bajo la cual la conjugación puede tomar lugar es típicamente, aunque no necesariamente, en el intervalo desde aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 40°C, y es a menudo a temperatura ambiente o menos. Las reacciones de conjugación son a menudo llevadas a cabo usando una solución amortiguadora de fosfato, acetato de sodio o un sistema similar Con respecto a la concentración de reactivo, un exceso de reactivo polimérico es típicamente combinado con el agente activo. En algunos casos, sin embargo, se prefiere tener cantidades estequiométricas de grupos reactivos en el reactivo polimérico a los grupos reactivos del agente activo. De este modo, por ejemplo, una mol de agente polimérico que porta dos grupos reactivos se combina con dos moles del agente activo. Relaciones ejemplares de reactivo polimérico a agente activo incluyen relaciones molares de aproximadamente 1:1 (reactivo polimérico: agente activo), 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1 ó 10:1. La reacción de conjugación se deja proceder hasta que no ocurre conjugación substancialmente adicional, la cual puede ser determinada de manera general, monitoreando el progreso de la reacción con el tiempo. El progreso de la reacción puede ser monitoreado retirando alícuotas de la mezcla de reacción en varios puntos de tiempo y analizando la mezcla de reacción por SDS-PAGE o espectrometría de masas MALDI-TOF o cualquier otro método analítico adecuado. Una vez que se ha alcanzado la estabilización con respecto a la cantidad de conjugado formada o la cantidad de reactivo polimérico no conjugado que permanece, la reacción se asume estar completa. Típicamente, la reacción de conjugación toma desde algunos minutos hasta varias horas (por ejemplo, desde 5 minutos hasta 24 horas o más) . La mezcla de producto resultante es preferiblemente, pero no necesariamente purificada, para separar el exceso de reactivo polimérico, reactivos no conjugados (por ejemplo, agente activo) , y especies multi-conjugadas indeseadas. Los conjugados resultantes pueden entonces ser además caracterizados usando métodos analíticos tales como MALDI, electrofóresis capilar, electrofóresis en gel, y/o cromatografía. Los conjugados de agente activo-polímero pueden ser purificados para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. Alternativamente, y más preferiblemente para reactivos poliméricos de peso molecular inferior (por ejemplo, menos de aproximadamente 20,000 Daltons, más preferiblemente menos de aproximadamente 10,000 Daltons), usados para formar conjugados, la mezcla de producto puede ser purificada para obtener la distribución de segmentos de polímeros solubles en agua por agente activo. Por ejemplo, la mezcla de producto puede ser purificada para obtener un promedio de cualquiera de uno, dos, tres, cuatro o cinco uniones del reactivo polimérico por agente activo (por ejemplo, proteína) , típicamente un promedio de aproximadamente uniones por agente activo (por ejemplo, proteína) . La estrategia para purificación de la mezcla de reacción conjugada final, dependerá de un número de factores que incluyen, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, el agente activo particular, el régimen de dosificación deseado y la actividad residual y propiedades in vivo del (los) conjugados individuales. Si se desea, conjugados que tienen diferentes pesos moleculares pueden ser aislados usando cromatografía de filtración en gel . Es decir, se usa cromatografía de filtración en gel para fraccionar reactivos poliméricos diferentemente numerados a relaciones de agentes activos (por ejemplo, 1-mero, 2-mero, 3-mero, etc., en donde "1-mero" indica 1 reactivo polimérico a agente activo, "2-mero" indica dos reactivos poliméricos a agente activo, etc.), en base a sus pesos moleculares diferentes (en donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de los segmentos del polímero soluble en agua) . Por ejemplo, en una reacción ejemplar en donde una proteína de 100,000 Daltons es aleatoriamente conjugada a un PEG ramificado que tiene un peso molecular total de aproximadamente 20,00 Daltons (en donde cada "brazo" de polímero del PEG ramificado tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10,000 Daltons), la mezcla de reacción resultante puede contener proteína no modificada (que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 100,000 Daltons), proteína monoPEGilada (que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 120,000 Daltons), proteína diPEGilada (que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 140,000 Daltons) , etc. Mientras este procedimiento puede ser usado para separar PEG y otros conjugados de agentes activos de polímero que tienen diferentes pesos moleculares, este procedimiento es generalmente inefectivo para separar isómeros posicionales que tienen diferentes sitios de unión de polímero dentro de la proteína. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel puede ser usada para separar de cada una de las otras mezclas de 1-mero, 2-mero, 3-mero etc., de PEG, aunque cada una de las composiciones PEG-mero recuperadas puede contener PEG unidos a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, residuos de lisina) dentro del agente activo. Las columnas de filtración en gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles de ersham Biosciences (Piscataway, NJ) . La selección de una columna particular dependerá del intervalo de fraccionamie to deseado. La elución se lleva a cabo de manera general usando un amortiguador adecuado, tal como fosfato, acetato o similares. Las fracciones colectadas pueden ser analizadas por un numero de diferentes métodos, por ejemplo, (i) densidad óptica (OD) a 280 nm para determinar contenido de proteína, (ii) análisis de proteína de albúmina de suero bovino (BSA) , (iii) pruebas de yodo para determinar contenido de PEG (Sims et a. (1980) Anal. Biochem, 107 : 60-63) , y (iv) electrofóresis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) , seguida por teñido con yoduro de bario. La separación de isómeros posicionales se lleva a cabo por cromatografía de fase inversa usando Columna C18 de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (Fl-CLAR) (Amersham Biosciences o Vydac) , o por cromatografía de intercambio iónico usando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico Sepharose™ disponible de Amersham Biosciences . Cualquier procedimiento puede ser usado para separar isómeros de agentes activos de polímeros que tienen el mismo peso molecular (isómeros posicionales) . Los reactivos polimericos descritos en este documento, pueden estar unidos, ya sea de forma covalente o no covalente, a un número de entidades que incluyen películas, superficies de separación y purificación química, soportes sólidos, superficies de metal tales como oro, titanio, tantalio, niobio, aluminio, acero, y sus óxidos, óxido de silicio, marcomoléculas (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, etc.) y pequeñas moléculas. Adicionalmente , los reactivos polimericos pueden ser usados en sensores bioquímicos, interruptores bioeléctricos y entradas. Los reactivos poliméricos también pueden ser empleados como portadores para síntesis de péptido, para la preparación de superficies revestidas del polímero e injertos de polímero, para preparar conjugados de polímero-ligando por división de afinidad, para preparar hidrogeles reticulados y no reticulados, y para preparar aductos del cofactor de polímero para bioreactores . Un agente biológicamente activo para uso en el acoplamiento a un reactivo polimérico como se presenta en este documento, puede ser uno cualquiera o más de los siguientes. Se pueden seleccionar agentes adecuados de, por ejemplo, hipnóticos y sedativos, energizantes psíquicos, tranquilizadores, fármacos respiratorios, anticonvulsionantes, relajantes musculares, agentes antiparkinson (antagonistas de dopamina) , analgésicos, anti-inflamatorios, fármacos antiansiedad (anxiolíticos) , supresores de apetito, agentes antimigraña, contractantes musculares, anti-infectivos (antibióticos, antivirales, antifúngicos , vacunas) antiarítmicos, antimalaria, antieméticos, anepilépticos, broncodilatadores, citocinas, factores de crecimiento, agentes anti-cancerígenos, agentes antitrombóticos, antihipertensivos, fármacos cardiovasculares, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes anti-asmáticos, agentes hormonales que incluyen anticonceptivos, simpatomiméticos, diuréticos, agentes reguladores de lípidos, agentes antiandrogénicos, antiparasíticos, anticoagulantes, neoplásicos, antineopl sicos, hipoglicémicos, agentes y suplementos nutricionales, suplementos del crecimiento, agentes antienteríticos, vacunas, anticuerpos, agentes diagnóstico y agentes contrastantes. Más particularmente, el agente activo puede caer en un número de clases estructurales, que incluyen pero no se limitan a moléculas pequeñas (preferiblemente moléculas pequeñas insolubles) , péptidos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, polisacáridos, esteroxdes, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, grasas, electrolitos y similares. Preferiblemente, un agente activo para acoplamiento a un reactivo polimérico como se describe en este documento, posee un grupo amino nativo, o alternativamente, es modificado para contener al menos un grupo amino reactivo adecuado para conjugarse a un reactivo polimérico descrito en este documento. Ejemplos específicos de agentes activos adecuados para unión covalente incluyen pero no se limitan a agalsidasa, alefacept, asparginasa, amdoxovir (DAPD) , antida, becaplermina, calcitoninas, cianovirina, diftitox denileucina, eritropoyetina (EPO) , agonistas EPO (por ejemplo, péptidos de aproximadamente 10-40 aminoácidos en longitud y que comprenden una secuencia central particular como se describe en el documento WO 96/40749) , alfa dornasa, eritropoiesis que estimula la proteína (NESP) , factores de coagulación tales como el Factor V, Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XII, Factor XIII, factor von Willebrand; ceredasa, cerezima, alfa-glucosidasa, colágeno, ciclosporina, alfa defensis, beta defensis, desmopresina, exedin-4, factor que estimula la colonia de granulocitos (GCSF) , trombopoyetina (TPO) , inhibidor de proteinasa alfa-1, elcatonina, factor que estimula la colonia macrófago del granulocito (GMCSF) , fibrinógeno, filgrastim, hormona del crecimiento humano (hGH) , somatropina, hormona de liberación de la hormona del crecimiento (GHRH) , GRO-beta, anticuerpo GRO-beta, proteínas morfogénicas óseas tales como proteína-2 morfogénica ósea, proteína-6 morfogénica ósea, OP-1; factor de crecimiento de fibroblasto acídico, factor de crecimiento de fibroblasto básico, ligando CD-40, heparina, albúmina de suero de humano, heparina de peso molecular bajo (LMWH) , xnterferonas tales como alfa interferona, beta interferona, gamma interferona, omega interferona, tau interferona, interferona consenso; interleucinas y receptores de interleucinas tales como receptor de interleucina-1, interleucina-2 , proteínas de fusión de interleucina-2, antagonista del receptor de interleucina-1, interleucina-3 , interleucina-4 , receptor de interleucina- , interleucina-6, interleucina-8 , interleucina-12, receptor de interleucina-13 , receptor de interleucina-17; lactoferrina y fragmentos de lactoferrina; hormona de liberación de la hormona leutinizante (LHRH) , insulina, pro-insulina, análogos de insulina (por ejemplo, insulina mono-acilada como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,992,675), amilina, péptido C, somatostatina, análogos de somatostatina que incluyen octreotida, vasopresina, hormonas que estimulan el folículo (FSH) , vacuna de influenza, factor del crecimiento similar a la insulina (IGF) , insulintropina, factor que estimula la colonia de macrófagos (M-CSF) , activadores de plasminógeno tales como alteplasa, urocinasa, reteplasa, estreptocinasa, pamiteplasa, lanoteplasa y teneteplasa; factor del crecimiento del nervio (NGF) , osteoprotegrina, factor de crecimiento derivado de plaqueta, factores de crecimiento del tejido, factor-1 de crecimiento de transformación, factor de crecimiento endotelial vascular, factor que inhibe la leucemia, factor de crecimiento de queratinocito ( FG) , factor de crecimiento glial (GGF) , receptores de célula T moléculas CD/antígenos, factor de necrosis de tumor (TNF) , proteina-l quimioatrayente de monocito, factores de crecimiento endotelial, hormona paratiroides (PHT) , péptido similar a glucagona, somatotropina, alfa-1 alfa timosina, rasburicasa, inhibidor alfa 1 Ilb/lIIa timosina, beta 10 timosina, beta 9 timosina, beta 4 timosina, antitripsina alfa-1, compuestos de fosfodiesterasa (PDE) , VLA-4 (antígeno-4 muy tardío) , inhibidores VLA-4, bisfosponatos, anticuerpo del virus sincitial respiratorio, gen regulador de transmembrana de fibrosis cística (CFTR) , desoxiribonucleasa (Dnase) , proteina que incrementa la actividad bactericida/permeabilidad (BPI) y anticuerpo anti-CMV. Anticuerpos monoclonales ejemplares incluyen etanercepto (una proteina de fusión dimérica que consiste de la porción que enlaza al ligando extracelular del receptor TNF de 75 kD humano similar a la porción Fe de IgGl) , abciximab, adalimimab, afeliomomab, alemtuzumab, anticuerpo a linfocito-B, altizumab, basiliximab, bevacizumab, biciromab, bertilimumab, CDP-571, CDP-870, cetuximab, clenoliximab, daclizumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, epratuzumab, fontolizumab, gavilimomab, gemtuzimab ozogamicina, tiuexetano de ibritumomab, infliximab, inolimomab, celiximab, labetuzumab, lerdelimumab, olizumab, lim-1 radioetiquetado, metelimumab, mepolizumab, mitumomab, muromonad-CD3 , nebacumab, natalizumab, odulimomab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, pemtumomab, pexelizumab, rhuMA -VEGF, rituximab, pendetido de satumomab, servirumab, siplizumab, tositumomab, I131 tositumomab, trastuzumab, tuvirumab y visilizumab.
Agentes adicionales adecuados para unión covalente incluyen, pero no se limitan a tacrina, memantina, rivastigmina, galantamina, donepecil, levetiracetam, repaglinida, atorvastatina, alefacept, tadalafil, vardenafil, sildenafil, fosamprenavir, oseltamivir, valaciclovir y valganciclovir, avarelix, adefovir, alfuzosina, alosetron, amifostina, amiodarona, ácido aminocapriónico, sodio de aminohipurato, aminoglutetimida, ácido aminolevuliníco, ácido aminosalicílico, amlodipina, amsacrina, anagrelida, anastrozol, aprepitant, aripiprazol, asparaginasa, atazanavir, atomoxetina, antraciclinas , bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, bortezomib, buserelina, busulfan, cabergolina, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucina, cilastatino sódico, cisplatino, cladribina, clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, camptotecinas, ácido retinoico 13-cis, todos los ácidos retionoicos trans; dacarbazina, dactinomicina, daptomicina, daunorubicina, deferoxamina, dexametasona, diclofenac, dietilstilbestrol, docetaxel, doxorubicina, dutasterida, eletriptan, emtricitabina, enfuvirtida, eplerenona, epirubicina, estramustina, etinil estradiol, etoposido, exemestano, ezetimiba, fentanil, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, fluticazona, fondaparinux, fulvestrant, gamma- hidroxibutirato, gefitinib, gencitabina, epinefrina, L-Dopa, hidroxiurea, icodextrina, idarubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecano, itraconazol, goserelina, laronidaso, lansoprazol, letrozol, leucovorina, levamisol, lisinopril, lovotiroxina sódica, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalan, memantina, mercaptopurina, mequinol, metaraminol bitartrato, metotrexato, metoclopramida, mexiletina, miglustat, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, modafinil, naloxona, naproxen, nevirapina, nicotina, nilutamida, nitazoxanida, nitisinona, noretindrona, octreótido, oxaliplatino, palonosetron, pamidronato, pemetrexed, pergólido, pentostatina, pilcamicina, porfimer, prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetron, palonosetron, oxaliplatino, raltitrexed, rosuvastatina, sirolimus, estreptozocina, pimecrolimus, sertaconazol, tacrolimus, tamoxifen, tegaserod, temozolomido, tenipósido, testosterona, tetrahidrocanabinol, talidomida, tioguanina, tiotepa, tiotropium, topiramato, topotecano, treprostinil, tretinoina, valdecoxib, celecoxib, rofecoxib, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, voriconazol, dolasetron, granisetron, formoterol, fluticasona, leuprólido, midazolam, alprazolam, amfotericina B, podofilotoxinas, nucleósidos antivirales, aroil hidrazonas, sumatriptan, eletriptan; macrólidos tales como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiromicina, midecamicina, loratadina, desloratadina, leucomicina, miocamicina, roquitamicina, andazitromicina, y swinólidos A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina, alatrofloxacina, moxifloxicina, norfloxacina, enoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, grepafloxacina, lomefloxacina, sparfloxacina, temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina, y sitafloxacina; aminoglicósidos tales como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amicacina, canamicina, neomicina, y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato; polimixinas tales como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penemos; penicilinas que incluyen agentes sensibles a penicilinasa como penicilina G, penicilina V; agentes resistentes a penicilinasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; agentes activos de microorganismos gram-negativos como ampicilina, amoxicilina, y hetacilina, cilina, y galampicilina; penicilinas antipseudomonales como carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, y piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozil, ceftbuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefradrina, cefoxitina, cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxil, cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetrilo, cefepima, cefixima, cefonicid, cefoperazona, cefotetan, cefmetazol, ceftazidima, loracarbef, y moxalactam, monobactamas como aztreonam; y carbapenemos tales como imipenemo, meropenemo, y ertapenemo, isetionato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaína, sulfato de metaproterenol, diprepionato de beclometasona, acetamida de triamcinolona, acetónido de budesónido, salmeterol, bromuro de ipratropio, flunisólido, cromolln sódico, y tartrato de ergotamina; taxanos tales como paclitaxel; SN-38, y tirfostinas. Moléculas pequeñas preferidas para acoplarse a un polímero como se describe en este documento, son aquellas que tienen al menos un grupo amino que se originan de forma natural . Moléculas preferidas tales como aquellas que incluyen sodio de aminohipurato, amfotericina B, doxorubicina, ácido aminocaproxco, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, bitartrato de metaraminol, disodio de pamidronato, daunorubicina, sodio de levotiroxina, lisinoprilo, sodio de cilastatina, mexiletina, cefalexina, deferoxamina, y amifostina.
Péptidos o proteínas preferidos para acoplamiento a un reactivo polimérico como se describe en este documento incluyen EPO, ???-a, IFN-ß, IFN consenso, Factor VIII, Factor VIII suprimido del dominio B, Factor IX, GCSF, GMCSF, hGH, insulina, FSH, péptidos que tienen actividad GLP-1, desmopresina, amdoxivir y PTH. Los anteriores agentes biológicamente activos significan abarcar, donde sea aplicable, análogos, agonistas, antagonistas, inhibidores, isómeros y formas salinas del mismos farmacéuticamente aceptables. Con referencia a péptidos y proteínas, la invención pretende abarcar formas sintéticas, recombinantes, nativas, glicosiladas y no glicosiladas, así como también fragmentos de los mismos biológicamente activos. Además, el término "agente activo" está propuesto para abarcar el agente activo previo a la conjugación así como también el "residuo" de agente activo después de la conjugación. Un agente farmacológicamente activo particularmente preferido es un péptido que tiene actividad agonista o antagonista al receptor del péptido similar a glucagona (GLP-1) . El GLP-1 y sus derivados agonistas farmacológicamente activos de los mismos, estimulan la secreción de insulina por células beta e inhiben la secreción de glucagona in vivo. Tales agonistas para el receptor GLP-1 son útiles en la regulación de la producción de insulina. Ejemplos de agentes relacionados con GLP-1 que son útiles como conjugados incluyen, sin limitación los siguientes: GLP-1 nativo, exendina-3, exendina-4, exendina-4 (1-30) ; exendina-4 (1-31) amida; exendina-4 (1-28) amida; "Leu, 5Phe exendina-4 amida; 14Leu, 25Phe exendina-4 (1-28) amida; 1Leu, 22Ala, 5Phe exendina-4 (1-28) amida, o derivados de los mismos farmacológicamente activos . Estos y otros agentes que tienen actividad agonista para el receptor GLP-1 se describen en el documento W099/07404 e incluyen agentes que tienen una estructura que corresponde a la fórmula general Xaai Xaa2 Xaa3 Gly Thr Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Ser Lys Gln Xaa9 Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Xaa10 Xaan Xaai2 Xaai3 Leu Lys Asn Gly Gly Xaai Ser Ser Gly Ala XaaX5 XaaX6 Xaa17 Xaa18 -Z, (SEC. ID. NO. : 1) en donde: Xaai es His, Arg o Tyr; Xaa2 es Ser, Gly, Ala o Thr; Xaa3 es Asp o Glu; Xaa es Phe, Tyr o naftilalanina; Xaa5 es Thr o Ser; Xaa6 es Ser o Thr; Xaa7 es Asp o Glu; Xaa8 es Leu, Ide, Val, pentilglicina o Met; Xaa9 es Leu, lie, pentilglicina, Val o Met; Xaaio, es Phe, Tyr o naftilalanina; Xaaxl es lie, Val, Leu, pentilglicina, terc-butilglicina o Met; Xaai2 es Glu o Asp; Xaa13 es Trp, Phe, Tyr, o naftilalanina; Xaai4, Xaa15, Xaa16 y Xaai7 son independientemente Pro, homoprolina, 3Hyp, 4Hyp, tioprolina, N-alquilglicina, N- alquilpentilglicina, N-alquilalanina; Xaa18 es Ser, T r o Tyr; y Z es -OH o -NH2. Otros agonistas GLP-1 se describen en la Patente Estadounidense No. 6,583,111. Agonistas particularmente preferidos descritos en esta referencia incluyen NH2-His7-Ala-Glu-Glyl10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH (SEC ID NO: 2), NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp- Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-N¾ (SEC ID NO: 3), y NH2-His7-Val -Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH (SEC ID NO : 4) Ejemplos adicionales de agentes que son útiles como conjugados, incluyen, pero sin limitación, a aquellos descritos en el documento WO 01/23420. Como se describe en este documento, muchos de los siguientes polipéptidos pueden ser elaborados por técnicas sintéticas a base de estado sólido convencionales (como se describe en Peptide Synthesis Protocole (1994) , Volumen 35 por icheal . Pennington & Ben . Dunn) y/o por técnicas basadas recombinantes . Secuencias particularmente preferidas incluyen: Ac-HSDAVFTENYTKLRKQNIeAAKKYLNDLKKGGT-NH2 5 Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAA KYLNDLKKGGT-NH2 6 Ac-HSDAVFTE YTKLRKQLAA YLNDLKKGGT 7 HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT 8 Ac-HSDAVFIEN(CH30-Y)TKLl^QMeAA YLl^LKK-NH2 9 HSDAVFTENYTKLRKQLAA KYLNDL 10 HSDAVFTDNYTRLRKQMAVK YLNSIK -NH2 11 HSDAVFTONYTRLRKQMAVKKYLNSIK GGT 12 HSDAVFTENYTKLRKQLAA YLNDLLNGGT 13 HSDAVFTONYTKLRKQLAAKXYLNDILNGGT 14 HSDAVFTONYTRLRKQLAAKKYLNDI KGGT 15 HSDAVFTDNYTRLRKQLAA KYL DIKK-NH2 16 HSDAVFTDNYTRLRKQMAVK YLNDLKKGGT 17 IISDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLK GGTSWCEPGWCR 18 HSDAVFTDNYTRLRKQMAAK YLNDIK GGT 19 HSDAVFTDNYTRLRKQLAV KYLNDIK GGT 20 HSDAVFTDNYTRLRKQLAAK YLNSI KGGT 21 HSDAVFTDNYTRLRKQLAAK YLNDIKNGGT 22 HSDAVFTOlSrY^T¾LRKQLAVKKYLNSIKKGGT 23 HSDAVFTDNYTRLPvKQMAAK YLNSI KGGT 24 HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDI NGGT 25 HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSI NGGT 26 HSD AVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDI GG 27 HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIIKG 28 HSDAVFTDNYTRLRKQLAAK YLNDIKK 29 HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIK Q 30 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HSDAVFTONYTRLRKQMARK YLNSIRNRI HSDAVFTDlSrm^RKQMASKKYLNSIRNRI Se describen ejemplos adicionales de agonistas del péptido que tienen actividad GLP-1 en la Patente EstadounidenseNo. 6,528,486 y que incluyen, por ejemplo, H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser- (Lys) 6- H2 (SEC ID NO: 342) , H-Lys6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-P e-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- et-Gl -Glu-Glu-Ala-V al-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser- (Lys)s-NH2 (SEC ID NO: 343), H-His-Gly-Glu-Gly-T r-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lie-Glu-Trp-Le -Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2 (SEc ID NO: 344) , H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- et-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2 (SEC ID NO: 345) , H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2 (SECQ ID NO: 346) , H~His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val~Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser- (Lys) 6-NH2 (SEC ID NO: 347), H- (Lys) 6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- et-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P e-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser- (Lys) s-NH2 (SEC ID NO: 348), y H-Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-T r-P e-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser- (Lys)6-NH2 (SEC ID NO: 349) . Todas las abreviaturas de aminoácido usan formas convencionales y comúnmente aceptadas, como sigue: Penilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es lie o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Aspargina es Asn o N; Lysina es Lys o K; Ácido Aspartico es Asp o D; Ácido Gutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptofano es Trp o W; Argina es Arg o R; y Glicina es Gly o G. Los péptidos acetilados poseen el prefijo wAc" . La presente invención también incluye preparaciones farmacéuticas que comprende un conjugado como se proporcionó en este documento con un excipiente farmacéutico. De forma general, el conjugado puede ser en forma sólida (por ejemplo, un precipitado) , el cual puede ser combinado con un excipiente farmac ticamente adecuado que puede estar ya sea en forma sólida o líquida. Excipientes ejemplares incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados del grupo que consiste de carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, amortiguadores, ácidos, bases y combinaciones de los mismos. Pueden estar presentes como un excipiente un carbohidrato tal como un azúcar, un azúcar derivatizada tal como un aditol, ácido aldonico y un azúcar esterificada y/o un polímero de azúcar. Excipientes de carbohidratos específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tal como fructuosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares: disacáridos, tal como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tal como rafinosa, melezitosa, maltodextrina, dextranos, almidones y similares; y aditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol) , sorbitol de piranosilo, mioinositol, y similares. El excipiente también puede incluir una sal o amortiguador inorgánico tal como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dib sico y combinaciones de los mismos. La preparación también puede incluir un agente antimicrobiano para prevenir o detener el crecimiento microbiano. Ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para presente invención incluyen cloruro de banzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato de fenilmercúrico, timersol y combinaciones de los mismos. También puede estar presente un antioxidante en la preparación. Se usa un antioxidante para prevenir la oxidación, con ello previene el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Antioxidantes adecuados para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxi olueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol , galato de propilo, bisulfito de sodio, formaldehído de sodio sulfoxilado, metabisulfito de sodio y combinaciones de los mismos. Puede estar presente un tensioactivo como un excipiente. Tensioactivos ejemplares incluyen: polisorbatos, tal como wTween 20" y "T een 80", Y plurónicos tal como F68 y F88 (ambos de los cuales están disponibles de BASF, ount Olive, New Jersey) ; esteres de sorbitan; lípidos tales como fosfolípidos tal como lecitina y otros polisacáridos, fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma liposómica) , ácidos grasos y esteres grasos; esteroides, tal como colesterol; y agentes guelantes, tal como EDTA, zinc y otros cationes adecuados. Pueden estar presentes ácidos o bases como un excipiente en la preparación. Ejemplos no limitantes de ácidos que pueden ser usados incluyen aquellos ácidos seleccionados del grupo que consiste de ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido percloriro, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de los mismos. Ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consiste de hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formiato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumarato de potasio y combinaciones de los mismos. Las composiciones farmacéuticas abarcan todo tipos de formulaciones y en particular, aquellas que son adecuadas por inyección, por ejemplo, polvos que pueden ser reconstituidos así como suspensiones y soluciones. La cantidad del conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el polímero se describe en este documento) en la composición variará dependiendo del número de factores, pero opcionalmente será una dosis terapéuticamente efectiva cuando la composición es almacenada en una unidad de dosis del contenedor (por ejemplo, un vial) . Además, la preparación farmacéutica puede ser alojada en una jeringa. Una dosis terapéuticamente efectiva puede ser experimentalmente determinada por administración repetida de cantidades incrementadas del conjugado para determinar dicha cantidad que produce un punto final clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y en las necesidades particulares de la composición. De forma típica, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina a través de la experimentación de rutina, es decir, preparando las composiciones que contienen variación de cantidades del excipiente (que varían de bajo a alto) , examinando la estabilidad y otros parámetros, y después determinando el intervalo al cual la realización óptima es alcanzada sin efectos adversos significantes . De forma general, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 99% en peso, preferiblemente de aproximadamente 5%-98% en peso, más preferiblemente de aproximadamente 15-95% en peso del excipiente, con concentraciones menores de 30% en peso más preferidas. Estos excipientes farmacéuticos anteriores junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy" , 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference" , 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ(1998), y ibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edición, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención son típicamente, aunque no necesariamente, administradas vía inyección y son por lo tanto generalmente soluciones o suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. La preparación farmacéutica puede también tomar otras formas tales como jarabe, cremas, ungüentos, tabletas, polvos y similares. También se incluyen otras formas de administración, tales como pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosal , oral, intratecal, subcutánea, intra-arterial y así sucesivamente. Como previamente se describe, los conjugados pueden ser administrados inyectados parenteralmente por vía intravenosa, o menos preferiblemente por inyección intramuscular o por subcutánea. Tipos de formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para fácil inyección, polvos secos para combinación con un solvente antes del uso, suspensiones para fácil inyección, composiciones insolubles secas para combinación con un vehículo antes del uso, y emulsiones y concentrados líquidos para dilución antes de la administración, entre otros. La invención también proporciona un método para administrar un conjugado como se proporciona en este documento, a un paciente que sufre de una condición que es responsable del tratamiento con un conjugado. El método comprende administrar, de forma general vía inyección, una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado (preferiblemente se proporciona como parte de una preparación farmacéutica) . El método de administración puede ser usado para tratar cualquier condición que puede ser curada o prevenida por administración del conjugado particular. Aquellos expertos ordinarios en la técnica apreciaran condiciones las cuales pueden ser tratadas efectivamente con un conjugado específico. La dosis a ser administrada variará dependiendo de la edad, peso y condición general del sujeto así como de la severidad de la condición a ser tratada, la opinión del profesional del cuidado de la salud, y conjugados a ser administrados. Se conocen cantidades terapéuticamente efectivas por aquellos expertos en la técnica y/o se describen en los textos y literatura de referencia pertinente. De forma general, una cantidad terapéuticamente efectiva variará de aproximadamente 0.001 mg hasta 100 mg, preferiblemente en dosis de 0.01 mg/día hasta 75 mg/día, y más preferiblemente en dosis de aproximadamente 0.10 mg/día hasta 50 mg/día. La unidad de dosificación de cualquier conjugado proporcionado (nuevamente, preferiblemente se proporciona como parte de una preparación farmacéutica) puede ser administrada en una variedad de esquemas de dosificación dependiendo de la opinión del médico, necesidades del paciente y así sucesivamente. El esquema de dosificación específica será conocido por aquellos expertos ordinarios en la técnica o puede ser determinado experimentalmente usando métodos de rutina. Los esquemas de dosificación ejemplares incluyen, sin limitación, administración cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces diarias, una vez diaria, tres veces semanalmente, dos veces semanalmente, una vez semanalmente , dos veces mensualmente, una vez mensualmente y cualquier combinación de las mismas . Una vez que el punto final clínico se ha logrado, la dosificación de la composición es interrumpida. Una ventaja de la administración de los conjugados de la presente invención es que las porciones del polímero soluble en agua individuales pueden ser desdobladas. Tal resultado es ventajoso cuando la separación del cuerpo es potencialmente un problema debido al tamaño del polímero. De forma óptima, el desdoblamiento de cada porción de polímero soluble en agua es facilitada a través del uso de enlaces de desdoblamiento fisiológico y/o enzimáticamente degradables tales como uretano, amida, carbonato o enlaces que contienen éster. En esta forma, la separación del conjugado (vía desdoblamiento de las porciones del polímero soluble en agua individual) puede ser modulada seleccionando el tamaño molecular del polímero y el tipo de grupo funcional que proporciona las propiedades de separación deseadas . Un experto ordinario en la técnica puede determinar el tamaño molecular apropiado del polímero así como el desdoblamiento del grupo funcional. Por ejemplo, un experto ordinario en la técnica, usando experimentación de rutina, puede determinar un tamaño molecular apropiado y desdoblamiento del grupo funcional para la primera preparación de una variedad de derivados del polímero con pesos de polímero diferentes y desdoblamiento de grupos funcionales, y después obtener el perfil de separación (por ejemplo, a través del muestreo periódico de orina o sangre) administrando el derivado del polímero a un paciente y tomando muéstreos periódicos de orina y sangre. Se han obtenido una serie de perfiles de separación para cada conjugado probado, un conjugado adecuado puede ser identificado. Se entenderá que mientras la invención se ha descrito en conjunto con las modalidades específicas preferidas de esta, tal descripción precedente así como los ejemplos que siguen, están propuestos para ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención.
Todos los artículos, libros, patentes, solicitudes de patentes y publicaciones referenciados en este documento se incorporan por referencia en su totalidad.
EXPERIMENTAL La práctica de la invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de síntesis orgánicas y similares, las cuales están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas son completamente explicadas en la literatura. Véase, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992) , supra. En los siguientes ejemplos, se hacen esfuerzos para asegurar exactitud con respecto a números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero se debe considerar algún error y desviación experimental . A menos que se indique de otra forma, las temperatura están en grados C y la presión está en o cerca de la presión atmosférica a nivel del mar. Todos los reactivos se obtienen comercialmente a menos que se indique de otro modo. Se usan en este documento las siguientes abreviaturas y en otra parte de la especificación.
Ejemplo 1 Preparación de una Molécula Precursora a Base de Gl cerol una molécula precursora a base de glicerol (Compuesto 8-02) Se secó azeotrópicamente destilando completamente de tolueno, una solución de cis-1, 3-O-bencildenglicerol (7.2 g, 0.0040 moles) (Sigma-Aldrich Corporation, St . Louis, MO) en tolueno (100 mi) . El compuesto seco se disolvió en tolueno anhidro (100 mi) y se agregó 1.0 de una solución de terc-butóxido de potasio en terc-butanol (60 mi, 0.060 moles) y 1- (3-bromopropil) -4-metil-2, 6, 7- trioxabiciclo[2,2,2]octano (14.0 g, 0.0558 moles) y la mezcla se agitó durante la noche a 100 °C bajo atmósfera de argón. La mezcla se filtró y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida proporcionando 15.7 g del producto sólido (Compuesto 5-02) . RMN (d6-DMSO) : 0.74 ppm (s, 3H) , 1.61 ppm (m, 4H) , 1.88 ppm (m, 2H) , 3.44 ppm (t, 2H) , 3.81 ppm (s, 6H) , 4.05 ppm (m, 4H) , 5.55 ppm (s, 1H) , 7.37 ppm (m, 5H) . De forma esquemática, la reacción se representa como sigue: Cis-l,3-0-bencil- 1- (3-bromopropil) -4-metil- Compuesto 5-02 idenglicerol 2,6,7- trioxabiciclo[2,2,2]octano Hidrólisis de 5-02. Se disolvió el compuesto 5-02 (15.0 g) en una mezcla de acetonitrilo (150 mi) y agua destilada (35 mi) . Después, se agregó una solución al 10% de H3PO4 para ajustar el pH a 4.5. La mezcla se agitó por 1 hora a pH = 4.5. Se agregó NaCl (2 g) y el pH se ajustó a 7.5. El producto se extrajo con CH2C12 (600 y 150 mi) . El extracto se secó (MgS04) y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida para proporcionar un producto sólido (Compuesto 6-02) . El rendimiento se determinó para ser 14.2 g. RMN (de-DMSO) : 0.78 ppm (s, 3H) , 1.79 ppm (m, 2H) , 2.41 ppm (t, 2H) , 3.25 ppm (m, 6H) , 3.49 ppm (t, 2H) , 4.05 ppm (m, 4H) , 4.48 ppm (t, 3H) , 5.56 ppm (s, 1H) , 7.37 ppm (m, 5H) . De forma esquemática, la reacción se representa como sigue : Compuesto 5-02 Compuesto 6-02 Se disolvió el compuesto 6-02 (14.2 g) en una mezcla de acetonitrilo (80 mi) y agua destilada (80 mi) . Después, se agregó una solución al 6% de NaOH para ajustar el pH a 12.5. La solución se agitó por 5.5 horas a pH que varía de 12.3-12.8, el cual se mantuvo por adición periódica de una solución al 6% de NaOH. Se agregó NaCl (5g) y el pH se ajustó a 7.5 con H3P0 al 5%. Las impurezas no acídicas se extrajeron con CH2C12 (dos tratamientos, uno primero usando 300 mi y uno segundo usando 200 mi) . El pH de la solución se ajustó a 3 con H3P04 y el producto se extrajo con CH2C12 (dos tratamientos, uno primero usando 200 mi y uno segundo usando 100 mi) . El extracto se secó (MgS04) y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. El producto resultante (Compuesto 7-02) tiene un rendimiento de 8.7 g. RMN (d6-DMS0) : 1.76 ppm (m, 2H) , 2.31 ppm (t, 2H) , 3.46 ppm (t, 2H) , 4.05 ppm (m, 4H) , 5.56 ppm (s, 1H) , 7.37 ppm (m, 5H) . De forma esquemática, la reacción se representa como sigue: Compuesto 6-02 Compuesto 7-02 Se disolvió el compuesto 7-02 (8.0 g) en metanol anhidro (120 mi) y se agregó de H2S04 concentrado (1.6 mi) en disolución. La solución se agitó por 4 horas a temperatura ambiente. Se agregó NaHC03 (solución al 8%) para ajustar el pH de la mezcla a 7.5. El producto se extrajo con CH2C12 (dos tratamientos, cada uno usando 100 mi) . El extracto se secó (MgS04) y los compuestos volátiles se destilaron completamente bajo presión reducida (0.05 mm de Hg) a 60°C. El producto resultante (Compuesto 8-02) tiene un rendimiento de 4.8 g. RMN (d6-DMSO) : 1.72 ppm (m, 2H) , 2.37 ppm (t, 2H) , 3.20 ppm (m, 1H) , 3.42 ppm (bm, 4H) , 3.49 ppm (t, 2H) , 3.59 ppm (s, 3H) , 4.46 ppm (t, 2H) . De forma esquemática, la reacción se representa como sigue: Compuesto 7-02 Compuesto 8-02 Ejemplo 2 Preparación del "Ester N-Hidroxisuccinimida del Ácido mPEG( QK) -Butanoico" (en donde mPEG20K designa un PEG que tiene un peso molecular de 20,000 Daltons) "Ester N-hidroxisuccinimida del Acido mPEG2( O ) -Butanoico Activación de los grupos hidroxilo en la molécula precursora . Se disolvió el compuesto 8-02 (2.0 g, 0.0208 equivalentes) en acetonitrilo anhidro (50 mi) y piridina anhidra (2.2 mi, 0.272 mole) y se agregó carbonato de N,IT-disuccinimidilo (5.86 g, 0.0229 mole, DSC) . La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. Después, la mezcla se filtró y el solvente se destiló completamente. El producto crudo se disolvió en CH2C12 (50 mi) y se lavó con una solución de H3PO4 al 5%. La solución después se secó (MgS0 ) , y el solvente se destiló completamente. El producto resultante (Compuesto 9-02) tiene un rendimiento de 2.8 g. (d6-DMSO) : 1.76 ppm (m, 2H) , 2.35 ppm (t, 2H) , 2.82 ppm (s, 8H) , 3.56 ppm (t, 2H) , 3.58 ppm (s, 3H) , 3.96 ppm (m, 1H) , 4.37 ppm (m, 2H) , 4.52 ppm (m, 2H) .
De forma esquemática, la reacción se representa como sigue: Compuesto 8-02 Compuesto 9-02 Acoplamiento del precursor activado con un polímero soluble en agua que contiene amina. Se agregó a una mezcla de mPEG<20K) -amina (11 g, 0.00055 mole) (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) , acetonitrilo (70 mi) y trietilamina (0.15 mi), compuesto 9-02 (0.119 g, 0.00050 equivalentes) . La mezcla se agitó por 3 horas a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Después, el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. De forma esquemática, la reacción se representa como sigue: Compuesto 10-2 Etapa de desprotección y purificación cromatográfica del ácido PEG2(40K) -butanoico. Se disolvió el compuesto obtenido 10-2 (referido en este documento como éster metílico del ácido PEG2 (40 -butanoico en 150 mi de agua destilada y el pH de la solución se ajustó a 12.2 con una solución de NaOH al 5%. La solución se agitó por 1.5 horas a un pH en el intervalo de 12.0-12.2. Después, se agregó NaCl (10 g) y el pH se ajustó a 2.5 con una solución de H3PO4 al 5%. El producto se extrajo con un tratamiento de CH2C12. El extracto se secó (MgS0 ) , y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida proporcionando 9 g de producto sólido. La cromatografía de intercambio iónico: ácido PEG2 (40K) -butanoico al 85%, amina de mPEG(2o ) al 10%. El producto se purificó por cromatografía de intercambio iónico como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,932,462 proporcionando 100% de producto puro. RMN (d6-D SO) : 1.72 ppm (q, 2H) 2.24 ppm (t, 2H) , 3.24 ppm (s, 6H) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 3.99 ppm (m, 4H) , 7.19 ppm (t, 2H) .
De forma esquemática, la reacción se representa como sigue: Ester metílico del ácido Ácido mPEG2 (40 ) -Butanoico mPEG2 ( OK) -Butanoico Se puede usar ácido mPEG2(40K) como un reactivo polimérico para reacciones para formar conjugados del agente de polímero activo. Además, se puede hacer reaccionar adicionalmente ácido mPEG2 (40?) -butanoico para proporcionar los reactivos poliméricos que contienen grupos funcionales diferentes a ácido carboxílico. Por ejemplo, la preparación del éster N-hidroxisuccinimida correspondiente del ácido mPEG2 ( 0K) -butanoico así como aldehido, maleimida y derivados de tiol se describen abajo.
Preparación del Ester N-Hidroxisuccinimida del Ácido mPEG2 (4OK) -butanoico Se disolvió ácido mPEG2 (40?) -butanoico (9.0 g, 0.000225 mole) (preparado como se describe anteriormente) en diclorometano anhidro (70 mi) y N-hidroxisuccinimida (0.0285 g, 0.000248 moles) y se agregó 1,3-diciclocarboimida (0.0510 g, 0.000247 mole) . La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. Después, la parte del solvente se destiló completamente bajo presión reducida y el producto se precipitó con alcohol isopropilico a temperatura ambiente y se secó bajo vacío proporcionando 8.6 g del polvo blanco. RM (ds-DMS0) : 1.81 ppm (q, 2H) 2.70 ppm (t, 2H) , 2.81 ppm (s, 4H) , 3.24 ppm (s, 6H) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 3.99 ppm (m, 4H) , 7.22 ppm (t, 2H) .
Ejemplo 3 Preparación de un "mPEG2 (40K) -Butiraldehído" Preparación de dietil acetal de tetra (etilen glicol)mono-butiraldehído HO- (CH2CH20) 4CH2 (CH2) 2-CH (OCH2CH2) 2 Se secó azeotrópicamente una mezcla de tetra (etilen glicol) (97.1 g, 0.500 moles) y tolueno (200 mi) destilando completamente tolueno bajo presión reducida (evaporador rotatorio). Se disolvió el tetra (etilen glicol) seco en tolueno anhidro (180 mi) y 1.0 de una solución de terc-butóxido de potasio en terc-butanol (120.0 mi, 0.120 moles) y se agregó dietil acetal de 4-clorobutiraldehído (18.1 g, 0.100 moles) (Alfa Aesar, Ward Hill, MA) . La mezcla se agitó a 95-100 °C durante la noche bajo atmósfera de argón. Después del enfriamiento a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y los solventes se destilaron completamente bajo presión reducida. El producto crudo se disolvió en 1000 mi de agua desionizada y la solución resultante se filtró a través de carbón activo. Se agregó cloruro de sodio (100 g) y el producto se extrajo con diclorometano (250, 200 y 150 mi) . El extracto se secó (sobre MgS04) y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida (por evaporación rotatoria) . El producto crudo se disolvió en 300 mi de amortiguador de fosfato al 10% (pH = 7.5) y las impurezas se extrajeron con acetato de etilo (2 x 50 mi) . El producto resultante se extrajo con diclorometano (200, 150, y 100 mi) . El extracto se secó (sobre MgS04) y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida (por evaporación rotatoria). Rendimiento: 20.3 g, RMN (d6-D S0) : 1.10 ppm (t, CH3-C-) 1.51 ppm (m, C-C¾-CH2~) , 3.49 ppm (bra, - OCH2CH20~) , 4.46 ppm (t, -CU, acetal), 4.58 ppm (t, -OH) . Pureza: -100% (sin señales de materiales de partida sin reaccionar) .
Preparación de dietilo de tetra (etilen glicol) -g-mesilato-?-butiraldehído CH3-S (O) 2-0- (CH2CH20) 4CH2 (CH2) 2-CH (0CH2CH2) 2 Se secó azeotrópicamente una mezcla de dietil acetal de tetra (etilen glicoDmono-butiraldehído (12.5 g, 0.037 moles) y tolueno (120 mi) destilando completamente tolueno bajo presión reducida (evaporador rotatorio) . Se disolvió el dietil acetal de tetra (etilen glicoDmono-butiraldehído en tolueno anhidro (100 mi) . Se agregó a la solución 20 mi de dielorómetaño anhidro y 5.7 mi de trietilamina (0.041 moles). Después se agregó por goteo 4.5 g de cloruro de metansulfonilo (0.039 moles). La solución se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno durante la noche. Después, se agregó carbonato de sodio (5 g) , la mezcla se agitó por una hora. La solución después se filtró y los solventes se destilaron completamente bajo presión reducida (evaporador rotatorio) . RMN (d6-DMSO) : 1.10 ppm (t, CH3-C-) 1.51 ppm (m, C-CH2-CH2-) , 3.17 ppm (s, CH3-metansulfonato) , 3.49 ppm (bm, -OCH2CH20-) , 4.30 ppm (m, -CH2-metansulfonato) , 4.46 ppm (t, -CH, acetal) . Pureza: ~100%.
Dietil acetal de tetra (etilen glicol) -g-amino-?-butiraldehído ¾N- (CH2CH20) 4CH2 (CH2) 2-CH (OCH2CH2) 2 Se agitó por 24 horas a temperatura ambiente una mezcla de dietil acetal de tetra (etilen glicol) -cc-mesilato-?-butiraldehído (14.0 g) , hidróxido de amonio concentrado (650 mi) y alcohol etílico (60 mi) . Después, las materiales volátiles se destilaron completamente bajo presión reducida. El producto crudo se disolvió en 150 mi de agua desionizada y el pH de la solución se ajustó a 12 con 1.0 M de NaOH. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 100 mi) . El extracto se secó (MgS04) y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida (evaporador rotatorio) . Rendimiento 10.6 g. RM (D20) : 1.09 ppm (t, CH3-C-) 1.56 ppm (m, C-CH2-CH2-) , 2.69 ppm (t, CH2-N) , 3.56 ppm (bm, -OCH2CH20-) , 4.56 ppm (t, -GH, acetal) . Pureza: -100%.
Dietil acetal de mPEG2(40.3 KDa) -butiraldehído ramificado Se agregó dietil acetal de tetra (etilen glicol) -a-amino^-butiraldehído (0.050 g, 0.000148 moles) y trietilamina (0.035 mi) a una solución de éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 (40?) -butanoico, (Ejemplo 2) (5.0 g, 0.000125 moles) en cloruro de metileno (100 mi) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. El solvente se evaporó a sequedad usando un evaporador rotatorio. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó con alcohol isopropílico. El producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento 4.8 g. R N (d6-D SO) : 1.10 ppm (t, 6H) , 1.51 ppm (m, 4H) , 1.67 ppm (m, 2H) , 2.12 ppm (t, 2H) , 3.12 ppm (q, 4H) , 3.24 ppm (s, 3H) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 3.99 ppm (m, 4H) , 4.46 ppm (t, 1H, acetal) . 7.22 ppm (t, 2H) , 7.82 ppm (t, 1H) . Sustitución: -100%. mPEG2(40.3 KDa) -butiraldehido ramificado Se disolvió dietil acetal PEG2(40.3 KDa) -butiraldehido ramificado (4.8 g) en 100 mi de agua y el pH de la solución se ajustó a 3 con ácido fosfórico diluido. La solución se agitó por 3 horas a temperatura ambiente, seguido por adición de 0.5M de hidróxido de sodio suficiente para ajustar el pH de la solución a aproximadamente 7. El producto se extrajo (mPEG2(40.3 KDa -butilado ramificado) con cloruro de metilo, y el extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro. El solvente se destiló completamente bajo presión reducida. Rendimiento 4.2 g. RMN (d6-D SO) : 1.67 ppm (m, 2H) , 1.76 ppm (p,-CH-CHa-CHO-, 2H) , 2.11 ppm (t, 2H) , 2.44 ppm (dt, -CH2-CH0) , 3.24 ppm (s, -OCH3, 6H) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 3.99 ppm (m, 4H) , 7.24 ppm (t, 2H) , 7.83 ppm (t, 1H) , 9.66 ppm (t,-CH0). Sustitución: ~100% Ejemplo 4 Preparación de una "mPEG2 (40K) -Maleimida' Se agregó N- (3 -maleimidapropionamido) etilendiamida en una forma de sal del ácido trifluoroacético (0.042 g, 0.000129 moles) y trietilamina (0.050 mi) a una solución de éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 ( 0?) -butanoico (Ejemplo 2) (5.0 g, 0.000125 moles) en acetonitrilo anhidro (100 mi) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. El solvente se evaporó a sequedad usando un evaporador rotatorio. El producto crudo se disolvió en una cantidad pequeña de cloruro de metileno y se precipitó con alcohol isopropílico . El producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento 4.7 g. RMN (ds-DMS0) : 1.69 ppm (m, 2H) , 2.09 ppm (t, 2H) 2.31 ppm (t, 2H) , 3.03 ppm (q, 4H) , 3.12 ppm (q, 4H) , 3.24 ppm (s, 6H) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 3.99 ppm (m, 4H) , 7.00 ppm (s, 2H, maleimida) , 7.21 ppm (t, 2H) , 7.75 ppm (t, 1H) , 7.96 ppm (t, 1H) .
Ejemplo 5 Preparación de un "mPEG2 (40K) -Tiol Se agregó diclorhidrato de cistamina (0.0142 g, 0.000126 equivalentes) y trietilamina (0.040 mi) a una solución de éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 ( 0K) -butanoico y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Después, se agregó ditiotreitol (0.054 g, 0.000350 moles) y trietilamina (0.25 mi) y la mezcla se agitó por 3 horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. El solvente se evaporó a sequedad usando un evaporador rotatorio. El producto crudo se disolvió en una cantidad pequeña de cloruro de metileno y se precipitó con alcohol isopropílico. El producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 4.8 g. RMN (CDC13) : 1.68 ppm (m, -SH, 1H) , 1.35 ppm (t, 2H) , 2.65 ppm (q, -CH25H, 2H) , 3.15 ppm (q, 6H) , 3.36 ppm (s, 6H) , 3.65 ppm (s, estructura PEG) , 4.15 ppm (m, 4H) . Sustitución: -100%.
Ejemplo 6 Preparación de un "Ester N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG3 (ß??) -Butanoico" con enlazador de Pentaeritritol Preparación del Compuesto 1.04 Compuesto 1-04 Se secó azeotrópicamente destilando completamente tolueno bajo presión reducida una mezcla de pentaeritritol etoxilado (15/4 EO/OM, n = 797, Sigma-Aldrich) (100 g, 0.125 moles) y tolueno (200 mi). El pentaeritritol etoxilado se disolvió en tolueno anhidro (150 mi) y una solución 1.0M de terc-butóxilado de potasio en terc-butanol (30 mi, 0.03 moles) y se agregó 1- (3-bromopropil) -4-metil-2,6/7-trioxabiciclo[2,2,2]octano (6.3 g, 0.025 moles).
Después, la mezcla se agitó a 80-85°C durante la noche bajo una atmósfera de argón. Después del enfriamiento a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y los solventes se destilaron completamente bajo presión reducida. El producto crudo se disolvió en 800 mi de agua desionizada. El pH de la solución se ajustó a 2 con ácido fosfórico al 5% y la solución se agitó por 15 minutos a temperatura ambiente. Después, el pH se ajustó nuevamente a 12 con 1M de hidróxido de sodio y la solución se agitó por 2 horas manteniendo el pH a 12 por adiciones periódicas de 1M de hidróxido de sodio. Se agregó cloruro de sodio (40 g) y se extrajo el pentaeritritol etoxilado sin reaccionar con dxclorometano. Después, el pH se ajustó a 3 con ácido fosfórico al 5% y el producto se extrajo con dxclorometano. El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. Rendimiento 15 g. RMN (d6-DMSO) : 1.72 ppm (q, 2H) 2.24 ppm (t, 2H) , 3.51 ppm (S, 60H) , 4.57 ppm (t, 3H) .
Preparación del Compuesto 2-04 Compuesto 2-04 Se disolvió el compuesto 1-04 (15 g, 0.017 moles) en metanol anhidro (300 mi) y se agregó ácido sulfúrico concentrado (4 mi) . La solución se agitó por 4 horas a temperatura ambiente. Se agregó NaHC03 (solución al 8%) para ajustar el pH de la mezcla a 7.5. El producto se extrajo con CH2C12. El extracto se secó (MgS04) y los compuestos volátiles se destilaron completamente bajo presión reducida. Rendimiento 13.5 g, RMN (d6~D SO) : 1.72 ppm (q, 2H) 2.37 ppm (t, 2H) , 3.51 ppm (s, 60H) , 4.57 ppm (t, 3H) .
Preparación del Compuesto 3-04 Se disolvió el compuesto 2-04 (13.5 g, 0.044 equivalentes) en acetonitrilo (100 mi) y piridina anhidro (4.4 mi, 0.544 mole) y se agregó carbonato de N,N-disuccinimidilo (12.40 g, 0.0484 mole). La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Después, la mezcla se filtró y el solvente se destiló completamente. El producto crudo se disolvió en CH2C12 (200 mi) y se lavó con una solución de H3PO4 al 5%. La solución después se secó (MgS04) , y el solvente se destiló completamente. Rendimiento 16.5 g. RMN (d6-DMSO) : 1.72 pm (m, 2H) , 2.37 ppm (t, 2H) , 2.82 ppm (s, 12H) , 3.50 ppm (s, 48H) , 3.70 ppm (m, 6H) , 4.45 (m, 6H) .
Preparación del Compuesto 4-04 un éster metílico del ácido (PEG3 (60K) -butanoico. Se agregó el compuesto 3-04 (0.259 g, 0.00060 equivalentes) a una mezcla de mPEG(20K) -amina (15 g, 0.00075 moles) (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) , acetonitrilo (70 mi) y trietilamina (0.15 mi). La mezcla se agitó por tres horas a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Después, el solvente se destiló completamente bajo presión reducida.
Estapa de desprotección y purificación cromatográfica del ácido PEG3 (60 ) -butanoico . Se disolvió el compuesto 4-04 (referido en este documento como "éster metílico del ácido PEG3(6O )-butanoico" en 150 mi de agua destilada y el pH de la solución se ajustó a 12.2 con una solución de NaOH al 5%.
La solución se agitó por 1.5 horas a un pH en un intervalo de 12.0-12.2. Después, se agregó NaCl (10 g) y el pH se ajustó a 2.5 con una solución de H3P04 al 5%. El producto se extrajo con un tratamiento de CH2C12- El extracto se secó (MgS04) , y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida proporcionando 13.8 g del producto sólido . Cromatografía de intercambio iónico: ácido PEG3(6OK)-butanoico al 82%, M-PEG(2OK) -amina al 18%. El producto se purificó por cromatografía de intercambio iónico como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,932,462 proporcionando un producto 100% puro. RMN (d6-DMS0) : 1.72 ppm (q, 2H) 2.24 ppm (t, 2H) , 3.24 ppm (s, 6H) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 3.99 ppm (m, 6H) , 7.19 ppm (t, 3H) .
Preparación de éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG3 (6QK) -butanoico . Se disolvió el ácido mPEG3 (60?) -butanoico obtenido (etapa previa) (9.0 g, 0.000225 moles) en diclorometano anhidro (70 mi) y N-hidroxisuccinimida (0.0285 g, 0.000248 mole) y se agregó 1, 3~diciclohexilcarbodiimida (0.0510 g, 0.000247 mole). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Después, la parte del solvente se destiló completamente bajo presión reducida y el producto se precipitó con alcohol isopropílico a temperatura ambiente y se secó bajo vacío proporcionando 8.6 g del polvo blanco. RMN (d6- DMSO) : 1.81 ppm (q, 2H) 2.70 ppm (t, 2H) , 2.81 ppm (s, 4H) , 3.24 ppm (s, 6H) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 3.99 ppm (m, 4H) , 7.22 ppm (t, 2H) .
Ejemplo 7 Preparación de un mPEG Monofuncional Se preparó un polímero de la invención que comprende un polímero soluble en agua único. Se sigue el procedimiento del Ejemplo 2 excepto que el éster metílico del ácido 3-hidroxi-propiónico se reemplazó por el compuesto 8-02. Éster metílico del ácido 3-hidroxi-propiónico El compuesto resultante ("éster metílico del ácido mPEG-propiónico" ) se encontró tener la siguiente estructura: m Éster metílico del ácido mPEG (2 OK) -propiónico El éster metílico del ácido mPEG(20K) -propiónico puede proporcionar el ácido carboxílico correspondiente. Por ejemplo, se puede disolver el éster metílico en agua destilada y el pH se ajusta hasta aproximadamente 12 usando una solución de NaOH. Después de esto, se puede agregar una sal tal como cloruro de sodio y el pH después se ajusta aproximadamente 3 usando un ácido adecuado. El ácido carboxílico correspondiente (ácido mPEG(20K) -propiónieo) puede ser extraído usando un tratamiento de cloruro de metileno, secando y destilando completamente cualquier solvente restante. El ácido mPEG(20 ) -propiónieo puede ser usado como un reactivo polimérico para reacciones para formar un conjugado de agente de polímero activo. Además, el ácido mPEG(20K) -propiónieo puede hacerse reaccionar adicionalmente para proporcionar reactivos poliméricos que tienen grupos funcionales distintos a ácido carboxílico. Por ejemplo, usando técnicas previamente descritas, se pueden preparar el éster N-hidroxisuccinimida correspondiente (véase el Ejemplo 2), aldehido (véase el Ejemplo 3), maleimida (véase el Ejemplo 4) , y tiol (véase el Ejemplo 5) derivados del ácido mPEG¡20 ) -propiónieo.
Ej emplo 8 Preparación de un PEG Homobifuncional Se preparó un polímero homobifuncional de la invención que comprende una porción de polímero ' soluble en agua único. El procedimiento del Ejemplo 7 es seguido excepto que la amina-PEG(2? ) -amina es sustituida por mPEG(20K) -amina. El compuesto resultante se encontró por tener la siguiente estructura: Ester Metílico del Ácido mPEG(20 ) -Propiónico (un polímero difuncional) El éster metílico del ácido mPEG(2oK) -dipropiónico puede proporcionar el ácido dicarboxílico correspondiente. Por ejemplo, se puede disolver éster metílico del ácido mPEG(20K) -dipropiónico en agua destilada y el pH se ajusta aproximadamente a 12 usando una solución de NaOH. Después de lo cual, se puede agregar una sal tal como cloruro de sodio y el pH después se ajusta aproximadamente a 3 usando un ácido adecuado. El ácido dicarboxílico correspondiente (ácido mPEG(20K) -dipropiónico) se puede extraer usando un tratamiento de cloruro de metileno, secando y destilando completamente cualquier solvente restante. Se puede usar ácido mPEG(2o ) -dipropiónico como un reactivo polimérico para reacciones para formar conjugados de agente de polímero activo (que comprende dos agentes activos). Además, el ácido mPEG(2oK) -dipropiónico se puede hacer reaccionar adicionalmente para proporcionar reactivos polímericos que tienen grupos funcionales diferentes a ácido carboxílico. Por ejemplo, usando técnicas previamente descritas, se pueden preparar el éster diN-hidroxisuccinimida correspondiente (véase el Ejemplo 2) , dihaldehído (véase el Ejemplo 3) , dimaleimida (véase el Ejemplo 4) , y ditiol (véase el Ejemplo 5) derivados del ácido m EG(20K) -propiónico.
Ejemplo 9 Conjugación Se hizo reaccionar mPEG2 ( 0?) -maleimida (Ejemplo 4) que tiene un grupo reactivo de sulfhidrilo selectivo con cada una de las secuencias de polipéptido como se proporciona en las SEC ID NOS: 1-349. en donde (m) , en la estructura anterior, es aproximadamente 454 y/o el peso molecular de cada polímero soluble en agua es aproximadamente 20,000 Daltons, con ello se proporciona un reactivo que tiene un peso molecular de aproximadamente 40,000 Daltons . En el grado que cualquier polipéptido carece de un grupo sulfhidrilo (por ejemplo, el polipéptido carece de metionina tanto como de un residuo de cisteina) , se puede agregar una metionina o un residuo de cisterna al polipéptido usando técnicas convencionales sintéticas. Véase, por ejemplo, el documento WO 90/12874. Para cada polipéptido, se agregó un exceso del polímero a un frasco de reacción que contiene el polipéptido. Las condiciones de reacción incluyen un pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8 a temperatura ambiente. Después de aproximadamente cinco horas, se produce un conjugado del polipéptido y el polímero.
Ejemplo 10 Polímero Multibrazos Se preparó un polímero multibrazos que comprende al menos un grupo reactivo como sigue. Se combinaron tres equivalentes del bis- (2,5-dioxo-pirrolidin-l-il) éster del ácido carbónico con metil-D-glucopiranosido en trietilamina para producir un primer intermediario, como se muestra abajo: Primer intermediario El primer intermediario después se expuso a un exceso ligero de mPEG(ioK) -amina en la presencia de trietilamina para producir un segundo intermediario, como se muestra abajo: Segundo intermediario El segundo intermediario es después sometido a hidrólisis de ácido catalizado para producir las formas aldehido y hemiacetal, como se muestra abajo: aldehido El aldehido se comprende de tres PEGs de 10K, con ello se proporciona una estructura ramificada de 30K total. El aldehido en cambio, es opcionalmente convertido en otros derivados a través del ácido (por ejemplo, el ácido carboxílico formado cuando el aldehido se expone a condiciones de oxidación media) . El procedimiento puede ser usado para proporcionar dos brazos así como también cuatro brazos . Durante cualquier procedimiento dado, se pueden producir mezclas de las sustancias (por ejemplo, doblemente sustituidas y algunas cuádruplemente sustituidas) . Además, son posibles los isómeros posicionales de cualquiera de los polímeros .
Ejemplo 11 Preparación de PEGilación aleatoria del Conjugado del Polímero EPO de EPO La eritropoyetina recombinante, wEPO" (producida en E. coli, células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino, u otras fuentes) se acopló a un mPEG2 (40KDa) -butiraldehido ramificado (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió EPO (~2 mg) en 1 mi de 50 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.6) y se agregó PEG2 (40 KDa) -butiraldeído ramificado a 5X la concentración molar de EPO. Se agregó un agente reductivo, NaCNBH3 y la solución se agitó por 24 horas a temperatura ambiente para acoplar el reactivo PEG2 (40 KDa) -butiraldehido ramificado a la proteína vía un enlace de amina. La mezcla de reacción se analizó por SDS-PAGE para determinar el grado de conjugación. La conformación del grado de conjugación se hace por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpcion Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por diferentes especies nativas y monoconjugadas por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monoconjugada . Incrementando la relación del reactivo PEG a la proteína incrementa el grado de conjugación. La PEGilación aleatoria demostrada anteriormente de una proteína ilustrativa de la invención, proporciona una distribución de productos EPO PEGilados. Si se desea, la mezcla de reacción puede además ser separada para aislar los isómeros individuales como se describe abajo. Los conjugados PEG que tienen diferentes pesos moleculares se separan por cromatografía de separación de gel. Los diferentes conjugados PEG se fraccionaron en bases a sus diferentes pesos moleculares (en este caso, variando por aproximadamente 40,000 Daltons) . Específicamente, la separación se realiza usando un sistema de columna serial adecuada para separación efectiva de productos en el intervalo de peso molecular observado, por ejemplo una columna Superdex™200 (Amersham Biosciences) . El producto se eluyó con 10 mi de amortiguador de acetato como una velocidad de flujo de 1.5 ml/min. Las fracciones colectadas (1 mi) se analizaron por OD a 280 nm para determinar el contenido de proteína y también usando una prueba de yodo para determinar el contenido de PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem. 107 : 60-63) . Además, los resultados pueden ser visualizados ejecutando una SDS PAGE de gel, seguido por teñido con yoduro de bario. Las fracciones que corresponden a los picos eluidos se colectaron, se concentraron por ultrafiltración usando una membrana y se liofilizaron. Este método resultó en separación/purificación de conjugados que tienen los mismos pesos moleculares pero no proporciona separación de conjugados que tienen el mismos peso molecular, pero diferentes sitios de PEGilación, (es decir, isómero posicional) . Se llevó a cabo la separación de isómeros posicionales por cromatografía de fase inversa usando una columna RP-CLAR C18 (Amersham Biosciences or Vydac) . Este procedimiento es efectivo para la separación de isómeros de biomoléculas PEG que tienen el mismo peso molecular (isómero posicional) . La cromatografía de fase inversa se llevó a cabo usando una columna preparativa RP-CLAR C18 y se eluyó con una gradiente de agua/TFA al 0.05% (Eluyente A) y acetonitrilo/TFA 0.05% (Eluyente B) . Se colectaron las fracciones correspondientes para los picos eluidos, se evaporaron para eliminar acetonitrilo y TFA, seguido por remoción del solvente para aislar el isómero PEG posicional individual. Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención para ser usados en la formación de conjugados de EPO.
Ejemplo 12 Preparación de Polímero- Conjugado de EPO-PEGilación N- terminal de EPO La eritropoyetina recombinante, "EPO" (producida en E. coli, células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino, u otras fuentes) se acopló a mPEG2(40 KDa) -butiraldehído ramificado (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió la EPO (~2 mg) en 1 mi de acetato de sodio O.lm (pH 5) y se agregó mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar de EPO. Se agregó un agente reductivo, NaCNBH3 y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a la proteína vía una enlace de amina. La mezcla de reacción se analizó por SDS-PAGE para determinar el grado de conjugación. La confirmación del grado de conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpción Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por diferentes especies nativas y monoconjugadas por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante principalmente contiene una mezcla de proteína nativa y monocon ugada. Las especies monoconjugadas se purificaron por cromatografía en columna para remover EPO libre y especies de alto peso molecular. La confirmación de la PEGilación N-terminal se llevó a cabo por mapeo del péptido. Incrementando la relación de PEG a proteína, se incrementa el grado de PEGilación, produciendo la proteína conjugada. La PEGilación demostrada anteriormente de una proteína ilustrativa de la invención proporciona predominantemente una proteína PEGilada única N-terminal . Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención para ser usados en la formación de conjugados de EPO.
Ejemplo 13 PEGilación KT-terminal de GCSF Se acopló el factor de estimulación de la colonia de granulocito recombinante "GCSF" (producida en E. coli, células de mamífero tal como células de ovario de hámster Chino, u otra fuente) a mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió GCSF (~2 mg) en 1 mi de 0.1 mM de acetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar GCSF. Se agregó el agente de reducción, NaCNBH3 y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a la proteína vía un enlace de amina. La mezcla de reacción resultante se analizó por SDS-PAGE para determinar el grado de conjugación. La confirmación del grado de la conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpción Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por diferentes especies nativas y monoconjugadas por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monoconjugada GCSF. El monoconjugado se purificó por cromatografía en columna para remover el GCSF libre y especies de alto peso molecular. La conformación de PEGilacion N-terminal se conduce por mapeo del péptido. Incrementando la relación de PEG a la proteína se incrementa el grado de conjugación produciendo la proteína del policonjugado. Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención a ser usados en la formación de conjugados de GCSF.
Ejemplo 14 PEGilacion N-terminal de interferona-a Se acopló la interferona-alfa recombinante, "IFN-a" (producida en E . coli, células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino, u otras fuentes) a mPEG2 (40 Da) -butiraldehído (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió IFN-a (~2 mg) en 1 mi de 0.1 mM de acetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar de IFN-oc. Se agregó un agente reductivo, NaCNBH3 y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2 (40 KDa) -buriraldehído a la proteína vía un enlace de amina. La mezcla de reacción se analizó por SDS-PAGE para determinar el grado de conjugación. La conformación del grado de conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpción Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por diferentes especies nativas y monoconjugadas por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante principalmente contiene una mezcla de proteína nativa y monoconjugad . Las especies monoconjugadas se purifican por cromatografía en columna para remover interferona-a libre y especies de alto peso molecular. La confirmación de la PEGilación K-terminal se conduce por mapeo del péptido. Incrementando la relación de PEG a la proteína se incrementa el grado de conjugación produciendo la IFN-a policonjugada . Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención para ser usados en la formación de conjugados de IFN-a.
Ejemplo 15 PEGilación N-terminal de la Hormona de Crecimiento Humano Se acopló la hormona de crecimiento humano recombinante, "hGH" (producida en E. coli, células de mamífero tal como células de ovario de hámster Chino, u otra fuente) a mPEG2 (40 Da) -butiraldehído (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió hHG (~2 mg) en 1 mi de 0.1 mM de acetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2 ( 0 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar hHG. Se agregó exceso molar 5 a 20 veces del agente reductivo, NaCNB¾ y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a la proteína vía un enlace de amina. El progreso de la reacción se analizó por espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDO-TOF para determinar el grado de conjugación. La confirmación del grado de la conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpción Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por nativas y monoco jugadas y otras diferentes especies por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante principalmente contiene una mezcla de proteína nativa y monoconjugada. Las especies monoconjugadas se purificaron por cromatografía en columna para remover hGH libre y especies de alto peso molecular. La confirmación de la conjugación N-terminal se conduce por mapeo del péptido. Incrementando la relación de mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a la proteína se incrementa el grado de conjugación produciendo una población del hGH policonjugado . Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención para ser usados en la formación de conjugados de hGH.
Ejemplo 16 PEGilación N-terminal de Interferona-g Se acopló la interferona-ß recombinante, "INF-ß" (producida en E. coli, células de mamífero tal como células de ovario de hámster Chino, u otra fuente) a mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído (preparada como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió IFN-ß (~2 mg) en 1 mi de 0.1 m de acetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2 (40 KDa) a 5X la concentración molar IFN-ß. Se agregó un exceso molar de 5 a 20 veces de un agente reductivo, y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a la proteína vía un enlace de amina. Se analizó el progreso de la reacción por espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF para determinar el grado de conjugación. La confirmación del grado de conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpción Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron para diferentes especies nativas y monoconjugadas por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante principalmente contiene una mezcla de proteína nativa y monoconjugado . Las especies monoconjugadas se purificaron por cromatografía en columna para remover IFN-ß libre y especies de alto peso molecular. La confirmación de PEGilación N-terminal se conduce por mapeo del péptido. Incrementando la relación de mPEG2 (40 Da) -butiraldehído a la proteína se incrementa el grado de conjugación produciendo una población de IF -ß policonjugada. Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención a ser usados en la formación de conjugados de IFN-ß.
Ejemplo 17 PEGilación de N-terminal de FSH Se acopló la hormona se estimulación del folículo recombinante, "FSH" (producida en E. coli, células de mamífero tal como células de ovario de hámster Chino, u otra fuente) a mPEG2(40 KDa) -butiraldehído (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió FSH (~2 mg) en 1 mL de 0.1 mM de acetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar FSH. Se agregó un exceso molar de 5 a 20 veces del agente reductivo, NaCNBH3 y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a la proteína vía un enlace de amina. El progreso de la reacción se analizó por espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF para determinar el grado de conjugación. La confirmación del grado de conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpcion Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por diferentes especies nativas y monoconjugación y otras por aproximadamente 40,000 Daltons . La mezcla de reacción resultante principalmente contiene una mezcla de proteína nativa y monoconjugado . Las especies de monoconjugación se purificaron por cromatografía en columna para remover la FSH libre y especies de alto peso molecular. La confirmación de PEGilación N-terminal se conduce por mapeo del péptido. Incrementando la relación de mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a una proteína se incrementa el grado de conjugación que produce una población de FSH policon ugado. Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención a ser usados en la formación de conjugados de FSH.
Ejemplo 18 PEGilación N-terminal del Factor VIII Se acopló el Factor VIII recombinante, WF8" (producido en E. coli, células de mamífero tal como células de ovario de hámster Chino, o otra fuente) a mPEG2(40 KDa) -butiraldehído (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió F8 (~2 mg) en 1 mL de 0.1 mM de acetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar F8. Se agregó un exceso molar 5 a 20 veces del agente reductivo, NaCNBH3 y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a la proteina vía un enlace de amina. Se analizó el progreso de la reacción por espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF para determinar el grado de conjugación. La confirmación del grado de conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpción Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por diferentes especies nativas y monoconjugacion y otras por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante principalmente contiene una mezcla de proteína nativa y monoconjugada. Las especies de monoconjugacion se purificaron por cromatografía en columna para remover el F8 libre y especies de peso molecular alto. La confirmación de PEGilación N-terminal se conduce por mapeo del péptido. Incrementando la relación de mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a una proteína se incrementa el grado de conjugación que produce una población de F8 co jugado . Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención para ser usados en la formación de conjugados de F8.
Ejemplo 19 PEGilación N-terminal del Factor VIII que Suprime el Dominio B Se acopló el Factor VIII que suprime el dominio B recombinante (producido en E. coli, células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino, u otra fuente) a mPEG2 (40 KDa) -buriraldehído (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió BDD F8 (~2 mg) en 1 mL de 0.1 mM de acetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar de BDD F8. Se agregó un exceso molar 5 a 20 veces del agente reductivo, NaCNBH3 y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a la proteína vía un enlace de amina. Se analizó el progreso de la reacción por espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF para determinar el grado de conjugación. La confirmación del grado de conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpción Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por diferentes especies nativas y monoconjugación y otras por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante principalmente contiene una mezcla de proteína nativa y monoconjugada. Las especies de monoconjugación se purificaron por cromatografía en columna para remover el BDD F8 libre y especies de peso molecular alto. La confirmación de PEGilación N-terminal se conduce por mapeo del péptido. Incrementando la relación de mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a la proteína se incrementa el grado de conjugación que produce una población de BDD F8 con ugado. Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención usados en la formación de conjugados de BDD F8.
Ejemplo 20 PEGilación del Factor VIII Usando Ester N- Hidroxisuccinimida del Acido mPEG2 ( 0 ) -Butanoíco Se acopló el Factor VIII recombinante, "F8" (producido en E. coli, células de mamífero tal como células de ovario de hámster Chino, u otras fuentes) a éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 (40 ) -butanoico (preparado como se describe en el Ejemplo 2) . Se disolvió F8 en un líquido acuoso y se agregó éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2(40K) -butanoico de una a diez veces la concentración molar F8 para formar una solución de reacción. El pH de la solución de reacción se ajustó aproximadamente 8 hasta 9.5 y la temperatura se mantuvo a temperatura ambiente . La solución de reacción se agitó por varias horas para permitir el acoplamiento del reactivo polimérico a F8 vía un enlace de amida. En la prueba de la solución de reacción, se determinó que la conjugación ha ocurrido en ambos sitios N-terminal y lisina. Este ejemplo demostró la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención para ser usados en la formación de conjugados de F8.
Ejemplo 21 PEGilación del Factor VIII que Suprime el dominio B Usando Éster N-Hidroxisuccinimida del Ácido mPEG2 (40K) -Butanoico Se acopló el Factor VIII que suprime el dominio B recombinante , "BDD F8" (producido en E. coli, células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino, u otra fuente) a éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 (4? ) -butanoico (preparado como se describe en el Ejemplo 2) . Se disolvió BDD F8 en un líquido acuoso y se agregó éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2( 0K)-butanoico de una a diez veces la concentración molar de F8 para formar una solución de reacción. El pH de la solución de reacción se ajustó aproximadamente 8 hasta 9.5 y la temperatura se mantuvo a temperatura ambiente. La solución de reacción se agitó por varias horas para permitir el acoplamiento del reactivo polimérico a BDD F8 vía un enlace de amida. En la prueba de la solución de reacción, se determinó que la conjugación ha ocurrido en ambos sitios N-terminal y lisina. Este ejemplo demostró la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención a ser usados en la formación de conjugados de BDD F8.
Ejemplo 22 PEGilacion N-terminal de Desmopresina Se acopló desmopresina a mPEG2 (40 Da) -butiraldehído (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió la desmopresina (~2 mg) en 1 mL de 0.1 mM de acetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar de BDD F8. Se agregó un exceso molar de 5 a 20 veces del agente reductivo, NaCNB¾ y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo mPEG2 (40 KDa) -butiraldehido a la proteína vía un enlace de amina. Se analizó el progreso de la reacción por espectrometría de masas SDS-PAGE o ALDI-TOF para determinar el grado de conjugación. La confirmación del grado de conjugación se llevó a cabo por espectrometría de masas por Tiempo de Ionización de Desorpcion Láser Asistida por Matriz de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF) . Los picos se desplegaron por diferentes especies nativas y monoconjugacion y otras por aproximadamente 40,000 Daltons. La mezcla de reacción resultante principalmente contiene una mezcla de proteína nativa y monoco jugada. Las especies de monoconjugacion se purificaron por cromatografía en columna para remover la desmopresina libre y especies de peso molecular alto. La confirmación de PEGilación N-terminal se conduce por mapeo del péptido. Incrementando la relación de mPEG2(40 KDa) -butiraldehido a la proteína se incrementa el grado de conjugación que proporciona una población de desmopresina conjugada. Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención a ser usados en la formación de conjugados de desmopresina.
Ejemplo 23 PEGilación de Desmopresina Usando Ester N- Hidroxisuccinimida del Ácido mPEG2 (40K) -Butanolco Se acopló desmopresina a un éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 (40?) -butanoico (preparado como se describe en el Ejemplo 2) . Se disolvió la desmopresina en un liquido acuoso y se agregó éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 (40K) -butanoico de una a diez veces la concentración molar de desmopresina para formar una solución de reacción. El pH de la solución de reacción se ajustó aproximadamente 8 hasta 9.5 y la temperatura se mantuvo a temperatura ambiente . La solución de reacción se agitó por varias horas para permitir el acoplamiento del reactivo polimérico para desmopresina vía un enlace de amida. En la prueba de la solución de reacción, se determinó que ha ocurrido la conjugación.
Ejemplo 24 PEGilación de Amdoxivir (DAPD) Se acopló Amdoxivir (DAPD) a mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído (preparado como se describe en el Ejemplo 3) . Se disolvió amdoxivir (~2 mg) en 1 mL de 0.1 mM deacetato de sodio (pH 5) y se agregó mPEG2 (40 KDa) -butiraldehído a 5X la concentración molar de amdoxivir. Se agregó un exceso molar de 5 a 20 veces del agente reductivo, NaCNBH3 y la solución se agitó por 24 horas a 4°C para acoplar el reactivo de mPEG2(40 KDa) -butiraldehído a la proteina vía un enlace de amina. Se analizó el progreso de la reacción por espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF. Este ejemplo demostró la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención a ser usados en la formación de conjugados de amdoxivir.
Ejemplo 25 PEGilación de .Amdoxivir (DAPD) Usando Ester M- Hidroxisuccinimida del Ácido mPEG2 (i0K) -Butanoico Se acopló amdoxivir (DAPD) al éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 (40?) -butanoico (preparado como se describe en el Ejemplo 2) . Se disolvió amdoxivir en un líquido acuoso y se agregó éster N-hidroxisuccinimida del ácido mPEG2 (40?) -butanoico en una a diez veces la concentración molar de amdoxivir para formar una solución de reacción. El pH de la solución de reacción se ajustó aproximadamente 8 hasta 9.5 y la temperatura se mantuvo a temperatura ambiente . La solución de reacción se agitó por varias horas para permitir acoplamiento del reactivo polimérico para amdoxivir vía un enlace de amida. En la prueba de la solución de reacción, se determinó que ha ocurrido la conjugación. Este ejemplo demuestra la capacidad de los reactivos poliméricos de la invención a ser usados en la formación de conjugados de amdoxivir.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un reactivo polimérico caracterizado porque R O comprende una una porción _[!]_c_o- posicionada entre un polímero soluble en agua y un grupo reactivo; en donde: (i) R1 o el átomo de nitrógeno en la porción _¿_c_o- está próximo al polímero soluble en agua; (ii) el átomo de carbono R1 o carbonilo de la porción «¿«¿«Q- está próximo al grupo reactivo; y (iii) R1 es H o un radical orgánico. 2. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 es H. 3. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R1 es un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. 4. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque R1 se selecciona del grupo que consiste de metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, tere-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, terc-pentilo y piperidonilo . 5. El reactivo polimé ico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción de polímero soluble en agua es un polímero seleccionado del grupo que consiste de un poli (óxido de alquileno) , poli (vinil pirrolidona) , poli (alcohol vinílico) , polioxazolina, poli (acriloilmorfolina) y poli (polioles oxietilados) . 6. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción de polímero soluble en agua es poli (óxido de alquileno) . 7. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el poli (óxido de alquileno) es un poli (etilenglicol) . 8. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el poli (etilenglicol) es terminalmente tapado con una porción de extremo tapado seleccionada del grupo que consiste de idroxilo y alcoxi. 9. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el poli (etilenglicol) es terminalmente tapado con metoxi. 10. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el poli (etilenglicol) tiene un peso molecular desde aproximadamente 100 Daltons hasta aproximadamente 100,000 Daltons . 11. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el poli (etilenglicol) tiene un peso molecular desde aproximadamente 1,000 Daltons hasta aproximadamente 60,000 Daltons . 12. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el poli (etilenglicol) tiene una masa molecular promedio nominal desde aproximadamente 2,000 Daltons hasta aproximadamente 50,000 Daltons . 13. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero soluble en agua es un homopolímero. 1 . El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el átomo de R1 o nitrógeno de la porción _¡i¡_c—o— está ligado al polímero solubleen agua a través de un enlace covalente directo. 15. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el átomo de R1 O nitrógeno de la porción _,!j_¿_0_ está ligado al polímero solubleen agua a través de una primera porción espaciadora. 16. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo reactivo se selecciona del grupo que consiste de hidroxilo, éster, éster, ortoéster, carbonato, carbonato, acetal, acetaldehido, aldehido, hidrato de aldehido, cetona, vinilcetona, hidrato de cetona, tiona, monotiohidrato, ditiohidrato, hemicetal, hemicetal de monotiocetal , ditiohemicetal, cetal, ditiocetal, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, sulfona, amina, hidrazido, tiol, disulfuro, tiol hidrato, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida, succinimida, benzotriazol, vinilsulfona, cloroetilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tiosulfonato, tresilato, silano, -(CH2)rC02H, - (CH2) r,C02NS, - (C¾) rC02Bt, - (CH2)rCH(OR)2, - (C¾)r(CHO) , -(CH2)2-NH2, -(CH2)rM, -(CH2)r-S-S02-R, en donde (r) es 1-12, (r' ) es 0-5, R es arilo o alquilo, NS es N-succinimidilo, Br es 1-benzotriazolilo y M es N-maleimidilo y formas protegidas y activadas de cualquiera de los anteriores. 17. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la estructura de (Fórmu,a "> en donde: POLI1 es un polímero soluble en agua; (a) es O, 1, 2 ó 3; (b) es O, 1, 2 ó 3; R1 es H o un radical orgánico; X1, cuando se presenta, es una primera porción espaciadora; X2 cuando se presenta, es una segunda porción espaciadora; y Z es un grupo reactivo. 18. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la estructura de (Fórmula III) en donde : POLI1 es un polímero soluble en agua; POLI2 es un polímero soluble en agua; (a) es 0, 1, 2 ó 3, (b) es 0, 1, 2 ó 3, (e) es 0, 1, 2 ó 3, (f) es 0, 1, 2 ó 3; (g) es 0, 1, 2 ó 3; (h) es 0, 1, 2 ó 3; (j) es 0 hasta 20; cada R1 es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; X1, cuando se presenta, es una primera porción espaciadora; X2, cuando se presenta, es una segunda porción espaciadora; X5, cuando se presenta, es una quinta porción espaciadora; X6, cuando se presenta, es una sexta porción espaciadora; X7, cuando se presenta, es una séptima porción espaciadora; X8, cuando se presenta, es una octava porción espaciadora; R5 es una porción de ramificación; y Z es un grupo reactivo. 19. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque R5 se selecciona del grupo que consiste de: en donde (p) es 1-8 y (q) es 1-8. en donde POLI1, X, (a) , (c) , Q y Z son como se definen previamente. 20 El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende una estructura de: en donde (m) es 2 hasta 4000, y (f) es 0 hasta 6 y (n) es 0 hasta 20. 21. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque (f) es 2 hasta 4 y (n) es 0 hasta 4. 22. El reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación i, caracterizado porque comprende una estructrura seleccionada del grupo que consiste de: en donde cada (m) es 2 hasta 4000. 23. El reactivo polimerico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende una estructura seleccionada del grupo que consiste de en donde cada (m) es 2 hasta 4000. 24. El reactivo polimérico de conformidad con reivindicación 1, caracterizado porque comprende estructura seleccionada del grupo que consiste de 5 25. El reactivo polimérico de conformidad con reivindicación 1, caracterizado porque comprende estructura seleccionada del grupo que consiste de 25 en donde cada (m) es 2 hasta 4000 y cada (n) es 0 hasta 20. 26. Un método para preparar un reactivo polimérico caracterizado porgue comprende las etapas de (i) proporcionar una molécula precursora comprendida opcionalmente de un grupo reactivo protegido y uno o más grupos hidroxilo; (ii) activar al menos uno ede uno o más grupos hidroxilo de la molécula precursora por reacción con un grupo amino para formar una molécula precursora activada; (iii) poner en contacto bajo condiciones de acoplamiento covalente, al emnos uno de uno o más grupos hidroxilo activados con un polímero soluble en agua que tiene un grupo amino, con ello, formar un polímeo comprendido de la porción de polímero soluble en agua y el grupo reactivo protegido; y (iv) desproteger el grupo reactivo protegido, cuando se presenta, formando con ello el reactivo polimérico. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque además comprende la etapa de aislar el reactivo polimérico. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la etapa de aislamiento se lleva a cabo realizando cromatografía. 29. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la molécula precursora protegida contiene un grupo hidroxilo o una forma protegida del mismo. 30. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la molécula precursora protegida contiene dos grupos hidroxilo o formas protegidas del mismo. 31. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la molécula precursora protegida contiene tres grupos hidroxilo o formas protegidas del mismo. 32. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la molécula precursora protegida tiene la siguiente estructura: en donde PG es un grupo protector. 33. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el precursor protegido comprende un grupo protector seleccionado del grupo que consiste de metilo, etilo, metoximetilo ( OM) , metiltiometilo (MTM) , tetrahidropiranilo (THP) , bencilozimetilo, fenacilo, N-f alimidometilo, 2,2,-tricloroetilo, 2-haloetilo, 2- (p-toluensulfonil) etilo, t-butilo, cinamilo, bencilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, bis (o-nitrofenil) metilo, 9-antrilmetilo, 2- (9,10-dioxo) antrilmetilo, piperonilo, trimetilsililo y t-butildimetilsililo. 34. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el agente de activación es carbonato de di (N-succinimidilo) (DSC), ?,?'- diciclohexilcarbodiimida (DCC) , ?,?'- diisopropilcarbodiimida, N- (3-dimetilaminopropil) -N' - etilcarbodiimida, 1, 1' -carbonildiimidazol (CDI) , 1,1'- carbonild(l,2,4-triazol) (CDT) , bis (4-nitrofenil) carbonato, p-nitrofenil clorocarbonato, fosgeno, tirfósgeno, 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) , dibenzotriazolil carbonato (diBTC) , N-hidroxisuccinimida y DCC, N-hidroxiftalimida y DCC, y tiazlidin tiona. 35. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polímero soluble en agua que tiene un grupo se selecciona del grupo que consiste de: en donde: (m) es 2 hasta 4000. 36. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la etapa de desprotección comprende los métodos seleccionados del grupo que consiste de hidrólisis promovida por base, hidrólisis catalizada por ácido y reducción. 37. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende la etapa opcional de convertir el grupo reactivo a un grupo reactivo diferente . 38. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende la etapa opcional de llevar a cabo la etapa de incrementar la reactividad del grupo reactivo . 39. Un conjugado, caracterizado porque comprende R1 o un polímero soluble en agua, una porción —^—c—o— / Y un agente farmacológicamente activo, en donde: (i) el polímero soluble en agua etá ligado al átomo de nitrógeno de la R1 o porción _[¡J_l_0_ a través de ya sea un enlace covalente directo o através de una primera porción espaciadora; (ii) el agente farmacológicamente activo está ligado al átomo de R1 o carbono carbonilo de la porción _¡d_c_o- a través de ya sea un enlace covalente directo o una segunda porción espaciadora; y (iii) R1 es H o un radical orgánico. 40. Un método para preparar un conjugado caracterizado porque comprende la etapa de poner en contacto un reactivo polimérico de conformidad con la reivindicación 1 con un agente activo bajo condiciones adecuadas para con ello proporcionar el conjugado de fármaco . 41. Una preparación farmacéutica caracterizada porque comprende el conjugado preparado de conformidad con la reivindicación 40 en combinación con un excipiente farmacéutico. 42. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el excipiente es azúcar. 43. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque está en forma liofilizada. 44. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque además comprende un diluyente líquido. 45. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el diluyente líquido se selecciona del grupo que consiste de agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5% en agua, salina amortiguada con fosfato, solución inger, solución salina, agua estéril, agua desionizada, y combinaciones de las mismas. 46. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque está en forma de dosificación unitaria. 47. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque se aloja en un vial de vidrio. 48. Un método para suministrar un conjugado, caracterizado porque comprende la etapa de administrar a un paciente, una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de conformidad con la reivindicación 39. 49. Un polímero caracterizado porque comprende un R1 o polímero soluble en agua, una porción _?_?_0_ , y un agente farmacológicamente activo, en donde: (i) el polímero soluble en agua etá ligado al átomo de nitrógeno de la R1 O porción —i,-cn-o—. a través de yJa sea un enlace covalente directo o através de una primera porción espaciadora; (ii) el agente farmacológicamente activo está ligado al átomo de R O carbono carbo ilo de la porción _[J1_ii_0_ a través de ya sea un enlace covalente directo o una segunda porción espaciadora; y (iii) 1 es H o un radical orgánico.
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