CN1747748A

CN1747748A - 具有特定原子排列的聚合物衍生物

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Publication number: CN1747748A
Application number: CNA2004800040643A
Authority: CN
Inventors: J·M·哈里斯; A·科兹洛夫斯基; S·P·麦克马纳斯; M·D·本特利; S·A·查尔斯
Original assignee: Nektar Therapeutics AL Corp
Current assignee: Nektar Therapeutics
Priority date: 2003-05-23
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2006-03-15
Anticipated expiration: 2024-05-21
Also published as: CA2510040A1; EP2644206A2; EP1626741A2; EP2644206A3; JP2007500278A; DK2644206T3; EA011351B1; IL169165A; WO2005000360A3; CA2510040C; HUE043911T2; PT2644206T; US7887789B2; AU2004251602B2; MXPA05007628A; PL2644206T3; AU2004251602A1; SI2644206T1; US20050009988A1; CY1121759T1

Abstract

提供了聚合试剂，它含有以特定次序排列的原子部分，其中该部分位于水溶性聚合物和反应基之间。本发明聚合试剂特别适用于，除了其它事情以外，形成聚合物－活性剂偶联物。还提供了相关的方法、组合物、制剂等等。

Description

具有特定原子排列的聚合物衍生物

发明领域

本发明总地涉及包含特定内部结构取向的新聚合试剂，以及涉及这些新聚合试剂的偶联物。此外，本发明涉及合成聚合试剂的方法和将聚合试剂和活性剂及其他物质偶联的方法。此外，本发明还涉及药物制剂以及将偶联物给药于患者的方法。

发明背景

科学家和临床医生在他们试图将活性剂开发成适于传送至患者的形式中面临很多挑战。是多肽的活性剂，例如，通常通过注射而不是口服途径传送。以这种方式，将多肽引入全身循环而不暴露于胃的蛋白水解环境中。然而，注射多肽具有数个缺点。例如，许多多肽半衰期相对短，因此需要重复注射，其通常是不方便和疼痛的。此外，一些多肽可能引起一个或多个免疫反应，结果是可能激活患者的免疫系统而降解了多肽。因此，活性剂如多肽的传送通常存在问题，即使通过注射给予这些药剂时。

在解决通过注射传送活性剂的问题中已经获得了一些成功。例如，将活性剂和水溶性聚合物偶联形成免疫原性和抗原性降低的聚合物-活性剂偶联物。此外，由于通过肾脏清除降低和/或全身循环中酶降解降低，这些聚合物-活性剂偶联物和它们未偶联对应物相比较通常极大地增加了半衰期。由于具有更大的半衰期，聚合物-活性剂偶联物需要的服药频率较低，其依次减少了疼痛注射的总数和卫生保健医生的不方便观察。此外，仅仅是边缘可溶的活性剂当和水溶性聚合物偶时通常证明显著增加了水溶解性。

对于局部使用和内服，由于其证实的安全性以及其得到了FDA的批准，聚乙二醇已经和活性剂偶联。当活性剂和聚乙二醇或“PEG”的聚合物偶联时，偶联的活性剂通常称为已经“PEG化的”。PEG化活性剂如PEGASYS^PEG化的干扰素α-2a(Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ)、PEG-INTRON^PEG化的干扰素α-2b(Schering Corp.，Kennilworth，NJ)和NEULASTA^TMPEG-非格司亭(Amgen Inc.，ThousandOaks，CA)的商业成功证明，给药偶联形式的活性剂相对于未结合对应物可具有显著优势。还制得与聚(乙二醇)偶联的小分子如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Zalipsky(1993)Bioconjug.Chem. 4(4)：296-299)与氟尿嘧啶(Ouchi等(1992)Drug Des.Discov. 9(1)：93-105)。Harris等已经提供了聚乙二醇化对药物影响的综述。Harris等(2003)Nat.Rev.Drug Discov. 2(3)：214-221。

尽管这些成功，水溶性聚合物和活性剂的偶联仍然存在挑战。这样的挑战之一是和相对长的聚乙二醇分子连接时活性剂会失活。尽管相对长的聚乙二醇分子可以为相应的活性剂-聚合物偶联物提供更大水溶解性，已知带有这样长聚乙二醇部分的偶联物在体内实质上是无活性的。已经假定这些偶联物的失活是由于相对聚乙二醇链的长度，其有效地将它本身缠绕在整个活性剂周围，因此阻断了活性所需的接近潜在配体。

通过使用“支化”形式的聚合物，已经部分解决了带有相对大聚乙二醇部分偶联物失活相关的问题。这样“支化”聚合物的实例描述于Harris等的美国专利No.5,932,462中。如其中所述，“mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺”可以连接至生物活性蛋白质上的可接近氨基(例如，由于构象结构没有物理阻断的氨基)。该支化聚合物(分子量约40,000道尔顿)从Nektar Therapeutics(Huntsville，AL)可获得且具有以下结构：

其中mPEG_20K表示约20,000道尔顿分子量的甲氧基封端的聚乙二醇衍生物。

该支链聚合物和干扰素α-2a的偶联形成含有连接干扰素α-2a至聚合物的酰胺键的偶联物。示意地，偶联物可以如下表示：

该偶联物，可以PEGASYS^品牌商业上获得的聚乙二醇化干扰素α-2a(Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ)，表明用于治疗成人的丙型肝炎。

尽管使用支链聚合物可以解决一些与相对大的线性聚合物相关的问题，仍然存在制备有用偶联物的其它挑战。例如，偶联物的体内降解速率通常不可接受地太长或太短。特别地，在连接活性剂至聚合物的一连串原子一些位点发生的水解速率通常(尽管不是必需的)部分地控制了体内降解速率。因此，相对快的水解速率可以导致不可接受的具有太短体内半衰期的偶联物，而相对慢的水解可以导致不可接受的具有太长体内半衰期的偶联物。因此，具有独特系列原子(在聚合物自身以及相应偶联物中)的聚合物可以导致独特的水解速率，其随后影响了偶联物的体内降解速率。

某些活性剂和mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺的偶联物的水解发生在将一个mPEG“支链”连接至另一个的原子链中，假定代谢产物之一具有约20,000道尔顿的分子量。原子链中用于这样裂解的一个可能的位置是直接位于相邻于聚合物中一个mPEG部分的

部分中。

部分表示裂解的最可能的位置，因为将一个mPEG支链连接至另一个的链中仅有的其它原子是构成亚甲基的一连串碳原子，其在体内降解比部分相对更稳定。裂解后，聚合物分开的形式是mPEG-OH。因此，至少部分基于形成mPEG-OH的偏好，结果是独特的水解速率。

然而，理想的是能够提供聚合物使得它们的水解速率可以“定制”。例如，关于通常每周给药的PEG化干扰素α-2a，更慢的水解速率可以提供给药之间的甚至更长时间段。此外，通过增加偶联物的水解敏感性可以改进具有太长体内半衰期的偶联物。

具有独特水解速率聚合物的展开调色板(palette)使研究者和科学家能提供“定制”的活性剂-聚合物偶联物来提供(除了其它事情以外)所需的水溶解性和/或体内降解速率的增加。此外，具有独特水解速率的聚合物不仅可以用于支链聚合物，还可以用于其它形式(例如，线性或多臂的)。因此，仍然存在提供(除了其它事情以外)独特系列的原子来提供“定制的”降解速率的聚合物的需求。对申请人知识的最佳来说，在此所述的聚合物、偶联物、制剂，和方法是新的且本技术完全没有建议过。

发明概述

因此，本发明的主要目的是提供含有下列结构的聚合试剂：

水溶性聚合物

式(I)

其中：“水溶性聚合物”是水溶性聚合物，每个“-\\-”独立地表示直接共价键或间隔部分；R¹是H或有机基；Z是反应基。如式(I)所示，水溶性聚合物和

部分的氮原子接近，反应基Z和

部分的羰基碳原子接近。尽管带有部分的聚合试剂包括于本发明中，优选具有和

羰基碳原子邻接的氧原子，因此形成

部分，通常称为“氨基甲酸酯”或“尿烷”基。其他官能团也可以存在于聚合试剂内或其上。

本发明另一个目的是提供这样的聚合试剂，其中R¹是H。

本发明还另一个目的是提供这样的聚合试剂，其中硫原子和

部分的羰基碳原子连接，因此形成

部分。

本发明还另一个目的是提供这样的聚合试剂，其中-N(R²)-部分和

部分的羰基碳原子连接，因此提供

部分，其中R²是H或有机基。

本发明还另一目的是提供聚合试剂，其中水溶性聚合物是聚(烯化氧)。

本发明进一步的目的是提供制备上述聚合试剂的方法，其中该方法包括步骤(i)提供由受保护反应基或反应基前体和一个或多个羟基组成的前体分子；(ii)激活前体分子一个或多个羟基中的至少一个来和氨基反应形成激活的前体分子；(iii)在共价偶联的条件下将一个或多个激活羟基中的至少一个和具有氨基的水溶性聚合物接触，因此形成由水溶性聚合物部分和受保护反应基或反应基前体组成的聚合物；和(iv)当保护反应基存在时将它去保护。

本发明还进一步的是提供聚合物偶联物，该偶联物包含水溶性聚合物、

部分，和药理学活性剂，其中：(i)通过直接共价键或通过第一个间隔部分将水溶性聚合物和

部分的氮原子连接；(ii)通过直接共价键或第二个间隔部分将药理学活性剂和

部分的羰基碳原子连接；和(iii)R¹是H或有机基。

本发明另外的目的是提供制备偶联物的方法，该偶联物包含在合适条件下将在此提供的聚合试剂和活性剂接触因此形成偶联物的步骤。通常，活性剂通过聚合试剂上的反应基和活性剂上的官能团(例如，胺)之间的反应和聚合物共价连接。

本发明还一个另外的目的是提供药物制剂，该制剂包含和药物赋形剂组合的在此提供的活性剂-聚合物偶联物。

另外的目的是提供传送药理学活性剂的方法，该方法包括给予治疗有效量的在此提供的活性剂-聚合物偶物联的步骤。

在下面的说明中将描述本发明另外的目的、优点和新特征，且它们部分地，对本领域技术人员来说根据以下内容将变得显而易见，或通过实施本发明得知。

然后在一个实施方案中，提供了聚合试剂，该聚合试剂包含位于水溶性聚合物和反应基之间的部分。该内部结构排列是这样的(i)

部分的氮和水溶性聚合物接近，(ii)

部分的羰基碳原子和反应基接近，和(iii)R¹是H或有机基，其中有机基通常选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。

本发明的聚合试剂还包含水溶性聚合物、部分，和反应基，其中：(i)通过直接共价键或通过第一个间隔部分，水溶性聚合物和

部分的氮原子连接；(ii)通过直接共价键或第二个间隔部分，反应基和部分的羰基碳原子连接；和(iii)R¹如前定义。

对于本发明的聚合试剂来说，任何水溶性聚合物可以用作聚合试剂中的水溶性聚合物，且在这点上本发明不受限制。然而，优选的聚合物是在一端封端的。此外，优选具有小于约120,000道尔顿质量平均分子量的聚合物。

另一个实施方案中，提供了制备本发明聚合试剂的方法。简短地说，该方法包括提供由有受保护反应基或反应基前体和一个或多个羟基组成的前体分子。激活前体分子一个或多个羟基中的至少一个(因此形成激活的前体分子)使得一个或多个羟基中的至少一个将和氨基反应。此后，在共价偶联的条件下放置激活的前体分子并使其和具有氨基的水溶性聚合物接触，因此使两者化学反应。随后的反应导致水溶性聚合物和激活的前体分子之间形成共价键，其依次形成由水溶性聚合物部分和受保护反应基或反应基前体组成的聚合物。通常，该聚合物可以进一步和各种试剂反应以便用例如所需的反应基功能化聚合物。当前体分子包含受保护反应基时，该方法有利地包括去保护步骤来除去保护反应基的基团。任意地，进行分离聚合物的步骤使得可以以更纯的形式提供聚合物。

在本发明的还另一个实施方案中，提供了偶联物，该偶联物包括水溶性聚合物、

部分，和活性剂，其中：(i)通过直接共价键或通过第一个间隔部分，水溶性聚合物和

部分的氮原子连接；(ii)通过直接共价键或第二个间隔部分，药理学活性剂和部分的羰基碳原子连接；和(iii)R¹是H或有机基。有利地，可以使用可以和在此提供的聚合试剂偶联的任何活性剂，且关于所用的特定活性剂本发明不受限制。

在本发明的还另一个实施方案中，提供了制备偶联物的方法，该方法包括在适于提供偶联物的条件下将在此提供的聚合试剂和活性剂接触的步骤。

在本发明的还另一个实施方案中，提供了药物制剂，该制剂包含和药物赋形剂组合的本发明偶联物。药物制剂包括所有类型的制剂，尤其是那些适于注射的，例如，可以重构的粉末以及悬浮液和溶液。

在本发明另外的实施方案中，提供了给予偶联物的方法，该方法包括将治疗有效量的在此提供的偶联物给予患者的步骤。通常，尽管不是必需的，以药物制剂的部分来提供偶联物。可以使用给予偶联物的任何方法，在这点上本发明不受限制。然而，优选通过注射给予偶联物。

发明详述

在详细描述本发明之前，将要理解本发明不限于特定聚合物、合成技术、活性剂，等等，这些可以改变。

必须注意，本说明书和权利要求中所用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括多个所指对象，除非文中明确地另外指出。因此，例如，提到“聚合物”包括单个聚合物以及两个或更多个相同或不同的聚合物，提到“偶联物”指的是单个偶联物以及两个或更多个相同或不同的偶联物，提到“赋形剂”包括单一种赋形剂以及两种或更多种相同或不同的赋形剂，等等。

在描述和要求保护本发明中，将根据以下所述的定义使用下列术语。

如在此所用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”，意思是包括任何水溶性聚(环氧乙烷)，且可以交换使用。通常，用于本发明的PEG将包括“-(OCH₂CH₂)_m”或“-O(CH₂CH₂O)_m”，其中(m)是2至4000，且所有PEG的端基和结构可以改变。如在此所用的，根据末端氧是否被取代，PEG还包括“-CH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-”和“-(CH₂CH₂O)_m”。当PEG进一步包括间隔部分时(以下将更详细描述)，包括间隔部分的原子，当和水溶性聚合物共价连接时，不导致氧-氧键(即，“-O-O-”或过氧化物键)的形成。贯穿说明书和权利要求，应该记住术语“PEG”包括具有各种末端或“封端”基团等等的结构。“PEG”意思是含有多数，也就是说，大于50％，为-CH₂CH₂O-亚基的聚合物。常用PEG之一是封端PEG。用于本发明的特定PEG形式包括具有各种分子量、结构或几何结构(例如，支链，线性，分叉PEG，多功能，多臂等等)的PEG，以下将更详细描述。

在此可以交换使用术语“封端”或“末端封头”以表示具有封端部分的聚合物的末端或端点。通常，关于PEG，封端部分包括羟基或C_1-20烷氧基。因此，封端部分的实例包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和苄氧基)，以及芳基、杂芳基、环、杂环，等等。应该记住，当结构拉长时，末端羟基和烷氧基可以包括重复环氧乙烷单体的末端氧原子，取决于如何定义重复环氧乙烷单体[例如，“-(OCH₂CH₂)_m”或“-CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-”]。此外，可以预见每个前述封端部分的饱和、不饱和、取代和未取代形式。此外，封端基团还可以是硅烷或脂质(例如，磷脂)。封端基团还可以有利地包括可检测的标记。当聚合物具有含有可检测标记的封端基团时，偶联所关心聚合物的聚合物和/或部分(例如活性剂)的数量或位置可以使用合适的检测仪来检测。这样的标记包括，无限制，荧光剂、化学发光剂、酶标记中所用的部分、比色剂(例如，染料)、金属离子、放射性部分，等等。合适的检测仪包括光度计、薄层、光谱仪，等等。

关于聚合物“非天然存在”意思是指不以其整体存在于自然界的聚合物。然而，非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一个或多个亚基或亚基的部分，只要全部聚合物结构不存在于自然界。

术语“水溶性”如在“水溶性聚合物”中是在室温溶于水的聚合物。通常，水溶性聚合物溶液透过至少约75％，更优选至少约95％的光，过滤后通过相同溶液透光。基于重量，水溶性聚合物或其部分将优选至少约35％(重量)可溶于水，更优选至少约50％(重量)可溶于水，还更优选约70％(重量)可溶于水，还更优选约85％(重量)可溶于水。然而，最优选水溶性聚合物或部分是约95％(重量)可溶于水或完全溶于水。

本发明水溶性聚合物情况下的分子量，如PEG，可以表示为数均分子量或重均分子量。除非另外指出，在此所有涉及的分子量指的是加权平均分子量。两种分子量，数均和重均的测定，可以使用凝胶渗透色谱法或其它液体色谱法技术来测量。还可以使用测量分子量值的其它方法，如使用端基分析或测量依数性质(例如，冰点降低、沸点升高，或渗透压)来测定数均分子量或使用光散射技术、超离心或粘度测定法来测定重均分子量。本发明的聚合试剂通常是多分散的(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，具有低的多分散性值，优选小于约1.2，更优选小于约1.15，还更优选小于约1.10，还更优选小于约1.05，最优选小于约1.03。

如在此所用，术语“羧酸”是具有

官能团的部分[也表示为“-COOH”或“-C(O)OH”]，以及为羧酸衍生物的部分，这样的衍生物包括，例如，受保护的羧酸。因此，除非上下文明确地另外指出，术语羧酸不仅包括酸形式，还包括相应的酯和受保护的形式。羧酸的示范性保护基和其它保护基描述于Greene等“PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS，”第6章，第3版，John Wiley和sons，Inc.，New York，1999(p.454-493)中。

术语“反应的”或“激活的”当和特定官能团结合使用时，指的是容易和另一分子上的亲电体或亲核体反应的反应官能团。这和为了反应需要强催化剂或高度不实用反应条件的那些基团(即，“不反应的”或“惰性”基团)相反。

术语“受保护的”、“保护基”和“保护性基团”指的是防止或阻断在特定反应条件下分子中特定化学反应性官能团的反应的部分(即，保护基)的存在。根据待保护的化学反应基的类型以及使用的反应条件和分子中存在的另外的反应基或保护基(若有的话)，保护基将变化。本领域已知的保护基可以在Greene等，上文中找到。

“激活的羧酸”意思是比母体羧酸更反应性的羧酸功能性衍生物，尤其是，就亲核酰基取代而言。激活的羧酸包括但不限制于酸卤化物(如酸氯化物)、酐、酰胺和酯。

如在此所用的，术语“官能团“或其任何同义词意思是包括其受保护形式。

在此所用的术语“间隔”和“间隔部分”指的是任意用于连接互连部分如水溶性聚合物部分的末端和官能团的原子或原子集合。间隔部分可以是水解稳定的或可以包括生理上可水解的或酶降解的键。

“烷基”指的是烃链，通常为约1至20个原子长度。这样的烃链优选，但不是必需是饱和的并可以是支链或直链，尽管通常优选直链。示范性烷基包括乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基(即，2-戊基)、1-乙基丙基(即，3-戊基)、3-甲基戊基，等等。如在此所用的，“烷基”包括环烷基，当涉及三个或更多碳原子时。

“低级烷基”指的是含有1至6个碳原子的烷基，可以是直链或支链，实例为甲基、乙基、正丁基、异丁基，和叔丁基。

“环烷基”指的是饱和或不饱和环烃链，包括桥接的、稠合的，或螺环化合物，优选由3至约12个碳原子组成，更优选3至约8个。

“非干扰取代基”是当存在于分子中时，通常和分子中含有的其他官能团不反应的那些基团。

术语“取代的”，如在例如“取代的烷基”中指的是由一个或多个非干扰取代基取代的部分(例如，烷基)，取代基例如但不限制于：C₃-C₈环烷基，例如环丙基、环丁基，等等；卤代，例如，氟代、溴代和碘代；氰基；烷氧基，苯基；取代的苯基；等等。“取代的芳基”是具有一个或多个非干扰基团作为取代基的芳基。对于苯环上的取代，取代基可以是任何方向的(即，邻位、间位，或对位)。

“烷氧基”指的是-O-R基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选C₁-C₂₀烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、苄氧基，等)，优选C₁-C₇。

如在此所用的，“烯基”指的是1至15个原子长度的支链或无支链烃基，含有至少一个双键，如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、四癸烯基，等等。

如在此所用的术语“炔基”指的是2至15个碳原子长度的支链或无支链烃基，含有至少一个三键，乙炔基、正丁炔基、异戊炔基、辛炔基、癸炔基，等等。

“芳基”意思是一个或多个芳环，每个为5或6个核心碳原子。芳基包括可被稠合的多个芳环，如在萘基中，或未稠合的，如在联苯中。芳环还可以和一个或多个环烃、杂芳基或杂环稠合或未稠合。如在此所用的，“芳基”包括杂芳基。

“杂芳基”是含有1至4个杂原子的芳基，优选N、O，或S，或其组合。杂芳环还可以和一个或多个环烃、杂环、芳基或杂芳环稠合。

“杂环”或“杂环的”意思是一个或多个5-12个原子的环，优选5-7个原子，带有或不带有不饱和或芳香性并至少一个环原子不是碳。优选的杂原子包括硫、氧，和氮。

“取代的杂芳基”是具有一个或多个非干扰基团作为取代基的杂芳基。

“取代的杂环”是具有一个或多个由非干扰取代基形成的侧链的杂环。

“亲电体”指的是离子或原子或原子集合，它可以是离子的，具有亲电子中心，即电子搜索的中心，能够和亲核体反应。

“亲核体”指的是离子或原子或原子集合，它可以是离子的，具有亲核中心，即搜索亲电中心或带有亲电体的中心。

“生理学上可裂解”或“可水解”或“可降解”键是在生理条件下和水反应(即，水解)的相对弱的键。键在水中水解的倾向不仅将取决于连接两个中心原子键的一般类型，还取决于和这些中心原子连接的取代基。合适的水解不稳定或弱键包括但不限制于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、乙缩醛、酮缩醇、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。

“酶可降解键”意思是经历被一种或多种酶降解的键。

“水解稳定”键指的是在水中实质上稳定的化学键，通常为共价键，也就是说，在生理条件下在延长的时间段内不水解成任何可察觉的程度。水解稳定键的实例包括但不限制于以下键：碳-碳键(例如，脂肪链中)、醚、酰胺、尿烷，等等。通常，水解稳定键是在生理条件下呈现每天水解速率小于约1-2％每天。代表性化学键的水解速率可以在大多数标准教科书中找到。

术语“活性剂”、“生物活性剂”和“药理学活性剂”在此可交换使用并定义为包括提供可以在体内或体外证明的一些药理效应(通常是有益的)的任何药剂、药物、化合物、物质的组合物或混合物。这包括食品、食品补充剂、营养物、营养药、药物、疫苗、抗体、维生素，和其他有益的药剂。如在此所用的，这些术语进一步包括在患者中产生局部或全身作用的任何生理或药理学活性物质。

“药物学上可接受的赋形剂”和“药物学上可接受的载体”指的是可以包括于本发明组合物中且不对患者引起显著不良毒理作用的赋形剂。

“药理学有效量”、“生理学有效量”和“治疗有效量”在此交换使用，意思是指提供血流中或目标组织中希望的活性剂和/或偶联物的水平所需要的聚合物-活性剂偶联物(通常存在于药物制剂中)的量。准确的量取决于多个因素，例如，特定活性剂、药物制剂的成分和物理特征、计划的患者人数、患者因素，等等，并本领域技术人员可以容易确定，基于在此提供的和相关文献中可获得的信息。

本发明聚合物范围中的“多功能”意思是指其中具有3个或更多个官能团的聚合物，其中官能团可以相同或不同。本发明的多功能聚合物通常在聚合物骨架中含有约3-100个官能团，或3至50个官能团，或3至25个官能团，或3至15个官能团，或3至10个官能团，或将含有3，4，5，6，7，8，9或10个官能团。“双功能”聚合物意思是其中含有两个官能团的聚合物，相同(即，同型双功能的)或不同(即异型双功能的)。

涉及聚合物几何构造或总体结构的“叉状”，指的是具有一个聚合物“臂”(即，单个水溶性聚合物)的双功能聚合物，其中两个官能团(直接或通过一个或多个原子)连接至用作分支原子的原子，其依次和水溶性聚合物连接(直接或通过一个或多个原子)。

涉及聚合物几何结构或总体结构的“支化的”，指的是聚合物具有两个或更多个聚合物“臂”的聚合物。支化聚合物可以具有2个聚合物臂、3个聚合物臂、4个聚合物臂、6个聚合物臂、8个聚合物臂或更多。一种特定类型的高度支化聚合物是树枝状聚合物或树枝状物(dendrimer)，其对于本发明的目的，认为具有与支化聚合物的结构不同的结构。

“树枝状物”或树枝状聚合物是球状、大小单分散性的聚合物，其中所有键以规则的分支模式和每个提供一个分支点的重复单元从中心焦点或核心放射地呈现。树枝状物呈现特定树枝状特性如核心包围，使得它们独特于其他类型的聚合物包括支链聚合物。

在此所述的碱性或酸性反应剂包括其中性、带电荷的，和其任何相应的盐形式。

术语“患者”指的是遭受或倾向于通过给药在此提供的偶联物可以防止或治疗的状况的活有机体。

“有机基”是可通过共价键和另一个原子连接的含有碳的部分。示范性有机基包括选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基的那些。

“任意”或“任意地”意思是随后所述的情况可能发生或可能不发生，使得描述包括情况发生的实例和情况不发生的实例。

如在此所用的，当卤素和分子连接时，通常使用“卤代”命名符(例如，氟代、氯代、碘代、溴代，等等)，而当使用离子形式时使用后缀“化物(ide)”(例如，氟化物、氯化物、碘化物、溴化物，等等，当卤素以其独立的离子形式存在时(例如，当离去基团离开分子时)。

在本发明所述范围内，应该认识到关于一个结构或式提供的变量定义是适用于不同结构中重复的相同变量的，除非文中另外指出。因此，例如，关于聚合试剂的“POLY”、“间隔部分”、“Z”等等的定义同等适用于在此提供的水溶性聚合物偶联物。

然后转向本发明的第一个实施方案，提供了独特的聚合试剂。尽管不希望受到理论的束缚，申请者认为在此所述的聚合试剂不同的特征可归因于原子的独特取向。例如，当将在此所述聚合试剂和活性剂偶联形成偶联物时，偶联物的体内水解速率不同于具有相同原子但是以不同次序排列偶联物的水解速率。除了提供可选择的水解速率，在此提供的聚合试剂相对于现有技术聚合试剂的另外优点。

本发明的聚合物包括以特定方式取向的三个分开的组分。这三个组分如下：含有重复单体单元的水溶性聚合物；含有和羰基碳原子共价结合的氮原子的部分；和反应基。将聚合物的三个组分特定取向，使得上文提到部分的氮原子和聚合物重复单体部分接近，而碳原子和反应基邻接。将要理解本文中的术语“接近”指的是沿着连接原子的最接近路径将要“最近的”而不是就空间或绝对距离而言的最近。

因此，可以通过下式图解表示聚合物：

水溶性聚合物

(式I)

其中“水溶性聚合物”是含有重复单体单元的水溶性聚合物；每个“-\\-”独立地是直接的共价键或间隔部分；R¹是H或有机基；和Z是反应基。如式I所示，

部分的氮和水溶性聚合物接近，而羰基的碳原子和反应基“Z”接近。

因此本发明的聚合试剂包含位于水溶性聚合物和反应基之间的

部分，其中：(i) 部分的氮原子和水溶性聚合物接近，(ii)

部分的羰基碳原子和反应基接近，和(iii)R¹如上定义。通过直接共价键或通过第一个间隔部分，水溶性聚合物和

部分的氮原子连接。通过直接共价键或第二个间隔部分，反应基和部分的羰基碳原子连接。

此外，本发明的聚合试剂可以描述为包含水溶性聚合物，

部分，和反应基，其中：(i)通过直接共价键或通过第一个间隔部分，水溶性聚合物和

部分的氮原子接近，(ii)通过直接共价键或通过第二个间隔部分，反应基和

部分的羰基碳原子接近，和(iii)R¹如上定义。

当分离和与邻近原子分开考虑时，可以将

部分(其中R¹是H或有机基)认为是酰胺部分。然而，必须记住，聚合物中的

部分是更大结构的部分。例如，氧原子可被并且优选直接和

部分的羰基碳原子连接，因此提供通常称为“氨基甲酸酯”或“尿烷”的

部分。同样，硫原子可以任意和

部分的羰基碳原子连接，因此提供部分。此外，-N(R²)-部分可以和部分的羰基碳连接，因此提供

部分，其中R²是H或有机基。最后，所有涉及制成

部分的例子中，可以取代部分，因此本发明不仅仅受限于

部分。

因此，为了此后描述化学结构的目的，通常提及部分。然而，为了本发明描述的目的，

部分(其中氧原子没有和羰基碳原子连接)、部分、

部分、部分、

部分、

部分和

部分中每个，可以被取代，当提及

部分时。

关于

部分，氮原子的一个键和邻接的羰基碳的碳原子(“羰基碳”)连接，另一个键直接和水溶性聚合物或间隔部分连接，第三个键和取代基“R¹”连接。“R¹”是任何非干扰取代基。尽管不是必需的，R¹通常是H或有机基。然而，优选R¹是H。在当R¹是有机基时的那些例子中，优选的有机基包括选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基的那些。优选有机基的特定实例包括选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基，和哌啶酮基的那些。

关于反应基“Z”，该基团可以是在合适条件下和合适试剂反应的任何基团。优选的反应部分选自亲电体和亲核体。这样反应基的实例包括，但不限制于，选自羟基(-OH-)、酯、酯、原酸酯、碳酸酯、碳酸酯、乙缩醛、醛、醛水合物、酮、乙烯酮、酮水合物、硫酮、单硫代水合物、二硫代水合物、半酮缩醇、单酮缩硫醇半酮缩醇、二硫代半酮缩醇、酮缩醇、二硫代酮缩醇、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、砜、胺、酰肼、硫醇、二硫化物、硫醇水合物、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺

琥珀酰亚胺苯并三唑乙烯砜、氯乙基砜、二硫代吡啶、乙烯吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、硫代磺酸盐、tresylate、硅烷、-(CH₂)_rCO₂H、-(CH₂)_r′CO₂NS、-(CH₂)_r′CO₂Bt、-(CH₂)_rCH(OR)₂、-(CH₂)_rCHO、-(CH₂)₂-NH₂、-(CH₂)_rM、-(CH₂)_r-S-SO₂-R，其中(r)是1-12，(r’)是0-5，R是芳基或烷基，NS是N-琥珀酰亚胺基，Bt是1-苯并三唑基，和M是N-马来酰亚胺基，以及前述的任体受保护和激活形式。

关于任何反应基，尤其是马来酰亚胺和醛，任意衔接物可以连接反应基至聚合物。因此，例如，衔接物可以将反应基和间隔部分或分支部分(当存在时)连接。此外，当间隔部分或分支部分都不存在时，衔接物可以将反应基和

部分的羰基碳直接连接。衔接物可以包括含有至少四个碳原子的直链饱和无环烃，如四亚甲基、1，5-亚戊基，和1，6-亚己基，以及含有至少四个碳原子的支链饱和无环烃。在一个实施方案中，键的烃部分具有结构-(CR³R⁴)_g-，其中每个R³独立地是H、烷基或环烷基，每个R⁴独立地是H、烷基或环烷基，和(g)是3至约20，优选4至约12。在一个优选实施方案中，每个R³和R⁴是H。在支链无环烃实施方案中，优选在最接近反应基(例如，马来酰亚胺)的两个碳原子中的一个或多个处产生分支，以便最大化位阻。另一实施方案中，键的烃部分包括饱和二价脂环烃并具有结构-(CR³R⁴)_p-C_3-12环烷基-(CR³R⁴)_q-，其中p和q各自独立地是0至约10，优选0至约6(例如，0，1，2，3，4，5或6)，且R³和R⁴如前定义。二价环烷基(例如，亚环烷基)优选C₃-C₈亚环烷基，如环丙二烯(例如，1，1-、顺1，2-，或反-1，2-环丙烯)、环丁二烯、环戊二烯、环己二烯和环庚二烯的各种异构形式。亚环烷基可以由一个或多个烷基，优选C_1-6烷基取代。

关于水溶性聚合物，本发明的聚合试剂还含有至少一个水溶性聚合物部分。非肽和水溶性，具有2至约300个末端的水溶性聚合物，对本发明尤其有用。合适水溶性聚合物的实例包括，但不限制于，聚(亚烷基二醇)，如聚(乙二醇)(“PEG”)，具有水溶解性的乙二醇和丙二醇的共聚物，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羟酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，如美国专利No.5,629,384中所述的。在一些期望相对高水溶解性的应用中，水溶性聚合物不是聚(氧化丙烯)。

每个水溶性聚合物中的重复单元可以具有多种不同的排列，包括但不限制于，选自均聚物(其中含有水溶性聚合物的每个单体单元是相同的)、交替共聚物(其中在水溶性聚合物中第一个单体单元和第二个单体单元一致地交替)、随机共聚物(其中在水溶性聚合物中第一个单体单元和第二个单体单元不一致地交替)、嵌段共聚物(其中水溶性聚合物中两个或更多个第一单体单元和两个或更多个第二单体单元交替)、交替三聚物、随机三聚物，和嵌段三聚物的那些。

尽管不是必需的，水溶性聚合物优选聚(乙二醇)(“PEG”)或其衍生物。然而，应该理解，相关的聚合物也适用于本发明的实践中，术语“PEG”或“聚(乙二醇)”在这点上意思是包括性的而不是排他性的。因此，术语“PEG”包括呈其线性、支化或多臂形式的任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能PEG、叉状PEG、支化PEG、悬垂PEG，或其中带有可降解键的PEG，以下将更全面描述。

在适用于本发明的一个形式中，游离或未结合的PEG是每端由羟基终止的线性聚合物：

HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m’-CH₂CH₂-OH

(m’)通常为0至约4,000。

上述聚合物，α-，ω-二羟基聚(乙二醇)，可以以HO-PEG-OH的简写形式来表示，其中不用说-PEG-符号可以表示以下结构单元：

-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m’-CH₂CH₂-

其中(m’)如上定义。

适用于本发明的另一种类型PEG是甲氧基-PEG-OH，或简写为mPEG，其中一个末端是相对惰性的甲氧基，而另一末端是羟基。以下给出mPEG的结构。

CHO₃-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m’-CH₂CH₂-OH

其中(m’)如上定义。

除了上述形式的PEG，还可以用聚合物，包括任何上述聚合物中的一个或多个弱的或可降解的键制备聚合物。例如，可用聚合物中接受水解的酯键制得PEG。如下所示，该水解导致聚合物裂解成更低分子量的片段：

适用作聚合物骨架中的可降解键的其它水解可降解键包括：碳酸酯键；例如由胺和醛反应形成的亚胺键(参见，例如Ouchi等(1997)Polymer Preprints 38(1)：582-3)；例如由醇和磷酸盐基团反应形成的磷酸酯键；通常由酰肼和醛之间反应形成的腙键；通常由醛和醇之间反应形成的乙缩醛键，例如由甲酸盐和醇反应形成的原酸酯键；由例如在聚合物如PEG末端的胺基和另一PEG链的羧基形成的酰胺键；由例如末端为异氰酸酯基团的PEG和PEG醇反应形成的尿烷；由例如聚合物如PEG末端的胺基和肽的羧基形成的肽键；和由例如聚合物末端的氨基磷酸酯基团和寡核苷酸的5’羟基形成的寡核苷酸键。

本领域技术人员理解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括全部上述形式的PEG。

尽管水溶性聚合物(以及聚合试剂)的分子量可以改变，但分子量将满足以下值的一个或多个：大于100道尔顿；大于200道尔顿；大于400道尔顿；大于500道尔顿；大于750道尔顿；大于900道尔顿；大于1,000道尔顿；大于1,400道尔顿；大于1,500道尔顿；大于1,900道尔顿；大于2,000道尔顿；大于2,200道尔顿；大于2,500道尔顿；大于3,000道尔顿；大于4,000道尔顿；大于4,900道尔顿；大于5,000道尔顿；大于6,000道尔顿；大于7,000道尔顿；大于7,500道尔顿；大于9,000道尔顿；大于10,000道尔顿；大于11,000道尔顿；大于14,000道尔顿；大于15000道尔顿；大于16,000道尔顿；大于19,000道尔顿；大于20,000道尔顿；大于21,000道尔顿；大于22,000道尔顿；大于25,000道尔顿；大于30,000道尔顿。不用说在此适用的任何所给水溶性聚合物的分子量最大限是约300,000道尔顿。

水溶性聚合物(以及整个聚合试剂)的分子量还可以表示为分子量范围内的值。示范性范围包括，约100道尔顿至约100,000道尔顿；约500道尔顿至约80,000道尔顿；约1,000道尔顿至约60,000道尔顿；约2,000道尔顿至约50,000道尔顿；和约5,000道尔顿至约40,000道尔顿。

聚合试剂内的任何所给水溶性聚合物(以及整个聚合试剂)的示范性分子量包括约100道尔顿，约200道尔顿，约300道尔顿，约400道尔顿，约500道尔顿，约600道尔顿，约700道尔顿，约750道尔顿，约800道尔顿，约900道尔顿，约1,000道尔顿，约2,000道尔顿，约2,200道尔顿，约2,500道尔顿，约3,000道尔顿，约4,000道尔顿，约4,400道尔顿，约5,000道尔顿，约6,000道尔顿，约7,000道尔顿，约7,500道尔顿，约8,000道尔顿，约9,000道尔顿，约10,000道尔顿，约11,000道尔顿，约12,000道尔顿，约13,000道尔顿，约14,000道尔顿，约15,000道尔顿，20,000道尔顿，22,500道尔顿，25,000道尔顿，约30,000道尔顿，约40,000道尔顿，约50,000道尔顿，60,000道尔顿，约75,000道尔顿，和约80,000道尔顿。

关于PEG，其中可以提供含有重复环氧乙烷单体如“-(CH₂CH₂O)_m-”或“-(OCH₂CH₂)_m-”的结构，(m)优选值包括：约3至约3,000；约10至约3，000；约15至约3,000；约20至约3,000；约25至约3,000；约30至约3,000；约40至约3,000；约50至约3,000；约55至约3,000；约75至约3,000；约100至约3,000；和约225至约3,000。

如在此所用的术语“水溶性聚合物”包括那些生物相容和非致免疫的水溶性聚合物，并特别排除不是生物相容的和非致免疫的水溶性聚合物部分。关于生物相容性，如果如由临床医师例如内科医生评价的，与单独使用物质或和另一物质(例如，活性剂)一起使用结合活组织(例如，给药于患者)有关的有益效果胜于任何有害的效果，则认为物质是生物相容的。关于非致免疫性，如果物质在体内计划的使用不产生不期望的免疫反应(例如，形成抗体)，或如果产生了免疫反应，如由临床医师评价的，不认为这样的反应是临床上有意义的或重要的，则认为物质是非致免疫的。尤其优选在此所述的水溶性聚合物部分以及偶联物是生物相容的和非致免疫的。

本领域普通技术人员将认识到，上述实质上涉及水溶性聚合物的讨论根本不是穷举且仅仅是说明，以及想到了具有上述性质的所有聚合物材料。如在此所用的，术语“聚合试剂”通常指的是整个分子，其可包含水溶性聚合物和官能团。术语“水溶性聚合物”通常预备用于讨论更大分子结构如聚合试剂、前体分子、偶联物等等的一部分。

在此所述的聚合试剂的每个部分(例如，官能团、活性剂、水溶性聚合物，等等)和其它结构可以通过直接共价键相互直接连接。然而，更典型地，每个部分是通过由一个或多个原子组成的用来将每个部分系在一起形成统一整体的间隔部分连接。

在此所述的聚合试剂的各个部分和其它结构通过其连接的优选间隔部分包括由碳、氮、氧，和/或硫原子形成的原子链。和该原子链连接的，可以是一种或多种其它原子如碳、氮、氧，硫，和氢。链可以是短链，包括少至两至五个原子的链。也想到了更长链，例如，10、15，或更多个原子长度的链。此外，间隔部分可以包括饱和、不饱和以及芳香族的原子环。存在时，间隔部分优选包括约1-20个原子的序列，排除任何分支原子。优选，形成间隔分子的原子(包括任何分支原子)包括氧、碳、氮、硫和氢原子的一些组合。聚合试剂中的每个间隔部分(例如，第一个间隔部分，第二个间隔部分，第三个间隔部分，等等)和聚合物中存在的任何其它间隔部分可以是相同的或不同的。

间隔部分的非限制实例是选自以下的那些-O-，-S-，-C(O)-，-O-C(O)-，-C(O)-O-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-C(S)-，-CH₂-，-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-O-CH₂-，-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-，-C(O)-NH-CH₂-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-O-CH₂-，-CH₂-C(O)-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-，-C(O)-O-CH₂-CH₂-，-NH-C(O)-CH₂-，-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-C(O)-NH-CH₂-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-，-NH-CH₂-，-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-NH-CH₂-，-C(O)-CH₂-，-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-[CH₂]_0-6-(OCH₂CH₂)_0-2，-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-，-O-C(O)-CH₂-，-O-C(O)-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，二价环烷基，-N(R²)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，O-C(O)-NH[CH₂]_f-(OCH₂CH₂)_n-，以及上述任意的两个或更多个的组合，其中(f)是0至6，(n)是0至20(优选0至10，例如，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10，更优选为4)，R²是H或有机基。优选的二价环烷基具有结构-(CR³R⁴)_p-C_3-12环烷基-(CR³R⁴)_q-，其中p和q各自独立地为0至约10，优选0至约6(例如，0，1，2，3，4，5或6)，每个R³独立地为H、烷基，或另一个环烷基，每个R⁴独立地为H、烷基，或另一个环烷基。其它二价环烷基(例如，亚环烷基)包括C_3-8环烷基，如环丙二烯(例如，1，1-，顺-1，2，或反1，2-环丙烯)、环丁二烯、环戊二烯、环己二烯和环庚二烯的各种异构体。亚环烷基还可以由一个或多个烷基，优选C₁-C₆烷基取代。

对于任何所给的包括羰基及其邻接碳原子的间隔部分，间隔部分任意地包括和羰基邻接的碳原子连接的有机基。通常，和羰基碳直接连接的碳原子称为α碳。因此，任何所给间隔部分中的α碳可以具有与其连接的有机基如小的烷基(例如，甲基)。

聚合试剂的总结构可以采用任何数量的不同形式。例如，聚合试剂可以是线性、支化、多臂、树枝状，或叉状的。根据本发明的线性结构对应于以下的式II和IIa。然而，优选聚合试剂具有支化或多臂结构。一般而言，这样的聚合物具有两个或更多个水溶性聚合物并围绕活性剂形成较大的、更密集的聚合物“云”，因此减少了可获得偶联连接位点的有效数量。以下式III，IIIa，IIIb，和IIIb₁的支化结构包括两个水溶性聚合物。支化结构还可以包括三个水溶性聚合物。另一方面，多臂聚合物包括四个或更多这样的水溶性聚合物。聚合物的树枝状形式具有数个(例如3至50)分开的水溶性聚合物，这些聚合物最终和含有一个或多个原子的核心连接。对于含有两个或更多个水溶性聚合物的任何特定聚合试剂，每个水溶性聚合物可以是相同的或不同的。此外，当聚合试剂包括三个或更多个水溶性聚合物时，可以使用相同或不同的水溶性聚合物的组合，尽管优选聚合物中的每个水溶性聚合物和其它的相同。

关于聚合试剂的支化形式，聚合物总分子量的示范性合适大小范围(实质上基于两个水溶性聚合物部分的组合重量)包括以下(再次，以分子质量表示)：约200道尔顿至约200,000道尔顿；约1,000道尔顿至约100,000道尔顿；约2,000道尔顿至约120,000道尔顿；约4,000道尔顿至约100,000道尔顿；约5,000道尔顿至约90,000道尔顿；约10,000道尔顿至约80,000道尔顿；以及约15,000道尔顿至约60,000道尔顿。更特别，本发明聚合物支化形式的总分子质量(道尔顿)对应于以下之一：约400；约1,000；约1,500；约2,000；约3,000；约4,000；约10,000；约15,000；约20,000；约30,000；约40,000；约50,000；约60,000；约80,000；约90,000；约100,000；约120,000；约160,000；或约200,000。

考虑在此所述聚合试剂的一般结构时，将认识到相对于现有技术所述聚合试剂的某些差异。例如，许多现有技术的聚合试剂遭遇很多问题，使它们不适于和活性剂偶联。例如，一些现有技术的聚合试剂缺乏容易置换的官能团，如反应基(例如，酯)。即使试图和缺少容易置换官能团(例如，亚甲基(-CH₂-))的聚合试剂偶联，这样做需要的条件将是非常苛刻的(例如，强碱性条件)，因此很可能降解活性剂。此外，一些现有技术的聚合试剂在连接的潜在位点上具有两个取代的基团(例如，羰基)，其通常由于位阻效应导致不完全偶联和/或作为基团接近的结果降低了反应性。

当在聚合物总体结构中仅存在单个水溶性聚合物时，聚合物结构优选对应于式(II)：

式(II)

其中：

POLY¹是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；

(a)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(b)是0，1，2或3(且优选0或1)；

R¹是H或有机基(例如，选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基)；

X¹，存在时，是第一个间隔部分；

X²，存在时，是第二个间隔部分；和

Z是反应基。

此外，当聚合物在总体结构中仅包含单个水溶性部分时，所述结构还对应于式(IIa)：

式(IIa)

其中：

POLY¹是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；

(a)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(b)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(c)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(d)是0，1，2或3(且优选0或1)；

每个R¹独立地是H或有机基(例如，选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基)；

X¹，存在时，是第一个间隔部分；

X²，存在时，是第二个间隔部分；

X³，存在时，是第三个间隔部分；

X⁴，存在时，是第四个间隔部分；和

每个Z独立地是反应基。

此外，当在聚合试剂总体结构中存在两个水溶性聚合物时，所述结构可对应于式(III)：

式(III)

POLY¹是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；

POLY²是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；

(a)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(b)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(e)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(f’)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(g’)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(h)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(j)是0至20(即，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)；

X¹，存在时，是第一个间隔部分；

X²，存在时，是第二个间隔部分；

X⁵，存在时，是第五个间隔部分；

X⁶，存在时，是第六个间隔部分；

X⁷，存在时，是第七个间隔部分；

X⁸，存在时，是第八个间隔部分；

R⁵是分支部分；和

Z是反应基。

具有式II、式IIa、式III包括的结构的优选聚合试剂是其中每个水溶性聚合物(即，POLY¹和/或POLY²)是聚(烯化氧)如聚(环氧乙烷)的那些。优选，尽管不是必需的，聚(环氧乙烷)在一端用基团如甲基、苄基或羟基封端。特别优选的封端聚(环氧乙烷)是对应于以下结构之一的那种：H₃C-(OCH₂CH₂)_m-或H₃C-(OCH₂CH₂)_m-O-C(O)-NH-[CH₂]_f-(OCH₂CH₂)_n-，其中(m)是2至4000，(f)是0至6，(n)是0至20。

通常关于间隔部分，将聚合物中出现的和式II、式IIa、式III包括的每个间隔部分(不管第一个间隔部分，第二个间隔部分，或第三个间隔部分)独立地定义如上。然而，优选，每个间隔部分如那些命名为“X¹”和“X⁵”的选自-O-，-O-CH₂-，-O-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-和-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-(OCH₂CH₂)₂-。关于命名为“X²”和“X⁶”的间隔部分，间隔部分优选选自-CH₂-，-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂(OR²)-，-CH₂-CH(OR²)-CH(OR²)，-NR²-，且R²是H或选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代芳基的有机基。关于命名为“X⁸”的间隔部分，间隔部分优选选自-O-，-O-CH₂-，-O-CH₂-CH₂-，-O-CH₂-CH₂-CH₂-，-O-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-，-CH₂-，-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-和-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-(CH₂CH₂O)_n-CH₂-CH₂-CH₂-，其中(n)是0至20。任意地，X⁸可以进一步包括分支点或数个分支点，其中可以存在另外的反应基，因此提供“叉状”排列。可用于本发明聚合物中的其它“叉状”排列更全面地描述于国际申请No.PCT/US99/05333中。

式III中分支部分R⁵可以是可提供和至少三个原子偶联的任何分支部分。然而，优选，R⁵选自饱和烷基，取代的饱和烷基，

和

其中(p)是1-10(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)和(q)是1-10(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)。

尽管式II、式IIa、式III中所述的反应基“Z”可以是上述的任何反应基，优选反应基选自羧酸、醛、砜、酯、琥珀酰亚胺和马来酰亚胺。间隔部分(例如，X²、X⁴和X⁸)和Z组合的说明性实例包括……，

和

其中(r)是1-12(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12)，(r¹)是0-5(例如，1，2，3，4或5)，且R⁶是芳基或烷基。

如本领域普通技术人员将认识到，本发明包括大量聚合物。以下将提供根据本发明聚合物的非限制性实例。

例如，用式III开始并将R⁵定义为中每个(p)和(q)是1，且每个(b)和(f’)是0，形成具有对应于以下式(IIIa)结构的聚合物

式(IIIa)

其中POLY¹、POLY²、(a)、(c)、(g′)、(j)、h)、R¹、X⁷、X⁸如上定义。

依次将式(IIIa)进一步定义来提供具有对应于式(IIIb)结构的聚合试剂。特别地，从式IIIa开始并将每个R¹定义为H，POLY¹和POLY²中的每个为H₃C-(OCH₂CH₂)_m-，其中(m)是2至4000，(a)和(e)中的每个为1，X¹和X⁵中的每个为-O-C(O)-NH-[CH₂]_f-(OCH₂CH₂)_n-，其中(f)为0至6，(n)为0至20，形成具有对应于式IIIb结构的聚合试剂：

式(IIIb)

其中每个(m)是2至4000，每个(f)独立地为0至6，每个(n)独立地为0至20，且(g’)、(h)、(j)、X⁷、X⁸和Z如上定义。

可以依次将式IIIb进一步定义来提供具有对应于式IIIc结构的聚合试剂。特别地，从式IIIb开始并将(g’)和(j)中的每个定义为0，X⁸为-CH₂-CH₂-CH₂-，Z为羧酸，形成具有对应于以下式IIIc结构的聚合物。

(式IIIc)

其中每个(m)是2至400。每个(f)独立地为0至6，每个(n)独立地为0至20(例如，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)。

任意地，式IIIc还可以包括和羧酸α碳或β碳连接的烷基。关于羧酸α碳上的烷基(例如，甲基)，所述结构对应于式IIIb₁。

(式IIIb₁)

此外，还可以进一步定义式IIIa来提供另一种优选的聚合物。特别地，从式IIIa开始并将POLY¹和POLY²中的每个定义为H₃C-(OCH₂CH₂)_m-，其中(m)为2至4000，(a)、(c)、(g′)和(j)中的每个为0，(h)为1，X⁸为-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，Z为形成具有下列结构的聚合物：

……

(式IIId)

其中每个(m)为2至4000。

本发明另外的聚合试剂如下：

其中所有变量如上定义，其中每个(n′)为0-100，更优选0-40，最优选0-20。

某些情况中，本发明的聚合试剂不包括酮部分，即其中两个分开的碳原子中的每一个都和羰基部分的碳原子连接的部分。此外，在有些情况下优选

部分不是带环结构(如马来酰亚胺)的部分。此外，还优选比反应基更接近水溶性聚合物，如测量的，例如，就从水溶性聚合物中最近的原子开始到达反应基需要的原子数量而言，与从反应基中最近的原子开始到达反应基的原子数量相比较。

本发明还包括制备在此提供的聚合试剂的方法。该方法包括步骤(i)提供由受保护反应基(未保护的反应基是这样的反应基，或当进行方法步骤时它能保持不变)或反应基前体和一个或多个羟基构成的前体分子。一些由受保护反应基或前体反应基和一个或多个羟基构成的前体分子是可购得的。此外，可以合成未保护形式的前体分子，然后使用常规技术保护(如果需要)。

尽管存在许多形式的合适前体分子且本发明在这方面并无限制，但优选的前体分子具有两个羟基。优选的合适前体分子的实例对应于式(IV)。

(式IV)

其中PG是保护基。如例如在实施例1中所述可以合成制得该试剂。

优选的保护基的实例包括选自甲基、乙基、叔丁基和苄基的那些。特别优选的保护基是甲基。

制备根据本发明聚合试剂的方法包括步骤(ii)激活前体分子的一个或多个羟基中的至少一个和氨基反应形成激活的前体分子。尽管可以使用任何合适的本领域已知激活试剂，优选使用的激活剂选自二(N-琥珀酰亚胺)碳酸酯(DSC)、N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳化二亚胺、N-(3-二甲基氨丙基)-N’乙基碳化二亚胺、1，1′-羰二咪唑(CDI)、1，1′-羰基(1，2，4-三唑)(CDT)、双(4-硝基苯基)碳酸酯、对硝基苯基氯碳酸酯、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、光气、三光气、1-羟基苯并三唑(HOBt)、二苯并三唑碳酸酯((diBTC)、N-羟基琥珀酰亚胺和DCC、N-羟基邻苯二甲酰亚胺和DCC，和四氢噻唑硫酮。通常将激活剂加入含有前体分子的容器中，使得激活剂和前体分子的一个或多个羟基接触。

制备本发明聚合试剂的方法的另一步骤包括(iii)在共价偶联条件下将一个或多个激活羟基中的至少一个和具有氨基的水溶性聚合物接触，因此形成由水溶性聚合物部分和保护反应基或反应基前体构成的聚合物。本领域普通技术人员可以通过常规实验来测定适于获得共价偶联的pH、温度等条件。例如，可以进行数次偶联步骤，每次在不同设定的条件(例如，不同pH、不同温度、溶剂，等等)下。通过测定每组条件下形成的由水溶性聚合物部分和保护反应基构成的聚合物量(例如通过大小排阻色谱法)，可能测定哪组条件最适于进行偶联步骤。

尽管可以使用大多数任何具有氨基的水溶性聚合物，尤其优选使用以下聚合物之一：

和

其中(m)是2至4000。可以使用本领域普通技术人员公知的技术从头合成具有氨基的水溶性聚合物和通过如Nektar Therapeutics(Huntsville，AL)供货商购得。

当前体分子中存在保护基时，制备聚合试剂的方法还包括步骤(iv)将保护反应基去保护，因此形成聚合物。使用适于除去特定保护基的任何方法来进行去保护步骤。对于任何特定的保护基，合适的去保护基方法是本领域普通技术人员已知的。此外，合适的去保护基方法描述于相关文献中，如Greene等，上文。使保护为烷基酯(例如甲酯)的酸基去保护的优选方法是将带有受保护基的分子暴露于碱催化的水解中。加入含有带有受保护反应基的分子的反应容器中的合适碱实例包括，无限制，无机氢氧化物如氢氧化钠、氢氧化钾，和弱酸的金属盐如醋酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、柠檬酸钾、醋酸钾，等等。酸催化水解还可以用原酸酯来实现，尽管对于那些衍生物可以使用的酸催化水解后接着碱催化水解的组合。对于乙缩醛，酸催化水解是有效的，而碱催化水解是无效的。对于苄基酯或苄基醚，催化还原是有效的，尽管酸或碱催化水解对于酯也是有效的。

制备聚合试剂的方法任意包括一旦其形成就将聚合试剂分离的另外步骤。可以使用已知方法来分离聚合物，但尤其优选使用色谱法，例如离子交换色谱法或大小排阻色谱法。可替换的或另外的，方法包括一旦其形成就将聚合物纯化的步骤。再次，可以使用本领域已知的标准纯化方法来纯化聚合物。

对于通过本方法制得的任何所给聚合物，方法有利地提供了进一步转化聚合物的能力(任何去保护步骤之前或之后)，使得其带有特定的反应基。因此，使用本领域公知的技术，可以将聚合物功能化来包括反应基(例如，活性酯、硫醇、马来酰亚胺、醛、酮，等等)。

在合适的溶剂中进行制备聚合试剂的各个步骤。本领域普通技术人员可以测定是否任何特定溶剂适于任何所给反应步骤。然而，通常溶剂优选为非极性溶剂或极性溶剂。非极性溶剂的非限制性实例包括苯、二甲苯和甲苯。特别优选的非极性溶剂包括甲苯、二甲苯、二氧己环、四氢呋喃、叔丁基醇。示范性极性溶剂包括但不限制于二氧己环、四氢呋喃(THF)、叔丁基醇、DMSO(二甲基亚砜)、HMPA(六甲基磷酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMA(二甲基乙酰胺)，和NMP(N-甲基吡咯烷酮)。

本发明还包括含有水溶剂聚合物部分、部分，和药理学活性剂的偶联物。偶联物具有以下内部结构取向：(i)通过直接共价键或通过第一个间隔部分，水溶性聚合物部分和

部分的氮原子连接；(ii)通过直接共价键或通过第二个间隔部分，药理学活性剂和

部分的羰基碳原子连接；和(iii)R¹是H或有机基。

当偶联物全部结构中仅存在单个水溶性聚合物时，偶联物的结构优选对应于式V：

活性剂 (式V)

其中：

POLY¹是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；

(a)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(b)是0，1，2或3(且优选0或1)；

X¹，存在时，是第一个间隔部分；

X²，存在时，是第二个间隔部分；和

活性剂是药理学上的活性剂。

此外，当偶联物的全部结构中存在两个水溶性聚合物时，偶联物的结构优选对应于式VI：

活性剂(式VI)

其中

POLY¹是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；

POLY²是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；

(a)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(b)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(e)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(f’)是O，1，2或3(且优选0或1)；

(g’)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(h)是0，1，2或3(且优选0或1)；

(j)是0至2 0(即，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)；

X¹，存在时，是第一个间隔部分；

X²，存在时，是第二个间隔部分；

X⁵，存在时，是第五个间隔部分；

X⁶，存在时，是第六个间隔部分；

X⁷，存在时，是第七个间隔部分；

X⁸，存在时，是第八个间隔部分；

R⁵是分支部分；和

活性剂是药理学上的活性剂。

在此所述的聚合试剂适用于和生物活性剂或表面偶联。适于和在此所述的聚合试剂反应的优选基团是亲电子基团和亲核基团。示范性基团包括伯胺(例如来自赖氨酸残基侧链的或多肽N-端的伯胺)、醇(例如来自丝氨酸或苏氨酸残基侧链的伯醇)、硫醇、肼、酰肼和巯基。适于和在此所述的聚合试剂反应的这样的基团是本领域普通技术人员已知的。因此，本发明提供了制备偶联物的方法，该偶联物包括在偶联条件下将活性剂和在此所述的聚合试剂接触的步骤。

合适的偶联条件是足够实现聚合试剂和活性剂之间偶联的时间、温度、pH、试剂浓度、试剂官能团、活性剂上可利用的官能团、溶剂，等等的那些条件。如本领域已知的，特定条件取决于，除其它事情以外，活性剂、所需偶联物的类型、反应混合物中其它物质的存在，等等。本领域普通技术人员根据阅读在此公开的、参考相关文献，和/或通过常规实验可以确定任何特定情况中实现偶联的充分条件。

例如，当聚合试剂含有N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(例如，琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯，和琥珀酰亚胺丁酸酯)，和活性剂含有胺基(例如，多肽上的末端胺基和/或含有赖氨酸多肽的ε胺)时，在室温约7.5至约9.5的pH可以实现偶联。此外，当聚合试剂含有乙烯砜反应基或马来酰亚胺基和药理学活性剂含有巯基(例如，含有半胱氨酸或含有蛋氨酸多肽的巯基)时，在室温下约7至约8.5的pH可以实现偶联。此外，当和聚合试剂相连的反应基是醛或酮且药物学活性剂含有伯胺时，通过还原性胺化可以实现偶联，其中药理学活性剂的伯胺和聚合物的醛或酮反应。在约6至约9.5pH下发生的还原性胺化最初形成偶联物，其中药理学活性剂和聚合物通过亚胺键连接。随后用合适的还原剂如NaCNBH₃来处理含有亚胺的偶联物将亚胺还原成仲胺。对于涉及这些和其它偶联反应的其它信息，参考Hermanson“Bioconjugate Techniques，”Academic Press，1996。

示范性偶联条件包括在约4至约10的pH下进行偶联反应，例如约4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，或10.0的pH。允许反应进行约5分钟至约72小时，优选约30分钟至约48小时，更优选约4小时至约24小时。偶联可发生的温度通常，尽管不是必需的，在约0℃至约40℃，经常为室温或更低温度。通常使用磷酸盐缓冲液、醋酸钠，或相似系统来进行偶联反应。

关于试剂浓度，通常用过量的聚合试剂和活性剂结合。然而一些情况中，优选具有聚合试剂上反应基与活性剂反应基的化学计量。因此，例如，1摩尔带有两个反应基的聚合试剂和两摩尔的活性剂结合。聚合试剂与活性剂的示范性比例(聚合试剂∶活性剂)包括约1∶1，1.5∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，8∶1或10∶1的摩尔比。允许偶联反应进行直至实质上没有进一步的偶联发生，通常可以通过监控随着时间的反应过程来确定。

通过在各个时间点从反应混合物中取出等分试样，并通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法或任何其它合适的分析方法分析反应混合物来监控反应的进程。就形成的偶联物的量或残留的未偶联聚合试剂的量而言，一旦达到了平稳状态，就假定反应完成。通常，偶联反应大概进行数分钟至数小时(例如，5分钟至24小时或更久)。优选但不是必需将所得到的产品混合物纯化来分离出过量聚合试剂、未偶联反应物(例如，活性剂)，和不需要的多偶联物质。然后可以使用分析方法如MALDI、毛细管电泳、凝胶电泳，和/或色谱法来进一步表征所得到的偶联物。

可以纯化聚合物-活性剂偶联物来获得/分离不同的偶联物质。或者，对于用于形成偶联物的更低分子量(例如，小于约20,000道尔顿，更优选小于约10,000道尔顿)聚合试剂，更优选将产品混合物纯化来获得每个活性剂的水溶性聚合物部分的分布。例如，可以将产品混合物纯化来获得每个活性剂(例如，蛋白质)大概平均一个、两个、三个、四个或五个聚合试剂的连接，通常每个活性剂(蛋白质)平均约连接。纯化最终偶联物反应混合物的策略将取决于多个因素，包括，例如，所用聚合试剂的分子量、特定活性剂、所需给药方案，以及单个偶联物的残余活性和体内特性。

如果需要，使用凝胶过滤色谱法分离具有不同分子量的偶联物。也就是说，使用凝胶过滤色谱法分级分离不同数量的聚合试剂对活性剂的比例(例如，1-基体(mer)、2-基体、3-基体等，其中“1-基体”表示1聚合试剂对活性剂，“2-基体”表示两个聚合试剂对活性剂，等等)，基于其不同的分子量(其中差异基本上对应于水溶性聚合物部分的平均分子量)。例如，示范性反应中，100,000道尔顿蛋白质和总分子量约20,000道尔顿的支化PEG随机偶联(其中支化PEG的每个聚合物“臂”具有约10,000道尔顿的分子量)，所得到的反应混合物可以含有未修饰的蛋白质(具有约100,000道尔顿的分子量)、单PEG化的蛋白质(具有约120,000道尔顿的分子量)、二PEG化的蛋白质(具有约140,000道尔顿的分子量)等。

尽管该方法可以用于分离PEG和具有不同分子量的其它聚合物-活性剂偶联物，通常该方法对于分离蛋白质中具有不同聚合物连接位点的位置异构体是无效的。例如，凝胶过滤色谱法可以用于PEGl-基体、2-基体、3-基体等等混合物的相互分离，尽管每个回收的PEG-基体组合物可以含有连接至活性剂中不同反应氨基(例如，赖氨酸残基)的PEG。

适用于进行这种类型分离的凝胶过滤柱包括Superdex^TM和Sephadex^TM柱，从Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)可获得。特定柱的选择将取决于需要的分级分离范围。通常使用合适的缓冲剂如磷酸盐、醋酸盐等等进行洗脱。通过多种不同方法分析收集的级分，例如，(i)用于蛋白质含量的280nm处光密度(OD)，(ii)牛血清清蛋白(BSA)蛋白质分析，(iii)用于PEG含量的碘测试(Sims等(198O)Anal.Biochem， 107：60-63)，和(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，随后用碘化钡染色。

通过使用反相高效液体色谱法(RP-HPLC)C18柱(AmershamBiosciences或Vydac)的反相色谱法或通过使用离子交换柱如从Amersham Biosciences获得的Sepharose^TM离子交换柱的离子交换色谱法进行位置异构体的分离。每个方法都可以用来分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(位置异构体)。

在此所述的聚合试剂可以共价或非共价和多种实体连接，这些实体包括薄膜，化学分离和纯化表面，固体支持物，金属表面如金、钛、钽、铌、铝、钢，及它们的氧化物，氧化硅，大分子(例如蛋白质、多肽，等等)，以及小分子。此外，聚合试剂还可以用于生化传感器、生物电开关和栅极中。聚合试剂还可以用作肽合成、制备聚合物涂覆的表面和聚合物移植物的载体，来制备用于亲和性分离的聚合物-配体偶联物，来制备交联或非交联水凝胶，来制备用于生物反应器的聚合物-辅因子加合物。

用于和在此所述聚合试剂偶联的生物活性剂可以是下列的任意一种或多种。合适的药剂可以选自，例如，安眠药和镇定剂，精神兴奋药，镇静剂，呼吸药，抗惊厥药，肌肉松驰药，抗帕金森氏病药剂(多巴胺拮抗剂)，止痛剂，抗炎剂，抗焦虑剂(抗焦虑药)，食欲抑制剂，抗偏头痛剂，肌肉收缩剂，抗感染剂(抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗)，抗关节炎药，抗疟药，止吐药，anepileptics，支气管扩张剂，细胞因子，生长因子，抗癌剂，抗血栓形成药，抗高血压药，心血管药，抗心率失齐药，抗氧化剂(antioxicant)，抗哮喘药，激素药包括避孕药，拟交感神经作用药，利尿剂，脂质调节剂，抗雄激素剂，抗寄生虫药，抗凝血剂，肿瘤药，抗肿瘤药，低血糖药，营养剂和补充剂，生长补充剂，抗肠炎药，疫苗，抗体，诊断剂和造影剂。

更特别地，活性剂可以落入多种结构类别中的一种，包括但不限制于，小分子(优选不溶性小分子)，肽，多肽，蛋白质，抗体，抗体片段，多糖，类固醇，核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸，脂肪，电解质，等等。优选，用于和在此所述聚合物偶联的活性剂具有天然氨基，或可替代地，被修饰以含有适与在此所述聚合物偶联的至少一种反应性氨基。

适于共价连接的活性剂特定实例包括但不限制于agalsidase，alefacept，天冬酰胺酶(aspariginase)，amdoxovir(DAPD)，抗排卵肽，贝卡普勒明，降钙素，蓝藻抗病毒蛋白，地尼白介素2，促红细胞生成素(EPO)，EPO激动剂(例如，约10-40个氨基酸长并含有特定核心序列的肽，如WO 96/40749中所述的)，α链道酶，红细胞生成刺激蛋白(NESP)，凝血因子如因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XII、因子XIII，冯威勒布兰特因子；西利酶，重组葡糖脑苷脂酶，α-葡糖苷酶，胶原，环孢霉素，α防御素，β防御素，去氨加压素，exedin-4，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，血小板生成素(TPO)，α-1蛋白酶抑制剂，益钙宁，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，纤维蛋白原，非格司亭，somatropin，生长激素人生长激素(hGH)，生长激素释放激素(GHRH)，GRO-β，GRO-β抗体，骨形态发生蛋白如骨形态发生蛋白-2，骨形态发生蛋白-6，OP-1；酸性成纤细胞生长因子，碱性成纤细胞生长因子，CD-40配体，肝素，人血清白蛋白，低分子量肝素(LMWH)，干扰素如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω、干扰素σ、共有干扰素；白细胞介素和白细胞介素受体如白细胞介素-1受体，白细胞介素-2，白细胞介素-2融合蛋白，白细胞介素-1受体拮抗剂，白细胞介素-3，白细胞介素-4，白细胞介素-4受体，白细胞介素-6，白细胞介素-8，白细胞介素-12，白细胞介素-13受体，白细胞介素-17受体；乳铁蛋白和乳铁蛋白片段，促黄体生成激素释放因子(LHRH)，胰岛素，胰岛素原，胰岛素类似物(例如，单酰化胰岛素，如美国专利No.5,922,675中所述的)，胰淀素，C-肽，生长激素抑制素，生长激素抑制素类似物包括奥曲肽，后叶加压素，促卵泡激素(FsH)，流感疫苗，胰岛素样生长因子(IGF)，促胰岛素激素，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，纤维蛋白溶酶原活化因子如阿替普酶，尿激酶，瑞替普酶，链激酶，帕米普酶，拉诺普酶，和替奈谱酶；神经生长因子(NGF)，骨保护素，血小板衍生的生长因子，组织生长因子，转化生长因子-1，血管内皮生长因子，白血病抑制因子，角质化细胞生长因子(KGF)，神经胶质生长因子(GGF)，T细胞受体，CD分子/抗原，肿瘤坏死因子(TNF)，单核细胞化学吸附蛋白-1，内皮生长因子，甲状旁腺激素(PTH)，胰高血糖素样肽，促生长素，胸腺素α1，拉布立酶，胸腺素α1 IIb/IIIa抑制剂，胸腺素β10，胸腺素β9，胸腺素β4，α-1抗胰蛋白酶，磷酸二酯酶(PDE)化合物，VLA-4(非常迟抗原-4)，VLA-4抑制剂，二膦酸盐，呼吸合胞体病毒抗体，囊性纤维化跨膜调节(CFTR)基因，脱氧核糖核酸酶(DNA酶)，杀菌剂/渗透性增强蛋白(BPI)，以及抗CMV抗体。示范性单克隆抗体包括依那西普(一种由和IgG1 Fc部分连接的人75kD TNF受体的胞外配体结合部分构成的二聚融合蛋白)，阿昔单抗，阿达木单抗，阿非莫单抗，阿来珠单抗，B淋巴细胞的抗体，atlizumgb，巴利希单抗，贝伐单抗，比西单抗，bertilimumab，CDP-571，CDP-860，CDP-870，西妥昔单抗，克立昔单抗，达克珠单抗，eculizumab，依决可单抗，依利佐单抗，依帕珠单抗，fontolizumab，gavilimomab，吉妥珠单抗奥唑米星，替伊莫单抗，英昔单抗，伊诺莫单抗，凯利昔单抗，labetuzumab，乐地单抗，奥利珠单抗，放射性标记的lym-1，metelimumab，美泊利单抗，米妥莫单抗，莫罗单抗-CD3，奈巴库单抗，那他珠单抗，奥度莫单抗，omalizumab，oregovomab，帕利珠单抗，pemtumomab，pexelizumab，重组人MAb-VEGF，利妥昔单抗，沙妥莫单抗喷地肽，司韦单抗，siplizumab，托西莫单抗，I¹³¹托西莫单抗，曲妥珠单抗，妥韦单抗和visilizumab。

适于共价连接的其它试剂，包括但不限制于，特可林，美金胺，利凡斯的明，加兰他敏，盐酸多奈哌齐，左乙拉西坦，瑞格列奈，阿托伐他汀，alefacept，他达那非，伐地那非，西地那非，膦沙那韦，奥塞米韦，万乃洛韦和缬更昔洛韦，阿巴瑞克，阿德福韦，阿夫唑嗪，阿洛斯琼，氨磷汀，胺碘酮，氨基己酸，氨基马尿酸钠，氨鲁米特，氨基乙酰丙酸，氨基水杨酸，氨氯地平，胺苯吖啶，阿那格雷，阿那曲唑，aprepitant，阿立哌唑，天冬酰胺酶，atazanavir，阿托西汀，蒽环霉素类，贝卡瑞特，比卡鲁胺，博莱霉素，bortezomib，布舍瑞林，白消安，卡麦角林，卡培他滨，卡铂，卡莫司汀，苯丁酸氮芥(chlorambucin)，西司他丁钠，顺铂，克拉屈滨，氯膦酸，环磷酰胺，环丙氯地孕酮，阿糖胞苷，喜树碱类，13-顺视黄酸，全反式视黄酸；氮烯唑胺，更生霉素，达托霉素，柔红霉素，去铁胺，地塞米松，双氯芬酸，己烯雌酚，多西紫杉醇，阿霉素，度他替利，依来曲坦，恩曲他滨，enfuvirtide，依普利酮，表柔比星，雌氮芥，炔雌醇，足叶乙甙，依西美坦，ezetimibe，芬太尼，费索芳定，氟达拉宾，氟氢可的松，氟尿嘧啶，氟甲睾酮，氟他米特，氟替卡松(fluticazone)，磺达肝素，氟维司群，γ-羟基丁酸盐，吉非替尼，吉西他滨，肾上腺素，L-多巴，羟基脲，艾考糊精，去甲氧柔红霉素，异环磷酰胺，伊马替尼，伊立替康，伊曲康唑，戈舍瑞林，艾杜糖醛酸酶，兰索拉唑，来曲唑，甲酰四氢叶酸，左旋咪唑，赖诺普利，左甲状腺素(lovothyroxine)钠，环己亚硝脲，二氯甲二乙胺，甲羟孕酮，甲地孕酮，苯丙氨酸氮芥，美金胺，巯嘌呤，甲氧苯酚，重酒石酸间羟胺，氨甲喋呤，灭吐灵，慢心利，miglustat，丝裂霉素，米托坦，米托蒽醌，莫达非尼，纳洛酮，萘普生，奈韦拉平，烟碱，尼鲁米特，硝唑尼特，尼替西农，炔诺酮，奥曲肽，奥沙利铂，帕洛诺司琼，帕米膦酸盐，培美曲塞，培高利特，喷司他丁，pilcamycin，光卟啉，强的松，甲基苄肼，丙氯拉嗪，恩丹西酮，帕洛诺司琼，奥沙利铂，雷替曲塞，罗伐他汀，西罗莫司，链脲佐菌素，吡美莫司，硝酸舍他康唑，他克莫司，三苯氧胺，替加色罗，替莫唑胺，替尼泊甙，睾酮，四氢大麻酚，沙利度胺，硫鸟嘌呤，噻替派，噻托溴胺，托吡酯，拓扑替康，treprostinil，维甲酸，伐地考昔，塞来昔布，罗非昔布，戊柔比星，长春碱，长春新碱，长春地辛，长春瑞滨，伏立康唑，多拉司琼，格拉司琼，福莫特罗，氟替卡松，亮丙瑞林，咪达唑仑，阿普唑仑，两性霉素B，鬼臼毒素，核苷类抗病毒药，芳酰基腙，舒马曲坦，依来曲坦；大环内酯类如红霉素，竹桃霉素，醋竹桃霉素，罗红霉素，克拉霉素，环酯红霉素，阿奇霉素，氟红霉素，地红霉素，交沙霉素，螺旋霉素，麦迪霉素，氯雷他定，地洛他定，白霉素，miocamycin，罗他霉素，andazithromycin，和swinolide A；氟喹诺酮类如环丙沙星，氧氟沙星，左氧氟沙星，曲伐沙星，alatrofloxacin，moxifloxicin，诺氟沙星，依诺沙星，加替沙星，吉米沙星，格帕沙星，洛美沙星，司帕沙星，替马沙星，培氟沙星，阿拉曲沙星，氟罗沙星，托氟沙星，普卢利沙星，irloxacin，帕珠沙星，克林沙星和西他沙星；氨基糖甙类如庆大霉素，奈替米星，草履虫素，托普霉素，阿米卡星，卡那霉素、新霉素和链霉素，万古霉素，替考拉宁，rampolanin，表地拉宁，粘菌素，达托霉素，短杆菌肽，多粘菌素E甲磺酸；多粘菌素如多粘菌素B，卷曲霉素，杆菌肽，penems；青霉素类包括青霉素酶敏感药剂如青霉素G，青霉素V；抗青霉素酶药剂如二甲氧苯青霉素，苯唑青霉素，邻氯青霉素，双氯青霉素，氟氯青霉素，乙氧萘青霉素；革兰氏阴性微生物活性剂如氨苄青霉素，阿莫西林，海他西林，cillin，和galampicillin；抗假单胞菌青霉素类如羧苄青霉素，羧吩噻青霉素，阿洛西林，美洛西林和哌拉西林；头孢菌素类如头孢泊，头孢丙烯，头孢布烯(ceftbuten)，头孢唑肟，头孢曲松，头孢菌素，头孢吡硫，头孢氨苄，头孢拉定(cephradrine)，头孢西丁，头孢孟多，头孢唑啉，头孢菌素II，头孢克洛，头孢氨苄，头孢菌素III，头孢呋辛，头孢雷特，头孢噻肟，头孢曲秦，氰乙酰头孢菌素，头孢吡肟，头孢克肟，头孢尼西，头孢哌酮，头孢替坦，先锋美他醇，头孢他啶，氯碳头孢和拉氧头孢，单环β-内酰胺菌素如氨曲南；和碳青霉烯类如亚胺培南，美罗培南和ertapenem，喷他脒，伊西酸盐(isetionate)，沙丁胺醇硫酸盐，利多卡因，硫酸异丙喘宁，倍氯米松diprepionate，去炎松乙酰胺，布地奈德丙酮化物，沙美特罗，异丙托溴铵，氟尼缩松，色甘酸钠和麦角胺酒石酸盐；紫杉烷类如紫杉醇；SN-38和tyrphostine。

和在此所述聚合物偶联的优选小分子是具有至少一个天然存在的氨基的那些。优选的分子如这些包括氨基马尿酸钠、两性霉素B、阿霉素、氨基己酸、氨基乙酰丙酸、氨基水杨酸、重酒石酸间羟胺、帕米膦酸二钠、柔红霉素、左甲状腺素钠、赖诺普利、西司他丁钠、慢心利、头孢氨苄、去铁胺和氨磷汀。

和在此所述聚合物偶联的优选肽或蛋白质包括EPO、IFN-α、IFN-β、共有IFN、因子VIII、B-结构域缺失因子VIII、因子IX、GCSF、GMCSF、hGH、胰岛素、FSH、具有GLP-1活性的肽、去氨加压素、amdoxivir和PTH。

上述示范性生物活性剂意味着包括，可适用的，类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂、异构体，及其药物学上可接受的盐形式。对于肽和蛋白质，本发明意欲包括合成的、重组的、天然的、糖基化的，和非糖基化形式，及其生物活性片段。此外，术语“活性剂”意欲包括偶联之前的活性剂以及偶联后的活性剂“残基”。

特别优选的药物学活性剂是对胰高血糖素样肽(GLP-1)受体具有激动剂或拮抗剂活性的肽。GLP-1及其药理学活性激动剂衍生物在体内刺激β细胞分泌胰岛素并抑制胰高血糖素的分泌。这样的GLP-1受体激动剂适用于调节胰岛素产生。

适用作偶联物的GLP-1相关药剂的实例包括但不限制于以下物质：天然GLP-1；exendin-3；exendin-4；exendin-4(1-30)；exendin-4(1-30)酰胺；exendin-4(1-28)酰胺；¹⁴Leu，²⁵Pheexendin-4酰胺；¹⁴Leu，²⁵Phe exendin-4(1-28)酰胺；¹⁴Leu，²²Ala，²⁵Phe exendin-4(1-28)酰胺，或其药理学活性衍生物。这些和具有GLP-1受体激动剂活性的其它药剂描述于WO99/07404中并包括具有对应以下通式结构的药剂Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Gly Thr Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇Xaa₈ Ser Lys Gln Xaa₉ Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂Xaa₁₃ Leu Lys Asn Gly Gly Xaa₁₄ Ser Ser Gly Ala Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈-Z，(SEQ.ID.NO.：1)其中：Xaa₁是His，Arg或Tyr；Xaa₂是Ser，Gly，Ala或Thr；Xaa₃是Asp或Glu；Xaa₄是Phe，Tyr或萘基丙氨酸；Xaa₅是Thr或Ser；Xaa₆是Ser或Thr；Xaa₇是Asp或Glu；Xaa₈是Leu，Ile，Val，戊基甘氨酸或Met；Xaa₉是Leu，Ile，戊基甘氨酸，Val或Met；Xaa₁₀是Phe，Tyr或萘基丙氨酸；Xaa₁₁是Ile，Val，Leu，戊基甘氨酸，叔丁基甘氨酸或Met；Xaa₁₂是Glu或Asp；Xaa₁₃是Trp，Phe，Tyr，或萘基丙氨酸；Xaa₁₄，Xaa_1s，Xaa₁₆和Xaa₁₇独立地是Pro，同型脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸，N-烷基甘氨酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；Xaa₁₈是Ser，Thr或Tyr；和Z是-OH或-NH₂。

其它GLP-1激动剂描述于美国专利No.6,583,111中。该参考文献中所述的特别优选激动剂包括NH₂-His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-Gly³⁷-OH(SEQ ID NO：2)，NH₂-His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-lle-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-NH₂(SEQ ID NO：3)，和NH₂-His⁷-Val-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-Gly³⁷-OH(SEQ ID NO：4)。

适用作偶联物的药剂其它实例包括但不限制于WO01/23420中描述的那些。如在此所述的，通过常规基于固态的合成技术(如描述于Peptide Synthesis Protocol(1994)，Vol.35，by MichealW.Pennington&Ben M.Dunn)和/或通过基于重组技术可以制得以下多肽中的许多。特别优选的序列包括：

多肽 SEQ.ID.No.：

Ac-HSDAVFTENYTKLRKQNIeAAKKYLNDLKKGGT-NH₂ 5

Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT-NH₂ 6

Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT 7

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具有GLP-1活性的肽激动剂的进一步实例描述于美国专利No.6,528,486中，包括，例如，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)₆-NH₂(SEQ ID NO：342)，H-Lys₆-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)₆-NH₂(SEQ ID NO：343)，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH₂(SEQ ID NO：344)，H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH₂(SEQ ID NO：345)，H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH₂(SEQ ID NO：346)，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)₆-NH₂(SEQ ID NO：347)，H-(Lys)₆-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)₆-NH₂(SEQ ID NO：348)，和H-Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)₆-NH₂(SEQ ID NO：349)。

所有氨基酸缩写使用常规和普遍接受的形式，如下：苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；蛋氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；以及甘氨酸为Gly或G。酰化肽带有前缀“Ac”。

本发明还包括药物制剂，该制剂含有与药物赋形剂结合的在此提供的偶联物。通常，偶联物自身将呈固态(例如，沉淀物)，其可以和可呈固态或液态的适合的药物赋形剂结合。

示范性赋形剂包括，无限制，选自碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲液、酸、碱，及其组合的那些。

碳水化合物如糖，衍生的糖如醛醇、醛糖酸、酯化糖，和/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。特定的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖，等等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉，等等；以及醛醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(山梨醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇，等等。

赋形剂还可以包括无机盐或缓冲液如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，及其组合物。

制剂还可以包括抗微生物剂用来防止或阻止微生物生长。适于本发明的抗微生物剂非限制性实例包括洁而灭、氯化苄乙氧铵、苯甲醇、氯化十六烷吡啶鎓、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、乙基汞硫代水杨酸钠，及其组合物。

制剂的还可以存在抗氧化剂。抗氧化剂用于防止氧化，因此防止了制剂中偶联物或其它成分的变质。用于本发明的合适抗氧化剂包括，例如，抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、一硫代丙三醇、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛化次硫酸钠、焦亚硫酸钠，及其组合物。

表面活性剂可以以赋形剂存在。示范性表面活性剂包括：聚山梨酯，如“吐温20”和“吐温80”，和普如兰尼克如F68和F88(两者都可以从BASF，Mount Olive，New Jersey获得)；山梨聚糖酯；脂质，如磷脂如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺(尽管优选不呈脂质体形式)，脂肪酸和脂肪酯；类固醇，如胆固醇；和螯合剂，如EDTA、锌和其它这样合适的阳离子。

酸和碱可以作为赋形剂存在于制剂中。可以使用的酸的非限制性实例包括选自盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸，及其组合的那些酸。合适碱的实例包括，无限制，碱选自氢氧化钠、醋酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、醋酸铵、醋酸钾、磷酸钠、硫酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、磷酸钾、富马酸钾，及其组合的碱。

药物制剂包括所有类型的制剂，尤其是那些适于注射的，例如可以重构的粉末以及悬浮剂和溶液。组合物中的偶联物的量(即，活性剂和在此所述聚合物形成的偶联物)根据多种因素而改变，当组合物保存于单位剂量的容器(例如，小瓶)中时，最佳将为治疗有效剂量。此外，药物制剂可以放入注射器中。可通过重复给药递增量的偶联物来实验测定治疗有效剂量，以便确定哪个量产生了临床所需的终点。

组合物中任何单个赋形剂的量可以根据赋形剂的活性和组合物的特定需要而改变。通常，通过常规实验确定任何单个赋形剂的最佳量，即通过制备含有改变量的赋形剂(从低至高)的组合物、测定稳定性和其它参数，然后确定在获得最佳性能而无显著不良作用的范围。

然而，通常，存在于组合物中的赋形剂量为约1％至约99％重量，优选约5-98％重量，更优选约15-95％重量，最优选浓度小于30％重量。

这些前述的药物赋形剂和其他赋形剂一起描述于“Remington：The Science&Practice of Pharmacy”，第19版，Williams&Williams，(1995)，the“Physician′s Desk Reference″，第52版，MedicalEconomics，Montvale，NJ(1998)，和Kibbe，A.H.，Handbookof Pharmaceutical Excipients，第3版，American PharmaceuticalAssociation，Washington，D.C.，2000中。

尽管不是必需的，本发明的药物制剂通常通过注射给药并因此通常在给药之前即时为液体溶液或悬浮液。药物制剂还可以采用其它形式如糖浆、霜剂、软膏、片剂、粉末，等等。给药的其它方式也被包括，如肺、直肠、透皮、透粘膜、口服、鞘内、皮下、动脉内，等等。

如前所述，通过静脉内注射胃肠外注射给药偶联物，或较少优选通过肌内或通过皮下注射。用于胃肠外给药的合适剂型包括即可注射的溶液、使用前和溶剂结合的干粉、即可注射的悬浮液、使用前和载体结合的干的不溶组合物，以及给药前稀释的乳剂和液体浓缩物，除了其它的外。

本发明还提供了将在此提供的偶联物给药于患者的方法，该患者遭受对用偶联物治疗起反应的状况。该方法包括通常通过注射给药治疗有效量的偶联物(优选作为药物制剂的部分来提供)。给药的方法可以用来治疗通过给药特定偶联物可以治疗或防止的任何状况。本领域普通技术人员懂得特定偶联物可以有效治疗哪些状况。给药的实际剂量将根据受试者年龄、体重，和一般情况以及待治疗状况的严重程度、卫生护理专业人员的判断和将给药的偶联物而改变。治疗有效量对本领域技术人员来说是已知的和/或描述于有关参考文本和文献中。通常，治疗有效量为约0.O01mg至100mg，优选剂量为O.01mg/天至75mg/天，更优选剂量为0.10mg/天至50mg/天。

任何所给偶联物(再次，优选作为药物制剂的一部分提供)的单位剂量可以根据临床医生的判断、患者的需要等等以多种给药方案给药。特定给药方案是本领域普通技术人员已知的或可以使用常规方法实验确定。示范性给药方案包括，无限制，一天给药五次、一天四次、一天三次、一天两次、一天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次，及其任意的组合。一旦获得临床终点，就停止组合物的给药。

本发明偶联物给药的一个优点是单个水溶性聚合物部分可被裂解下来。当由于聚合物大小，当从体内清除是潜在问题时，这样的结果是有利的。最佳地，通过使用生理可裂解和/或酶可降解键如尿烷、酰胺、碳酸酯或含有酯的键，促进每个水溶性部分裂解。以这种方式，通过选择将提供所需清除特性的聚合物分子大小和官能团类型，可以调节偶联物的清除(通过单个水溶性聚合物部分的裂解)。本领域普通技术人员可以确定合适的聚合物分子大小以及可裂解官能团。例如，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定合适分子大小以及可裂解官能团，首先制备具有不同聚合物重量和可裂解官能团的多种聚合物衍生物，然后通过将聚合物衍生物给药于患者和采取周期性血样和/或尿样来获得清除特征(例如，通过周期性血或尿取样)。一旦获得每个测试偶联物的系列清除特征，可以确定合适的偶联物。

应该理解虽然已经结合其优选的特定实施方案描述了本发明，前述的说明以及下列的实施例意欲说明而非限制本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优点和修饰对本发明涉及领域的技术人员来说是显而易见的。

在此提及的所有文献、书本、专利、专利申请，和出版物在此以其整体引入作为参考。

实施例

本发明的实践将使用本领域技术范围内有机合成等等的常规技术，除非另外指出。这样的技术全部描述于文献中。参见，例如，J.March，Advanced Organic Chemistry：Reactions Mechanisms andStructure，第4版(New York：Wiley-Interscience，1992)，上文。

以下实施例中，已经作出努力来确保涉及的所用数字(例如，量、温度，等等)的准确性，但是一些实验误差和偏差必须说明。除非另外指出，温度为℃，压力是海平面大气压或接近海平面大气压。所有试剂可以购得除非另外指出。说明书中在此和别处使用下列缩写。

实施例1

制备基于甘油的前体分子

基于甘油的前体分子(化合物8-02)

将甲苯(100ml)中的顺-1，3-O-苯亚甲基甘油(7.2g，0.040摩尔)(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)溶液通过蒸馏掉甲苯来共沸干燥。将干燥的化合物溶解于无水甲苯(100ml)中，并加入叔丁醇(6Oml，0.060摩尔)中的1.0M叔丁氧钾溶液和1-(3-溴丙基)-4-甲基-2，6，7-三氧杂二环[2，2，2]辛烷(14.0g，0.0558摩尔)。在氩气氛下于100℃辛烷将混合物搅拌过夜。将混合物过滤，并在减压下蒸发掉溶剂获得15.7g固体产物(化合物5-02)。NMR(d₆-DMSO)：0.74ppm(s，3H)，1.61ppm(m，4H)，1.88ppm(m，2H)，3.44ppm(t，2H)，3.81ppm(s，6H)，4.05ppm(m，4H)，5.55ppm(s，1H)，7.37ppm(m，5H)。

图解表示该反应如下：

5-02的水解。将化合物5-02(15.0g)溶解于乙腈(150ml)和蒸馏水(35ml)的混合物中。接着，加入10％H₃PO₄溶液将pH调节至4.5。在pH＝4.5将该混合物搅拌1小时。加入NaCl(2g)并将pH调节至7.5。用CH₂Cl₂(600和150ml)抽提产物。

将提取物干燥(MgSO₄)并在减压下蒸馏掉溶剂来获得固体产物(化合物6-02)。测定产量为14.2g。NMR(d₆-DMSO)：0.78ppm(s，3H)，1.79ppm(m，2H)，2.41ppm(t，2H)，3.25ppm(m，6H)，3.49ppm(t，2H)，4.05ppm(m，4H)，4.48ppm(t，3H)，5.56ppm(s，1H)，7.37ppm(m，5H)

图解表示该反应如下：

将化合物6-02(14.2g)溶解于乙腈(80ml)和蒸馏水(80ml)的混合物中。接着，加入6％NaOH溶液将pH调节至12.5。在12.3-12.8pH下将溶液搅拌5.5小时，间歇加入6％NaOH溶液来维持pH。加入NaCl(5g)并用5％H₃PO₄将pH调节至7.5。用CH₂Cl₂抽提非酸性杂质(两次处理，第一次使用300ml，第二次使用200ml)。用H₃PO₄将溶液pH调节至3，用CH₂Cl₂抽提产物(两次处理，第一次使用200ml，第二次使用100ml)。

将提取物干燥(MgSO₄)并在减压下蒸馏掉溶剂。所得到产物(化合物7-02)产量为8.7g。NMR(d₆-DMSO)：1.76ppm(m，2H)，2.31ppm(t，2H)，3.46ppm(t，2H)，4.05ppm(m，4H)，5.56ppm(s，1H)，7.37ppm(m，5H)。

图解表示该反应如下：

将化合物7-02(8.0g)溶解于无水甲醇中(120ml)并在溶解后加入浓H₂SO₄(1.6ml)。在室温下将溶液搅拌4小时。加入NaHCO₃(8％溶液)将混合物的pH调节至7.5。用CH₂Cl₂抽提产物(两次处理，每次使用100ml)。

将提取物干燥(MgSO₄)并在减压(0.05mmHg)60℃下蒸馏掉挥发性化合物。所得到的产物(化合物8-02)产量为4.8g。NMR(d₆-DMSO)：1.72ppm(m，2H)，2.37ppm(t，2H)，3.20ppm(m，1H)，3.42ppm(bm，4H)，3.49ppm(t，2H)，3.59ppm(s，3H)，4.46ppm(t，2H)。

图解表示该反应如下：

实施例2

制备“mPEG2 _(40K) 丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯”

(其中mPEG2_(20K)表示具有20,000道尔顿分子量的PEG)

“mPEG2_(40K)丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯”

激活前体分子中的羟基。将化合物8-02(2.0g，0.0208当量)溶解于无水乙腈(50ml)中，并加入无水吡啶(2.2ml，0.272摩尔)和N，N-二琥珀酰亚胺碳酸盐(5.86g，0.0229摩尔，DSC)。在氩气氛下于室温将溶液搅拌过夜。接着，将混合物过滤并蒸馏掉溶剂。将粗制产物溶解于CH₂Cl₂(50ml)中，并用5％H₃PO₄溶液洗涤。然后将溶液干燥(MgSO₄)，并蒸馏掉溶剂。所得到的产物(化合物9-02)产量为2.8g。NMR(d₆-DMSO)：1.76ppm(m，2H)，2.35ppm(t，2H)，2.82ppm(s，8H)，3.56ppm(t，2H)，3.58ppm(s，3H)，3.96ppm(m，1H)，4.37ppm(m，2H)，4.52ppm(m，2H)。

图解表示该反应如下：

将激活的前体和含有胺的水溶性聚合物偶联。将化合物9-02(0.119g，0.00050摩尔)加入mPEG_(20K)-胺(11g，0.00055摩尔)(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)、乙腈(70ml)和三乙胺(0.15ml)的混合物中。在氩气氛下于室温将混合物搅拌3小时。接着，在减压下蒸馏掉溶剂。

图解表示该反应如下：

PEG2_(40K)丁酸的去保护步骤和色谱纯化。将获得的化合物10-2(在此指的是PEG2_(40K)-丁酸，甲酯)溶解于150ml蒸馏水中并用5％NaOH溶液将溶液的pH调节至12.2。在12.0-12.2的pH下将溶液搅拌1.5小时。接着，加入NaCl(10g)并用5％H₃PO₄溶液将pH调节至2.5。用CH₂Cl₂处理来抽提产物。将提取物干燥(MgSO₄)，并在减压下蒸馏掉溶剂获得9g固体产物。离子交换色谱法：PEG2_(40K)-丁酸85％，mPEG_(20K)胺10％。通过描述于美国专利No.5,932,462中的离子交换色谱法纯化产物，获得了100％纯产物。NMR(d₆-DMsO)：1.72ppm(q，2H)2.24ppm(t，2H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，4H)，7.19ppm(t，2H)。

图解表示该反应如下：

……

mPEG2_(40K)-丁酸可以用作聚合试剂用于反应来形成聚合物-活性剂偶联物。此外，mPEG2_(40K)-丁酸可以进一步反应来提供具有羧酸以外的官能团的聚合试剂。例如，如下所述制备mPEG2_(40K)-丁酸相应的N-羟基琥珀酰亚胺酯以及醛、马来酰亚胺，和硫醇衍生物。

制备mPEG2 _(40K) -丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯

将mPEG2_(40K)-丁酸(9.0g，0.000225摩尔)(上述制得的)溶解于无水二氯甲烷(70ml)中，并加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.0285g，0.000248摩尔)和l，3-双环carboimide(0.0510g，0.000247摩尔)。在氩气氛下于室温将混合物搅拌过夜。接着，在减压下蒸发掉部分溶剂并在室温用异丙醇沉淀产物并在真空下干燥获得8.6g白色粉末。NMR(d₆-DMSO)：1.81ppm(q，2H)2.70ppm(t，2H)，2.81ppm(s，4H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG backbone)，3.99ppm(m，4H)，7.22ppm(t，2H)。

实施例3

制备“mPEG2 _(40K) -丁醛”

制备四(乙二醇)单丁醛，二乙基乙缩醛

HO-(CH₂CH₂O)₄CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

通过减压下蒸馏掉(旋转蒸发器)甲苯共沸干燥四(乙二醇)(97.1g，0.500摩尔)和甲苯(200ml)混合物。将干燥的四(乙二醇)溶解于无水甲苯中(180ml)，并加入1.0M叔丁氧钾的叔丁醇(120.0ml，0.120摩尔)溶液和4-氯丁醛二乙基乙缩醛(18.1g，0.100摩尔)(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)。在氩气氛下于95-100℃将混合物搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物过滤并在减压下蒸馏掉溶剂。将粗制产物溶解于1000ml去离子水中并通过活性炭过滤所得到的溶液。加入氯化钠(100g)并用二氯甲烷(250，200和150ml)提取产物。将提取物干燥(通过MgSO₄)并在减压下蒸馏掉溶剂(通过旋转蒸发器)。

将粗制产品溶解于300ml 10％磷酸盐缓冲液中(pH＝7.5)并用乙酸乙酯(2×50ml)抽提杂质。用二氯甲烷(200，150和100ml)抽提所得到产物。将提取物干燥(通过MgSO₄)并在减压下蒸馏掉溶剂(通过旋转蒸发器)。产量：2O.3g。NMR(d₆-DMSO)：1.10ppm(t，CH₃-C-)1.51ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，3.49ppm(bm，-OCH₂CH₂O-)，4.46ppm(t，-CH，乙缩醛)，4.58ppm(t，-OH)。纯度：～100％(无未反应原料的信号)

制备四(乙二醇)-α-甲磺酸盐-ω-丁醛，二乙基乙缩醛

CH₃-S(O)₂-O-(CH₂CH₂O)₄CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

在减压下通过蒸馏掉甲苯(通过旋转蒸发仪)来共沸干燥四(乙二醇)单丁醛，二乙基乙缩醛(12.5g，0.037摩尔)和甲苯(120ml)混合物。将干燥四(乙二醇)单丁醛，二乙基乙缩醛溶解于无水甲苯(100ml)中。将20ml无水二氯甲烷和5.7ml三乙胺(0.041摩尔)加入溶液中。然后逐滴加入4.5g甲磺酰氯化物(0.039摩尔)。在氮气氛下于室温将溶液搅拌过夜。接着加入碳酸钠(5g)，并将混合物搅拌1小时。然后过滤溶液并在减压下蒸馏掉溶剂(旋转蒸发仪)。

NMR(d₆-DMSO)：1.10ppm(t，CH₃-C-)1.51ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，3.17ppm(s，CH₃-甲磺酸盐)，3.49ppm(bm，-OCH₂CH₂O-)，4.30ppm(m，-CH₂-甲磺酸盐)，4.46ppm(t，-CH，乙缩醛)。纯度：～100％。

四(乙二醇)-α-氨基-ω-丁醛，二乙基乙缩醛

H₂N-(CH₂CH₂O)₄CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

将四(乙二醇)-α-甲磺酸盐-ω-丁醛，二乙基乙缩醛(14.0g)、浓氢氧化铵(650ml)，和乙醇(60ml)的混合物在室温下搅拌42小时。接着，在减压下蒸馏掉所有挥发性物质。将粗制产物溶解于150ml去离子水中并用1.0M NaOH将溶液的pH调节至12。用二氯甲烷(3×100ml)抽提产物。将提取物干燥(MgSO₄)并在减压下蒸馏掉溶剂(旋转蒸发仪)。产量10.6g。NMR(D₂O)：1.09ppm(t，CH₃-C-)1.56ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，2.69ppm(t，CH₂-N)，3.56ppm(bm，-OCH₂CH₂O-)，4.56ppm(m，-CH，乙缩醛)。纯度：～100％。

支化mPEG2(40.3KDa)-丁醛，二乙基乙缩醛

将四(乙二醇)-α-氨基-ω-丁醛，二乙基乙缩醛(0.050g，0.000148摩尔)和三乙胺(0.035ml)加入mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(实施例2)(5.0g，0.000125摩尔)的二氯甲烷溶液中(100ml)，并在氩气氛下于室温将反应混合物搅拌过夜。使用旋转蒸发仪将溶剂蒸发至干。将粗制产物溶解于二氯甲烷中并用异丙醇沉淀。在减压下干燥湿产物。产量4.8g。NMR(d₆-DMSO)：1.10ppm(t，6H)，1.51ppm(m，4H)，1.67ppm(m，2H)，2.12ppm(t，2H)，3.12ppm(q，4H)，3.24ppm(s，3H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，4H)，4.46ppm(t，1H，乙缩醛).7.22ppm(t，2H)，7.82ppm(t，1H)。

取代度：～100％。

支化mPEG2(40.3KDa)-丁醛

将支化mPEG2(40.3KDa)-丁醛，二乙基乙缩醛(4.8g)溶解于100ml水中并用稀释的磷酸将溶液的pH调节至3。在室温下将溶液搅拌3小时，接着加入足够将溶液pH调节至约7的0.5M氢氧化钠。将产物(支化mPEG2(40.3KDa)-丁醛)用二氯甲烷抽提，用无水硫酸镁干燥提取物。并在减压下蒸馏掉溶剂。产量4.2g。NMR(d₆-DMSO)：1.67ppm(m，2H)，1.76ppm(p，-CH₂-CH₂-CHO-，2H)，2.11ppm(t，2H)，2.44ppm(dt，-CH₂-CHO)，3.24ppm(s，-OCH₃，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)3.99ppm(m，4H)，7.24ppm(t，2H)，7.83ppm(t，1H)，9.66ppm(t，-CHO)。取代度：～100％。

实施例4

制备“mPEG2 _(40K) -马来酰亚胺”

将N-(3-马来酰亚胺丙酰胺基)亚乙基二酰胺以三氟乙酸盐(0.042g，0.000129摩尔)的形式和三乙胺(0.050ml)加入mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(实施例2)(5.0g，0.000125摩尔)的无水乙腈(100ml)溶液中，并在氩气氛下于室温将混合物搅拌过夜。使用旋转蒸发仪将溶剂蒸发至干。将粗制产品溶解于小量二氯甲烷中，并用异丙醇沉淀。在减压下干燥湿产物。产量4,7g。NMR(d₆-DMSO)：1.69ppm(m，2H)，2.09ppm(t，2H)2.31ppm(t，2H)，3.03ppm(q，4H)，3.12ppm(q，4H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，4H)，7.00ppm(s，2H，马来酰亚胺)，7.21ppm(t，2H)，7.75ppm(t，1H)，7.96ppm(t，1H)。

实施例5

制备“mPEG2 _(40K) -硫醇”

将胱氨二盐酸(0.0142g，0.000126当量)和三乙胺(0.040ml)加入mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(实施例2)(5.0g，0.000125摩尔)的二氯甲烷(50ml)溶液中，并在氩气氛下于室温将混合物搅拌过夜。接着加入二硫苏糖醇(0.054g，0.000350摩尔)和三乙胺(0.25ml)，并在氩气氛下于室温将混合物搅拌3小时。使用旋转蒸发仪将溶剂蒸发至干。将粗制产品溶解于小量二氯甲烷中，并用异丙醇沉淀。在减压下干燥湿产物。产量4.8g。NMR(CDCl₃)：1.68ppm(m，-SH，1H)，1.35ppm(t，2H)，2.65ppm(q，-CH₂SH，2H)，3.15ppm(q，6H)，3.36ppm(s，6H)，3.65ppm(s，PEG骨架)，4.15ppm(m，4H)。

取代度：～100％。

实施例6

制备具有季戊四醇衔接物的“mPEG2 _(40K) -丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯”

制备化合物1-04

化合物1-04

通过在减压下蒸馏掉甲苯来共沸干燥季戊四醇乙氧基化物(15/4EO/OH，Mn＝797，sigma-Aldrich)(100g，0.125摩尔)和甲苯(200ml)的混合物。将干燥的季戊四醇乙氧基化物溶解于无水甲苯中(150ml)，并加入1.0M叔丁氧钾的叔丁醇(30ml，0.03摩尔)溶液和1-(3-溴丙基)-4-甲基-2，6，7-三氧杂二环[2，2，2]辛烷(6.3g，0.025摩尔)。接着，在氩气氛于80-85℃搅拌混合物。冷却至室温后，将混合物过滤并在减压下蒸馏掉溶剂。将粗制产品溶解于800ml去离子水中。用5％磷酸将溶液的pH调节至2并在室温下将溶液搅拌15分钟。接着用1M氢氧化钠将pH调节至12并将溶液搅拌2小时，通过定期添加1M氢氧化钠来保持pH在12。加入氯化钠(40g)并用二氯甲烷抽提未反应的季戊四醇乙氧基化物。接着用5％磷酸将pH调节至3并用二氯甲烷抽提产物。用无水硫酸镁干燥提取物并在减压下蒸馏掉溶剂。产量15g。NMR(d₆-DMSO)：1.72ppm(q，2H)2.24ppm(t，2H)，3.51ppm(s，60H)，4.57ppm(t，3H)。

制备化合物2-04

化合物2-04

将化合物1-04(15g，0.017摩尔)溶解于无水甲醇中(300ml)并加入浓硫酸(4ml)。将溶液在室温下搅拌4小时。加入NaHCO₃(8％溶液)将混合物的pH调节至7.5。用CH₂Cl₂抽提产物。将提取物干燥(MgSO₄)并在减压下蒸馏掉挥发性化合物。产量13.5g。NMR(d₆-DMSO)：1.72ppm(q，2H)2.37ppm(t，2H)，3.51ppm(s，60H)，4.57ppm(t，3H)。

制备化合物3-04

化合物3-04

将化合物2-04(13.5g，0.0444当量)溶解于无水乙腈(100ml)中，并加入无水吡啶(4.4ml，0.544摩尔)和N，N-二琥珀酰亚胺碳酸盐(12.40g，0.0484摩尔)。在氩气氛下将溶液在室温下搅拌过夜。接着，将混合物过滤并将溶剂蒸馏掉。将粗制产品溶解于CH₂Cl₂(200ml)并用5％H₃PO₄溶液洗涤。然后将溶液干燥(MgSO₄)并将溶剂蒸馏掉。产量16.5g.NMR(d₆-DMSO)：1.72ppm(m，2H)，2.37ppm(t，2H)，2.82ppm(s，12H)，3.50ppm(s，48H)，3.70ppm(m，6H)，4.45(m，6H)。

制备化合物4-04，(PEG3 _(60K) -丁酸，甲酯)。将化合物3-04(0.259g，0.00060当量)加入mPEG_(20K)胺(15g，0.00075摩尔)(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)、乙腈(70ml)和三乙胺(0.15ml)的混合物中。在氩气氛下将混合物在室温下搅拌3小时。接着，在减压下蒸馏掉溶剂。

PEG3 _(60K) -丁酸的去保护步骤和色谱纯化。将化合物4-04(在此称作“PEG3_(60K)-丁酸，甲酯”)溶解于150ml去离子水中并用5％NaOH溶液将溶液的pH调节至12.2。在12.0-12.2的pH下将溶液搅拌1.5小时。接着加入NaCl(10g)并用5％H₃PO₄溶液将pH调节至2.5。用CH₂Cl₂处理来抽提产物。将提取物干燥(MgSO₄)，并在减压下蒸馏掉溶剂获得13.8g固体产物。离子交换色谱法：PEG3_(60K)-丁酸82％，M-PEG_(20K)-胺18％。通过描述于美国专利No.5,932,462的离子交换色谱法将产物纯化，获得100％纯产物。NMR(d₆-DMSO)：1.72ppm(q，2H)2.24ppm(t，2H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，6H)，7.19ppm(t，3H)。

制备PEG3 _(60K) -丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯。将获得的mPEG3_(60K)-丁酸(前-步骤)(9.0g，0.000225摩尔)溶解于无水二氯甲烷(70ml)中，并加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.0285g，0.000248摩尔)和1，3-双环碳化二亚胺(0.0510g，0.000247摩尔)。在氩气氛下于室温将混合物搅拌过夜。接着，在减压下蒸馏掉部分溶剂，用异丙醇在室温下沉淀产物并在真空下干燥获得8.6g白色粉末。NMR(d₆-DMSO)：1.81ppm(q，2H)2.70ppm(t，2H)，2.81ppm(s，4H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，4H)，7.22ppm(t，2H)。

实施例7

制备单官能mPEG

制备含有单个水溶性聚合物的本发明聚合物。按照实施例2的方法，除了用3-羟基-丙酸，甲酯替代了化合物8-02。

3-羟基-丙酸，甲酯

发现所得到的化合物(“mPEG-丙酸，甲酯”)具有以下结构：

mPEG_(20K)-丙酸，甲酯

mPEG_(20K)-丙酸，甲酯可以提供相应的羧酸。例如，可将甲酯溶解于蒸馏水中并使用NaOH溶液将pH调节至12。此后，加入盐如氯化钠，然后使用合适的酸将pH调节至约3。可用二氯甲烷处理抽提相应的羧酸(mPEG_(20K)-丙酸)、干燥，并蒸馏掉任何残余的溶剂。

mPEG_(20K)-丙酸可以用作聚合试剂来反应形成聚合物-活性剂偶联物。此外，mPEG_(20K)-丙酸可以进一步反应来提供具有羧酸以外的官能团的聚合试剂。例如，使用之前所述的技术，可以制得mPEG_(20K)丙酸相应的N-羟基琥珀酰亚胺酯(参见实施例2)、醛(参见实施例3)、马来酰亚胺(参见实施例4)，以及硫醇(参见实施例5)衍生物。

实施例8

制备同型双官能PEG

制备含有单个水溶性聚合物部分的本发明同型双官能聚合物。按照实施例7的方法，除了用胺-PEG_(20K)-胺替代了mPEG_(20K)-胺。发现所得到的化合物具有以下结构：

mPEG_(20K)-丙酸甲酯(双功能聚合物)

mPEG_(20K)-丙酸，甲酯可以提供相应的二羧酸。例如，将mPEG_(20K)-丙酸，甲酯溶解于蒸馏水中并使用NaOH溶液将pH调节至12。此后，加入盐如氯化钠，然后使用合适的酸将pH调节至约3。用二氯甲烷处理抽提相应的二羧酸(mPEG_(20K)-二丙酸)、干燥，并蒸馏掉任何残余的溶剂。

mPEG_(20K)-二丙酸可以用作聚合试剂来反应形成聚合物-活性剂偶联物(含有两个活性剂)。此外，mPEG_(20K)-丙酸可以进一步反应来提供具有羧酸以外的官能团的聚合试剂。例如，使用之前所述的技术，可以制得mPEG_(20K)-丙酸相应的二N-羟基琥珀酰亚胺酯(参见实施例2)、二醛(参见实施例3)、二马来酰亚胺(参见实施例4)，以及二硫醇(参见实施例5)衍生物。

实施例9

偶联

将具有巯基选择性反应基的mPEG2_(40K)-马来酰亚胺(实施例4)和SEQ.ID.NOS.1-349中提供的每个多肽序列反应。

其中上述结构中(m)为约454和/或每个水溶性聚合物的分子量为约20,000道尔顿，因此提供了具有约40,000道尔顿分子量的试剂。

就缺少巯基的任何特定多肽(例如缺少蛋氨酸和半胱氨酸残基的多肽)而言，可以使用常规合成技术将蛋氨酸或半胱氨酸残基加至多肽。参见，例如，WO90/12874。

对于每个多肽，将过量的聚合物加入含有多肽的反应容器中。反应条件包括室温下约7至约8的pH。约5小时后，产生了多肽和聚合物的偶联物。

实施例10

多臂聚合物

如下制得含有至少一个反应基的多臂聚合物。

将三当量的碳酸二-(2，5-二氧代-吡咯烷-1基)酯和三乙胺中的甲基-D-葡糖吡喃糖苷结合来产生第一个中间产物，如下所示：

然后将第一个中间产物在三乙胺存在下暴露于轻微过量的mPEG_(10K)-胺来产生第二个中间产物，如下所示：

然后将第二个中间产物进行酸催化的水解来产生醛和半缩醛形式，如下所示。

醛由三个，10K PEGs构成，因此提供总体为30K的支化结构。任意地依次将醛通过酸(例如，当醛暴露于温和的氧化条件下时形成的羧酸)转化成其它衍生物。

该方法可以用来提供两个臂以及四个臂。

任何所给方法过程中，可以制得物质的混合物(例如，双重取代的和一些四重取代的)。此外，任何聚合物的位置异构体也是可能的。

实施例11

制备聚合物-EPO偶联物-随机PEG化的EPO

将重组促红细胞生成素，“EPO”(由大肠杆菌(E.coli)，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源产生的)和支化mPEG2(40KDa)丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将EPO(～2mg)溶解于1ml 50mM磷酸盐缓冲液中(pH7.6)并以5倍EPO摩尔浓度加入支化mPEG2(40KDa)-丁醛。加入还原剂NaCNBH₃，并将溶液在室温下搅拌24小时来通过胺键将支化mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE分析反应混合物来确定偶联的程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物含有天然和单偶联蛋白质的混合物。增大PEG对蛋白质的比例增加了偶联的程度。

上述证明了本发明说明性蛋白质的随机PEG化产生了PEG化EPO产品的分布。如果需要，如下所述可以进一步分离反应混合物来分离单个的异构体。

通过凝胶过滤色谱法分离具有不同分子量的PEG偶联物。基于其不同的分子量(这种情况下，偏离约为40,000道尔顿)将不同PEG偶联物分级分离。特别地，使用适于观察到的分子量范围内的产物有效分离的连续柱系统来进行分离，例如，Superdex^TM200柱(AmershamBiosciences)。用10ml醋酸盐缓冲液以1.5ml/分钟的流速洗脱产物。通过280nm处的OD分析收集级分(1ml)的蛋白质含量，还使用碘测试来分析PEG含量(Sims等(1980)Anal.Biochem. 107：60-63)。此外，通过运行SDS PAGE胶可以呈现结果，随后用碘化钡染色。收集对应于洗脱峰的级分，使用膜超滤浓缩，并冻干。该方法使得具有相同分子量的偶联物分离/纯化，但不提供具有相同分子量但PEG化位点不同的偶联物(即，位置异构体)的分离。

通过反相色谱法使用RP-HPLC C18柱(Amersham Biosciences或Vydac)进行位置异构体的分离。该方法有效分离具有相同分子量的PEG-生物分子异构体(位置异构体)。使用RP-HPLC C18制备柱进行反相色谱法并用水/0.05％TFA(洗脱液A)和乙腈/0.05％TFA(洗脱液B)梯度洗脱。

收集对应于洗脱峰的级分，蒸发除去乙腈和TFA，接着除去溶剂并分离单个位置PEG异构体。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成EPO偶联物的能力。

实施例12

制备聚合物-EPO偶联物-N-末端PEG化EPO

将重组促红细胞生成素，“EPO”(由大肠杆菌哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源产生的)和支化mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将EPO(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH5)并以5倍EPO摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃下搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE分析反应混合物来测定偶联程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联蛋白质的混合物。通过柱色谱法纯化单偶联的物质来除去游离的EPO和更高分子量物质。

通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大PEG对蛋白质的比例增加了偶联的程度，产生了聚偶联的蛋白质。

上述证实本发明说明性蛋白质PEG化以产生主要是N-末端单个PEG化的蛋白质。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成EPO偶联物的能力。

实施例13

GCSF的N端PEG化

将重组粒细胞集落刺激因子，“GCSF”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将GCSF(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH)并以5倍GCSF摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)丁醛。加入还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃下搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE分析反应混合物来测定偶联程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联GCSF的混合物。通过柱色谱纯化单偶联的物质来除去游离GCSF和更高分子量物质。通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大PEG对蛋白质的比例增加了产生聚偶联蛋白质的偶的程度。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成GCSF偶联物的能力。

实施例14

干扰素α的N-端PEG化

将重组粒干扰素α，“IFN-α”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将IFN-α(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH5)并以5倍IFN-α摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE分析反应混合物来测定偶联程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联蛋白质的混合物。通过柱色谱法纯化单偶联的物质并除来游离干扰素-α和更高分子量物质。通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大PEG对蛋白质的比例增加了产生聚偶联IFN-α的偶联程度。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成IFN-α偶联物的能力。

实施例15

人生长激素的N-端PEG化

将重组人生长激素，“hGH”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将hGH(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH5)并以5倍hGH摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩尔的过量还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法分析反应的进程来测定偶联程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质以及其它物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联蛋白质的混合物。通过柱色谱法纯化单偶联的物质来除去游离hGH和更高分子量物质。通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大mPEG2(40KDa)-丁醛对蛋白质的比例增加了产生聚偶联hGH群的偶联程度。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成hGH偶联物的能力。

实施例16

干扰素β的N-端PEG化

将重组干扰素-β，“IFN-β”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将IFN-β(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH5)并以5倍IFN-β摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩尔过量的还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法分析反应进程来测定偶联程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联蛋白质的混合物。通过柱色谱法纯化单偶联的物质来除去游离IFN-β和更高分子量物质。通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大mPEG2(40KDa)-丁醛对蛋白质的比例增加了产生聚偶联IFN-β群的偶联程度。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成IFN-β偶联物的能力。

实施例17

FSH的N-端PEG化

将重组促卵泡激素，“FSH”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将FSH(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH5)并以5倍FSH摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩尔过量的还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法分析反应进程来测定偶联的程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联蛋白质的混合物。通过柱色谱法纯化单偶联的物质来除去游离FSH和更高分子量物质。通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大mPEG2(40KDa)-丁醛对蛋白质的比例增加了产生聚偶联FSH群的偶联程度。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成FSH偶联物的能力。

实施例18

因子VIII的N-端PEG化

将重组因子VIII，“F8”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将F8(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH5)并以5倍F8摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩尔过量的还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法分析反应进程来测定偶联程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联蛋白质的混合物。通过柱色谱法纯化单偶联的物质来除去游离F8和更高分子量物质。通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大mPEG2(40KDa)-丁醛对蛋白质的比例增加了产生聚偶联F8群的偶联程度。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成F8偶联物的能力。

实施例19

B-结构域缺失因子VIII的N-端PEG化

将重组B-结构域缺失因子VIII，“BDD F8”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将BDD F8(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠缓冲液中(pH5)并以5倍BDD F8摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩尔过量的还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法分析反应混合物来测定偶联的程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联蛋白质的混合物。通过柱色谱法纯化单偶联的物质并除去游离BDD F8和更高分子量物质。通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大mPEG2(40KDa)-丁醛对蛋白质的比例能增加产生聚偶联BDD F8群的偶联程度。

该实施例证明了本发明的聚合试剂用于形成BDD F8偶联物的能力。

实施例20

使用mPEG2 _(40K) 丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯的因子VIII的PEG化

将重组因子VIII，“F8”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(如实施例2所述制得的)偶联。

将F8溶解于水液体中，以一至十倍F8的摩尔浓度加入mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯来形成反应溶液。将反应溶液的pH调节至约8至9.5，并将温度维持于室温。将反应溶液搅拌数小时使聚合试剂通过胺键和F8偶联。通过测试反应溶液，测定偶联在N-端和赖氨酸位点都发生了偶联。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成F8偶联物的能力。

实施例21

使用mPEG2 _(40K) -丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯的B结构域缺失因子 VIII的PEG化

将重组B结构域缺失因子VIII，“BDD F8”(在大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或另一来源中产生的)和mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(如实施例2所述制得的)偶联。

将BDD F8溶解于水液体中，以一倍至十倍BDD F8的摩尔浓度加入mPEG2_(40K)-丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯来形成反应溶液。将反应溶液的pH调节至约8至9.5，并将温度维持于室温。将反应溶液搅拌数小时使聚合试剂通过胺键和BDD F8偶联。通过测试反应溶液，测定偶联在N-端和赖氨酸位点都发生了偶联。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成BDD F8偶联物的能力。

实施例22

去氨加压素的N-端PEG化

将去氨加压素和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将去氨加压素(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH5)并以5倍BDD F8的摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩尔的过量还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法分析反应进程来测定偶联程度。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法进行偶联程度的证实。天然和单偶联物质显示的峰值相差约40,000道尔顿。所得到的反应混合物主要含有天然和单偶联蛋白质的混合物。通过柱色谱法纯化单偶联的物质来除去游离去氨加压素和更高分子量物质。通过肽作图进行N-末端PEG化的证实。增大mPEG2(40KDa)-丁醛对蛋白质的比例增加了产生聚偶联去氨加压素群的偶联程度。

该实施例证明了本发明聚合试剂用于形成去氨加压素偶联物的能力。

实施例23

使用mPEG2 _(40K) -丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯的去氨加压素的PEG 化

将去氨加压素和mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(如实施例2所述制得的)偶联。

将去氨加压素溶解于水液体中，以一至十倍去氨加压素的摩尔浓度加入mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯来形成反应溶液。将反应溶液的pH调节至约8至9.5，并将温度维持于室温。将反应溶液搅拌数小时使聚合试剂通过胺键和去氨加压素偶联。通过测试反应溶液，测定已经发生了偶联。

实施例24

amdoxivir(DAPD)的PEG化

将amdoxivir(DAPD)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如实施例3所述制得的)偶联。

将amdoxivir(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸钠中(pH5)并以5倍amdoxivir的摩尔浓度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩尔的过量还原剂NaCNBH₃，并将溶液在4℃搅拌24小时来通过胺键将mPEG2(40KDa)-丁醛试剂和蛋白质偶联。

通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱法分析反应进程。

该实施例证明了本发明聚合试剂用来形成amdoxivir偶联物的能力。

实施例25

使用mPEG2 _(40K) -丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯的amdoxivir(DAPD) 的PEG化

将amdoxivir和mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(如实施例2所述制得的)偶联。

将amdoxivir溶解于水液体中，以一至十倍amdoxivir的摩尔浓度加入mPEG2_(40K)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯来形成反应溶液。将反应溶液的pH调节至约8至9.5，并将温度维持于室温。将反应溶液搅拌数小时使聚合试剂通过胺键和amdoxivir偶联。通过测试反应溶液，测定已经发生了偶联。

Claims

1.聚合试剂，它含有位于水溶性聚合物和反应基之间的

部分，其中：(i)

部分中的氮原子和所述水溶性聚合物邻接，(ii)

部的羰基碳原子和所述反应基接近；和(iii)R¹是H或有机基。

2.权利要求1的聚合试剂，其中R¹是H。

3.权利要求2的聚合试剂，其中R¹是有机基，选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。

4.权利要求2的聚合试剂，其中R¹选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基，和哌啶酮基。

5.权利要求1的聚合试剂，其中所述水溶性聚合物部分是选自聚(烯化氧)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)，和聚(氧乙烯化多元醇)的聚合物。

6.权利要求1的聚合试剂，其中所述水溶性聚合物部分是聚(烯化氧)。

7.权利要求6的聚合试剂，其中聚(烯化氧)是聚(乙二醇)。

8.权利要求7的聚合试剂，其中聚(乙二醇)被用选自羟基和烷氧基的封端部分末端封端。

9.权利要求7的聚合试剂，其中聚(乙二醇)被用甲氧基末端封端。

10.权利要求8的聚合试剂，其中聚(乙二醇)具有约100道尔顿至约100,000道尔顿的分子量。

11.权利要求10的聚合试剂，其中聚(乙二醇)具有约1,000道尔顿至约60,000道尔顿的分子量。

12.权利要求13的聚合试剂，其中聚(乙二醇)具有约2,000道尔顿至约50,000道尔顿的标称平均分子质量。

13.权利要求1的聚合试剂，其中所述水溶性聚合物是同型聚合物。

14.权利要求1的聚合试剂，其中

部分的氮原子通过直接共价键和所述水溶性聚合物连接。

15.权利要求1的聚合试剂，其中

部分的氮原子通过第一个间隔部分和水溶性聚合物连接。

16.权利要求1的聚合试剂，其中所述反应基选自羟基、酯、酯、原酸酯、碳酸酯、碳酸酯、乙缩醛、醛、醛水合物、酮、乙烯酮、酮水合物、硫酮、单硫代水合物、二硫代水合物、半酮缩醇、单酮缩硫醇半酮缩醇、二硫代半酮缩醇、酮缩醇、二硫代酮缩醇、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、砜、胺、酰肼、硫醇、二硫化物、硫醇水合物、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、苯并三唑、乙烯砜、氯乙基砜、二硫代吡啶、乙烯吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、硫代磺酸盐、tresylate、硅烷、-(CH₂)_rCO₂H、-(CH₂)_r′CO₂NS、-(CH₂)_r′CO₂Bt、-(CH₂)_rCH(OR)₂、-(CH₂)_rCHO、-(CH₂)₂-NH₂、-(CH₂)_rM、-(CH₂)_r-S-SO₂-R，其中r是1-5，r’是0-5，R是芳基或烷基，NS是N-琥珀酰亚胺基，Bt是1-苯并三唑基，和M是N-马来酰亚胺基，以及前述的任何受保护和激活形式。

17.权利要求1的聚合试剂，它包含结构

(式II)

其中：

POLY¹是水溶性聚合物；

(a)是0，1，2或3；

(b)是0，1，2或3；

R¹是H或有机基；

X¹，存在时，是第一个间隔部分；

X²，存在时，是第二个间隔部分；和

Z是反应基。

18.权利要求1的聚合试剂，它包含结构

(式III)

其中：

POLY¹是水溶性聚合物；

POLY²是水溶性聚合物；

(a)是0，1，2或3；

(b)是0，1，2或3；

(e)是0，1，2或3；

(f)是0，1，2或3；

(g)是0，1，2或3；

(h)是0，1，2或3；

(j)是0至20；

每个R¹独立地是H或选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基的有机基；

X¹，存在时，是第一个间隔部分；

X²，存在时，是第二个间隔部分；

X⁵，存在时，是第五个间隔部分；

X⁶，存在时，是第六个间隔部分；

X⁷，存在时，是第七个间隔部分；

X⁸，存在时，是第八个间隔部分；

R⁵是分支部分；和

Z是反应基。

19.权利要求18的聚合试剂，其中R⁵选自……

和

其中(p)是1-8，(q)是1-8。

其中POLY¹、X、(a)、(c)、Q和Z如上定义。

根据权利要求18的聚合试剂，它含有结构……

(式IIb)

其中(m)是2至4000，(f)是0至6，(n)是0至20。

根据权利要求20的聚合试剂，其中(f)是2至4，(n)是0至4。

根据权利要求1的聚合试剂，它含有选自以下的结构：

和

其中每个(m)是2至4000。

23.根据权利要求18的聚合试剂，它含有选自以下的结构：

其中每个(m)是2至4000。

24.权利要求1的聚合试剂，它含有选自以下的结构：

25.权利要求1的聚合试剂，它含有选自以下的结构：

和

其中每个(m)是2至4000，每个(n)是0至20。

26.制备聚合试剂的方法，该方法包括步骤

(i)提供任意由受保护反应基和一个或多个羟基构成的前体分子；

(ii)激活所述前体分子一个或多个羟基中的至少一个来和氨基反应形成激活的前体分子；

(iii)在共价偶联的条件下将一个或多个激活羟基中的至少一个和具有氨基的水溶性聚合物接触，因此形成由水溶性聚合物部分和受保护反应基构成的聚合物；和

(iv)当受保护反应基存在时，将它去保护，因此形成聚合试剂。

27.权利要求26的方法，它还包括分离所述聚合试剂的步骤。

28.权利要求27的方法，其中通过进行色谱法来进行所述分离步骤。

29.权利要求26的方法，其中所述受保护前体分子含有一个羟基或其受保护形式。

30.权利要求26的方法，其中所述受保护前体分子含有两个羟基或其受保护形式。

31.权利要求26的方法，其中所述受保护前体分子含有三个羟基或其受保护形式。

32.权利要求26的方法，其中所述受保护前体分子具有下列结构：

其中PG是保护基。

33.权利要求26的方法，其中所述受保护前体包括选自甲基、乙基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫甲基(MTM)、四氢吡喃基(THP)、苄氧甲基、苯甲酰甲基、N-苯二甲酰亚氨基甲基、2，2，2-三氯乙基、2-卤代乙基、2-(对-甲苯磺酰)乙基、叔丁基、肉桂基、苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、二(邻-硝基苯基)甲基、9-蒽甲基、2-(9，10-二氧代)蒽甲基、胡椒基、三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基的保护基。

34.权利要求26的方法，其中所述激活剂是二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸盐(DSC)、N，N′-双环己基碳化二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳化二亚胺、N-(3-二甲基氨丙基)-N’乙基碳化二亚胺、1，1′-羰二咪唑(CDI)、1，1′-羰基(1，2，4-三唑)(CDT)、二(4-硝基苯基)碳酸盐、对硝基苯基氯碳酸盐、光气、三光气、1-羟基苯并三唑(HOBt)、二苯并三唑碳酸盐((diBTC)、N-羟基琥珀酰亚胺和DCC、N-羟基邻苯二甲酰亚胺和DCC，以及四氢噻唑硫酮。

35.权利要求26的方法，其中所述含有氨基的水溶性聚合物选自：