RU2250911C2

RU2250911C2 - Липосомальная композиция, нейтральный липополимер и способ увеличения времени циркуляции липосомы

Info

Publication number: RU2250911C2
Application number: RU2002100651/04A
Authority: RU
Inventors: Сэмюель ЗАЛИПСКИ (US); Сэмюель ЗАЛИПСКИ
Original assignee: Элзэ Копэрейшн
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 2000-07-12
Publication date: 2005-04-27
Also published as: MXPA02000402A; CN1193059C; CY1105466T1; BR0012443A; HUP0202177A3; CN1360611A; NO20020175D0; PT1198490E; PL352711A1; WO2001005873A1; JP2003505401A; ZA200200303B; DE60026030D1; CA2379060A1; NO20020175L; KR20070086708A; DK1198490T3; ATE317869T1; CZ2002140A3; EP1198490B1

Abstract

Изобретение относится к нейтральному липополимеру формулы

где каждый из R¹ и R² независимо друг от друга означает алкильную или алкенильную цепь, содержащую от приблизительно 8 до приблизительно 24 атомов углерода; n равно от приблизительно 10 до приблизительно 300, Z выбирают из группы, состоящей из гидрокси, алкокси, бензилокси, сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира сульфоновой кислоты, алкил- или арилкарбоната, амино и алкиламино, и L выбирают из группы, состоящей из (i) -X-(C=О)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=О)- и (iii) -X-CH₂-, где Х и Y независимо выбирают из кислорода, NH и простой связи, при условии, что если L означает -Х-(С=О)-, то Х не является NH. Также изобретение относится к липосомомальной композиции и к способу увеличения времени циркуляции липосомы. Изобретение позволяет получить нейтральные липополимеры, которые обеспечивают продолжительное время циркуляции липосом. 3 c. и 8 з.п. ф-лы, 10 табл., 5 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к ПЭГ-замещенным нейтральным липополимерам и их использованию для получения липосом с продолжительным временем циркуляции. Липосомы, содержащие такие липополимеры, характеризуются сходными временами циркуляции в крови по сравнению с липосомами, включающими общепринятые отрицательно заряженные ПЭГ-замещенные фосфолипиды.

Уровень техники

Липосомы используются для многочисленных терапевтических целей, и прежде всего, для доставки терапевтических агентов в клетки-мишени с помощью системного введения липосомальных составов, содержащих такие агенты. К преимуществам составов на основе липосом, содержащих лекарственные средства, относятся улучшенные свойства по доставке лекарственного средства, которые включают, например, контролируемое высвобождение лекарственного средства. В большинстве случаев для липосом требуется продолжительное время циркуляции, чтобы обеспечить достижение липосомами области-, клетки- или участка-мишени. Прежде всего, это необходимо, если область-, клетка- или участок-мишень не расположены вблизи участка инъекции. Например, если липосомы вводят системным способом, то желательно иметь липосомы с покрытием из гидрофильного агента, например, с покрытием из гидрофильных полимерных цепей, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), чтобы продлить время циркуляции (продолжительность существования) липосом в крови. Такие липосомы с модифицированной поверхностью обычно называют липосомами с "пролонгированной циркуляцией" или "стерически стабилизированными" липосомами.

Наиболее общим способом модификации поверхности липосом является присоединение цепей ПЭГ, обычно имеющих молекулярную массу от приблизительно 1000 дальтон (Да) до приблизительно 5000 Да, к приблизительно 5 мол.% липидов, входящих в состав липосом (см., например, книгу Stealth Liposomes (Липосомы типа "Стелc"), CRC Press. Под ред. Lasic D. и Martin F., Boca Raton, FL, (1995) и упомянутые в ней ссылки). Фармакокинетика, которую проявляют такие липосомы, характеризуется дозонезависимым снижением поглощения липосом печенью и селезенкой с участием системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), а также значительно увеличенным временем циркуляции в крови по сравнению с липосомами с немодифицированной поверхностью, которые имеют тенденцию к быстрому удалению из кровотока и к накоплению в печени и селезенке.

Наиболее широко используемыми и выпускаемыми в промышленности являются ПЭГ-замещенные фосфолипиды на основе фосфатидилэтаноламина (ФЭ), обычно дистеароилфосфатидил-этаноламин (ДСФЭ), который отрицательно заряжен в полярной головной группе. В некоторых случаях отрицательный заряд на поверхности липосом может оказывать неблагоприятное действие, например, при взаимодействии с клетками (см., например, в статье Miller и соавт., Biochemistry, 37:12875-12883 (1998)) и при доставке катионных лекарственных средств, когда возможна утечка лекарственного средства (см., например, в статье Webb и соавт., Biochim. Biophys. Acta, 1372:272-282 (1998)).

B связи с этим в настоящее время существует необходимость в разработке незаряженных ПЭГ-производных липидов, которые эффективно встроены в липидный бислой и обеспечивают продолжительные времена циркуляции липосом. В идеальном случае такие липиды обладают низкой токсичностью и могут быть легко получены.

Сущность изобретения

Один аспект настоящего изобретения включает нейтральный липополимер, представленный формулой:

где каждый из R¹ и R² означает алкильную или алкенильную цепь, содержащую от приблизительно 8 до приблизительно 24 атомов углерода;

n равно от приблизительно 10 до приблизительно 300,

Z выбирают из группы, состоящей из гидрокси, алкокси, бензилокси, сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира сульфоновой кислоты, алкил- или арилкарбоната, амино и алкиламино, и

L выбирают из группы, состоящей из (i) -X-(C=0)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=0)- и (iii) -Х-СН²-, где Х и Y независимо выбирают из кислорода, NH и простой связи.

Согласно другому аспекту L означает гидролизуемую связь, такую как карбаматная связь, сложноэфирная связь или карбонатная связь. В другом аспекте Z означает гидрокси- или метоксигруппу, R¹ и R² предпочтительно являются неразветвленными. Согласно одному аспекту R¹ и R² оба означают стеарильные группы (С₁₇Н₃₅). Согласно другому аспекту величина n предпочтительно составляет от приблизительно 20 до приблизительно 115, и, таким образом, молекулярная масса ПЭГ-группы составляет от приблизительно 1000 Да до приблизительно 5000 Да.

В следующем аспекте изобретение включает липосомальную композицию, которая содержит вышеуказанный нейтральный липополимер. Предпочтительным является содержание нейтрального липополимера в количестве от приблизительно 1 мол.% до приблизительно 10 мол.% и наиболее предпочтительным - от приблизительно 3 мол.% до приблизительно 6 мол.%.

Изобретение включает также способ увеличения времени циркуляции в крови липосомы, содержащей везикулообразующие липиды, путем встраивания в липосому нейтрального липополимера вышеуказанной формулы. При этом встраиваемое количество нейтрального липополимера может варьировать в широких пределах, однако предпочтительным является его содержание от приблизительно 1 мол.% до приблизительно 10 мол.%, а наиболее предпочтительным - от приблизительно 3 мол.% до приблизительно 6 мол.%.

Перечень фигур чертежей

На фигуре 1 представлена схема синтеза незаряженного липополимера с карбаматной связью (ПЭГ-к-ДС).

На фигурах 2.1-2.4 представлена схема синтеза незаряженных липополимеров с эфирной, сложноэфирной, амидной и кетосвязью.

На фигурах 3.1-3.3 представлены графики биораспределения липосом ГФХС/ХС, содержащих 3 мол.% ПЭГ-к-ДС (Фиг.3.1); 5 мол.% ПЭГ-ДСФЭ (Фиг.3.2) или 5 мол.% ПЭГ-к-ДС (Фиг.3.3), в крови, печени и селезенке.

На фигуре 4 показан график удерживания в крови липосом ГФХС 2:1, не содержащих ПЭГ (крестики), то есть без ПЭГ; 5 мол.% ПЭГ-ДСФЭ (треугольники) и 5 мол.% ПЭГ-к-ДС (кружочки).

На фигуре 5 представлен график удерживания в крови липосом ЧГФХЯ, содержащих 5 мол.% ПЭГ-к-ДС (кружочки) и 5 мол.% ПЭГ-ДСФЭ (квадратики).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

I. Определения

Термин "нейтральный" липополимер, использованный в данном описании, означает незаряженный липополимер, то есть неионного типа.

Термин "везикулообразующие липиды" означает амфипатические липиды, содержащие гидрофобные и полярные фрагменты в головных группах. Такие везикулообразующие липиды могут самопроизвольно образовывать в воде везикулы из бислоя, например, фосфолипиды, или могут устойчиво встраиваться в липидные бислои, причем гидрофобный фрагмент находится в контакте с внутренней средой, то есть с гидрофобной областью бислойной мембраны, а полярный фрагмент головной группы ориентирован во внешнюю среду, то есть к полярной поверхности мембраны. Обычно класс везикулообразующих липидов этого типа включает в себя одну или две гидрофобные ацильные углеводородные цепи или стероидную группу и может содержать реакционноспособную группу, такую как амин, кислота, сложный эфир, альдегид или спирт), присоединенную к полярной головной группе. В этот класс включены фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидовая кислота (ФК), фосфатидилинозит (ФИ) и сфингомиелин (СМ), в которых длина двух углеводородных цепей составляет от приблизительно 14 до приблизительно 22 атомов углерода, а степень ненасыщенности может изменяться. Другие везикулообразующие липиды включают в себя гликолипиды, такие как цереброзиды и ганглиозиды, и стеролы, такие как холестерин. Предпочтительными компонентами для описанных в данном контексте композиций являются фосфолипиды, такие как ФХ и ФЭ, холестерин и нейтральные липополимеры, описанные в данном контексте.

Термин "алкил" означает полностью насыщенный одновалентный радикал, содержащий углерод и водород, который может быть разветвленной или линейной цепью. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-бутил, трет-бутил, н-гептил и изопропил. Термин "низший алкил" означает алкильный радикал, содержащий от приблизительно одного до приблизительно 6 атомов углерода, примерами которого являются метил, этил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, изоамил, н-пентил и изопентил.

Термин "алкенил" означает одновалентный радикал, содержащий углерод и водород, который может быть разветвленной или линейной цепью и который содержит по крайней мере одну двойную связь.

Сокращения: ПЭГ: полиэтиленгликоль; мПЭГ: полиэтиленгликоль с метоксигруппой в концевом фрагменте; ХС: холестерин; ФХ: фосфатидилхолин; ЧГФХ: частично гидрированный фосфатидилхолин; ЧГФХЯ: частично гидрированный фосфатидилхолин из яиц; ГФХС: гидрированный фосфатидилхолин из соевых бобов; ДСФЭ: дистеароилфосфатидилэтаноламин; ДСП или ПЭГ-к-ДС: дистеароилПЭГ с карбаматной связью; АПД: 1-амино-2,3-пропандиол; ДТПК: диэтилентетрааминпентауксусная кислота; Бн: бензил.

II. Нейтральные липополимеры

ПЭГ-замещенные нейтральные липополимеры по настоящему изобретению имеют структуру, показанную ниже:

L выбирают из группы, состоящей из (i) -X-(C=0)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=0)- и (iii) -X-CH₂-, где X и Y независимо выбирают из кислорода, NH и простой связи.

Липополимеры включают нейтральную связь (L) вместо заряженной фосфатной связи в ПЭГ-фосфолипидах, таких как ПЭГ-ДСФЭ, которые часто используются для получения стерически стабилизированных липосом. Такую нейтральную связь обычно выбирают из следующих групп: карбамат, сложный эфир, амид, карбонат, мочевина, амин и простой эфир. Гидролизуемые или расщепляемые другим способом связи, такие как карбаматы, карбонаты и сложные эфиры, предпочтительны в тех случаях, если требуется удаление ПЭГ-цепей через определенное время циркуляции in vivo. Такое свойство может быть использовано для высвобождения лекарственного средства или для ускорения поглощения клетками после того, как липосомы достигли своей мишени (см. Martin и соавт. в патенте США No 5891468; Zalipsky и соавт. в публикации РСТ No WO 98/18813 (1998)).

Молекулярная масса ПЭГ-группы, присоединенной к связующей группе, предпочтительно составляет от приблизительно 1000 Да до приблизительно 15000 Да, что выполняется, если n равно от приблизительно 20 до приблизительно 340. Более предпочтительная молекулярная масса составляет от приблизительно 1000 Да до приблизительно 12000 Да (n = от приблизительно 20 до приблизительно 275) и наиболее предпочтительная молекулярная масса составляет от приблизительно 1000 Да до приблизительно 5000 Да (n = от приблизительно 20 до приблизительно 115). Длина R¹ и R² обычно составляет от приблизительно 8 атомов углерода до приблизительно 24 атомов углерода и предпочтительно от приблизительно 16 до приблизительно 20 атомов углерода. Наиболее предпочтительным является R¹=R²=C¹⁷H₃₅, и, таким образом, COOR означает стеарильную группу.

Как было указано выше, встраивание незаряженного липида в липосому может представлять значительные преимущества, например, снижение утечки инкапсулированного катионного лекарственного средства. Кроме того, другим преимуществом является большая степень гибкости при модулировании взаимодействий поверхности липосом с клетками-мишенями и с ретикулоэндотелиальной системой RES (см. в статье Miller и соавт., Biochemistry, 37:12875-12883 (1998)). В качестве незаряженных компонентов стерически стабилизированных липосом были использованы ПЭГ-замещенные синтетические церамиды (см. в статье Webb и соавт., Biochim. Biophys. Acta, 1372:272-282 (1998)), однако такие молекулы характеризуются сложностью строения и высокой стоимостью их получения, и они в основном не встраиваются в фосфолипидный бислой, также как и диацилглицерофосфолипиды.

Липополимеры могут быть получены с помощью стандартных методов синтеза. Например, соединение с карбаматной связью (L означает -O-(С=O)-NH-CH₂-) получают, как показано на Фиг.1, при взаимодействии концевого гидроксила мПЭГ (метоксиПЭГ) с п-нитрофенилхлорформиатом с образованием п-нитрофенилкарбоната. Затем этот продукт взаимодействует с 1-амино-2,3-пропандиолом с образованием промежуточного карбамата. Гидроксильные группы диола ацилируют, при этом получают конечный продукт. Может быть использован аналогичный синтез с использованием глицерина вместо 1-амино-2,3-пропандиола, с образованием продукта с карбонатной связью (L означает -0-(С=0)-O-СН₂-). Получение дистеароил- и диэйкозаноиллипополимеров с карбаматной связью описано также в примере 1.

Как показано на Фиг.2.1, липополимер с эфирной связью (L означает -O-CH₂-) получают при взаимодействии концевого гидроксила, содержащегося в мПЭГ-ОН, с глицидилхлоридом с последующим гидролизом полученного эпоксида и ацилированием полученного диола. Липополимеры со сложноэфирной связью (L означает -O-(С=O)- или -O-(С=O)-СН₂-) могут быть получены, например, как показано на Фиг.2.2, при взаимодействии мПЭГ-ОН с активированным производным ацетонида глицериновой кислоты (2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоновой кислотой) или с гомологом из четырех атомов углерода, с 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-уксусной кислотой. Затем в диоле удаляют защитные группы и его ацилируют.

Для получения липополимеров, содержащих амидную, уреидную или аминную связь (то есть, если L означает -NH-(C=0)-NH-, -NH-(C=0)-CH2-, -NH-(C=0)-NH-CH₂- или -NН-СН₂-) могут быть использованы соответствующие реакции с использованием метода, описанного Zalipsky и соавт. в публикации РСТ No WO 98/18813 (1998), и мПЭГ-NH₂ вместо мПЭГ-ОН.

Соединения, в которых L означает -Х-(С=0)-, где Х означает O или NH, могут быть получены при взаимодействии активированного ПЭГ, содержащего концевую карбоксильную группу (полученного путем окисления концевой гидроксильной группы ПЭГ и активации карбоксильной группы, например, с помощью превращения нитрофенилового эфира или реакции с дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД)), с 1,2,3-пропантриолом или 1-амино-2,3-пропандиолом соответственно (Фиг.2.3). Соединение с кетосвязью (то есть, где Х означает простую связь) может быть получено путем конденсации ПЭГ, содержащего концевую альдегидную группу (полученного окислением в мягких условиях ПЭГ с концевой гидроксильной группой), например, с реагентом Гриньяра, ацетонидом 1-бром-2,3-пропандиолом (Фиг.2.4) с последующим окислением до кетона в не кислотных условиях и гидролизом ацетонида до диола. Затем в каждом случае диол ацилируют в стандартных условиях.

Концевой группой олигомера ПЭГ, не связанной с остатком глицерина (α концевая группа, вышеупомянутая группа Z) обычно является гидрокси или метокси, однако эта группа может быть функциональной группой, полученной в соответствии с методами, известными в данной области техники для ускорения присоединения различных молекул к нейтральному липополимеру и/или для использования с целью доставки липосом к определенным клеткам или типам тканей или для ускорения доставки лекарственного средства другим путем. Молекулы, предназначенные для присоединения, могут включать, например, белки, пептиды, сахариды, антитела или витамины. В примерах 2 и 3 описаны стадии получения липополимеров с α-функциональной группой с использованием методов, аналогичных описанным выше, но которые получают с использованием выпускаемых в промышленности олигомеров ПЭГ, в которых α-концевая группа замещена группой, такой как трет-бутиловый простой эфир или бензиловый простой эфир, которые легко превращаются в гидроксильную группу после синтеза липидного фрагмента молекулы. Затем эту концевую группу активируют, в данном случае с помощью превращения в п-нитрофенилкарбонат.

III. Фармакокинетика липосом

Липосомы с высоким временем циркуляции формируют с помощью встраивания нейтрального липополимера в липосомы, состоящие из везикулообразующих липидов. Предпочтительным является содержание нейтрального липополимера в липосомах в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 10 мол.% и наиболее предпочтительным - от приблизительно 3 до приблизительно 6 мол.%. Для иллюстрации способа получают липосомы, включающие от приблизительно 3 до приблизительно 5 мол.%, либо мПЭГ₂₀₀₀-ДСФЭ (дистеароилфосфатидилэтаноламин), либо липополимера с карбаматной связью, мПЭГ₂₀₀₀-к-ДС, как описано в примере 4. Молярное соотношение липидов, состоящих из ГФХС и холестерина, составляет 1,5:1. Липосомы содержат маркер ¹²⁵I-тираминилинулин. Образец каждого препарата вводят в хвостовую вену мыши и определяют распределение в тканях через различные промежутки времени, как описано в примере 4. Уровни, определенные в крови, печени и селезенке, представлены в таблицах 1-3 и показаны в виде графиков на фигурах 3.1-3.3. Полученные данные свидетельствуют о том, что фармакокинетика липосом, содержащих ПЭГ-к-ДС, очень близка к фармакокинетике липосом, содержащих ПЭГ-ДСФЭ.

Таблица 1. Распределение липосом в крови
Время	% от введенной дозы
	А	В	С
30 мин	-	94,8±3,99	89,7±6,94
2 ч	85,1±1,99	79,8±3,42	73,0±17,4
6 ч	67,1±6,25	54,5±3,05	55,3±2,51
12 ч	54,9±6,04	39,7±2,52	44,4±2,52
24 ч	14,8±2,81	12,4±2,34	16,6±2,38

Таблица 2. Распределение липосом в печени
Время	% от введенной дозы
	А	В	С
30 мин	-	2,27±0,13	3,14±0,95
2 ч	8,76±2,01	9,42±1,24	11,7±1,74
6 ч	21,7±2,55	19,3±1,37	20,8±0,86
12 ч	26,6±0,51	26,4±1,99	30,4±1,28
24 ч	43,9±2,7	36,6±2,25	42,6±0,48

Таблица 3. Распределение липосом в селезенке
Время	% от введенной дозы
	А	В	С
30 мин	-	0,09±0,06	0,23±0,08
2 ч	0,96±0,16	0,99±0,09	1,08±0,09
6 ч	1,94±0,07	1,96+0,29	2,12±0,13
12 ч	3,15±0,31	3,13±0,12	3,35±0,22
24 ч	4,69±0,37	3,91±0,31	4,56±0,29

Аналогичное исследование проводят для сравнения характеристик обоих типов ПЭГ-замещенных липидов по сравнению с контрольным составом, не содержащим ПЭГ. На Фиг.4 показано удерживание в крови липосом ГФХС 2:1, не содержащих липидов ПЭГ (крестики), содержащих 5 мол.% ПЭГ₂₀₀₀-ДСФЭ (треугольники) или 5 мол.% ПЭГ₂₀₀₀-к-ДС (кружочки).

Дальнейшие исследования проводят с использованием липосом, содержащих мПЭГ₂₀₀₀-к-ДС:ЧГФХ:ХС в молярном соотношении 5:55:40. В липосомы вводят метку путем включения комплекса индий-ДТПК. Процент от введенной дозы определяют в крови и различных тканях в течение 24 ч. Результаты представлены в таблицах 4-6. И в этом случае липосомы характеризуются типичной фармакокинетикой с пролонгированной циркуляцией, причем среднее удерживание составляет более 70% от введенной дозы через 4 ч и более 30% через 24 ч.

Таблица 4. Процент от введенной дозы индия в крови
Животное	0,0 ч	0,5 ч	1,0 ч	2,0 ч	4,0 ч	24 ч
Крыса 1	103,7	91,2	82,5	73,8	72,0	33,1
Крыса 2	97,7	87,7	79,4	78,7	74,4	30,7
Крыса 3	95,1	83,1	77,8	68,6	64,4	29,8
Крыса 4	91,9	85,4	78,5	75,6	72,6	33,2
Сред. велич.	97,1	86,8	79,6	74,2	70,9	31,7
Станд. откл.	5,0	3,4	2,1	4,2	4,4	1,7

Таблица 5. Процент от введенной дозы в тканях через 24 ч
Ткань	Крыса 1	Крыса 2	Крыса 3	Крыса 4	Сред. велич.	Станд. откл.
Печень	7,5	6,9	6,7	7,2	7,1	0,3
Селезенка	4,9	5,4	5,6	4,8	5,2	0,4
Сердце	0,4	0,5	0,5	0,6	0,5	0,1
Почки	1,2	1,2	1,0	1,2	1,1	0,1
Легкое	0,7	0,7	0,7	0,8	0,7	0,1
Кожа	0,1	0,3	0,2	0,2	0,2	0,1
Кость	0,3	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Мышцы	0,1	0,1	0,1	0,2	0,1	0,4
Моча	11,2	13,4	5,7	12,3	10,7	3,4

Таблица 6. Процент от введенной дозы/г в тканях через 24 ч
Ткань	Крыса 1	Крыса 2	Крыса 3	Крыса 4	Сред. велич.	Станд. откл.
Печень	0,7	0,7	0,7	0,7	0,7	0,3
Селезенка	7,3	6,9	8,2	5,9	7,1	0,9
Сердце	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,4
Почки	0,6	0,6	0,5	0,6	0,6	0,6
Легкое	0,6	0,5	0,5	0,6	0,5	0,6
Кожа	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Кость	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,3
Мышцы	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,2
Моча*	0,6	0,6	0,3	0,8	0,6	0,2

И наконец, липосомы, содержащие 5 мол.% мПЭГ₂₀₀₀-к-ДС или мПЭГ₂₀₀₀-ДСФЭ и остальное количество процентов ЧГФХЯ, сравнивают по проценту остаточного количества в крови через промежуток времени вплоть до 24 ч после введения. Как показано на Фиг.4, типы фармакокинетики практически идентичны, причем удерживание через 24 ч составляет приблизительно 40%.

Все публикации, патенты и патентные документы включены в данное описание в качестве ссылок, как если бы каждый документ был отдельно включен в качестве ссылки. Изобретение описано со ссылкой на различные специфические и предпочтительные варианты воплощения изобретения и методики. Однако следует понимать, что возможны многочисленные изменения и модификации, которые включены в сущность и объем притязаний по изобретению.

Следующие примеры приведены для иллюстрации, но не для ограничения объема притязаний изобретения.

Пример 1А. Синтез мПЭГ-к-ДС (мПЭГ аминопропандиол дистеароил: α-метокси-ω-2.3-ди(стеароилокси)пропилкарбамат-поли(этиленоксид))

Раствор мПЭГ₂₀₀₀ (20 г, 10 моль) сушат путем упаривания в виде азеотропной смеси в толуоле (50 мл, 120°С). После того, как температура вышеуказанного раствора достигнет 25°С, его обрабатывают нитрофенилхлорформиатом (3,015 г, 15 моль), а затем ТЭА (2,01 мл, 15 моль). Реакцию в полученной смеси проводят в течение 1,5 ч. Соль ТЭА отфильтровывают, а растворитель удаляют, при этом получают неочищенный мПЭГ₂₀₀₀-нитрофенилхлорформиат, к которому добавляют раствор аминопропандиола (3 г, 30 моль) в ацетонитриле (50 мл). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Нерастворенные вещества удаляют фильтрованием, а растворитель упаривают. Полученный продукт дважды перекристаллизовывают из изопропанола. Выход: 13,7 г, 65%. ¹Н ЯМР: (300 МГц, DMSO-D₆) δ 3,23 (s, ОСН₃, 3Н), 3,65 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,05 (t, уретан CH₂, 2Н), 4,42 (t, 10 ОН, 1Н), 4,57 (d, 20 ОН, 1Н).

Полученный продукт, мПЭГ_2000-аминопропандиол (2,3 г, 1,08 моль, 2,17 миллиэкв. ОН), растворяют в толуоле (30 мл) и сушат путем упаривания в виде азеотропной смеси, удаляя приблизительно 10 мл раствора. Раствор охлаждают до комнатной температуры. При помощи пипетки добавляют пиридин (4 мл, 20%), а затем стеароилхлорид (1 г, 4,3 моль). При этом наблюдается немедленное образование осадка белого цвета. Реакционную смесь нагревают с обратным холодильником при 120°С в течение ночи и затем охлаждают. Когда температура реакционного сосуда достигнет приблизительно 40°С, соль пиридина отфильтровывают. Фильтрат упаривают. продукт (ПЭГ₂₀₀₀-к-ДС) очищают двухкратной перекристаллизацией из изопропанола (2×30 мл) и сушат в вакууме над Р₂О₅.

Выход: 2,26 г, 80%. ТСХ (хлороформ/метанол, 90:10): мПЭГ-аминопропандиол, R_f=0,266; ПЭГ-к-ДС, R_f=0,533. ¹H ЯМР: (300 МГц, DMSO-D₆) δ 0,89 (t, СН₃, 6Н), 1,26 (s, CH₂, 56H), 1,50 (2t, 2CH₂, 4Н), 2,24 (t, CH_gCH_s -С=0, 4Н), 3,23 (s, ОСН₃, 3Н), 3,50 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,00 (dd, CH₂ из АПД, 1Н), 4,02 (t, СН₂OC=O-N, 2Н), 4,20 (dd, СН₂ из АПД, 1Н), 4,98 (m, CHOC(O), 1H), 7,34 (m, NH, 1H).

Для получения полимеров мПЭГ с молекулярным весом 750, 5000 и 12000 используют методику, аналогичную использованной для получения ПЭГ-к-ДС. Структуры полимеров определяют методами ¹H ЯМР и масс-спектрометрии. Молекулярные массы определяют методом МС MALDI (лазерная десорбция на матрице/ионизация), полученные результаты приведены ниже:

Конъюгат	Мол. масса по МС (MALDI)
мПЭГ(750)-к-ДС	1426
мПЭГ(2000)-к-ДС	2892
мПЭГ(5000)-к-ДС	5816
мПЭГ(12000)-к-ДС	12729

Пример 1Б. Синтез ПЭГ-к-ДЭ (мПЭГ-аминопропандиолдиэйкозаноил: α-метокси-ω-2,3-ди(эйкозаноилокси)пропилкарбамат-поли(этиленоксид))

В круглодонной колбе объемом 100 мл растворяют эйкозановую кислоту (500 мг, 1,6 ммоль) в толуоле (20 мл), а затем при помощи пипетки добавляют оксалилхлорид(147 мкл, 1,68 ммоль). К перемешиваемой реакционной смеси добавляют 1% ДМФ. При добавлении ДМФ наблюдается выделение газа. Любые контакты с данным газом следует исключить. Через 10 мин толуол упаривают, добавляют еще 20 мл толуола и упаривают для удаления избытка оксалилхлорида. Остаток повторно растворяют в 10 мл толуола. К раствору добавляют мПЭГ-аминопропандиол, полученный по методике, приведенной выше (1,19 г, 0,56 ммоль), к колбе подсоединяют обратный холодильник и полученную смесь нагревают с обратным холодильником в течение ночи. Данные ТСХ (метанол/хлороформ, 9:1) свидетельствуют о том, что реакция завершена. После охлаждения реакционной смеси нерастворенные вещества отфильтровывают, а фильтрат высушивают досуха. Полученный продукт очищают трехкратной перекристаллизацией из изопропанола и сушат в вакууме над P₂O₅. Выход: 1,0 мг, 70%. ¹H ЯМР: (360 МГц, DMSO-D₆) δ 0,89 (t, СН₃, 6Н), 1,26 (s, CH₂, 66 Н из липида), 1,50 (t, 2СН₂, 4Н), 2,24 (t, СН₂СН₂ С=0, 4Н), 3,23 (s, OСН₃, 3Н), 3,50 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,00 (dd, CH₂ из АПД, 1Н), 4,05 (t, СН₂СН₂С+O, 4H), 4,05 (t, CH₂OC=O-N, 2H), 4,20 (dd, CH₂ из АПД, 1Н), 4,98 (m, СНОС(О), 1Н), 7,34 (m, NH, 1H) част./млн.

Пример 2. Получение трет-бутил-O-ПЭГ-аминопропандиолачерезтрет-бутил-O-ПЭГ-O-сукцинимид

А.Трет-бутил-O-ПЭГ-O-сукцинимид

Трет-бутил-O-ПЭГ-2000, предоставленный лабораторией полимеров (Polymer Labs) (10 г, 5 ммоль), сушат путем упаривания в виде азеотропной смеси, растворяя в 120 мл толуола и удаляя приблизительно 20 мл растворителя, причем воду собирают в ловушку Дина Старка.

Раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют фосген (15 мл). Реакцию проводят при комнатной температуре в течение ночи. После завершения реакции растворитель удаляют на роторном испарителе. В реакционную смесь добавляют приблизительно 50 мл свежеперегнанного толуола и удаляют на роторном испарителе. Остаток растворяют в сухом толуоле (30 мл) и хлористом метилене (10 мл). К полученному раствору добавляют N-гидроксисукцинимид (NHS) (1,7 г, 14,8 ммоль) и триэтиламин (ТЭА) (2,1 мл, 14,9 ммоль) и реакцию проводят при комнатной температуре в течение ночи, данные ТСХ свидетельствуют о том, что реакция завершена.

Соль отфильтровывают из реакционной смеси, растворитель удаляют упариванием и твердое вещество дважды перекристаллизовывают из изопропилового спирта, сушат над P₅O₅. Выход: 9,2 г, 85%. ¹H ЯМР: (СDСl₃, 360 МГц) δ 1,25 (s, трет-бутил, 9Н), 2,82 (s, CH₂CH₂, 4Н), 3,60 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,45 (t, СН₂ОСОМН, 2Н) част./млн.

Б. Трет-бутил-O-ПЭГ-аминопропандиол

К раствору аминопропандиола (300 мг, 3,2 ммоль) в ДМФ (10 мл) добавляют трет-бутил-ПЭГ-OSc (5 г, 2,29 ммоль) и проводят реакцию в течение ночи. При этом потребляется весь эфир NHS, что позволяет получить гомогенный продукт (по данным ТСХ одно пятно).

К реакционной смеси добавляют предварительно промытую ионно-обменную смолу в кислотной форме (~ 1 г) и через 30 мин ее удаляют фильтрованием. Растворитель удаляют и остаток перекристаллизовывают из 200 мл изопропилового спирта. Твердое вещество собирают и сушат над Р₂О₅. Выход: 4,2 г, 85%. ¹H ЯМР: (D₆-DMSO, 360 МГц) δ 1,25 (s, трет-бутил, 9Н), 3,68 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,03 (t, CH₂OCONH, 2H), 4,43 (t, 10 ОН, 1Н), 4,55 (d, 20 ОН, 1Н), 6,98 (t, NH, 1H) част./млн.

Пример 3. Получение п-нитросфенилкарбонат-ПЭГ-к-ДС

А. Бн-0-ПЭГ-нитрофенилкарбонат (НФК)

Бн-О-ПЭГ-2000, приобретенный на фирме Shearwater Polymers (Huntsville, LA; 5 г, 2,41 ммоль), сушат путем упаривания в виде азеотропной смеси, растворяя в 120 мл толуола и удаляя приблизительно 20 мл растворителя, причем воду собирают в ловушку Дина Старка. Раствор охлаждают до комнатной температуры и оставшийся растворитель упаривают при пониженном давлении.

Остаток растворяют в 30 мл смеси хлористый метилен/этилацетат (60:40), затем добавляют п-нитрофенилхлорформиат (729 мг, 3,6 ммоль) и триэтиламин (1 мл, 7,2 ммоль). Реакцию проводят при 4°С в течение 8-16 ч. Этот метод снижает скорость реакции, но исключает образование бисПЭГ-карбоната. Данные ТСХ на силикагелевой пластине GF (пятно наблюдают в УФ) свидетельствуют о том, что реакция завершена.

Реакционную смесь обрабатывают предварительно очищенной ионно-обменной смолой в кислотной и основной форме в течение 30 мин, фильтруют и высушивают досуха. Полученный продукт перекристаллизовывают из изопропилового спирта и сушат над P₂O₅. Выход: 4,4 г, 80%.

Б. Бн-O-ПЭГ-аминопропандиол

К раствору аминопропандиола (260 мг, 1,9 ммоль) в ДМФ (10 мл) добавляют Бн-0-ПЭГ-НФК, полученный, как описано выше (4,3 г, 2,9 ммоль), и проводят реакцию в течение 5 ч. Весь Бн-0-ПЭГ-НФК потребляется, по данным ТСХ (хлороформ/метанол/вода, 90:18:2), в реакционной смеси наблюдается одно пятно.

Реакционную смесь обрабатывают 5 г предварительно очищенной ионно-обменной смолы в кислотной форме в течение 30 мин, фильтруют и высушивают досуха. Полученный продукт перекристаллизовывают из изопропилового спирта и сушат над Р₂O₅. Выход: 3,8 г, 91%.

В. Бн-0-ПЭГ-к-дистеароил

Раствор Бн-0-ПЭГ-аминопропандиола (3 г, 1,36 ммоль), стеариновой кислоты (1,94 г, 6,79 ммоль) и ТСДП (4-толуолсульфонат 4-(диметиламино)пиридиния) в качестве катализатора (408 мг, 1,36 ммоль) перемешивают при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавляют при помощи пипетки диизопропилкарбодиимид (1,28 мл, 8,16 ммоль) и проводят реакцию в течение ночи. Данные ТСХ (хлороформ/метанол, 90:10) свидетельствуют о том, что все диольные группы вступили в реакцию.

К реакционной смеси добавляют ионно-обменную смолу в основной форме (~5 г). Смесь встряхивают в течение 30 мин, смолу отфильтровывают и фильтрат высушивают досуха. Остаток перекристаллизовывают из изопропанола (100 мл) и сушат над P₂O₅. Выход: 4 г, 80%.

Г. НО-ПЭГ-к-дистеароил

Существуют два различных метода удаления защитной бензильной группы с Бн-0-ПЭГ-к-ДС.

Метод 1. Гидрогенолиз: удаление защитной группы в присутствии палладия на угле. К раствору Бн-0-ПЭГ-к-ДС (218 мг, 0,08 ммоль) в 5 мл метанола добавляют 10% Pd/C (110 мг) и формиат аммония (107 мг, 0,8 ммоль), проводят реакцию при комнатной температуре в течение ночи. Pd/C удаляют фильтрованием через слой целита, фильтрат высушивают досуха. Остаток повторно растворяют в хлороформе и три раза промывают насыщенным раствором NaCl. Фазу хлороформа собирают, сушат над МgSO₄, фильтруют и концентрируют. Твердый остаток лиофилизируют из трет-бутанола и полученный порошок сушат над Р₂O₅. Выход: 80%, 175 мг.

Метод 2. Удаление защитной группы в присутствии тетрахлорида титана.

Раствор Bn-0-ПЭГ-к-ДС (1,18 г, 0,43 ммоль) в хлористом метилене (10 мл) охлаждают на ледяной бане в течение 5 мин. Тетрахлорид титана (3 мл, 21,5 моль, избыток) переносят при помощи высушенного в термостате шприца в герметично закрытый реакционный сосуд. Через 5 мин ледяную баню удаляют и удаление защитной группы проводят при комнатной температуре в течение ночи. По данным ТСХ на силикагелевой пластине GF происходит полное удаление защитной группы, о чем свидетельствует смещение пятна по сравнению с исходным веществом.

К реакционной смеси добавляют приблизительно 40 мл хлороформа и смесь переносят в делительную воронку, содержащую 40 мл насыщенного раствора NаНСO₃. Полученную смесь осторожно встряхивают (чтобы избежать образования эмульсии) и слой хлороформа собирают. Эту экстракцию повторяют три раза, фазу хлороформа собирают и экстрагируют еще раз свежей порцией насыщенного раствора NаНСО₃, чтобы убедиться в том, что TiCl₄ удален полностью. Собранную фазу хлороформа сушат над MgS0₄, фильтруют и концентрируют.

Полученный по вышеописанной методике остаток повторно растворяют в 1 мл хлороформа и наносят на подготовленную колонку с силикагелем (200-400 меш, 60

). Полярность подвижной фазы (хлороформ) увеличивают постепенным добавлением метанола (с приращением 2%) до элюирования продукта при соотношении метанол/хлороформ, 10:90. Продукт собирают и растворитель удаляют на роторном испарителе. Твердое вещество лиофилизируют из трет-бутанола и сушат над Р₂О₅. Выход: 70%, 800 мг.

Д. п-Нитрофенилкарбонат-ПЭГ-к-ДС

Перед началом реакции реакционный сосуд, перемешивающий стержень, шприцы и исходное вещество (НО-ПЭГ-к-ДС, полученное, как описано выше) тщательно сушат.

К раствору НО-ПЭГ-к-ДС (1,2 г, 0,45 ммоль) в 10 мл смеси хлористый метилен/этилацетат (60:40) добавляют п-нитрофенилкарбонат (136 мг, 0,65 ммоль) и триэтиламин (188 мкл, 1,35 ммоль). Реакционную смесь выдерживают при 4°С (для предотвращения образования бисПЭГ-карбоната) в течение 8-16 ч, после чего данные ТСХ на силикагелевой пластине GF пластине свидетельствуют о завершении реакции.

Соединение	R_f (СНСl₃/СН₃ОН, 90:10)
НО-ПЭГ-к-ДС НФК-ПЭГ-к-ДС	0,40 0,54

Реакционную смесь обрабатывают в течение 30 мин предварительно очищеннами ионно-обменными смолами в кислотной и основной форме и фильтруют. Фильтрат высушивают досуха и остаток перекристаллизовывают из изопропилового спирта. Твердое вещество сушат над P₂O₅. Выход: 70%. ¹H ЯМР: (D₆-DMSO, 360 МГц) δ 0,86 (t, СН₃, 6Н), 1,22 (s, ДС, 56Н), 1,48 (m, СН₂СH₂(СО), 4Н), 2,26 (2 xt, CH₂OCONH, 2H) 4,03 & 4,22 (2 xd, CH₂CH из липида, 2H), 4,97 (m, СНСH₂ из липида), 6,98 (t, NH, 1H), 7,55 & 8,32 (2xd, ароматический, 4Н) част./млн.

Пример 4. Получение и изучение биораспределения липосом, содержащих ПЭГ-ДСФЭ и ПЭГ-к-ДС.

Липидные пленки формируют путем растворения и удаления растворителя из смеси липидов, содержащей ГФХС:ХС:ПЭГ в следующем молярном соотношении:

А. 58:39:3; ПЭГ-липид = ПЭГ-к-ДС

Б. 57:38:5; ПЭГ-липид = ПЭГ-ДСФЭ

В. 57:38:5; ПЭГ-липид = ПЭГ-к-ДС

Пленки гидратируют в свежеприготовленном растворе ¹²⁵I-тираминилинулина в 25 мМ HEPES, содержащем 140 мМ NaCl, pH 7,4, и с помощью экструзии формируют липосомы диаметром 100-105 нм. Липосомы стерилизуют фильтрацией через фильтр Миллипор с диаметром пор 0,22 мкм со шприцевой насадкой для связывания низкомолекулярных белков (производства фирмы Millipore Corporation, Bedford, МА). В аликвотах определяют число импульсов ¹²⁵I для расчета дозы. Концентрацию липидов в препаратах липосом определяют по содержанию фосфатов и препараты липосом разбавляют в стерильном буфере до конечной концентрации 2,5 мкмол/мл. Мышам вводят по 0,2 мл разбавленных липосом внутривенно в хвостовую вену, таким образом каждая мышь получает по 0,5 мкмол фосфолипида. Через различные промежутки времени мышей умерщвляют путем эфтаназии с использованием анестезии галотаном с последующим цервикальным вывихом. Отбирают кровь из сердца и в крови, а также в различных органах определяют число импульсов ¹²⁵I.

Claims

1. Нейтральный липополимер формулы

где

каждый из R¹ и R² независимо друг от друга означает алкильную или алкенильную цепь, содержащую от приблизительно 8 до приблизительно 24 атомов углерода;

L выбирают из группы, состоящей из (i) -X-(C=O)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=O)- и (iii) -X-CH₂-, где X и Y независимо выбирают из кислорода, NH и простой связи, при условии, что если L означает -Х-(С=O)-, то Х не является NH.

2. Липополимер по п.1, отличающийся тем, что Х означает кислород, а Y означает азот.

3. Липополимер по п.1, отличающийся тем, что L означает карбаматную связь, сложноэфирную связь или карбонатную связь.

4. Липополимер по п.3, отличающийся тем, что L означает карбаматную связь -O-(С=O)-NН-СН₂-.

5. Липополимер по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что Z означает гидрокси или метокси.

6. Липополимер по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что каждый из R¹ и R² независимо друг от друга означает неразветвленную алкильную или алкенильную цепь, содержащую от приблизительно 8 до приблизительно 24 атомов углерода.

7. Липополимер по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что каждый из R¹ и R² означает С₁₇Н₃₅.

8. Липополимер по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что n равно от приблизительно 20 до приблизительно 115.

9. Липосомальная композиция, отличающаяся тем, что она содержит от приблизительно 1 мол.% до приблизительно 10 мол.% нейтрального липополимера по любому из пп.1-8.

10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что она содержит от приблизительно 3 мол.% до приблизительно 6 мол.% нейтрального липополимера.

11. Способ увеличения времени циркуляции липосомы, содержащей везикулообразующие липиды, отличающийся тем, что в липосому, содержащую везикулообразующие липиды, встраивают нейтральный липополимер по любому из пп.1-8.