KR20230124980A - 쯔비터이온성 지질 나노입자 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

쯔비터이온성 지질 나노입자 조성물 및 사용 방법 Download PDF

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KR20230124980A
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lipid
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zwitterionic
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시진 루오종
제판 유안
샤오이 지앙
샤오란 후
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코넬 유니버시티
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Abstract

(i) 지질 모이어티가 쯔비터이온성 폴리머에 공유 부착된 적어도 하나의 쯔비터이온성 폴리머-함유 지질; (ii) 폴리머에 부착되지 않은 하전 및 비하전 지질로부터 선택되는 적어도 하나의 비-양이온성 지질; (iii) 2차, 3차 또는 4차 아미노기를 갖는 적어도 하나의 양이온성 또는 이온화가능한 지질; 및 (iv) 적어도 하나의 치료 물질, 및 선택적으로 (v) 콜레스테롤 또는 그의 유도체를 포함하는 지질 나노입자 조성물. 또한 대상체에게 치료 물질을 전달하는 방법이 본원에 기술되며, 상기 방법은 전술한 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

Description

쯔비터이온성 지질 나노입자 조성물 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 이 출원은 2020년 12월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 63/129,343의 우선권을 주장하며, 이 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
[0002] 본 발명은 국립 과학 재단이 수여한 승인 번호 2002940 및 2103295에 따라 정부 지원 으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 지분을 갖는다.
[0003] 본 발명은 일반적으로 핵산과 같은 치료제의 캡슐화 및 전달을 위한 쯔비터이온성(zwitterionic) 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP) 제제에 관한 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로 유전자 요법과 같은 다양한 질병 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 전달을 위한, 또는 대상체를 예방접종하기 위한 이러한 LNP F제제, 특히 그의 비-PEG화 버전의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
[0004] DNA, siRNA 및 mRNA와 같은 핵산의 생체내 전달은 백신접종, 효소 대체 요법 및 유전 질환 치료에 혁명을 일으킬 가능성이 있다. 바이러스 벡터에 비해 지질 나노입자 전달 플랫폼은 안전성 문제가 더 적은 것으로 여겨진다. 2018년 최초의 FDA 승인 LNP-siRNA 약물 이후, 점점 더 많은 수의 지질 나노입자가 개발되어 임상 시험 중에 있다. LNP는 일반적으로 이온화가능한 양이온 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질의 네 가지 구성 요소로 구성된다. 그 중 PEG-지질은 일반적으로 LNP 구조를 안정화하고 보호하는 데 사용된다.
[0005] PEG는 처음에는 면역학적으로 불활성인 것으로 추정되었지만 지질이나 단백질에 대한 부착은 합텐 효과로 인한 면역 반응의 추가 원인을 도입하여 항-PEG 항체(Abs)를 유발하는 것으로 알려져 있다. 점점 더 많은 임상 보고서에서 항-단백질 Ab 대신 항-PEG Ab가 경우에 따라 임상 문제의 주요 원인임을 강조하고 있다. PEG화된 유리카제 제품인 페글로티카제(Krystexxa)의 전형적인 경우에서, 이 약물을 투여받은 불응성 만성 통풍 환자의 40% 이상이 높은 수준의 항-PEG Ab 반응을 겪었고 결과적으로 그 치료에 대한 무반응자가 되었다.
[0006] 항-PEG Ab는 시장에서 일부 PEG 결합 단백질의 효능을 손상시켰다. 유도된 항-PEG 항체 외에도 기존의 항-PEG Ab는 모든 PEG화 약물에 중요하다. 급성관상동맥증후군 환자를 대상으로 한 임상시험에서 페그니바코긴(PEG화된 RNA aptamer)의 첫 투여 후 심각한 알레르기 반응이 발생하였다. 독소루비신에 대한 PEG화된 리포솜 제제인 Doxil®은 또한 첫 주사 시 일부 환자에서 즉각적인 과민 반응을 나타내는 것으로 보고되었다. 따라서, 종래의 LNP에서 문제가 되는 성분을 대체할 수 있고 개선된 기능의 생물약제 제품을 제공할 수 있는 새로운 지질 조성물을 제공하기 위한 아직 충족되지 않은 요구가 있다.
발명의 요약
[0007] 본 발명은 무엇보다도 대상체에게 핵산과 같은 치료제를 전달하기 위한 신규한 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다. 본원에 기술된 LNP 조성물은 유리하게는 낮은 면역원성, 긴 순환 능력 및 표적화 능력을 갖는다. LNP 조성물은 또한 특정 세포 또는 세포 성분에 결합하기 위해 표적화제로 기능화될 수 있다.
[0008] 제1 측면에서, 본 발명은 적어도 하기 성분을 함유하는 LNP 조성물에 관한 것이다: (i) 지질 모이어티가 쯔비터이온성 폴리머에 공유 부착된 적어도 하나의 쯔비터이온성 폴리머-함유 지질; (ii) 폴리머에 부착되지 않은 하전 및 비하전 지질로부터 선택되는 적어도 하나의 비-양이온성 지질; (iii) 2차, 3차 또는 4차 아미노기를 갖는 적어도 하나의 양이온성 또는 이온화가능한 지질; 및 (iv) 적어도 하나의 치료 물질. 구현예의 제1 세트에서, 성분 (i)의 지질 모이어티는 디아실글리세롤(디아실글리세라이드)이다. 구현예의 제2 세트에서, 성분 (i)은 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, PEG) 세그먼트를 제외한다. 구현예의 제3 세트에서, 성분 (i)의 쯔비터이온성 폴리머는 베타인 폴리머, 또는 더욱 구체적으로 카르복시 베타인 폴리머이다. 구현예의 제4 세트에서, 성분 (ii)의 비-양이온성 지질은 쯔비터이온성 모이어티를 함유한다. 구현예의 제5 세트에서, 성분 (ii)는 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 제외한다. 구현예의 제6 세트에서, 성분 (ii)의 비-양이온성 지질은 인지질, 예컨대 포스파티딜 세린(PS) 지질이다. 구현예의 제7 세트에서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 2차, 3차 또는 4차 기를 갖는다. 구현예의 제8 세트에서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, PEG) 세그먼트를 제외한다. 구현예의 제9 세트에서, 지질 나노입자 조성물은 (v) 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함한다. 구현예의 제10 세트에서, 치료 물질은 핵산 분자, 예컨대 RNA, 보다 구체적으로 mRNA, 또는 보다 구체적으로 바이러스 mRNA 또는 보다 구체적으로 선형 또는 고리형 mRNA이다. 특히, 제1 내지 제10 구현예 중 임의의 것을 조합하여 본 발명의 LNP 조성물을 생성할 수 있다.
[0009] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기 기재된 제1 내지 제10 구현예 중 임의의 것을 포함하는 상기 기재된 임의의 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체에게 치료 물질을 전달하는 방법에 관한 것이다. 구현예의 제1 세트에서, 지질 나노입자 조성물은 대상체의 세포에 전달된다. 구현예의 두 번째 세트에서, 치료 물질은 핵산 분자이고, 그 투여는 대상체의 유전자 치료를 초래한다. 구현예의 제3 세트에서, 치료 물질은 핵산 분자이고, 그의 투여는 대상체의 백신접종을 초래한다.
[0010] 또 다른 측면에서, 본 발명은 생리학적 조건 하에서 음하전된 관능기와 함께 2차, 3차 또는 4차 아민기에 부착된 지질 모이어티를 함유하는 지질 조성물에 관한 것이다. 이 지질 모이어티는
일 수 있고
식 중,
R1/R2 = H 또는 알킬기이다. 알킬은 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형, 모두 탄소 및 수소이거나, 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F와 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다.
L은 N과 A 사이의 공유 결합 링커기이다. 링커는 모두 탄소 및 수소이거나 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F와 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다. 구조 L의 비제한적인 예는 -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CHClCH2-, -CH2OCH2-, -CH2SCH2-, -CH2SSCH2-, -CH2COOCH2-이다.
A-(X)n은 생리학적 하에서 음전하를 띠는 관능기이다. 이의 비제한적인 구조는 다음과 같다:
(i) A(X)n은 카르복실산기(A = -COOH 및 n=0)이거나
(ii) A(X)n은 포스페이트이며, 여기서 A =
또는
이고 n = 1이다. X = H 또는 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형의, 모두 탄소 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F와 같은 헤테로원자를 함유하는 알킬기이거나 또는
(iii) A(X)n은 설폰산기이고, 여기서 A =
이고 n = 0
(iv) A(X)n은 설폰아미드기이며, 여기서 A =
이고 n = 1, X = H 또는 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형, 모두 탄소 및 수소 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F와 같은 헤테로원자를 함유하는 알킬기이다.
이러한 이온화가능한 지질의 예시적인 구조는 다음과 같다.
여기서 n=1 내지 10이다.
[0011] 도 1. 본 발명의 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질인 DMG-PCB(또는 PCB 지질)의 화학 구조 및 1H NMR 스펙트럼.
[0012] 도 2. PCB 지질을 포함하는 LNP(또는 PCB-LNP)의 시험관내 특성화. (a) 대표적인 PCB-LNP 제제의 TEM 이미지. (b) HepG2 세포주에서 상이한 PCB-LNP의 루시퍼라제 발현.
[0013] 도 3. PCB 지질을 함유하는 LNP(또는 PCB-LNP)의 생체내 mRNA 발현. Aura Image Software로 이미지를 분석하였다. 모든 PCB-LNP는 간에서 그의 PEG 대응물과 유사한 형질감염 효율을 보였다.
[0014] 도 4. ZW-A-CBn의 합성(n=1, 2, 3)의 합성도.
[0015] 도 5. 화합물 ZW-A-CB1의 1H NMR(CDCl3) 스펙트럼.
[0016] 도 6. 화합물 ZW-A-CB2의 1H NMR(CDCl3) 스펙트럼.
[0017] 도 7. 화합물 ZW-A-CB3의 1H NMR(CDCl3) 스펙트럼.
[0018] 도 8. ZW-B-CBn(n=1, 2, 3)의 합성도.
[0019] 도 9. 3-((8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)프로판산(6)의 1H NMR 스펙트럼.
[0020] 도 10. N-(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)-N-(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)글리신(8)의 1H NMR 스펙트럼.
[0021] 도 11. 4-((8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)부탄산(10)의 1H NMR 스펙트럼.
[0022] 도 12. ZW-A-SulfAmid-3의 합성도
[0023] 도 13. 화합물 ZW-A-SulfAmid-3의 1H NMR(CDCl3) 스펙트럼
[0024] 도 14. A. 상이한 몰비에서 ZW-B-CB2를 함유하는 PCB-LNP의 제제. B. 그룹 A 및 그룹 B에 대해 HepG2 세포에서 시험관내 형질감염을 수행하였다. 각 시스템을 3회 반복하여 수행하였다.
[0025] 도 15. a) 실시예 8에서 수행된 주사 도식. b) 실시예 8에서 연구된 제제의 조성. c) 제제의 세 번째 주사 후 표시된 시점에서 채취한 혈청으로부터의 EPO(에리스로포이에틴) 혈청 농도 분석: CB1(왼쪽), CB2 (가운데) 및 MC3(오른쪽). 두 코호트 간의 변화의 배수를 나타내기 위해 여기에 정규화된 데이터를 나타내었다.
[0026] 도 16. C57B6/L 마우스(0.2 mg/kg)에서, PCB- mLNP(즉, ZW-B-CB2 지질을 포함하는 PCB-LNP)(왼쪽) 및 PS5-PCB- mLNP(즉, ZW-B-CB2 및 PS 지질을 포함하는 PCB-LNP)의 생체내 루시퍼라제 발현(오른쪽). 이미지는 정맥 주사 후 6시간 후에 촬영되었다.
[0027] 도 17. LNP에 의해 전달되는 Fluc-mRNA의 시험관내 발현. 완충 수용액의 pH 값: pH = 5(a) 또는 pH = 3(b). 제제: 50:38.5:10:1.5(이온화 지질 + 쯔비터이온성 이온화 지질): 콜레스테롤: 헬퍼 지질(DOPE 또는 DSPC): PEG-지질. 가로 줄무늬: MC3 50% + 쯔비터이온성 지질 0%; 세로 줄무늬: MC3 25% + ZW-B-CB1 25%; 바둑판 무늬: MC3 25% + ZW-B-CB2 25%; 그리드: MC3 25% + ZW-B-CB3 25%.
[0028] 도 18. LNP에 의해 전달되는 Fluc-mRNA의 시험관내 발현. 완충 수용액의 pH 값: pH = 5(왼쪽) 또는 pH = 3(오른쪽). 일반 제제: 50:38.5:1.5(이온성 지질 + 쯔비터이온성 이온성 지질): 콜레스테롤: PEG-지질. 가로 줄무늬: MC3 50% + 쯔비터이온성 지질 0%; 세로 줄무늬: MC3 25% + ZW-B-CB1 25%; 바둑판 무늬: MC3 25% + ZW-B-CB2 25%; 그리드: MC3 25% + ZW-B-CB3 25%.
[0029] 도 19. 상이한 세포에서 PS5-LNP 및 PS0-LNP(PEG 제제)의 루시퍼라제 발현: (a) HepG2, (b) Raw264.7, (c) 일차 마우스 비장세포. 실험은 세 번 반복하여 수행되었다. (d) 각각 Fluc-인코딩 mRNA를 보유하는 PS0-LNP 및 PS5-LNP로 처리된 마우스로부터 분리된 장기의 IVIS 이미지 및 생체발광 신호 분석. 도면에 표시된 장기(위에서 아래로)는 폐, 표면 경부 림프절(SCLN, 타액선에 부착됨), 간, 신장 및 비장이다.
[0030] 도 20. LNP 제제에서 PC 모이어티를 갖거나 갖지 않는 일부 예시적인 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질 및 비-양이온성 지질의 구조.
[0031] 도 21. 상이한 유형의 지질 모이어티(예를 들어, 쯔비터이온성 폴리머 개질된 지질, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체)가 화학적으로 결합된 일부 예시적인 지질 조성물의 구조.
[0032] 일 측면에서, 본 개시내용은 지질 나노입자(LNP) 조성물에 관한 것이다. 당업계의 일부 LNP는 예를 들어, 문헌[X. Hou et al., Nature Reviews Materials, 6, 1078-1094, 2021]에 기재되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 용어 "지질 나노입자"는 적어도 부분적으로 지질 분자로 구성된 나노입자를 의미한다. 하기에 추가로 기재된 바와 같이, 지질 분자는 본원에 기재된 하나 이상의 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질 및 하나 이상의 비-양이온성 지질, 양이온성 또는 이온화가능한 지질, 및/또는 콜레스테롤을 포함한다.
[0033] 다른 구현예에서, LNP는 정확히, 약, 적어도, 또는 최대, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 또는 250 마이크론, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 경계가 정해진 범위 내의 크기를 갖는다.
[0034] LNP의 제1 성분은 적어도 하나의 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질이다. 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질에서, 지질 모이어티는 쯔비터이온성 폴리머에 공유 결합(즉, 연결)된다. 쯔비터이온성 폴리머는 일반적으로 쯔비터이온성 모노머 뿐만 아니라 쯔비터이온성 모노머로 전환될 수 있는 모노머, 즉, 쯔비터이온성 모노머의 전구체로부터 유도된다. 쯔비터이온성 모노머는 동일한 수의 양전하 및 음전하 (예컨대 각각 하나씩)를 포함하는 전자적으로 중성인 모노머이다. 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 복수의 반복 단위를 함유하며, 각각의 반복 단위는 하나의 양전하 및 음전하를 띤 모이어티를 포함한다. 쯔비터이온성 폴리머는 전형적으로 적어도 2, 5 또는 10개 이상 및 100, 200, 300, 400, 500 또는 1000개 이하의 단위를 함유한다.
[0035] 본원에서 사용되는 용어 "쯔비터이온성 중합체"는 쯔비터이온성 모이어티를 100몰% 갖는 쯔비터이온성 폴리머를 제공하는, 중합가능한 쯔비터이온성 모노머를 중합함으로써 제조된 폴리머를 지칭하거나(즉, 쯔비터이온성 폴리머의 각각의 반복 단위는 쯔비터이온성 모이어티임); 또는 쯔비터이온성 모이어티를 100몰% 미만으로 갖는 쯔비터이온성 폴리머를 제공하는, 중합가능한 쯔비터이온성 모노머와 코모노머를 공중합하여 제조된 폴리머(예를 들어, 중합가능한 쯔비터이온성 모노머와 중합가능한 코모노머가 중합 혼합물 중에 동일한 비율로 존재하는 경우, 생성물은 50몰%의 쯔비터이온성 모이어티를 갖는 쯔비터이온성 폴리머임)를 의미한다.
[0036] "쯔비터이온성 폴리머"라는 용어는 또한 중합 혼합물 중에 실질적으로 동일한 비율로 존재하는 중합가능한 음전하 모노머와 중합가능한 양전하 모노머를 공중합함으로써 제조되며 실질적으로 동일한 수의 음(음이온) 전하 및 양(양이온) 전하를 갖는 폴리머를 지칭한다. 이러한 공중합의 생성물은 100몰%의 쯔비터이온성 모이어티를 갖는 쯔비터이온성 폴리머이며, 여기서 각각의 쯔비터이온성 모이어티는 한 쌍의 반복 단위, 즉: 음전하를 갖는 반복 단위 및 양전하를 갖는 반복 단위로 정의된다. 이러한 쯔비터이온성 폴리머는 혼합 전하 코폴리머로 지칭된다. 용어 "쯔비터이온성 폴리머"는 또한 중합성 코모노머와 중합 혼합물 중에 실질적으로 각각 동일한 비율로 존재하는 중합성 음전하 모노머, 중합성 양전하 모노머를 공중합하여 제조된 폴리머를 말하며, 이 경우 쯔비터이온성 모이어티를 100 몰% 미만으로 갖는 쯔비터이온성 폴리머가 제공된다[즉, 중합성 음전하 모노머와 중합성 양전하 모노머의 조합 및 중합성 코모노머가 중합 혼합물 중에 동일한 비율로 존재하는 경우(즉, 중합성 음전하 모노머와 중합성 양전하 모노머의 조합 50% 및 중합성 코모노머 50%), 생성물은 쯔비터이온성 부분을 50 몰% 갖는 쯔비터이온성 폴리머이다].
[0037] 지질 모이어티는 하나 또는 두 개의 지방산 분자로 에스테르화되어 모노아실 또는 디아실 지질을 생성하는 폴리올 부분(예컨대 디올, 글리세롤, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜세린)으로 구성되며, 여기서 용어 "아실"은 RC(=O)기를 의미하고, 여기서 R은 적어도 8개, 일반적으로 최대 30개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 탄화수소(지방) 사슬이고, 여기서 탄화수소 사슬은 포화되거나 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유할 수 있다. 지질 모이어티는 예를 들어 디아실디올(예컨대 디아실에틸렌글리콜), 디아실글리세롤(디아실글리세라이드), 디아실포스파티딜글리세롤, 디아실포스파티딜에탄올아민 또는 디아실포스파티딜세린 모이어티일 수 있다. 지질은 본 출원에 제공된 실시예 1-14 중 임의의 하나에 기술된 지질 중 임의의 것일 수 있다. 지질은 또한 본원에 참조로 포함된 WO2011/057227에 기재된 지질 중 하나일 수 있다. 지방산 아실 부분은 공지된 지방산 중 임의의 것으로부터 유도될 수 있다. 지방 아실 부분의 일부 예에는 올레오일, 팔미토일, 라우릴, 미리스토일, 스테아로일, 리놀레오일 및 아라키도닐이 포함된다. 쯔비터이온성 폴리머는 전형적으로 폴리올 상의 탄소를 통해 전술한 임의의 지질 모이어티와 같은 지질 모이어티에 부착된다. 쯔비터이온성 폴리머는 폴리머의 측쇄 또는 백본(또는 이들의 조합)에 쯔비터이온성 기를 함유할 수 있다.
[0038] 일 구현예에서, 폴리머는 쯔비터이온성 모노머로부터 제조된 호모폴리머이고 하기 화학식을 갖는다:
식 중 B는 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리우레탄, 폴리아미드 또는 폴리히드로카본(예컨대 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌) 백본과 같은 폴리머 백본이고, P는 쯔비터이온 모이어티이다. 특정 구현예에서, 백본(B)는 다음 구조 중 임의의 것을 가질 수 있다:
또는
식 중 R은 수소 및 치환 또는 비치환 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; E는 치환 또는 비치환 알킬렌, -(CH2)pC(O)O-, and -(CH2)pC(O)NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되며; p는 일반적으로 0 내지 12의 정수이고; R2는 수소 및 치환 또는 비치환 알킬로부터 선택되며; L은 하나 이상의 산소 원자를 선택적으로 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌 기이다. 아래 첨자 x는 전형적으로 적어도 2, 5 또는 10보다 크고 100, 200, 300, 400, 500 또는 1000 단위 이하이다.
[0039] 특정 구현예에서, P는 다음 구조 중 임의의 것으로부터 선택된다:
여기서 R3, R4, 및 R6 수소 및 치환 또는 비치환된 알킬기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, R5 또는 R5는 치환 또는 비치환된 알킬렌, 페닐렌 및 폴리에테르기로 이루어진 군으로부터 선택되며, m은 1 내지 7의 정수이고; x는 2 내지 500의 정수이다.
[0040] 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 베타인 폴리머이다. 다른 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 폴리(포스파티딜콜린) 폴리머, 폴리(트리메틸아민 N-옥사이드) 폴리머, 폴리(쯔비터이온성 포스파티딜세린) 폴리머, 또는 글루탐산-리신(EK)-함유 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 포스파티딜 세린은 포스포세린의 음전하 균형을 맞추기 위해 하나의 이웃하는 양전하 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 포스파티딜 세린은 본원에 참조로 그 내용 전체가 통합된 문헌 "De novo design of functional zwitterionic biomimetic material for immunomodulation" Science Advances, 29 May 2020, Vol. 6, Issue 22, (DOI: 10.1126/sciadv.aba0754)"에 설명된 화합물을 포함한다.
[0041] 베타인 폴리머의 일부 예는 폴리(카르복시베타인), 폴리(설포베타인) 및 폴리(포스포베타인) 폴리머를 포함한다. 적합한 폴리(카르복시베타인)은 예를 들어 카르복시베타인 아크릴레이트, 카르복시베타인 아크릴아미드, 카르복시베타인 비닐 화합물, 카르복시베타인 에폭사이드 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 모노머로부터 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 모노머는 카르복시베타인 메타크릴레이트이다. 본 발명에 유용한 카르복시베타인 폴리머를 제조하기 위한 대표적인 모노머에는 카르복시베타인 메타크릴레이트, 예컨대 2-카르복시-N,N-디메틸-N-(2'-메타크릴로일옥시에틸) 에탄아미늄 내염; 카르복시베타인 아크릴레이트; 카르복시베타인 아크릴아미드; 카르복시베타인 비닐 화합물; 카르복시베타인 에폭사이드; 및 히드록실, 이소시아네이트, 아미노 또는 카르복실산 기를 갖는 기타 카르복시베타인 화합물이 포함된다. 특정 구현예에서, 폴리머는 폴리(카르복시베타인 메타크릴레이트)(폴리(CBMA))이다.
[0042] 쯔비터이온성 폴리머는 원자 이동 라디칼 중합(ATRP), 가역적 부가 단편화 사슬 이동(RAFT) 중합 및 자유 라디칼 중합과 같은 임의의 적합한 중합 방법에 의해 제조될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 것을 포함하여 이러한 모노머를 중합하기 위한 임의의 적합한 라디칼 개시제가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질 또는 다른 폴리머 함유 지질을 제조하기 위해, 쯔비터이온성 또는 다른 모노머 또는 그의 전구체가 지질에 부착되고, 모노머는 지질에 부착된 상태에서 중합된다. 대안적으로, 이미 생성된 폴리머는 당업계에 잘 알려진 수단에 의해 지질에 부착될 수 있다.
[0043] 다른 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 폴리머 백본에 양전하를 갖고 펜던트 카르복실산기를 가지며 하기 화학식을 갖는 호모폴리머이다:
식 중 R은 수소 및 치환 또는 비치환 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; L1 및 L2는 독립적으로, 하나 이상의 산소 원자를 임의로 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이며; x는 2 내지 500의 정수이다.
[0044] 또 다른 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 혼합된 전하 코폴리머이고 하기 화학식을 갖는다:
여기서 B1 및 B2는 전술한 바와 같이 X1, X2 및 X3에서 독립적으로 선택되며; R은 수소 및 치환 또는 비치환 알킬로부터 선택되며; E는 치환 또는 비치환 알킬렌, -(CH2)pC(O)O-, 및 -(CH2)pC(O)NR2-로 부터 선택되고, 여기서 p는 0 내지 12의 정수이고; R2는 수소 및 치환 또는 비치환 알킬로부터 선택되며; L은 임의로 하나 이상의 산소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이고; P1은 양전하를 띤 기이고; P2는 카르복실산기와 같은 음하전된 기이며; m은 1 내지 500의 정수이고; n은 1 내지 500의 정수이다. 일부 구현예에서, P1은 방향족 고리 내의 질소 또는 NR5R6이고, 여기서 R5 및 R6은 독립적으로 치환되거나 비치환된 알킬기이다.
[0045] 쯔비터이온성 폴리머의 양전하 단위(P1 함유 단위)는 양하전된 펜던트기를 갖는 모노머로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 폴리머에서 양전하 단위를 유도하는데 사용될 수 있는 대표적인 모노머는 2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, [2-(메타크릴로일옥시)에틸] 트리메틸암모늄 클로라이드, 및 N-아세틸글루코사민을 포함한다.
[0046] 일 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머의 음하전된 단위는 2-카르복시에틸 아크릴레이트(CA)로부터 유도되고, 양하전된 단위는 2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(DM)로부터 유도된다. 또 다른 구현예에서, 음하전된 단위는 2-카르복시에틸 아크릴레이트(CA)로부터 유도되고, 양하전된 단위는 2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트(DE)로부터 유도된다. 또 다른 구현예에서, 음하전된 단위는 2-카르복시에틸 아크릴레이트(CA)로부터 유도되고, 양하전된 단위는 [2-(메타크릴로일옥시)에틸]트리메틸암모늄 클로라이드(TM)로부터 유도된다. 또 다른 구현예에서, 음하전된 단위는 2-카르복시에틸 아크릴레이트(CA)로부터 유도되고, 양하전된 단위는 2-아미노에틸 메타크릴레이트 히드로클로라이드(NH2)로부터 유도된다.
[0047] 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드(폴리알킬렌 글리콜) 세그먼트를 배제하거나, 쯔비터이온성 폴리머는 보다 구체적으로 폴리에틸렌 옥사이드 또는 폴리프로필렌 옥사이드 세그먼트를 배제한다. 일부 구현예에서, 성분 (i) 모두가 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 제외하거나, 성분 (i)가 보다 구체적으로 폴리에틸렌 옥사이드 또는 폴리프로필렌 옥사이드 세그먼트를 제외한다. 일부 구현예에서, 전체로서의 지질 나노입자는 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트 또는 분자를 배제한다.
[0048] 용어 "지질"은 지방산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유기 화합물을 말하며, 물에 불용성이지만 많은 유기 용매에 용해되는 것을 특징으로 한다. 이들은 일반적으로 적어도 세 가지 부류로 나뉜다: (1) 왁스뿐만 아니라 지방과 오일을 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질". 일 구현예에서, 지질은 디아실글리세라이드를 포함한다.
[0049] 일 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 "복합 지질"과 연결된다. 그러한 지질의 일부 예로는 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸-포스포에탄올아민, 16-O-디메틸-포스포에탄올아민, 18-1-트랜스-포스포에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(transDOPE)을 들 수 있다. 또 다른 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 "단순 지질"과 연결된다. 또 다른 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 "유도 지질"과 연결된다. 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머는 그 내용이 본원에 참조로 통합된 WO2011057225A2에 개시된 바와 같은 쯔비터이온성 화합물을 포함한다.
[0050] LNP의 두 번째 구성 요소는 폴리머에 부착되지 않은 전하 및 비전하 지질 중에서 선택되는 적어도 하나의 비-양이온성 지질이다. 본원에서 사용되는 용어 "비-양이온성 지질"은 양전하를 띠지 않고 양전하 상태로 이온화될 수 없는 지질을 의미한다. 그러나, 비-양이온성 지질은 상기 앞서 기술된 임의의 쯔비터이온성 기 및 모이어티와 같은 쯔비터이온(폴리머 내의 양전하 및 음전하)을 함유함으로써 중성으로 하전될 수 있다.
[0051] 일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 쯔비터이온성 모이어티를 함유한다. 쯔비터이온성 모이어티는 전술한 모이어티일 수 있다. 쯔비터이온성 모이어티는 예를 들어 포스포베타인, 포스파티딜콜린, 카르복시베타인, 설포베타인, 트리메틸아민 N-옥사이드, 글루탐산-라이신(EK)-함유 모이어티, 또는 쯔비터이온성 포스파티딜 세린(포스포세린) 모이어티, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 쯔비터이온성 지질은 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린 지질과 같은 인지질이다.
[0052] 다른 구현예에서, 비-양이온성 지질은 쯔비터이온성이 아니라 음하전된 기(예를 들어, 포스포세린)를 함유함으로써 음하전된다. 금속(예를 들어, 알칼리) 또는 암모늄 상대음이온은 음하전된 기와 이온적으로 플럭셔널하게 회합될 수 있다.
[0053] 구현예의 또 다른 세트에서, 비-양이온성 지질은하전된 기를 일체 함유하지 않음으로써 하전되지 않는다. 하전되지 않은 비-양이온성 지질은 예를 들어 포스파티딜글리세롤 지질, 포스파티딜에탄올아민 지질 또는 스핑고지질일 수 있다. 비-양이온성 지질은 일부 구현예에서 지방, 오일 및/또는 왁스와 같은 단순 지질일 수 있다. 비-양이온성 지질은 일부 구현예에서 인지질 또는 당지질과 같은 복합 지질일 수 있다. 비-양이온성 지질은 일부 구현예에서 스테로이드, 인지질, 스핑고지질 및/또는 스테롤과 같은 유도 지질일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 디히드로스핑고미엘린, 세팔린 또는 세레브로시드로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 비-양이온성 지질은 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딘산(PA) 또는 포스파티딜이노시톨(PI) 중 하나 이상으로부터 선택된다. 다른 특정 구현예에서, 비-양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16 -O-모노메틸-포스포 에탄올아민, 16-O-디메틸-포스포에탄올아민, 18-1-트랜스-포스포에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일 포스파티디에탄올아민(SOPE) 및 1,2-디올레오일-sn 글리세로-3-포스포에탄올아민(transDOPE)이다. 비-양이온성 지질은 폴리머에 부착되어 있지 않기 때문에 비-양이온성 지질은 폴리알킬렌 옥사이드(폴리알킬렌 글리콜) 세그먼트를 배제한다.
[0054] 특정 구현예에서, 이온성 모이어티를 함유하는 비-양이온성 지질은 인지질이다. 일 구현예에서, 이온성 모이어티를 함유하는 비-양이온성 지질은 하나 이상의 카르복시베타인 기와 접합된 지질이다. 일 구현예에서, 이온성 모이어티를 함유하는 비-양이온성 지질은 하나 이상의 설포베타인 기와 접합된 지질이다. 일 구현예에서, 이온성 모이어티를 함유하는 비-양이온성 지질은 하나 이상의 트리메틸아민 N-옥사이드 기와 접합된 지질이다.
[0055] LNP의 세 번째 구성 요소는 적어도 하나의 양이온성 또는 이온화가능한 지질이다. 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 양이온성 기를 갖는 폴리머에 부착된 지질을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 폴리머에 부착되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "양이온성 지질"은 (전형적으로, 암모늄 기를 가짐으로써) 양전하를 띤 지질을 의미한다. 양이온성 지질에서 양전하를 띤 기는 양이온성 지질 내에서 음전하와 결합하지 않는다. 따라서, 양이온성 지질은 쯔비터이온성 지질이 아니다. 본원에서 사용되는 용어 "이온화가능한 지질"은 이온화됨으로 해서 폴리머에서 양전하를 발생시킬 수 있는 하나 이상의 기를 함유하는 지질을 의미한다. 이온화가능한 지질은 일반적으로 2차, 3차 또는 4차 아미노기, 또는 특히 알킬화 아민, 또는 보다 특히 모노알킬아민 또는 디알킬아민기를 보유하며, 이들 모두는 양성자화되거나 알킬화되어 알킬화 암모늄 기를 생성할 수 있다. 양이온성 지질은 트리알킬아민기를 함유할 수 있으며, 이는 지질에 결합될 때 반드시 양전하를 띤다. 특정 구현예에서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 디메틸아미노 또는 트리메틸아미노(또는 디메틸암모늄 또는 트리메틸암모늄) 기를 갖는다. 특정 구현예에서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2DMA) 및 [(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일]-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLinMC3DMA)로부터 선택된다.
[0056] 일부 구현예에서, 이온화가능한 지질은 작용기와 함께 2차, 3차 또는 4차 아민 기에 부착된 지질 모이어티를 함유하며, 이는 생리학적 조건 하에서 음전하를 띤다. 이 지질 모이어티는
일 수 있고,
여기서,
R1/R2 = H 또는 알킬기이다. 알킬은 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형, 모두 탄소 및 수소이거나, 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F와 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다.
L은 N과 A 사이의 공유 결합 링커기이다. 링커는 모두 탄소 및 수소이거나 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F와 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다. 구조 L의 비제한적인 예는 -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CHClCH2-, -CH2OCH2-, -CH2SCH2-, -CH2SSCH2-, -CH2COOCH2-이다.
A-(X)n은 특정 pH 하에서 음전하를 띠는 관능기이다. 이의 비제한적인 구조는 다음과 같다:
(v) A(X)n은 카르복실산기(A = -COOH 및 n=0)이거나
(vi) A(X)n은 포스페이트이며, 여기서 A =
또는
이고 n = 1이다. X = H 또는 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형의, 모두 탄소 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F와 같은 헤테로원자를 함유하는 알킬기이거나 또는
(vii) A(X)n은 설폰산기이고, 여기서 A =
이고 n = 0
(viii) A(X)n은 설폰아미드기이며, 여기서 A =
이고 n = 1, X = H 또는 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형, 모두 탄소 및 수소 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F와 같은 헤테로원자를 함유하는 알킬기이다.
이러한 이온화가능한 지질의 예시적인 구조는 다음과 같다.
여기서 n=1 내지 10이다.
[0057] 일부 구현예에서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 폴리알킬렌 옥사이드(폴리알킬렌 글리콜) 세그먼트를 배제하거나, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 보다 구체적으로 폴리에틸렌 옥사이드 또는 폴리프로필렌 옥사이드 세그먼트를 배제한다. 일부 구현예에서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 배제하거나, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 보다 구체적으로 폴리에틸렌 옥사이드 또는 폴리프로필렌 옥사이드 세그먼트를 배제한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 배제한다.
[0058] 일부 구현예에서, LNP는 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함하며, 이는 본원에서 LNP의 선택적 추가 성분인 것으로 간주된다. 특정 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 파이토스테롤, 예를 들어 β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 푸코스테롤 또는 스티그마스타놀이다. 특정 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 디히드로콜레스테롤, ent-콜레스테롤, 에피-콜레스테롤, 데스모스테롤, 콜레스타놀, 콜레스타논, 콜레스테논, 콜레스테릴-2'-히드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-히드록시부틸 에테르, 3β[N-(N'N'-디메틸아미노에틸)카르바모일 콜레스테롤(DC-Chol), 24(S)-히드록시콜레스테롤, 25-히드록시콜레스테롤, 25(R)-27-히드록시콜레스테롤, 22-옥사콜레스테롤, 23-옥사콜레스테롤, 24-옥사콜레스테롤, 시클로아르테놀, 22-케토스테롤, 20-히드록시스테롤, 7-히드록시콜레스테롤, 19-히드록시콜레스테롤, 22-히드록시콜레스테롤, 25-히드록시콜레스테롤, 7-데히드로콜레스테롤, 5α-콜레스-7-텐-3β-올, 3,6,9-트리옥사옥탄-1-올-콜레스테릴-3e-올, 데히드로에르고스테롤, 데히드로에피안드로스테론, 라노스테롤, 디히드로라노스테롤, 라노스테놀, 루미스테롤, 시토칼시페롤, 칼시포트리올, 코프로스타놀, 콜레칼시페롤, 루페올, 에르고칼시페롤, 22-디히드로에고칼시페롤, 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔산, 콜산, 케노데옥시 콜산, 자이모스테롤, 디오스게닌, 푸코스테롤, 페코스테롤 또는 페코스테롤, 또는 그의 염 또는 에스테르, 예를 들어 콜산나트륨이다.
[0059] LPN은 상술한 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 지질 성분 중 하나 이상으로 구성된 자가-조립 쉘에 포함되거나 이에 의해 캡슐화된 치료 물질을 추가로 포함한다. 치료 물질은 살아있는 유기체, 특히 인간 또는 동물 대상과 같은 포유동물에 대한 치료 가치를 갖는 임의의 물질일 수 있다. 치료 물질은 예를 들어 음전하를 띤 핵산 분자일 수 있다. 핵산 분자는 예를 들어 뉴클레오티드, 뉴클레오사이드, 핵염기 또는 핵산(예컨대 DNA 또는 RNA)일 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 물질은 하나 이상의 그러한 핵산 분자를 함유한다. 일부 구현예에서, 치료 물질은 RNA, 또는 더욱 특히 mRNA, 또는 더욱 특히 바이러스 mRNA를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 치료 물질은 코로나바이러스, SARS-COV2(COVID-19) 또는 HIV 바이러스와 같은 바이러스의 스파이크 단백질이다.
[0060] 본 발명의 지질 나노입자 및 조성물은 핵산 분자, 리보핵단백질(RNP) 및 수많은 다른 치료 물질의 전달을 포함하는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 핵산의 예에는 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), miRNA 억제제(antagomirs/antimirs), 메신저-RNA 간섭 상보적 RNA(micRNA), 다가 RNA, 원형 RNA(circRNA), 크리스퍼 RNA(crRNA), 긴 비인코딩 RNA(lncRNA), 플라스미드 DNA, 올리고 DNA 및 상보적 DNA(cDNA)가 포함된다. 특정 구현예에서, 치료 분자는 DNA, RNA, ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA, 및 이들의 하이브리드 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서, 치료 분자는 플라스미드 DNA 또는 선형화된 DNA 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서, 치료 분자는 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 원형 RNA(circRNA) 및/또는 긴 비인코딩 RNA(lncRNA) 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예에서, 치료 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 포함한다. 다른 구현예에서, 치료 분자는 Cas 뉴클레아제 mRNA 및/또는 가이드 RNA 핵산을 포함한다. 가이드 RNA 핵산은 예를 들어 단일 가이드 RNA(sgRNA)일 수 있다. 임의의 전술한 구현예에서, 치료 분자는 SARS-Cov-2에 대한 백신을 포함하며, 특히 여기서 백신은 mRNA 백신이거나 mRNA 백신은 스파이크 단백질 또는 이의 일부에 해당한다.
[0061] 상기 구현예 중 임의의 것에서, 뉴클레오타이드는 보호 도메인 및 기능 도메인을 포함하는 융합 생물학적 모이어티를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 기능적 도메인은 직접적으로 또는 아미노산으로 구성된 링커를 통해 보호 도메인에 융합된다. 추가의 특정 구현예에서, 보호 도메인은 다수의 음전하를 띤 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산 및 이의 유도체); 다수의 양전하를 띤 아미노산(예를 들어, 리신, 히스티딘, 아르기닌 및 이의 유도체); 및 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 다수의 추가 아미노산을 포함하며, 여기서 양전하를 띤 아미노산의 수에 대한 양전하를 띤 아미노산의 수의 비율은 약 1:0.5 내지 약 1:2이다. 일부 구현예에서, 보호 도메인은 다른 아미노산 폴리머(예를 들어, 확장된 재조합 폴리펩타이드(XTEN), 프롤린-알라닌-세린 및 엘라스틴-유사 폴리펩타이드)로부터 선택될 수 있다. 임의의 상기 구현예에서, 보호 도메인은 천연 반감기 연장 도메인(예를 들어, Fc 단편)으로부터 선택될 수 있다.
[0062] LNP는 또한 결합된 기능성을 갖는 지질 성분을 포함할 수 있다. 구현예에서, 임의의 지질 성분, 비제한적인 예로서 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질, 비-양이온성 지질, 양이온성 지질, 및 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤 유도체는 모두상이한 지질 성분의 하나 이상의 기능성을 포함할 수 있다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질은 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질 및 양이온성 또는 이온화가능한 지질의 기능성을 포함한다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질, 비-양이온성 또는 이온화가능 지질, 양이온성 지질, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤 유도체 중 임의의 것은 또한 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질, 비-양이온성 지질, 양이온성 지질, 및 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤 유도체 중 하나 이상의 하나 이상의 기능성을 포함할 수 있다. 구현예에서, 지질 성분은 또 다른 지질 성분의 기능성을 포함할 수 있고, 따라서 그 기능성을 갖는 추가적인 지질 성분에 대한 필요성을 제거한다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질은 비-양이온성 지질의 기능성을 포함할 수 있어, 비-양이온성 지질에 대한 필요성을 제거하거나 감소시킬 수 있다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질은 양이온성 지질의 기능성을 포함할 수 있고, 이로써 양이온성 지질에 대한 필요성을 제거하거나 감소시킬 수 있다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질은 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤 유도체의 기능성을 포함할 수 있어, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤 유도체에 대한 필요성을 제거하거나 감소시킬 수 있다.
[0063] 구현예에서, 임의의 지질 성분 (쯔비터이온성 폴리머 개질 지질, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 콜레스테롤 또는 그 유도체)은 임의의 다른 지질 성분과 화학적으로 결합될 수 있다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질 및 양이온성 지질은 하나의 지질로 화학적으로 결합된다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질 및 비-양이온성 지질은 하나의 지질로 화학적으로 결합된다. 구현예에서, 양이온성 지질 및 비-양이온성 지질은 하나의 지질로 화학적으로 결합된다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질, 양이온성 지질 및 비-양이온성 지질은 하나의 지질로 화학적으로 결합된다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질 및 콜레스테롤 또는 유도체는 하나의 지질로 화학적으로 결합된다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질, 양이온성 지질 및 콜레스테롤 또는 유도체는 하나의 지질로 화학적으로 결합된다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질, 비-양이온성 지질 및 콜레스테롤 또는 유도체는 하나의 지질로 화학적으로 결합된다. 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질, 비-양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 콜레스테롤 또는 유도체는 하나의 지질로 화학적으로 결합된다. 다른 구현예에서, 각각의 지질 성분은 분리되고 구별되며 또 다른 지질 성분과 결합되지 않는다.
[0064] 상기 기재된 지질 나노입자의 임의의 성분은 표적화 리간드(예를 들어, Fab 또는 Fc)를 함유하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 쯔비터이온성 폴리머 함유 지질은 치료제 또는 진단제 또는 이들 모두가 적재된 LNP를 펩타이드 (예를 들어, RGD), 지질(예컨대 포스포세린 함유 지질), 단백질(예컨대 아포지단백 E), 압타머(예컨대 항-VEGF 압타머), 당(예컨대 시알산) 및 항체(예컨대 항-PD1) 또는 항체 단편(예컨대 Fab 또는 Fc)와 같은, 체내의 특수 장기 내의 표적 영역으로 전달하기 위한 표적 리간드를 보유한다.
[0065] 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기 기술된 LNP 조성물 중 임의의 하나 이상을 대상체에게 투여함으로써 대상체에게 치료 물질을 전달하는 방법에 관한 것이다. 대상체는 전형적으로 포유동물, 보다 전형적으로 인간 대상체이지만, 개, 고양이, 소 또는 양과 같은 애완동물 또는 농장 동물과 같은 또 다른 유형의 포유동물일 수도 있다. 일부 구현예에서, 치료 물질을 전달하는 방법은 대상체를 치료하는 방법을 결과시킨다. 치료 방법으로서, 예를 들어, 단백질 대체 요법, 암 면역 요법, 암 백신 요법, 전염병 백신, 유전자 편집, 자가 면역 질환 치료 및/또는 암 진단을 목적으로 LNP 조성물을 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, LNP 조성물은 CRISPR-Cas 유전자 편집을 포함하는 유전자 요법을 위해, 또는 세포외 소포의 시험관내 및 생체내 생성을 위해, 또는 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2)에 대한 백신접종을 위해 투여된다. 보다 특정한 구현예에서, LNP는 예를 들어 비제한적인 예로서 Cas 단백질과 같은 하나 이상의 CRISPR 관련 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산의 전달을 포함하여, 시험관내 및 생체내에서 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복-Cas 엔도뉴클레아제(CRISPR-Cas) 유전자 편집에 사용된다. 일부 구현예에서, LNP는 암을 치료하기 위해 체크포인트 억제제, 예를 들어, 항-프로그램화된 사멸-리간드 1(항-PD-L1) 항체 또는 항-세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(항-CTLA4)와 함께 투여된다.
[0066] 일부 구현예에서, 치료 방법은 대상체의 2차 림프 기관(SLO)로의 치료제의 표적화된 전달을 포함하고, 여기서 대상체는 치료제 및 포스포세린-함유 지질을 포함하는 지질 나노입자를 투여받는다. SLO는 예를 들어 비장 및/또는 림프절일 수 있다. 포스포세린 함유 지질은 예를 들어 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS), 또는 L-α-포스파티딜세린(뇌)와 같은 자연발생적인 PS-지질일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화된 전달은 암 면역요법, 자가면역 질환 면역요법 또는 유전자 편집을 초래한다.
[0067] LNP 조성물은 전형적으로 LNP를 함유하는 약학적 조성물의 형태로 투여된다. 약학적 조성물에서, LNP는 당업계에 잘 알려진 바와 같이 액체, 반고체(예를 들어, 겔 또는 왁스) 또는 고체일 수 있는 제약상 허용되는 담체에 용해되거나 현탁되거나 혼합될 수 있다. "약학적으로 허용되는" 이라는 어구는 본원에서 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 대상체에게 투여하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 대상체에게 생리학적으로 안전하다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 당업계에 공지된 임의의 담체가 투여 방식에 따라 본원에 적합할 수 있다.
[0068] 약학적으로 허용되는 액체 담체의 일부 예는 알코올(예컨대 에탄올), 글리콜(예컨대 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜), 폴리올(예컨대 글리세롤), 오일(예컨대 광유 또는 식물성 오일), 파라핀 및 포유동물에게 도입이 허용되는 비양자성 극성 용매(예컨대 디메닐 설폭사이드 또는 N-메틸-2-피롤리돈)을 포함하며, 이들은 수성 성분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다(예를 들어, 10, 20, 20, 20, 30, 40 또는 50 부피% 이상 또는 이하의 물). 약학적으로 허용되는 겔의 일부 예에는 장쇄 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 코폴리머(예컨대 폴록사머), 셀룰로스 및 알킬 셀룰로스 물질(예컨대 미국 특허 6,432,415에 설명됨) 및 카르보머가 포함된다. 약학적으로 허용되는 왁스는 예를 들어 카르나우바 왁스, 화이트 왁스, 밀납, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세롤 올레이트 및/또는 파라핀일 수 있거나 이를 함유할 수 있다.
[0069] 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 LNP 및 하나 이상의 용매 또는 담체만을 함유한다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 추가 성분을 포함한다. 추가 성분은 예를 들어 pH 완충제, 단당류 또는 다당류(예를 들어, 락토스, 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스 또는 덱스트란), 방부제, 전해질, 계면활성제 또는 항균제일 수 있다. 원하는 경우 감미료, 착향료 또는 착색제가 포함될 수 있다. 다른 적합한 부형제는 표준 약학 문헌, 예를 들어 "Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995에서 찾아볼 수 있다.
[0070] 전형적으로 LNP가 액체 또는 고체의 약학적으로 허용되는 담체와 혼합되거나 현탁되는 약학적 조성물의 형태인 LNP 조성물은 임의의 적합한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. LNP는 정맥내, 경구, 근육내, 피내, 피하, 비강내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, LNP는 대상체에게 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, LNP는 대상체의 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, LNP는 대상체로부터 세포를 제거하고, 제거된 세포에 지질 나노입자를 투여한 다음, 제거된 세포를 대상체에게 재도입함으로써 전달된다. 일부 구현예에서, LNP는 생체내로 직접 주사되고 생체내에서 숙주 세포로 전달된다. 다른 구현예에서, LNP는 생체외에서 숙주 세포로 형질감염되고 결과적인 세포는 이어서 생체내에서 주입된다.
[0071] 예시를 목적으로 그리고 현시점에서 본 발명의 최선의 모드를 설명하기 위해 실시예가 아래에 제시되었다. 그러나, 본 발명의 범위는 본 명세서에 제시된 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되지 않는다.
실시예
[0072] 실시예 1. 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질(DMG-PCB 또는 PCB 지질)의 제조 및 특성화
[0073] 이 실시예에서, 본 발명의 대표적인 쯔비터이온성 폴리머 개질 지질인 DMG-PCB의 제조 및 특성화가 기술된다. DMG-PCB의 구조 및 1H NMR 스펙트럼은 도 1에 도시되어 있다.
[0074] DMG-N-BOC. 질소분위기 하에서, 트리에탄올아민(1.6 mL, 9.36 mmol, 1.2 당량)을 건조 DCM(10 mL) 중 tert-부틸 N-(2,3-디히드록시프로필)카바메이트(1.5g, 7.8 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 아이스배쓰에서 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 스테아로일 클로라이드(2.83 g, 9.36 mmol, 1.2 당량)를 20 mL DCM에 용해시키고 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3(수성[aq])로 추출하였다. 유기층을 분리하고 염수로 세척한 다음 MgSO4로 건조하고 여과하고 진공 하에서 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 추가 정제하여 DMG-N-BOC(1.42g, 40%)를 얻었다.
[0075] DMG-N. DMG-N-BOC(100 mg)를 5 mL의 DCM 및 5 mL의 TFA에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 그런 다음 용매를 진공에서 제거하여 DMG-N을 백색 분말로 얻었다.
[0076] CTA-DMG 지질. DCM(5 mL) 중 DMG-N(100 mg, 0.16 mmol), 2-(도데실티오카르보노티오일티오)-2-메틸프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(92.34 mg, 0.2 mmol) 및 TEA(22.3μL, 0.16 mmol)의 용액울 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에서 농축하고 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 CTA-DMG 지질을 얻었다.
[0077] DMG-PCB. 10 kDa 폴리머를 산출하기 위한 전형적인 가역적 부가-단편화 사슬-이동(RAFT) 중합 반응에서, CTA-DMG 지질(100 mg, 0.142 mmol) 및 CBAAM-1-tBu(1036.32 mg, 2.84 mmol) 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(AIBN, 4.66 mg, 0.028 mmol)를 교반 막대가 장착된 25 mL 둥근 바닥 플라스크에서 무수 디메틸포름아미드(DMF, 5 mL)에 용해시켰다. 플라스크를 고무 격막으로 밀봉하고 30분 동안 질소로 퍼징하였다. 반응물을 65℃ 오일조에서 밤새 교반하였다. 얻어진 폴리머를 에틸 에스테르에 3회 침전시키고, 원심분리하여 펠릿을 수집하고, 밤새 진공 건조하여 담황색 분말을 얻었다. 트리티오카보네이트기 폴리머(258.6 mg)를 제거하기 위해, 결과적인 폴리머(258.6 mg, 0.05 mmol), EPHP(89.2 mg, 0.5 mmol) 및 AIBN(3.3 mg, 0.02 mmol)을 3 mL의 DMF에 용해시켰다. 용액을 질소에서 30분 동안 퍼징하고 100℃에서 2시간 동안 교반하였다. 생성물을 디에틸 에테르에 침전시키고 원심분리하고 진공 건조하여 백색 고체 분말을 얻었다. 최종 생성물인 DMG-PCB는 실온에서 4시간 동안 트리플루오로아세트산(TFA, 폴리머 100 mg당 5 mL)으로 tert-부틸기를 탈보호한 다음, 에틸 에테르에 침전시키고 3회 원심분리하여 얻었다. 펠릿을 진공 하에서 밤새 건조시키고, RNase가 없는 물에 용해시키고, 2일 동안 투석하였다. 분자량(약 12kDa)은 1H NMR(D2O)로부터 구하였다.
[0078] 실시예 2. 쯔비터이온성 폴리머 개질된 지질(DMG-PCB 또는 PCB 지질)을 함유하는 LNP의 제조 및 시험관내 특성화.
[0079] 이 실시예에서는, 시판되는 2종의 LNP 제제의 DMG-PEG를 실시예 1의 DMG-PCB로 대체하여 PCB 지질을 함유하는 LNP(또는 PCB-LNP)를 형성한다. PCB-LNP의 시험관내 형질감염 효율은 도 2b에 열거되어 있다. PCB-LNP의 형태는 도 2a에 도시된 바와 같이 투과 전자 현미경(TEM) 하에서 관찰되었다. mRNA 치료제를 포함하는 PCB-LNP의 제조는 하기에 기술된다.
[0080] DLin-MC3-DMA(MC3)는 Organixinc lnc에서 구입하였다. 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스 (도데칸-2-ol)(C12-200)은 Cordenpharma Inc.에서 구입하였다. 기타 성분에는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC, Avanti Polar Lipids, USA), 콜레스테롤(Sigma, USA), 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2K, Avanti Polar Lipids, USA)이 포함된다. 상이한 폴리머 분자량(4kDa 또는 7kDa)을 포함하는 DMG-PCB는 실시예 1로부터 합성되었다.
[0081] mRNA의 PCB-LNP로의 캡슐화는 미세유체 혼합 장치인 NanoAssemblr Ignite(Precision NanoSystems Inc.)에서 지질 성분과 mRNA를 혼합하여 준비하였다. 두 가지 다른 이온화 지질을 기반으로 하는 LNP 제제를 각각 조사하였다. MC3 기반 LNP의 경우, 지질 혼합물의 몰비는 MC3:DSPC:콜레스테롤:X = 50:40:38.5:1.5이며, 여기서 X는 MC3-PEG의 경우 DMG-PEG2K, MC3-PCB4의 경우 DMG-PCB4K, 그리고 MC3-PCB7의 경우 DMG-PCB7K이다. C12-200 기반 LNP의 경우, 지질 혼합물의 몰비는 C12-200:DOPE:콜레스테롤:Y = 35:16:46.5:2.5이며, 여기서 Y는 C12-PEG의 경우 DMG-PEG2K, C12-PCB의 경우 DMG-PCB4K이다. 간략하게, 4종의 지질 성분을 에탄올에 용해시키고 별도로 반딧불이 루시퍼라제(Fluc)를 인코딩하는 mRNA를 50 mM 시트레이트 완충액(pH=3)에 용해시켰다. 그런 다음 수성상과 에탄올상을 미세유동장치에서 3:1의 유속비로 혼합하였다. 잔류 유기용매를 제거하기 위해, 결과적인 LNP를 100-kDa 원심분리 필터(MilliporeSigma, USA)에서 PBS로 세척하였다.
[0082] LNP를 HepG2(ATCC No. HB-8065)에 형질감염시키고 형질감염 6시간 후에 루시퍼라제 발현을 분석하였다. 간략하게, 세포를 60-70% 컨플루언시로 플레이팅하고 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1x 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)이 보충된 Eagle's 최소필수배지(EMEM)에서, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 형질감염 동안, 도 2b에 나타낸 용량으로 웰당 RNA를 첨가하였다. 형질감염 6시간 후, LNP를 함유하는 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 세포를 PBS로 부드럽게 1회 헹구었다. 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 어세이(Promega Cat#: E1501)를 사용하여 루시퍼라제 발현을 측정하였다. 모든 PCB-LNP는 상응하는 PEG-LNP와 유사한 시험관내 형질감염 효율을 나타냈으며, 이는 DMG-PCB가 LNP에서 mRNA를 세포로 전달하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
[0083] 실시예 3. 쯔비터이온성 폴리머 개질된 지질(DMG-PCB 또는 PCB 지질)을 함유하는 LNP의 생체내 전달
[0084] 전신 전달 후 단백질 발현의 생체분포를 연구하기 위해, 실시예 2로부터의 PCB-LNP 제제를 마우스에 전달하였다.
[0085] 간략하게, 6-8주령의 C57BL/6 마우스에 0.4 mg/kg의 투여량으로 후안와 주사를 통해 Fluc-mRNA를 운반하는 LNP를 투여하였다. 생체발광 이미징은 형질감염 6 시간 후에 수행되었다. PBS에 희석된 150 mg/kg의 D-루시페린을 마우스에 주사하였다. 모든 이미지는 Aura Image Software를 사용하여 분석되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 모든 PCB-LNP는 간에서 높은 mRNA 발현을 촉진하였다. 효율적인 생체내 mRNA의 발현은 2개의 상이한 LNP 시스템에서 확증되었다: 하나는 이온화가능한 지질로서 MC3를 사용하고; 다른 하나는 이온화가능한 지질로서 C12-200을 사용한다. 따라서, 이 초친수성 폴리머 접합 지질을 LNP에 통합하면 효율적인 생체내 형질감염이 수행되므로, DMG-PCB가 DMG-PEG에 대한 실행 가능한 대안임을 나타낸다.
[0086] 실시예 4. ZW-A-CBn(n=1,2,3)의 합성 및 특성화.
[0087] 이 구현예에서, ZW-A-CBn(n=1,2,3)이 합성되었고 1H-NMR에 의해 특성화되었다. ZW-A-CBn의 합성 방법은 도 4에 도시되어 있고, 이하에 후술된다.
[0088] 화합물 S1은 Jayaraman과 Hope의 조건에 따라 합성되었다(Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529 -8533). Mg 터닝을 0.1M HCl로 새롭게 활성화하고, 물과 아세톤으로 세척하고, 고진공 하에서 건조시켰다. 자석 교반기, 첨가 깔때기 및 환류 응축기가 장착된 3목 둥근 바닥 플라스크에 Mg(680 mg)를 첨가하였다. 플라스크를 탈기시키고 무수 에테르 2.3 mL로 채웠다. 리놀레일 브로마이드(7.50g)를 에테르 14 mL에 용해한 다음 실온에서 플라스크에 에테르 용액 2 mL를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2분 동안 교반한 다음 작은 요오드 결정을 첨가하였다. 요오드의 짙은 갈색이 빠르게 사라지고 반응 혼합물이 환류하기 시작하였다. 에테르 중 나머지 리놀레일 용액을 5 내지 10분에 걸쳐 적가하면서 반응을 온화한 환류 하에 유지하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 35℃ 수조에서 3시간 동안 유지한 다음 아이스배쓰에서 냉각시켰다. 에틸 포르메이트(0.8 mL, 0.734g)를 0℃에서 적가하고 반응물을 실온으로 데웠다. 6시간 후, NH4Cl 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 용액을 에테르(x3)로 추출하고, Na2SO4를 사용하여 건조하고 농축하여 미정제 혼합물을 황색 오일로 얻었다. 주요 부산물은 S1의 포름산 에스테르인 것으로 확인되었으므로 조 혼합물을 에탄올 중 KOH 포화 용액 10 mL에 용해하고 밤새 교반하여 부산물을 가수분해하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, NH4Cl로 세척하고, 농축하고, Na2SO4를 사용하여 건조시킨 다음, 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피(헥산 중 1% 내지 15% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 원하는 생성물을 밝은 황색 오일로서 수득하였다. 수율: 3.56g.
[0089] 화합물 S2: 질소 하에 2구 둥근 바닥 플라스크에 S1(2.00g), 4-[(tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노]부탄산(0.87g), DMAP(0.045g) 및 25 mL DCM을 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각시킨 다음, DCM 중 DCC의 5 mL 용액을 적가하였다. 반응물을 실온으로 데우고 10시간 동안 교반하였다. 용액을 여과, 농축하고, 헥산 중 0-10% 에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 생성물로서 2.658g의 무색 오일이 생성되었다.
[0090] 화합물 S3: 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 S2(1.758g) 및 DCM 중 TFA의 5 mL 50v/v% 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 다음 농축하였다. 미정제물을 DCM에 용해시키고, Na2CO3 용액으로 세척하고, Na2SO4로 건조 및 농축시켰다. 황색 오일을 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(DCM 중 2-15% MeOH)를 통해 정제하여 1.02g의 희미한 황색 오일을 수득하였다.
[0091] 화합물 ZW-A-CB1: 2 mL 오토샘플러 바이알에 화합물 S3(114 mg), tert-부틸 브로모아세테이트(35.4 mg), K2CO3(80 mg), KI(4.3 mg), 및 무수 아세토니트릴(0.3 mL)과 THF(0.1 mL)의 혼합물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반한 다음, DCM으로 희석하고 여과하였다. 여액을 농축하고 실리카 겔 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(DCM 중 5%-15% MeCN)를 통해 정제하여 무색 오일로서 화합물 1'을 얻었다. 수율: 61 mg. 화합물 1'(61 mg)을 DCM 중 TFA의 50 v/v % 용액에 용해시키고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축한 다음, DCM 중 5-20% MeOH를 사용하여 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피를 통해 정제하여 담황색 오일로서 화합물 ZW-A-CB1을 얻었다. 수율: 53 mg. 화합물 ZW-A-CB1의 1H NMR(CDCl3)은 도 5에 도시되어 있다.
[0092] 화합물 ZW-A-CB2: 2 mL 오토샘플러 바이알에 화합물 S3(102 mg), 아크릴산(38.4 mg), N,N-디이소프로필에틸아민(2.4 mg) 및 0.3 mL의 에탄올을 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 30시간 동안 교반한 다음 DCM으로 희석하고 물 및 염수로 세척하였다. 추출물을 Na2SO4 로 건조, 농축하고, 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(DCM/에틸 아세테이트 1:1 중 1%-20% MeOH)를 통해 정제하여 밝은 황색 오일로서 화합물 ZW-A-CB2를 얻었다. 수율: 86 mg. 화합물 ZW-A-CB2의 1H NMR(CDCl3)은 도 6에 도시되어 있다.
[0093] 화합물 ZW-A-CB3: 2 mL 오토샘플러 바이알에 화합물 S3(99.4 mg), t-부틸 4-브로모부티레이트(46.8 mg), K2CO3(89.6 mg), KI(8 mg) 및 무수 아세토니트릴(0.3 mL)과 THF(0.1 mL)의 혼합물을 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 18시간 동안 교반한 다음, DCM으로 희석하고 여과하였다. 여액을 농축하고 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 1%-15% MeCN)를 통해 정제하여 무색 오일로서 화합물 3'을 산출하였다. 수율: 95 mg. 화합물 3'(90 mg)을 DCM 중 TFA의 50 v/v % 용액에 용해시키고 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축한 다음, DCM 중 1-15% MeOH를 사용하여 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피를 통해 정제하여 화합물 ZW-A-CB3을 점성 액체로 산출하였다. 수율: 54 mg. 화합물 ZW-A-CB3의 1H NMR(CDCl3)은 도 7에 도시되어 있다.
[0094] 별도의 언급이 없는 한 상업적 공급원의 시약을 추가 정제 없이 사용하였다. 달리 명시되지 않는 한 모든 반응은 N2 또는 아르곤 분위기 하에서 수행되었다. SiliCycle SiliaSep HP 플래시 카트리지를 사용하여 Biotage Isolera 시스템에서 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. NMR 스펙트럼은 Bruker 또는 Varian 400 또는 500MHz 분광계를 사용하여 기록되었다. 모든 1H NMR 실험은 δ 단위, ppm(parts per million)으로 보고되고, 중수소화된 용매에서 잔류 클로로포름(7.26ppm)에 대한 신호와 관련하여 측정되었다.
[0095] 실시예 5 ZW-B-CBn(n=1-3)의 합성 및 특성화
[0096] 이 실시예에서, ZW-B-CBn(n=1,2,3)을 합성하고 1H-NMR로 특성화하였다. ZW-B-CBn의 합성 방법은 도 8에 도시되어 있으며 후술하는 바와 같다.
[0097] 노난-2-일 8-브로모옥타노에이트 (1). 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 8-브로모아세트산(2.00g), 노난-1-올(2.59g) 및 20 mL의 디클로로메탄을 채웠다. 플라스크를 N2 로 퍼징하고, 디클로로메탄 20 mL 중 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(2.25g) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.22g)을 적가하였다. 혼합물을 N2하에서 18시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고 조 생성물을 디클로로메탄으로 추출하고 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 생성물을 용리액으로서 디클로로메탄/헥산을 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 수율은 2.36g(75%)이었다.
[0098] 헵타데칸-9-일 8-((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥타노에이트 (2). 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 8-((tert-부톡시카보닐)아미노)옥탄산(1.04g) 및 헵타데칸-9-올(1.13g)과 20 mL의 디클로로메탄을 채웠다. 플라스크를 N2로 퍼징하고, 디클로로메탄 20 mL 중 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(1.01g) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.05g)을 적가하였다. 혼합물을 N2하에서 20시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고 조 생성물을 디클로로메탄으로 추출하고 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 용리액으로 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 생성물을 정제하였다. 수율은 1.42g(72%)이었다.
[0099] 헵타데칸-9-일 8-아미노옥타노에이트(3). 20 mL 바이알에 헵타데칸-9-일 8-((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥타노에이트(0.13g), 디클로로메탄 2 mL 및 트리플루오로아세트산 2 mL를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 진공에서 휘발성 물질을 제거한 후 조 생성물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 1N NaOH 및 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 수율은 93.2 mg(93%)이었다.
[00100] 노닐 8-((8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트 (4). 화염 건조된 50 mL Schlenk 반응물에 활성화된 4Å 분자체(500 mg), 수산화세슘 일수화물(188 mg) 및 6 mL의 무수 디메틸포름아미드를 충전하였다. 반응물을 N2 하에 10분 동안 교반하였다. 헵타데칸-9-일 8-아미노옥타노에이트(500 mg)를 첨가하고, 혼합물을 N2 하에 추가로 30분 동안 교반하였다. 이어서 노난-2-일 8-브로모옥타노에이트(483 mg)를 현탁액에 적가하고 반응물을 N2 하에서 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 1N NaOH에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용리액으로서 메탄올/클로로포름을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 생성물을 정제하였다. 수율은 705 mg(84%)이었다.
[00101] 헵타데칸-9-일 8-((3-(tert-부톡시)-3-옥소프로필)(8-(노난-2-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트 (5). 1.5 mL 바이알에 0.5 mL 메탄올 중 노닐 8-((8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트(50 mg) 및 t-부틸 아크릴레이트(10.6 mg)를 첨가하였다. 반응물을 N2 하에서 20시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공에서 제거하였다. 수율은 58 mg(98%)이었다.
[00102] 3-((8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)프로판산 (6). 1.5 mL 바이알에 헵타데칸-9-일 8-((3-(tert-부톡시)-3-옥소프로필)(8-(노난-2-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트(50 mg), 0.5 mL 디클로로메탄 및 0.5 mL 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공에서 제거하고 생성물을 용리액으로 메탄올/디클로로메탄을 사용하여 실리카겔에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 수율은 45 mg(94%)이었다. 3-((8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)프로판산(6)의 1H NMR 스펙트럼을 도 9에 나타내었다. 9. 이 화합물을 ZW-B-CB2라 명명한다.
[00103] 헵타데칸-9-일 8-((2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸)(8-(노난-2-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트 (7). 화염 건조된 1.5 mL 바이알에 노닐 8-((8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트(100 mg), t-부틸 브로모아세테이트(117 mg), N,N-디이소프로필에틸아민(97 mg) 및 1 mL 무수 디메틸포름아미드를 첨가하였다. 반응물을 N2 하에서 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 1N NaOH에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용리액으로 메탄올/디클로로메탄/암모니아를 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 생성물을 정제하였다. 수율은 92 mg(79%)이었다.
[00104] N-(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)-N-(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)글리신 (8). 1.5 mL 바이알에 헵타데칸-9-일 8-((2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸)(8-(노난-2-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트(50 mg), 0.5 mL 디클로로메탄 및 0.5 mL 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공에서 제거하고 생성물을 용리액으로서 메탄올/디클로로메탄을 사용하여 실리카겔에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 수율은 42 mg(88%)이었다. N-(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)-N-(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)글리신(8)의 1H NMR 스펙트럼을 도 10에 나타내었다. 이 화합물의 이름은 ZW-B-CB1이다.
[00105] 헵타데칸-9-일 8-((4-(tert-부톡시)-4-옥소부틸)(8-(노난-2-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트 (9). 화염 건조된 1.5 mL 바이알에 노닐 8-((8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트(100 mg), t-부틸 4-브로모부티레이트(134 mg), N,N-디이소프로필에틸아민(97 mg) 및 무수 디메틸포름아미드 1 mL를 첨가하였다. 반응물을 N2 하에서 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 1N NaOH에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용리액으로 메탄올/디클로로메탄/암모니아를 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 생성물을 정제하였다. 수율은 98 mg(81%)이었다.
[00106] 4-((8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)부탄산 (10). 1.5 mL 바이알에 헵타데칸-9-일 8-((4-(tert-부톡시)-4-옥소부틸)(8-(노난-2-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트(50 mg), 0.5 mL 디클로로메탄 및 0.5 mL 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공에서 제거하고 생성물을 용리액으로 메탄올/디클로로메탄을 사용하여 실리카겔에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 수율은 44 mg(93%)이었다. 4-((8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)(8-(옥타데칸-9-일옥시)-8-옥소옥틸)아미노)부탄산(10)의 1H NMR 스펙트럼을 도 11에 나타내었다. 이 화합물의 이름은 ZW-B-CB3이다.
[00107] 실시예 6. ZW-A-SulfoAmid-3의 합성 및 특성화
[00108] 이 실시예에서는 ZW-A-SulfAmid-3을 합성하고 1H-NMR로 특성화하였다. ZW-A-SulfAmid-3의 합성 방법은 도 12 도시되어 있으며 후술하는 바와 같다.
[00109] S4 : 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 화합물 S1(600 mg), 브로모 아세트산(178 mg), DMAP(6 mg) 및 5 mL DCM을 첨가하였다. 혼합물을 아이스배쓰에서 냉각시키고, DCC(178 mg)의 5 mL 용액을 적가하였다. 반응물을 실온으로 데우고 12시간 동안 교반한 다음, 여과하고, 농축하고, 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(헥산 중 5%-30% DCM)를 통해 정제하였다. 무색 오일로서 화합물 S4를 얻었다. 수율: 0.59g.
[00110] S5: 25 mL 둥근 바닥 플라스크에 4-히드록시벤젠설폰아미드(60.8 mg), K2CO3 (43.4mg) 및 0.5 mL의 DMF를 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, DMF 중 S4(121 mg)의 1 mL 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 35℃에서 20시간 이상 교반한 다음 5 mL DCM으로 희석하고 여과하였다. 여액을 농축하고 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피(헥센 중 10%-40% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 무색 오일로서 S5를 수득하였다. 수율: 102 mg.
[00111] ZW-A-SulfAmid-3: 20 mL 바이알에 S5(100 mg), 3-카르복시-N,N,N-트리메틸프로판-1-아미늄 클로라이드(48 mg), N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(75 mg), DMAP(32 mg), 트리에틸 아민(55 μL) 및 2 mL의 DMF를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(DCM 중 5%-50% MeOH)를 통해 정제하여 밝은 황색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다. 수율: 55 mg. 화합물 ZW-A-SulfAmid-3의 1H NMR(CDCl3)이 도 13에 도시되어 있다.
[00112] 실시예 7. ZW-B-CB2를 함유하는 PCB-LNP(비-PEG 제제)의 제조 및 시험관내 특성화
[00113] 이 실시예에서는, 실시예 5에서 합성된 ZW-B-CB2를 실시예 2에 설명된 PCB-LNP에 통합하여 MC3를 상이한 여러 비율로 대체한다. 다른 구성 요소에는 DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PCB4K가 포함된다. 각 성분의 몰비는 도 14에 기재하였다.
[00114] 지질을 에탄올에 용해시키고 mRNA를 50 mM 구연산 완충액(pH3)에 용해시켰다. 격렬하게 교반하면서 1:3(에탄올:수성, v/v%)의 비율로 2개의 상을 혼합하여 LNP에서 mRNA의 캡슐화를 준비하였다. 제제는 적어도 10시간 동안 투석 카세트에서 PBS(pH 7.4)에 대해 투석하고, 0.22-μm 필터를 통과시켜 농축하고, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
[00115] Fluc를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP의 시험관내 형질감염을 수행하여 제제의 형질감염 효율을 평가하였다. 간략히 LNP를 HepG2(ATCC No. HB-8065)에 형질감염시키고 형질감염 6시간 후에 루시퍼라제 발현을 분석하였다. 세포 배양 조건은 실시예 2에 기재되어 있다. 형질감염 동안, RNA를 웰당 100ng씩 3회 첨가하였다. 형질감염 6시간 후, LNP를 함유하는 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 세포를 PBS로 부드럽게 1회 헹구었다. 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 분석(Promega Cat#: E1501)을 사용하여 루시퍼라제 발현을 측정하였다.
[00116] 실시예 8. ZW-B-CBn(n=1-3)을 함유하는 PCB-LNP의 생체내 다중 전신 전달(비-PEG 제제)
[00117] LNP를 여러 번 주사한 경우, 후속 주사에서 LNP의 빠른 제거 관찰과 함께 가속 혈액 제거(ABC) 효과가 보고되었다. ABC 효과는 주로 면역원성인 것으로 보고된 LNP의 지질 성분에 대해 생성된 항체에 의해 유발된다. 이 실시예에서는 실시예 7의 ZW-B-CBn을 포함하는 PCB-LNP를 사용하여 LNP의 ABC 효과를 연구하였다. 실시예 2의 MC3-기반 PEG-LNP를 대조군으로 사용하였다. 각 제제의 조성은 도 15b에 나열되어 있다.
[00118] 생체내 약동학(PK) 연구를 위해 3마리씩 그룹으로 나뉜 3~4주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에개 mRNA-LNP를 mRNA 5 μg의 용량으로 정맥 투여하였다. 2개의 상이한 주사 코호트를 수행하였다. (도 15a) 코호트 1에서, hEPO-mRNA(인간 에리트로포이에틴 mRNA)의 단 1회 용량이 주어졌다. 코호트 2에서, Fluc-mRNA(플라이 루시퍼라제 mRNA)는 처음 2회 주입에 대해 투여되었고 hEPO-mRNA는 마지막 주입에 대해 투여되었다. (도 15a) 코호트 2는 처음 2회 주사로부터 유도된 항-hEPO 면역 반응을 제거하는 방식으로 설계되었고, 따라서 세 번째 주사에서 hEPO의 PK 프로필은 주로 LNP 성분으로 인한 ABC 효과를 나타낸다. hEPO의 PK 프로필을 결정하기 위해 마우스 혈청을 주사 후 6시간, 24시간에 수집하고 ELISA(DuoSet, hEPO ELISA 키트, R&D)를 사용하여 분석하였다.
[00119] 도 15c에 나타낸 바와 같이, PCB 및 ZW-B-CB1/ZW-B-CB2를 함유하는 LNP는 MC3 제제와 비교하여 주사 코호트 2에서 ABC 효과가 덜한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 ZW-B-CBn이 있는 PCB-LNP가 감소된 ABC 효과를 유도하여 면역원성이 적다는 것을 나타낸다.
[00120] 실시예 9. ZW-B-CB2를 함유하고 포스포세린(PS) 지질을 표적화하는 PCB-LNP의 생체내 전신 전달(비-PEG 제제)
[00121] 이 실시예에서 음전하 인지질, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS)을 실시예 7에 기술된 PCB-LNP 제제에 혼입시켰다. 간략히, MC3:ZW-B-CB2:DSPC:콜레스테롤:DMG-PCB4k:DOPS의 몰비는 20:30:10:38.5:1.5:5와 같다. DOPS가 있는 제제는 PS-PCB-mLNP(즉, ZW-B-CB2 및 PS 지질을 함유하는 PCB-LNP)로 명명되는 반면, DOPS가 없는 제제는 PCB-mLNP(즉, ZW-B-CB2 지질을 함유하는 PCB-LNP)로 명명하여 대조군으로 사용한다. 실시예 2에 설명된 바와 같이, 지질 혼합물과 mRNA 수용액을 미세유체 채널에서 빠르게 혼합한 후 PBS로 세척하여 최종 생성물을 생성하였다. DOPS는 2차 림프 기관(SLO)을 표적으로 하는 비-양이온성 지질로 사용되었다.
[00122] 생체내 단백질 발현을 연구하기 위해 Fluc 인코딩 mRNA를 운반하는 PS-PCB- mLNP를 정맥 주사를 통해 마우스에 전달하였다. 생체발광 이미지는 상기 기재된 바와 같이 IVIS를 사용하여 투여 6시간 후 촬영하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, IVIS 이미지는 mRNA 발현이 간에서 비장 및 표면 림프절로 이동되었음을 보여준다. 대조군에서, Fluc 발현은 표적 지질 DOPS가 없는 PCB-mLNP에 대해 간에서 주로 발생하였다. 따라서 DOPS의 혼입은 비장과 림프절에서 더 많은 단백질 발현을 허용했으며, 이는 이러한 SLO에 대한 표적 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 PS-PCB-mLNP가 면역 요법 및 백신을 포함한 적용에 있어 SLO에 대한 생체내 mRNA 전달을 위한 유망한 플랫폼임을 입증한다.
[00123] 실시예 10. ZW-B-CBn(n=1-3)을 함유하는 PEG LNP의 제조 및 시험관내 특성화(PEG 제제)
[00124] LNP(또는 PEG 지질이 PCB 지질로 대체된 PCB LNP와 구별하기 위해 PEG LNP로 표시됨)의 주성분인 이온화 지질은 면역원성인 것으로 보고되었다. 면역원성을 감소시키기 위해 이온화가능한 지질을 실시예 6에서 얻은 ZW-B-CBn으로 부분적으로 대체하여 제제를 생성하였다. 간략하게, 상이한 헬퍼 지질을 변화시키는 3가지 조건을 테스트하였다: 1) DSPC, 2) DOPE 및 3) 헬퍼 지질 없음. 조건 1 및 2의 경우, LNP를 다음 지질들로 구성시켰다: MC3+ZW-B-CBn, DSPC 또는 DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2k(몰비 50:10:38.5:1.5). 조건 3의 경우, LNP를 다음 지질들로 구성시켰다: MC3+ZW-B-CBn, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2k(몰비 50:38.5:1.5). 시험관내 형질감염 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다. LNP의 준비 및 시험관내 형질감염은 후술하는 바와 같다.
[00125] 지질을 지시된 몰비로 에탄올에 용해시키고 mRNA를 20 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5) 또는 20 mM 시트르산 완충액(pH 3)에 용해시켰다. LNP를 생성하기 위해 에탄올과 수용액을 격렬하게 교반하면서 1:3(에탄올:수성)의 비율로 빠르게 혼합하였다. 제제를 적어도 10시간 동안 투석 카세트에서 PBS(pH 7.4)에 대해 투석하고, 0.22-μm 필터를 통과시켜 농축하고, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 모든 제제를 입자 크기 및 RNA 캡슐화에 대해 테스트하였다.
[00126] Fluc를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP의 시험관내 형질감염을 수행하여 제제의 형질감염 효율을 평가하였다. 간략하게, LNP를 HepG2(ATCC No. HB-8065)에 형질감염시키고 형질감염 6시간 후에 루시퍼라제 발현을 분석하였다. 세포 배양 조건은 실시예 2에 기재되어 있다. 형질감염 동안, RNA를 웰당 100ng씩 3회 첨가하였다. 형질감염 6시간 후, LNP를 함유하는 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 세포를 PBS로 부드럽게 1회 헹구었다. 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 분석(Promega Cat#: E1501)을 사용하여 루시퍼라제 발현을 측정하였다.
[00127] 실시예 11. 표적화 지질로서 PS 지질을 함유하는 PEG LNP의 제조 및 시험관내 특성화(PEG 제제)
[00128] 이 실시예에서는 음전하 인지질인 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS)을 MC3 기반 제제에 혼입하여 PS5-LNP를 생성하였다. 간략하게, MC3, DSPC, 콜레스테롤, DMG-PEG2k 및 DOPS를 50:10:38.5:1.5:5의 몰비로 함유하는 실시예 2에 기술된 미세유체 채널을 사용하여 PS5-LNP를 생성하였다. DOPS가 없는 LNP는 대조군(PS0-LNP)으로 사용되었다.
[00129] PS5-LNP 및 PS0-LNP 모두 반딧불이 루시퍼라제(Fluc)를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하고 HepG2(ATCC No. HB-8065) 및 Raw264.7(ATCC No. TIB-71)에 형질감염시켜 시험관내에서 형질감염 효율을 평가하였다. 세포 배양 조건을 위해, HepG2를, 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1x 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)이 보충된 Eagle's 최소필수배지(EMEM)에서 37℃, 5% CO2 하에 유지시켰다. 마찬가지로, Raw264.7를, 10% FBS 및 1x Pen-Strep이 보충된 Dulbecco's 변형 Eagle's 배지(DMEM)에서 동일한 배양 조건에서 유지시켰다. LNP를 세포에 형질감염시키기 위해, 상이한 양의 RNA(플롯에 표시된 바와 같음)를 60-70% 컨플루언시로 접종된 96-웰 플레이트에 플레이팅된 세포에 첨가하였다. 형질감염 6시간 후, PS-LNP를 포함하는 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 세포를 PBS로 부드럽게 1회 헹구었다. 수동 용해 완충액(Promega Cat#: E1941) 30μL를 첨가하여 세포를 용해하고 D-루시페린 기질(Promega Cat#: E1501) 100μL를 각 웰에 첨가하였다. 기질을 첨가한 직후 Cytation 5 마이크로플레이트 리더(Biotek, USA)를 사용하여 흰색 불투명 플레이트에서 발광 강도를 측정하였다. 도 19 도시된 바와 같이, PS5-LNP는 간세포 세포주인 HepG2(도 19a) 및 단핵구/대식세포주인 RAW264.7(도 19b) 모두에서 형질감염 효율을 갖는다. 또한, PS0-LNP와 비교하여 PS5-LNP는 단핵구/대식세포에서 더 높은 mRNA 발현 수준을 나타내지만 간세포에서는 훨씬 더 낮다. 또한, PS5-LNP는 일차 마우스 비장 세포에서 더 높은 형질감염 효율을 나타내었다(도 19c). 이들 세포에서 단백질 발현의 차이는 PS5-LNP가 간 세포가 아닌 면역 세포에 mRNA를 선택적으로 전달할 가능성이 있음을 나타낸다.
[00130] 시험관내 연구의 발견은 생체내에서 확증되었다. PS5-LNP 및 PS0-LNP 양자 모두 반딧불이 루시퍼라제(Fluc)를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하고 후안와 주사를 통해 C57BL/6 마우스(0.2 mg/kg)로 전달하였다. 투여 6시간 후, 마우스를 안락사시키고 상이한 장기들을 단리하여 mRNA 발현 수준을 분석하였다. PS5-LNP의 경우, 총 생체발광 신호의 40%가 경부 림프절과 비장에서 발견되었다. 반대로, 대조군 PS0-LNP의 경우 생체발광 신호의 90% 이상이 간에서 발견되었지만 림프절과 비장에서는 거의 발견되지 않았다(도 19d). 이러한 결과는 DOPS 혼입 후 SLO로의 생체 분포 이동을 명확하게 결론지었다. 전체 형질감염 효율을 희생하지 않고 림프절과 비장에 PS 표적을 추가하는 반면, 다른 많은 음전하 지질이 입자의 형질감염 효율을 감소시킨다고 보고한 것은 주목할 만한다.
[00131] 실시예 12 - 예측적 실시예. 감소된 구성요소들로 PCB-LNP의 준비 및 특성화
[00132] 콜레스테롤 양이 감소된 PCB-LNP 라이브러리가 생성된다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 콜레스테롤의 비율은 0 내지 38.5 mol%이고, 이에 상응하여 DMG-PCB는 1.5 내지 40 mol%이다. 이온화가능한 지질(50 mol%) 및 헬퍼 지질(10 mol%)의 양은 실시예 2에 기재된 바와 같이 변하지 않고 유지된다.
[00133] 표 1. 콜레스테롤이 감소된 PCB-LNP에 대한 실험 설계
[00134] 각각의 제제는 실시예 2에 기술된 동일한 절차에 따라 제조될 것이다. 크기, 제타 전위 및 캡슐화 효율의 특성화를 각각의 제제에 대해 수행한다. 효능 시험을 위해, 각 제제를 시험관내에서 형질감염시켜 형질감염 효율을 평가한다. 구체적으로, 반딧불이 루시퍼라제(Fluc)를 인코딩하는 mRNA를 각각의 제제에 의해 각각 캡슐화한다. HEK 293T(ATCC, CRL-11268)를 100μL의 배양 배지(10% FBS가 포함된 DMEM)의 96웰 플레이트에 4 x 104 세포/웰로 접종하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 부착되도록 배양한다. 그런 다음, 5 μL의 Fluc mRNA-로딩된 LNP를 배지에 첨가하고 6시간 동안 인큐베이션하였다. 각 제제에는 5개의 복제본이 있으며 PBS는 음성 대조군으로 추가된다. 형질감염 후 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 루시페라제 분석 시스템을 사용하여 Fluc의 발현을 평가한다.
[00135] 또한, 최고의 성능을 발휘하는 제제를 마우스에 전달하여 생체내 발현 및 생체 분포를 평가한다. 구체적으로, Fluc mRNA-로딩된 LNP(1 mg/kg의 mRNA)를 6~7주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에 주사한다. 형질감염 6시간 후, 마우스에 D-루시페린(PBS 중 30 mg/ mL)을 복강내 주사한다. 10분 후 마우스를 희생시키고 8개의 장기(간, 비장, 신장, 폐 및 비장)를 채취한다. 장기의 발광을 광학 이미징 시스템을 사용하여 분석하고 각 장기의 광도를 초당 광자 단위로 측정하기 위해 적합한 소프트웨어를 사용하여 정량화한다.
[00136] 실시예 13 - 예측적 실시예. PC 모이어티가 있거나 없는 LNP의 제조 및 특성화
[00137] 이 실시예에서는, PC 모이어티의 면역원성을 다루기 위해, PC 모이어티가 없는 분자를 사용하는 제제를 생성한다(도 20.) PC 모이어티가 없는 하나의 제제에서, LNP의 4가지 성분은 이온화가능한 지질, DMG-CB1, 콜레스테롤 및 DMG-PCB를 포함한다. DMG-CB1은 CB가 DMG-N에 부착되어 이전 제제의 헬퍼 지질 DSPC를 대체하는 실시예 1에서 생성될 것이다. PC 모이어티가 있는 제제에서 LNP의 4가지 구성 요소에는 이온화가능한 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PCB가 포함된다. DSPE-PCB는 참조문헌(Z. Cao, L. Zhang 및 S. Jiang, Superhydrophilic Zwitterionic Polymers Stabilize Liposomes, Langmuir, 28, 11625, 2012)에 따라 생성된다.
[00138] 각각의 제제는 실시예 2에 기술된 동일한 절차에 따라 제조될 것이다. 크기, 제타 전위 및 캡슐화 효율의 특성화를 각각의 제제에 대해 수행한다. 효능 시험을 위해, 각 제제를 시험관내에서 형질감염시켜 형질감염 효율을 평가한다. 구체적으로, 반딧불이 루시퍼라제(Fluc)를 인코딩하는 mRNA를 각각의 제제에 의해 각각 캡슐화한다. HEK 293T(ATCC, CRL-11268)를 100μL의 배양 배지(10% FBS가 포함된 DMEM)의 96웰 플레이트에 2 x 104 세포/웰로 접종하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 부착되도록 배양한다. 그런 다음, 5 μL의 Fluc mRNA-로딩된 LNP를 배지에 첨가하고 6시간 동안 인큐베이션하였다. 각 제제에는 5개의 복제본이 있으며 PBS는 음성 대조군으로 추가된다. 형질감염 후 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 루시페라제 분석 시스템을 사용하여 Fluc의 발현을 평가한다.
[00139] 또한, 최고의 성능을 발휘하는 제제를 마우스에 전달하여 생체내 발현 및 생체 분포를 평가한다. 구체적으로, Fluc mRNA-로딩된 LNP(1 mg/kg의 mRNA)를 6~7주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에 주사한다. 형질감염 6시간 후, 마우스에 D-루시페린(PBS 중 30 mg/ mL)을 복강내 주사한다. 10분 후 마우스를 희생시키고 8개의 장기(간, 비장, 신장, 폐 및 심장)를 채취한다. 장기의 발광을 광학 이미징 시스템을 사용하여 분석하고 각 장기의 광도를 초당 광자 단위로 측정하기 위해 적합한 소프트웨어를 사용하여 정량화한다.
[00140] 실시예 14 - 예측언적 실시예. 지질 성분의 조합
[00141] 또한 도 21에 도시된 바와 같이, 임의의 지질 성분 (쯔비터이온성 폴리머 개질된 지질, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체)은 임의의 다른 성분과 화학적으로 결합되어 상기 기재된 조성물 및 방법을 달성할 수 있다.
현재 본 발명의 바람직한 구현예로 간주되는 것을 도시하고 설명하였지만, 당업자는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 및 수정을 할 수 있을 것이다.

Claims (64)

  1. (i) 지질 모이어티가 쯔비터이온성 폴리머에 공유 부착된 적어도 하나의 쯔비터이온성 폴리머-함유 지질;
    (ii) 폴리머에 부착되지 않은 하전 및 비하전 지질로부터 선택되는 적어도 하나의 비-양이온성 지질;
    (iii) 2차, 3차 또는 4차 아미노기를 갖는 적어도 하나의 양이온성 또는 이온화가능한 지질; 및
    (iv) 적어도 하나의 치료 물질
    을 포함하는 지질 나노입자 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 성분 (i)의 상기 지질 모이어티는 디아실글리세라이드인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 성분 (i)은 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 배제하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 성분 (i)의 쯔비터이온성 폴리머는 폴리(카르복시베타인)(PCB), 폴리(설포베타인), 폴리(포스포베타인), 폴리(포스파티딜콜린), 글루탐산-리신(EK)-함유 폴리펩타이드, 폴리(트리메틸아민 N-옥사이드) 폴리머 및 폴리(쯔비터이온성) 포스파티딜 세린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 성분 (i)의 쯔비터이온성 폴리머는 베타인 폴리머인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 베타인 폴리머는 폴리(카르복시베타인), 폴리(설포베타인) 또는 폴리(포스포베타인) 폴리머인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 성분 (ii)의 비-양이온성 지질은 쯔비터이온성 모이어티를 함유하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 쯔비터이온성 모이어티는 포스포베타인, 포스파티딜콜린, 카르복시베타인, 설포베타인, 트리메틸아민 N-옥사이드, 글루탐산-리신(EK)- 함유 펩타이드, 또는 쯔비터이온성 포스파티딜 세린 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 비-양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸-포스포에탄올아민, 16-O-디메틸-포스포에탄올아민, 18-1-트랜스-포스포에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(transDOPE)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 성분 (ii)는 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 배제하는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 성분 (ii)의 비-양이온성 지질은 인지질인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 인지질은 포스파티딜 세린 지질인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 성분 (iii)의 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 2차, 3차 또는 4차 아미노 기를 보유하는, 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 성분 (iii)의 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 생리학적 조건 하에 음하전되는 작용기와 함께 2차, 3차 또는 4차 기를 보유하는, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 하기를 포함하는 것인 조성물:

    여기서:
    R1/R2 = H 또는 알킬기이고, 여기서 알킬기는 포화, 불포화, 분지형 및/또는 비분지형일 수 있으며, 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F를 포함하는 하나 이상의 헤테로원자를 추가로 포함할 수 있고;
    L은 N과 A 사이의 공유 링커기를 포함하고, 여기서 공유 링커기는 -CH2-, -CH2CH(OH)-, -CH2CHClCH2-, -CH2OCH2-, -CH2SCH2-, -CH2SSCH2-, -CH2COOCH2-, C, H 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br 및 F를 포함하는 하나 이상의 헤테로원자를 추가로 포함할 수 있고;
    A-(X)n은 특정 pH 조건에서 음전하를 띠는 작용기로서 다음을 포함할 수 있으며;
    (i) A(X)n은 카르복실산기(A = -COOH 및 n=0)이거나
    (ii) A(X)n은 포스페이트이며, 여기서 A =

    또는
    이고 n = 1이다. X = H 또는 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형이고, 모두 탄소이거나 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br과 같은 헤테로원자를 함유하는 알킬기이거나, 또는
    (iii) A(X)n은 설폰산기이고, 여기서 A =

    이고 n=0
    (iv) A(X)n은 설폰아미드기이고, 여기서 A =

    이고 n = 1, X = H 또는 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형이고, 모두 탄소이거나 또는 비제한적인 예로서 N, O, F, Si, P, S, Cl, Br과 같은 헤테로원자를 함유하는 알킬기이다.
  16. 제14항에 있어서, 작용기는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물:

    여기서 n은 1 내지 10이다.
  17. 제1항에 있어서, 성분 (iii)의 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 배제하는, 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 지질 나노입자 조성물은 (v) 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함하는, 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 성분 (iv)의 치료 물질은 핵산 분자인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 핵산 분자는 RNA인, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, RNA는 mRNA인, 조성물.
  22. 제20항에 있어서, RNA는 바이러스 mRNA인, 조성물.
  23. 제20항에 있어서, RNA는 메신저 RNA(mRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 원형 RNA(circRNA), 긴 비인코딩 RNA(lncRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), CRISPR-관련 RNA, Cas 뉴클레아제 mRNA, 가이드 RNA, 단일 가이드 RNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 치료 물질은 바이러스의 스파이크 단백질인, 조성물.
  25. (i) 지질 모이어티가 쯔비터이온성 폴리머에 공유 부착된 적어도 하나의 쯔비터이온성 폴리머-함유 지질;
    (ii) 폴리머에 부착되지 않은 하전 및 비하전 지질로부터 선택되는 적어도 하나의 비-양이온성 지질;
    (iii) 2차, 3차 또는 4차 아미노기를 갖는 적어도 하나의 양이온성 또는 이온화가능한 지질; 및
    (iv) 적어도 하나의 치료 물질
    을 포함하는 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료 물질을 대상체에게 전달하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 지질 나노입자 조성물은 대상체의 세포에 전달되는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 치료 물질은 핵산 분자이고, 그의 투여는 대상체의 유전자 요법을 초래하는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 치료 물질은 핵산 분자이고, 그의 투여는 대상체의 백신접종을 초래하는, 방법.
  29. 제25항에 있어서, 성분 (i)의 지질 모이어티는 디아실글리세리드인, 방법.
  30. 제25항에 있어서, 성분 (i)은 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 배제하는, 방법.
  31. 제25항에 있어서, 성분 (i)의 쯔비터이온성 폴리머는 폴리(카르복시베타인)(PCB), 폴리(설포베타인), 폴리(쯔비터이온성 포스포베타인), 글루탐산-라이신(EK)-함유 폴리펩타이드, 폴리(포스파티딜콜린), 및 폴리(트리메틸아민 N-옥사이드) 폴리머인, 방법.
  32. 제25항에 있어서, 성분 (i)의 쯔비터이온성 폴리머는 베타인 폴리머인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 베타인 폴리머는 카르복시 베타인 폴리머인, 방법.
  34. 제25항에 있어서, 성분 (ii)의 비-양이온성 지질은 쯔비터이온성 모이어티를 함유하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 쯔비터이온성 부분은 포스포베타인, 포스파티딜콜린, 카르복시베타인, 설포베타인, 트리메틸아민 N-옥사이드, 글루탐산-리신(EK)-함유 펩타이드, 또는 쯔비터이온성 포스파티딜 세린 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제25항에 있어서, 비-양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸-포스포 에탄올아민, 16-O-디메틸-포스포에탄올아민, 18-1-트랜스-포스포에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일 포스파티디에탄올아민(SOPE) 및 1,2-디올레오일-sn 글리세로-3-포스포에탄올아민(transDOPE)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제25항에 있어서, 성분 (ii)는 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 배제하는, 방법.
  38. 제25항에 있어서, 성분 (ii)의 비-양이온성 지질은 인지질인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 인지질은 포스파티딜 세린 지질인, 방법.
  40. 제25항에 있어서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 2차, 3차 또는 4차 아미노기를 보유하는, 방법.
  41. 제25항에 있어서, 양이온성 또는 이온화가능한 지질은 폴리알킬렌 옥사이드 세그먼트를 배제하는, 방법.
  42. 제25항에 있어서, 지질 나노입자 조성물은 (v) 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제25항에 있어서, 치료 물질은 핵산 분자인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 핵산 분자는 RNA인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, RNA는 mRNA인, 방법.
  46. 제44항에 있어서, RNA는 메시지 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 원형RNA(circRNA), 긴-비인코딩 RNA(lncRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 바이러스 mRNA, CRISPR RNA, Cas 뉴클레아제 mRNA, 가이드 RNA, 단일 가이드 RNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제25항에 있어서, 치료 물질은 바이러스의 스파이크 단백질인, 방법.
  48. 작용기와 함께 2차, 3차 또는 4차 아민기에 부착된 지질 모이어티를 함유하는 지질 조성물로서, 여기서 작용기는 생리학적 조건 하에서 음전하를 띠는 것인, 지질 조성물.
  49. 제15항의 지질 모이어티를 포함하는, 지질 조성물.
  50. 제16항의 지질 모이어티를 포함하는, 지질 조성물.
  51. 대상체의 2차 림프 기관(SLO)에 치료제를 표적 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 지질 나노입자 조성물을 수득하는 단계로서, 지질 나노입자 조성물은 포스포세린-함유 지질(PS)을 추가로 포함하는 단계; 및
    유효량의 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하되,
    여기서 치료제는 대상체의 2차 림프 기관(SLO)을 표적으로 하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 치료제는 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 포스포세린 함유 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS), 자연 발생 PS-지질, L-α-포스파티딜세린, 및/또는 쯔비터이온성 PS-지질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제51항에 있어서, SLO는 비장 및 림프절로부터 선택되는, 방법.
  55. 제51항에 있어서, 치료제의 표적 전달은 암 면역요법, 자가면역 질환 면역요법, 백신접종 및/또는 유전자 편집을 수행하는 것인 방법.
  56. 치료제를 대상체의 대식세포에 표적 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 지질 나노입자 조성물을 수득하는 단계로서, 지질 나노입자 조성물은 포스포세린-함유 지질(PS)을 추가로 포함하는 단계; 및
    유효량의 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하되,
    여기서 치료제는 대상체의 대식세포를 표적으로 하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 치료제는 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 포스포세린 함유 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS), 자연 발생 PS-지질, L-α-포스파티딜세린, 및/또는 쯔비터이온성 PS-지질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  59. 제56항에 있어서, 치료제는 대상체의 대식세포를 표적으로 하여 치료제를 비장 및/또는 림프절에 추가로 표적화하는 방법.
  60. 제56항에 있어서, 치료제의 표적 전달은 암 면역요법, 자가면역 질환 면역요법, 백신접종 및/또는 유전자 편집을 수행하는 것인 방법.
  61. 대상체의 2차 림프 기관(SLO)에 치료제를 표적 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
    지질 나노입자 조성물을 수득하는 단계로서, 지질 나노입자 조성물은 포스포세린-함유 지질(PS)을 추가로 포함하는 단계; 및
    유효량의 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하되,
    여기서 치료제는 대상체의 2차 림프 기관(SLO)을 표적으로 하는, 방법.
  62. 대상체의 2차 림프 기관(SLO)에 치료제를 표적 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 지질 나노입자 조성물을 수득하는 단계로서, 지질 나노입자 조성물은 포스포세린-함유 지질(PS)을 추가로 포함하는 단계; 및
    유효량의 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하되,
    여기서 치료제는 대상체의 2차 림프 기관(SLO)을 표적으로 하는, 방법.
  63. 치료제를 대상체의 대식세포에 표적 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
    지질 나노입자 조성물을 수득하는 단계로서, 지질 나노입자 조성물은 포스포세린-함유 지질(PS)을 추가로 포함하는 단계; 및
    유효량의 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하되, 여기서 치료제는 대상체의 대식세포를 표적으로 하는, 방법.
  64. 치료제를 대상체의 대식세포에 표적 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 지질 나노입자 조성물을 수득하는 단계로서, 지질 나노입자 조성물은 포스포세린-함유 지질(PS)을 추가로 포함하는 단계; 및
    유효량의 지질 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하되,
    여기서 치료제는 대상체의 대식세포를 표적으로 하는, 방법.
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