CN116867500A - 两性离子脂质纳米颗粒组合物和使用方法 - Google Patents

两性离子脂质纳米颗粒组合物和使用方法 Download PDF

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Abstract

一种脂质纳米颗粒组合物，其包含：(i)至少一种含两性离子聚合物的脂质，其中脂质部分与两性离子聚合物共价连接；(ii)至少一种非阳离子脂质，所述至少一种非阳离子脂质选自带电荷和不带电荷的脂质，但不与聚合物连接；(iii)至少一种阳离子或可电离脂质；以及(iv)至少一种治疗物质，以及任选地(v)胆固醇或其衍生物。本文中还描述了向受试者递送治疗物质的方法，所述方法包括向所述受试者施用上文所描述的脂质纳米颗粒组合物。

Description

两性离子脂质纳米颗粒组合物和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年12月22日提交的美国临时申请第63/129,343的优先权权益，所述美国临时申请以全文引用的方式并入本文中。
政府支持
本发明是根据美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的授权号2002940和2103295在政府支持下进行的。政府享有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明总体上涉及用于包封和递送治疗剂(如核酸)的两性离子脂质纳米颗粒(LNP)制剂。本发明更具体地涉及此类LNP制剂，具体地其非PEG化版本在递送用于如通过基因疗法治疗一系列疾病或病症或用于对受试者进行疫苗接种的治疗剂中的用途。
背景技术
核酸(如DNA、siRNA和mRNA)的体内递送有可能革新疫苗接种、酶替代疗法和对遗传病症的治疗。与病毒载体相比，据信脂质纳米颗粒递送平台具有更少安全问题。自2018年FDA首次批准LNP-siRNA药物以来，越来越多的脂质纳米颗粒被开发并进入临床试验。LNP通常由以下四种组分组成：可电离阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇(PEG)脂质。其中PEG脂质通常用于稳定和保护LNP结构。
虽然PEG最初被认为是免疫上惰性的，但现在已知其与脂质或蛋白质的附着由于半抗原效应而引入免疫应答的另外原因，从而产生抗PEG抗体(Ab)。越来越多的临床报告强调，在一些情况下，抗PEG Ab而不是抗蛋白Ab是临床问题的主要罪魁祸首。在普瑞凯希(Pegloticase)(Krystexxa)，一种PEG化尿酸酶产品的典型案例中，超过40％的接受这种药物的难治性慢性痛风患者遭受高水平的抗PEG Ab应答，并且因此对其治疗无应答。
抗PEG Ab已经削弱了市场上一些PEG缀合的蛋白质的疗效。除了诱导的抗PEG抗体之外，预先存在的抗PEG Ab对所有PEG化药物都是至关重要的。在患有急性冠状动脉综合征的患者的临床试验期间，若干种过敏反应在第一剂量的pegnivacogin，一种peg化RNA适体之后发生。还据报道一种多柔比星的PEG化脂质体制剂在首次注射时在一些患者中产生速发型超敏反应。因此，仍然尚未满足的需求是提供可以替代常规LNP中的成问题的组分的新型脂质组合物，并且提供功能改进的生物制药产品。
发明内容
本发明首先涉及用于向受试者递送治疗剂(如核酸)的新型脂质纳米颗粒(LNP)组合物。本文所描述的LNP组合物有利地具有低免疫原性、长循环能力和靶向能力。所述LNP组合物还可以用靶向剂功能化以与特定细胞或细胞组分结合。
在第一方面，本公开涉及至少含有以下组分的LNP组合物：(i)至少一种含两性离子聚合物的脂质，其中脂质部分与两性离子聚合物共价连接；(ii)至少一种非阳离子脂质，所述至少一种非阳离子脂质选自带电荷和不带电荷的脂质，但不与聚合物连接；(iii)至少一种阳离子或可电离脂质，所述至少一种阳离子或可电离脂质具有仲氨基、叔氨基或季氨基；以及(iv)至少一种治疗物质。在第一组实施方式中，组分(i)中的所述脂质部分是二酰基甘油(二酰基甘油酯)。在第二组实施方式中，组分(i)不包含聚环氧烷(例如，PEG)区段。在第三组实施方式中，组分(i)中的所述两性离子聚合物是甜菜碱聚合物，或更具体地羧基甜菜碱聚合物。在第四组实施方式中，组分(ii)中的所述非阳离子脂质含有两性离子部分。在第五组实施方式中，组分(ii)不包含聚环氧烷区段。在第六组实施方式中，组分(ii)中的所述非阳离子脂质是磷脂，如磷脂酰丝氨酸(PS)脂质。在第七组实施方式中，所述阳离子或可电离脂质具有仲基团、叔基团或季基团。在第八组实施方式中，所述阳离子或可电离脂质不包含聚环氧烷(例如，PEG)区段。在第九组实施方式中，所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含：(v)胆固醇或其衍生物。在第十组实施方式中，所述治疗物质是核酸分子，如RNA，或更具体地mRNA，或更具体地病毒mRNA或更具体地线性或环状mRNA。值得注意的是，第一实施方式至第十实施方式中的任何一个可以组合以产生本发明的LNP组合物。
另一方面，本公开涉及一种通过以下向受试者递送治疗物质的方法：向所述受试者施用上文所描述的脂质纳米颗粒组合物中的任何一种，包括上文所描述的第一实施方式至第十实施方式中的任何一个。在第一组实施方式中，所述脂质纳米颗粒组合物被递送到所述受试者的细胞中。在第二组实施方式中，所述治疗物质是核酸分子，并且其施用引起所述受试者的基因疗法。在第三组实施方式中，所述治疗物质是核酸分子，并且其施用引起所述受试者的疫苗接种。
另一方面，本公开涉及一种脂质组合物，其含有脂质部分，所述脂质部分与仲氨基、叔氨基或季氨基以及官能团连接，所述官能团在生理学条件下带负电荷。此脂质部分可以为
其中
R1/R2＝H或烷基。所述烷基可以是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的、全碳和氢或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F。
L是位于N与A之间的共价接头基团。所述接头可以是全碳和氢或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F。L的结构由以下例示，但不限于：-CH2-、-CH2CH(OH)-、-CH2CHClCH2-、-CH2OCH2-、-CH2SCH2-、-CH2SSCH2-、-CH2COOCH2-。
A-(X)n是在生理学条件下带负电荷的官能团。结构由以下例示，但不限于以下：
(i)A(X)n是羧酸基团(A＝-COOH并且n＝0)；或者
(ii)A(X)n是磷酸根，其中A＝
并且n＝1。X＝H或烷基，所述烷基是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的、全碳或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F；或者
(iii)A(X)n是磺酸基团，其中A＝
并且n＝0
(iv)A(X)n是磺酰胺基团，其中A＝
并且n＝1，X＝H或烷基，所述烷基是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的、全碳和氢或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F。
这些可电离脂质的示例性结构是
其中n＝1至10。
附图说明
图1.DMG-PCB(或PCB脂质)的化学结构和1H NMR谱，其是一种本发明的含两性离子聚合物的脂质。
图2.含PCB脂质的LNP(或PCB-LNP)的体外表征。(a)代表性PCB-LNP制剂的TEM图像，(b)不同PCB-LNP在HepG2细胞系中的荧光素酶表达。
图3.含PCB脂质的LNP(或PCB-LNP)的体内mRNA表达。通过Aura图像软件分析图像。所有PCB-LNP示出了与其PEG对应物相当的肝脏中的转染效率。
图4.ZW-A-CBn(n＝1、2、3)的合成。
图5.化合物ZW-A-CB1的1H NMR(CDCl3)谱。
图6.化合物ZW-A-CB2的1H NMR(CDCl3)谱。
图7.化合物ZW-A-CB3的1H NMR(CDCl3)谱。
图8.ZW-B-CBn(n＝1、2、3)的合成。
图9.3-((8-(壬氧基)-8-氧代辛基)(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)丙酸(6)的1HNMR谱。
图10.N-(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)-N-(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)甘氨酸(8)的1H NMR谱。
图11.4-((8-(壬氧基)-8-氧代辛基)(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)丁酸(10)的1H NMR谱。
图12.ZW-A-SulfAmid-3的合成。
图13.化合物ZW-A-SulfAmid-3的1H NMR(CDCl3)谱。
图14.A.在不同摩尔比下含ZW-B-CB2的PCB-LNP的制剂。B.对于组A和组B，在HepG2细胞中进行体外转染。每个系统进行三个重复。
图15.a)在实施例8中进行的注射方案。b)在实施例8中研究的制剂的组成。c)在第三次注射制剂之后在指示时间点抽取的血清的EPO(促红细胞生成素)血清浓度分析：CB1(左边)、CB2(中间)和MC3(右边)。在此示出了归一化的数据以表示两个群组之间的变化倍数。
图16.PCB-mLNP(即含PCB-LNP的ZW-B-CB2脂质)(左边)和PS5-PCB-mLNP(即含PCB-LNP的ZW-B-CB2和PS脂质)(右边)在C57B6/L小鼠(0.2mg/kg)中的体内荧光素酶表达。在静脉内注射后6小时拍摄图像。
图17.由LNP递送的Fluc-mRNA的体外表达。水性缓冲液溶液的pH值：pH＝5(a)或pH＝3(b)。制剂：50:38.5:10:1.5(可电离脂质+两性离子可电离脂质):胆固醇:辅助脂质(DOPE或DSPC):PEG-脂质。水平条带：MC3 50％+两性离子脂质0％；竖直条带：MC3 25％+ZW-B-CB1 25％；棋盘：MC3 25％+ZW-B-CB2 25％；网格：MC3 25％+ZW-B-CB3 25％。
图18.由LNP递送的Fluc-mRNA的体外表达。水性缓冲液溶液的pH值：pH＝5(左边)或pH＝3(右边)。一般制剂：50:38.5:1.5(可电离脂质+两性离子可电离脂质):胆固醇:PEG-脂质。水平条带：MC3 50％+两性离子脂质0％；竖直条带：MC3 25％+ZW-B-CB1 25％；棋盘：MC3 25％+ZW-B-CB2 25％；网格：MC3 25％+ZW-B-CB3 25％。
图19.PS5-LNP和PS0-LNP(PEG制剂)在不同细胞中的荧光素酶表达：(a)HepG2；(b)Raw264.7；(c)初级小鼠脾细胞。进行三次重复实验，(d)从分别用携带Fluc编码mRNA的PS0-LNP和PS5-LNP处理的小鼠中分离的器官的IVIS图像和生物发光信号分析。图中所示的器官(从上到下)是肺、颈浅表淋巴结(SCLN，附接在唾液腺上)、肝、肾和脾。
图20.LNP制剂中的具有或不具有PC部分的一些示例性含两性离子聚合物的脂质和非阳离子脂质的结构。
图21.一些示例性脂质组合物的结构，其中不同类型的脂质部分(例如，经两性离子聚合物修饰的脂质、阳离子脂质、非阳离子脂质和胆固醇或其衍生物)在化学上组合。
具体实施方式
一方面，本公开涉及一种脂质纳米颗粒(LNP)组合物。在例如X.Hou等人,《自然评论-材料(Nature Reviews Materials)》,6,1078-1094,2021中描述了本领域的一些LNP，其内容通过引用并入本文。术语“脂质纳米颗粒”是指至少部分地由脂质分子构造而成的纳米颗粒。如下文进一步描述的，脂质分子包括本文所描述的一种或多种含两性离子聚合物的脂质和一种或多种非阳离子脂质、阳离子或可电离脂质和/或胆固醇。
在不同实施方式中，LNP的大小精确地为、约为、至少或至多例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或250微米或大小在由上述值中的任何两个界定的范围内。
LNP的第一组分为至少一种含两性离子聚合物的脂质。在含两性离子聚合物的脂质中，脂质部分与两性离子聚合物共价连接(attach/link)。两性离子聚合物通常衍生自两性离子单体以及可以转化为两性离子单体的单体(即两性离子单体的前体)。两性离子单体是电子中性单体，所述电子中性单体包括等量的正电荷和负电荷(例如，每种各一个)。在一些实施方式中，两性离子聚合物含有多个重复单元，每个重复单元包括一个带正电荷的部分和一个带负电荷的部分。两性离子聚合物通常含有至少或大于2、5或10且至多或小于100、200、300、400、500或1000个单元。
如本文所使用的，术语“两性离子聚合物”是指通过聚合可聚合两性离子单体而制备的聚合物，所述聚合物提供了具有100摩尔％两性离子部分的两性离子聚合物(即，两性离子聚合物的每个重复单元是两性离子部分)；或者是指通过使可聚合两性离子单体与可聚合共聚单体共聚而制备的聚合物，所述聚合物提供了具有小于100摩尔％两性离子部分的两性离子聚合物(例如，当可聚合两性离子单体和可聚合共聚单体以等比例存在于聚合混合物中时，产物为具有50摩尔％两性离子部分的两性离子聚合物)。
术语“两性离子聚合物”还指代具有基本上等量的负(阴离子)电荷和正(阳离子)电荷的聚合物，所述聚合物通过使可聚合带负电荷的单体与可聚合带正电荷的单体共聚而制备，所述可聚合带负电荷的单体和所述可聚合带正电荷的单体各自以基本上等比例存在于聚合混合物中。此类共聚的产物是具有100摩尔％两性离子部分的两性离子聚合物，其中每种两性离子部分被定义为一对重复单元：一个重复单元具有负电荷，而一个重复单元具有正电荷。此类两性离子聚合物被称为混合电荷共聚物。术语“两性离子聚合物”还指代通过使可聚合带负电荷的单体、可聚合带正电荷的单体和可聚合共聚单体共聚而制备的聚合物，所述可聚合带负电荷的单体和所述可聚合带正电荷的单体各自以基本上等比例存在于聚合混合物中，所述聚合物提供了具有小于100摩尔％两性离子部分的两性离子聚合物(例如，当可聚合带负电荷的单体和可聚合带正电荷的单体的组合以及可聚合共聚单体以等比例存在于聚合混合物中时(即，50％可聚合带负电荷的单体和可聚合带正电荷的单体的组合以及50％可聚合共聚单体)，产物为具有50摩尔％两性离子部分的两性离子聚合物。
脂质部分由多元醇部分(例如，二醇、甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸)构造而成，所述多元醇部分已经用一种或多种脂肪酸分子酯化以产生单酰基或二酰基脂质，其中术语“酰基”是指RC(＝O)基团，其中R是含有至少八个并且典型地至多30个碳原子的直链或支链烃(脂肪)链，其中烃链可以是饱和的或含有一个或多个碳-碳双键。脂质部分可以是例如二酰基二醇(例如，二酰基乙二醇)、二酰基甘油(二酰基甘油酯)、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酰乙醇胺或二酰基磷脂酰丝氨酸部分。脂质可以是本申请中提供的实施例1-14中的任一个中描述的脂质中的任何一种。脂质可以是WO2011/057227中描述的脂质中的任何一种，其通过引用并入本文。脂肪酰部分可以衍生自已知脂肪酸中的任何一种。脂肪酰部分的一些实例包括油酰、棕榈酰、月桂酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、亚油酰和花生酰。两性离子聚合物通常通过多元醇上的碳与脂质部分(如上文所述的任何脂质部分)连接。两性离子聚合物可以在聚合物的侧链或骨架(或其组合)中含有两性离子基团。
在一个实施方式中，聚合物是由两性离子单体制备的均聚物并且具有下式：
其中B是聚合物骨架，如聚酯、聚醚、聚氨酯、聚酰胺或聚烃(例如，聚乙烯或聚丙烯)骨架，并且P是两性离子部分。在特定实施方式中，骨架(B)可以具有以下结构中的任何一个：
其中R选自由以下组成的组：氢和经取代或未经取代的烷基；并且E选自由以下组成的组：经取代或未经取代的亚烷基、-(CH2)PC(O)O-和-(CH2)PC(O)NR2-；p典型地是0至12的整数；R2选自氢和经取代或未经取代的烷基；并且L是直链或支链亚烷基，所述直链或支链亚烷基任选地包括一个或多个氧原子。下标x典型地为至少或大于2、5或10且至多或小于100、200、300、400、500或1000个单元。
在特定实施方式中，P选自以下结构中的任何一个：
其中R3、R4和R6独立地选自由以下组成的组：氢和经取代或未经取代的烷基，R5或R5选自由以下组成的组：经取代或未经取代的亚烷基、亚苯基和聚醚基团，并且m是1至7的整数；并且x是2至500的整数。
在一些实施方式中，所述两性离子聚合物是甜菜碱聚合物。在其它实施方式中，所述两性离子聚合物是聚(磷脂酰胆碱)聚合物、聚(三甲胺N-氧化物)聚合物、聚(两性离子磷脂酰丝氨酸)聚合物或含谷氨酸-赖氨酸(EK)的多肽。在一些实施例中，两性离子磷脂酰丝氨酸包括一个相邻带正电荷的部分以平衡磷酸丝氨酸的负电荷。在一些实施方式中，两性离子磷脂酰丝氨酸包括如“用于免疫调节的功能两性离子仿生材料的重新设计(De novodesign of functional zwitterionic biomimetic material for immunomodulation)”《科学进展(Science Advances)》,2020年5月29日,第6卷,第22期(DOI:10.1126/sciadv.aba0754)中描述的化合物，其特此以全文引用的方式并入。
甜菜碱聚合物的一些实例包括聚(羧基甜菜碱)、聚(磺基甜菜碱)和聚(磷酸酯甜菜碱)聚合物。合适的聚(羧基甜菜碱)可以由一个或多个选自以下的单体制备：例如羧基甜菜碱丙烯酸脂、羧基甜菜碱丙烯酰胺、羧基甜菜碱乙烯基化合物、羧基甜菜碱环氧化物和其混合物。在一个实施方式中，所述单体是羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯。用于制备可用于本发明的羧基甜菜碱聚合物的代表性单体包括羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯，如2-羧基-N,N-二甲基-N-(2'-甲基丙烯酰氧基乙基)乙铵内盐；羧基甜菜碱丙烯酸脂；羧基甜菜碱丙烯酰胺；羧基甜菜碱乙烯基化合物；羧基甜菜碱环氧化物；以及其它具有羟基、异氰酸酯、氨基或羧酸基团的羧基甜菜碱化合物。在特定实施方式中，所述聚合物是聚(羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯)(聚(CBMA))。
两性离子聚合物可以通过任何合适的聚合方法制备，如原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合和自由基聚合。可以使用用于聚合此类单体的任何合适的自由基引发剂，包括本领域众所周知的自由基引发剂。在一些实施方式中，为了制备含两性离子聚合物的脂质或其它含聚合物的脂质，将两性离子或其它单体或其前体与脂质连接，并且在与脂质连接的情况下使单体聚合。可替代地，已经产生的聚合物可以通过本领域众所周知的方法与脂质连接。
在另一个实施方式中，两性离子聚合物是均聚物，所述均聚物具有在聚合物骨架的正电荷和侧基羧酸基团并且具有下式：
其中R选自由以下组成的组：氢和经取代或未经取代的烷基；L1和L2独立地是直链或支链亚烷基，所述直链或支链亚烷基任选地包括一个或多个氧原子；并且x是2至500的整数。
在另一个实施方式中，所述两性离子聚合物是混合电荷共聚物并且具有以下通式：
其中B1和B2独立地选自如先前所描述的X1、X2和X3；R选自氢和经取代或未经取代的烷基；E选自经取代或未经取代的亚烷基、-(CH2)PC(O)O-和-(CH2)PC(O)NR2-，其中p是0至12的整数；R2选自氢和经取代或未经取代的烷基；L是直链或支链亚烷基，所述直链或支链亚烷基任选地包括一个或多个氧原子；P1是带正电荷的基团；P2是带负电荷的基团，如羧酸基团；m是1至500的整数；并且n是1至500的整数。在一些实施方式中，P1是芳香族环或NR5R6中的氮，其中R5和R6独立地是经取代或未经取代的烷基。
两性离子聚合物的带正电荷的单元(含P1单元)可以衍生自具有带正电荷的侧基的单体。可以用于衍生本发明的聚合物中的带正电荷的单元的代表性单体包括甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯、甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵和N-乙酰基葡糖胺。
在一个实施方式中，两性离子聚合物的带负电荷的单元衍生自丙烯酸2-羧乙酯(CA)，并且带正电荷的单元衍生自甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(DM)。在另一个实施方式中，带负电荷的单元衍生自丙烯酸2-羧乙酯(CA)，并且带正电荷的单元衍生自甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯(DE)。在另一个实施方式中，带负电荷的单元衍生自丙烯酸2-羧乙酯(CA)，并且带正电荷的单元衍生自[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TM)。在另一个实施方式中，带负电荷的单元衍生自丙烯酸2-羧乙酯(CA)，并且带正电荷的单元衍生自甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐(NH2)。
在一些实施方式中，两性离子聚合物不包括聚环氧烷(聚亚烷基二醇)区段，或者两性离子聚合物更具体地不包含聚氧化乙烯或聚氧化丙烯区段。在一些实施方式中，所有组分(i)不包含聚环氧烷区段，或者组分(i)更具体地不包含聚氧化乙烯或聚氧化丙烯区段。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒整体上不包含聚环氧烷区段或分子。
术语“脂质”是指有机化合物，所述有机化合物包括但不限于脂肪酸酯，并且其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。它们通常分为至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂质”，如类固醇。在一个实施方式中，脂质包括二酰基甘油酯。
在一个实施方式中，两性离子聚合物与“化合物脂质”连接。此类脂质的一些实例包括二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基-磷酰乙醇胺、16-O-二甲基-磷酰乙醇胺、18-1-反式-磷酰乙醇胺、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(transDOPE)。在另一个实施方式中，两性离子聚合物与“简单脂质”连接。在另一个实施方式中，两性离子聚合物与“衍生脂质”连接。在一些实施方式中，两性离子聚合物包含如WO2011057225A2中所公开的两性离子化合物，其通过引用并入本文。
所述LNP的第二组分是至少一种非阳离子脂质，所述至少一种非阳离子脂质选自带电荷和不带电荷的脂质，但不与聚合物连接。如本文所使用的，术语“非阳离子脂质”是指不带正电荷且不能电离成带正电荷状态的脂质。然而，非阳离子脂质可以通过含有两性离子(聚合物内的正电荷和负电荷)，如上文先前所描述的任何两性离子基团和部分而带中性电荷。
在一些实施方式中，非阳离子脂质含有两性离子部分。所述两性离子部分可以是上文先前详细描述的任何此类部分。所述两性离子部分可以是例如磷酸酯甜菜碱、磷脂酰胆碱、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、三甲胺N-氧化物、含谷氨酸-赖氨酸(EK)或两性离子磷脂酰丝氨酸(磷酰丝氨酸)部分或其组合。在一些实施方式中，两性离子脂质是磷脂，如磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸脂质。
在其它实施方式中，非阳离子脂质不是两性离子的，但通过含有带负电荷的基团(例如，磷酰丝氨酸)而带负电荷。金属(例如，碱金属)或铵抗衡阴离子可以与带负电荷的基团电离地且流动地缔合。
在另一组实施方式中，非阳离子脂质通过不含任何带电基团而不带电。不带电的非阳离子脂质可以是例如磷脂酰甘油脂质、磷脂酰乙醇胺脂质或鞘脂。在一些实施方式中，非阳离子脂质可以是简单脂质，如脂肪、油和/或蜡。在一些实施方式中，非阳离子脂质可以是化合物脂质，如磷脂或糖脂。在一些实施方式中，非阳离子脂质可以是衍生脂质，如类固醇、磷脂、鞘脂和/或甾醇。在一些实施方式中，非阳离子脂质选自二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂或脑苷脂。在特定实施方式中，非阳离子脂质选自以下中的一种或多种：磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇(PI)。在其它特定实施方式中，所述非阳离子脂质是二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基-磷酰乙醇胺、16-O-二甲基-磷酰乙醇胺、18-1-反式-磷酰乙醇胺、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰-sn甘油-3-磷酰乙醇胺(transDOPE)。由于非阳离子脂质不与聚合物连接，因此非阳离子脂质不包含聚环氧烷(聚亚烷基二醇)区段。
在特定实施方式中，含有离子部分的非阳离子脂质是磷脂。在一个实施方式中，含有离子部分的非阳离子脂质是与一个或多个羧基甜菜碱基团缀合的脂质。在一个实施方式中，含有离子部分的非阳离子脂质是与一个或多个磺基甜菜碱基团缀合的脂质。在一个实施方式中，含有离子部分的非阳离子脂质是与一个或多个三甲胺N-氧化物基团缀合的脂质。
LNP的第三组分为至少一种阳离子或可电离脂质。阳离子或可电离脂质可以或可以不含与聚合物连接的脂质，所述聚合物具有阳离子基团。在一些实施方式中，阳离子或可电离脂质不与聚合物连接。如本文所使用的，术语“阳离子脂质”是指带正电荷的脂质(典型地通过具有铵基团)。在阳离子脂质中，带正电荷的基团不与阳离子脂质内的负电荷缔合。因此，阳离子脂质不是两性离子脂质。如本文所使用的，术语“可电离脂质”是指含有一个或多个能够被电离以在聚合物中产生正电荷的基团的脂质。可电离脂质通常具有仲氨基、叔氨基或季氨基，或具体地烷基化胺，或更具体地单烷基胺或二烷基胺基团，其中的任何一个可以被质子化或烷基化以产生烷基化铵基团。阳离子脂质可以含有三烷基胺基团，所述三烷基胺基团在与脂质结合时必然是带正电荷的。在特定实施方式中，阳离子或可电离脂质具有二甲基氨基或三甲基氨基(或二甲基铵或三甲基铵)基团。在特定实施方式中，阳离子或可电离脂质选自1,2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油酰-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLinKC2DMA)和4-(二甲基氨基)丁酸[(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基]酯(DLinMC3DMA)。
在一些实施方式中，可电离脂质含有与仲氨基、叔氨基或季氨基以及官能团连接的脂质部分，所述官能团在生理学条件下带负电荷。此脂质部分可以为
其中
R1/R2＝H或烷基。所述烷基可以是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的、全碳和氢或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F。
L是位于N与A之间的共价接头基团。接头可以是全碳和氢或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F。L的结构由以下例示，但不限于：-CH2-、-CH2CH(OH)-、-CH2CHClCH2-、-CH2OCH2-、-CH2SCH2-、-CH2SSCH2-、-CH2COOCH2-。
A-(X)n是在某些pH条件下带负电荷的官能团。结构由以下例示，但不限于以下：
(v)A(X)n是羧酸基团(A＝-COOH并且n＝0)；或者
(vi)A(X)n是磷酸根，其中A＝
并且n＝1。X＝H或烷基，所述烷基是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的、全碳或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F；或者
(vii)A(X)n是磺酸基团，其中A＝
并且n＝0
(viii)A(X)n是磺酰胺基团，其中A＝
并且n＝1，X＝H或烷基，所述烷基是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的、全碳和氢或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F。
这些可电离脂质的示例性结构是
其中n＝1至10。
在一些实施方式中，阳离子或可电离脂质不包括聚环氧烷(聚亚烷基二醇)区段，或者阳离子或可电离脂质更具体地不包括聚氧化乙烯或聚氧化丙烯区段。在一些实施方式中，阳离子或可电离脂质不包括聚环氧烷区段，或者阳离子或可电离脂质更具体地不包括聚氧化乙烯或聚氧化丙烯区段。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒不包括聚环氧烷区段。
在一些实施方式中，LNP进一步包括胆固醇或其衍生物，所述胆固醇或其衍生物在本文中被认为是LNP的任选的另外组分。在某些实施方式中，胆固醇衍生物是植物甾醇，例如β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、岩藻甾醇或豆甾烷醇。在某些实施方式中，胆固醇衍生物是二氢胆固醇、ent-胆固醇、epi-胆固醇、链甾醇、胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、胆甾醇基-2'-羟乙基醚、胆甾醇基-4'-羟丁基醚、3β[N—(N'N'-二甲基氨基乙基)氨基甲酰胆固醇(DC-Chol)、24(S)-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、25(R)-27-羟基胆固醇、22-氧杂胆固醇、23-氧杂胆固醇、24-氧杂胆固醇、环阿屯醇、22-酮基甾醇(22-ketosterol)、20-羟基甾醇、7-羟基胆固醇、19-羟基胆固醇、22-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、7-脱氢胆固醇、5α-胆甾-7-烯-3β-醇、3,6,9-三氧杂辛-1-醇-胆甾醇基-3e-醇、去氢麦角固醇、脱氢表雄酮、羊毛甾醇、二氢羊毛甾醇、羊毛甾烯醇、光甾醇、谷钙化醇(sitocalciferol)、钙泊三醇、粪醇、胆钙化醇、羽扇豆醇、钙化醇、22-二氢钙化醇、麦角固醇、菜籽固醇、水解番茄碱、番茄苷、熊果酸、胆酸、鹅去氧胆酸、酵母甾醇、薯蓣皂苷元、岩藻甾醇、粪生甾醇、或粪生甾醇，或其盐或酯，例如胆酸钠。
LPN进一步包括治疗物质，所述治疗物质并入到由上文所述的第一脂质组分、第二脂质组分、第三脂质组分和/或第四脂质组分中的一种或多种构造而成的自组装壳中或由所述自组装壳包封。治疗物质可以是用于活生物体，具体地哺乳动物，如人或动物受试者的具有治疗价值的任何物质。治疗物质可以是例如带负电荷的核分子。核分子可以是例如核苷酸、核苷、核碱基或核酸(例如，DNA或RNA)。在特定实施方式中，治疗物质含有一种或多种此类核分子。在一些实施方式中，治疗物质含有RNA，或更具体地mRNA，或更具体地病毒mRNA。在其它特定实施方式中，治疗物质是病毒的刺突蛋白，所述病毒如冠状病毒、SARS-COV2(COVID-19)或HIV病毒。
本发明的脂质纳米颗粒和组合物可以用于各种目的，包括递送核酸分子、核糖核蛋白(RNP)和许多其它治疗物质。核酸的实例包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA抑制剂(antagomirs/antimirs)、信使RNA-干扰互补RNA(micRNA)、多价RNA、环状RNA(circRNA)、crispr RNA(crRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、质粒DNA、寡聚DNA和互补DNA(cDNA)。在特定实施方式中，治疗分子包括以下中的一种或多种：DNA、RNA、ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA和其杂交体。在其它实施方式中，治疗分子包括质粒DNA或线性化DNA中的一种或多种。在其它实施方式中，治疗分子包括以下中的一种或多种：信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)和/或长非编码RNA(IncRNA)。在其它实施方式中，治疗分子包括反义寡核苷酸(ASO)。在其它实施方式中，治疗分子包括Cas核酸酶mRNA和/或向导RNA核酸。向导RNA核酸可以是例如单向导RNA(sgRNA)。在前述实施方式中的任何实施方式中，治疗分子包括针对SARS-Cov-2的疫苗，具体地其中所述疫苗是mRNA疫苗，或者其中mRNA疫苗与刺突蛋白或其部分相对应。
在前述实施方式中的任何实施方式中，核苷酸可以编码融合生物部分，所述融合生物部分包括保护结构域和功能结构域。在一些实施方式中，功能结构域直接或通过由氨基酸组成的接头与保护结构域融合。在另外的特定实施方式中，保护结构域可以包含：多个带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸和其衍生物)；多个带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸、组氨酸、精氨酸和其衍生物)；以及多个独立地选自由以下组成的组的另外的氨基酸：脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和其衍生物，其中带正电荷的氨基酸的数量与带正电荷的氨基酸的数量的比率为约1:0.5至约1:2。在一些实施方式中，保护结构域可以选自其它氨基酸聚合物(例如，延伸重组多肽(XTEN)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸和弹性蛋白样多肽)。在前述实施方式中的任何实施方式中，保护结构域可以选自自然半衰期延长结构域(例如，Fc片段)。
LNP还可以包括具有组合官能团的脂质组分。在实施方式中，任何脂质组分(包括但不限于含两性离子聚合物的脂质、非阳离子脂质、阳离子脂质和胆固醇和/或胆固醇衍生物)可以包括不同脂质组分的一种或多种功能。在实施方式中，含两性离子聚合物的脂质包括含两性离子聚合物的脂质和阳离子或可电离脂质的功能。在实施方式中，含两性离子聚合物的脂质、非阳离子或可电离脂质、阳离子脂质和胆固醇和/或胆固醇衍生物中的任何一种还可以包括含两性离子聚合物的脂质、非阳离子脂质、阳离子脂质和胆固醇和/或胆固醇衍生物中的一种或多种的一种或多种功能。在实施方式中，脂质组分可以包括另一种脂质组分的功能，由此消除具有所述功能的另外脂质组分的需求。在实施方式中，含两性离子聚合物的脂质可以包括非阳离子脂质的功能，由此消除或减少非阳离子脂质的需求。在实施方式中，含两性离子聚合物的脂质可以包括阳离子脂质的功能，由此消除或减少阳离子脂质的需求。在实施方式中，含两性离子聚合物的脂质可以包括胆固醇和/或胆固醇衍生物的功能，由此消除或减少胆固醇和/或胆固醇衍生物的需求。
在实施方式中，任何脂质组分(两性离子聚合物修饰的脂质、阳离子脂质、非阳离子脂质和胆固醇或其衍生物)可以与任何其它脂质组分化学结合。在实施方式中，两性离子聚合物修饰的脂质和阳离子脂质化学结合成一个脂质。在实施方式中，两性离子聚合物修饰的脂质和非阳离子脂质化学结合成一个脂质。在实施方式中，阳离子脂质和非阳离子脂质化学结合成一个脂质。在实施方式中，两性离子聚合物修饰的脂质、阳离子脂质和非阳离子脂质化学结合成一个脂质。在实施方式中，两性离子聚合物修饰的脂质和胆固醇或衍生物化学结合成一个脂质。在实施方式中，两性离子聚合物修饰的脂质、阳离子脂质和胆固醇或衍生物化学结合成一个脂质。在实施方式中，两性离子聚合物修饰的脂质、非阳离子脂质和胆固醇或衍生物化学结合成一个脂质。在实施方式中，两性离子聚合物修饰的脂质、非阳离子脂质、非阳离子脂质和胆固醇或衍生物化学结合成一个脂质。在其它实施方式中，每种脂质组分是单独的、不同的，并且不与另一种脂质组分结合。
上文所述的脂质纳米颗粒的组分中的任何一种可以被化学修饰以含有靶向配体(例如，Fab或Fc)。在特定实施方式中，含两性离子聚合物的脂质具有用于将装载有治疗剂或诊断剂或两者的LNP递送到身体中的特别器官内的靶向区域的靶向配体，如肽(例如，RGD)、脂质(例如，含磷酸丝氨酸的脂质)、蛋白质(例如，载脂蛋白E)、适体(例如，抗VEGF适体)、糖(例如，唾液酸)和抗体(例如，抗PD1)或抗体片段(例如，Fab或Fc)。
另一方面，本公开涉及一种通过以下向受试者递送治疗物质的方法：向所述受试者施用上文所描述的LNP组合物中的任何一种或多种。所述受试者典型地是哺乳动物，更典型地是人类受试者，但还可以是另一种哺乳动物，如宠物或农场动物，如狗、猫、奶牛或绵羊。在一些实施方式中，递送治疗物质的方法产生治疗受试者的方法。作为治疗方法，LNP组合物可以出于例如蛋白质置换疗法、癌症免疫疗法、癌症疫苗疗法、传染病疫苗、基因编辑、自身免疫性治疗和/或癌症诊断的目的而施用。在特定实施方式中，施用LNP组合物以用于基因疗法(包括CRISPR-Cas基因编辑)、用于体外和体内产生胞外囊泡或用于接种针对冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)的疫苗。在更特定实施例中，LNP用于体外和体内成簇的规则间隔的短回文重复序列-Cas核酸内切酶(CRISPR-Cas)基因编辑，例如包括但不限于递送一种或多种编码一种或多种CRISPR相关蛋白(如Cas蛋白)的核酸。在一些实施方式中，递送LNP连同检查点抑制剂(例如，抗程序性死亡配体1(抗PD-L1)抗体或抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(抗CTLA4))以治疗癌症。
在一些实施方式中，治疗方法包括向受试者的次级淋巴器官(SLO)靶向递送治疗剂，其中向受试者施用包括含磷酸丝氨酸的脂质和治疗剂的脂质纳米颗粒。SLO可以是例如脾和/或淋巴结。含磷酸丝氨酸的脂质可以是例如1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸(DOPS)或天然存在的PS脂质，如L-α-磷脂酰丝氨酸(脑)。在一些实施方式中，靶向递送引起癌症免疫疗法、自身免疫性疾病免疫疗法或基因编辑。
LNP组合物通常以含有LNP的药物组合物的形式施用。在药物组合物中，LNP可以溶解或悬浮于药学上可接受的载体中或与其混合，所述药学上可接受的载体可以是液体、半固体(例如，凝胶或蜡)或固体，如本领域众所周知的。短语“药学上可接受的”在本文中是指在合理医学判断的范围内适于施用于受试者的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在与制剂的其它成分相容并且对受试者而言在生理学上安全的意义上来讲，每种载体应是“可接受的”。根据施用模式，本领域已知的任何载体在本文中可能都是合适的。
药学上可接受的液体载体的一些实例包括醇(例如，乙醇)、二醇(例如，丙二醇和聚乙二醇)、多元醇(例如，甘油)、油(例如，矿物油或植物油)、石蜡和可接受的用于引入到哺乳动物体内的非质子极性溶剂(例如，二甲亚砜或N-甲基-2-吡咯烷酮)，其中的任何一种可以包括或可以不包括水性组分(例如，至少、大于、至多或少于10、20、30、40或50vol％的水)。药学上可接受的凝胶的一些实例包括长链聚亚烷基二醇和其共聚物(例如，泊咯沙姆(poloxamer))、纤维素和烷基纤维素物质(例如美国专利6,432,415中所描述的)和卡波姆(carbomer)。药学上可接受的蜡可以是或含有例如巴西棕榈蜡、白蜡、蜂蜡、单硬脂酸甘油酯、油酸甘油酯和/或石蜡。
在一些实施方式中，药物组合物仅含有LNP和一种或多种溶剂或载体。在其它实施方式中，药物组合物包括一种或多种另外的组分。另外的组分可以是例如pH缓冲剂、单糖或多糖(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖或葡聚糖)、防腐剂、电解质、表面活性剂或抗菌剂。如果期望，可以包括甜味剂、调味剂或着色剂。可以在标准药学文献中，例如在“雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”,《药学科学与实践(The Scienceand Practice of Pharmacy)》,第19版,美国宾夕法尼亚州伊斯顿市马克出版公司(MackPublishing Company,Easton,Pa.),1995中找到其它合适的赋形剂。
LNP组合物，通常呈药物组合物的形式，其中LNP与液体或固体药学上可接受的载体混合或悬浮于其中，可以通过任何合适的途径施用于受试者。LNP可以静脉内、口服、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或通过吸入施用。在特定实施方式中，LNP通过注射施用于受试者。在一些实施方式中，LNP递送到受试者的细胞。在一些实施方式中，LNP是通过从受试者中取出细胞，将脂质纳米颗粒施用于取出的细胞并且然后将取出的细胞重新引入到受试者体内来递送的。在一些实施方式中，LNP在体内直接注射，并在体内递送到宿主细胞中。在其它实施方式中，LNP离体转染到宿主细胞中，并且然后在体内输注所产生的细胞。
为了展示和描述本发明目前的最佳模式，下面阐述了实施例。然而，本发明的范围不以任何方式受到本文所阐述的实施例的限制。
实施例
实施例1.两性离子聚合物修饰的脂质(DMG-PCB或PCB脂质)的制备和表征
在此实施例中，在此描述了本发明的代表性两性离子聚合物修饰的脂质，DMG-PCB的制备和表征。图1中展示了DMG-PCB的结构和1H NMR谱。
DMG-N-BOC：在氮气气氛下将三乙醇胺(1.6mL，9.36mmol，1.2当量)添加到N-(2,3-二羟丙基)氨基甲酸叔丁酯(1.5g，7.8mmol，1当量)于干燥DCM(10mL)中的溶液中，并且将混合物在冰浴中冷却到0℃。将硬脂酰氯(2.83g，9.36mmol，1.2当量)溶解于20mL DCM中并且在30分钟内逐滴添加到溶液中。将反应在室温下搅拌过夜。用饱和NaHCO3(水溶液[a.q.])萃取反应混合物。分离有机层并用盐水洗涤，然后经MgSO4干燥、过滤并在真空下蒸发。通过快速色谱法将残余物进一步纯化以获得DMG-N-BOC(1.42g，40％)。
DMG-N：将DMG-N-BOC(100mg)溶解于5mL的DCM和5mL的TFA中。将反应在室温下搅拌3小时。然后在真空中去除溶剂以获得呈白色粉末的DMG-N。
CTA-DMG脂质：使DMG-N(100mg，0.16mmol)、2-(十二烷基硫代硫代羰基硫代)-2-甲基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(92.34mg，0.2mmol)和TEA(22.3μL，0.16mmol)于DCM(5mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空下浓缩，并通过快速色谱法纯化以获得CTA-DMG脂质。
DMG-PCB：在用于产生10kDa聚合物的典型可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合反应中，在25mL装配有搅拌棒的圆底烧瓶中将CTA-DMG脂质(100mg，0.142mmol)和CBAAM-l-tBu(1036.32mg，2.84mmol)、2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN，4.66mg，0.028mmol)溶解于无水二甲基甲酰胺(DMF，5mL)中。用橡胶垫片密封烧瓶并用氮气吹扫30分钟。将反应在65℃油浴下搅拌过夜。将所得聚合物在乙酯中沉淀三次，离心以收集沉淀物并且真空下干燥过夜以产生淡黄色粉末。为了去除三硫代碳酸酯基团聚合物(258.6mg)，将所得聚合物(258.6mg，0.05mmol)、EPHP(89.2mg，0.5mmol)和AIBN(3.3mg，0.02mmol)溶解于3mL的DMF中。将溶液在氮气中吹扫30分钟，并且在100℃下搅拌2小时。将产物沉淀于二乙醚中，离心并在真空下干燥以获得白色粉末。最终产物DMG-PCB是通过在室温下用三氟乙酸(TFA，5mL/100mg聚合物)使叔丁基脱保护4小时，随后在乙醚中沉淀并离心三次来获得的。将沉淀物在真空下干燥过夜，溶解于不含RNA酶的水中并透析两天。根据1H NMR(D2O)确定分子量(约12kDa)。
实施例2.含LNP的两性离子聚合物修饰的脂质(DMG-PCB或PCB脂质)的制备和体外表征。
在此实施例中，来自两种可商购获得的LNP制剂的DMG-PEG被来自实施例1的DMG-PCB替换以形成含PCB脂质的LNP(或PCB-LNP)。图2b中列出了PCB-LNP的体外转染效率。在透射电子显微镜(TEM)下观察到PCB-LNP的形态学，如图2a所示。下文描述了含mRNA治疗剂的PCB-LNP的制备。
DLin-MC3-DMA(MC3)购自Organixinc公司(Organixinc Inc)。1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)购自Cordenpharma公司(Cordenpharma Inc)。其它组分包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC，美国Avanti极性脂质公司(AvantiPolar Lipids,USA))、胆固醇(美国西格玛公司(Sigma,USA))和1,2-二棕榈酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2K，美国Avanti极性脂质公司)。根据实施例1合成含不同聚合物分子量(4kDa或7kDa)的DMG-PCB。
mRNA于PCB-LNP中的包封是通过将脂质组分和mRNA在微流控混合装置NanoAssemblr Ignite(精密纳米系统公司(Precision NanoSystems Inc.))中混合来制备的。分别研究了基于两种不同的可电离脂质的LNP制剂。对于基于MC3的LNP，脂质混合物的摩尔比为MC3:DSPC:胆固醇:X＝50:40:38.5:1.5，其中对于MC3-PEG，X为DMG-PEG2K，对于MC3-PCB4，X为DMG-PCB4K，并且对于MC3-PCB7，X为DMG-PCB7K。对于基于C12-200的LNP，脂质混合物的摩尔比为C12-200:DOPE:胆固醇:Y＝35:16:46.5:2.5，其中对于C12-PEG，Y为DMG-PEG2K，对于C12-PCB，Y为DMG-PCB4K。简而言之，将四种脂质组分溶解于乙醇中，并且分别将编码mRNA的萤火虫荧光素酶(Fluc)溶解于50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝3)中。然后，将水相和乙醇相以3:1的流速比率在微流控装置中混合。为了去除残余有机溶剂，在100-kDa离心过滤器(美国密理博西格玛公司(MilliporeSigma,USA))中用PBS洗涤所产生的LNP。
将LNP转染到HepG2(ATCC编号HB-8065)，并在转染后6小时分析荧光素酶表达。简而言之，将细胞以60-70％汇合度平板接种并在37℃下用5％ CO2在补充有10％胎牛血清(FBS)和1x青霉素-链霉素(Pen-Strep)的伊格尔氏最低必需培养基(Eagle's MinimumEssential Medium，EMEM)中温育。在转染期间，在图2b所指示的剂量下每孔添加RNA。在6小时转染之后，小心去除含LNP的培养基，并且用PBS轻轻冲洗细胞一次。遵循制造商的方案，使用荧光素酶测定(普洛麦格公司(Promega)目录号：E1501)测量荧光素酶表达。所有PCB-LNP示出了与其对应的PEG-LNP的转染效率相当的体外转染效率，表明DMG-PCB可以用于LNP中以将mRNA递送到细胞中。
实施例3.含LNP的两性离子聚合物修饰的脂质(DMG-PCB或PCB脂质)的体内递送
将来自实施例2的PCB-LNP调配物递送到小鼠以在全身性递送之后研究蛋白质表达的生物分布。
简而言之，通过眶后注射向6-8周龄的C57BL/6小鼠施用剂量为0.4mg/kg的携带Fluc-mRNA的LNP。在转染后6小时进行生物发光成像。向小鼠注射稀释于PBS中的150mg/kg的D-荧光素。使用Aura图像软件分析所有图像。如图3所示，所有PCB-LNP促进肝中更高的mRNA表达。mRNA的有效体内表达在两个不同的LNP系统中得到证实：一个系统使用MC3作为可电离脂质；另一个系统使用C12-200作为可电离脂质。因此，将这种超亲水性聚合物缀合的脂质并入到LNP中在体内转染中更有效地进行，表明DMG-PCB是DMG-PEG的可行替代方案。
实施例4.ZW-A-CBn(n＝1、2、3)的合成和表征。
在此实施例中，通过1H-NMR合成和表征ZW-A-CBn(n＝1、2、3)。图4和下文中展示了ZW-A-CBn的合成方法。
遵循Jayaraman和Hope条件(Jayaraman and Hope’s conditions)(《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》2012,51,8529-8533)合成化合物S1。将Mg屑用0.1M HCl新鲜激活，用水和丙酮洗涤并且在高真空下干燥。将Mg(680mg)添加到配备有磁力搅拌器、加料漏斗和回流冷凝器的三颈圆底烧瓶中。使烧瓶脱气并用2.3mL无水乙醚填充。将二亚油酰溴化物(7.50g)溶解于14mL醚中，然后在室温下立即将2mL的醚溶液添加到烧瓶中。将反应混合物搅拌2分钟，然后添加少量碘晶体。由碘产生的深棕色迅速消失，并且反应混合物开始回流。在5-10分钟内逐滴添加二亚油酰于醚中的溶液的其余部分，同时在温和回流下维持反应。在添加之后，将反应混合物保持在35℃水浴中3小时并且然后在冰浴中冷却。在0℃下逐滴添加甲酸乙酯(0.8mL，0.734g)，并使反应温热到室温。6小时后，添加NH4Cl溶液以淬灭反应。将溶液通过醚萃取(x3)，使用Na2SO4干燥并浓缩以产生呈黄色油的粗混合物。主要副产物被鉴定为S1的甲酸酯，因此将粗混合物溶解于10ml的KOH于乙醇中的饱和溶液中并搅拌过夜以水解副产物。然后将反应混合物用DCM稀释，用NH4Cl洗涤，浓缩，使用Na2SO4干燥，并且然后通过硅胶快速色谱法(1％至15％乙酸乙酯/己烷)纯化以产生呈淡黄色油的期望产物。产率：3.56g。
化合物S2：在氮气下向二颈圆底烧瓶中添加S1(2.00g)、4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]丁酸(0.87g)、DMAP(0.045g)和25mL DCM。将溶液冷却到0℃，然后逐滴添加5mL的DCC于DCM中的溶液。使反应温热到室温并且搅拌10小时。将溶液过滤，浓缩并通过硅胶快速色谱法使用0-10％乙酸乙酯/己烷纯化。产生2.658g无色油作为产物。
化合物S3：向50mL圆底烧瓶中添加S2(1.758g)和5mL 50v/v％TFA于DCM中的溶液。将反应在室温下搅拌1.5小时，然后浓缩。将粗品稀释于DCM中，用Na2SO4溶液洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。通过硅胶快速色谱法(2-15％ MeOH/DCM)纯化黄色油以产生1.02g淡黄色油。
化合物ZW-A-CB1：向2mL自动采样器小瓶中添加化合物S3(114mg)、溴乙酸叔丁酯(35.4mg)、K2CO3(80mg)、KI(4.3mg)和无水乙腈(0.3mL)与THF(0.1mL)的混合物。将混合物在室温下搅拌15小时，然后通过DCM稀释并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(5％-15％ MeCN/DCM)纯化以产生呈无色油的化合物1'。产率：61mg。将化合物1'(61mg)溶解于50v/v％TFA于DCM中的溶液中并在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩，然后通过硅胶快速色谱法使用5-20％ MeOH/DCM纯化以产生呈淡黄色油的化合物ZW-A-CB1。产率：53mg。图5中示出了化合物ZW-A-CB1的1H NMR(CDC13)。
化合物ZW-A-CB2：向2mL自动采样器小瓶中添加化合物S3(102mg)、丙烯酸(38.4mg)、N,N-二异丙基乙胺(2.4mg)和0.3mL的乙醇。将混合物在37℃下搅拌30小时，然后用DCM稀释，用水和盐水洗涤。将萃取物经Na2SO4干燥，过滤并通过硅胶快速柱色谱法(1％-20％含MeOH的DCM/乙酸乙酯1:1)纯化以产生呈淡黄色油的化合物ZW-A-CB2。产率：86mg。图6中示出了化合物ZW-A-CB2的1H NMR(CDC13)。
化合物ZW-A-CB3：向2mL自动采样器小瓶中添加化合物S3(99.4mg)、4-溴丁酸叔丁酯(46.8mg)、K2CO3(89.6mg)、KI(8mg)和无水乙腈(0.3mL)与THF(0.1mL)的混合物。将混合物在40℃下搅拌18小时，然后通过DCM稀释并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(1％-15％ MeCN/DCM)纯化以产生呈无色油的化合物3'。产率：95mg。将化合物3'(90mg)溶解于50v/v％TFA于DCM中的溶液中并在室温下搅拌3小时。将反应混合物浓缩，然后通过硅胶快速色谱法使用1-15％ MeOH/DCM纯化以产生呈粘性液体的化合物ZW-A-CB3。产率：54mg。图7中示出了化合物ZW-A-CB3的1H NMR(CDC13)。
除非另有说明，否则使用来自商业来源的试剂，而无需进一步纯化。除非另有说明，否则在N2或氩气气氛下进行所有反应。在Biotage Isolera系统上使用SiliCycleSiliaSep HP快速盒进行柱色谱法。使用Bruker或Varian 400或500MHz光谱仪记录NMR谱。所有1HNMR实验以δ为单位(百万分之一，ppm)报告并且相对于残余氯仿(7.26ppm)的信号在氘化溶剂进行测量。
实施例5.ZW-B-CBn(n＝1-3)的合成和表征
在此实施例中，合成ZW-B-CBn(n＝1、2、3)并在1H-NMR中表征。图8和下文中展示了ZW-B-CBn的合成方法。
8-溴辛酸壬-2-基酯(1)：向100mL圆底烧瓶中注入8-溴乙酸(2.00g)、壬-1-醇(2.59g)和20mL的二氯甲烷。用N2吹扫烧瓶，并且逐滴添加含1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(2.25g)和4-二甲基氨基吡啶(0.22g)的20mL二氯甲烷。将混合物在N2下搅拌18小时。添加水，并且用二氯甲烷萃取粗产物，用盐水洗涤并用硫酸钠干燥。通过硅胶柱色谱法使用二氯甲烷/己烷作为洗脱液来纯化产物。产率为2.36g(75％)。
8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(2)：向100mL圆底烧瓶中注入8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酸(1.04g)和十七烷-9-醇(1.13g)与20mL的二氯甲烷。用N2吹扫烧瓶，并且逐滴添加含1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(1.01g)和4-二甲基氨基吡啶(0.05g)的20mL二氯甲烷。将混合物在N2下搅拌20小时。添加水，并且用二氯甲烷萃取粗产物，用盐水洗涤并用硫酸钠干燥。通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/己烷作为洗脱液来纯化产物。产率为1.42g(72％)。
8-氨基辛酸十七烷-9-基酯(3)：向20mL小瓶中添加8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(0.13g)、2mL二氯甲烷和2mL三氟乙酸。将混合物搅拌3小时。在真空中去除挥发物之后，将粗产物溶解于乙酸乙酯中，用1N NaOH和盐水洗涤并且用硫酸钠干燥。产率为93.2mg(93％)。
8-((8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸壬基酯(4)：向火焰干燥的50mL Schlenk反应中注入经激活的分子筛(500mg)、氢氧化铯一水合物(188mg)和6mL无水二甲基甲酰胺。将反应在N2下搅拌10分钟。添加8-氨基辛酸十七烷-9-基酯(500mg)，并将混合物在N2下搅拌另外30分钟。然后向悬浮液中逐滴添加8-溴辛酸壬-2-基酯(483mg)，并且将反应在N2下搅拌24小时。将混合物过滤，倒入1N NaOH中，用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤并用硫酸钠干燥。通过硅胶柱色谱法使用甲醇/氯仿作为洗脱液来纯化产物。产率为705mg(84％)。
8-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)(8-(壬-2-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(5)：向1.5mL小瓶中添加含8-((8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸壬基酯(50mg)和丙烯酸叔丁酯(10.6mg)的0.5mL甲醇。将反应在N2下搅拌20小时。在真空中去除挥发物。产率为58mg(98％)。
3-((8-(壬氧基)-8-氧代辛基)(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)丙酸(6)：向1.5mL小瓶中添加8-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)(8-(壬-2-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(50mg)、0.5mL二氯甲烷和0.5mL三氟乙酸。将混合物搅拌3小时。在真空中去除挥发物，并且通过硅胶柱色谱法使用甲醇/二氯甲烷作为洗脱液来纯化产物。产率为45mg(94％)。图9中示出了3-((8-(壬氧基)-8-氧代辛基)(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)丙酸(6)的1H NMR谱。此化合物被称为ZW-B-CB2。
8-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)(8-(壬-2-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(7)：向火焰干燥的1.5mL小瓶中添加8-((8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸壬基酯(100mg)、溴乙酸叔丁酯(117mg)、N,N-二异丙基乙胺(97mg)和1mL无水二甲基甲酰胺。将反应在N2下搅拌24小时。将混合物倒入1N NaOH中，用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤并用硫酸钠干燥。通过硅胶柱色谱法使用甲醇/二氯甲烷/氨作为洗脱液来纯化产物。产率为92mg(79％)。
N-(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)-N-(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)甘氨酸(8)：向1.5mL小瓶中添加8-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)(8-(壬-2-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(50mg)、0.5mL二氯甲烷和0.5mL三氟乙酸。将混合物搅拌3小时。在真空中去除挥发物，并且通过硅胶柱色谱法使用甲醇/二氯甲烷作为洗脱液来纯化产物。产率为42mg(88％)。图10中示出了N-(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)-N-(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)甘氨酸(8)的1H NMR谱。此化合物被称为ZW-B-CB1。
8-((4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)(8-(壬-2-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(9)：向火焰干燥的1.5mL小瓶中添加8-((8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸壬基酯(100mg)、4-溴丁酸叔丁酯(134mg)、N,N-二异丙基乙胺(97mg)和1mL无水二甲基甲酰胺。将反应在N2下搅拌24小时。将混合物倒入1N NaOH中，用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤并用硫酸钠干燥。通过硅胶柱色谱法使用甲醇/二氯甲烷/氨作为洗脱液来纯化产物。产率为98mg(81％)。
4-((8-(壬氧基)-8-氧代辛基)(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)丁酸(10)：向1.5mL小瓶中添加8-((4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)(8-(壬-2-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(50mg)、0.5mL二氯甲烷和0.5mL三氟乙酸。将混合物搅拌3小时。在真空中去除挥发物，并且通过硅胶柱色谱法使用甲醇/二氯甲烷作为洗脱液来纯化产物。产率为44mg(93％)。图11中示出了4-((8-(壬氧基)-8-氧代辛基)(8-(十八烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)氨基)丁酸(10)的1H NMR谱。此化合物被称为ZW-B-CB3。
实施例6.ZW-A-SulfoAmid-3的合成和表征
在此实例中，合成ZW-A-SulfAmid-3并通过1H-NMR表征。图12和下文中展示了ZW-A-SulfAmid-3的合成方法。
S4：向50mL圆底烧瓶中添加化合物S1(600mg)、溴乙酸(178mg)、DMAP(6mg)和5mL的DCM。将混合物在冰浴中冷却，并且逐滴添加5mL的DCC溶液(178mg)。使反应温热到室温并且在12小时内搅拌，然后过滤，浓缩并通过硅胶快速色谱法(5％-30％DCM/己烷)纯化。获得呈无色油的化合物S4。产率：0.59g。
S5：向25mL圆底烧瓶中添加4-羟基苯磺酰胺(60.8mg)、K2CO3(43.4mg)和0.5mL的DMF。将混合物搅拌5分钟，然后添加1mL的S4(121mg)于DCM中的溶液。将反应混合物在35℃下在20小时内进行搅拌，然后用5mL DCM稀释并过滤。将滤液浓缩并通过硅胶快速色谱法(10％-40％乙酸乙酯/己烯)纯化以产生呈无色油的S5。产率：102mg。
ZW-A-SulfAmid-3：向20mL小瓶中添加S5(100mg)、3-羧基-N,N,N-三甲基丙-1-铵氯化物(48mg)、N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(75mg)、DMAP(32mg)、三乙胺(55μL)和2mL的DMF。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后通过硅胶快速色谱法(5％-50％MeOH/DCM)纯化以产生呈淡黄色固体的标题化合物。产率：55mg。图13中示出了化合物ZW-A-SulfAmid-3的1HNMR(CDC13)。
实施例7.含ZW-B-CB2的PCB-LNP(非PEG制剂)的制备和体外表征
在此实施例中，根据实施例5合成的ZW-B-CB2以不同比率并入实施例2中所述的PCB-LNP以替换MC3。其它组分包括DSPC、胆固醇和DMG-PCB4K。图14中列出了每种组分的摩尔比。
将脂质溶解于乙醇中，并且将mRNA溶解于50mM柠檬酸缓冲液(pH3)中。mRNA于LNP中的包封是通过以1:3(乙醇:水溶液，v/v％)比率混合两相，同时剧烈搅拌来制备的。将制剂在透析盒中相对于PBS(pH 7.4)透析至少10小时，通过穿过0.22-μm过滤器浓缩，并且储存在4℃下直到使用为止。
进行包封编码Fluc的mRNA的LNP的体外转染以评价制剂的转染效率。简而言之，将LNP转染到HepG2(ATCC编号HB-8065)，并在转染后6小时分析荧光素酶表达。实例2中描述了细胞培养条件。在转染期间，向每孔添加100ng RNA，重复三份。在6小时转染之后，小心去除含LNP的培养基，并且用PBS轻轻冲洗细胞一次。遵循制造商的方案，使用荧光素酶测定(普洛麦格公司目录号：E1501)测量荧光素酶表达。
实施例8.含ZW-B-CBn(n＝1-3)的PCB-LNP(非PEG制剂)的体内多次全身性递送
已经在多次注射LNP的病例中报道了加速血液清除(ABC)效应，其中在后续注射中观察到LNP的快速清除。ABC效应主要是由针对LNP的脂质组分产生的抗体引起的，据报道LNP具有免疫原性。在此实施例中，来自实施例7的含ZW-B-CBn的PCB-LNP用于研究LNP的ABC效应。来自实施例2的基于MC3的PEG-LNP用作对照。图15b中列出了每种制剂的组成。
对于体内药代动力学(PK)研究，向3～4周龄的雄性C57BL/6J小鼠分三组以5μgmRNA的剂量静脉内注射mRNA-LNP。进行两个不同的注射群组。(图15a)在群组1中，仅给予一剂量的hEPO-mRNA(人促红细胞生成素mRNA)。在群组2中，前两次注射给药Fluc-mRNA(萤火虫荧光素酶mRNA)，并且最后一次注射给药hEPO-mRNA。(图15a)群组2的设计方式使得消除由前两次注射诱导的抗hEPO免疫应答，并且由此第三次注射中的hEPO的PK谱主要表明由LNP组分引起的ABC效应。为了确定hEPO的PK谱，在注射后6小时、24小时采集小鼠血清，并且使用ELISA(DuoSet，hEPO ELISA试剂盒，R&D)进行分析。
如图15c所示，与MC3制剂相比，含PCB和ZW-B-CB1/ZW-B-CB2的LNP示出了在注射群组2中的较小的ABC效应。结果表明，具有ZW-B-CBn的PCB-LNP诱导的ABC效应降低，并且因此免疫原性较低。
实施例9.含ZW-B-CB2和靶向磷酸丝氨酸(PS)脂质的PCB-LNP(非PEG制剂)的体内全身性递送
在此实施例中，将带负电荷的磷脂，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸(DOPS)并入到实施例7中所述的PCB-LNP制剂中。简而言之，MC3:ZW-B-CB2:DSPC:胆固醇:DMG-PCB4k:DOPS的摩尔比等于20:30:10:38.5:1.5:5。具有DOPS的制剂被称为PS-PCB-mLNP(即，含ZW-B-CB2和PS脂质的PCB-LNP)，而不具有DOPS的制剂被称为PCB-mLNP(即，含ZW-B-CB2脂质的PCB-LNP)作为对照。将脂质混合物和mRNA水溶液在如实施例2中所述的微流控通道中快速混合，并且然后用PBS洗涤以产生最终产物。DOPS用作非阳离子脂质以靶向次级淋巴器官(SLO)。
为了研究体内蛋白质表达，将携带编码Fluc的mRNA的PS-PCB-mLNP通过静脉内注射递送到小鼠。如上所述，使用IVIS在施用后6小时拍摄生物发光图像。如图16所示，IVIS图像示出了从肝向脾和浅表淋巴结偏移的mRNA表达。在对照组中，对于不具有靶向脂质DOPS的PCB-mLNP，Fluc表达主要在肝中发生。因此，DOPS的并入使脾和淋巴结中的蛋白质表达更多，表明对这些SLO的靶向效应。结果表明，作为有前途的平台，PS-PCB-mLNP用于在体内mRNA递送到SLO，用于各种应用，包括免疫疗法和疫苗。
实施例10.含ZW-B-CBn(n＝1-3)的PEG LNP(PEG制剂)的制备和体外表征
据报道，可电离脂质，即LNP中的主要组分(或表示为PEG LNP以区分PEG脂质被PCB脂质替换的PCB LNP)具有免疫原性。为了降低免疫原性，可电离脂质部分地被从实施例6中获得的ZW-B-CBn取代以产生制剂。简而言之，测试了改变不同辅助脂质的三种条件：1)DSPC；2)DOPE；以及3)无辅助脂质。对于条件1和2，LNP由以下脂质构成：摩尔比为50:10:38.5:1.5的MC3+ZW-B-CBn、DSPC或DOPE、胆固醇和DMG-PEG2k。对于条件3，LNP由以下脂质构成：摩尔比为50:38.5:1.5的MC3+ZW-B-CBn、胆固醇和DMG-PEG2k。图17和图18中示出了体外转染结果。下文中描述了LNP的制备和体外转染。
将脂质以指定的摩尔比溶解于乙醇中，并且将mRNA溶解于20mM乙酸钠缓冲液(pH5)或20mM柠檬酸缓冲液(pH 3)中。为了产生LNP，将乙醇和水溶液以1:3(乙醇:水溶液)的比率快速混合，同时剧烈搅拌。将制剂在透析盒中相对于PBS(pH 7.4)透析至少10小时，通过穿过0.22-μm过滤器浓缩，并且储存在4℃下直到使用为止。测试所有制剂的粒度和RNA包封。
进行包封编码Fluc的mRNA的LNP的体外转染以评价制剂的转染效率。简而言之，将LNP转染到HepG2(ATCC编号HB-8065)，并在转染后6小时分析荧光素酶表达。实施例2中描述了细胞培养条件。在转染期间，向每孔添加100ng RNA，重复三份。在6小时转染之后，小心去除含LNP的培养基，并且用PBS轻轻冲洗细胞一次。遵循制造商的方案，使用荧光素酶测定(普洛麦格公司目录号：E1501)测量荧光素酶表达。
实施例11.含作为靶向脂质的PS脂质的PEG LNP(PEG制剂)的制备和体外表征
在此实施例中，将带负电荷的磷脂，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸(DOPS)并入到基于MC3的制剂中以产生PS5-LNP。简而言之，PS5-LNP是使用实施例2所述的微流控通道产生的，所述微流控通道含有摩尔比为50:10:38.5:1.5:5的MC3、DSPC、胆固醇、DMG-PEG2k和DOPS。不具有DOPS的LNP用作对照(PS0-LNP)。
PS5-LNP和PS0-LNP两者包封编码萤火虫荧光素酶(Fluc)的mRNA并且转染到HepG2(ATCC编号HB-8065)和Raw264.7((ATCC编号TIB-71)以评价体外转染效率。对于细胞培养条件，将HepG2在37℃下用5％ CO2维持在补充有10％胎牛血清(FBS)和1x青霉素-链霉素(Pen-Strep)的伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)中。类似地，将Raw264.7在相同培养条件下维持在补充有10％ FBS和1x Pen-Strep的杜尔贝科氏改良型伊格尔氏培养基(DMEM)中。为了将LNP转染到细胞中，将不同量的RNA(如图所示)添加到在以60-70％汇合度接种的96孔板中平板接种的细胞中。在6小时转染之后，小心去除含PS-LNP的培养基，并且用PBS轻轻冲洗细胞一次。添加30μL被动裂解缓冲液(普洛麦格公司目录号：E1941)以裂解细胞，并且每孔添加100μL D-荧光素底物(普洛麦格公司目录号：E1501)。在添加底物之后，立即使用Cytation 5微孔板酶标仪(美国伯腾公司(Biotek,USA))在白色不透明板上测量发光强度。如图19所示，PS5-LNP在肝细胞系HepG2(图19a)和单核细胞/巨噬细胞系RAW264.7(图19b)两者中均具有转染效率。此外，与PS0-LNP相比，PS5-LNP在单核细胞/巨噬细胞中示出更高的mRNA表达水平，而在肝细胞中示出低得多的表达水平。此外，PS5-LNP在初级小鼠脾细胞中的转染效率也较高(图19c)。这些细胞中的蛋白质表达的差异表明，PS5-LNP有可能选择性地将mRNA递送到免疫细胞，而不是肝细胞。
体外研究的发现在体内得到证实。PS5-LNP和PS0-LNP两者包封编码萤火虫荧光素酶(Fluc)的mRNA，并且通过眶后注射递送到C57BL/6小鼠(0.2mg/kg)。施用后6小时，对小鼠实施安乐死，并且分离不同器官以分析mRNA表达水平。对于PS5-LNP，在颈淋巴结和脾中发现总生物发光信号的40％。相反，对于对照组PS0-LNP，在肝中发现大于90％的生物发光信号，而在淋巴结和脾中发现很少生物发光信号(图19d)。结果清楚地表明，在并入DOPS后，生物分布向SLO偏移。值得注意的是，在不牺牲整体转染效率的情况下，将PS靶标添加到淋巴结和脾，而许多其它报道称带负电荷的脂质降低颗粒的转染效率。
实施例12-预示性实施例。组分减少的PCB-LNP的制备和表征
将产生胆固醇量降低的PCB-LNP文库。如表1所示，胆固醇比率的范围将为0至38.5mol％，并且对应地，DMG-PCB的范围将为1.5至40mol％。如实例2所述，可电离脂质(50mol％)和辅助脂质(10mol％)的量保持不变。
表1.胆固醇减少的PCB-LNP的实验设计
编号 胆固醇(mol％) DMG-PCB(mol％)
1 0 40
2 10 30
3 20 30
4 30 10
5 38.5 1.5
每种制剂将遵循实施例2中所述的相同程序制备。将对每种制剂的尺寸、ζ电位和包封效率进行表征。对于功效测试，将在体外转染每种制剂，以评估转染效率。具体地，编码萤火虫荧光素酶(Fluc)的mRNA将分别被每种制剂包封。将HEK 293T(ATCC，CRL-11268)在100μL培养基(具有10％ FBS的DMEM)中以4x 104个细胞/孔接种于96孔板中，并在37℃下使用5％ CO2附着过夜。然后，向培养基中添加5μL装载Fluc mRNA的LNP并温育6小时。每种调配物将具有五个复制品，并且将添加PBS作为阴性对照。转染后，将小心地取出培养基，并且将使用荧光素酶测定系统评价Fluc的表达。
此外，最佳制剂将递送到小鼠体内以评价体内表达和生物分布。具体地，将装载Fluc mRNA的LNP(1mg/kg mRNA)注射到6～7周龄的雄性C57BL/6J小鼠体内。转染6小时后，将向小鼠腹膜内注射D-荧光素(30mg/mL于PBS中)。10分钟后，将处死小鼠，并且将采集八个器官(肝、脾、肾、肺和脾脏)。将使用光学成像系统分析器官的发光，并使用合适的软件进行定量，以便以光子/秒为单位测量每个器官的辐射。
实施例13-预示性实施例。具有或不具有PC部分的LNP的制备和表征
在此实施例中，将产生使用不具有PC部分的分子的制剂，以解决PC部分的免疫原性。(图20)在不具有PC部分的一种调配物中，LNP的四种组分包括可电离脂质、DMG-CB1、胆固醇和DMG-PCB。将根据实施例1产生DMG-CB1，其中CB将附着到DMG-N上，以替换来自先前制剂的辅助脂质DSPC。在具有PC部分的制剂中，LNP的四种组分包括可电离脂质、DSPC、胆固醇和DSPE-PCB。DSPE-PCB将遵循参考产生(Z.Cao,L.Zhang和S.Jiang,超亲水性两性离子聚合物稳定脂质体(Superhydrophilic Zwitterionic Polymers Stabilize Liposomes),Langmuir,28,11625,2012)。
每种调配物将遵循实施例2中所述的相同程序制备。将对每种制剂的尺寸、ζ电位和包封效率进行表征。对于功效测试，将在体外转染每种制剂，以评估转染效率。具体地，编码萤火虫荧光素酶(Fluc)的mRNA将分别被每种制剂包封。将HEK 293T(ATCC，CRL-11268)在100μL培养基(具有10％ FBS的DMEM)中以2x 104个细胞/孔接种于96孔板中，并在37℃下使用5％ CO2附着过夜。然后，向培养基中添加5μL装载Fluc mRNA的LNP并温育6小时。每种制剂将具有五个复制品，并且将添加PBS作为阴性对照。转染后，将小心地取出培养基，并且将使用荧光素酶测定系统评价Fluc的表达。
此外，最佳制剂将递送到小鼠体内以评价体内表达和生物分布。具体地，将装载Fluc mRNA的LNP(1mg/kg mRNA)注射到6～7周龄的雄性C57BL/6J小鼠体内。转染6小时后，将向小鼠腹膜内注射D-荧光素(30mg/mL于PBS中)。10分钟后，将处死小鼠，并且将采集八个器官(肝、脾、肾、肺和心脏)。将使用光学成像系统分析器官的发光，并使用合适的软件进行定量，以便以光子/秒为单位测量每个器官的辐射。
实施例14-预示性实施例。脂质组分的结合
如图21所示，任何脂质组分(两性离子聚合物修饰的脂质、阳离子脂质、非阳离子脂质和胆固醇或其衍生物)可以与任何其它组分化学结合以实现上述组合物和方法。
虽然已经示出和描述了目前被认为是本发明的优选实施方式的内容，但本领域技术人员可以在所附权利要求所定义的本发明的范围内进行各种更改和修改。

Claims (64)

1.一种脂质纳米颗粒组合物，其包含：
(i)至少一种含两性离子聚合物的脂质，其中脂质部分与两性离子聚合物共价连接；
(ii)至少一种非阳离子脂质，所述至少一种非阳离子脂质选自带电荷和不带电荷的脂质，其中所述非阳离子脂质不与聚合物连接；
(iii)至少一种阳离子或可电离脂质，所述至少一种阳离子或可电离脂质含有仲氨基、叔氨基或季氨基；以及
(iv)至少一种治疗物质。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(i)中的所述脂质部分是二酰基甘油酯。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(i)不包含聚环氧烷区段。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(i)中的所述两性离子聚合物选自由以下组成的组：聚(羧基甜菜碱)(PCB)、聚(磺基甜菜碱)、聚(磷酸酯甜菜碱)、聚(磷脂酰胆碱)、含谷氨酸-赖氨酸(EK)的多肽、聚(三甲胺N-氧化物)聚合物和聚(两性离子磷脂酰丝氨酸)。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(i)中的所述两性离子聚合物是甜菜碱聚合物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述甜菜碱聚合物是聚(羧基甜菜碱)、聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酸酯甜菜碱)聚合物。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(ii)中的所述非阳离子脂质含有两性离子部分。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述两性离子部分选自由以下组成的组：磷酸酯甜菜碱、磷脂酰胆碱、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、三甲胺N-氧化物、含谷氨酸-赖氨酸(EK)的肽或两性离子磷脂酰丝氨酸部分。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基-磷酰乙醇胺、16-O-二甲基-磷酰乙醇胺、18-1-反式-磷酰乙醇胺、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰-sn甘油-3-磷酰乙醇胺(transDOPE)。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(ii)不包含聚环氧烷区段。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(ii)中的所述非阳离子脂质是磷脂。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述磷脂是磷脂酰丝氨酸脂质。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(iii)中的所述阳离子或可电离脂质具有仲氨基、叔氨基或季氨基。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(iii)中的所述阳离子或可电离脂质具有仲氨基、叔氨基或季氨基以及在生理学条件下带负电荷的官能团。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述阳离子或可电离脂质包含：
其中：
R1/R2＝H或烷基，并且其中所述烷基可是饱和的、不饱和的、支链的和/或非支链的，并且可进一步包含一个或多个杂原子，所述一个或多个杂原子包括但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F；
L包含位于N与A之间的共价接头基团，其中所述共价接头基团可包含以下中的一个或多个：-CH2-、-CH2CH(OH)-、-CH2CHClCH2-、-CH2OCH2-、-CH2SCH2-、-CH2SSCH2-、-CH2COOCH2-、C、H，并且可进一步包含一个或多个杂原子，所述一个或多个杂原子包括但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F；并且
A-(X)n是在某些pH条件下带负电荷的官能团，并且可包括：
(i)A(X)n是羧酸基团(A＝-COOH并且n＝0)；或者
(ii)A(X)n是磷酸根，其中A＝
并且n＝1。X＝H或烷基，所述烷基是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的、全碳或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F；或者
(iii)A(X)n是磺酸基团，其中A＝
并且n＝0
(iv)A(X)n是磺酰胺基团，其中A＝
并且n＝1，X＝H或烷基，所述烷基是饱和的或不饱和的、支链的或非支链的、全碳和氢或含有杂原子，所述杂原子如但不限于N、O、F、Si、P、S、Cl、Br和F。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述官能团选自由以下组成的组：
并且
其中n＝1至10。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(iii)中的所述阳离子或可电离脂质不包含聚环氧烷区段。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含：(v)胆固醇或其衍生物。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中组分(iv)中的所述治疗物质是核酸分子。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述核酸分子是RNA。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述RNA是mRNA。
22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述RNA是病毒mRNA。
23.根据权利要求20所述的组合物，其中所述RNA选自由以下组成的组：信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、CRISPR相关RNA、Cas核酸酶mRNA、向导RNA、单向导RNA和其组合。
24.根据权利要求20所述的组合物，其中所述治疗物质是病毒的刺突蛋白。
25.一种向受试者递送治疗物质的方法，所述方法包括向所述受试者施用脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物包含：
(i)至少一种含两性离子聚合物的脂质，其中脂质部分与两性离子聚合物共价连接；
(ii)至少一种非阳离子脂质，所述至少一种非阳离子脂质选自带电荷和不带电荷的脂质，其中所述非阳离子脂质不与聚合物连接；
(iii)至少一种阳离子或可电离脂质，所述至少一种阳离子或可电离脂质含有仲氨基、叔氨基或季氨基；以及
(iv)至少一种治疗物质。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒组合物被递送到所述受试者的细胞中。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗物质是核酸分子，并且其施用引起所述受试者的基因疗法。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗物质是核酸分子，并且其施用引起所述受试者的疫苗接种。
29.根据权利要求25所述的方法，其中组分(i)中的所述脂质部分是二酰基甘油酯。
30.根据权利要求25所述的方法，其中组分(i)不包含聚环氧烷区段。
31.根据权利要求25所述的方法，其中组分(i)中的所述两性离子聚合物选自由以下组成的组：聚(羧基甜菜碱)(PCB)、聚(磺基甜菜碱)、聚(两性离子磷酸酯甜菜碱)、含谷氨酸-赖氨酸(EK)的多肽、聚(磷脂酰胆碱)和聚(三甲胺N-氧化物)聚合物。
32.根据权利要求25所述的方法，其中组分(i)中的所述两性离子聚合物是甜菜碱聚合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述甜菜碱聚合物是羧基甜菜碱聚合物。
34.根据权利要求25所述的方法，其中组分(ii)中的所述非阳离子脂质含有两性离子部分。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述两性离子部分选自由以下组成的组：磷酸酯甜菜碱、磷脂酰胆碱、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、三甲胺N-氧化物、含谷氨酸-赖氨酸(EK)的肽或两性离子磷脂酰丝氨酸部分。
36.根据权利要求25所述的方法，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基-磷酰乙醇胺、16-O-二甲基-磷酰乙醇胺、18-1-反式-磷酰乙醇胺、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰-sn甘油-3-磷酰乙醇胺(transDOPE)。
37.根据权利要求25所述的方法，其中组分(ii)不包含聚环氧烷区段。
38.根据权利要求25所述的方法，其中组分(ii)中的所述非阳离子脂质是磷脂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述磷脂是磷脂酰丝氨酸脂质。
40.根据权利要求25所述的方法，其中所述阳离子或可电离脂质具有仲氨基、叔氨基或季氨基。
41.根据权利要求25所述的方法，其中所述阳离子或可电离脂质不包含聚环氧烷区段。
42.根据权利要求25所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含：(v)胆固醇或其衍生物。
43.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗物质是核酸分子。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述核酸分子是RNA。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述RNA选自由以下组成的组：信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、病毒mRNA、CRISPR RNA、Cas核酸酶mRNA、向导RNA、单向导RNA和其组合。
47.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗物质是病毒的刺突蛋白。
48.一种脂质组合物，其含有脂质部分，所述脂质部分与仲氨基、叔氨基或季氨基以及官能团连接，其中所述官能团在生理学条件下带负电荷。
49.一种脂质组合物，其包含权利要求15的脂质部分。
50.一种脂质组合物，其包含权利要求16的脂质部分。
51.一种用于向受试者的次级淋巴器官(SLO)靶向递送治疗剂的方法，所述方法包括：
获得根据权利要求1至24中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含含磷酰丝氨酸的脂质(PS)；以及
向所述受试者施用有效量的所述脂质纳米颗粒组合物，
其中所述治疗剂被靶向到所述受试者的次级淋巴器官(SLO)。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述治疗剂包含核酸分子。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述含磷酰丝氨酸的脂质选自由以下组成的组：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸(DOPS)、天然存在的PS-脂质、L-α-磷脂酰丝氨酸和/或两性离子PS-脂质。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述SLO选自脾和淋巴结。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述治疗剂的所述靶向递送执行癌症免疫疗法、自身免疫性疾病免疫疗法、疫苗接种和/或基因编辑。
56.一种用于向受试者的巨噬细胞靶向递送治疗剂的方法，所述方法包括：
获得根据权利要求1至24中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含含磷酰丝氨酸的脂质(PS)；以及
向所述受试者施用有效量的所述脂质纳米颗粒组合物，
其中所述治疗剂被靶向到所述受试者的巨噬细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗剂包含核酸分子。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述含磷酸丝氨酸的脂质选自由以下组成的组：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸(DOPS)、天然存在的PS-脂质、L-α-磷脂酰丝氨酸和/或两性离子PS-脂质。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗剂被靶向到所述受试者的巨噬细胞，由此进一步将所述治疗剂靶向到脾和/或淋巴结。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗剂的所述靶向递送执行癌症免疫疗法、自身免疫性疾病免疫疗法、疫苗接种和/或基因编辑。
61.一种用于向受试者的次级淋巴器官(SLO)靶向递送治疗剂的方法，所述方法包括：
获得脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含含磷酰丝氨酸的脂质(PS)；以及
向所述受试者施用有效量的所述脂质纳米颗粒组合物，
其中所述治疗剂被靶向到所述受试者的次级淋巴器官(SLO)。
62.一种用于向受试者的次级淋巴器官(SLO)靶向递送治疗剂的方法，所述方法包括：
获得根据权利要求48至50中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含含磷酰丝氨酸的脂质(PS)；以及
向所述受试者施用有效量的所述脂质纳米颗粒组合物，
其中所述治疗剂被靶向到所述受试者的次级淋巴器官(SLO)。
63.一种用于向受试者的巨噬细胞靶向递送治疗剂的方法，所述方法包括：
获得脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含含磷酰丝氨酸的脂质(PS)；以及
向所述受试者施用有效量的所述脂质纳米颗粒组合物，
其中所述治疗剂被靶向到所述受试者的巨噬细胞。
64.一种用于向受试者的巨噬细胞靶向递送治疗剂的方法，所述方法包括：
获得根据权利要求48至50中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物进一步包含含磷酰丝氨酸的脂质(PS)；以及
向所述受试者施用有效量的所述脂质纳米颗粒组合物，
其中所述治疗剂被靶向到所述受试者的巨噬细胞。
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