CN100379404C - 用于减少脂质体诱导的补体激活的脂质体组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了当体内给予含有包载治疗剂的脂质体制剂时减少补体激活的方法。该方法提供了具有聚乙二醇衍生的中性脂质聚合物的脂质体。

Description

用于减少脂质体诱导的补体激活的脂质体组合物

技术领域

本发明涉及用于体内降低脂质体诱导的补体激活的脂质体组合物。

发明背景

脂质体用于多种治疗目的，特别是用于通过系统给予这些治疗剂的脂质体制剂将这些治疗剂携带到靶细胞。脂质体-药物制剂提供潜在的改善的药物递送性质，如药物控制释放。脂质体从注射位置到达目标区域、细胞或位置通常需要长的循环时间。因此，当脂质体进行系统给药时，期望使用无相互作用剂为脂质体包衣，例如亲水聚合物链如聚乙二醇的包衣，以延长脂质体的血液循环持续时间。这种表面改性的脂质体通常称为“长循环”或“空间稳定化”脂质体。最常见的表面改性是为构成脂质体的约5摩尔％的脂类连接典型地具有1000-5000分子量的PEG链。参见例如Lasic，D.和Martin，F.，编辑，“STEALTHLIPOSOMES”，CRC出版社，Boca Raton，FL，1995第108-100页，及其中的参考文献。这种脂质体表现出来的药代动力学的特征在于，与易于迅速地从血液除去并在肝脏和脾脏中积聚的非表面改性的脂质体相比(ld.)，非剂量依赖性地减少肝脏和脾脏(通过单核吞噬细胞系统、或MPS)摄入脂质体，并显著延长血液循环时间。

最通常使用和市售的PEG取代的磷脂基于磷脂酰乙醇胺，通常为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，其在极性头基带负电荷。脂质体中的负表面电荷在某些方面不利，如在与细胞的相互作用中(参见例如Miller，C.M.等人，Biochemistry，37：12875-12883(1998))、和阳离子药物的递送，其中可能发生药物渗漏(参见例如Webb，M.S.等人，Biochim.Biophys.Acta，1372：272-282(1998))。

在某些个体中，某些脂质体组合物的体内给药产生的一个公认的问题是诱导补体激活(Laverman，P.等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，18(6)：551(2001)；Szebeni，J.等人，Am.J.Physiol Heart Circ.Physio.，279：H1319(2000)；Szebeni，J.等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，15(1)：57(1998))。补体系统是免疫系统体液分支的主要效应物，并且包括近三十种血清和膜蛋白。在初始活化之后，多种补体组分以高度受控的酶促级联方式相互作用，生成反应产物，所述反应产物有助于清除抗原和产生炎性应答。有两个补体激活途径：经典途径和替代途径。两个途径共用一个末端反应序列，其产生大分子的膜攻击复合体(MAC)，其可溶解多种细胞、细菌、和病毒(Kuby，Janis，IMMUNOLOGY，W.H.Freeman and Company，第14章，1997)。

补体反应产物放大最初的抗原-抗体反应并将该反应转化为更有效的防御。在补体激活过程中释放的多种小的可扩散反应产物诱导局部血管舒张并趋化性地吸引吞噬细胞，引起炎性反应。当抗原被补体反应产物覆盖时，其更容易被带有用于这些补体产物的受体的吞噬细胞所吞噬(Kuby，Janis，IMMUNOLOGY，W.H.Freeman  andCompany，第14章，1997)。

已经报导了补体激活在由体内给予脂质体制剂所引起的心血管窘迫中的因果作用，所述脂质体制剂如市售的聚乙二醇化的脂质体阿霉素制剂(Doxil^，Caelyx^)和用于克罗恩结肠炎的闪烁扫描诊断的聚乙二醇化的脂质体制剂HYNIC-PEG(Szebeni，J.等人，Am.J.PhysiolHeart Circ.Physiol.，279：H1319(2000)；Szebeni，J.等人，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，15(1)：57(1998)；SzebeniJ.等人，J.Liposome Res.，12(1&2)：165(2002))。这些制剂输液引起的症状包括心肺窘迫如呼吸困难、呼吸急促、高血压和/或低血压、胸痛、背痛、潮红、头痛、和寒战(Szebeni，J.等人，Am.J.Physiol HeartCirc.Physiol.，279：H1319(2000))。

脂质体诱导的补体激活随多种因素变化，还没有弄清楚哪些因素或因素组合是主要诱因。脂质体诱导的补体激活似乎随脂质饱和度、胆固醇含量、带电磷脂的存在、和脂质体大小的变化而变化(Bradley，A.J.，Archives of Biochem.and Biophys.，357(2)：185(1998))。

期望提供降低体内给予时补体激活应答的脂质体制剂。

发明概述

一方面，本发明提供了当体内给予含有包载治疗剂的脂质体时降低脂质体诱导的补体激活的方法。该方法包括提供包含成囊脂质和1-10摩尔％、更优选1-5摩尔％的下式的中性脂质聚合物的脂质体和余量的成囊脂质：

其中R¹和R²各自为具有8到24个碳原子的烷基或链烯基链；n＝10-300，Z为选自C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃烷基醚、N-甲基酰胺、二甲基酰胺、甲基碳酸酯、二甲基碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、N-甲基乙酰胺、羟基、苄氧基、羧酸酯、和C₁-C₃烷基或芳基碳酸酯的惰性端基，L选自(i)-X-(C＝O)-Y-CH₂-、(ii)-X-(C＝O)-、和(iii)-X-CH₂-，其中X和Y独立地选自氧、NH、和直接键，条件是当L为-X-(C＝O)-时，X不是NH。

在一个实施方案中，X为氧，Y为氮。

在另一个实施方案中，L为氨基甲酸酯键、酯键、或碳酸酯键。在其它实施方案中，L为-O-(C＝O)-NH-CH₂-(氨基甲酸酯键)。

在一个实施方案中，Z为羟基或甲氧基。

在优选实施方案中，中性脂质聚合物是二硬脂酰基(氨基甲酸酯连接的)聚乙二醇或甲氧基-聚乙二醇1，2二硬脂酰基甘油。

在另一个实施方案中，R¹和R²各自为具有8到24个碳原子的无支链的烷基或链烯基链。在优选实施方案中，R¹和R²各自为C₁₇H₃₅。

在另一个实施方案中，n为约20到约115。

在一个实施方案中，治疗药物为化疗剂。示例性的药物包括蒽环类抗生素如阿霉素、柔红霉素、表柔比星、和伊达比星。其它示例性的药物包括含铂化合物，如顺铂或选自以下的顺铂类似物：卡铂、奥马铂、奥沙利铂、((-)-(R)-2-氨基甲基吡咯烷(1，1-环丁烷二羧基合))铂、折尼铂、恩洛铂、洛铂、(SP-4-3(R)-1，1-环丁烷-二羧基合(2-)-(2-甲基-1，4-丁二胺-N，N′))铂、奈达铂、和双乙酸基合-氨络物-二氯-环己胺-铂(IV)。

在结合附图阅读以下本发明的详细说明之后可以更透彻地理解本发明的这些及其它目的和特征。

附图简述

图1表示制备本文称为PEG-DS的氨基甲酸酯连接的不带电荷的脂质聚合物的合成图解；

图2A-2D表示制备醚、酯、酰胺、和酮基连接的不带电荷的脂质聚合物的合成图解；

图3A-3C为表示包含3摩尔％PEG-DS(图3A)、5摩尔％PEG-DSPE(图3B)、或5摩尔％PEG-DS(图3C)的HSPC/Chol脂质体在血液、肝脏、和脾脏中的生物分布图；

图4为表示不包含PEG脂质(十字形)、包含5摩尔％PEG-DSPE(三角形)、或5摩尔％PEG-DS(圆形)的氢化大豆卵磷脂脂质体在血液中的保留图；

图5表示制备衍生自天然磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油的中性-两性离子型mPEG-脂质共轭物的合成图解；

图6表示通过SC5b-9诱导法测量制剂1、3、4、5、6、8、9、和10的体外人血清中补体激活的诱导，表示为通过磷酸盐缓冲盐水(PBS)的SC5b-9诱导百分比。

发明的详细说明

定义

如本文中使用的，“中性的”脂质体聚合物是不带电荷的、没有净电荷，即，即使有电荷也是正负电荷等量的。

“成囊脂质”是指具有疏水性和极性头基部分的两性脂质，并且其可以在水中自发地形成双分子层囊如磷脂，或者被稳定地结合到脂质双分子层中，其疏水性部分与双分子层膜内部(疏水性区域)接触，极性头基部分定向朝向外部(膜的极性表面)。这种类型的成囊脂质典型地包括一个或两个疏水性酰基烃链或类固醇基团，并且可以在极性头基处包含化学活性基团，如胺、酸、酯、醛、或醇。这一类成囊脂质包括磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、和鞘磷脂(SM)，其中两个烃链的长度典型为约14-22个碳原子，并且具有不同的不饱和度。其它成囊脂质包括糖脂，如脑苷脂和神经节苷脂；和固醇，如胆固醇。对于本文中描述的组合物，优选组分为本文中所述的磷脂如PC和PE、胆固醇、和中性脂质聚合物。

“烷基”是指包含碳和氢的完全饱和的单价基团，其可为支链或直链形式。烷基例子为甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基、和异丙基。“低级烷基”是指具有1-6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、正戊基、和异戊基。

“链烯基”是指包含碳和氢的单价基团，其可为支链或直链，并且其包含一个或多个双键。

缩写：PEG：聚乙二醇；mPEG：甲氧基封端的聚乙二醇；Chol：胆固醇；PC：磷脂酰胆碱；PHPC：部分氢化的磷脂酰胆碱；PHEPC：部分氢化的卵磷脂酰胆碱；HSPC：氢化的大豆磷脂酰胆碱；DSPE：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；DSP或PEG-DS：二硬脂酰(氨基甲酸酯连接的)PEG；APD：1-氨基-2，3-丙二醇；DTPA：二亚乙基四胺五乙酸；Bn：苄基。

减少补体激活的方法

一方面，本发明提供了当对人体内给予脂质体制剂时减少补体激活诱导的方法。如以下所述，该方法包括提供脂质体制剂，所述制剂包括中性脂质聚合物，或者，在选择性的实施方案中，包括中性-两性离子型脂质聚合物。本发明还提供了包括中性脂质聚合物的脂质体组合物，或者，在选择性的实施方案中，提供了包括中性-两性离子型脂质聚合物，用于当体内给予脂质体制剂时减少补体激活诱导。本发明进一步考虑了脂质体组合物在制备用于减少受试者体内补体激活的药物中的应用。

A.脂质体制剂

本发明的PEG取代的中性脂质聚合物具有以下所示的结构：

其中R¹和R²各自为具有8到24个碳原子的烷基或链烯基链；

n为约10到约300，

Z为选自C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃烷基醚、n-甲基酰胺、二甲基酰胺、甲基碳酸酯、二甲基碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、n-甲基乙酰胺、羟基、苄氧基、羧酸酯、和C₁-C₃烷基或芳基碳酸酯的惰性端基；和

L选自(i)-X-(C＝O)-Y-CH₂-、(ii)-X-(C＝O)-、和(iii)-X-CH₂-，其中X和Y独立地选自氧、NH、和直接键。

选择末端基团Z使得与诱导补体激活的体内组分的相互作用最小化。优选Z是作为结合水的氢键受体且不能作为氢键供体的部分。适合于Z的示例性惰性部分包括C₁-C₅烷氧基，更优选C₁-C₃烷氧基，C₁-C₅烷基醚，更优选C₁-C₃烷基醚，n-甲基酰胺、二甲基酰胺、甲基碳酸酯、二甲基碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、n-甲基乙酰胺、羟基、苄氧基、羧酸酯、和C₁-C₃烷基或芳基碳酸酯。优选的Z部分包括甲氧基、乙氧基、和n-甲基乙酰胺。

脂质聚合物包括中性键(L)代替经常用于空间稳定化脂质体中的PEG-磷脂如PEG-DSPE的荷电磷酸酯键。L可包含荷电部分，条件是净电荷为零，例如，L为两性离子型。中性键可为例如氨基甲酸酯、酯、酰胺、碳酸酯、脲、胺、醚、硫或二氧化硫。在其中期望在体内给定循环时间之后除去PEG链的应用中优选可水解的或可裂解的键，如碳酸酯和酯。这种特征可用于释放药物或有助于在脂质体到达其目标之后摄入细胞(Martin F.J.等人，美国专利5,891,468(1999)；Zalipsky，S.等人，PCT公开WO 98/18813(1998))。

优选与连接基团连接的PEG基团的分子量为约1000到15000，也就是说，其中n为约20到约340。更优选地，分子量为约1000到12000(n＝约20-275)，最优选为约1000到5000(n＝约20-115)。优选R¹和R²基团的长度为16-20个碳原子，特别优选R¹＝R²＝C₁₇H₃₅(使得COOR为硬脂酰基)。

如上所述，将不带电荷的脂质引入到脂质体中可提供以下优点，如减少包封的两性分子的弱碱性或酸性药物的渗漏。另一个优点是在调节脂质体表面与靶细胞和与RES的相互作用中有更大的灵活性(Miller，C.M.等人，Biochemistry，37：12875-12883(1998))。PEG取代的合成神经酰胺已经用作空间稳定化脂质体的不带电荷组分(Webb，M.S.等人，Biochim.Biophys.Acta，1372：272-282(1998))；然而，这些分子为复合体，并且制备很昂贵，并且它们通常不能被装入磷脂双层以及二酰基甘油磷脂中。

可使用标准合成方法制备脂质聚合物。例如，如图1所示，氨基甲酸酯连接的化合物(L＝-O-(C＝O)-NH-CH₂-)的制备可通过使mPEG(甲氧基PEG)的末端羟基与对硝基苯基氯甲酸酯反应得到对硝基苯基碳酸酯，然后其与1-氨基-2，3-丙二醇反应得到中间体氨基甲酸酯。然后对邻二醇部分的羟基酰化得到最终产物。使用甘油代替1-氨基-2，3-丙二醇，以类似的路线可用于生产碳酸酯连接的产物(L＝-O-(C＝O)-O-CH₂-)。氨基甲酸酯连接的二硬脂酰基和二(二十烷酰基)脂质聚合物的制备在实施例1和2中描述。

如图2A所示，醚连接的脂质聚合物(L＝-O-CH₂-)可通过使mPEG-OH的末端羟基与缩水甘油基氯化物(如表氯醇)反应，水解得到的环氧化物，并将得到的二醇酰化而容易地制备。例如，如图2B所示，酯连接的脂质聚合物(L＝-O-(C＝O)-或-(C＝O)-CH₂-)可通过使mPEG-OH与甘油酸缩丙酮的活化衍生物(2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷-4-羧酸)或所示的四碳同系物2，2-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷-4-乙酸反应制备。然后将二醇脱保护并酰化。

通过使用例如Zalipsky，S.等人(Eur.Polym.J.，19：1177-1183(1983))的方法制备的mPEG-NH₂代替mPEG-OH的相应反应可用于制备具有酰胺、脲或胺连接的脂质聚合物(即，其中L＝-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-CH₂-、-NH-(C＝O)-NH-CH₂-、或-NH-CH₂-)。

其中L为-X-(C＝O)-，且其中X为O或NH的化合物可通过使活化的羧基封端的PEG(通过羟基封端的PEG的氧化和通过例如转化为硝基苯基酯或与DCC反应而使羧基活化制备)分别与1，2，3-丙三醇或1-氨基-2，3-丙二醇反应制备(图2C)。酮基连接的化合物(即，其中X为直接键)可通过使醛封端的PEG(通过羟基封端的PEG的温和氧化制备)与例如1-溴-2，3-丙二醇缩丙酮的格氏试剂的缩合(图2D)、随后在无酸的条件下氧化成酮、并将缩丙酮水解得到二醇而制备。在所有情况下，然后照例将二醇酰化。

没有与甘油部分连接的PEG低聚物的末端(α末端；上述基团Z)典型地为羟基或甲氧基，但可根据本领域中已知的方法将其官能化，以帮助将不同的分子连接到中性脂质聚合物上，用于使脂质体靶向于特定的细胞或组织类型，或者帮助药物递送。待连接的分子可包括例如肽、糖、抗体、或维生素。以下实施例2-3描述了根据类似于上述那些途径制备α官能化的脂质聚合物的步骤，但是以市售的其中α末端被基团如叔丁基醚或苄基醚取代的PEG低聚物开始，在合成分子的脂质部分之后，所述基团容易地转化为羟基。在这种情况下，然后通过转化为对硝基苯基碳酸酯将该末端活化。

图5中阐明另一个示例性的中性脂质聚合物。使用聚合物PEG和脂质DSPG举例说明中性-两性离子型聚合物-脂质的合成。应该理解，也可以使用其它亲水聚合物和其它脂质，例如磷脂酰乙醇胺与mPEG醛的还原烷基化作用。简单地说，如实施例4中更详细的描述，通过用高碘酸钠处理使DSPG氧化，然后在硼烷-吡啶的存在下使其与mPEG-NH₂反应，形成中性-两性离子型mPEG-DSPE聚合物。两性离子型脂质聚合物在生理学pH下具有净的中性电荷。其用于中性脂质体双分子层，除去脂质体粒子中的不希望的电荷。

B.脂质体药代动力学

长循环脂质体通过在由成囊脂质组成的脂质体中引入1-10摩尔％，更优选1-5摩尔％，更优选3-10摩尔％的中性脂质聚合物或中性-两性离子型聚合物而形成。为了说明，如实施例5中所述，制备了引入3到5摩尔％的mPEG₂₀₀₀-DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)或氨基甲酸酯连接的脂质聚合物mPEG₂₀₀₀-DS的脂质体。脂质的余量由1.5∶1摩尔比的 HSPC 和胆固醇组成。为脂质体装载标识物¹²⁵I-tyraminylinulin。如实施例5所述，将各个制剂的样品注射到小鼠尾静脉中，并在不同的时间点测定组织分布。存在于血液、肝脏和脾脏中的水平如表1A-1C所示，并在图3A-3C中用图表表示。如数据所示，含PEG-DS的脂质体的药代动力学非常类似于包含PEG-DSPE的脂质体。

表1A：血液中的脂质体分布

表1B：肝脏中的脂质体分布

表1C：脾脏中的脂质体分布

类似的研究比较了PEG脂质与不含 PEG 脂质的对照制剂的性能。图4表示不含 PEG 脂质(十字形)、含5摩尔％的 PEG₂₀₀₀-DSPE(三角形)、或5摩尔％PEG₂₀₀₀-DS(圆形)的2∶1HSPC脂质体在血液中的保留。

使用包含mPEG₂₀₀₀-DS∶PHPC∶Chol为5∶55∶40摩尔比的脂质体进行了另一项研究。通过引入铟-DTPA复合体标记脂质体。在24小时测定血液中和不同的组织中的注射剂量的百分比。结果如表2A-2C中所示。再一次，脂质体表现出典型的长循环药代动力学，其4小时后的平均保留大于注射剂量的70％，24小时之后大于30％。

表2A.血液中铟的注射剂量的百分比

动物#	0.0小时	0.5小时	1.0小时	2.0小时	4.0小时	24小时
							大鼠1	103.7	91.2	82.5	73.8	72.0	33.1
大鼠2	97.7	87.7	79.4	78.7	74.4	30.7
							大鼠3	95.1	83.1	77.8	68.6	64.4	29.8
大鼠4	91.9	85.4	78.5	75.6	72.6	33.2
							平均	97.1	86.8	79.6	74.2	70.9	31.7
标准偏差	5.0	3.4	2.1	4.2	4.4	1.7

表2B.24小时的组织中注射剂量的百分比

组织	大鼠1	大鼠2	大鼠3	大鼠4	平均	标准偏差
							肝脏	7.5	6.9	6.7	7.2	7.1	0.3
脾脏	4.9	5.4	5.6	4.8	5.2	0.4
							心脏	0.4	0.5	0.5	0.6	0.5	0.1
肾脏	1.2	1.2	1.0	1.2	1.1	0.1
							肺	0.7	0.7	0.7	0.8	0.7	0.1
皮肤	0.1	0.3	0.2	0.2	0.2	0.1
							骨骼	0.3	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
肌肉	0.1	0.1	0.1	0.2	0.1	0.4
							尿	11.2	13.4	5.7	12.3	10.7	3.4

表2C.24小时的组织中的每克注射剂量的百分比

组织	大鼠1	大鼠2	大鼠3	大鼠4	平均	标准偏差
							肝脏	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.3
脾脏	7.3	6.9	8.2	5.9	7.1	0.9
							心脏	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.4
肾脏	0.6	0.6	0.5	0.6	0.6	0.6
							肺	0.6	0.5	0.5	0.6	0.5	0.6
皮肤	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
							骨骼	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.3
肌肉	0.1	.01	0.1	0.1	0.1	0.2
							尿<sup>＊</sup>	0.6	0.6	0.3	0.8	0.6	0.2

^＊每毫升注射剂量的百分比

比较包含5摩尔％mPEG₂₀₀₀-DS或mPEG₂₀₀₀-DSPE、余量为PHEPC的脂质体在给药后最多24小时时血液中的保留百分比。如图4所示，药代动力学实质上是相同的，在24小时之后保留约40％。

C.体外补体激活的测量

为了评价由中性脂质聚合物组成的脂质体制剂对补体激活诱导的作用，如实施例6中所述，制备了十二种脂质体制剂和两种胶束制剂。实施例6中的表3详述了制剂的脂质组成。简而言之并参考表4，制剂包括：

制剂1、2、3：两种装填药物、具有相同脂质组成的脂质体，不同之处只在于包载药物为阿霉素(Doxil^)和顺铂(制剂1和2)，和具有相同脂质组成但没有包载治疗剂的制剂，即安慰剂(制剂3)；

制剂4：通过比较具有0.6摩尔％PEG₂₀₀₀-DSPE的制剂与具有相同组成但具有更高(4.5摩尔％)量PEG₂₀₀₀-DSPE的制剂3，评价PEG₂₀₀₀-DSPE的量对补体激活诱导的作用；

制剂5、6、7：通过比较制剂3(相对于制剂1和2的Doxil^和顺铂的安慰剂)与其中除去带负电荷的PEG₂₀₀₀-DSPE(制剂5)或代之以中性脂质聚合物：PEG₂₀₀₀-DS(制剂6)或PEG₂₀₀₀-DSG(制剂7；DSG二硬脂酰基甘油，参见图2A的mPEG-DSG的结构)研究PEG-DSPE的负电荷的作用；

制剂8、9：通过比较具有带负电荷的PEG-DSPE和具有350道尔顿(制剂8)、2000道尔顿(制剂3)、和12,000道尔顿(制剂9)的不同PEG分子量的脂质体，研究PEG部分的大小对补体激活诱导的作用；

制剂10：制备通过成脂质体的磷脂氢化大豆磷脂酰甘油(HSPG)引入负电荷的脂质体，与其中通过成胶束的脂质聚合物PEG₂₀₀₀-DSPE引入负电荷的脂质体(制剂3)比较；

制剂11、12：作为脂质体阳性对照，是大粒径并由DMPC/胆固醇/DMPG组成的脂质体，其中胆固醇的摩尔百分数为50％(制剂11)和71％(制剂12)，因为这些制剂在补体系统，包括猪的补体依赖性心肺窘迫的活化中是高度有效的；

制剂13、14：为了测定没有其它脂质的PEG₂₀₀₀-DSPE是否诱导补体激活，制备了PEG₂₀₀₀-DSPE胶束(制剂13)和PEG-DS胶束(制剂14)。

脂质体制剂10与脂质体制剂3的比较提供了对暴露的负电荷与隐藏的负电荷之间的区别的研究，因为具有通过成脂质体的磷脂HSPG引入的带负电荷的脂质体具有暴露的负电荷，而其中通过脂质聚合物PEG₂₀₀₀-DSPE引入负电荷的脂质体具有由PEG链遮蔽的负电荷。

表4总结了脂质体和胶束制剂，并且表示了大小、表面电位(Ψ₀)和ζ电位。

表4：脂质体组合物的表征

制剂编号和名称<sup>1</sup>	粒子大小<sup>2</sup>(nm)	表面电位<sup>2</sup>(mV)	ζ电位<sup>2</sup>(mV)
				1-Doxil<sup></sup>	108		-13.3
2-顺铂脂质体	116	-14.3	-9.8
				3-Doxil<sup></sup>安慰剂	124	-52	-10.1
4-0.6％PEG<sub>2000</sub>-DSPE	121	-2.9	-10.3
				5-HSPC/Chol	135	0	-4.6
6-PEG-DS	111	-12.3	-0.79
				7-EPC/PEG-DSG	70		0.7
8-PEG<sub>350</sub>-DSPE	127
				9-PEG<sub>12000</sub>-DSPE	128
10-HSPG	135	-81.34	-52.5
				11-Low-Chol	＞1000
12-High-Chol	＞1000
				13-PEG<sub>2000</sub>-DSPE胶束	25	-141	-9.0
14-PEG<sub>2000</sub>-DS胶束	25	-19	-1.3

¹脂质体组合物的详细信息参见以下实施例6中的表3

²测试方法学参见以下实施例6

如实施例6中所述，通过当人血清与不同脂质体制剂培养时测量S-蛋白质结合的C末端复合物(SC5b-9)的形成作为补体激活的标识物来测定体外补体激活诱导.在典型的研究中，脂质体制剂与血清混合并在37℃下培养约30分钟.中止反应，并通过酶联免疫吸附试验测定SC5b-9的量.制剂1、3、4、5、6、8、9和10的结果如图6中所示.

图6表示了所示脂质体制剂的SC5b-9诱导，其作为用磷酸盐缓冲盐水培养的细胞的基线SC5b-9诱导的百分比.脂质体制剂5和6为电中性的(制剂6包括中性脂质聚合物PEG-DS，制剂5由中性脂质HSPC/Chol组成).这些中性制剂没有引起SC5b-9形成的可测量的改变.包含0.6％PEG₂₀₀₀-DSPE的制剂4还引起很少的补体激活.然而，所有的其它脂质体制剂引起了相对于PBS对照的显著的SC5b-9上升。“Doxil^安慰剂”制剂3和含带负电荷的HSPG的脂质体制剂10引起中等的、约2倍的SC5b-9增加，Doxil^制剂1引起非常强烈的、7倍的SC5b-9增加。这些数据暗示了负电荷，特别是Doxil^中的阿霉素是补体激活的贡献因素。该发现被具有与Doxil^脂质体制剂1相同的脂质组成和大小的、装填了顺铂的脂质体制剂2没有引起或引起较小的补体激活(数据未显示)的事实所证实。当如制剂7中用EPC代替HSPC(相对于制剂6)时，在2/3的受试血清中得到了中等但显著的补体激活。

通过向人血清中加入浓度增加的胶束评价制剂13(PEG₂₀₀₀-PE胶束)的补体激活效应。在当Doxil^(制剂1)引起显著活化(数据未显示)的条件下，胶束没有在任何血清中引起显著的SC5b-9的上升。事实上，加入比Doxil^制剂1高至多10倍的浓度的胶束时引起补体激活。因此，双分子层膜上的补体结合部位的空间排列可能是脂质体诱导的补体激活的另一个关键因素。

D.体内补体激活的测量

如实施例7中所述，通过对猪给予制剂体内评价上述脂质体制剂诱导的补体激活。为了统一量化引起猪体内由脂质体诱导的超敏(HSR)的多种生理变化，开发了从等级I到IV的鉴定这些反应的评分系统。评分系统在实施例7中详述并且分别将没有反应、中等反应、严重反应和致命反应指定为等级I、II、III、和IV。猪对不同的脂质体的剂量依赖性、剂量频率、和心肺应答等级在表5中总结。

表5：猪对不同脂质体的心肺反应

¹等级的定义参见实施例7

²制剂的脂质组成在实施例6中的表3中给出。

与制剂1(Doxil^)以及带负电荷的含PE的脂质体(制剂8、9、10)是有效的体外人血清中补体活化剂(图6)的观察相一致，这些同样的脂质体是猪心肺窘迫的最有效的诱导物，其在3-150nmole磷脂/kg时在＞90％的试验中引起严重到致命的反应。引起超敏反应的制剂1(Doxil^)的最小剂量为得自包含2mg/mL阿霉素和12.8mg/mL磷脂的原装小瓶的50μL，相当于在大约输注的最初15-30秒内到达血液的人治疗剂量的1/400到1/1000份。在人和猪中，Doxil^的反应原性的剂量依赖性实际相同。

进一步与体外补体激活一致的是，等剂量的制剂3(安慰剂Doxil^)也在猪中引起超敏反应，但是速率较低(67％)，而制剂4(PEG₂₀₀₀-DSPE)、制剂8(PEG₃₅₀-DSPE)、和制剂6(PEG₂₀₀₀-DS)和制剂13、14(PEG₂₀₀₀胶束)即使在更高剂量下也没有引起反应或引起温和的反应。在体外补体激活和猪的超敏反应之间唯一明显的分歧是，在人血清中没有引起或引起较小补体激活的制剂9(PEG₁₂₀₀₀-DSPE脂质体)的三个试验中的两个试验中产生严重的反应。

制剂6和制剂7都由中性脂质制备。制剂6由HSPC、胆固醇、和PEG-DS形成。制剂7由EPC和市售的中性脂质聚合物PEG-DSG形成(参见实施例6)。然而，两种制剂的体内应答的不同之处在于：制剂7引起受试动物中足够严重到引起死亡的补体激活诱导。相比之下，制剂6在四只受试动物中的三只中的反应为等级I或最小反应，在一只受试动物只为等级0(未应答)。该结果暗示了不是所有的中性脂质聚合物都能够减小当给予脂质体制剂体时引起的补体激活诱导。

在猪中进行的另一个研究中，如实施例8中所述，制备了四种脂质体制剂。四种制剂的脂质组成和特征在表6中表示。

表6：用于体内评价补体激活诱导的脂质体制剂

¹如实施例1中所述制备中性脂质体

²带负电荷的氢化大豆磷脂酰甘油

制剂16、17、18和19都包括HSPC和胆固醇，但脂质聚合物不同。制剂16与上述制剂3中类似包括PEG-DSPE。制剂17包括DEG-DS，制剂19包括HSPG。

如实施例8中所述，对猪给予脂质体制剂16-19和制剂1(Doxil^)。在注射之后约3-6分钟内出现典型的血液动力学改变，包括肺动脉压(PAP)上升30-300％、体动脉血压(SAP)的不稳定上升和下降、心动过速(有或没有随后的心动过缓)和Hb氧饱和下降。这些变化通常互相成比例，虽然在某些动物中观察到心脏应答相对于肺应答明显具有严重的心动过缓而没有PAP的显著上升的倾向。

表7总结了受试动物中的血液动力学改变。在该研究中使用标号为P1-P12的12只猪，表7中表示了个体应答。个体参数的改变定量表示为相对于注射前基线的百分比，根据实施例7中所述的评分系统(没有(0)、最小(I)、温和(II)、严重(III)、和致命(IV))主观定性各个脂质体制剂的总应答。注射50-100微升的制剂1(Doxil^)引起9/9的猪的严重到致命的心肺反应，而即使在100倍的较高剂量下制剂18(HSPC/Chol小囊)在受试的所有六只猪中没有引起反应。如制剂19(HSPC/Chol/HSPG)那样，制剂16(HSPC/Chol/PEG-DSPE)在4/5的猪中引起温和到致命的反应。包括本发明的中性脂质聚合物的制剂17(HSPC/Chol/PEG-DS)只在最高剂量下产生温和的反应。

表7：对脂质体制剂给药的血液动力血应答

¹各个制剂的脂质组成详见表6和3

²等级评分细节参见实施例7

在本文中所述的研究中，选择具有阿霉素或顺铂、或空的安慰剂脂质体的脂质体制剂作为研究模型。应该理解，中性脂质聚合物PEG-DS引起补体激活诱导减少的发现适用于包含任何包载的药物或治疗剂的脂质体制剂。示例性的治疗剂包括化疗剂、抗病毒药、抗菌剂等等。考虑了蒽环类抗生素化疗剂阿霉素和其它这种化合物，如柔红霉素、表柔比星、和依达比星。还考虑了含铂的化疗剂顺铂和其它含铂药物，如本领域中已知的多种顺铂类似物，其包括但不限于卡铂、奥马铂、奥沙利铂、((-)-(R)-2-氨基甲基吡咯烷(1，1-环丁烷二羧基合))铂、折尼铂、恩洛铂、洛铂、(SP-4-3(R)-1，1-环丁烷-二羧基合(2-)-2-甲基-1，4-丁二胺-N，N′))铂、奈达铂、和双乙酸基合-氨络物-二氯环己胺-铂(IV)。然而，应该理解，本文的发现适用于任何药物或治疗剂。

实施例

以下实施例说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1A

mPEG-DS(mPEG氨基丙二醇二硬脂酰基；α-甲氧基-ω-2，3-二(硬脂酰氧基)丙基氨基甲酸酯聚(氧化乙烯))的合成

将mPEG₂₀₀₀(20g，10mmol)的溶液在甲苯(50mL，120℃)中共沸干燥。在上述溶液的温度达到25℃之后，用硝基苯基氯甲酸酯(3.015g，15mmol)处理，然后用TEA(2.01mL，15mmol)处理。然后使混合物反应1.5小时。过滤TEA-盐并除去溶剂，得到粗mPEG₂₀₀₀-硝基苯基氯甲酸酯，向其中加入氨基丙二醇(3g，30mmol)在乙腈(50mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。通过过滤除去不溶性物质并蒸发溶剂。产物从异丙醇重结晶两次。收率13.7g，65％。¹H-NMR：(300MHz，DMSO-D₆)δ3.23(s，OCH₃，3H)，3.65(s，PEG，180H)，4.05(t，乌拉坦CH₂，2H)，4.42(t，1°OH，1H)，4.57(d，2°OH，1H)。

将产物mPEG₂₀₀₀氨基丙二醇(2.3g，1.08mmol，2.17毫当量的OH)溶解于甲幕(30mL)中并共沸干燥，除去约10mL的溶液。将溶液冷却到室温。通过移液管加入吡啶(4mL，20％)，随后加入硬脂酰氯(1g，4.3mmol)。紧接着形成白色沉淀。使反应混合物在120℃下回流过夜并使其冷却。当反应烧瓶的温度达到约40℃时，过滤吡啶盐。蒸发滤液。通过从异丙醇重结晶两次(2x 30mL)纯化产物(PEG₂₀₀₀-DS)，并在P₂O₅下真空干燥。

收率：2.26g，80％。TLC(氯仿∶甲醇，90∶10)：mPEG氨基丙二醇R_f＝0.266；PEG-DS R_f＝0.533。¹H-NMR：(300MHz，DMSO-D₆)δ0.89(t，CH₃，6H)，1.26(s，CH₂，56H)，1.50(2t，2CH₂，4H)，2.24(t，CH₂CH₂C＝O，4H)，3.23(s，OCH₃，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH₂，1H)，4.02(t，CH₂OC＝O-N，2H)，4.20(dd，APD的CH₂，1H)，4.98(m，CHOC(O)，1H)，7.34(m，NH，1H)。

根据类似的过程，使用分子量为750，5000、和12000的mPEG聚合物制备mPEG-DS。结构通过¹H-NMR和质谱验证。通过MALDI(基质辅助激光解析/电离)测定的分子量如下。

共轭物MALDI     测量的MW

                              

mPEG(750)-DS     1426

mPEG(2000)-DS    2892

mPEG(5000)-DS    5816

mPEG(12000)-DS   12729

实施例1B

PEG-DE(mPEG氨基丙二醇二(二十烷酰基)；α-甲氧基-ω-2，3-二(二十烷酰氧基)丙基氨基甲酸酯聚(氧化乙烯))的合成

在100mL圆底烧瓶中，将二十烷酸(500mg，1.6mmol)溶解于甲苯(20mL)中，并通过移液管加入草酰氯(147μl，1.68mmol)。向搅拌的反应中加入1％DMF。在加入DMF时放出气体，应避免与这种气体的任何接触。在10分钟之后，蒸发甲苯，并加入另外20mL的甲苯并蒸发以除去任何过量的草酰氯。将残余物再溶解在10mL甲苯中。将如上所述制备的mPEG-氨基丙二醇(1.19g，0.56mmol)加入到溶液中，连接回流冷凝器并使混合物回流过夜。通过TLC分析(甲醇和氯仿，9∶1)显示反应完成。在反应混合物冷却之后，过滤不溶解的物质，并将滤液干燥。通过从异丙醇重结晶三次纯化产物并通过P₂O₅真空干燥。收率：1.0g，70％。¹HNMR：(360MHz，DMSO-D₆)δ0.89(t，CH₃，6H)，1.26(s，CH₂，脂质的66H)，1.50(t，2CH₂，4H)，2.24(t，CH₂ CH ₂ C＝O，4H)，3.23(s，OCH₃，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH₂，1H)，4.05(t，CH₂ CH ₂ C+O，4H)，3.23(s，OCH₃，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH₂，1H)，4.05(t，CH₂OC＝O-N，2H)，4.20(dd，APD的CH₂，1H)，4.98(m，CHOC(O)，1H)，7.34(m，NH，1H)ppm。

实施例2

通过t-Bu-O-PEG-O-琥珀酰亚胺制备t-Bu-O-PEG-氨基丙二醇

A.t-Bu-O-PEG-O-琥珀酰亚胺

通过将得自Polymer Labs的tBu-O-PEG-2000(10g，5mmol)溶解于120mL甲苯中并除去约20mL溶剂进行共沸干燥，在Dean Stark分水器中收集水。

将溶液冷却到室温并加入碳酰氯(15mL)。使混合物在室温下反应过夜。在反应完成之后，通过旋转蒸发器除去溶剂。加入约50mL的新鲜的甲苯并通过旋转蒸发器除去。将残余物溶解于无水甲苯(30mL)和二氯甲烷(10mL)中。向该溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.7g，14.8mmol)和三乙胺(2.1mL，14.9mmol)，并使混合物在室温下反应过夜，之后通过TLC判断反应完成。

化合物          R_f(CHCl₃∶CH₃OH，90∶10)

                                                

t-Bu-O-PEG-OH      0.44

t-Bu-O-PEG-OSc     0.51

从反应混合物中过滤盐，通过蒸发除去溶剂，并将固体从异丙醇重结晶两次并通过P₂O₅干燥。收率9.2g，85％。¹HNMR：(CDCl₃，360MHz)δ1.25(s，t-Bu，9H)，2.82(s，CH₂CH₂，4H)，3.60(s，PEG，180H)，4.45(t，CH₂OCONH，2H)ppm。

B.t-Bu-O-PEG-氨基丙二醇

向氨基丙二醇(300mg，3.2mmol)在DMF(10mL)的溶液中加入t-Bu-PEG-OSc(5g，2.29mmol)并反应过夜。所有的NHS酯被消耗掉，得到在TLC上表现为一个点的混合物。

化含物          R_f(CHCl₃∶CH₃OH，90∶10)

                                   

t-Bu-O-PEG-OSc    0.51

t-Bu-O-PEG-APD    0.35

将预先洗涤过的酸性离子交换树脂(～1g)加入到反应混合物中，并在30分钟之后通过过滤除去，除去溶剂并将残余物从200mL异丙醇重结晶。收集固体并通过P₂O₅干燥。收率4.2g，85％。¹HNMR：(D6-DMSO，360MHz)δ1.25(s，t-Bu，9H)，3.68(s，PEG，180H)，4.03(t，CH₂OCONH，2H)，4.43(t，1°OH，1H)，4.55(d，2°OH，1H)，6.98(t，NH，1H)ppm.

实施例3对硝基苯基碳酸酯-PEG-DS的制备

A.Bn-O-PEG-硝基苯基碳酸酯(NPC)

通过将得自Shearwater Polymers的Bn-O-PEG-2000(Huntsville，LA；5g，2.41mmol)溶解于120mL甲苯中并除去约20mL溶剂对其进行共沸干燥，在Dean Stark分水器中收集水.将溶液冷却到室温并在减压下蒸发残留的溶剂。

将残余物溶解于30mL二氯甲烷/乙酸乙酯(60∶40)中，并加入对硝基苯基氯甲酸酯(729mg，3.6mmol)和三乙胺(1mL，7.2mmol)。使反应在4℃进行8-16小时。该方法使反应变慢，但排除了双PEG-碳酸酯的形成。在GF二氧化硅板上的UV可见斑点表明反应完成。

用预先清洁的酸性和碱性离子交换树脂处理反应混合物30分钟，过滤，并使其完全干燥。产物从异丙醇重结晶并P₂O₅上干燥。收率：4.4g，80％。

B.Bn-O-PEG-氨基丙二醇

向氨基丙二醇(260mg，1.9mmol)在DMF(10mL)的溶液中加入如上制备的Bn-O-PEG-NPC(4.3g，2.9mmol)并反应5小时。所有的Bn-O-PEG-NPC被消耗，反应混合物在TLC上给出一个斑点(氯仿∶甲醇∶水90∶18∶2)。

用5g预先清洁的酸性离子交换树脂处理反应混合物30分钟，过滤，并使其彻底干燥。产物从异丙醇重结晶并通过P₂O₅干燥。收率3.8g，91％。

C.Bn-O-PEG-二硬脂酰基

在室温下将Bn-O-PEG-氨基丙二醇(3g，1.36mmol)、硬脂酸(1.94g， 6.79mmol)、和作为催化剂的DPTS(4-(二甲氨基)吡啶4-甲基苯磺酸盐)(408mg，1.36mmol)的溶液搅拌20分钟。通过移液管加入二异丙基碳二亚胺(1.28mL，8.16mmol)并使混合物反应过夜。TLC(氨仿∶甲醇，90∶10)表明二醇完全反应。

向反应混合物中加入碱性离子交换树脂(～5g)，在振摇30分钟之后，过滤树脂并将滤液干燥。残余物从异丙醇(100mL)重结晶并通过P₂O₅干燥。收率：4g，80％。

D.HO-PEG-二硬脂酰基

采用两种不同的方法为Bn-O-PEG-DS的苄基脱保护。

方法1.氢解：通过碳载钯脱保护

向Bn-O-PEG-DS(218mg，0.08mmol)在5mL的甲醇的溶液中加入10％Pd/C(110mg)和甲酸铵(107mg，0.8mmol)并使混合物在室温下反应过夜。

通过Celte过滤除去Pd/C，并将滤液干燥。将残余物溶解于氯仿并用饱和NaCl洗涤三次。收集氯仿相，用MgSO₄干燥，过滤并浓缩。将固体残余物从tBuOH冻干，并将得到的粉末通过P₂O₅干燥，收率80％，175mg。

方法2.通过四氯化钛脱保护

在冰浴中冷却Bn-O-PEG-DS(1.18g，0.43mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液5分钟。通过烘干的注射器将四氯化钛(3mL，21.5mol，过量)转移到密封的反应烧瓶中。5分钟之后，除去冰浴，在室温下进行脱保护反应过夜。通过在GF二氧化硅TLC色谱板上(相对于起始原料)较低的位移斑点显示完全脱保护。

向反应混合物中加入约40mL氯仿并将混合物转移到包含40mL饱和NaHCO₃的分液漏斗中。轻轻地振摇混合物(避免形成乳液)并收集氯仿层。重复这种萃取3次，并收集氯仿相，并用新鲜的饱和NaHCO₃再萃取一次，以保证完全除去TiCl₄。用MgSO₄干燥收集的氯仿相，过滤并浓缩。

将上述残余物溶解于1mL的氯仿中并将其加到硅胶(200-400目，60A)的制备柱上。通过以2％渐增的方式加入甲醇使流动相(氯仿)的极性增加，直到在10％甲醇/90％氯仿时洗脱产物。收集产物并通过旋转蒸发器除去溶剂。将固体从tBuOH冻干并通过P₂O₅干燥。收率70％，800mg。

E.对硝基苯基碳酸酯-PEG-DS

在反应开始之前将反应烧瓶、搅拌棒、注射器、起始原料(如上制备的HO-PEG-DS)小心地干燥。

向HO-PEG-DS(1.2g，0.45mmol)在10mL二氯甲烷/乙酸乙酯(60∶40)的溶液中加入对硝基苯基碳酸酯(136mg，0.65mmol)和三乙胺(188μL，1.35mmol)。在4℃下反应8-16小时(消除双PEG-碳酸酯的形成)，然后通过GF硅胶TLC检验反应完成。

化合物      R_f(CHCl₃∶CH₃OH，90∶10)

                                            

HO-PEG-DS     0.40

NPC-PEG-DS    0.54

用预先清洁的酸性和碱性离子交换树脂处理反应混合物30分钟并过滤。将滤液彻底干燥并将残余物从异丙醇重结晶。固体通过P₂O₅干燥。收率70％。¹NHMR：(D6-DMSO，360MHz)δ0.86(t，CH₃，6H)，1.22(s，DS，56H)，1.48(m，CH₂CH₂(CO))，4H)，2.26(2xt，CH₂OCONH，2H)，4.03&4.22(2xd，脂质的CH₂CH，2H)，4.97(M，脂质的CHCH₂)，6.98(t，NH，1H)，7.55％8.32(2xd，芳香，4H)ppm。

实施例4

通过mPEG-NH₂和高碘酸盐氧化的DSPG的还原胺化偶联制备中性-两性离子型mPEG-DSPE

将1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸基-外消旋[(1-甘油)]或二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG，200mg，0.25mmol)悬浮在乙酸钠盐水缓冲液(1.5mL，50mM，pH＝5)中，并用高碘酸钠(348mg，1.6mmol)处理4h，同时将悬浮液超声。TLC(氯仿∶甲醇∶水＝90∶18∶2)表明DSPG耗尽。在离心之后从溶液分离不溶性产物，然后用水(1mL)、水/乙腈1∶1(2mL，两次)洗，然后只用乙腈(1mL，3次)洗。通过P₂O₅真空干燥产物1.5h，将mPEG-NH₂(1g，0.5mmol，2eq)加入到氧化的DSPG和苯(3ml)中并将溶剂旋转蒸发以除去残留的水。再重复苯蒸发步骤2次。向混合物中加入无水甲醇(6mL)和粉状分子筛(4，320mg)，随后加入硼烷(borant)-吡啶(8M，1.6mL，12mmol)。将反应混合物在25℃搅拌15h。TLC确认脂质聚合物产物的形成。为了除去过量的未反应的mPEG-NH₂，用水(3mL)稀释产物混合物，转移到spectropore CE渗析膜(MWCO 300,000)并在4℃下相对盐水溶液(～50mM，1000mL，3次)透析。然后相对去离子水透析(3次)。将粗产物(通过TLC确认，包含一些氧化的DSPG杂质)冻干并通过P₂O₅真空干燥并进一步通过硅胶柱色谱法纯化，使用在具有甲醇梯度(0-15％)的氯仿作为洗脱液。收集包含纯脂质聚合物产品的洗脱级分并蒸发，得到141mg(20％)固体。¹H NMR(360MHz，CDC1₃)δ：0.88(t，CH₃，6H)；1.26(s，CH₂，56H)；1.58(m，CH₂CH₂CO，4H)；2.28(2xt，CH₂CO，4H)；3.2(br m，NHCH₂CH₂，1H)；3.32(br m，NHCH₂CH₂，1H)；3.6(s，PEG～180H)；4.15(dd，反式PO₄CH₂CH，1H)；4.35(dd，顺式PO₄CH₂CH，1H)；5.2(m，PO₄CH₂CH，1H)。MALDI-TOFMS产生以相同的44道尔顿间隔分隔并在2770道尔顿处集中的离子钟形分布(计算分子量：2813道尔顿)。

实施例5

含PEG-DSPE和PEG-DS的脂质体的制备和生物分布研究

通过溶解并从HSPC∶Chol∶PEG为以下比例的脂质混合物中除去溶剂形成脂质膜：

A：58∶39∶3；PEG-脂质＝PEG-DS

B：57∶38∶5：PEG-脂质＝PEG-DSPE

C：57∶38∶5：PEG-脂质＝PEG-DS

在包含140mM NaCl、pH为7.4的25mM HEPES中的新制备的¹²⁵I-酪氨菊粉中将膜水合并挤出形成直径为100-105nm的脂质体。使脂质体通过0.22μm的Millipore(Millipore Corporation，Bedford，MA)低蛋白结合注射器末端过滤器过滤灭菌。计数等分样品以测定¹²⁵I的注射计数。通过分析脂质体制剂的磷酸盐含量测定脂质浓度，并将脂质体制剂在无菌缓冲液中稀释到2.5μmol/mL的最终浓度。通过尾静脉为小鼠静脉内注射0.2mL的稀释后的脂质体，使每只小鼠接受0.5μmol的磷脂。在不同的时间点，通过氟烷麻醉、随后断颈将小鼠处死，分析心脏取血的血样，以及血液和不同器官的¹²⁵I计数。

实施例6

体外补体激活的测量

材料

二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰基甘油(DMPG)、胆固醇(Chol)和蛋黄卵磷脂(EPC)购自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)完全氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和完全氢化的大豆磷脂酰甘油(HSPG)得自Lipoid Inc.，Ludwigshafen，Germany。所有的脂质都具有≥97％的纯度。酵母多糖得自Sigma Chem.Co.(St.Louis，MO)。

市售的Doxil^得自ALZA Corp(Mountain View，CA)，并且包含阿霉素HCl，2mg/mL(4.22mM)；脂质体脂质16mg/mL；硫酸铵≈0.2mg/mL；组氨酸，10mM(pH 6.5)和蔗糖，10％。脂质组分包括HSPC，9.58mg/mL；Chol，3.19mg/mL；PEG₂₀₀₀-DSPE，3.19mg/mL(总磷脂12.8mg/mL，13.3mM)。

具有350道尔顿、2000道尔顿、和12,000道尔顿的PEG部分的N-氨甲酰基-聚(乙二醇甲基醚)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺三乙基铵盐(PEG-DSPE)(PEG₃₅₀-DSPE、PEG₂₀₀₀-DSPE、PEG₁₂₀₀₀-DSPE，也分别称为0.35K-PEG-DSPE、2.0K PEG-DSPE、12.0KPEG-DSPE)得自Alza Corporation。

如上所述制备具有聚乙二醇(2000Da的PEG部分)的3-甲氧基聚乙二醇-氧羰基3-氨基-1，2-丙二醇二硬脂酸酯(PEG₂₀₀₀-DS，还称为2K-PEG-DS)。

3-甲氧基聚乙二醇1，2-二硬酰甘油(PEG₂₀₀₀-DSG，还称为2K-PEG-DSG)(Sunbright DSG-2H)得自Nippon Oil & Fat Co.，Ltd(Tokyo，Japan)。

人血清得自健康的志愿者供体。在使用前将血清保持在-70℃。

方法

磷脂浓度的测定：使用Bartlett方法的改进方法测定磷脂浓度。

粒度分布测定：在25℃使用具有ALV-5000/EPP多重数字相关器的高性能粒度筛选器ALV-NIBS/HPPS(ALV-Laser VertriebsgesellschaftGm bH，Langen，Germany)或Nicomp Model 370(Pacific Scientific，Silver Spring，MD)亚微细粒筛选器通过动态光散射测定粒度分布。

脂质体表面电荷(Ψ电位)的测量：为了测定脂质体的表面电位，测量了宽pH值范围内的HC离子化程度。将30μL的等份的脂质体在1.5mL缓冲液中稀释。通过加入适量的浓氢氧化钠和盐酸调节pH。将所有的样品在水浴中超声处理约5秒以保证在大的单层小囊(LUV)内外的pH平衡。为了测量HC离子化状态，使用LS550B发光光谱仪(PerkinElmer，Norwalk，CT)在室温(22℃)下记录HC荧光激发光谱。在两个激发波长下进行测量：330nm，其为pH非依赖性的(等吸光点)并且表示脂质环境中HC的总量(未离子化的+离子化的)；和380nm，其只反映离子化的HC^-。对于两个激发波长，发射波长都是450nm。使用2.5nm的激发谱带和发射谱带宽。对于每个脂质组成，由激发波长380/330的比的变化计算HC的表观pKa，作为整体pH(bulk pH)的函数。表示HC相对于参考中性面的表观质子结合常数的表观pKa的变化是HC荧光团周围环境中表面pH和表面电位的指征。表面电位值(Ψ)使用以下方程式计算：

${\mathrm{\Ψ}}_0=-\frac{\mathrm{\Δp}{K}_{\mathrm{el}}\mathrm{kT}}{e\ln 10}$

ξ电位的测定：使用Zetasizer 3000HAS，Malvern InstrumentsLtd，Malvern，UK，在25℃下测量ξ电位。将40μL等份的脂质体在20mL的10mM NaCl(pH6.7)中稀释并将溶液穿过0.2μm的针筒式滤器(Minisart，Sartorius，Germany)。测量原理如下：当对带电粒子在电解液中的悬浮液施加电场时，它们朝向相反极性电极的移动速度取决于电场强度、介电常数、介质粘度、和ζ-电位。在单位电场中ζ电位与粒子速度的关系(电泳迁移率)由Henry方程式表示：

$U_E=\frac{\mathrm{z\ϵf}\left(\mathrm{Ka}\right)}{6\mathrm{\π\η}}$

其中U_E＝电泳迁移率，z＝ζ电位，ε＝介电常数，η＝粘度。f(K_a)为电偶层厚度和粒径的函数。在水介质或中等电解质浓度(10mM的NaCl)中，f(K_a)值为1.5，将其带入Smoluchowski近似关系：

$U_E=\frac{\mathrm{\ϵz}}{4\mathrm{\πn}}$

在25℃时，ζ电位可近似为：

z＝12.85U_EmV

A.脂质体制剂

制备包括如下表3所示的多种脂质组成的脂质体。将各个制剂的脂质组分溶解于叔丁醇中。将澄清溶液冻干。将粉末在10mL热(65℃)的无菌无热原的盐水中通过在70℃下涡流水合2-3分钟，形成多层小囊(MLV)。使用得自Northern Lipids Inc.(以前是Lipex，Vancouver，BC，Canada)的TEX 02010mL桶式挤出机在62℃下使多层小囊通过0.4和0.1μm孔径的聚碳酸酯过滤器的两步挤出步骤中使其尺寸缩小，分别通过每种孔径10次。脂质体的所有制备步骤都在无菌条件下进行。将脂质体悬浮在0.15M NaCl/5mM组氨酸缓冲液(pH 6.5)中。所有的脂质体制剂都是无菌的并且是无热原的。

通过将盐水中的2mg/mL的2K-PEG-DSPE或2K-PEG-DS大规模涡流混合并随后通过0.22μm过滤器过滤制备胶束。

表3：脂质体组成

制剂编号和名称<sup>1</sup>	脂质体组成(+药物)	脂质摩尔比
			1-Doxil<sup></sup>	HSPC/Chol/PEG<sub>2000</sub>-DSPE(+阿霉素)	56∶38.6∶5.4
2-顺铂脂质体	HSPC/Chol/PEG<sub>2000</sub>-DSPE(+顺铂)	56∶38.6∶5.4
			3-Doxil<sup></sup>安慰剂	HSPC/Chol/PEG<sub>2000</sub>-DSPE	56∶38.6∶5.4
4-0.6％PEG<sub>2000</sub>-DSPE	HSPC/Chol/PEG<sub>2000</sub>-DSPE	54.7∶44.6∶0.62
			5-HSPC/Chol	HSPC/Chol	57.2∶42.8
6-PEG-DS	HSPC/Chol/PEG<sub>2000</sub>-DS	54.3∶42.7∶4.5
			7-EPC/PEG-DSG	EPC/PEG<sub>2000</sub>-DSG	95.5∶4.5
8-PEG<sub>350</sub>-DSPE	HSPC/Chol/PEG<sub>350</sub>-DSPE	54.3∶41.3∶4.3
			9-PEG<sub>12000</sub>-DSPE	HSPC/Chol/PEG<sub>12000</sub>-DSPE	54.3∶41.3∶4.3
10-HSPG	HSPC/Chol/HSPG	38.1∶28.4∶33.5
			11-Low-Chol	DMPC/Chol/DMPG	45∶50∶4
12-High-Chol	DMPC/C hol/DMPG	24∶71∶5
			13-PEG-DSPE  胶束	PEG<sub>2000</sub>-DSPE胶束	100
14-PEG-DS胶束	PEG<sub>2000</sub>-DS胶束	100

B.体外补体激活测量

在振摇的水浴(80循环/分钟)中将脂质体与未稀释的人血清温孵并通过测量补体终端复合体SC5b-9的形成评价补体激活。在典型的实验中，在Eppendorf管中将10μL的脂质体与40μL的血清混合，然后在振摇的水浴(振摇速率为80rpm)中在37℃下温孵30分钟。通过加入20倍体积的10mM EDTA、25mg/mL牛血清清蛋白、0.05％吐温20和0.01％硫柳汞(pH 7.4)(即，由EDTA补充的SC5b-9ELISA试剂盒的“样品稀释液”)中止反应。如前所示(Szebeni，J.等人，J.Natl.Cancer Inst.，90：300(1998))，通过酶联免疫吸附试验(Quidel Co.，San Diego，CA)测定SC5b-9。

实施例7

体内补体激活的测量

将实施例6中所述制备的脂质体对猪进行如下给药。使用25-40kg的不分性别的约克夏(Yorkshire)猪。对动物肌肉注射氯胺酮(500mg)使其镇静并使用麻醉机用2％异氟烷麻醉。使肺动脉导管经由右颈内静脉穿过右心房进入肺动脉，以测量肺动脉嵌入压(PAP)。在股动脉中测量体动脉压(SAP)。手术、仪器、和血液动力学分析的其它细节如先前所述(Szebeni，J.等人，Circulation，99：2302(1999)))进行。

将所示量的各个脂质体制剂在1mL PBS中稀释并通过导管导引器注射到颈静脉中或通过肺动脉插管直接注射到肺动脉中。这些注射方法在诱导血液动力学变化中是等效的。用5-10mL PBS将脂质体冲洗到循环中。为了提供对脂质体反应的综合测量，通过监测以下生理学异常之一通过随机分级方案对血液动力学改变进行定量测量：

异常

PAP上升

体动脉压(SAP)上升或下降

心输出量下降

EKG异常

呼出的CO₂下降

心率上升或下降

血浆TXB2上升

肺循环和体血管阻力上升

潮红

如下将猪中脂质体诱导的心血管反应分级：

等级	症状
		0(没有)	ECG或任何血液动力学参数没有显著改变
I(最小的)	以下参数中的一项或多项有短暂的(＜2分钟)、＜20％、可清楚识别的改变：心率、ECG、SAP、PAP、Hb氧饱和
		II(温和的)	以下参数中的一项或多项有短暂的(＜2分钟)、＞20％但＜50％的改变：心率、ECG、SAP、PAP、Hb氧饱和
III(严重的)	以上参数中多于一项有更长的(最大为10分钟)＞50％的改变：+慢脉型心率不齐
		IV(致命的)	致命反应：在4分钟内循环衰竭，需要肾上腺素和/或去心脏纤颤的CPR。典型地SAP下降到＜40mm Hg，PAP上升到最大值(cc 60mmHg)，心动过速然后是严重的心动过缓和心律不齐，导致心跳停止和死亡

实施例8

脂质体制剂的体内表征

制备四种脂质体(LUV)制剂。脂质体组成和表征如表6中所述。在制备每种制剂时，将制剂的所有脂质组分溶解于叔丁醇中。将澄清的溶液冻干。将粉末在10mL热(65℃)无菌无热原的盐水中通过在70℃下涡流水合1分钟形成多层小囊。使用得自Northern Lipids(以前为Lipex，Vancouver，BC，Canada)的TEX 02010mL桶式挤出机在62℃下使多层小囊通过0.4和0.1μm孔径的聚碳酸酯过滤器两步挤出步骤中使其尺寸缩小，分别通过每种孔径10次。脂质体制备的所有步骤都在无菌条件下进行。

使用市售的Doxil^(磷脂浓度13.3mM，150μg阿霉素/μmol磷脂)。在盐水(0.9％NaCl)和没有(NH₄SO₄)梯度中制备所有的其它脂质体。使用的所有脂质体的大小都为105nm±35nm(参见表6)。

将所示量的Doxil^和其它试验用脂质体在1mL PBS中稀释并注射到右心室中、或通过肺动脉插管直接注射到猪的肺动脉中。用10mLPBS将脂质体冲洗到循环中。以前的发现表明小的脂质体团的血液动力学效果是非快速免疫的并在相同的动物中可定量地重现若干次，因此，在各个猪中注射增加量的同样类型的脂质体，直到出现反应，或在没有反应时，直到某一预定的极限剂量。结果如表7中所示。

虽然已经参考特定方法和实施方案描述了本发明，应该理解，可在不脱离本发明的基础上进行多种改进。

Claims (15)

1.脂质体组合物在制备当体内给予含有包载治疗剂的脂质体时用于减少脂质体诱导的补体激活的药物中的用途，所述脂质体组合物包括由成囊脂质和1-10摩尔％的下式表示的中性脂质聚合物以及余量的成囊脂质组成的脂质体：

其中R¹和R²各自为具有8到24个碳原子的烷基或链烯基链；

n＝10-300，

Z选自C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃烷基醚、n-甲基酰胺、二甲基酰胺、甲基碳酸酯、二甲基碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、n-甲基乙酰胺、羟基、苄氧基、羧酸酯和C₁-C₃烷基碳酸酯，或芳基碳酸酯；和

L选自(i)-X-(C＝O)-Y-CH₂-、(ii)-X-(C＝O)-和(iii)-X-CH₂-，其中X和Y独立地选自氧、NH和直接键，条件是当L为-X-(C＝O)-时，X不是NH。

2.权利要求1的用途，其中X为氧，Y为氮。

3.权利要求1或2的用途，其中L为氨基甲酸酯键、酯键或碳酸酯键。

4.权利要求3的用途，其中L为-O-(C＝O)-NH-CH₂-。

5.权利要求1或2的用途，其中Z是羟基或甲氧基。

6.权利要求1或2的用途，其中所述脂质体包括1摩尔％到10摩尔％的中性脂质聚合物氨基甲酸酯连接的二硬脂酰基聚乙二醇。

7.权利要求1或2的用途，其中所述脂质体包含1摩尔％到10摩尔％的中性脂质聚合物甲氧基聚乙二醇1，2-二硬脂酰甘油。

8.权利要求1或2的用途，其中R¹和R²各自是具有8到24个碳原子的无支链的烷基或链烯基链。

9.权利要求1或2的用途，其中R¹和R²各自为C₁₇H₃₅。

10.权利要求1或2的用途，其中n为20到115。

11.权利要求1或2的用途，其中治疗剂为化疗剂。

12.权利要求11的用途，其中所述化疗剂为蒽环类抗生素。

13.权利要求12的用途，其中所述化疗剂选自阿霉素、柔红霉素、表柔比星和依达比星。

14.权利要求11的用途，其中所述化疗剂为含铂的化合物。

15.权利要求14的用途，其中所述含铂的抗生素为顺铂或选自以下的的顺铂类似物：卡铂、奥马铂、奥沙利铂、((-)-(R)-2-氨基甲基吡咯烷(1，1-环丁烷二羧基合))铂、折尼铂、恩洛铂、洛铂、(SP-4-3(R)-1，1-环丁烷-二羧基合(2-)-2-甲基-1，4-丁二胺-N，N′))铂、奈达铂和双乙酸基合-氨络物-二氯环己胺-铂(IV)。

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