CN111265480B - 一种表柔比星脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种盐酸表柔比星脂质体，含有脂质双层和内水相，内水相中含有硫酸铵溶液和盐酸表柔比星，所述内水相中硫酸铵的浓度为200‑300mmol/L，硫酸铵与盐酸表柔比星的摩尔比为0.1‑3.0。所述脂质双层含有氢化大豆卵磷脂、胆固醇和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。所述脂质体的体外释放率20min为30％‑50％，60min为50％‑75％，180min为大于80％。所述的盐酸表柔比星脂质体的形状为球形或椭球形，长轴/短轴的平均值≤2。研究表明通过控制内水相中硫酸铵与药物的比例，在保证药物释放一致和降低过敏反应发生率方面都获得了令人满意的结果。

Description

一种表柔比星脂质体及其制备方法
与相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2018年12月4日提出的中国专利申请201811470726.6的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种表柔比星脂质体及其制备方法和用途。
背景技术
盐酸表柔比星又叫盐酸表阿霉素，是蒽环类抗肿瘤药，盐酸表柔比星是盐酸多柔比星的同分异构体，与盐酸多柔比星相比，仅在氨基糖部分4位的羟基由顺式变成了反式。盐酸表柔比星由意大利Farmitalia Carlo Erba公司开发，1984年在意大利上市，1998年在中国上市，是一种广谱的化疗药物，其适应症包括乳腺癌、胃癌、何杰金氏淋巴瘤、肺癌和卵巢癌。盐酸表柔比星的骨髓毒性和心脏毒性均低于盐酸多柔比星，所以目前在临床上被广泛使用。
然而，盐酸表柔比星普通注射液与其它抗肿瘤药物一样，在临床上表现出许多毒副作用。目前药物载体是最经常使用的减少化疗药物毒副作用的手段，其中属脂质体应用最为广泛。国内外已经报道了许多关于盐酸表柔比星脂质体的研究和产品开发工作(周晖,贺霞,杨文涛,等.表柔比星长循环脂质体冻干粉的制备；吴燕,吴诚,梅兴国,等.盐酸表柔比星长循环热敏脂质体的处方优化及体外释药考察；吴燕,吴诚,梅兴国,等.盐酸表柔比星长循环热敏冻干脂质体的处方工艺研究与体外释药机制探讨；方瑜,陈进,吴询燊,等.盐酸表柔比星长循环磁性脂质体的制备及表征；张诚翔,赵炜煜,吕万良.多功能靶向性表柔比星脂质体的制备及其对脑胶质瘤细胞的抑制效应.)。
美国Johnson&Johnson公司也进行了盐酸表柔比星脂质体的研发工作，其采用了硫酸铵(化学式(NH4)2SO4)梯度法装载药物。硫酸铵梯度法是pH梯度法的一种发展形式，它是利用硫酸铵作为水相，首先制备内外均含有硫酸铵的脂质体，然后通过去除脂质体外水溶液中的硫酸铵，使得脂质体内外的硫酸铵浓度形成浓度梯度，而硫酸铵梯度又是产生pH梯度的原动力，即内水相的NH4+易分解成NH3和H+，而不同离子对双分子层渗透系数不同，(NH4)2SO4<SO4 2-<NH+<H+<NH3。随着中性氨分子离开脂质体，质子被保留在脂质体的内水相中，从而导致脂质体内外相的H+浓度差，即产生了一个pH梯度。弱碱性药物进入到内水相酸性环境后变成离子态，阻止其返回外水相并与SO4 2-形成沉淀，对双分子层有很低的渗透系数，从而使药物能够高效而稳定的装载到脂质体内。该方法适用于装载蒽环类等两性弱碱性药物。美国Johnson&Johnson公司采用该技术装载盐酸表柔比星后能够实现药物的高效装载，临床前研究也表明制备成脂质体后能够明显的增强药效、降低毒性。但是截止到目前，仍没有上市的盐酸表柔比星脂质体产品。
许多已上市的脂质体在临床使用时会出现过敏反应的风险，例如Doxil，其在临床上出现过敏反应率为10％左右。由于这类反应是由脂质体激活补体引发的，并且没有IgE介导，因此这类反应叫做补体激活相关的假性过敏反应(C activation-relatedpseudoallergy，CARPA)。有研究表明，盐酸多柔比星脂质体与其未装载药物的空白脂质体，或是处方组成相同、装载药物不同的顺铂脂质体相比，CAPRA反应的发生率明显升高，分析该现象发现这种差异是由于脂质体的形状不同造成的。在载药过程中脂质体内相里面的硫酸根与药物形成沉淀，由于沉淀的影响，导致脂质体变成了类似咖啡豆的椭球型，而空白脂质体和顺铂脂质体(药物装载后不形成沉淀)则为正球型，由于形状的改变导致激活补体的能力不同，从而导致过敏反应率存在差异(J Szebeni，P Bedcs，Liposome-inducedcomplement activation and related cardiopulmonary distress in pigs:factorspromoting reactogenicity of Doxil and AmBisome)。
补体是一组存在于人和动物体液中及细胞表面，经活化后具有生物活性，可介导免疫和炎症反应的蛋白，也称为补体系统，补体系统由近40种成分组成，多数组分为糖蛋白。补体系统有三条激活途径，分别为：经典途径、替代途径和凝集素途径，不同的途径由不同的补体蛋白参与，但是3条途径最终都会形成膜攻击复合物SC5b-9。有研究者使用血浆中的SC5b-9的含量变化来衡量Doxil的过敏反应的程度，并建议临床上可以通过检测血清SC5b-9的含量来评价CARPA反应的强度。其研究表明，药物激活血清中SC5b-9浓度与baseline(PBS组)相比，如果增加在30％～100％之间，认为是温和的补体反应，临床上出现过敏反应的可能性极小；增加100％～300％，被认为在临床上出现过敏反应的风险增加；当浓度增加超过300％时，则认为在临床上会出现补体激活、发生过敏反应风险较高(Chanan-Khan，A.，Szebeni，J.，Complement activation following first exposure topegylated liposomal doxorubicin(Doxil):possible role in hypersensitivityreactions)。
目前已知的研究仅关注内相硫酸铵对包封率的影响，没有任何研究揭示或暗示了哪些因素会对药物释放和过敏反应造成影响。
发明内容
本发明的发明人在研究表柔比星脂质体时出乎意料地发现：采用相同的初始投料量和工艺，制备得到的盐酸表柔比星脂质体的药物释放有很大差异，而且在体内引起的过敏反应率也不同。研究表明通过控制硫酸铵与药物的比例，在药物释放和过敏反应发生率方面都获得了令人满意的结果。
为揭示药物释放和过敏反应的影响因素，本发明的发明人对多个工艺参数进行了比较研究，发现，在本发明限定条件下，制备初始时硫酸铵投入量虽然会对最终脂质体内相中的硫酸根与表柔比星的摩尔比产生一定的影响，但未显著影响脂质体的形态；其次，制备不同内相硫酸铵与药物的比例的处方，这些处方的包封率没有差别，但是脂质体内沉淀纤维的性状和脂质体的形态不同，且不同处方的体外释放率以及激活补体的能力也存在差异。
本发明通过控制内水相中硫酸铵与盐酸表柔比星的比例，不仅能保证不同批次脂质体的释放率一致，而且能控制脂质体形态，将盐酸表柔比星脂质体引起的CARPA反应的发生率控制在较低水平。
下文中所述的硫酸铵的浓度、硫酸铵与盐酸表柔比星的摩尔比、脂质体中各组分含量、药脂比(质量比)、体外释放率、长轴/短轴的平均值、脂质体的粒径所涉及的数据，均允许±20％的误差。
本发明提供一种盐酸表柔比星脂质体，含有脂质双层和内水相，内水相中含有硫酸铵溶液和盐酸表柔比星，其中内水相中硫酸铵的浓度为200-300mmol/L，硫酸铵与盐酸表柔比星的摩尔比为0.1-3.0。
当硫酸铵与盐酸表柔比星的摩尔比大于3.0时，载药量过低。
上述的盐酸表柔比星脂质体，其中所述内水相中硫酸铵的浓度为225-275mmol/L，硫酸铵与盐酸表柔比星的摩尔比为0.8-2.5，优选1.1-2.5，进一步优选1.2-2.5，进一步优选1.5-2.5，最优选1.7-2.5。
上述任一项所述的盐酸表柔比星脂质体，其中脂质双层含有氢化大豆卵磷脂、胆固醇和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
上述盐酸表柔比星脂质体，其中各组分含量为：氢化大豆卵磷脂8.5-10.5mg/ml、胆固醇2.5-4mg/ml和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺2.5-4mg/ml，药脂比(质量比)为1:9.58-3:9.58。
上述盐酸表柔比星脂质体，其中各组分含量为：氢化大豆卵磷脂9-10mg/ml、胆固醇2.9-3.5mg/ml和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺2.9-3.5mg/ml，药脂比(质量比)为1:9.58-3:9.58。
上述任一项所述的盐酸表柔比星脂质体，其中脂质体的体外释放率20min为30％-50％，60min为50％-75％，180min为大于80％。
上述任一项所述的盐酸表柔比星脂质体，其中脂质体的形状为球形或椭球形，长轴/短轴的平均值≤2，优选长轴/短轴的平均值≤1.5，进一步优选长轴/短轴的平均值≤1.1。
所述长轴的长度数值大于短轴的长度数值。
上述任一项所述的盐酸表柔比星脂质体，其中脂质体的粒径为70-150nm，优选70-110nm，进一步优选为80-100nm。
本发明的目的还在于提供制备上述的盐酸表柔比星脂质体的方法，含有如下步骤：将氢化大豆卵磷脂、胆固醇和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于乙醇中，完全溶解形成脂相溶液；配制硫酸铵溶液作为水相溶液；脂相溶液与水相溶液混合，以蔗糖/组氨酸溶液为透析液，透析置换外相中的硫酸铵溶液，之后将盐酸表柔比星游离药溶液与透析后的空白脂质体混合，孵育，完成药物装载。
本发明还提供一种注射剂，含有如上述任一项所述的盐酸表柔比星脂质体。
本发明还提供上述表柔比星脂质体或其注射剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。所述肿瘤包括恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、白血病。所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌或耐药乳腺癌。
附图说明
图1 A为LipEPI-8的电镜图，B为LipEPI-5的电镜图，C为LipEPI-10的电镜图。
图2 A为空白脂质体的电镜图，B为LipEPI-7的电镜图，C为LipEPI-2的电镜图，D为LipEPI-9的电镜图。
图3LipEPI-8、LipEPI-5和LipEPI-10三个处方的体外释放结果。
图4LipEPI-8、LipEPI-5和LipEPI-10三个处方激活血清中补体SC5b-9的结果。
***表示P<0.001，与空白脂质体比较。▲▲是P<0.01，与EPI-10比较
具体实施方式
以下实施例是对本发明的具体说明，不应对本发明的范围构成限制。
实施例1
按照氢化大豆卵磷脂(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine，HSPC)95.8mg/ml、胆固醇31.9mg/ml、培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)31.9mg/ml的浓度称取各组分，溶于乙醇中，完全溶解形成脂相溶液。分别配制225mM、250mM和275mM的硫酸铵溶液作为水相溶液，脂相溶液与水相溶液混合，之后在60℃恒温水浴中水化。水化后的溶液置挤出仪，使用聚碳酸酯膜，将脂质体的粒径分别挤出到80nm和100nm左右。以蔗糖/组氨酸溶液为透析液，透析置换外相中的硫酸铵溶液。透析完成后，将盐酸表柔比星游离药溶液(Epirubicin，EPI)与透析后的空白脂质体按照2:9.58的药脂比(重量比，EPI：HSPC)混合，完成药物装载。装载后，各组分浓度分别为：氢化大豆卵磷脂9.58mg/ml、胆固醇3.19mg/ml、培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺3.19mg/ml。
制备的具体处方如表1所示。电镜观察，上述脂质体样品的形态相似。
表1制备的具体处方及检测结果
处方名称 硫酸铵mmol/L 粒径nm 包封率％ 内水相中Mol<sub>SO4</sub><sup>2-</sup>/Mol<sub>EPI</sub>
LipEPI-1 225mM 85.71 97.37 0.86
LipEPI-2 250mM 86.10 98.31 1.08
LipEPI-3 275mM 88.57 97.12 1.05
LipEPI-4 225mM 105.50 97.92 0.97
LipEPI-5 250mM 95.88 97.96 1.07
LipEPI-6 275mM 100.4 97.01 1.18
从测定的结果可以看出，在发明选用的硫酸铵浓度范围内，调整硫酸铵浓度不会对脂质体的包封率产生显著影响。在所述试验条件下，虽然硫酸铵浓度不同会使内水相中硫酸根与表柔比星的摩尔比相应改变，但是这种摩尔比差异未对脂质体的形态产生显著影响。此结果表明在本发明所述的硫酸铵浓度范围内，在药脂比相同的情况下，初始内相溶液中硫酸铵的浓度不会脂质体包封率产生显著影响，也不会对脂质体形态产生显著影响。
实施例2
按照HSPC 95.8mg/ml、胆固醇31.9mg/ml、mPEG2000-DSPE 31.9mg/ml的浓度准确称量各组分，溶于乙醇中，完全溶解形成脂相溶液。配制250mM的硫酸铵溶液作为水相溶液，将脂相溶液与水相溶液混合，之后在60℃恒温水浴中水化。水化后的溶液置挤出仪，使用聚碳酸酯膜，将脂质体的粒径分别挤出到80nm和100nm左右。以蔗糖/组氨酸溶液为透析液，透析置换外相中的硫酸铵溶液。透析完成后，将盐酸表柔比星游离药溶液与透析后的空白脂质体按照1:9.58、2:9.58以及3:9.58的药脂比(EPI：HSPC)混合，完成药物装载。装载后，各组分浓度分别为：氢化大豆卵磷脂9.58mg/ml、胆固醇3.19mg/ml、培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺3.19mg/ml。
制备的具体处方如表2所示。电镜观察脂质体形态。
表2制备的具体处方及检测结果
Figure BDA0002300847200000051
Figure BDA0002300847200000061
从结果可以看出，使用的处方中，内相硫酸根与表柔比星的比例随着药脂比的变化而有所不同，但各个处方的包封率都>97％，且不同处方的差异不大。在脂质体的内相中药物和硫酸根以(EPI)2SO4的形式形成沉淀，当内相SO4 2-与EPI的摩尔比越小时，参与形成沉淀的SO4 2-越多，沉淀纤维的体积越大(直径越大，长度越长)，内相的渗透压越小。从附图1中可以看出，A为LipEPI-8的电镜图，内相SO4 2-与EPI的摩尔比为2.38，沉淀较为细；B为LipEPI-5的电镜图，内相SO4 2-与EPI的摩尔比为1.07，与LipEPI-8相比沉淀增粗，但是长度变化不大；C为LipEPI-10的电镜图片，该处方内相SO4 2-与EPI的摩尔比为0.50，形成沉淀纤维的直径和长度都大于其它两个处方。这说明脂质体内相中硫酸根与表柔比星的比例会影响脂质体内沉淀的性状。
此外，内相中SO4 2-与EPI的摩尔比的降低，一方面形成的沉淀体积直径和长度增加，另一方面参与形成沉淀的SO4 2-越多，脂质体内的渗透压越低，内外相的渗透压差越大，导致脂质体在沉淀纤维性状和脂膜内外压差增大的共同影响下发生形变，不再是类似空白脂质体正球形，而变成椭球型甚至“杆状”(见附图2)。附图2中，A为空白脂质体的电镜图，形状为正球型；B为LipEPI-7的电镜图，可以看出形状基本上仍接近正球型；C为LipEPI-2的电镜图片，已经变成以沉淀为长轴的椭球型；D为LipEPI-9的电镜图片，形变最为严重，已经变成“杆状”。这说明脂质体内相中硫酸根与表柔比星的比例会影响脂质体的形态。
随机选择电镜图片中的脂质体，经过MShot Image Analysis System软件测量，发现脂质体的形状为球形或椭球形时，长轴/短轴的平均值≤2，结果见表3和表4。
表3 LipEPI-2、LipEPI-7和LipEPI-9的长轴、短轴、长轴/短轴和长轴/短轴平均值测量结果
Figure BDA0002300847200000062
Figure BDA0002300847200000071
Figure BDA0002300847200000081
表4 LipEPI-5、LipEPI-8和LipEPI-10的长轴/短轴平均值测量结果
样品 长轴/短轴平均值
LipoEPI-5 1.71
lipoEPI-8 1.22
lipoEPI-10 5.26
实施例3
按照实施例2的制备方法，制备内相为225mM硫酸铵，粒径为80nm的空白脂质体，分别按照药脂比2:9.58、3:9.58、4:9.58载药，考察装载的包封率。结果见表5。表5表明，在225mM的内相条件下，药脂为4:9.58时，药物的包封率仅为18.34％，电镜图显示视野中有大量的脂质体没有装载药物，分析是由于形成的沉淀将脂膜戳破，药物渗漏而导致。
表5不同药脂比表柔比星脂质体的包封率
Figure BDA0002300847200000091
实施例4
考察不同内相SO4 2-与EPI的摩尔比的脂质体的体外释放差异：取LipEPI-8、LipEPI-5和LipEPI-10各3ml，分别加入1mL的2.5mol/L的氯化铵溶液(pH值6.5)，混匀。每份脂质体溶液取1ml分别置于3个塑料离心管中，于水浴中放置0.5h、1h和3h，到时间后，立即取出相应应的离心管置冰水浴中冷却。用一次性纤维素GF-5脱盐色谱柱(102mm×8mm，内含凝胶2ml)分离包封和游离的药物，测定包封率。取样品100μl加入GF-5柱中，当样品完全进入GF-5柱后，用0.9％氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液测定其中EPI的含量，该部分为包封部分。在已完成上一步洗脱的GF-5柱中，加入洗脱液(缓冲液(2.88g的十二烷基磺酸钠，1.36ml的磷酸，水溶解至1000ml)：乙腈：甲醇＝51:42:7)4ml，使之在重力作用下洗脱，收集洗脱液，测定其中的EPI含量，该部分为游离药部分。体外释放率的计算公式如下：
体外释放率(％)＝初始包封率(％)－释放试验后的包封率(％)
脂质体发挥药效的前提是药物能够从脂质体中释放出来，EPI在脂质体中以沉淀的形式存在，沉淀的性质直接决定了药物的释放速度。LipEPI-8、LipEPI-5和LipEPI-10两个处方中内相中SO4 2-与EPI的摩尔比分别为2.38、1.07和0.50，由电镜图可以看出3个处方的沉淀形态有明显的差异，而从附图3可以看出，3个处方的释放曲线也不同，LipEPI-8和LipEPI-5释放行为更相似，而LipEPI-10的释放更慢，与前两者存在明显差异。
实施例5
脂质体在体内通过激活补体而产生过敏反应(即CARPA反应)，有文献报道，通过体外脂质体对血清中补体激活实验可以反映该脂质体在体内激活补体的情况。因此，通过检测脂质体加入血清后血清中SC5b-9的量的变化，来评价不同处方脂质体在体内引发CARPA反应的风险。SC5b-9的量增加的越多，表明激活补体的反应越强，引起过敏反应的可能性也越大。
采集40个健康志愿者的全血，用10ml真空玻璃促凝采血管收集，全血在室温放置30min使其凝固，之后用3000rpm离心5min收集血清。分别从40份样品中取200ul置于15ml离心管中制成混合血清，充分混合后，分装，于-80℃保存。血清取出后在37℃的水浴中快速融化，之后立刻置于冰上，从中取出40ul的人血清加入10μl的LipEPI-8、LipEPI-5、LipEPI-10以及空白脂质体，之后在37℃振荡水浴(80rpm)中孵育30min，反应结束后，加入终浓度为20mM的EDTA终止反应，之后样品放置于冰上以备检测。激活后的血清样品用样品稀释液稀释20倍，取100μl加入到SC5b-9ELISA试剂盒的96孔板的孔中，后续操作按照SC5b-9的说明书进行，最后在450nm检测吸光度值(OD值)。OD值与SC5b-9的浓度正相关，OD值越大，SC5b-9的浓度越高。
从结果(见附图4)可以看出，载药后的脂质体与空白脂质体相比，SC5b-9的量明显升高，该结果与文献报道的一致。LipEPI-8、LipEPI-5和LipEPI-10这三个处方内相中SO4 2-与EPI的摩尔比不同，根据电镜图可知，三者的形态也有明显差异：LipEPI-8接近正球型，LipEPI-5为椭球型，而LipEPI-10则为“杆”状，由于三者的形态差异，在体外加入到血清之后，激活SC5b-9的量也不同，lipEPI-10由于形变最严重，激活的SC5b-9也最多，而LipEPI-8和lipEPI-5激活的量明显少于lipEPI-10，两者之间差异不大。
实施例6
许多组织的肥大细胞中含有大量的组胺。当组织受到损伤或发生炎症和过敏反应时，都可释放组胺，因此，组胺是过敏标志物之一，可通过体外药物刺激肥大细胞释放组胺实验来预测其在体内产生过敏反应的可能。
取大鼠腹腔肥大细胞，置冰上备用。96孔板中每孔加入肥大细胞悬液200μl，每孔细胞数2×105/孔，37℃水浴预孵5min。分别加入50μl各浓度药物使成不同的终浓度，阴性对照加入等量药物稀释液(生理盐水溶液)，每浓度3复孔，继续孵育60min，然后将96孔板置-20℃终止反应。3000r/min离心10min分离细胞。上清液封装于1.5ml小管中，-20度保存待测。
取待测液200ul，依次加入200ul 0.5M Na3PO4，0.1M HCl溶液200ul，0.4M NaOH溶液200ul，混匀后立即加入0.1％OPT溶液200ul，混匀后室温下反应15min，然后加200ul0.5M HCl终止反应。所得反应产物使用荧光分光光度计进行检测，激发波长360nm，发射波长460nm，波宽10nm。结果见表6。
表6不同处方脂质体对大鼠肥大细胞组胺释放的影响
Figure BDA0002300847200000101
Figure BDA0002300847200000102
Figure BDA0002300847200000111
**p<0.01，*p<0.05，与LipoEPI-10相比
可见，同等药物浓度下，LipoEPI-10刺激肥大细胞释放的组胺量明显高于LipoEPI-5和LipoEPI-8，且有统计学意义。因此，相对于LipoEPI-10来说，LipoEPI-5和LipoEPI-8在体内引起过敏反应的可能更小。
实施例7
以HSPC 95.8mg/ml、胆固醇31.9mg/ml、mPEG2000-DSPE 31.9mg/ml为1倍磷脂浓度，分别制备磷脂浓度为0.75、1、1.25和1.5倍的空白脂质体：1)0.75倍磷脂浓度处方：按照HSPC 71.9mg/ml、胆固醇23.9mg/ml、mPEG2000-DSPE 23.9mg/ml的浓度准确称量各组分；2)1倍磷脂浓度处方：按照HSPC 95.8mg/ml、胆固醇31.9mg/ml、mPEG2000-DSPE 31.9mg/ml的浓度准确称量各组分；3)1.25倍磷脂浓度处方：按照HSPC 119.8mg/ml、胆固醇39.9mg/ml、mPEG2000-DSPE 39.9mg/ml的浓度准确称量各组分；4)1.5倍磷脂浓度处方：按照HSPC143.7mg/ml、胆固醇47.9mg/ml、mPEG2000-DSPE 47.9mg/ml的浓度准确称量各组分。将称量好的各组样品溶于乙醇中，完全溶解形成脂相溶液。配制250mM的硫酸铵溶液作为水相溶液，将脂相溶液与水相溶液混合，之后在恒温水浴中水化。水化后的溶液置于挤出仪，使用聚碳酸酯膜，将脂质体的粒径分别挤出到80nm左右。以蔗糖组氨酸溶液为透析液，透析置换外相中的硫酸铵溶液。透析完成后，将盐酸表柔比星游离药溶液与透析后的空白脂质体按照2:9.58的药脂比(EPI：HSPC)混合，完成药物装载。
制备的具体处方如表7所示。
表7制备的具体处方及检测结果
Figure BDA0002300847200000121
这说明，脂质体制备时磷脂浓度不同，但硫酸铵溶液浓度相同时，得到的成品内水相中硫酸铵与磷脂的比例相差不大，如果载药时按照相同的药脂比投料，最终成品内水相中MolSO4 2-/MolEPI的值也不会有太大差异。
实施例8
按照实施例2的制备方法(药脂比2:9.58)，分别制备不同粒径的表柔比星脂质体，考察不同处方小鼠体内毒性的差异。结果见表8。
从小鼠的毒性试验结果可以看出，粒径为130nm左右的脂质体的MTD(最大耐受剂量)值小于80nm和95nm，这说明其毒性明显大于其它两个处方，而80nm和95nm之间没有差别。
表8小鼠单次静脉给药MTD值(n＝5)
Figure BDA0002300847200000122

Claims (15)

1.一种盐酸表柔比星脂质体，含有脂质双层和内水相，内水相中含有硫酸铵溶液和盐酸表柔比星，其特征在于脂质双层含有氢化大豆卵磷脂、胆固醇和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，内水相中硫酸铵的浓度为200-300mmol/L，硫酸铵与盐酸表柔比星的摩尔比为0 .8-3.0，盐酸表柔比星与氢化大豆卵磷脂的重量比为1:9 .58-2:9 .58。
2.如权利要求1所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于所述内水相中硫酸铵的浓度为225-275mmol/L，硫酸铵与盐酸表柔比星的摩尔比为1 .7-2 .5。
3.如权利要求1所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于各组分含量为：氢化大豆卵磷脂8 .5-10 .5mg/ml、胆固醇2 .5-4mg/ml和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺2 .5-4mg/ml。
4.如权利要求3所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于各组分含量为：氢化大豆卵磷脂9-10mg/ml、胆固醇2 .9-3 .5mg/ml和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺2 .9-3 .5mg/ml。
5.如权利要求1-4任一项所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于脂质体的体外释放率20min为30％-50％，60min为50％-75％，180min为大于80％。
6.如权利要求1-4任一项所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于脂质体的形状为球形或椭球形，长轴/短轴的平均值≤2。
7.如权利要求6所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于长轴/短轴的平均值≤1 .5。
8.如权利要求7所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于长轴/短轴的平均值≤1 .1。
9.如权利要求1-4任一项所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于脂质体的粒径为70-150nm。
10.如权利要求9所述的盐酸表柔比星脂质体，其特征在于脂质体的粒径为80-100nm。
11.制备如权利要求1-4任一项所述的盐酸表柔比星脂质体的方法，含有如下步骤：将氢化大豆卵磷脂、胆固醇和培化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于乙醇中，完全溶解形成脂相溶液；配制硫酸铵溶液作为水相溶液；脂相溶液与水相溶液混合，以蔗糖/组氨酸溶液为透析液，透析置换外相中的硫酸铵溶液，之后将盐酸表柔比星游离药溶液与透析后的空白脂质体混合，孵育，完成药物装载。
12.一种注射剂，含有如权利要求1-4任一项所述的盐酸表柔比星脂质体。
13.如权利要求1-4任一项所述的盐酸表柔比星脂质体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
14.权利要求12所述的注射剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于所述肿瘤包括恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、白血病。
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