JP2006508968A - ウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤およびその製造方法 - Google Patents
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本発明で得られたウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の薬物封入率は88.3%、薬物含量は25.2%であった。レーザー粒径測定装置で測定した粒径は平均209.5mm、ゼータ電位は−31.67mV、多分散指数(polydispersity)は0.149であった。
1.実験動物:健康な昆明種マウス、体重18〜20g、雌雄同数、雌雄同数、同済医科大学動物所提供、合格証番号19−052。
ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の肝ガン細胞への抑制作用研究
ヒトの肝ガン細胞株SMMC−7721は第四軍医大学生物教研室による提供。
RPMI−1640培地はギブコ社の製品を用いる。説明に従い3回蒸留して得られた水を用いて調製し、ウシ胎児血清10%(V/V)、ペニシリン1000U/mLとストレプトマイシン100U/mLを添加して0.22Uろ過器で除菌し、4℃の冷蔵庫で保存する。ウシ胎児血清は浙江省金華市清湖犢牛応用研究站の製品を用いる。MTT[3−(4,5)−メチルエチルチアゾール−(2,5)−ジメチルプロミドブルーテトラゾリウム]はアメリカのシグマ社製で、リン酸塩緩衝液(0.01mol/L,pH7.4,PBS)で5mg/mLの溶液をつくり、ろ過除菌し、4℃の冷蔵庫で保存する。TUNEL未端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼキット[Termi−naldeoxylnuculeotidyl Transferase(TdT)]はアメリカのプロメガ社製を用いる。DIG−dUTPはドイツのBM社の製品を用いる。Anti−DIG−Biotinはアメリカのシグマ社の製品を用いる。エトポシドは北京製薬工業研究所実験薬廠の製品を用いる。免疫組織化学法試薬キットは武漢博士徳公司の製品を用い、一次抗体は小ロット包装の輸入品で、SABC及びDABキットはともに武漢博士徳公司製である。
3.1 実験用薬品の調製:ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤に注射用水を加え完全に溶解した後、加熱煮沸(100℃30分)して濃度を100mg/mL(ウルソル酸含有)に調整する。使用前、無菌環境下で培養液で段階希釈して必要な濃度にする。
抑制率(E)=(1−OD薬/OD対)×100%。
4.1 ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の肝ガン細胞SMMC−7721に対する投与量依存抑制:
MTT法によりウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のSMMC−7721増殖に対する抑制を測定した。ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤はSMMC−7721細胞の増殖に対してあきらかな抑制・殺傷作用が見られた。ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の投与量の増加にしたがって抑制程度も強まり、両者はプラスの相関関係(r=0.976,p<0.01)を示した。統計学処理で曲線を直線に近似させて回帰計算した結果、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のIC50は4μ/mLを示した。IC50(ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤)<IC50(VP16)、(t=−10.84,P<0.01)という結果は、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のSMMC−7721に対する抑制作用があきらかにVP16より勝っていることを示している。
免疫組織化学法でp53、ToopII、bc1−2の発現を測定すると(表2)、ToopII、p53蛋白は細胞核内のみに存在し細胞質中にはなく、細胞は黄色から濃いチョコレート色に染色した。bc1−2蛋白は細胞質中で淡黄色に発色し、核内にはなかった。SMMC−7721の正常細胞対照染色において3者はいずれも陽性または強い陽性を示したが、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の細胞に作用する時間を長くするにつれて、3者ともあきらかに低減変化を示した。
以上の実験は、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のヒト肝ガン細胞SMMC−7721に対する抑制作用および殺傷作用がエトポシド(VP16)をあきらかに上回り、且つ、投与量の増大につれてその抑制強度も増し、両者は正の相関関係を示すことを物語る。さらに行われた研究は、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤がp53、bc1−2、TopoII発現を抑制し得ることを証明し、それによるガン細胞の増殖抑制作用および殺傷作用の達成を明らかにした。
Claims (8)
- ウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤であって、その主要原料の組成が活性原料ウルソル酸、ウルソル酸ナノ粒子用複合担体、凍結乾燥助剤であることを特徴とするウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤。
- その複合担体として大豆レシチンおよびステアリン酸を選択することを特徴とする請求項1に記載のウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤。
- その凍結乾燥助剤中の賦形薬に、マンニトール、注射用乳糖、注射用ブドウ糖、デキストラン、塩化ナトリウム、グリシンナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、アミノ酢酸の中から一種、好ましくは乳糖を用いることを特徴とする請求項1に記載のウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤。
- 活性原料ウルソル酸、ウルソル酸ナノ粒子用複合担体の大豆レシチンおよびステアリン酸、凍結乾燥助剤の乳糖の重量比が、0.1〜10:0.3〜30:0〜10:0.1〜20であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤。
- ウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法であって、ウルソル酸を医薬用有機溶剤で溶解後、複合担体として大豆レシチンとステアリン酸を加え、45〜55℃に加熱して反応が完全になるまで攪拌し、蒸留水を加え、賦形薬を加え、35〜55℃に加熱して反応が完全になるまで攪拌し、その後細孔ろ過膜でろ過し、ろ液を凍結乾燥させて凍結乾燥注射剤を得ることを特徴とするウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法。
- 請求項5に記載のウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法であって、有機溶剤にメタノール、アセトンの中の1種あるいは2種を採用することを特徴とするウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法。
- 請求項5に記載のウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法であって、賦形薬に乳糖を用い、乳糖を加えた後35〜55℃に加熱することを特徴とするウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法。
- 請求項5に記載のウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法であって、凍結乾燥温度が−45〜−55℃であることを特徴とするウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法。
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