CN1231209C - 熊果酸聚乳酸纳米粒冻干粉针剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米级熊果酸冻干粉针剂。其主要原料组成为：活性原料熊果酸，分散剂，熊果酸纳米粒载体，冻干辅料。与熊果酸的普通制剂比较，熊果酸纳米粒粉针具有肝靶向作用，能在病变部位浓集，提高了药物的治疗效果，减少药物的毒副作用。其制备方法为：熊果酸用医用有机溶剂溶解后，加入表面处理分散剂搅拌，加热边搅拌边加入聚乳酸，反应完成后，在35℃～55℃温度下加入赋形剂搅拌至反应完成，用微孔滤膜过滤，滤液进行冻干的冻干粉针剂。该方法简单易操作。该纳米粒粉针具有分散度高，稳定性好等优点。其平均粒径为218nm，载药量为24.8%。该药物具有抑制和杀灭肝癌细胞，降低p53、bcl-2和TopoII的表达。

Description

熊果酸聚乳酸纳米粒冻干粉针剂及制备方法

                      技术领域

本发明属于药物熊果酸，具体涉及熊果酸的纳米级冻干粉针剂及制备方法。

                      背景技术

熊果酸为植物体内的一种有机酸，近年来国内外的实验研究发现本品对肿瘤、炎症及某些基因有作用。

目前有关熊果酸的药理作用，都是停留在实验室的研究工作，并没有熊果酸的制剂上市。近年来国内有人申报了熊果酸的片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、口服液的中国专利，其申请号为99126892-X。熊果酸的水溶性较小，口服后不易吸收。国外的有关熊果酸的研究也都只是原料的普通形式，尚未有其纳米级的文献公开。

                     发明内容

本发明的目的在于提供一种纳米级的熊果酸冻干粉针剂及其制备方法，以提高其安全性。

本发明纳米级熊果酸冻干粉针剂的主要原料组成为：活性原料熊果酸，分散剂，熊果酸纳米粒载体，冻干辅料。

熊果酸纳米粒载体选用聚乳酸。

分散剂选用伯洛沙姆、吐温-80、司盘-65中的一种。

冻干辅料中的赋形剂选用甘露醇、注射用乳糖、注射用葡萄糖、右旋糖酐、氯化纳、甘氨酸纳、磷酸二氢钠、氨基乙酸中的一种，优选乳糖。

活性原料熊果酸、分散剂、熊果酸纳米粒载体聚乳酸、冻干辅料中的赋形剂的重量比为0.1～10∶0.4～40∶0.2～30∶0.1～30。

与熊果酸的普通制剂比较，熊果酸纳米粒粉针具有肝靶向作用，能在病变部位浓集，提高了药物的治疗效果，减少药物的毒副作用。

其制备方法为：熊果酸用有机溶剂溶解后，加入表面处理分散剂搅拌，加热至35℃～55℃边搅拌边加入聚乳酸，反应完成后，在35℃～55℃温度下加入赋形剂搅拌至反应完成，用微孔滤膜过滤，滤液进行冻干的冻干粉针剂。有机溶剂采用甲醇、丙酮中的一种或两种。活性原料熊果酸、分散剂、果酸纳米粒载体聚乳酸、冻干辅料赋形剂的重量比为0.1～10∶0.4～40∶0.2～30∶0.1～30。该方法简单易操作。该纳米粒粉针具有分散度高，稳定性好等优点。其平均粒径为218nm，载药量为24.8％。该药物具有抑制和杀灭肝癌细胞，降低p53、bcl-2和Topo II的表达。

                       附图说明

附图熊果酸聚乳酸纳米粒冻干粉针剂的制备流程图

                     具体实施方式

活性原料熊果酸，分散剂伯洛沙姆，熊果酸纳米粒载体聚乳酸，冻干辅料乳糖的重量比为0.1～10∶0.4～40∶0.2～30∶0.1～30。

如图所示，取熊果酸200mg，加甲醇10ml在室温下搅拌溶解完毕，加入泊洛沙姆400mg，室温下搅拌均匀后，将溶液加热到35℃～55℃如50℃，加入聚乳酸(MW＝3000)3000mg，以3～8毫升/分钟的速度注入如5毫升/分钟，边加边搅拌，搅拌速度为800～1800转/分钟，如1000转/分钟，搅拌25～40分钟后，在35℃～55℃如45℃和800～1800转/分钟，如1000转/分钟搅拌速度条件下，加入乳糖2000mg，继续搅拌2～10分钟。溶液用0.8μ微孔滤膜过滤，滤液分装于西林瓶中，每瓶2ml。在-45℃～-55℃如-50℃冷冻2～4小时，即得成品。

质量检查

上述制得的熊果酸一聚乳酸纳米粒粉针，药物的包封率为92.6％，载药量为24.8％，平均粒径为217.6nm，Zate电位为-22.71mv，聚散指数(Ploydispersity)为0.187。

动物的急性毒性试验

1、动物：健康昆明种小白鼠，体重18～20g/只，雌雄各半，由同济医科大学动物中心提供，合格证号：19-052。

2、供试药品的配制：①熊果酸溶液的配制：取熊果酸(含量为98.7％)6660mg溶于10ml 20％的丙二醇水溶液中。②熊果酸一聚乳酸纳米粒粉针配制，称取样品相当于熊果酸8350mg溶于10ml水中，每个剂量组之间按0.7倍递增。

3、实验方法：将实验动物随机分成5组，每组10只，禁食14小时后，每只一次性尾静脉注射0.5ml，立即观察动物反应，以动物死亡为阳性指标。并记录每组动物死亡数。按Bliss统计方法计算LD₅₀值。

4、结果：实验发现，动物的死亡均在用药后2天内发生。对存活的动物连续观察7天，未再出现死亡。动物死亡均由四肢瘫痪，肌肉无力，最后死于呼吸停止。

实验数据见下表

                表1熊果酸注射剂的LD₅₀

剂量(mg/kg)	动物数(n)	死亡数(r)	死亡率(％)	剂量对数(x)	概率单位(y)
						2250	10	0	0	3.35	0
3713	10	1	10	3.57	3.72
						6126	10	3	30	3.79	4.48
10108	10	6	60	4.00	5.25
						16678	10	10	100	4.22	8.09

LD₅₀＝7413(mg/kg)

              表2熊果酸一聚乳酸的纳米粉针LD₅₀

剂量(mg/kg)	动物数(n)	死亡数(r)	死亡率(％)	对数剂量(x)	概率单位(y)
						2500	10	0	0	3.39	0
4250	10	2	20	3.63	4.16
						7225	10	4	40	3.86	4.75
12283	10	7	70	4.09	5.52
						20880	10	10	100	4.32	8.09

LD50＝7943(mg/kg)

以上结果说明熊果酸纳米粉针比原料药的毒性要小。

药效学试验

熊果酸—聚乳酸纳米粉针对肝癌细胞抑制作用的研究

1.细胞株

人肝癌细胞株SMMC-7721由第四军医大学生物教研室提供

2.主要试剂

RPMI-1640培养基为GIBCO产品，按说明用三蒸水配制，并添加10％(V/V)胎牛血清、1000U/mL青霉素和100U/mL链霉素，0.22U滤器除菌，4℃冰箱保存；胎牛血清为浙江省金华市清湖犊牛应用研究站产品；MTT[3-(4，5)-双甲基-乙-噻唑-(2，5)-二甲基溴化四氮唑蓝]为美国SIGMA公司产品，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH7.4，PBS)配成5mg/mL的溶液，过滤除菌，4℃冰箱保存；TUNEL原位未端标记试剂盒[Termi-naldeoxylnucleotidyl Transferase(TdT]为美国Promega公司产品；DIG-dUTP为德国BM公司产品；Anti-DIG-Biotin为美国SIGMA公司产品；足叶乙甙为北京制药工业研究所实验药厂产品；免疫组化试剂盒为武汉博士德公司产品，一抗为进口分装，SABC及DAB kit均为武汉博士德公司产品。

3.实验方法

3.1实验用药品的配制：将熊果酸—聚乳酸纳米粒粉针加注射用水溶解完毕后，加热煮沸(100℃ 30分钟)调整浓度为100mg/mL(含熊果酸)，使用前，无菌条件下以培养液梯度稀释成所需浓度。

3.2细胞培养：人肝癌细胞株SMMC-7721常规培养于RPMI-1640完全培养液内，置37℃、5％ CO₂孵箱，2天～3天传代1次。取指数生长期细胞供实验。

3.3熊果酸聚乳酸纳米粉针对SMMC-7721作用观察：取对数生长期SMMC-7721细胞常规消化，调整细胞浓度至1×10⁴/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL，用RPMI-1640培养液分别稀释熊果酸聚乳酸纳米粉针药液及足叶乙甙(VP₁₆)至所需实验浓度，于细胞接种24h后，滴入96孔板，每孔100μL。实验组为熊果酸聚乳酸纳米粉针药液+SMMC-7721，阳性对照组为VP₁₆+SMMC-7721，阴性对照组为CM+SMMC-7721，各组设3个复孔，调零孔为200μL完全培养液。细胞于37℃，5％CO₂孵箱继续培养1天、3天、5天、7天后，加入浓度为5mg/mL的MTI，20μL/孔，孵育4h后，小心吸出各孔上清，加入二甲亚砜(DMSO)，150μL/孔，振荡溶解后，于490nm波长处测定各孔光密度值(OD值)。以药物浓度作横轴，细胞生长抑制率作纵轴绘制曲线。

抑制率(E)＝(1-OD_药/OD_对)×100％。

3.4药物对p53、Topo II及bcl-2作用：常规细胞爬片，24h后加熊果酸聚乳酸纳米粉针，浓度10μg/mL，作用48h及72h，以不加熊果酸聚乳酸纳米粉针为对照。培养终止后，冰PBS轻洗2遍。预冷95％酒精固定，4℃保存，用透明玻璃胶将细胞片背面粘于载玻片上，细胞面向上，37℃烘干，PBS浸洗5min，0.3％Tritonx-100，10min，0.01mol/L PBS，2×5min，3％双氧水，37℃，30min，PBS洗3×5min，加二抗，37℃，30min，PBS洗3×5min，滴加DAB显色液15μL/片，5min～15min显色(DAB 5mg溶于10mL，PBS，滤纸过滤后加10μL～15μL 30％双氧水)；镜下观察，显色后将玻璃片放放蒸馏水中，终止显色。Bcl-2片为非细胞核着色作一步核衬染：苏木素1min，自来水冲洗，盐酸酒精2min～5min，水洗，稀氨水，15s～20s，水洗，所有玻璃片经梯度酒精脱水后，二甲苯透明15min，封片。结果判定：光镜观察，p53及Topo II以细胞核染成黄色至棕黄色为阳性细胞，bcl-2以胞质染色成淡黄色为阳性细胞。用低倍镜选择3个背景最清楚，DAB显色对比最满意的区域，换高倍镜分别计算每500个细胞中阳性细胞的数量。取3个区域阳性细胞平均数为阳性率。弱阳性(+)：＜20％；强阳性(+++)：＞70％；中度阳性(++)：介于两者之间。

4.结果

4.1熊果酸聚乳酸纳米粉针对肝癌细胞SMMC-7721的剂量依赖性抑制

以MTT法测定熊果酸聚乳酸纳米粉针对SMMC-7721生长的抑制。熊果酸聚乳酸纳米粉针对SMMC-7721细胞生长有明显的抑制和杀伤作用。随着熊果酸聚乳酸纳米粉针剂量的增高，其抑制程度增强，两者呈正性相关关系(r＝0.976，p＜0.01)。统计学处理将曲线拟合直线化后用回归计算结果显示熊果酸聚乳酸纳米粉针的IC₅₀为4μ/mL；IC₅₀(熊果酸聚乳酸纳米粉针)＜IC_50(VP16)，(t＝-10.84，P＜0.01)，表明熊果酸聚乳酸纳米粉针对SMMC-7721的抑制作用明显优于VP₁₆。

4.2熊果酸聚乳酸纳米粉针对SMMC-7721细胞表达p53、Topo II、bcl-2的影响

免疫组织化学法测定p⁵³、Toop II及bcl-2表达(见表2)，Toop II、p⁵³蛋白仅存于细胞核内，胞质中没有，细胞染成黄色至棕黄色。bcl-2蛋白在胞质中呈淡黄色，核内没有。在SMMC-7721正常细胞对照染色中3者均呈阳性或强阳性，但随熊果酸聚乳酸纳米粉针对细胞作用时间延长，3者均出现明显减弱变化。

表3熊果酸聚乳酸纳米粉针对SSMC-7721、bcl-2、p53及Topo II表达的影响

组别	bcl-2	p53	Topo II
				对照组48h组72h组	++++++	++++	+++++

5.结论

以上实验说明熊果酸一聚乳酸纳米粒粉针对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制与杀伤，作用明显优于足叶乙甙(VP₁₆)，且随着剂量的增高，其抑制强度增强，两者呈正相关。进一步研究证明熊果酸—聚乳纳米粒粉针能够抑制p53、bcl-2和Topo II的表达，从而达到抑制和杀死癌细胞的生长。

Claims (4)

1、一种熊果酸聚乳酸纳米粒冻干粉针剂，其特征在于其主要原料组成为：活性原料熊果酸，选用伯洛沙姆、吐温-80、司盘-65中的一种分散剂，熊果酸纳米粒载体聚乳酸，冻干辅料赋形剂，冻干辅料赋形剂选用甘露醇、注射用乳糖、注射用葡萄糖、右旋糖酐、氯化钠、甘氨酸钠、磷酸二氢钠、氨基乙酸中的一种；活性原料熊果酸、分散剂、果酸纳米粒载体聚乳酸、冻干辅料赋形剂的重量比为0.1～10∶0.4～40∶0.2～30∶0.1～30。

2、如权利要求1所述熊果酸聚乳酸纳米粒冻干粉针剂，其特征在于所述冻干辅料中的赋形剂选用乳糖。

3、一种熊果酸聚乳酸纳米粒冻干粉针剂的制备方法，其特征方法为熊果酸用有机溶剂溶解后，加入表面处理分散剂搅拌，加热至35℃～55℃边搅拌边加入聚乳酸，反应完成后，在35℃～55℃温度下加入赋形剂搅拌至反应完成，用微孔滤膜过滤，滤液进行冻干，冻干温度为-45℃～-55℃得冻干粉针剂；活性原料熊果酸，分散剂，熊果酸纳米粒载体聚乳酸，冻干辅料赋形剂的重量比为0.1～10∶0.4～40∶0.2～30∶0.1～30；选用伯洛沙姆、吐温-80、司盘-65中的一种分散剂；冻干辅料赋形剂选用甘露醇、注射用乳糖、注射用葡萄糖、右旋糖酐、氯化钠、甘氨酸钠、磷酸二氢钠、氨基乙酸中的一种；有机溶剂采用甲醇、丙酮中的一种或两种。

4、如权利要求3所述熊果酸聚乳酸纳米粒冻干粉针剂的制备方法，其特征在于选用分散剂伯洛沙姆，以3～8毫升/分钟的速度加入聚乳酸，搅拌速度为800～1800转/分钟。

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