JPH03287530A

JPH03287530A - 免疫抑制剤

Info

Publication number: JPH03287530A
Application number: JP9083038A
Authority: JP
Inventors: Naohiro Washida; 尚洋鷲田; Noriko Yoshida; 紀子吉田; Koichi Koshimizu; 小清水　弘一; Hajime Daito; 肇大東
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1990-03-31
Filing date: 1990-03-31
Publication date: 1991-12-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、免疫抑制剤に関するものである。

（従来の技術）近年に発達した医学上の技術として、代表的なものに臓
器移植が挙げられる。臓器移植はこれまでに致命的とさ
れてきた心疾患、肝疾患、腎疾患の患者にとっては大き
な福音ともいえる。しかし、ＷＸ器移植に伴う問題とし
ては、移植臓器に対する拒絶反応やＧＶＨなどへの注意
が必要である。このためステロイド剤や６−ＭＰ、サイ
クロスポリンなどの免疫抑制剤が使用される。しかしこ
れらの免疫抑制剤は、種々の副作用が問題となっており
、新しい免疫抑制剤の開発が望まれている。

又、最近は、アレルギーなど自己免疫疾患への免疫抑制
剤の投与も行われており、免疫抑制剤の用途は広がって
いる。

一方、本発明者らは多年、植物など天然成分のもつ薬理
活性に注目し研究を進めてきた。この過程において、カ
キドオシに多量に含有されるウルソール酸について着目
し、研究を行ってきた。

ウルソール酸（ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）は、ツツジ
科植物つワウルシの葉、実より得られたウルサン骨格を
有するトリテルペンの一種であり、以下の構造式を有す
る物質である。

このウルソール酸は、カキ、サンザン、ウツボグサなど
の植物体に広く分布していることが知られている。また
、リンゴ、西洋ナシなど多くの果実表面のワックス様物
質もウルソール酸であり、主に医薬品あるいは食品の乳
化剤として用いられている。

このウルソール酸は、−船釣な有機溶剤、例えばメタノ
ールやエタノールなどのアルコール類を用い、日常食す
る果実や漢方生薬として用いられる植物体から簡便に抽
出することが出来る。

ウルソール酸をクロム酸などの触媒の存在下にゆるやか
に酸化することで、３位の水酸基が脱水素され、３−ケ
トウルソール酸が生成することも知られている。

ウルソール酸もケトウルソール酸も毒性はなくゆるやか
な抗菌効果や、肝障害の回復促進、抗潰瘍効果などが知
られ、注目を集めてきている。

本発明者らはこのウルソール酸、ケトウルソール酸の生
理効果について研究を進めた結果、ウルソール酸、ケト
ウルソール酸若しくはこの塩に抗体生産を抑制する作用
のあることを見出した。

（発明が解決しようとする課題）本発明は上述したウルソール酸、ケトウルソール酸若し
くはこれらの塩の示す抗体産生抑制作用を利用した免疫
抑制剤を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段）（１）（ｎ）本発明の免疫抑制剤においては、（１）の構造を有する
ウルソール酸、（ｎ）の構造を有する３−ケトウルソー
ル酸、及びそれらのＮａ、　Ｋなどの無機塩、酢酸、ク
エン酸などの有機塩などを有効成分とする。

本発明の免疫抑制剤を投与する場合、０．０１ｍｇ／ｋ
ｇ〜１０ｍｇ／ｋｇＯ量で経口あるいは非経口的に１日
１回もしくは数回投与すればよい。

投与剤型としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤
、カプセル剤、全列、注射剤などを挙げることが出来る
。

経口用固形製剤を調製する場合は、生薬に賦形剤、結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤などを加えた後、常法に従
って錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの薬剤とする
。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、ブド
ウ糖、マンニトール、結晶セルロースなど、結合剤とし
ては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテ
ル、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシ
プロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、崩壊
剤としては、例えばデンプン、寒天、炭酸カルシウムな
ど、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム
、タルクなと、着色剤としては医薬品に添加することが
許可されているものが、それぞれ用いられる。錠剤、顆
粒剤は必要に応じ、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピ
ルセルロースなどで被膜してもよいし、２以上の層で被
膜してもよい。更に、ゼラチンのような吸収され得る物
質のカプセルでもよい。

注射剤を調製する場合は、生薬に必要に応じ、ｐＨ１１
整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して、常
法により静脈内用注射剤とする。

（実施例）以下に実施例、実験例を示しさらに本発明の詳細な説明
する。

実施例下記配合により、免疫抑制製剤を調製した。

皇１皇土圀ウルソール酸又はケトウルソール酸　　１００．０　ｍ
ｇ乳１ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０．
０　ｍｇ結晶セルロース　　　　　　　　　　　３３．
０　ｍｇカルシウムカルボキシメチルセルロース　４．
０　Ｂ豊葺剋ウルソール酸又はケトウルソール酸乳糖ソルビットコーンスターチヒドロキシプロピルセルロース２００、Ｏｗａｇ５０．０　ｍｇ２５０．０　ｍｇ７５．０　ｍｇ１１０．０　伶ｇ１５．０　ｍｇ５００．０　ｍｇ柱」Ｌ鰻ウルソール酸、ケトウルソール酸はいずれも水に難溶、
もしくは不溶のため、まず必要量をＩＮ水酸化ナトリウ
ム水溶液、エタノールの３：８混合液にｌＯ％濃度で溶
解後、全量を注射用蒸留水で希釈し、全量を１００とし
た。次いで０．２２−のミリポアフィルタ−で無菌濾過
し、バイアル瓶に分注した。−船釣には１１１１ｇ／Ｗ
ｄの濃度に調整し、１１１１ずつ分注し、１１１ｇ注射
液とした。

実験例１本実験例は、実施例で得たウルソール酸、ケトウルソー
ル酸注射液のイン・ヴイトロ抗体産生応答をＴ細胞依存
性抗原を用いたＰＦＣ法により確認した。

（方法） ■Ｔ依存性抗原を用いたＰＦＣ法ＤＢＡ／２マウス（♀、８週齢）の肺臓を摘出し、単細
胞浮遊液を無菌的に調製した。溶血後、１０％ＦＣ３添
加ＲＰＭＩ　−１６４０培地で洗浄した細胞液（２×１
０ｂ個／ｄ）　０．５−に、マウスの羊赤血球（ＳＲＢ
Ｃ）５Ｘ１０ｈ個／−を０．５　ｄ、試料を１０μｌ加
え、３７℃で５％ＣＯ，の下で５日間培養した。培養後
、ＦＣＳ非添加ＲＰＭＩ−１６４０培地１００　ｐｌに
再浮遊し、抗体産生細胞液とした。ＲＰＭＩ−１６４０
−アガロース液００４−１２５％５ＲＢＣ液５０Ｉ！！
、抗体産生細胞液５０μｌ、モルモット補体２０μｌを
混合し、６０ｍｍプラスチックシャーレに薄く層にし、
２時間のインキュベート後、ＰＦＣ数を測定した。

■Ｔ非依存性抗原を用いたＰＦＣ法調製した肺細胞１Ｘ１０’個をリボ多１！（ＬＰＳ）２
５罐／−の存在下、試料を１０μｌ加え３日間、３７℃
で５％ＣＯ□の下で培養し、■と同様にｐＩ細胞を処理
してＰＦＣ数を測定した。

（結果）試料溶解の溶媒として使用しているエタノールが、イン
・ヴイトロ抗体産生糸に影響を与えない最高濃度で、試
料の抗体産生応答に対する効果についてまず調べた。そ
の結果を表１に示す。

Ｔ細胞依存性、非依存性のいずれについても強い抑制を
示した。

逆ＰＦＣ法で肺細胞中の総イムノグロブリン産生細胞数
を調べたところ、抗体産生抑制の認められた２サンプル
はいずれもその数の減少が認められている。このことは
、この２つのサンプルが肺細胞に対して毒性的に作用し
ている可能性が考えられるため、より低濃度での効果に
ついて、羊赤血球を抗原とした抗体産生応答とＤＮＡ合
戊合成いて同時に調べた。

ＤＮＡ合或能は、肺細胞と抗原との反応の最終１６時間
の〔：ｌＨ〕　−チミジンのＤＮＡへの取込みを測定し
て求めた。その結果を表２に示す。

本発明はいずれもＤＮＡ合威合成は大きな影響を与えず
抗体産生を抑制することが確認、できた。

実験例２本実験例は実施例で得たウルソール酸、ケトウルソール
酸のイン・ヴイヴオ抗体産生に対する効果を確認した。

（１）実験材料及び方法動物ＤＢＡ／２　（雌、８週齢〉を日本チャールスリバーよ
り購入し、１群３匹で使用した。サンプル（３濃度）を
７日間連続して腹腔内に投与した。

マウスをエーテル麻酔後、後大静脈より全採血し肺臓を
無菌的に摘出した。全血より血清を分離し、非動化（５
６℃３０分〉した後−２０℃にて保存した。

サンプル実施例の注射製剤をさらに注射用蒸留水により溶解し、
０．２、０．４ｍｇ／ｄ濃度とした。

■マウスの羊赤血球（ＳＲＢＣ）に対する一次応答（直
接ＰＦＣ）抗体産生能検査の４日前に５０％ＳＲＢＣ　０．２＋ｄ
を腹腔内に投与したマウスより肺臓を取り出し、単細胞
浮遊液とした後、２　ｘｌｏ”／ｗ１１の濃度に調製し
た。

ＦＣＳ非添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて一回洗浄した
。ＲＰ旧−アガロース０．４−、２５％ＳＲＢＣ５０＃
Ｚ，牌細胞懸濁液５０ｔｔｌ及びモルモット補体２０ｐ
ｌを３７℃で混合し、プラスチックシャーレに薄く層に
なるように広げて３７℃で２時間インキュベートした後
ＰＦＣ数をカウントした。

■逆ＰＦＣ法による総１ｇＭ産生細胞数の測定８Ｘ１０
’個の肺臓リンパ球を０．４＋ｄの培地に浮遊し、Ｌ　
Ｐ　Ｓ　（Ｄｉｆｃｏ　）　２５ｐｌ　ｗｄ存在下、シ
リコーン処理したガラス試験管を用いて３日間培養した
。培養終了後、細胞を２ｄのＲＰＭＩ　−　１６４０培
地に再浮遊した。

ＲＰＭＩ　−　１６４０−アガロース液０．４Ｔｌｉ、
ウサギ抗マウスμ鎖抗血清をＲＰＭＩ−１６４０で７倍
希釈したものを２０μ１１プロテインＡ　−ＳＲＢＣ　
（２５％）５０ｐｌ抗体産生細胞浮遊液５０＃ｌを３７
℃で混ぜ、プラスチックシャーレにまいた．３７℃で２
時間インキュベート後、１／２０に希釈したモルモット
補体０．３ｗ１１を加え、さらに１時間インキュベート
してＰＦＣ数をカウントした。

■血清中の抗羊赤血球抗体価の測定（ａ集反応）非動化
した各群のマウスの血清を２倍系列希釈を９６ウエルプ
レートにて調製した（５０ｐＺ／ウエル）。

これに充分に洗浄した２％ＳＲＢＣ浮遊液を５０ｐｌず
つ各ウェルに添加し混和後、４℃で一晩放置し凝集活性
を判定した。

（２）結果 ■羊赤血球に対する抗体産生−次応答Ｔ細胞を介して抗体産生が行われることが知られている
抗原である羊赤血球（ＳＲＢＣ）を用いて、ＳＲＢＣに
対する抗体産生について調べた。２種類のサンプルを７
日間投与したマウス牌細胞の抗体産生−次応答について
調べた結果を表３に示す。

サンプル投与により抗ＳＲＢＣ抗体を産生しているＢ細
胞（Ｐ　Ｆ　Ｃ）数の用量依存的な減少が認められ、５
ｍｇ／ｋｇ投与群は溶媒を投与した対照群の６６％にま
でＰＦＣ数の低下が観察された。従って本発明はイン・
ヴイヴオ系においても抗体産生抑制活性を示すことが明
らかとなった。

表３　羊赤血球に対する一次応答に及ぼす影響サンプル
を０　、　０．２，　１．０．　５．０　ｍｇ／ｋｇの
用量で７日間投与し、検査４日前にＳＲＢＣで免疫した
マウスの肺細胞のＳＲＢＣ特異的な直接ＰＦＣ数（平均
上ＳＤ，ｎ＝９）とした。カッコ内の数字は対照群に対
する百分比である。

■ＬＳＩｇＭ産生細胞数の変化抗体産生の抑制は、実際に抗体を産生ずるＢ細胞がその
数において減少したために起こることがあるため、サン
プルを投与したマウスの肺細胞をＢＩＢ胞マシマシマイ
トジエンボ多糖（’ＬＰＳ）により刺激して抗体産生細
胞へ分化誘導させて逆ＰＦＣ法により総１ｇＭ抗体産生
細胞数を調べた。その結果を表４に示す。

この結果、本発明物質は牌ＩＩＢ細胞の抗体産生細胞へ
の分化に影響を与、Ｌないと結論された。

表４　総１ｇＭ産生細胞に対する影響（総１ｇＭ産生細胞数／２ｘｌＯ’牌細胞）反応を用い
て調べた。その結果を表５に示す。

ウルソール酸、ケトウルソール酸とも５ｍｇ／ｋｇの投
与で抗体産生が抑制された。

表５　羊赤血球に対する血清抗体価（凝集力価）サンプルを０．０．２．１．０．５．０　ｍｇ／ｋｇの
用量で投与したマウスの肺細胞をＬ　Ｐ　Ｓ　（２５ｇ
／　＋ｄ）で３日間刺激後、ウサギ抗マウスμ鎖抗体を
用いた逆ＰＦＣ法で調べたＰＦＣ数を総ＩｇＭ産生細胞
数とした（平均±ＳＤ、ｎ＝９）。カッコ内の数字は対
照群に対する百分比である。

■血清中の抗５ＲＢＣ抗体価抗原を動物に免疫する抗体産生糸が働き始め、３日目ぐ
らいよりＩｇＭ抗体が産生され、血清中に検出されるよ
うになる。そこで、５ＲＢＣ免疫４日後の各群マウス血
清中の５ＲＢＣに対する抗体価を凝集サンプルを０．０
．２．１．０．５．０　ｍｇ／ｋｇの用量で７日間投与
し、検査４日前に５ＲＢＣで免疫したマウスより血清を
調製した。２％５ＲＢＣ（５０ＩＪ／）に２倍系列希釈
したマウス血清を同量添加し、−晩放置後、凝集が認め
られる最終点の希釈倍率の逆数を凝集力価としたく平均
±ＳＤ、ｎ＝９）。カッコ内の数字は対照群に対する百
分比である。

（発明の効果）本発明の実施により、低毒性の免疫抑制剤が提供される
。

また、本発明による免疫抑制剤は、臓器移植やアレルギ
ー治療剤としても使用可能である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ウルソール酸又はその塩を有効成分とする免疫抑
制剤。
（２）ケトウルソール酸又はその塩を有効成分とする免
疫抑制剤。