DD156813A5 - Verfahren zur herstellung von estern von 9-hydroxyalkylpurinen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Estern von Hydroxyalkylpurinen der allgemeinen Formel, in der R hoch 1 ein Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und R hoch 2 der Rest einer unsubstituierten Moncarbonsaeure, einer aromatischen Carbonsaeure, Aminocarbonsaeure, einer unsubstituierten Dicarbonsaeure, Phosphorsaeure oder Salpetersaeure oder ein Glycosid- oder Acetaldehydacetalrest ist. Diese Verbindungen wirken als Immunomodulatoren, haben antivirale und Antitumorwirksamkeit und stellen auch Enzyminhibitoren dar. Sie koennen auch zur Einfuehrung der ihnen zugrunde liegenden Alkohole in biologische Systeme angewandt werden, in einigen Faellen mit verstaerkter Wirksamkeit.

Description

Verfahren zur Herstellung von Estern von 9-Hydroxyalkyl-

purinen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Estern von 9-Hydroxyalkylpurinen der allgemeinen Formel

OH

CH

in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffato-

2 men und R der Acylrest einer unsubstituierten Monocarbonsäure, einer unsubstituierten Dicarbonsäure, einer Aminocarborisäure, einer aromatischen Carbonsäure, der Phosphorsäure oder Salpetersäure oder ein Glycosid- oder Acetaldehydacetalrest ist.

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Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

In der US-PS 3 215 696 wurde bereits ein Verfahren zur Herstellung ähnlicher heterocyclischer Verbindungen, nämlich von 3-substituierten 6-Aminopurinen vorgeschlagen, ferner in der US-PS 4 031 218 ein 7-(2-Hydroxypropyl)-1,3-di-n-propylxanthin 'mit bronchienerweiternder Wirkung. '

Diese- Verbindungen haben andere Wirkungen als die erfindungsgemäßen Verbindungen.

Außerdem ist bekannt, daß verschiedene natürliche und synthetische Glykoside die Herztätigkeit beeinflussen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung neuer Verbindungen mit neuartigen, verbesserten pharmakologischen Anwendungsmöglichkeiten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit immunomodulatorischer Wirkung herzustellen.

Sie geht von den im älteren DDR-Patent 146 050 der Anmelderin beschriebenen 9-Hydroxyalkylpurinen aus, die ebenfalls Immunomodulatoren darstellen. Gegenüber den Hydroxyalkylpurinen besitzen die erfindungsgemäß hergestellten Ester jedoch verbesserte oder veränderte Wirksamkeit, so daß man mit ihnen je nach den gegebenen Erfordernissen eine Schwächung oder Stärkung des Immunsystems herbeiführen kann. Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen haben auch antivirale und Antitumorwirksamkeit, insbesondere Wirksamkeit gegen Leukämie.

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Außerdem stellen sie Enzyminhibitoren dar. Sie eignen sich auch zur Abgabe der entsprechenden Alkohole an biologische Systeme, in einigen Fällen mit verbesserter Wirksamkeit. .

Der Acylrest R kann von unsubstituierten aliphatischen Monocarbonsäuren abgeleitet sein, wie solchen mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Isovaleriansäure, Capronsäure, Caprylsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Ölsäure, oder von unsubstituierten aliphatischen Dicarbonsäuren, z.B. Malonsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure

und sogar von Kohlensäure. Wenn sich der Rest R von

einer Dicarbonsäure ableitet, liegt er gewöhnlich als

Halbester vor, z.B. als Hemimalonat, Hemif umarat, Herrii-

maleat oder Hemisuccinat, ferner als Methylcarbonat und Ethylcarbonat. ,

2 R kann auch von einer Aminocarbonsäure abgeleitet sein, z.B. von Aminoalkansäuren, wie Glycin, Arginin, Lysin, Alanin, Leucin, Valin oder Methionin.

"2

Ferner kann R von einer aromatischen Carbonsaure stammen, z.B. von Salicylsäure oder Aralkylcarbonsäuren, wie Phenylessigsäure, Phenylpropionsäure oder Phenylalanin.

Die Ester mit organischen Säuren können in herkömmlicher Weise hergestellt werden, z.B. durch Umsetzung mit Säureanhydriden oder Säurehalogeniden, z.B. Säure-. Chloriden, wie Acetylchlorid. Die Kohlensäureester kann man mit Ghlorameisensäureestern, z.B. Ethylchlorformiat, Methylchlorformiat oder mit Phosgen herstellen.

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Die Ester anorganischer Säuren werden ebenfalls in herkömmlicher Weise hergestellt, z.B. durch Umsetzung mit o-Phenylenphosphochloridat zur Herstellung der Phosphate und mit Salpetersäure zu Herstellung von Nitraten.

Glycoside sind mit C₅- bis G_-Zuckern, wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, 2-Desoxyglucose, 2-Desoxyribose, Ribose, Arabinose, Galactose oder Rhamnose erhältlieh. Sie können durch Umsetzung mit Acetobromzuckern und nachfolgende Hydrolyse der Acetylgruppen gebildet werden. Zum Beispiel, kann man nach dem klassischen Königs-Knorr Verfahren, vgl. Königs und Knorr, Sitz bayr. akad. Wissenschaften Bd. 30, Seite 103 (1900); Brigl und Keppler, Ber. Bd. 59, Seite 1588 (1926) und Königs und Knorr, Ber. Bd. 34, Seite 974 (1901) Acetobromglucose in Gegenwart von Silbercarbonat verwenden.

Das Acetaldehydacetal wird ebenfalls in herkömmlicher Weise mit Acetaldehyd und alkoholischer Chlorwasserstoffsäure als Katalysator hergestellt.

Es ist eine anerkannte Tatsache, daß viele infektiöse Mittel, wie Viren (Influenzavirus, HSV, Friend Leukämievirus), Bakterien und Pilze beim Wirt einen Zustand unterdrückter Immunität hervorrufen, der seine Abwehrkräfte gegen infektiöse Mittel schwächt. Die meisten antiviralen Antimetaboliten, wie AraC, verursachen beim Wirt eine Unterdrückung des Immun-Abwehrmechanismus, wodurch die körpereigenen natürlichen Abwehrkräfte geschwächt und sekundäre Infektionen begünstigt werden.

Ein Immunpotentiator oder Immunomodulator stellt entweder die unterdrückte Immunfunktion wieder her oder verstärkt die normale Immunfunktion oder beides. Die Immunfuktion wird als Entwicklung humoraler, durch Antikör-

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per hervorgerufene Immunität, zellularer, durch Thymocyten hervorgerufene Immunität oder durch Makrophagen und Granulocyten hervorgerufene Widerstandsfähigkeit bezeichnet. Logischweise werden hierbei Mittel umfaßt, die direkt auf die Zellen wirken^ die an der Immunreak-ΐΐοη beteiligt sind, oder auf zellulare oder molukulare Mechanismen, die ihrerseits die Funktion von Zellen modifizieren, die an der Immunreaktion beteiligt sind. Eine Verstärkung der Immunfunktion kann aus der Wirkung eines Mittels resultieren, unterdrückende Mechanismen aufzuheben, die von negativen endogenen oder exogenen Rückkopplungseinflüssen auf das Immunsysten herrüh.ren. Somit können Immunpotentiatoren unterschiedliche Wirkungsmechanismen besitzen. Trotz der unterschiedlichen Wirkungsweise auf die Zellen und des biochemischen Wirkungsmechanismus der Immunpotentiatoren ist ihr Anwendungszweck im wesentlichen der gleiche, nämlich die Verstärkung der Widerstandsfähigkeit des Wirtes.

Anwendungsarten von Immunpotentiatoren

1) Die hauptsächliche Schutzfunktion des Immunsystems besteht im Widerstand gegen das Eindringen pathogener Erreger, einschließlich Viren, Krankheitserregern, Mycoplasma, Bakterien, Pilzen und Parasiten aller Art. Ein Verbeserung der Immunreaktion, insbesondere wenn diese unterdrückt ist, verbessert dementsprechend die Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion oder eine Überschwemmung mit einem der oben genannten pathogenen Erreger. Bei jeder und allen infektiösen Erkrankungen kann ein Immunopotentiator allein oder in Kombination mit einer Therapie gegen die Infektion angewandt werden.

22 82 49 3

2) Eine zweite Schutzfunktion des Immunsystems besteht im Widerstand gegen die Einpflanzung von fremden Gewebe, entweder in natürlicher Weise wie beim Verhältnis Fötus-Mutterleib, oder in unnatürlicher Weise, wie bei Transplantationen. Immunpotentiatoren können auch verwendet werden, um die Abstoßung von fötalem oder Plazentagewebe zu erleichtern * oder die Verträglichkeit von Transplantaten zu modifizieren oder herbeizuführen.

3) Eine dritte Schutzfunktion des Immunsystems besteht im Widerstand gegen die Entwicklung bösartiger Zellen, wie bei Krebs. Immunpotentiatoren können bei der Krebsbehandlung verwendet werden, um die Tumorbildung zu hemmen und deren Wiederauftreten nach anderen Therapieformen zu verhindern.

4) Eine vierte Schutzfunktion besteht in der Fähigkeit, Fremdsubstanzen zu erkennen und durch positive Unterdrückungsmechanismen eine Reaktion gegen körpereigene Stoffe zu verhindern. Bei auto-immunen und verwandten Erkrankungen richtet sich die Immunreaktion gegen körpereigene Antigene oder es tritt eine übertriebene Reaktion auf, die selbstzerstörerisch wirkt. Immunpotentiatoren können verwendet werden, um den. normalen Unterdrückungsmechanismus wieder herzustellen, Verträglichkeit herbeizuführen oder sonstwie eine normale Immunreaktion zu fördern.

Jede der Schutzfunktionen des Immunsystems kann durch eine nicht spezifische Therapie mit Immunpotentiatoren allein oder in Verbindung mit anderen Mitteln modifiziert werden, die verwendet werden, um die Widerstandsfähigkeit zu erhöhen oder die eingedrungenen pathogenen Erreger abzutöten. Darüber hinaus kann die spezifische

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Widerstandsfähigkeit durch die Verwendung von Immunpotentiatoren* in Verbindung mit Antigenformen, wie in Vakzinen mit z.B. Viren, Turmorzellen etc. verstärkt werden. Hierdurch kann entweder eine spezifische Immunität oder Verträglichkeit herbeigeführt werden. Ein Beispiel für den letzteren Fall ist die Anwendung bei Allergien oder Auto-Immunerkrankungen. Die Anwendung der Immunpotentiatoren kann aus therapeutischen oder prophylaktischen Gründen erfolgen, aus letzteren insbesondere im Alter, wenn Infektionen, Auto-Immunität und Krebs häufiger auftreten. Die Zeit und Art der Verabreichung sind variierbar und können bei der Ermittlung, ob eine positive oder negative Reaktion eintritt, kritisch sein. Jed'es Mittel, das eine Immunreaktion zu verstärken vermag, kann diese in Abhängigkeit von .der zeitlichen Verabfolgung und Dosis hemmen. Zum Beispiel könnte unter bestimmten Umständen ein Immunpotentiator als Immunreaktionen unterdrückendes Mitel bei Allergien, Auto-Immunität oder Transplantationen verwendet werden .

Der zugrundeliegende Alkohol ist, wenn R die Hexylgruppe bedeutet, Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin, der vorliegende, als NPT 15392 bezeichnet wird. Zu den erfindungsgemäßen Verbindungen gehören Erythro-9-(2-acetoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15458, Beispiel 1), Erythro-9-(2-succinoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15457, Beispiel 2), Erythro-9-(2-formyloxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15467, Beispiel 3), Erythro-9-(2-propionyloxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15477, Beispiel 4), Erythro-9-(2-butyroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15483, Beispiel 5) und Erythro-.9-(2-phosphat-3-nonyl )-hypoxanthin. .

22 82 4 9 .3

Andere erfindungsgemäße Verbindungen sind in der Tabelle 1 zusammengestellt. In dieser sind alle Alkylgrup-

· ' 1 . pen, die durch den Substituenten R dargestellt werden,

n-Alkylgruppen.

	Tabelle 1	O Il	0 11	0 Il "	(eis)
R1	2	CH3CH2CB2C-	HOOCCH=CHC-	(CH2)7C-
C6Hl3	O II CH3CB2C-	O Il CH3(CH2J14C-	0 Il
	O Il . CH3(CH2J16C-	HOOCCH=CHC-
C6H13			(CiS)
C6H13	CH3 (CH2)7CH=CH
C6H13	O Il HOOCCH2C-		(trans)
C6H13 '
C6H13
C6B13
C6H13

It HOOCCH₂CH₂CO-

22 8249 3

Forts. Tabelle

^C6^E13

^C6^H13

0 II HOOC(CE₂)₃C-

CE₂(NH₂)C-

_: ^{! C}6^H13

CH₃CH (NE₂)C-

^C6^H13

E₂NC(=NE)NHCH₂CH₂CH₂CB(NH₂)C-

^C6^E13

E₂N(CH₂J₄CH(NH₂)C-

^C6^H13

!I

CH₃SCH₂CE₂CH(NH₂)C-

^C6^E13

0 ti

(CE₃J₂CHCH₂CH(NH₂)C-

^C6^HI3

CH₂CH₂C-

6^E13

ιί Q-HOCgH₅C-

-PO,Eo

^c6^Ei3

-NO₂

22 82 4 9 3

Forts. Tabelle 1

C6Ei3	r^3r^""" (Ace·
C6EI3	Glucosid
C6E13·	Ribosid
C6E13	Fructosid
C6E13	Mannosid
C6E13 ·	Rhamnosid
C6E13	xylosid
C6E13	Galactosid
C6E13	Arabinosid
	0
CH3	CH3C-
CE3	0 HOOCCH2CH2C-
CH3	Glucosid
CE3	-PO3H2
	0
C2E5	CH3C-

(Acetaldehydacetal)

22 82 4

Forts. Tabelle 1

C₂H₅ C₂H₅

ii

HOOCCH₂CH₂C-

Glucosid

C₃H₇

CH₃C-

C₃H₇

^C4^E9

^C5^HI1

^C5^H11 C₅H_n ^C5^E11

0 H

HOOCCB₂CH₂C-

0 I! CH,C-

CH₃C-

O ti

HOOCCH₂CH₂C-

Glucosid

-PO₃E₂

^C7^H15

ti

CH₃C-

C₇H₁₅

ti

HOOCCE₇CH₇C-

C₇H₁₅

Glucosid

22 824 9 3

Forts. Tabelle 1

0 ^C8^H17 CB

C₈E₁₇

HOOCCH₂CE₂C-

^C8^H17 · Glucosid

Vor kurzem hat man festgestellt, daß NPT 15392 antivira-Ie, immunomodulierende und Anti-Tumorwirksamkeit hat.

Es wurde nun gefunden, daß man neue Derivate des NPT 15392 herstellen kann, die in biologischen Systemen in die aktive Verbindung, NPT 15392, umgewandelt werden und zu höheren Blutspiegeln an der aktiven Substanz "~\ . NPT 15392 führen als dieses selbst und damit die Wirksamkeit des NPT 15392 verstärken.

Nachfolgend sind die chemischen Eigenschaften einiger erfindungsgemäßer Verbindungen zusammengestellt.

22824S 3

Tabelle

Schmelzpunkt

Analyse

berechnet gefunden

Erythro-9-(2-acetoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15458 *) /

150 -

C	59	,97	59	,83
H	7	,55	7	,42
N	17	,48	17	,39

Erythro-9-(2-succinoxy 3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 154 57 ^xx)

Xmax/^Am χ 10³.

pH 1,0 . pH 7 pH 9,5 .250/9,7 249,5/10,1 254/10,06 250/- 249/- 254/-

pH 1 220 222

pH

222,5

223

Ein UV-Maximum auf einer Säule aus 5_/u Sphero-S 2,1 χ 250 mm, Lösungsmittel 65 % Methanol:

HPLC -

sorb ODS

35 % 0,05 M H PO

Ein UV-Maximum auf einer Säule aus 5,u Ultrasphere ODS; 4,6 χ 250 mm, Lösungsmittel 65 % Methanol: 35 % 0,05 M H₃PO₄

Die*Immunpotentiatoren gemäß der Erfindung können z.B. zur Verleihung von Widerstandsfähigkeit gegen das Eindringen der in der Tabelle A zusammengestellten Viren verwendet werden.

22 824 9 3

Tabelle A

Virus Klasse

Arenavirus RNA

Influenza BNA Rhinovirus ' RNA

Poliovirus RNA

Masern RNA

Newcastle

Virus RNA

Rotavirus " RNA

Hepatitis Typ A RNA

Tollwut Virus RNA

Arbovirus RNA

Vaccinia Virus DNA

Herpes Simplex

Virus DNA

Herpes Zoster DNA

Varicella Zoster DNA

Adenovirus DNA

Hepatitis Typ B DNA

Maul- und Klauenseuche Virus DNA

Machuoo Virus

Krankheit

Rift Valley Fieber Influenza

Erkältung

Polio

Deutsche Masern

NewcastIe-Krankheit

Gastroenteritis bei Kindern . .

Infektiöse Hepatitis Tollwut Encephalitis Pocken

Bläschenausschlag,

Encephalitis,

Geschlechtskrankheit Gürtelrose · Windpocken

Erkrankung der Atemwege

Chronische Hepatitis, Schwere Hepatitis

Maul- und Klauenseuche Käinorrhagisches Fieber

228249 3

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere wirksam gegen RNA-Viren.

Sie und therapeutische Zubereitungen, die diese Venbindungen als Wirkstoffe enthalten, können zur Behandlung ,von Menschen und Säugetieren, einschließlich deren Zellen, Schweinen, Hunden, Katzen, Rindvieh, Pferden, Schafen, Ziegen, Mäusen, Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen ,'Hamstern , Affen usw. verwendet werden.

Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich vorliegend alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht. Die Temperaturen sind in ⁰C angegeben.

Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen Verbindungen oder von therapeutischen Zubereitungen, die diese enthalten, kann in üblicher Weise erfolgen, z.B. oral, nasal, rektal, vaginal oder parenteral. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die Form injizierbarer Lösungen gebracht werden, z.B. mit Wasser, oder in die Form von Tabletten, Pillen, Kapseln etc.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung erfindungsgemäßer Verbindungen.

- i 6 -

8243 3

Beispiel 1

Erythr0-9-(2-acetoxy-3-nonyl)-hypoxanthin

Acetylnonylhypoxanthin)

(NPT 15458 -

(CHO r O C CE

CE.

2,78 g (10 mM) Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15392) wurden in 120 ml ' Py rid in gelöst und mit 3 ml (30 mM) Essigsäureanhydrid versetzt. Die Lösung wurde 24 Stunden auf 25 C gehalten. Dann wurden 50 ml Ethanol zugesetzt und die Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Diese Operation wurde viermal wiederholt, um das Pyridin zu entfernen. Der Rückstand wurde mit 150 ml Ether versetzt und der gebildete Feststoff abfiltriert. Die Fällung wurde dreimal mit Ether gewaschen. Man erhielt 2,51 g; (80% der Theorie) eines

weißen kristallinen Materials; F = 150 - 151° C; UV

ο _V ^max·

(C=O).

, pH 5,5) 249 nm;

10,1 χ 10 ; IR 1700 cm

Analyse: berechnet für ^c-|6^H24^N4⁰3

gefunden:

C 59,97 H 7,55 N 17,48 C 59,83 H 7,42 N 17,39

Aufsteigende 'Chromatographie (Whatman Papier Nr. 1)

Rf-Werte:

n-Butanol/H O/Essigsäure (2:1:1) = 0,92 Ethanol/1 M Ammoniumacetat (14:6) = 0,88 i-Propanol/konzentrierter Ammoniak/H„0 (7:2:4) = 0,90

Beispiel 2

Erythro-9-(2-succinoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15457 - Succinylnonylhypoxanthin)

(CH₀)

CH.

CH.

CH₂ C

OH

600 mg- (2,2 mM) Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15392) und 1 g (10 mM) Bernsteinsäureanhydrid wurden unter Rühren in der geringst möglichen Menge Pyridin gelöst. Die Lösung wurde 10 Tage lang unter ständigem Rühren mäßig erwärmt (etwa 30° C).

2282 4 9 3

Das Pyridin wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers entfernt, und der Rückstand wurde innerhalb 48 Stunden in 20 ml absolutes Ethanol extrahiert. Diese Lösung wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch präparative Dünnschichtchromatographie (2 mm .Silikagel 60, n-Butanol:2 η NH₄OH 10:2 V/V) gereinigt. Die Bande bei Rf = 0,17 wurde in absolutes Ethanol eluiert. Die Reinheit des Produktes wurde durch Dünnschichtchromatographie und UV-Spektrophotometrie festgestellt. ' ;.· ' .

Beispiel 3 -

Erythro-9-(2-formyloxy-3-nonyl)-hypoxanthin - Formylnonylhypoxanthin)

(NPT 15467

• HCOOH

C₆H₁₃-CH-CH-CH₃

30 g Erythro-5-amino-4-chlor-6-(2-hydroxy-3-nonylamino)-pyrimidin (0,104 Mol; Mg 278, 35) wurden in 300 ml 98%iger Ameisensäure gelöst und 34 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Kühlen wurde das Reaktionsgemisch in 500 ml eiskaltes Wasser gegossen. Die Fällung wurde gesammelt und mit kaltem Wasser gewaschen; Ausbeute 28,8 g (74,8 %); F = 218 bis 219° C; nach zweimaliger Umkristallisation aus Ethanol/Wasser 219 bis 220° C. UV: X = 249,5 (C₀H₁-OH); IR (KBr): 3100, 2950, 2850,

ΓΠ3.Χ - c. O

1720, 1210, 1170; Mg 306,36.

- 22 82

Analyse: berechnet für Cj-HNO : C 58,80;

H 7,23; N 18,28

gefunden C 58,82;

H 7,22; s N 18,24.

Beispiel 4

Eryhtro-9-(2-propionyIoxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15477- Propionylnonylhypoxanthin)

C-H₁₃-CH-CH-CH₃

Pyridin

Ci>

*·Ν 0-CO-CH₇-CH If

C H -CH-CH-QH^

1 g Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (3,6 mM; MG 278,35), 5 ml Propionsaureanhydrid (30 mM) und 10 ml Pyridin wurden 48 Stunden bei 25 C gerührt. Nach dem Kühlen in einem Eisbad wurden 5 ml Methanol zugefügt und die Mischung wurde unter verringertem Druck eingedampft. Dann wurden noch zweimal je 20 ml Methanol zugefügt und eingedampft. Der ölige Rückstand wurde bei der Zugabe von 30 ml Ethylether fest. Das Produkt wurde abfiltriert und zweimal mit jeweils 20 ml Ethylether und dann mit 20 ml Wasser gewaschen. Darauf wurde im Vakuum getrocknet und aus Ethylacetat umkristallisiert; Ausbeute 0,35 g (29 %) ; F = 122 bis 124° C; nach zwei weiteren Umkristallisationen war der Schmelzpunkt unverändert; MG 334,43; IR (KBr:3450, 3100, 3000, 1740, 1710, 1210.

228249 3

Analyse: berechnet für CHNO : C 61,05; '. · - H 7,84;

N 16,75 ·' ;

gefunden . C 60,94;

H 7,82;

• N 16,22. ·

Beispiel 5

Erythro-9-(2-butyroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15483 Butyroxynonylhypoxanthin)

OH

Pyridin

1g Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (3,6 mM; Mg 278, 35), 5 ml n-Buttersäureanhydrid (30 mM) und 10 ml Pyridin wurden 48 Stunden bei 25° C gerührt. Nach dem Kühlen in einem Eisbad wurden 5 ml Methanol zugefügt, worauf im Vakuum eingedampft wurde. Anschließend wurden noch zweimal je 20 ml Methanol zugegeben, worauf ; eingedampft wurde. Der Rückstand wurde fest, wenn 50 ml Ethylether zugegeben und darauf gekühlt wurde. Das Produkt wurde abfiltriert, mit 20 ml Ethylether und dann mit 20 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum und der Umkristallisation aus Methanol/Wasser erhielt man 0,95 g Produkt (Ausbeute 76 %); F= 168 bis 169° C.

Durch dreimalige Umkristallisation aus Methanol/Wasser erhielt man eine Analysenprobe vom Schmelzpunkt 170 bis 171° C; MG 3.48,43; UV:7) = 248 (Ethanol)

^x ΓΠ3. X

Analyse: berechnet für C._oH„_oN.0„ : C 62.04;

H 8,10; N 16,08

gefunden C 61,91;

H 8,03; N 16,18.

Chemische Beständigkeit

Die Werte in der Tabelle 3 veranschaulichen, daß die Ester NPT 15458 und NPT 15457 bei 37° C und neutralem pH-Wert (7,0, physiologischer Wert) beständig sind. Die Tatsache, daß eine alkalische Hydrolyse bei pH 9,5 sowohl den Essigsäureester (NPT 15458) als auch den Succinylester (NPT 15457) in NPT '15392 umzuwandeln vermag, bestätigt die Struktur dieser Ester.

Tabelle 3

Wirkung verschiedener pH-Werte auf die chemische Beständigkeit von Acetoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15458) und Succinoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15457)

Verbindung, Konzentration

NPT 1539 2, O,36 ,um/ml (Kontrolle) '

NPT 15457, O,36,um/ml) NPT 15458,

'3,5 Stunden bei 37 C, ermittelt durch Säulenchromatographie (HPLC)

	1,0 ·	% NPT 15 392 *
PH	7,0	100
pH	9,5	100
pH	1,0	100
pH	7,0	2
pH	9,5	0
pH	1,0	8
PH'	7,0	8
pH	9,5	0
pH	28

22 82 49 3

Antivirale Eigenschaften

Die Fähigkeit von NPT 15457 und NPT 15458, die Vermehrung von Influenza-Virus zu hemmen, wurde im Hämadsorp^r tionstest ermittelt. Wie aus der Tabelle 4 ersichtlich

•ist, hat NPT 15458, das nahezu vollständig in NPT 15392 aufgespalten wird, eine ähnliche Fähigkeit, das Viruswachstum zu hemmen, wie NPT 15392. In der Tat scheint NPT 15458 etwas wirksamer zu sein, möglicherweise aufgrund seiner stärkeren intracellulären Absorption. Beim

^ Succinylderivat, das bei pH 7,2 negativ geladen ist,

-' # ' ' . .·-.

erwartet man kein so leichtes Eindringen in die Zelle und damit eine geringere Wirksamkeit bei diesem Verfahren . '...-.. - .

Tabelle 4

Vergleich der antiviralen Eigenschaften von Succinoxynonylhypoxanthin (NPT 15457) und Acetoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15458) mit NPT 15392

Verbindung/ g/ml	prozentuale Hemmung' des Wachstums Influenza-Virus	0,36*	3,6	10, 8a	von	36a
	0	20	30	42	73
NPT 15392 (Kontrolle)	0	18	0	18	13
NPT 15457	0	26	40	80	88
NPT 15458	0

Konzentration in Nanomolen/ml.

Immunomodulierende Wirkung

Die Fähigkeit des Acetoxyesters (NPT 15458) und des Succinoxyesters (NPT 15457) von NPT 15392, das Immunsystem sowohl in vitro als auch in vivo zu modifizieren, wurde in den folgenden Systemen untersucht:

1) Mitogen-induzierte Lymphocytenproliferation bei Milzzellen der Maus (in vitro)

i\

2) Mitogen-induzierte Lymphocytenproliferation bei menschlichen peripheren Blutlymphocyten (in vitro)

3) Verstärkung der aktiven Rosettenbildung (in vitro)

4) Verstärkung der IgM-Antikörper Bildung bei mit roten Blutkörperchen von Schafen immunisierten Mäusen (in vivo) .

1) Die Werte in der Tabelle 5 zeigen die Fähigkeit von NPT 15458, die PHA-induzierte Lymphocytenproliferation zu verstärken, wie die Einverleibung von mit Tritium markiertem Thymidin ergab. Bei einer Konzentration von 50,ug/ml NPT 15458 wurde eine etwa 25%ige Verstärkung beobachtet. Eine ähnliche Verstäi— kung wurde mit 1O.ug/ml NPT 15392 erzielt.

2) Die Werte der Tabelle 6 zeigen, daß äquimolare Konzentrationen an NPT 15457 und NPT 15458 die PHA-induzierte Lymphocytenproliferation bei menschlichen peripheren Blutlymphocyten wirksam verstärken. Dies ist im Hinblick auf die Werte in der Tabelle 9 interessant, die veranschaulichen, daß menschliche periphere Blutlymphocyten beide Ester zu NPT 15392 aufspalten. NPT 15458, das in stärkerem Umfange als

- 24 -

22 824 9 3

NPT 15457 aufgespalten wird, vgl. die Tabelle 9, ist ein wirksamerer Potentiator - Tabelle 6: 1,48 gegenüber 1, 28 - bei der PHA-indüzierterv-Proliferation..

3) Aus der Tabelle 7 kann man ersehen, daß sowohl NPT 15457 als auch NPT 15458 in wirksamer Weise die

.-'aktive*.;. Rosettenbildung bei menschlichen peripheren Blutlymphocyten modifizieren. Interessant ist, daß bei Versuch Nr. 1, in dem die mit Plazebo behandelten Lymphocyten eine sehr geringe Menge aktiver Ro- setten bilden (mangelhafte Immunreaktion) NPT 15457

" · ' ' -

und NPT 15458 bei der Wiederherstellung der unterdrückten Immunität auf normale Werte ebenso wirksam sind wie NPT 15392. Im Versuch Nr.2 zeigten die mit Plazebo behandelten Kontrollen abnorm hohe Werte für die aktiven Rosetten. In diesem Fall vermochten NPT 15392 und NPT 15458 die hohen Werte auf normale Werte zu verringern und zeigten somit eine echte immunomodulierende Wirkung.

4) NPT 15457 und NPT 15458 sowie die "aktive" Verbindung NPT 15392 wurden an Balb/c Mäuse verabfolgt, die mit roten Blutkörperchen von Schafen immunisiert

. . . ^: .· -,

worden waren. Die Antikörperbildung gegenüber diesen roten Blutkörperchen wurde gemessen. Interessant war, daß NPT 15458 und NPT 15392 bei der Modifizierung der Bildung von IgM-Antikörpern sehr wirksam waren. NPT 15392 führte bei den untersuchten Werten zu einer 46%igen Steigerung der IgM-ETrzeugung. . Höhere Dosen von NPT 15392 verursachen eine geringere Steigerung oder eine Verringerung gegenüber den Kontrollwerten. Interessant ist auch, daß NPT 15458, das in NPT 15392 umgewandelt wird und zu mindestens zehnfach höheren Blutwerten des NPT 15392 führt vgl. Tabelle 10 '- eine Hemmung der IgM-Bildung verursacht, vgl. die Tabelle 8 und 8a).

ν²⁵-22 82 4 9 3

Dies war zu erwarten, da NPT 15458 sehr hohe Werte an NPT 15392 erzeugt, die sehr wahrscheinlich hemmend auf die IgM-Bildung wirken. Die Werte in der Tabelle 8 veranschaulichen die immunomodulierende Wirkung von , NPT 15457 und NPT 15458. Hierbei sollte darauf hingewiesen werden, daß die Wirkung von NPT 15457 geringer_λist als die von NPT 15458, und daß weniger NPT 15457 in NPT 15392 umgewandelt wird als NPT 15458, vgl. Tabelle 10.

Tabelle 5

Immunomodulierende Wirkung von Äcetoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15458)!Stimulierung der Mitogen-induzierten Lymphocytenproliferation bei Milzzellen der Maus in vivo

Verbindung, . Konz.ng/ Cpm einverleibt

ml .. -PHA +PHA . .S.I,^a D/C

	O	10	(C)	137	64,647	471	—	,25
NPT	15392	10	(D)	117	68,804	588	1	,93
NPT	15458	50	(D)	153	66,800	436	O	,25
NPT	15458	(D)	138	81 ,297	589	1

^a S.I. = Stimulierungsindex

22 8249 3

Tabelle 6

'inununomodulierende Wirkung von Succinoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15457) und Acetoxy-nonyl-hypoxanthin (NPT 15458) : Verstärkung der Mitogen-induzierten Lymphocytenproliferation bei menschlichen periOheren Blutlymphocyten

Verbindung Konzentration Cpm einverleibt

nMole/ml ' -PHA +PEA S.I. D/C

NPT 15392	0	(C)	379	59,404	156	—'
	0,036	(D)	297	59,167	199	1,27
	0,36	(D)	577	69,057	1 20	0,76
	3,6	(D)	381	67,328	176	1,128
NPT 154 57	0	(C)	277	54,015	195	-
	0,036	(D)	240	59,569	250	1,28
	0,36	(D)	228	59,689	261	1,33
	3,6	(D)	232	52,149	224	1,14
NPT 154 58	0	(C)	277	54,015	195a	-
	0,036	(D)	214	59,898	28Oa	1,43
	0,36	(D)	221	63,858	289a	1,48
	3,6	(D)	238	69,055	29Oa	1 ,48

Mittelwert aus drei Versuchen . ^a plO,O5

- Tabelle 7

Immunomodulierende Wirkung von Acetoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15458) und Succinoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15457) : Verstärkung der aktiven E-Rosettenbildung

Verbindung Konzentration % aktive E- χ +.S.E. nMole/ml Rosetten ~~

Plazebo 0 9,23+2,9 34,2+6,6

(Kontrolle)

NPT 15392 3,6 16,2 + 1 ,0

(Kontrolle) 0,36 - 15,4 +2,9^a

NPT 15457 3,6 24,8 + 6^a

0,36 - 33,6 + 2,4

NPT 15458 3,6 19,4 + 1,0^a

0,36 - 23,25 + 1,24^a

ρ 1 0,05 gegenüber der Plazebokontrolle

te» &a> ^J fe» ^% %3 IVr

. . Tabelle 8 .

Irnmunomodulierende Wirkung von Acetoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15458) und Succinoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15457) : Hemmung der IgM-Antikörperbildung bei mit roten Blutkörperchen von Schafen immunisierten Balb/C Mäusen

Ver such Nr.	Verbindung,	Dosis, i.p.	X	X	4	4	Anzahl der IgM- Ansammlungen χ i S.E.	% der Kon trolle
1	NPT 15392	1,80 nMole/kg	X		4		41 4	146a
2		0,18 nMole/kg	X		4		68 j	147a
1	NPT 15457	1,8 nMole/kg	X		4	19 j	68a
2		0,18 nMole/kg	X	4	47 j	102
1	NPT 15458	1,8 nMole/kg	8 j	28,5a
2		0,18 nMole/g	11 j	23,9a
1	Kontrolle	Plazebo χ 4	28 :	100
2		Plazebo χ 4	46 -	100
	: 4
: 2
: 3
: 3
I 1
l· 1
I 2
f 2

^a ρ — 0,01 im Vergleich zur Plazebokontrolle

-22 82 4

Tabelle 8a) '. -

Hemmung der IgM-Antikörperbildung bei mit roten Blutkörperchen von Schafen immunisierten Balb/C Mäusen.

Versuch''-! ·/· Stimulierung der

' Kochsalzkontrolle

Kochsalz -

Hydroxynonylhypoxanthin

(NPT 15392), 0,5 mg/kg 82

Th- Formyloxynonylhypoxanthin

(NPT 15467), 0,5 mg/kg -14

Acetoxynonylhypoxanthin .

(NPT 15458), 0,5 mg/kg . -47

Butyroxynonylhypoxanthin

(NPT 15483), 0,5 mg/kg -76

Propionyloxynonylhypoxanthin

(NPT 15477), 0,5 mg/kg 135

Versuch 2

Kochsalz -

Formyloxynonylhypoxanthin, 0,05 mg/kg 7

Acetoxynonylhypox-anthin , 0,05 mg/kg -75

Butyroxynonylhypoxanthin, 0,05 mg/kg -12

Propionyloxynonylhypoxanthin, 0,05 mg/kg 33

228249 3

Umwandlung im Stoffwechsel

Wie aus Tabelle 9. ersichtlich ist, führt die Inkubierung der Ester NPT 15457 und NPT 15458 mit Verozellen (Nierenzellen von Grünen Afrikanischen Affen), Leberhoi' ·*; mogenat und menschlichen peripheren Blutlymphocyten zur Bildung der "aktiven" Verbindung NPT 15392. Die Umwandlung von NPT 15458 in NPT 15392 scheint in stärkerem Maße vor sich zu gehen als die Umwandlung von NPT 15457 in NPT 15392.

Die Werte der Tabelle 10 zeigen, daß sowohl NPT 15457 als auch NPT 15458 nach intraperitonealer Verabreichung vom Blut absorbiert werden können, und daß die Verabfolgung von NPT 15458 zu den nahezu zwölffach höheren Werten an NPT 15392 führt als die Veräbfolgung von NPT 15392 selbst. Dies beweist, daß NPT 15458 und NPT 15457 in vivo NPT 15392 zu bilden vermögen, ferner, daß mindestens einer dieser Ester zu wesentlich höheren Blutspiegeln führt und damit größere Wirksamkeit besitzt.

22 8249

Tabelle 9

Bildung von NPT 15392 aus Acetoxy-nonylhypoxanthln (NPT 15458) und Succinoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15457) in biologischen Medien ' '

Verbindung % NPT 15392^a nach Stunden

• 0 0,5 24

NPT 15392 Vero Zellen · 100 . - - 100 Leberhomogenat ' 100 100 -

menschliche peri- 100 - . 100

phere Blutlympho-

'cyten

NPT 15457 Vero Zellen 0 - 0

Leberhomogenat 0 14 -

menschliche peri- O - 18,2 phere Blutlymphocyten

NPT 15458 Vero Zellen 0 - 50

Leberhomogenat 0 70 -

menschliche peri- O - 100 phere Blutlymphocyten

ermittelt durch Säulenchromatographie (HPLC)

22824 9 3

Tabelle 10

Bildung von NPT 15392 nach intraperitonealer Verabfolgung von Acetoxy-nonylhypoxanthin (NPT 15458) und Succinoxynonylhypoxanthin (NPT 154 57) an Mäuse

Verabfolgte Verbindung	Anzahl, d.Tiere	NPT 1	Blutspiegel, 5392 NPT	,uM/ml χ 103 15457 NPT 15458	4	0	·
NPT 15392	1	0,22	-	-	57	0
	2	0,68	-	-
NPT 15457	1	0,47	1,
	2	0,22	o,
NPT 154 58	1	8,2	-
	2	2,7	—
K 360 .uM/kg

Wirkung von Erythro-9*C2-acetoxy-3-nonyl)-hypoxanthin auf das Wachstum von Tumor (Leukämie)-Zellen in vivo

Verbindung Konzentration prozentuale Wachstumshemmung

L 1210, Maus 8068, Mensch

NPT 15458

10,ug/ml 40 32

	Tabelle	chemisch umwandelbar in	11	biologischen	Eigenschaften
	Zusammenfassung	NPT 15392	der	57 NPT	15458 NPT 15392
Eigenschaft	NPT		154
biologisch
			ja nein
pH 9,5 . ja pH 7,0 nein
umwandelbar

18

in NPT 15392

menschliche periphere Blutlymphocyten Leberhomogenat Vero Zellen Maus

biologische Wirksamkeit antiviral in vitro

immunomodulierende Wirkung in vitro

Lymphocytenproliferation immunomodulierende Wirkung

in vitro, Rosette ja (+166%)

immunomodulierende Wirkung in vivo

14	gering
0	(+14-28%)
25
sehr
ja

100

100

ja (88 %) ja (73 %)

ja(+43-48%) ja (+12-27%) ja (+11 %) ja (+78%)

IgM-Bildung gegen rote Blutkörperchen von Schafen mäßig(o-60%) ja (-72%) ja (+46%)

-22 82 4

Die vorstehenden Eigenschaften wurden nach den folgenden Methoden ermittelt.

A. Zellkulturen .

A. Vermehrung von Heia oder Vero Zellen

3 In 120 cm · Kolben wurden Zellki schichten auf die folgende Weise subkultiviert:

3 1) In 120 cm · Kolben wurden Zellkulturen in Mono-

2) die Medien wurden abgegossen und die Monoschicht wurde zweimal- mit je etwa 50 ml Kochsalzlösung bei pH 7,2 gewaschen, die mit Phosphat gepuffert und von Calcium und Magnesium frei war (PBS).

3) In jeden Kolben wurde 1 ml Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure Lösung gegeben, die 0,5 g Trypsin· (1:250) und 2,0 g Ethylendiamintetraessigsäure/Liter Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) ohne Ca und Mg enthielt, und unter mäßigem Schütteln, über der Monoschicht dispergiert.

4) Die Kolben wurden dann je nach der für die Herauslösung der Zellen erforderlichen Zeit etwa 3 bis 5 Minuten bei 37 C' inkubiert. Ein Schütteln von Hand ist erforderlich.

5) In jeden Kolben wurden 10 ml Nährmedium gegeben, und die Zellen wurden durch Aufsaugen und Ausstoßen der Suspension aus der Pipette dispergiert. Dies erfolgte zehnmal.

6) Der Inhalt einer Reihe von Kolben wurde gesammelt

und die Zellen in der Suspension wurden mit Nähr-

4 medium auf 7 bis 8,5 χ 10 Zellen/ml verdünnt.

7) Das Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung: . Eagles minimales essentielles Medium (MEM) mit Earle's Salzen und HEPES Puffer mit folgenden Zusätzen zu 100 ml MEM:

10 ml fötales Kalbsserum (Endkonzentraten = 10 %) 1 ml 1-Glutamin (200 molar)

1 ml mit 10.000 Einheiten Penicillin, 10.000,ug Streptomycin und 10.000.ug Neomycinmischung

V .

8)' Die Zellen wurden in Costar Gewebekulturschalen ; subkultiviert. Diese enthielten 24 flache Vertie-

:· . .. -

' fungen, jede mit einem Fassungsvermögen von 3 ml. In jede Vertiefung wurde 1 ml Zellkultursuspension gegeben.

9) Die Monoschichten werden für den Versuch verwendet, wenn sie ein nahezu zusammenlaufendes Wachstum erreicht haben, was etwa 1 bis 2 Tage erfordert.

10) Für die Aufrechterhaltung der Zellkulturen wurden getrennte Kolben verwendet. Das Medium hierfür

bestand aus MEM plus Zusätzen (vgl. Stufe 7) mit - -

fötalem Kalbsserum verdünnt auf eine Endkonzentration von 5 %.

B. Rote Blutkörperchen

1) Männlichen Hartly-Meerschweinchen wird Blut durch Herzpunktion entnommen.

2) Etwa 10 ecm diese Blutes werden mit 25 ml Alsever's Lösung vermischt und können bis 1 Woche bei 4 C aufbewahrt werden.

3) Unmittelbar vor ihrer Verwendung werden die roten Blutkörperchen dreimal bei pH 7,2 mit Kochsalzlösung gewaschen, die mit Phosphat gepuffert ist (PBS).

4) Jeder Waschvorgang wird durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 450 g der Suspension der roten Blutkörperchen bei Raumtemperatur bewirkt.

5) Mit Hanks ausgeglichener Salzlösung wird eine 0,4%ige V/V Suspension der roten Blutkörperchen hergeste11t.

C. Vermehrung von Viren in Eiern

A. Infektion

1) 9 bis 10 Tage alte befruchtete Hühnereier werden auf ihre Lebensfähigkeit durchleuchtet und die Stelle des Luftsackes wird auf der Schale mit einem Bleistift markiert. Nicht einwandfreie Eier (Fehlen von Bewegung oder Verfärbung) werden verwarfen.

. 2) Die Oberfläche der Schalen wird mit 70%igem Ethanol desinfiziert und trocknen lassen.

3. Durch die Schale wird mit einem sterilen Dorn ein kleines Loch von etwa 6 mm innerhalb des mit Bleistift markierten Kreises gestoßen, der den Luftsack jedes Eies markiert.

4. 0,1 ml verschiedener Virussuspensionen, 10 bis

3 ·

10 EID_c„/ml wird durch das Loch mit einer 1 ecm 50

Tuberkulinspritze in einem Winkel von 45 C in die Allantoinhöhle eingespritzt. Dabei achtet man darauf, daß' der Embryo oder der Eidottersack nicht verletzt werden.

22 8249 3

5. Zum Verschließen des Loches werden 2,5 cm Stücke Kunststoffband verwendet und für jedes Ei wird

der entsprechende Virus, die Passage-Nr. und das Datum auf einem Etikett angegeben. _; .

6. Die Eier werden 2 bis 5 Tage bei 35 bis 37°C bebrütet, je nach der Schnelligkeit des Viruswachstums. Die Inkubationszeit und die Temperatur

^-werden zusammen mit den anderen wichtigen Daten {'für jede Passage aufgezeichnet.

B. Sammlung der Allantoinflüssigkeiten

1. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Eier 3 bis 4 Stunden auf 4⁰C. gekühlt, um ein Ausbluten in die Allantoinhöhle während der Gewinnung'des Virus so weit wie möglich zu verringern.

2. Die Oberfläche der Schalen wird wiederum mit 79 %igem Ethanol desinfiziert und trocknen lassen.

3. Zum Entfernen der oberen Schale längs der Bleistiftlinie werden sterile Scheren verwendet und die Membranen werden mit sterilen Zangen ausgezupft.

4. Die Zangen werden vorsichtig zwischen dem Embryo und der Schalenmembran eingesetzt und der Embryo wird auf eine Seite gedrückt, so daß sich eine "Tasche" mit AllantoinflUssigkeit bildet. Dabei wird darauf geachtet, daß das Amnion nicht punktiert wird, ausgenommen in Fällen, wenn die Amnionflüssigkeit ebenfalls gesammelt werden soll, und die Placentäarterie möglichst nicht verletzt wird.

22 8249 3

5. Eine sterile 10 ml Wegwerfpipette mit mechanischer Vakuumküvette wird zum Sammeln der Allantoinflüssigkeit und ihrer Überführung in ein steriles Wegwerfzentrifugenrohr verwendet. Aus jedem Ei können etwa 5 bis 8 ml gewonnen werden.

6. Das gesammelte Material wird 10 Minuten bei 4°C und 1.200 g zentrifugiert. Die überstehende FlUs-

ysigkeit wird in die sterilen Rohre übergeführt.

7. Aus diesem vereinigten Material werden jeweils Proben entnommen und Titrations- und Sterilitätstest unterzogen. Die verbleibende Suspension wird in sterile 2 ecm Serumröhrchen übergeführt, die mit Etiketten für den Stamm, die Passage-Nr. und das Datum versehen werden.

8. Proben werden unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und zur Lagerung bei -70°C in einen Ultragefrierschrank oder in eine Gefriervorrichtung mit flüssigem Stickstoff gebracht.

D. Virusvermehrung in Gewebekultur A.. Infekt ion

1. 24 bis 48 Stunden alte Monoschichtkulturen des ge-

eigneten Zelltyps, gewöhnlich in 250 cm Wegwerfgewebekultur kolben werden für die Verwendung ausgewählt, wenn sie gerade zusammenhängen.

2. Alle Infektions- und Erntevorgänge werden in einem biologisch sicheren Raum durchgeführt, und es werden nur mechanische Pipettiervorrichtungen verwendet. Außerdem werden sterile Bedingungen eingehalten .

? 9 R? L Ά Λ

L. £. O L· &# *ρ ν

3. 25 ml Medium zum Aufrechterhalten der Kulturen werden verwendet, um das Wachstumsmedium in den zu infizierenden Kulturen zu ersetzen. Auch die Kontrollkulturen werden mit 25 ml Medium zum Aufrechterhalten versetzt.

4. Der Impfvirus wird mit serumfreiem MEM gemäß der von der- Bezugsquelle gegebenen Information verdünnt, oder aus der Titration von vorhergehenden Passagen, und es werden zu jeder Kultur 0,5 ml

;,. gegeben, die Kontrollen ausgenommen.

5. Die Kulturen werden in einer feuchten Atmosphäre aus 5 % CO₀ und 95 % Luft 48 bis 72 Stunden bei 37 C bebrütet, wobei täglich auf die Entwicklung cytopathogener Effekte, die für jedes Virus charakteristisch sind, geachtet wird.

B. Ernte

1. Die Kulturen werden zum Abernten entfernt, wenn der cytopathogene Effekt einen Wert von 3 bis 4+ erreicht. --' . ' -. '

0 - kein augenscheinlicher cytopathogener Effekt

1+ - 25 % der Zellen zeigen cytopathogene Wirkungen

2+ - 50 % der Zellen zeigen cytopathogene Wirkungen

3+ - 75 % der Zellen zeigen cytopathogene Wirkungen

4+ - 100 % der Zellen zeigen cytopathogene Wirkungen

2.. Die Kulturen werden dreimal eingefroren und wieder aufgetaut, um die Zellschicht aufzulösen. Nach dem dritten Auftauen wird die Kulturflüssigkeit in ein

steriles Wegwerfzentrifugenrohr übergeführt und 30 Minuten·bei 300 g zur Entfernung der Zellbruchstücke zentrifugiert. Diese Virussuspension wird auf bakterielle Verunreinigung untersucht.

3. Die überstehende Flüssigkeit wird sofort in 0,5 bis

1 ml Anteilen in 2 cm sterile Serumröhrchen überge führt und in flüssigem Stickstoff eingefroren.

4. Zur Titration werden Monoschichtkulturen in Gewebekulturplatten mit flachem Boden und 24 Vertiefungen hergestellt und wie folgt infiziert:

a) 10-fache Reihenverdünnungen des Virus werden in kaltem Auf-rechterhaltemedium mit 5 % fötalem Kalbsserum (10~ bis 1O~ ) hergestellt.

b) je 1 ml jeder Verdünnung wird in 3 Vertiefungen gegeben.

c) Zum Vergleich werden Kontrollkulturen, die nur das Aufrechterhaltemedium enthalten, hergestellt.

5. Die Kulturen werden 48 Stunden bei 37 C in feuchter Atmosphäre aus 5 % CO„ und 95 % Luft bebrütet und die Zellschichten werden wie zuvor beschrieben bewertet. TCID_c/~-Titer werden nach der Titrationsme thode von Reed und Munch errechnet.

Ei" Hämadsorptionstest

1. Unmittelbar vor der Durchführung dieses Tests werden die Medien von den Zellkulturplatten abdekantiert.

2. "in jede Vertiefung wird 1 ml Aufrechterhaltemedium gegeben.

3. Zwei Reihen der Kontrollkulturen erhalten nur das Aufrechterhaltemedium.

228249 3

4. Die Testkulturen und eine der Kontrollreihen werden sofort mit 0,1 ml des verdünnten Viruspräparats beimpft. Die Eingabetiter sind bezüglich vorhergehender Tests zur Ermittlung Hämadsorptionsstellen bildender Einheiten spezifiziert.

5. Die anderen Kontrollreihen bleiben uninfiziert, mit MEM allein. ·.;'..'.

6. Die Kulturen werden 16 bis 18 Stunden bei 37°C bebrütet, sofern nichts anderes angegeben ist.

7. Nach der Bebrütung werden die Medien abdekantiert und die Zellen, einmal mit gepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,2 gewaschen. ,

8. In jede Vertiefung wird 0,5 ml der Suspension der roten Blutkörperchen gegeben und die Kulturen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. :

9. Die Suspension wird dann abdekantiert und die Kulturen werden zwei-'bis dreimal mit gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, um alles, außer den spezifisch gebundenen roten Blutkörperchen zu entfernen.

10. Schließlich wird 1,0 ml Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) in jede Vertiefung gegeben.

11. Die Auszählung der Stellen hamadsorbierter roter Blutkörperchen erfolgt zu Anfang mit einem Nikon-Umkehrphasenkontrastmikroskop mit einem 4X-0bjektiv.

12. In allen Fällen werden zum Auszählen jeder Vertiefung mindestens fünf Felder beliebig ausgewählt.

22 824 9 3

13. Die Auszählung der Hamadsorptionsstellen erfolgt mit einer Bausch & Lomb Omnicon Alpha-Bildanalysiervorrichtung.

14. Das Bild des Mikroskopfeldes wird auf einen Vidicon-Abtaster projiziert. Es wird auch auf einem Fernsehschirm dargestellt, so daß der Bedienungsfachmann Fehler aufgrund von Zellbruchstücken entdecken und auszählen kann. Die Schwerpunktstellen werden aufgrund ihres Graut'ones und ihrer Bildgröße ermittelt.

15. Um eine Auszählung restlicher nichtadsorbierter roter Blutkörperchen zu eliminieren, wird ein überdimensionierter Zählmodul programmiert, um einzelne rote Blutkörperchen auszusieben.

16. Die statistische Analyse umfaßt die Analyse der Daten unter Verwendung eines Variance-Modells. Quellen für Abweichungen können in den Behandlungen, den Vertiefungen innerhalb der Behandlungen und experimentellen Fehlern in den Feldern der einzelnen Vertiefungen liegen. Der Durchschnitt der infizierten Zellen je Feld und die Standardabweichung des Durchschnitts werden für jede Vertiefung errechnet. Durchschnittswerte und Standardabweichungen werden auch für jede Behandlung errechnet, indem die Vertiefungen innerhalb jeder Behandlung gepoolt werden. Die durchschnittliche Anzahl der infizierten Zellen je Feld innerhalb jeder Behandlung wird unter Anwendung des Dunnets-Vielfachvergleiches unabhängig vom Gesamt-F—Test für die Behandlung mit der Kontrolle verglichen.

22824 9 3

	Kontrolle	Vertie fung 3	13	Vertie fung 4	11	Behandlung	1
Vertie- funa 1	Vertie fung 2	F	23	F1	21	Vertie fung 5	Vertie fung 6
* F 11	F 12	F	33	F'	31	F ' 12	F' 13
F 21	F 22	F		F'		F' 22	FV 23
F 31	F 32	*3:		X1 +		F1 32	F' 33
	Γ j. CC X2+ SE2				— * — x2+SE2 χ	3±SE3
gepoolt	x +SE		xT+SE

η = 9 . η = 9

F11 bedeutet Feld, Nr.

F. Herstellung menschlicher peripherer Blutlymphocyten A. Herstellung von Ficoll-Hypague Trennmedium .

1. 22,5 g Ficoll 400 (Pharmacia, Molekulargewicht etwa 400.000) werden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Wenn das meiste dieses Material in Lösung ist, wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf 250 ml eingestellt.

2. 34 g Hypagu'e (Natriumdiatrizoat, Sterling Organics, Molekulargewicht etwa 636) werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. ·

3. Die Lösungen werden durch ein 0,45,u Milliporenfilter steril filtriert und in ste unter Lichtausschluß aufbewahrt.

ter steril filtriert und in sterilen Behältern bei 4 C

4. Arbeitslösungen werden durch Vermischen von 10 ml Hypaque-Lösung mit 24 ml Ficoll-Lösung hergestellt. Die Mischung wird unter stetigem Rühren auf 25 C erwärmt.

22 8249 3

B. Trennung der menschlichen peripheren Blutlymphocyten aus dem Blut .

1. Proben von menschlichem Blut werden durch Blutabnahme aus der Vene in heparinisierte 20 ml-Vakuumröhrchen erhalten. 15 bis 20 ml des unverdünnten Blutes werden vorsichtig unter.aseptischen Bedingungen über das gleiche Volumen von Ficoll-Hypaque Lösung in sterilen 50 ml Polycarbonatzentrifugenröhrchen geschichtet.

2. Die Proben werden bei 25 C und 400 g 30 Minuten "%₅ zentrifugiert ·', Das flaumige weiße Band an der Grenzfläehe wird aseptisch in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen mit 10 bis 20 ml RPMI-1640 gesaugt. Die Zellen werden einmal bei 25 C gewaschen; 10 Minuten bei 400 g und 25⁰C.

3. Die zusammengeballten peripheren Blutlymphocyten werden in 1 ml RPMI je 8 ml des gesamten ursprünglich verwendeten Bluts resuspendiert und mit einem Coulter-Zähler gezählt. Die Konzentration wird mit RPMI-1640, ergänzt durch Glutamin und Antibiotica eingestellt. Die Zellen werden bis zu ihrer Verwendung bei Raumtemperatur gehalten.

G. Stimulierung der menschlichen peripheren Blutlymphocyten mit PHA. und LPS

1. 10 bis 40 ml Blut werden gesunden Freiwilligen entnommen und in heparinisierte Röhrchen aufgezogen.

2. Die Lymphocyten werden unter Anwendung der Ficoll-Hypaque Trenntechnik aus dem Blut abgetrennt.

3. Verschiedene Konzentrationen der Testverbindung werden in RPMI-1640 hergestellt.

22 824 93

4. Die Konzentration der Lymphocyten wird auf 2 χ 10⁶/ml RPMI-1640 eingestellt.

5. Die Lymphocyten werden mit der Testverbindung 90

- ' . - - - .

Minuten bei 37⁰C inkubiert.

6. Rote Blutkörperchen von Schafen, ein bis zwei Wochen alt, werden dreimal mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und auf eine Endkonzentration von 0,5 % in RPMI-1640 verdünnt.

' · - ... ·' .

7. Reaktionsgläser mit dem folgenden Inhalt werden aufgestellt:

0,2 ml Lymphocyten (2 χ 10 ) 0,2 ml 9 % Ficoll in RPMI-1640

0,2 ml rote Blutkörperchen von Schafen (0,5 % in RPMI-1640)

8. Die obigen Komponenten werden 5 Minuten bei Raumtemperatur und 200 g zentrifugiert.

9. Das Sediment wird vorsichtig resuspendiert und eine

Probe wird in ein Hämocytometer gegeben.

.-

10. Die Anzahl der Rosetten wird dann unter einem Mikroskop gezählt, wobei jeder Lymphocyt mit 3 oder mehr anhängenden roten Zellen als Rosette gezählt wird.

H. Ε-Rosetten bildende Zellen ' ·

A. Herstellung von Mitogenen

1. Lipopolysaccharid B oder Phytohämagglutinin P-Pulver wird gewogen und in RPMI-1640 in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst und durch ein 0,45 ,u Milliporenfilter sterilisiert.'

22 82

2. Anteile von 1 ml je Röhrchen werden aseptisch in etikettierte sterile Röhrchen übergeführt und eingefroren. Die Proben werden nach partieller Verwendung nicht wieder eingefroren sondern können einen Tag oder zwei bei 4 C aufbewahrt werden. Lyophilisiertes Pulver wird auf 4 C gehalten.

B. Herstellung, der Kulturen

1. Periphere Blutlymphocyten werden wie in SOP Nr.

1-004 in serumfreiem RPMI-1640, ergänzt durch Glutamin und eine Antibiotika-Antimycotika Lösung (GIBCO) hergestellt. 1/10 ml je Vertiefung wird in jede Vertiefung einer Mikrotestkulturplatte mit 96 Vertiefungen gefüllt (CoStar Plastics), wofür man eine automatische Mikropipette mit acht -Zuführungen und sterilen Spitzen (Flow Labs.) verwendete. .

2. Mitogenlösungen werden rasch aufgetaut und mit RPMI-1640 auf die vierfache gewünschte Konzentration verdünnt .

3. Testverbindungen werden für ihre Verwendung wie in 'SOP Nr. C-002 hergestellt, wobei man RPMI-1640 als Verdünnungsmitte 1 verwendet und auf das vierfache der gewünschten End konzentrat ion verdünnt.

4. 50.ul jeder Verdünnung des Mitogens und/oder der Test verbindung werden zu 6 Reproduktionskulturen gegeben. RPMI-1640 allein wird in den gleichen Mengen in Kontrollkulturen für ein Gesamtvolumen von 0,2 ml je Vertiefung verwendet.

5. Die Kulturen werden bei 37 C in feuchter Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % CO₂ 48 Stunden bebrütet (pH etwa 6,0 bis 7,0). Die Zellen werden dann mit 0,5,u Ci/Ver-

3 tiefung H-TdR (Thymidin) weitere 18 Stunden markiert.

228249 3

Die Zellen werden mit einer Vorrichtung, die automatisch mehrere Proben aberntet, gesammelt. Nicht anhaftende Zellen werden mit 0,9 % Kochsalzlösung (Ausspülungen von 10 Vertiefungen) auf Glasfaserfilterstreifen gesaugt und die Zellen werden mit destilliertem Wasser gewaschen (Ausspülungen von 20 Vertiefungen). Die Streifen werden sorgfältig an der Luft getrocknet, restliche Zellablagerungen werden aus den Streifen geschnitten und jede Probe wird in T g Glas-Scintillationsphiolen übergeführt. Scintillationskonzentrat (Scintiprep 1, Fisher Chemicals) wird mit Toluol von Scintillationsqualität (Packard) im Verhältnis 1:50 verdünnt und 1 ml hiervon wird in jede Phiole gegeben. Die Proben werden durch Flüssigkeitsscintillationsspektroskopie ausgewertet und die erhaltenen Werte als mittlere Zählungen je Minute je Testgruppe ausgedrückt.

I. Immunoplattentest

A. Herstellung von NPT 15392

1. Eine Lösung, die 500,ug/ml NPT 15392 enthält, wird dadurch hergestellt, daß man eine vorher gewogene Menge der pulvrigen Verbindung in sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung gibt und die Lösung 30 Minuten beschallt.

2. Die Wellenlänge des GCA/McPherson Doppelstrahl-Spectrophotometers wird auf 250 nm eingestellt.

3. Das NPT 15392 wird mit 0,1 normaler HCl im Verhältnis 1:10 verdünnt.

4. 15 ml 0,1 normaler HCl werden in einen Becher gegossen, diese Lösung wird zum Ausspülen der Küvetten verwendet. Beide Küvetten werden mit 0,1 normaler HCl gefüllt und die Wellenlänge wird abgelesen. Die Absorbanz sollte vom O-Wert aus bei 0,001 bis 0,005 liegen.

228249 3

5. Die Probenküvette wird geleert und die verdünnte NPT 15392-LÖsung eingefüllt. ,

6. Die Absorbanz wird abgelesen und die Konzentration wie folgt errechnet:

A (Absorbanz) •χ

Verdunnungsfaktor χ Atomgewicht-

11.,31

B. Vor dem Tag 0

1. Eine Lösung von NPT 15392 wird durch Lösen von 'öOO.ug.NPT 15392 je ml Phosphat gepufferter Kochsalzlösung hergestellt.

2. Die Konzentration wird nach Abschnitt A der Vorschrift SOP geprüft.

3. Die Grundlösung wird in Anteile von 1 ml unterteilt und mehrere Monate bei -20⁰C aufbewahrt.

4. Die Lösungen werden aufgetaut und auf die gewünschte Konzentration verdünnt.

C. Herstellung von Agarosegrundplatten:

1. Eine 1,4 %ige Suspension von Agarose in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (7 g in 500 ml) wird 15 Minuten autoklaviert.

2.' Unter Verwendung einer Cornwell-Spritze werden 3 ml geschmolzene Agarose aseptisch in Falcon Nr. 1006 P.etrischalen verteilt und in Drehbewegung versetzt, um ebene Schichten zu bilden.

3. Diese Platten können vor ihrer Verwendung bis zu einer Woche bei 4 C aufbewahrt werden. Dies erfolgt in umgekehrter Lage (Agar auf der Oberseite der Platte).

22824 9 3

D. Herstellung von Meerschweinschenserum

1. 10 ml Blut werden zwei bis sechs Meerschweinchen durch Herzpunktion entnommen und dann in ein 50 ml Falcon Nr. 2070 Zentrifugenröhrchen ohne Antikoagulationsmittel gegeben.

2. Diese Röhrchen werden zur Herbeiführung einer Gerinnung 45 Minuten bei 37⁰C bebrütet. ·

3. Die Röhrchen werden dann aus dem Brutschrank ent-

fernt, und 30 Minuten auf Eis gegeben, um das Blutgerin-

·.· '' .

sei zu entfernen.

4. Das Serum wird aseptisch aus jedem Röhrchen abgegossen, gesammelt, in 1 ml Proben unterteilt und bisjzur Verwendung bei -70 C aufbewahrt.

E. Immunisierung, Tag O \ : _:

1. Mäuse werden wie folgt immunisiert: von Hyland Labs wird wöchentlich Schafblut bezogen. Es wird aseptisch gesammelt in zwei Volumenteilen Alsevier je ein Volumenteil Blut. '-·.- '

2. 0,5 ml des Schafblutes in Alsevier wird dreimal mit steriler Phosphat gepufferter Kochsalzlösung in einer IEC klinischen Zentrifuge gewaschen (10 Minuten bei 2.800 UpM und. Raumtemperatur).

3. Das gebildete Sedimentkügelchen wird im Verhältnis 1:10 in steriler Phosphat gepufferter Kochsalzlösung resuspendiert.

4. Ein Modell Z Coulter-Zähler wird gemäß dem Coulter Instruktionshandbuch kalibriert.

5. Für die Coulter-Zellzählung ist eine 1:1.000 Verdünnung notwendig, und sie wird dadurch erhalten, daß man zuerst eine 1:100-Verdünnung in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung herstellt und diese dann im Verhältnis .1:10 in Isoton verdünnt. Die "Zählschwelle wird auf Nr. 5 eingestellt.

6. Die Grundlösung wird auf 4 χ 10 Zellen/ml verdünnt. Diese Endsuspension wird für die Immunisierung verwendet .

7. Jede Maus wird durch intravenöse Injektion in die seitliche Schwanzvene, die zur Erweiterung der Vene in einem 50 C warmen Wasserbad erwärmt wird, mit 0,1 ml der Suspension der roten Blutkörperchen von Schafen immunisiert. Die End konzentrat ion dieser Blutkörperchen beträgt 4 χ 10 je Maus.

F. Behandlung

1. Mäuse werden durch intraperetoneale Injektion an den

3 Tagen 0, 1,2 und 3 behandelt. Eine 1 cm Spritze wird mit einer 12,7 mm, 26 Gauge-Nadel, versehen. Die Nadel wird in einem 45 Winkel längs der rechten Seite der Linea Alba eingeführt. Es werden jeweils 0,2 ml sowohl an die behandelten als auch an die als Kontrcllgruppe dienenden Tiere verabfolgt.

2. Den Behandlungsgruppen werden 0,2 ml einer gewünschten Konzentration der NPT 15392 Lösung verabreicht, das sind 5,ug/ml für eine Maus mit einen Körpergewicht von '20 g < . .

228249 3

G. Milzpräparat, Tag 4 . .

1. Milz wird aseptisch entfernt und einzeln in Falcon Nr. 2025 Gewebekulturrohrchen gegeben, die 3 ml MEM enthalten. Die Röhrchen werden dann auf Eis aufbewahrt.

2. Die Milzzellen werden im gleichen Röhrchen mit einem Teflon-Pistill homogenisiert·, der an einem G.K. Heller Umkehrmotor mit variabler Geschwindigkeit angebracht ist. ;Der Geschwindigkeitsregler dieses Motors wird auf Nr . 6:. eingestellt.

% ..- ' } ' : ' · "' · . -. ^; .

3. Die Homogenisierungszeit und -wirkung sollte von Probe zu Probe gleichmäßig sein.

4. Die Proben werden dann durch ein 40 Mikron Sieb aus nichtrostendem Stahl mit einer lichten Maschenweite" von 0,149 mm in ein Standard-Gewebekulturröhrchen filtriert. Das Sieb wird mit 3 ml MEM gespült und. die Zellsuspension auf Eis aufbewahrt.

5. Eine 1:1000-Verdünnung wird für die Zellzählur.g mit dem Coulter-Zähler hergestellt und dadurch erhalten, daß man zuerst eine 1:100-Verdünnung mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung und dann eine 1:10-Verdünnung mit Isoton herstellt.

- 6. Die Zellzählung wird vorgenommen und die Grundsuspension auf 1 χ 10 Zellen/ml verdünnt. Die Schwelle für den Coulter-Zähler wird auf 10 eingestellt. Rote Zellen werden mit drei Tropfen Zap-Isoton aufgelöst.

H. Herstellung von Agar, 0,7 %

1. 0,35 g Agarose und 0,53 g MEM-Pulver -verden in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben. Dann werden 50 ml destilliertes Wasser zugefügt.

2. Die Lösung wird 15 Minuten bei 120 C und 1,03 kg/cm autok .!&Λ ie»rt . Dann wi^c¹ sie für 5 Minuten in ein Wasserbad von' 45⁰C gestellt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von Natriumbicarbonat (0,1 ml Na^,C0_) auf etwa 7,2 eingeste11t.

3. 1 ml Anteile werden in 5 ml Gewebekulturröhrchen verteilt, die· in einem Wasserbad stehen. Einigj Extraröhi chen werden bereitgestellt, um etvaige auftretende Fehler korrigieren zu können.

I. Herstellung einer 10 %igen Lösung von roten Blutkörperchen von Schafen

1. 5 ml Schafblut, die gleiche Charge wie für die Immunisierung, werden dreimal mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung unter Anwendung einer IEC klinischen Standardzentrifuge, 10 Minuten bei 2.800 UpM, gewaschen.

2. Nach der dritten Wäsche werden die gepackten Zellen im 10-fachen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert, das heißt 0,5 ml gepackte Zellen in 5 ml Phosphat gepufferter Kochsalzlösung.

. ~j ' J ..·; Plattenbildung .

Agarplatten nimmt man aus dem Kühlschrank und läßt sie auf Raumtemperatur erwärmen. Sie werden etikettiert in dreifacher Ausfertigung für jede experimentelle Gruppe ' verwendet.

2. Die mit Agar gefüllten Röhrchen werden aus dem Wasserbad genommen. In jedes Röhrchen werden 1/10 ml der 10 %igen Suspension roter Blutkörperchen von Schafen und 0,1 ml der Milzzellensuspension gegeben. Die Röhrchen werden auf einem' Vortex-Mischer bewegt.

22824 9 3

3. Der Inhalt der Röhrchen wird sofort auf die Agargrundplatten gegossen und in Umdrehung versetzt, bis eine gl'atte Schicht gebildet ist. Die Platten werden auf eine ebene Fläche gestellt, bis sich der Agar verfestigt hat.

' 4. Die Platten werden in einer feuchten Atmosphäre aus 5 % CO₂ und 95 % Luft 90 Minuten bei 37⁰C bebrütet.

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/1 ' " '

5. Meerschweinchenkomplement (siehe Abschnitt D) wird

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aus dem Gefrierschrank entnommen, bei Raumtemperatur

' ' · '

aufgetaut und im Verhältnis 1:10 mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung verdünnt . '..""..

6. Die Platten werden aus dem Brutschrank entnommen

und jeweils mit 1 ml des verdünnten Komplements versetzt . '

7. Die Platten werden darauf weitere 30 bis 45 Minuten bei 37°C bebrütet. Dann werden sie aus dem Brutschrank entnommen und unter schräg auffallendem Licht ausgezählt. .

_t J 8. Die Platten können in umgekehrter Lage bei 4 C aufbewahrt und bis zu 24 Stunden später ausgezählt werden.

Zusammenstellung der therapeutischen Anwendungsmöglichkeiten

Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen ^c Verbindungen die Vermehrung eines repräsentativen Vertreters von RNA-Viren bei Anwendung von Standardgewebekulturtechniken zu hemmen vermögen. Im Falle der RNA-Viren wurde der zum A Subtyp gehörende Influenzavirus bei Anwendung der Hämadsorptionstechnik gehemmt. Mehrere Glieder der Reihe NPT 15457 und NPT 15458 hemmten die Vermehrung des Influenzavirus b-ei Konzentrationen von . 3,6 bis 360 Nanomolen/ml. .

Andere Glieder von RNA-Viren sind in der Tabelle 6 zusammengestellt. Sie verursachen die dort aufgeführten Krankheiten. Von allen auf der Welt auftretenden Krankheiten werden bekanntlich mindestens 25 % durch Viren verursacht. Außerdem wurde eine Reihe von Viren isoliert, von denen nachgewiesen ist, daß sie zur Bildung von Tumoren führen. Es kann somit erwartet werden, daß antivirale Mittel einige Antitumorwirkung haben, zum Beispiel Wirkung gegen Leukämie.

Die Wirksamkeit einer dieser Verbindungen, das heißt von NPT 15458, das Wachstum anormaler Lymphocyten zu hemmen, wurde festgestellt. So vermag NPT 15458 die Proliferation leukämischer Mäuselymphocyten (L-1210 Zeil-Linie) in Gewebekultur zu hemmen. Eine 40 %ige Hemmung der L-1210-Zellen wurde mit NPT 15458 in einer Konzentration von 10,ug/rnl bewirkt.

Schließlich zeigen die Werte in der Tabelle 3, daß bei normalen Körper-pH-Werten (7,2) die erfindungsgemäßen Verbindungen gute chemische Beständigkeit besitzen, aber bei alkalischem pH-Wert zu der "aktiven" Substanz NPT 15392 aufgespalten werden. Aus der Tabelle 9 geht ;hervor, daß die Ester, insbesondere NPT 15458, in tierischen Geweben zu NPT 15392 aufgespalten werden. Dies beweist vermutlich, warum die erfindungsgemäßen Verbindungen die angegebene biologische Wirksamkeit haben. Außerdem zeigen die Werte der Tabelle 10, daß mindestens 12-fach höhere Blutspiegel an NPT 15392, das heißt der biologisch "aktiven" Substanz erzeugt werden, wenn NPT 15458 anstelle von NPT 15392 selbst intraperitoneal an Mäuse verabfolgt wird. Weiterhin zeigt die Tabelle 9, daß Verozellen (Niere), Leberzellen und periphere menschliche Blutlymphocyten sämtlich den "Vorläufer" zur biologisch wirksamen Verbindung NPT 15392 "aufspalten.

22 8249 3

Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen spezifisch die Vermehrung von Viren, modulieren (potenzieren oder hemmen) die Immunreaktion und hemmen das Wachstum von Leukämielymphocyten. Aufgrund der in vitro Versuche und der höheren Blutspiegel, die mit diesen Verbindungen im Vergleich zu NPT. 15392 erzielt werden und eine Aktivität im Konzentrationsbereich 0,'01 bis 100 ,ug/ml veranschaulichen, betragen die erwarteten wirksamen Dosen bei Säugetieren 0,0005 bis 50 mg/kg.

Formulierungen. ?

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können an Säugetiere in einer Dosis von 1 bis 1000 mg/kg Körpergewicht verabfolgt werden. Man kann annehmen, daß Wirksamkeit bereits in einer Dosis von 0,0005 mg/kg erreicht wird.

Sie können in Form von Tabletten oder Kapseln an Menschen und Tiere verabreicht werden und, wenn es die Löslichkeit erlaubt, in Form eines wäßrigen Sirups oder als Lösung in Öl, oder wenn sie unlöslich sind, als Suspension. Typische pharmazeutische Zubereitungen sind nachfolgend beschrieben:

Kapsel:

NPT 15458 0,1 - 500 mg

Avicel pH 101 (mikro- .

kristalline Zellulose) zum Auffüllen auf

800 mg

Suspension

Wäßrige Suspensionen können mit einer Reihe von Suspendiermitteln hergestellt werden. Zu diesen gehören Natriumcarboxymethylzellulose, Natriumalginat, Traganthgummi, Avicel RC-591 (mikrokristalline Zellulose), Methylzellulose, Veegum .und Xanthangummi. Außer dem Suspendiermittel können Süßungsmittel, Geschmacksstoffe,

22 8

Farbstoffe, Konservierungsmittel, 'Schutzkolloide und Dispergiermittel zugesetzt werden.

Sirup

NPT 15458

Maiszucker

destilliertes Wasser FD und C Rot 40 Natriumsaccharin Alkohol U.S.P. Methylparaben U.S.P. Glycerin

Kirschgeschmacksstoff Fruchtgeschmacksstoff

destilliertes Wasser zum Auffüllen auf 0,05-250 mg (oder bis zur

Lo s-

3,25 g 0,05 g 0,00175 g 0,00250 g 0,08 g 0,005 g 0,001 g 0,31225 g 0,00825 g

5 ml maximalen lichkeit)

Tablette ' NPT 15458 Avicel pH 101 modifizierte Stärke Magnesiumstearat U.S.P. Polyvinylpyrrolidon Stearinsäure U.S.P.

0,1-500 mg 130 mg 20 mg

5, 5 mg 22 mg 30 mg

Claims (10)

Erfindungsanspruch ' ..--.'

1. Verfahren zur Herstellung von Estern von Hydroxyalkylpurinen der allgemeinen Formel

OF.

in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoff-

2 zeichnet, daß man Ester herstellt, in denen R der Monomethyl- oder Monoethylcarbonatrest oder der Rest einer cL-Aminoalkancarbonsäure ist.

2 zeichnet, daß man Ester herstellt, in denen R der Rest einer C. bis C.-Fettsäure, von Kohlensäure, einem Monoalkylcarbonat, einer cL-Aminocarbonsäure, von Phenylalkancarbonsäuren mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkancarbonsäurerest, von Salicylsäure, einem Halbester einer Alkandicarbonsäure oder einer Alkendicarbonsäure, von Phosphorsäure oder Salpetersäure oder ein Glycosid- oder Acetaldehydacetalrest ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ^?daß man als Ausgangsstoff ein Hydroxyalkylpurin verwendet, in dem R eine normale Alkylgruppe mit !insbesondere 1 bis 6 C-Atomen ist.

2 2 8 2 A § 3

2
atomen und R der Rest einer Carbonsäure, der Phosphorsäure, Salpetersäure oder ein Glycosid- oder Acetaldehydacetalrest ist, dadurch gekennzeichnet, daß man

ein Hydroxyalkylpurin der allgemeinen Formel

CH

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn-

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn-

4» &m W' a» «f J₈? ^J

in der R die angegebene Bedeutung hat, mit einem Carbonsäureanhydrid, einem Carbonsäurehalogenid, einem Alkylchlorformiat, Phosgen, o-Phenylenphosphochloridat, Salpetersäure, Acetaldehyd oder einem Acetobromzucker' umsetzt und das zuletzt genannte* Umsetzungsprodukt hydrolysiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn-' . ' . 2

zeichnet, daß man Ester herstellt, in denen R der Acylrest der Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Palmitinsäure ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Ester herstellt, in denen R ein Hemimalonat-, Hemifumarat-, Hemimaleat- oder Hemisuccinatrest ist.

.7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekenn-^

zeichnet, daß man Ester herstellt, in denen R der Acylrest · von Glycin, Arginin, Lysin oder Alanin ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn-

zeichnet, daß man Ester herstellt, in denen R ein Glycosidrest eines Zuckers mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomenist.

daß man Ester herstellt, in denen R ein Glucosid-

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man E

rest ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Ester hers
Acetaldehydäcetalgruppe ist.

zeichnet, daß man Ester herstellt, in denen R die

SCHA/wo/kö