KR850000320B1

KR850000320B1 - 면역조절제 인 하이포크산틴 유도체의 제조방법

Info

Publication number: KR850000320B1
Application number: KR1019810000822A
Authority: KR
Inventors: 노튼 사이몬 리오넬; 기너 소롤라 알프레도; 구테그 알빈
Original assignee: 뉴포트 파마슈티컬 인터내셔널 인코포레이티드; 카메론 더블류. 멕스웰; 슬로안-케터링 인스티튜트 풔 캔서 리써어치; 로저 시. 허드만, 엠. 디
Priority date: 1980-03-14
Filing date: 1981-03-13
Publication date: 1985-03-20
Also published as: NO155579C; CA1159827A; DK154768C; EP0036077A2; IE51019B1; AU535052B2; PT72665A; ZA811181B; PL129094B1; NZ196295A; JPS572287A; US4340726A; GR74807B; IN155441B; KR830005224A; NO810723L; PT72665B; EP0036077B1; NO155579B; DK154768B

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

면역조절제 인 하이포크산틴 유도체의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 면역조절제인 다음 일반식(I)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다 :

위의 식에서, R¹은 C₁-C₈알킬이며, R²는 치환되지 않은 모노카복실산, 치환되지 않은 디카복실산, 아미노카북실산, 방향족 카복실산, 인산, 또는 질산의 에스테르 그룹이거나, 글루코시드 또는 아세트알데히드아세틸이다.

본 발명에 따른 상기 화합물은 면역조절제로서, 항비루스성 활성 및 항종양활성, 특히는 항백혈병 활성을 지니고 있으며, 또한 효소 억제제이기도 하다. 또한 본 발명의 화합물은 상응하는 알코올을 생물학적 계통에 도입시키는 데 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 일반식(I)의 화합물은 R²가 수소로 치환된 일반식(I)의 화합물을 카복실산 무수물 카북실산할라이드, 알킬크로로포르메이트, 포스겐, 오르로-페닐렌 포스포클로리데이트, 질산, 아세트알데히드 또는 아세토브로모슈가와 반응시킨 다음 가수분해하여 제조할 수 있다.

에스테르그룹 R²의 산 부위는 탄소수 1내지 8인 치환되지 않은 지방족 모노 카복실산의 것일 수 있으며(예, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 이소발레르산, 카프로인산, 카프릴산, 라우르산 팔미트산, 스테아린산 및 올데인산), 또한 치환되지 않은 지방족 디카복실산(예, 말론산, 푸마르산, 말레인산, 석신산, 글루타르산), 그리고 탄산일 수 있다. 이는 디카복실산과 함께 보통 반-에스테르(예, 헤미말로네이트, 헤미푸마레이트, 헤미말레에이트, 및 헤미석시네이트) 뿐만 아니라 메틸카보네이트와 에틸카보네이트를 형성한다.

아미노 카복실산으로서는 글리신, 아르기닌, 라이신, 알라닌, 레우신, 발린, 및 메티오닌과 같은 아미노 알카노산을 사용한다.

그리고, 방향족 카복실산으로서는 페닐아세트산, 페닐프로 피온산 또는 페닐알라닌과 같은 아르알킬카복실산 또는 실리실산을 사용할 수 있다.

유기산의 에스테르는 산무수물 또는 아실할라이드(예, 아세틸클로라이드와 같은 아실클로라이드)를 사용하여 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 탄산에스테르는 클로로포름산 에스테르(예, 에틸클로로포르메이트, 메틸클로로포르메이트) 또는 포스겐으로부터 제조할 수 있다.

또한 무기산의 에스테르도 오르토-페닐렌 포스클로리데이트를 사용하여 포스페이트를 그리고 질산을 사용하여 질산염을 제조하는 바와같이 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

글루코시드는 탄소수 5내지 6인슈가(예, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 크실로스, 2-데옥시글루코스, 2-데옥시리보스, 리보스, 아라비노스, 가락토스 또는 탐노스)로부터 제조할 수 있다. 이는 또한 아세토브로모슈가를 사용한 다음 아세틸그룹을 가수분해시켜 제조할 수 있다.

그러므로 알려진 절차 [Koings-Knorr Procedure : (Koings Knorr ,Sitz-bayer Acad. Wis. 30, 103 (1900 : Brigl and Keppler, Ber., 59, 1588 (1926) and Koings and Knorr, Ber., 34, 974 (1901)]에 따라, 은카보네이트의 존재하에 아세토브로모글루코스를 사용할 수 있다.

또한 아세트알데히드 사에탈은 촉매로서 알코홀게 염산을 사용하여 아세트알데히드로부터 통상적인 방법으로 제조할 수 잇다.

바이러스(인플루엔자 바이러스, HSV, Friend leukemia 바이러스), 박테리아 및 진균과 같은 많은 병원체는 이의 감염에 대한 저항력을 약화시키는 숙주내에서 면역 억제상태를 야기시키게 된다는 사실이 확립되었다. 대부분의 다른 항비루스성 항대사물질(예, AraC)은 숙주 면역방어 메카니즘의 억제를 야기시키기 때문에, 신체의 자연방어 메카니즘이 약화되어 제2의 감염이 일어나게 된다.

면역상승제 또는 면역조절제는 낮아진 면역기능을 회복시키거나, 정상적인 면역기능을 향상시키고, 또는 이들 모두를 향상시키는 물질이다. 면역기능은 체액면역성, 세포면역성, 또는 대식세포 조정 저항성의 개선 및 표현으로서 한정된다. 이는 면역반응의 표현에 포함되는 세포에 직접 작용하는, 또는 면역반응에 포함된 세포의 기능을 조절하는 작용을 하는 세포 또는 분자기전에 직접 작용하는 것을 포함한다. 면역기능의 증대는 면역계통에 대한 내성 또는 외성에 영향을 미치는 네카티브-피드백에 의해 유도된 억제 메카니즘을 폐지하는 물질의 작용으로부터 얻을 수 있다. 그러므로, 면역 상승제는 여러기전을 지니고 있다. 면역상승제의 여러작용세포 부위 및 생물학적 작용 메카니즘에도 불구하고, 이들의 적용은 주로 숙주의 내성을 증가시키는 데에 동일하다.

[면역상승제의 적용]

1) 면역계통의 주 보호기능은 바이러스, 리케챠, 미코프라즈마, 박테리아, 진균 및 기생균을 포함한 병원균에 의한 침입을 막는 것이다. 그러므로, 면역반응은 향상은 상기 병원균의 감염에 대한 내성을 증가시키게 된다. 면역상승제 자체 또는 항감염제와의 조합물은 어떤 모든 전염병에 적용할 수 있다.

2) 면역계통의 두번째 보호기능은 외투조직의 이식에 대한 저항성이다. 면역상승제는 또한 태아 또는 태반조직의 거부를 촉진하는데 사용할 수 있다.

3) 면역계통의 세번째 보호기능은 암에서의 악성세포에 대한 저항성이다. 면역상승제는 암의 치료에 사용할 수 있다.

4) 4번째 보호기능은 포지티브 억제인자 메카니즘에 의해 비반응성을 유지시키는 것을 포함한다. 자동-면역 및 이와 관련된 질병에 있어서, 자기저항원에 관계된 면역 반응성은 뚜렷하다. 면역상승제는 보통의 억제인자 메카니즘을 회복하는데 사용할 수 있다.

면역계통의 각 보호기능은 면역상승제 자체 또는 침입병원균의 내성을 향상시키고 이를 사멸하는데 사용하는 다른 물질과함께 조합으로 비특정치료에 의해 조절할 수 있다. 또한, 특정한 내성을 어떤 형태의 항원과 함께 면역상승제를 사용함으로써 증대시킬 수 있다. 이러한 사용은 특정한 면역성 또는 내성을 유도하게된다. 상기 내성은 알레르기 또는 자동면역 질병에 있어 항원과 함께 사용함으로써 유도된다. R¹이 헥실인 알코올은 에리트로-9-(2-하이드록시-3-노닐)-하이포크산틴인데, 이는 확인넘버 NPT 15392로써 실험한다.

본 발명에 포함되는 화합물에는 에리트리-9-(2-아세톡시-3-노닐)하이포크산틴(NPT 15458, 참조, 실시예 1), 에리트로-9-(2-석신옥시-3-노닐)-하이포크산틴(NPT 15457, 참조 : 실시예 2), 및 에리트로-9-(2-포스페이트-3-노닐)-하이포크산틴이 있다.

본 발명에 포함되는 다른 화합물들은 다음의 표 1에 나타나 있으며, 여기서 R¹에 대한 알킬그룹은 모두 n-알킬이다.

[표 1]

NPT 15392는 항비루스성 면역조절 및 항종양 활성을 지니고 있는 것으로 앞에서 입증되었다.

여기서 나타난 결과는 (1) NPT 15392의 새로운 유도체를 제조할 수 있으며, (2) 이를 생물학적 시스템에서 활성물질(NPT 15392)로 전환시킬 수 있으며, (3) 활성물질(NPT 15392)의 보다높은 혈액수준을 야기시켜 NPT 15392의 효력을 증가시킴을 입증해 준다.

다음의 표에는 본 발명의 몇몇 화합물에 대한 화학적 특성이 요약되어 있다.

[본 발명에 따른 대표적 회접물의 화학적 특성]

*HPCL--메탄올 65%-0.05M H₃PO₄35%의 용매를 사용하여 5μ 스페로소브 ODS 2.1×250mm 컬럼상에서 단일 UV 피이크.

**메탄올 65%-0.05M H3PO4 35%의 용매를 사용하여 5μ 초구형 ODS 4.6×250mm 컬럼상에서 단일 UV 피이크.

본 발명의 면역상승제는 다음의 표 A에 있는 바이러스의 침입에 대한 내성을 제공하는데 사용할 수 있다.

[표 A]

상기 화합물은 특히 RNA바이러스에 대하여 유용하다.

본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 인간, 돼지, 개, 고양이, 소, 말, 양, 생쥐, 토끼, 기나아피그, 원숭이 및 염소등을 포함한 포유동물(및 이의세포)을 치료하는데 유용하다.

본 발명을 실시예를 통해 더욱 자세히 설명하면 다음과 같다. 실시예에 있어서 다른 사항이 없는한 부 및 %는 중량에 관한 것이며 온도는 섭씨온도이다.

본 발명에 따른 조성물은 통상적인 방법으로 투여할 수 있으며, 주사용 용액으로서, 또는 정제, 알약 및 캅셀로서도 사용할 수 있다.

[실시예 1]

에리트로-9-(2-아세톡시-3-노닐)-하이포크산틴(NPT 15458) ("아세틸-노닐하이포크산틴")의 제조

에리트로-9-(2-하이드록시-3-노닐)하이포크산틴, NPT 15392(2.78g, 10밀리몰)를 피리딘(120ml)에 용해시키고, 여기서 초산무수물(3ml, 30밀리몰)을 가한다. 생성용액을 24시간동안 25℃로 유지시킨다. 다음에는 에탄올(50ml)을 가하고 생성용액을 진공중에서 증발시킨다. 상기 과정을 4회 반복하여 피리미딘을 제거한다. 잔류물에 에테르 150ml를 가하고 형성된 고체를 여과하여 수집한다. 다음에는 침전물을 에테르로 3회 세정한다. 결과로써 백색의 침전물을 얻었다. 수율은 80%로서 2.51g.

융점은 150내지 151℃

UV_max(H₂O, pH5.5) 249_nm·A_m10.1×10³, IR 1700cm^-1(C=0).

C₁₆H₂₄N₄O₃에 대한 원소분석 :

계산치 : C, 59.97 ; H, 7.55 ; N, 17.48.

실측치 : C, 59.83 ; H, 7.42 ; N, 17.39.

상승 크로마토그라피(Whatman paper #1) : Rf. 값-n-부탄올/H₂O/AcOH(2 : 1 : 1)=0.92 ; 에탄올/1M "암모늄 아세테이트(14.6)=0.8 ; 이소프로판올/진한암모니아/H₂O (7 : 2 : 4)=0.90.

[실시예 2]

에리트로-9-(2-석신옥시-3-노닐)하이포크산틴(석시닐-노닐-하이포크산틴) (NPT 15457)의 제조

에리트로-9-(2-하이드록시-3-노닐)하이포크산틴 (NPT 15392) 600mg(2.2밀리몰) 및 석신산무수물 1g(10밀리몰)을 최소량의 피리딘에 휘저으면서 용해시킨다. 생성용액을 10일간 계속 휘저으면서 천천히 대략 30℃까지 가열한다.

로타리 증발기를 사용하여 피리딘을 제거하고, 잔류물을 48시간동안 무수에탄올 20ml로 추출한다. 상기 용액을 원심분리시키고, 상등액을 박층크로마토그라피(2mm실리카겔60, N-부탄올 : 2N NH₄OH, 10 : 2v/v)시켜 정제한다. Rf=0.17에서 밴드는 무수에탄올에 용출된다. 생성물의 순도는 TLC 및 UV분광계로 확인한다.

[화학적 안정성]

다음 표 3의 데이타는, 37℃ 및 pH7.0(생리학적 pH)에서 배양할시, 에스테르, NPT 15488 및 NPT 15457이 안정성을 지님을 입증해준다. pH9.5에서의 염기성 가수분해가 아세틸(NPT 15458) 및 석시닐(NPT 15457) 에스테르 모두를 NPT 15392로 전환시킬 수 있다는 사실 또한 그의 구조를 증명해준다.

[표 3]

아세톡시-노닐-하이포크산틴(NPT 15458) 및 석신옥시-노닐-하이포크산틴(NPT 15457)의 화학적 안정도에 있어 pH 변화의 효과.

*37℃에서 3.5시간동안 배양, HPLC를 사용하여 측정.

[항비루스성 특성]

인플루엔자 비루스의 복체를 억제하는 NPT 15457 및 NPT 15458의 능력은 혈액흡착(hemadsorption) 분석법으로 측정한다. 다음의 표 4에 나타난 바와같이, 거의 온전히 NPT 15392(활성약제)로 분열된 NPT 1548의 비루스 성장억제력은 NPT 15392의 것과 유사하다. 실제로, 이는 NPT 15458이 어느정도 효과적일때 나타나는데, 아마도 NPT 15458 내부 세포의 보다 높은 흡착에 기인한 것이라 생각된다. pH7.2에서 음으로 하전된 석시닐 유도체는 쉽게 세포의 내부로 들어가지 않으며 이러한 처리에서 덜 효과적이다.

[표 4]

NPT 15392, 석신옥시 노닐-하이포크산틴(NPT 15457) 및 아세톡시-노닐 하이포크산틴(NPT 15458)의 항비루스성 특성비교

주 : a-농도(밀리몰/ml).

[면역조절 활성]

생체내 및 생체외의 모두에 있어서, 면역계통의 조절에 대한 NPT 15392의 아세톡시(NPT 15458) 및 석신옥시(NPT 15457)의 능력을 다음의 시스템을 사용하여 측정한다 :

1. 쥐의 비장세포를 사용한 유사분열물질 유도 임파구 증식(생체외).

2. 인체의 말포헐액 임파구(HPBL)를 사용한 유사분열물질유도 임파구 증식(생체외).

3. 활성로제테 형성의 향상(생체외).

4. 양의 적혈세포(SRBC)로 면역된 생쥐에서 IgM의 향상(생체내).

1) 다음의 표 5에 나타난 자료는 PHA 유도임파구 증식에 대한 NPT 15458의 능력을 보여주고 있다. 또한 NPT 15458 50㎍/ml의 농도로써 대략 25%의 증가가 이루어지며, NPT 15392 10㎍/ml로써 이와 유사한 증가가 이루어진다.

2) 다음의 표 6은 HPBL을 사용한 PHA유도 임파구 증식에 동일한 농도의 NPT 15458이 효과적임을 입증해준다. 이는 HPBL이 두 에스테르를 NPT 15392로 분해시킴을 보여주는 다음의 표 9에 주어진 자료와 관계있다. NPT 15457보다 큰 정도로 분해된 NPT 15458(참조 : 표 9)은 PHA유도 전형의 보다 효과적인 상승제이다(표 6, 1.48vs 1.28).

3) 다음의 표 7에 나타난 바와같이, NPT 15457 및 NPT 15458 모두는 HPBL에서 활성 로제테를 조절하는데 효과적이다. 실험 #1에서, 위약-처리 임파구의 활성로제테 수준이 매우 낮을경우(면역결핍), NPT 15457 및 NPT 15458이 보통 수준에 비교해 약화된 면역성을 회복하는데 NPT 15392처럼 활성적이다. 실험 #2에서는, 위약-처리대조용은 활성로제테 수준이 비정상적으로 높다. 이러한경우, NPT 15392 및 NPT 15458은 정상치의 높은 수준을 감소시킬 수 있기 때문에, 이러한 약제의 진실한 면역조절 특성을 입증해 준다.

4) 양의 적혈세포 SRBC로 면역된 Balb/c생쥐에 NPT 15457 및 NPT 15458 그리고 "활성" 약제, NPT 15392를 주입한다. SRBC에 대한 항체생성을 관찰한다. 이때 NPT 15458 및 NPT 15392는 IgM 항체의 생성을 조절하는데 매우 효과적이다. NPT 15392는 IgM 생성에 있어 46%의 증가를 나타낸다. NPT 15392의 복용량을 보다 높게하면 대조치의 증가가 둔화되거나 감소하게됨을 야기시킨다. NPT 15392로 전환되고 NAN15392혈액수준을 최소한 10배로 높게하는 (참조 : 표 10) NPT 15458은 IgM 형성을 억제한다(참조 : 표8). 이는 IgM의 형성을 억제하는 NPT 15392를 NPT 15458이 매우 높은 수준으로 생성하기 때문인 것으로 생각된다. 다음의 표 8에는 NPT 15457 및 NPT 15458의 면역조절 활성이 나타나있다. NPT 15457의 효과는 NPT 15458의 효과보다 덜하며 NPT 15457은 NPT 15458보다 NPT 15392로 전환된다(참조 : 10).

[표 5]

아세톡시-노닐-하이포크산틴(NPT 15458)의 면역조절 특성 : 쥐의 비장세포에서 유사분열물질유도-임파구 증식의 생체내 자극

주 : a-S.I.는 자극지수(stimulation index)와 동일.

[표 6]

석신옥시-노닐-하이포크산틴(NPT 15457) 및 아세톡시-노닐-하이포크산틴(NPT 15458)의 면역 조절 특성 : 인체의 말초혈액 임파구에 있어서 면역 조절물질-유도 임파구 증식의 향상.

*-3 실험의 평균치

a-P=0.05

[실험 7]

아세톡시-노닐-하이포크산틴(NPT 15458) 및 석신옥시-노닐-하이포크산틴(NPT 15457)의 면역 조절 특성 : 활성E-로제테 형성의 향상 :

a-p

0.05 위약조절.

[실험 8]

아세톡시-노닐-하이포크산틴(NPT 15458) 및 석신옥시-노닐-하이포크산틴(NPT 15457)의 면역 조절 특성 : SRBC-면역 BALB/C 생쥐에 있어 IgM 항체생성의 억제.

a-p≤0.01 us 위약조절.

[신진대시 전환]

다음의 표 9에 나타난 바와같이, NPT 15457 및 NPT 15458을 베로세포(Vero Cells) (African Green Monkey Kidney Cells), 간균등질(Liver Homogenate), 및 HPBL과 배양하면 "활성" 약제인 NPT 15392가 형성됨을 알 수 있다. NPT 15458이 NPT 15392로 전환되는 것은 NPT 15457이 NPT 15392로 전환되는 것보다 더욱 크게 일어난다.

다음의 표 10에는, NPT 15457 및 NPT 15458 모두가 i.p. 투여후 혈액에 흡착될 수 있으며, NPT 15458을 투여하면 NPT 15392의 수준이 NPT 15392 자체만 주어졌을 경우보다 거의 12배의 높은 정도로 이루어짐이 나타나있다. 이로부터 NPT 15458 및 NPT 15457이 생체내에서 NPT 15392를 생성할 수 있으며, 나아가 이러한 유도체중의 최소한 하나가 활성을 보다 크게하는 높은 혈액수준을 제공한다는 사실을 확립할수 있다.

[표 9]

아세톡시-노닐-하이포크산틴(NPT 15458) 및 석신옥시-노닐-하이포크산틴(NPT 15457)로부터 생물학적 방법에 의한 NPT 15392의 형성.

a-HPLC로써 측정.

[표 10]

아세톡시-노닐-하이포크산틴(NPT 15458) 및 석신옥시-노닐-하이포크산틴(NPT 15457)을 생쥐에 I.P. 투여한 후의 NPT 15392 형성.

생체내 종양(Leukemia)세포의 성장에 대한 에리트로-9-(2-아세톡시-2-노닐)하이포크산틴의 효과.

[표 11]

[생물학적 특성요약]

상기의 특성을 측정하는데 다음의 방법을 이용한다.

가. 세포 배양법

1. 헬라(Hela) 또는 베로(Vero) 세포 증식

1) 120㎠ 플라스트의 세포 배양체를 하기 방법으로 이차 단층 배양한다.

2) 배지를 제거하고, 단층을 매회 약 50ml의 칼슘과 마그네슘 유리 포스페이트 완충염수(PBS)로 7.2pH에서 2회 세척한다.

3) 0.5g 트립신(1 : 250)과 2.0g EDTA/Ca⁺⁺과 Mg⁺⁺이 없는 HBSS(Hanks balanced salt solution) 1litter를 함유하는 트립신-EDTA용액 1ml를 37℃에서 각 플라스크에 가하고 조심스럽게 진팅하여 단층에 분산시킨다.

4) 그 플라스크를 37℃에서 세포 이동에 필요한 시간에 따라 인큐베이터에서 항온시킨후 수동으로 진팅한다.

5) 각 플라스크에 플랜팅 배지 10ml를 가하고 피펫으로 그 현탁액을 흡입, 방출시켜 셀을 분산시킨다. 이를 10회 실시한다.

6) 플라스크의 내용물들을 집결하여 현탁액 중의 세포를 플랜팅 배지를 가해 7-8.5×10⁴cell/ml로 희석시킨다.

7) 플랜팅 배지는 하기 조성물로 제조된다. 100ml의 MEM(Minimum Essential Medium Eagle)에 10ml의 새끼 송아지 혈청(최종농도=10%) 1ml의 ℓ-글루타민(200몰)과 1ml의 10,000유니트페니실린 10,000㎍의 스트랩토마이신과 10,000네오마이신 혼합물을 보충한, 이글(Eagle)의 염과 HEPES 완충제의 MEM.

8) 각 3ml 용량의 24개의 웰의 코스타 티슈 배양 접시에 세포를 이차배양(subculture)한다. 각 웰에 세포현탁액(1ml)을 가한다.

9) 세포가 거의 융집 생장(confluent growth)에 이르렀을때(약 1-2일) 그 단층을 실험에 사용한다.

10) 플라스크를 셀라인을 유지하는데 사용한다. 보존 배지는 5%로 최종 농도가 감소된 FSC(새끼 송아지혈청)으로 보충된(7항 참조) MEM으로 조성된다.

나. 적혈구 세포

1) 기니아 피그 숫컷의 심장천자(心臟穿刺 cardiac puncture)로 부터 전혈(全血)을 취한다.

2) 약 10cc의 전혈을 25ml의 알세버 용액(Alsever's solution) 혼합하면 약 1주일간 4℃에서 보관할 수 있다.

3) 사용 바로 직전, 적혈구 현탁액을 포스페이트-완충 염수(PBS), pH7.2로 3회 세척한다.

4) 각 세척은 450g의 RBS 현탁액을 실온에서 원심 분리하여 수행한다.

5) HBSS Hhanks blanced salt solution)으로 0.4% v/v RBS 현탁액을 제조한다.

다. 비루스의 달걀 증식.

1. 전 염

1) 9일 내지 10일난 달걀들을 불빛에 조사하여 생존을 확인하고 에어색(공기 주머니)의 위치를 연필로 표시한다. 움직임이 없거나 변색한 달걀은 버린다.

2) 껍질 표피를 70%에탄올로 살균, 건조시킨다.

3) 멸균 달걀 타관참(打貫●, egg purch)을 사용하여 달걀 껍질의 에어색(공기 주머니)의 표시 범위내에 약 1/4의 작은 구멍을 뚫는다.

4) 여러 비루스 현탁액 1/10, 10²내지 10³EID₅₀/ml을 튜베쿨린 주사기를 사용하여, 45°각도로 달걀의 요막 동공에 접종시킨다.

5) 플라스틱 테이프의 1인티 조각으로 그 구멍을 막고 각 달걀들에 접종 비루스와 달걀들의 일렬번호와 날짜를 라벨 기입한다.

6) 달걀을 35°-37°에서 비루스 생장 속도에 따라 2내지 5일간 보관한다.

항온 시간과 온도를 다른 데이타와 함께 기록한다.

2. 요막액(알란토익 플루이드)의 수거

1) 항온 기간 말기에, 그 달걀들을 3-4시간동안 4℃에 냉온하여 비루스 수거 과정중 요막동공으로 누설되는 것을 최소화 한다.

2) 껍질 표면을 다시 70%에탄올로 소독하여 건조시킨다.

3) 멸균 가위로 연필 표시를 따라 껍질의 심부를 자르고 멸균 핀셋으로 껍질의 막을 찢어 가른다.

4) 핀셋을 배와 껍질막 사이로 조심스럽게 넣어 배를 한쪽으로 밀면 요막액의 공동이 생긴다. 양막을 찌르지 않도록 주의하여(양막액도 함께 수거할 경우에는 예외) 태반 중추의 상처를 최소화 한다.

5) 기계 진공 발브가 달린 멸균 10ml 피 펫으로 요막액을 수거하여 멸균된 원심 분리관에 옮긴다. 약 5-8ml를 각 달걀에서 수거한다.

6) 수거 물질 1200g을 10분간 4℃에서 원심분리한다. 상청액을 멸균튜브에 옮긴다.

7) 적정과 멸균 실험을 위해 각 푸울(pool)에서 샘플을 취한다. 남은 현탁액을 멸균한 2cc혈청 튜브에 부분표본하여 비루스 종류와 날짜와 열 번호로 라벨 부착한다.

8) 부분 표본을 즉시 액체질소에 서냉각시켜 초냉동기 또는 액체 N₂한랭기에서 -70℃로 보관한다.

라. 조직 배양에서의 비루스 증식

1. 감 염

1) 250㎠ 조직 배양 플라스크에서 단층 배양하여 융집생장에 달한 배양체를 선택한다.

2) 감염과 수거의 조작은 생물학적 안전 캐비넷과 기계 피펫으로 수행한다.

3) 25ml의 보존 배지로 감염원 배양체의 생장배지를 갈아준다.

4) 시이드 비루스(seed virus)를 전술한 바의 조성물로 보충된 혈청-유리 MEM(Minimum essential medium)으로 희석하고 그 0.5ml를 대조 샘플을 제외한 각 배양체에 가한다.

5) 각 배양체를 37℃에서 48-72시간동안, 5% CO₂의 습한 공기중에 항온시키면서 각 비루스의 세포병리학적 작용(CPE) 특성의 발현을 관찰한다.

2. 수 거

1) CPE가 3내지 4⁺에 이르렀을때 배양체를 수거한다.

0-세포병리작용 없음.

1+-25%의 세포가 세포병리 작용을 나타냄.

2+-50%의 세포가 세포병리 작용을 나타냄.

3+-70%의 세포가 세포병리 작용을 나타냄.

4+-100%의 세포가 세포병리 작용을 나타냄.

2) 배양체를 3회 냉동, 해빙시키면 세포층이 용해되고 제거된다. 3번째 해빙 이후, 배양액을 멸균 원심분리관에 옮기고 30분간 300g을 원심 분리하여 세포 파편들을 제거한다. 이 비루스 현탁액의 박테리아 오염을 점검한다.

3) 상청액을 즉시 2cc멸균 혈청 튜브에 부분표본(0.5-1ml)하여 액체 질소에서 냉동한다.

4) 적정을 위해, 24-웰의 조직 배양 플레이트에서의 단층 배양체를 준비하고 하기와 같이 감염시킨다.

a) 10배 희석된 비루스 액을 냉각된 5%새끼 송아지 혈청(FCS) 배지(10내지 10)에서 제조한다.

b) 각 희석액의 1ml를 3개 단위의 웰에 가한다.

c) 보존 배지만을 함유하는 대조 배양체는 제외한다.

5) 48시간 동안 5% CO₂, 95% 공기로 배양체를 37℃로 항온 시키고 전술한 바와 같이 세포 층을(CPE에 대해) 기록한다. ICID₅₀의 타이터(적정가)를 리이드 앤드 먼취 메소드(Reed and Munch method)로 계산한다.

마. 헴흡착(Hemadsorption, 혈액흡착) 분석

1) HAD(Hemadsorption)분석 수행직전에, 세포 배양 접시에서 배지를 제거한다.

2) 보존 배지 1ml를 각 배양체 웰에 가한다.

3) 두 계열의 대조 배양체에는 보존 배지만을 가한다.

4) 피검 배양체와 한 대조 배양체를 즉시 0.1ml의 희석 비루스 액으로 접종시킨다(부가 적정량은 전술한 HAdFFU 분석에서 설명한 바와 같다) HAdFFU는 헴흡착 포시 형성 단위(Hemadsorption foci forming unit)이다.

5) 다른 계열의 대조는 블랭크 접종으로서 MEM만을 가하여 비감염 상태로 유지시킨다.

6) 배양체들을 37℃에서 16시간 18시간동안 한온시킨다.

7) 접종후, 그 배지를 제거하여 세포를 pH7.2에서 PBSpH로 1회 세척한다.

8) 각 웰에 0.5ml의 RBC 현탁액을 가하고 그 배양체리 30분간 실온으로 유지시킨다.

9) RBC 현탁액을 제거하고 그 배양체를 2내지 3회 PBS로 세척하여 특별히 결합된 RBS만을 남기고 나머지 RBS를 제거한다.

10) 최종적으로 1.0ml의 HBSS를 각 웰에 가한다.

11) 4×대물렌즈의 니콘(Nikon)도립상-대비 현미경을 사용하여 헴흡착된, RBS표시를 카운팅한다.

12) 모든 경우에, 카운팅 웰당 최소 5개 필드를 무작위 선택한다.

13) HAD 표시의 카운팅은 바슈엔드 롬 옴니콘 알파 이미지 분석기(Bausch & Lomb Omnicon Alpha Image Analyzer)를 사용하여 수행한다.

14) 현미경의 상(象)을 비디콘 스캐너(Vidicon scanner)상에 투영시킨다. 이를 텔레비젼 스크린에 나타내어 오퍼레이터에 의해 검측하고 파편으로 인한 에라를 계산한다. 표시는 회색영상으로 나타낸다.

15) 비흡착된 잔류성 RBC 의 계산을 제하기 위해, 특대형 카운트 모듈(oversized count module)을 프로그램하여 각 RBS를 영사한다.

16) 통계 분석은 디자인 모델 포함된 변수와 함께 데이타를 분석함을 의미한다. 처리 방법과 각 처리에대한 웰과 각 웰의 필드당 실험적 오차값의 변수가 존재한다. 각 필드(field)당 평균감염 세포와 평균 표준오차가 각 웰당 계산될 것이다. 평균과 표준오차는 각각의 처리에 대한 웰을 집산(pool)시켜 각 처리에 대하여 계산될 수 있다. 각 처리당 전체적인 F- 페스트를 고려하지 않고 돈네트의 중복 비교 테스트(Dunnets' multiple comparison test)를 사용하여 각 처리에 대한 필드당 평균 감염세포를 대조 웰과 비교한다(하기참조)

Fll은 필드의 기입 번호를 표시함

바. 인체의 말초 혈액 임파구(HPBL)의 제조.

1. 피콜-하이페크(Ficoll-Hypaque)분리배지의 제조

1) 22.5g의 피콜(Ficoll)-400(약제, M.W.

400,000)을 200ml의 증류수에 용해한다. 피콜이 용액에 용해된 후 증류수로 250ml로 부피를 조절한다.

2) 34g의 하이페크(Hypaque) (소듐 디아트리조에이트, 멸균 유기물질, M.W.

636를 100ml증류수에 용해시킨다.

4) 10ml 하이페크 용액을 24ml피콜 용액과 혼합하여 실험 용액을 제조한다.

2. 전혈로 부터의 PBL의 분리

1) 헤파린화 20ml-베큐테이너 튜브로 정맥혈을 뽑아 인체의 전혈을 제공받는다. 무균 조작법으로 비희석 혈액의 15내지 20ml을 50ml의 멸균 폴리카르보데이트 원심 분리관에 동량의 피콜-하이페크 용매위로 조심스럽게 가한다.

2) 제조 샘플 40xg을 25℃에서 30분간 원심 분리한다. 접촉 부분의 희미한 백색 밴드를 무균적으로 50ml의 멸균원심 분리관으로 10-20ml의 RPMI-1640으로 흡인시킨다. 2세포를 25℃에서 일회 세척하고 10분간 400xg으로 원심분리시킨다.

3) 펠레트 PBL을 처음에 사용한 전혈 각 8ml에 대하여 1ml의 RPMI에 재현탁 시키고 코울터 카운터(Coulter counter)로 계산한다. 글루타민과 항생제가 보충된 RPMI-1640으로 농도를 조절한다. 그 세포를 사용할때까지 실온에서 유지시킨다.

사. PHA 및 LPS로써의 HPBL의 자주

1) 10내지 40ml의 전혈을 건강한 인체에서 헤파린화 튜브로 제공 받는다.

2) 피콜-하이페크 분리법을 사용하여 상기 전혈로 부터 임파구를 분리시킨다.

3) 피검 화합물의 여러 농도를 RPMI-1640중에서 제조한다.

4) 임파구 농도는 2×10⁶/RPMI-1640ml로 조절한다.

5) 임파구를 90분간 37℃에서 피검 화합물과 함께 항은 보조시킨다.

6) 양의 적혈구 세포(SRBS) (1내지 2주생)를 PBS로 3회 세척하고 0.5inj RPMI-1640의 최종 농도로 석한다.

7) 반응 튜브 임파구(2×10⁶)의 0.2ml, RPMI-1640중의 9% 피콜 0.2ml와 SRBS(RPMI-1640중의 0.5%)의 0.2ml를 포함시킨다.

8) 상기 반응물을 실온에서 5분간 200xg에서 원심 분리시킨다.

9) 침전물을 조심스럽게 재현탁시키고 10ℓ의 샘플을 헤모시토메터(hemocytometer)에 넣는다.

10) 현미경을 사용하여 로제테(菊座,rosette)의 수를 계산하는데 3이상의 부착 적색 세포를 갖는 임파구를 로제테로 계산한다.

아. E-로 제테 형성 세포

1. 미토겐의 제조

1) 리포폴리사카라이드 B 또는 피토헤모글루티닌 P분말을 칭량하여 1000㎍/ml(1mg/ml)의 농도로 RPMI-1640에 용해시켜 0.45μ 밀리포어 필터로 여과 살균시킨다.

2) 용액을 무균적으로 라벨된 멸균 크리오튜브(cryotube)에 부분 표본(1ml/튜브)하여 냉동시킨다. 샘플을 일부분 사용한후 재냉동시키지 않고 4℃에서 1내지 2일간 보관할 수 있다. 냉동 건조 분말을 4℃에서 냉장 보관한다.

2. 배양체의 제조

1) PBL을 글루타민과 항생 및 항진균성 용액(BIBCO)으로 보충한 혈청-유리 RPMI-1640에서 SOP #I-004로 제조한다. 96-웰 마이크로테스트 배양체 플레이트(코스타 플라스틱)의 각 웰에 8-채널 자동 마이크로 피페터로 0.1ml를 가한다.

2) 미토겐 용액을 급속히 녹여 RPMI-1640으로 4배 희석한다.

3) 피검 화합물을 SOP#C-002로 제조하여 RPMI-1640을 희석제로 4배로 희석한다.

4) 미토겐 및 또는 피검 화합물의 각 희석액 50㎕를 6리플리케이트 배양체에 가한다. 0.2ml/웰의 총부피당 대조 배양체에 동일양의 숙수한 RPMI-1640을 가한다.

5) 배양체를 37℃에서 95%공기, 5% CO₂대기(pH-6.0-7.0) 48시간 동안 항은 보존시킨다. 그 세포들을 18시간 동안 0.5μ Ci/웰 3H-TdR(티미딘)으로 라벨한다. 그 세포들을 중복의 자동 샘플 수거기(M.A.S.H)로 수거한다. 비흡착 세포를 0.9%염수 용액으로 유리 섬유 여과지 스트라이프 상에 흡인시키고(10개웰을 수세함) 세포들을 증류수로 증류수로 용해시킨다(20개 웰을 수세함). 그 스트라이프를 완전히 공기 전조시키고, 잔류 세포 점화물을 스트라이프에서 제거하고 각 샘플을 그 드람 유리 신틸레이숀(Scintillation)병에 넣는다. 신틸레이숀 액체 농도(신티프레프 1, Fisher Chemicals)를 신틸레이숀 품위의 톨루엔으로 1 : 50으로 희석하여 각 병에 1ml를 가한다. 액체 신틸레이숀 스펙트로스코피와 분당 각 피검그룹에 대한 평균 계산으로 나타내는 데이타에 의해 샘플을 측정한다.

자. 이유노플래크 분석

1. NPT 5392의 제조

1) 멸균 PBS에 예측량의 약제 분말을 가해 30분간 용액을 소니케이트하여 500㎍/ml NPT 15392용액을 제조한다.

2) GCA/맥퍼슨(Mcperson) 이중 비임 스페트로 포토메타의 파장을 250nm로 한다.

3) NPT 15392를 0.1N HCI로 1 : 10으로 희석한다.

4) 0.1N HCl의 15ml를 비이커에 가한다. 이 용액을 쿠베트를 헹구기 위해 사용한다. 양쪽의 쿠베트를 0.1N HCI로 채우고 파장을 읽는다. 흡수도는 0.001내지 0.005 이내이어야 한다.

5) 샘플 쿠베트를 비우고 희석된 약제 용액을 가한다.

6) 흡수도를 리록하고 농도를 하기식으로 계산한다 :

2. 면역 접종일 전

1) 500g의 NPT 15392를 1ml PBS에 용해하여 NPT 15392 약제 용액을 제조한다.

2) 그 농도를 이 SOP의 상기(A)에 따라 기록한다.

3) 상기용액을 1ml 샘플로 부분 표온하여 몇일간-20℃에서 보관한다.

4) 용액을 녹여 원하는 농도로 희석한다.

3. 아가로즈 베이스 플레이트

1) PBS중의 1.4% 현탁액의 아가로즈(7g/500ml)를 15분간 가압 살균한다.

2) 콘웰(Cornwell) 주사기를 사용하여, 용융된 아가로즈 3ml를 우균적으로 팔콘(Falcon) #1006페트리디쉬상에 분배시키고 평면 층을 이루도록 흔든다.

3) 상기 플래이트들을 사용전 4℃에서 1주일까지 보관할 수 있다. 이 플래이트를 뒤집어서 보관한다, (아가가 플래이트 상부에 오도록 뒤집음)

4. 기니아 피 2의 혈청 제조

1) 두마리 내지 여섯마리 기니아 피 2의 심장 천자로 10ml의 혈액을 취하여 항 응고제 없이 50ml의 팔콘#2070원심 분리관에 넣는다.

2) 원심 분리관을 45분간 37℃에서 응혈지도록 항온 보존한다.

3) 원심 분리관을 인큐베이터에서 꺼내어 30분간 얼음에 넣어 수축시킨다.

4) 그 혈청을 각 튜브에서 무균적으로 회수하여 1ml부분 표본으로 분배하고 사용할때까지 -70℃로 저장한다.

5. 면역, 제 0일

1) 쥐를 하기와 같이 면역 접종시킨다. 양의 혈액(sheep #23)을 하이랜드 랩스(Hyland Labs)로 부터 매주 공급 받는다. 양혈액을 1부피의 혈액당 2부피의 엘시비어(Alsevier)로 무균적으로 회수한다.

2) 엘시비어중 05ml의 양 혈액을 10분간 실온에서 2800rpm의 원심분리를 사용 멸균 PBS로 3회 세척한다

3) 그 펠레트를 멸균 PBS 중에 1 : 10으로 재현탁시킨다.

4) Z 코올터 카운터를 코울터 인스트럭션 메뉴얼이 따라 구경측정한다.

5) 10,000희석이 코울터 카운터 셀 계수에 필요하며, PBS중증 1 : 100희석액의 제조로 일단 제공되며, 이 용액을 이소톤에서 1 : 10으로 희석함으로써 1 : 10,000 희석이 제공된다.

6) 세포 수를 결정하고 그 시료 용액을 4×10⁷cell/ml로 희석한다. 이 최종 현탁액을 면역에 사용한다.

7) 각 쥐를 0.1ml SRBC 현탁액을 정맥 투여하여 접종시킨다. SRBC의 최종 농도는 각 쥐당 4×10⁶으로 한다.

6. 처 리

1) 쥐를 0, 1, 2, 3일에 복강내 투여로 처리한다. 주사기(1cc)에 1/2인치, 26게이지의 바늘을 고정시킨다. 오른쪽 백선에 45°각도로 주사를 놓는다. 0.2ml를 약처리 그룹과 대조 처리 그룹에 가한다.

2) 약 처리 그룹에는 20g 쥐당 5g/ml 농도의 NRT 13592 용액 0.2ml를 가한다.

7. 비장 제조. 제 4일

1) 비장을 무균적으로 박리시켜 각각 3ml MEM을 함유하는 펠콘 #2025조직 배양체 튜브에 놓는다. 그 튜브를 얼음에 보관한다.

2) G.K. Heller GT-21모터 제어기 세팅 #6에 연결된 G.K. Heller 변속 가역 모터에 부착된 테플론 막자로 비장을 상기 튜브에서 균질화 한다.

3) 균질화 시간과 작용은 샘플과 샘플간에 균일토록 한다.

4) 샘플을 100 메쉬 40미크론 스테인레스 스틸 스크린을 거쳐 표준 조직 배양 튜브로 여과시킨다. 스크린을 3ml의 MEM으로 헹구고 세포 현탁액을 얼음에서 보관한다.

5) 코울터 카운터 셀 계수를 위한 1 : 1000희석을 제조하기 위해 우선 PBS에서 1 : 100희석을, 이소톤에서 1 : 10희석을 제조한다.

6) 셀을 계수하고 모 현탁액을 1×10cell/ml로 희석한다. 코울터 카운터 시발점을 10으로 고정한다. 적세포(red cell)을 제프 이소톤(Zap isoton)의 3방울로 용해시킨다.

8. 톱 아가(Top agar) (0.7%)의 제조

1) 0.35g의 아가로즈와 0.53g의 MEM분말을 에를렌마이 에르플라스크(삼각 코르벤)에 넣는다. 증류수 50ml를 그 플라스크에 가한다.

2) 상기 용액을 15분간 122℃, 15psi에서 가압 살균한다. 이것을 45℃ 수조에서 5분간 유치한다. 그 pH를 중탄산 나트륨(0.1ml Na₂CO₂)를 가하여 약 7.2로 조절한다.

3) 1ml의 부분표본을 수조에 유치해 두었던 5ml의 조직 배양체 튜브에 분배한다. 플래이팅 에라에 대비하여 과의 튜브를 준비한다.

9. 10% SRBC 용액의 제조

1) 5ml의 양 혈액(면역에서 사용한 것과 동일한 공급혈액)을 IEC임상 표준 원심분리기, 스피드 #4(2800 rpm)을 사용하여 10분간 PBS로 3회 세척한다.

2) 3회 세척후, 셀 부피의 10배의 PBS부피 즉, SRBC 0.5ml에 PBS 5ml로 셀을 재현탁시킨다.

10. 플래이팅(Plating)

1) 아가 플래이트를 냉장고에서 꺼내 방치하여 실온으로 가온킨다. 각 실험 그룹당 트리플리케이트로 라벨한다.

2) 아가가 담긴 튜브를 수조에서 꺼낸다. 10% SRBC 0.1ml와 비장 셀 현탁액 0.1ml를 각 아가 튜브에 가한다. 그 튜브를 보르텍스 믹서에서 교반시킨다.

3) 튜브의 내용물을 즉시 아가 베이스 플래이트에 붓고 편명한 층이 형성될때까지 흔들어 준다.

4) 그 플래이트를 5% CO₂와 95% 공기로 90분간 37℃에서 항온 시킨다.

5) (D)에서 준비한 기니아 피 2혈청을 냉동기에서 꺼내 실온으로 녹이어 PBS에서 1 : 10으로 희석한다.

6) 플래이트들을 인큐베이터에서 꺼내고 1ml의 싱기 희석 혈청을 각 플래이트에 가한다.

7) 플래이트들을 30-45분간 37℃ 다시 항온 보존시킨다. 플래이들을 인큐베이터에서 꺼내 사광(斜光)을 사용하여 계수한다.

8) 플래이들을 4℃에서 뒤집어 보관하고 24시간후에 계수한다.

[작업 실시예에서의 치료법 요약]

본 발명의 목적 화합물은 표준 조직 배양법을 사용한 샘플의 RNA 비루스의 복제를 방해하는 것으로 입증되었다. RNA 비루스의 경우에는 헴흡착 법을 사용하여, A 서브(sub)-타입에 속하는 인플루엔자 비루스가 방해 받는 것이 증명되었다. NPT 15457과 NPT 15458의 몇가지가 3.6-360n몰/ml의 농도에서 인플루엔자 비루스의 복제를 방해하는 것으로 나타낸다. 다른 RNA 비루스가 표 6에 나타나 있고 상술된 질병에 감응한다. 전세계의 모든 질병중에 최소약 25%가 비루스에 의한것으로 알려져 있다. 또한 종양을 발생시키는 많은 비루스가 분리되었다. 그러므로, 항종양성 즉, 항 백혈병성을 가지는 항 비루스제가 요망된다. 비정상적 임파구생장의 방해제로서 상기의 항 비루스제 즉 NPT 15458의 작용이 결정되었다. 현저하게 NPT 15458은 조직 배양체에서 쥐의 백혈병 임파구(L-1210셀라인)의 증식을 저해할 수 있다. 10㎍/ml의 NPT 15458에 L-1210셀의 40%억제 효과가 성취되었다.

최종적으로, 표 3에 나타난 데이타는 정상 신체의 pH(7.2)에서 그 화합물들이 무수한 화학 안정성을 가지지만 알카리 pH에서 활성물질의 NPT 15392로 전환되는 것을 나타낸다. 표 9에 나타내는 바와같이, 에스테르, 특히 NPT 15458은 동물 조직과 항온시킴으로써 NPT 15392호 전환된다. 이는 아마도 목적화합물 즉 "예-약제"가 지정된 생물학적 활성을 가지기 때문이다. 또한 표 10에 나타낸 데이타는 NPT 15392 자체가 쥐에 투여될때 보다도 15458이 복강내 투여될때 최소 12배의 고 혈액 수준의 NPT 15392, 즉 생물학적 "활성" 물질이 생산된다는 것을 명백히 나타내고 또한 표 9에서와 같이 베로 셀(신장), 간, HPBL을 모두 "프로-호스트"를 생물학적 활성 NPT 15392로 전환시킨다.

본 발명의 목적화합물은 특히 비루스의 복제를 저해시키며, 면역 감응을 조절(증강 또는 저해)하며 백혈병 임파구의 생장을 억제한다. 0.01-100㎍/ml 범위의 농도에 걸쳐 활성을 나타내는 NPT 15392와 비교하여, 상기 화합물로 실시한 생체외 실험과 고 혈액 수준에 근거하여, 포유동물의 유효 투여분은 0.0005-50이다.

[제 형]

본 발명의 화합물은 1-1000mg/체중 kg의 투여분으로 포유동물에 공급될 수 있으며, 0.0005mg/kg과 같은 저 수준에서도 활성될 수 있다.

본 발명 화합물들은 정제나 캡슐형태로 인체와 동물에 투여될 수 있고 또한 수용성 시럽 또는 오일 중의 용액 또는 현탁액으로 투여될 수 있다. 일반적인 약제형은 하기와 같다.

캡슐 : NPT 15458 0.1-500mg

아비셀(Avicel) pH101 800mg으로 제조(마이크로크리스탈린 셀룰로오즈)

[현 탁 액]

수용성 현탁액은 활성 약제 물질과 많은 현탁제를 결합하여, 제조할 수 있다. 현탁제로서는 소듐 카르복시메틸셀룰로오즈, Na 알기네이트, 트라가칸트, 아비셀 RC-591(마이크로크리스탈린 셀룰로오즈), 메틸셀룰로오즈, 비굼, 산탄껌등의 물질이 있다.

현탁제외에 감미료, 향료, 착색제, 방부제, 보호 콜로이드제와 분산제 등의 물질이 첨가될 수 있다.

[시럽제형]

NPT 15458 0.05-250mg 알콜 U.S.P 0.08g

(또는 최대치의 용해도수준)

콘슈가 3.25g 글리세린 0.01g

증류수 0.25g 체리향 0.31225g

FO와 c Red 40 0.00175g 과일향 0.00825g

쇼듐 사카린 0.00520g 증류수 총 5ml가 되도록

정제 제형 부가함.

NPT 15458 0.1-500mg 마그네슘 스테아레이트 U.S.P. 5.5mg

아비셀 pH101 130mg 폴리비닐피롤리돈 22mg

전분(개량전분) 20mg 스테아르 산 U.S.P. 30mg

Claims

R²가 수소로 치환된 일반식(I)의 화합물을 카복실산 무수물, 카복실산할라이드, 알킬클로로포르메이트, 포스겐, 오르토-페닐렌 포스포클로리데이트, 질산, 아세트알데히드 또는 아세토브로모 슈가와 반응시킨다음, 가수분해하여 다음 일반식(I)의 화합물을 제조하는 방법.

위의 식에서,

R¹은 C₁-C₈알킬이며,

R²는 카복실산, 인산, 또는 질산의 에스테르그룹이거나, 글루코시드 또는 아세트알데히드 아세탈 결합이다.