NO155579B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive hypoxanttinderivater. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser med formelen

der R 2er estergruppen av eddiksyre eller hemiesteren av butandisyre.

Forbindelsene med formel (I) fremstilles ved

at man omsetter en forbindelse med formel (I) der R 2 er erstattet med et hydrogenatom, med et syreanhydrid, et syrehalogenid eller et annet reaktivt derivat som innfører gruppen R 2 for å oppnå forbindelsen med formel (I).

Det er velkjent at mange infeksjonskilder som virus (influensavirus), HSV (Friend leukemi virus), bakterier og sopp frembringer en tilstand med nedsatt immunitet hos verten, og dette svekker vertens forsvar mot en infeksjon

av nevnte infeksjonskilde. De fleste antivirale antimeta-bolitstoffer som AraC, frembringer en nedsettelse av vertens immunforsvarsmekanisme, hvorved man svekker kroppens eget

naturlige forsvar mot infeksjoner, hvorved man øker sjansen for en sekundær infeksjon.

En immunoforsterker eller iranunomodulator er

et stoff som enten opphever den nedsatte immunfunksjonen eller øker en normal immunfunksjon eller begge deler. En immunfunksjon er her definert som en utvikling og oppnåelse av en immunitetsmotstand som enten er styrt humoralt (anti-

stoff-styrt), cellulært (thymosyt-styrt) eller ved hjelp av makrofager eller granulocyter. Definisjonen innbefatter stoffer som enten virker direkte på de celler som inngår i oppåelsen; av immunreaksjon, eller på cellulære eller molekylære mekanismer som så igjen virker eller modifiserer funksjonen av de celler som inngår i immunreaksjonen. En økning av immunfunksjonen kan oppstå ved at et middel opphever de undertrykkende mekanismer som er avledet fra en negativ påvirkning enten denne skjer endogent eller ekso-gent i immunsystemet. Således har immunfor sterkere diverse virkninger eller mekanismer. Enten de nå virker på selve cellene eller ved hjelp av biokjemiske mekanismer, så vil resultatet alt vesentlig være det samme, nemlig at vertens resistens øker.

Anvendelse av immunofor sterkere.

1) Den prinsipielle beskyttende funksjon for et immunsystem angår motstand mot en invasjon av patogener, så som virus, ricettsia, mycoplasma, bakterier, sopp og para-sitter av alle typer. Således vil en bedring av immunreak- :o sjonen, spesielt når denne er nedsatt, gi en bedret resistens overfor infeksjon av de overnevnte patogener. En imnunfor-sterker alene eller i kombinasjon med anti-infektiv terapi kan anvendes overfor enhver infeksjonssykdom. 2) Enn annen beskyttende funksjon for immunsystemet angår motstand mot transplantering av fremmed vev, enten dette er naturlig såsom i en fostersituasjon, eller unaturlig slik det ses ved fysiske transplantasjoner. Immunforsterkere kan også brukes for å lette en forkastelse enten av foster eller morkakevev eller å modifisere eller indusere toleranse overfor transplantasjoner. 3) En tredje beskyttende funskjon for immunsystemet angår motstand mot en ondartet celleutvikling såsom kreft.

En imrnunforsterker kan således brukes ved kreftbehandling for å bedre sjansene for at svulsten skal forkastes og støtes ut, eller for å hemme at der igjen skapes svulster hvor disse

er fjernet etter andre former av terapi.

4.) En fjerde beskyttende funksjon innbefatter en evne-'til å gjenkjenne fremmedhet og opprettholde en ikke - reaktivitet overfor positive undertrykkende mekanismer.

I autoimmunologiske lidelser og tilsvarende sykdommer, så

vil en immunreaktivitet som virker på antigener fra selve kroppen, selvsagt være meget uheldig. Immunforsterkere kan brukes for å gjenskape normale undertrykningsmekanismer, indusere toleranse eller på annenmåte fremme en normal immunreaksjon .

Hver av de overnevnte beskyttende funksjoner fra et immunsystem kan modifiseres ved en ikke-spesifikk terapi ved hjelp av immunforsterkere alene, eller i kombinasjon med andre stoffer som brukes''for å bedre resistens eller for å ødelegge og drepe fremmede patogener. I tillegg kan spesifikk resistens bedres ved bruk av immunforsterkere sammen med visse former for antigener så som i vaksiner,

f. eks. ved hjelp av virus, svulstceller, etc. Disse kan brukes enten for å indusere spesifikk immunitet eller toleranse. Sistnevnte kan f. eks. eksemplifiseres ved at man bruker antigen ved behandling av allergi, eller autoimmunologiske lidelser. Bruken av immunforsterkere kan enten være terapeutiske eller profylaktisk, og sistnevnte er spesielt viktig hos eldre pasienter hvor infeksjon, autoimmunitet og kreft er mer vanlige lidelser. Doser og til-førselsveier er variable og kan være kritiske når det gjelder å bestemme hvorvidt man har fått en positiv eller negativ reaksjon. Et stoff som er i stand til å øke immunreaksjonen kan også hemme denne avhengig av tidspunkt og dose, og således vil man under visse omstendigheter bruke en immun-forsterker ,som et immun undertrykkende middel for bruk i allergi, autoimmunitet og ved transplanteringer.

Erythro-9-(2-hydroksy-3-nonyl)-hypoxantin ble prøvet under identifikasjonsnummer NPT 15 392 (omtalt i all-ment tilgjengelig norsk søknad 7 927 92) . Forbindelser som inngår i oppfinnelsen er erythro-9-(2-acetoksy-3-nonyl)-hypoxantin (identifisert som NPT 15458, se eksempel 1) og erythro-9-(2-succinoxy-3 -nonyl ) -hypoxantin (identifisert som NPT 154-57, se e ksempel 2).

NPT 15392 har tidligere vist seg å ha en anti-» iral imnunmodulerende og anti-svulst aktivitet.

I resultatet som er angitt her viser at (1)

nye derivater av NPT 15392 kan fremstilles som (2) omdannes i biologiske systemer til den aktive forbindelse (NPT 15392), (3) fører til høyere blodnivåer av den aktive forbindelsen (NPT 15392), hvorledes man øker virkningen av NPT 15392.

Den følgende tabell angir de kjemiske egenskaper for visse forbindelser ifølge oppfinnelsen.

Kjemiske egenskaper for representative

eksempler ifølge foreliggende oppfinnelse.

* HPLC- en enkelt UV-topp på en kolonne av 5um serosorb ODS 2,1 x 250 mm ved at man brukte som oppiøsningsmiddel 65 % metanol og 35 % 0, 5 M f^PO^. <*> Enkel. UV-topp på en kolonne av 5um ultrasphere ODS 4.6 x 250 mm, idet man som oppiøsningsmiddel brukte 56 % metanol og 35 % 0, 05 M H3P04.

Immunforsterkere ifølge foreliggende oppfinnelse kan f. eks. brukes for å bedre motstand mot de vira som er angitt i tabell A.

Forbindelsene er spesielt brukbare mot RNA virus-typene .

Forbindelser og sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes for behandling av pattedyr ( og celler fra pattedyr); så som mennesker, griser, hunder, katter, kveg, hester, suer, geiter, mus, kaniner, rotter, marsvin, hamstere, aper, etc.

Hvis intet annet er angitt er alle deler og prosentdeler på vektbasis.

Alle temperaturerer er i °C hvis intet annet er angitt.

Eksempel 1

Syntese av erythro-9-(2-acetoksy-3-nonyl)-hypoxantin (NPT 154-58) (" Acetyl -nonylhypoxantin" )

Erythro- 9-(2-hydroksy-3-nonyl)hypoxantin, NPT 15392 (2,78 g, 10 mmol) ble oppløst i 120 ml pyridin, hvoretter man tilsatte 3 ml (30 mmol) eddiksyreanhydrid. Oppløsning-en ble holdt på 25°C i 24 timer. 50 ml etanol ble tilsatt,

og oppløsningen ble fordampet til tørrhet i vakuum. Dette ble gjentatt 4 ganger for å eliminere pyridin. 150 ml eter ble tilsatt resten, 0g bunnfallet ble frafiltrert. Det ble så vasket med eter 3 ganger. Man fikk et hvitt, krystal-linsk stoff. (2,51 g, 80 %) smp. 150-151°C. UV ^.

(H20, pH 5, 5) 249 nm. Am 10,1 x 10<3>, IR 1700 cm^ (C=0).

Analyse for C.Æ N,0o: Beregnet: C,

16 2 4 L 3

59, 97, H, 7,55, N, 17, 48. Funnet: G, 59. 83, H, 7,42. N, 17.39.

Stigende kromatografi (Whatman papir nr, 1)

Rf verdi: n-butanol/HgO/AcOH (2:1:1) = 0,92,

Etanol/1 M ammoniumacetat (14:6) = 0,88,

i sopropanol/kons. ammoniakk/H20 (7:2:4) = 0.90.

Eksempel 2

Syntese av erythro-9-(2-succinoksy-3-nonyl) hypoxantin (succinyl-nonyl-hypoxantin) (NPT 15457)

600 mg erythro-9-(2-hydroksy-3-nonyl )-hypoxantin (NPT 15392) (2,2 mmol) og 1 gram ravsyreanhydrid (10 mmol) ble oppløst i et minimalt volum av pyridin under omrørin<g>. Oppløsningen ble oppvarmet forsiktig til ca. 30° under kontinuerlig omrøring i "10 døgn.

Pyridinet ble fjernet ved hjelp av en rotasjons-fordamper, og resten ekstrahert over i 20 ml absolutt etanol i løpet av 48 timer. Oppløsningen ble sentrifugert, og væsken renset ved preparativ tynnsjiktkromatografi (2 mm siliciumdioksyd gel 60, N-butanol: 2N NH^OH 10:2 v/v). Båndet med en en:.iRf på 0,17 ble eluert over i absolutt etanol. Renheten på produktet ble bedømt ut fra tynnsjiktkromatografi og UV-spektrofotometri.

Kjemisk stabilitet.

De data som er angitt i tabell 3 angir klart

at estrene NPT 15458 og NPT 15457 har stabilitet ved inkuberihg t ved 37°C og nøytral pH (7,0, fysiologisk verdi). Det faktum at basisk hydrolyse ved pH 9, 5 kan omdanne både acetyl-(NPT 15458) og succinyl-(NPT 15457) estrene til NPT 15392 er et ytterligere bevis på dets struktur.

3,5 timers inkubering ved 37°C, bestemt ved hjelp av HPLC.

Antivirale egenskaper.

NPT 15457 og NPT 15458 evne til å hemme influensavirusøkning ble målt 'ved å bruke en hemabsorpsjonsprøve. Det fremgår av tabell 4 at NPT 15458 forløperen som nesten fullstendig ble spaltet til en NPT 15392 (aktiv forbindelse), hadde samme evne til å hemme virusvekst som den aktive forbindelsen (NPT 15392). Det kan i virkeligheten se ut som om NPT 15458 er noe mer effektiv, noe som kanskje kan skyldes

en større absorpsjon av NPT 1545 8 intracellulært. Succinyl - derivatet som er negativt ladet ved pH 7,2, kan ikke forventes å trenge inn i cellen så lett, og vil følgelig være mindre effektiv i denne prøve.

ventet etter som NPT 15458 gir meget høye nivåer av NPT 15392 som er til en viss grad hemmende for IgM-dannelsen. De data som er angitt i tabell 8 viser den immunmodulerende aktivitet for NPT 15457 og NPT 15458. Det skal bemerkes at effekten av NPT 15457 er mindre enn den man har for NPT 154-58 og at mindre NPT 15457 blir omdannet til NPT 15392 enn NPT 15458 (tabell 10).

Tabell 6

Immunmodulerende egenskaper for succinoksy-nonyl-hypoxantin (NPT 154-57) og acetoksy-nonyl-hypoxantin (NPT 15458): for-bedring av mitogen-indusert lymfocyttproduksjon i humane perifere blodlymfocytter.

Metabolisk omdannelse.

Det fremgår av tabell 9 at inkubering av "forløpforbindelsen", NPT 154-57, og NPT 15458 med Veroceller (afrikanskGreen Monkey lever celler), leverhomogenat og humane perifere blodlymfocyter (HPBL) fører til dannelsen av den aktive forbindelsen NPT 15392. Det er større omdannelse av NPT 15458 til NPT 15392 enn for NPT 15457 til NPT 15392.

De angitte data i tabell 10 viser at både NPT 15457 og NPT 15458 kan absorberes i blodet etter en intraperitoneal tilførsel, og at en tilførsel av NPT 154-58 fører til en nesten 12 ganger høyere nivå av NPT 15392 enn hvis NPT 15392 tilføres som sådan. Dette viser klart at NPT 15458 og NPT 15457 kan gi en NPT 15392 in vivo, og at minst et av disse derivater gir et langt høyere nivå i blodet, noe som gir større aktivitet.

De følgende fremgangsmåter ble anvendt for å bestemme de egenskaper som er angitt ovenfor.

A. Celledyrkningsmetode

A. Hela eller Vero celleformering.

1. Cellekulturer i 120 cm 2 kolbe ble dyrket i monolag på følgende måte: 2. Media ble helt av, og monolaget ble vasket to ganger med ca. 5 0 ml pr. vaksegang av kalsium og mag - nesiumfritt fosfatbuffret saltoppløsning (PBS), ved en pH på 7,2. 3- En ml av trypsin-EDTA-oppløsning inneholdende 0, 5 g trypsin (1:250) og 2,0 g EDTA/liter av Hanks Balanserte saltoppløsning (HBSS) uten Ca + + og Mg<++>, ble tilsatt ved 37°C til hver kolbe og dispergert over monolaget ved hjelp av forsiktig risting. 4- Kolbene ble så plassert i en inkubator ved 37°C i ca. 3 til 5 minutter, avhengig av den tid det tok for å fjerne cellene. Det var nødvendig med risting med hånd. 5. 10 ml innplantingsmedium ble tilsatt pr. kolbe, og cellene ble dispergert ved at man sugde opp og sprøytet ut suspensjonen fra pipetten. Dette ble gjort 10 ganger. 6. Innholdet i en serie kolber ble så slått sammen, og cellene i suspensjonen fortynnet med utplantingsmedium til 7 til 8,5 x 10^ celler/ml. 7. Utplantingsmedium besto i alt vesentlig av følgende ingredienser: Minimums vesentlig medium Eagle (MEM) med Earl<»>s salter og HEPES buffer tilsatt følgende stoffer som angitt til 100 ml MEM: 10 ml kalvefosterserum (endelig konsentrasjon= 10 %)

1 ml 1-glutamin (200 molar)

1 ml 10.000 enheter penicillin, 10.000 ug

streptomycin og 10.000 neomycinblanding.

8. Cellene ble dyrket i Costar vevskulturtrau, bestående av 24- flate brønner hver med en kapasitet på 3 ml, og cellekultursuspensjonen på 1 ml ble tilsatt hver brønn. 9- Monolagene ble brukt for eksperimentering når de hadde en nesten utflytende vekst (ca. 1 til 2 døgn). 10. Separate kolber ble brukt for å opprettholde cellelinjene. Opprettholdelsesmediet besto av MEM samt (se trinn 7) FSC redusert til en sluttkonsentrasjon på 5 %.

B. Røde blodceller.

1. Fullblod ble tatt ut fra halspulsåren hos Hartly hanmarsvin.

2. Ca. 10 cm<3> av fullblodet ble blandet med

25 ml av Alsever's oppløsning, og kan lagres ved 4° opptil en uke. 3. Like før bruk ble nevnte RBC vasket 3 ganger med fosfatbuffret saltoppløsning (PBS), pH 7,2. 4.. Hver vasking ble utført ved at man sentrifugerte RBC-suspensjonen i 10 minutter ved 450 g ved romtemperatur. 5. En 0,4 % v/v RBC-suspensjon ble fremstilt ved hjelp av Hanks balanserte saltoppløsning.

C. Eggformering av virus.

A. Infe ksj on

1. Ni til ti dager gamle ferile kyllingeg_g_ ble gjennom-lyst og plasseringen av luftsekken ble markert på skallet med en blyant. Tvilsomme egg (mangel på bevegelse eller misfarging) ble kastet. 2. Skalloverflaten ble desinfisert med 70 % etanol og tørket. 3. Et lite hull ble sått gjennom skallet med en steril eggsyl, ca. 6 mm i diameter innenfor den angitte sirkelen som markerte eggsekken på hvert egg. 4. En tiendedels ml av forskjellige virussuspen-sjoner, 10 2 til 10 3 EID^/ml, ble inokulert gjennom hullet ved hjelp av en 1 cm<3> injeksjonssprøyte ved en vinkel på 45° inn i det allantoiske hulrom. Dette ble utgjort forsiktig slik at man ikke ødela hverken embryo eller selve egge-plommen ., 6. Stykker av gjennomsiktig tape ble brukt for å lukke egget, og hvert egg ble så merket med den virus som ble brukt, eggantallet og dato.

7. Eggene ble inkubert ved 35 til 37°C i fra 2 til

5 døgn avhengig av hvor raskt virusen vokste. Inkuberings-tiden og temperaturen ble nedtegnet sammen med andre data.

B. Innhøstning av de Allantoiske væsker.

1. Ved slutten av inkuberingsperioden ble eggene avkjølt i 3 til 4 timer til 4°C for å få så .lite blødning som mulig i det allantoiske hulrom under innhøstningen av virusene. 2. Skalloverflaten ble igjen desinfisert med 70 % etanol og tørket. 3. Sterile sakser ble brukt for å skjære vekk toppen av skallet langs den markerte linje, og membranet ble revet av med sterile pinsetter. 4. Pinsettene ble satt inn forsiktig mellom embryo og skallmembranet, og embryo skjøvet til side, hvor man fikk en "lomme" av allantoisk væske. Man passet hele tiden på å ikke gjennomhulle amiiion (bortsett fra de tilfeller hvor aminovæsken også skulle innhøstes), og for å få minimal avrivning av arteriene. 5. En steril engangs 10 ml pipette med en mekanisert vakuumkolbe ble brukt for å oppsamle den allantoiske væske og overføre denne til et sterilt engangssentrifugerør. Ca.

5 til 8 ml kan innhøstes fra hvert egg.

6. Det innhøstede materialet ble sentrifugert ved 1200 g i 10 minutter ved 4°C. Væskene fra hvert rør ble overført til sterile rør. 7. Prøve ble tatt ut fra hver prøve for titrering og sterilitetsundersøkelser. Den gjenværende suspensjon ble plassert i sterilg 2 cm 3 serumrør og merket med virus,

nummer og dato.

8. Porsjonene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og plassert ved -70°C i en ultradypfryser eller i en cryofryseboks med flytende nitrogen.

D. Virusformering i vev-kultur.

A. Infeksj on

1. 24- til 4-8 timers monolagkulturer av den angjeldende celletype, vanligvis i 250 cm 2 i engangsvevkulturkolbe ble valgt ut når de var nesten utflytende. 2. All infeksjon og innhøstning ble utført i et biologisk sterilt rom og bare pipettering ble brukt.

Steril teknikk ble observert.

3. 25 ml av et opprettholdelsesmedium ble brukt for å erstatte vekstsmediumet i kulturer som skulle in-fiseres. Kontroll kulturene mottok også 25 ml av dette medium. 4. Den infiserende virus ble fortynnet med serum-fritt MEM etter de opplysninger som var gitt av kilden for nevnte virus, eller fra titrer.ing fra tidligere gjennom-ganger, og 0,5 ml ble tilsatt hver kultur (bortsett fra kontrollene). 5. Kulturene ble inkubert ved 37°C i en fuktig atmosfære bestående av 5 % C02> og 95 % luft i fra 4-8 til 72 timer, og under daglig observasjon for utvikling av de karakteristiske cytopatiske effekter (CPE) for hvert virus.

B. Innhøstning.

1. Kulturene ble tatt ut for innhøstning når CPE nådde verdiene 3 til 4+ på følgende skala:

0 - Ingen tilsynelatende cytopatisk virkning,

1+ - 25 % av cellene viste cytopatiske virkning, 2+ - 50 % av cellene viser cytopatiske virkning, 3+ - 75 % av cellene viser cytopatiske virkning, 4+ - 100 % av cellene viser cytopatiske virkning,

2. Kulturene ble frosset og tint 3 ganger for å oppløse og fjerne cellelaget. Etter tredje opptining ble kulturvæsken overført til et sterilt engangssentrifugerør og sentrifugert ved 300 g i en halv time for å fjerne celle-rester. Denne virussu.spensjonen ble så undersøkt for bakterie-forurensning. 3. De overliggende ble umiddelbart plassert (0,5-1 ml) i 2 cm 3 sterile serumrør og frosset i flytende nitrogen. 4. For ti tre r ing av monolagkulturen, ble en 24-brønners, flatbunnede vevskulturplate fremstilt og infisert på følgende

måte:

a) Det ble utført en serie med ti-gangers fortynning av virus i kald 5% kalvefoster serum (FCS) medium (10 til 10"<7>). b) 1 ml av hver fortynning ble tilsatt de indi-viduelle brønner i 3 paraleller. c) Kontrollkulturer som inneholdt bare mediet var også inkludert. 5. Kulturene ble inkubert i 48 timer ved 37°C i fuktig 5% COg og 95 % luft, og cellelagene ble undersøkt som tidligere beskrevet. TCID^q titeringsverdien ble beregnet ved hjelp av Reed og Munch's titreringsmetode.

E. Hemabsorbsjonsprøve.

1. Like før man skulle utføre HAd prøvene ble mediet avhelt fra cellekulturtrauene. 2. 1 ml opprettholdelsesmedium ble tilsatt hver kulturbrønn. 3. To serier av kontrollkulturer mottok bare mediet. 4. Prøvekulturene og en av kontrollcellene ble umiddelbart inokulert med 0,1 ml av et fortynnet virus-preparat (selve titrerihg.skonsentrasjonen var spesifisert ifølge tidligere HAdFFU-prøver). HAdFFU er hemabsorbsjons-foci som danner enheter. 5. De andre kontroll serlene ble ikke infisert, og bare tilsatt MEM som en blank kontroll. 6. Kulturene ble inkubert ved 37°C ifra 16 til 18 timer hvis intet annet er angitt. 7. Etter inokuleringsperioden ble mediet helt av, og cellen vasket en gang med PBS ved pH 7,2. 8. 0,5 ml av RBC-suspensjonen ble tilsatt pr. brønn, og kulturene holdt i en halv time ved romtemperatur. 9. RBC-suspensjonen ble så helt av, og kulturene vasket to til tre ganger med PBS for å fjerne alt RBC som ikke var spesifikt bundet. 10. Til slutt tilsatte man 1,0 ml av Hanks balanserte 2. De preparerte prøvene ble sentrifugert ved 25°C, 4-00 x g i 30 minutter. Det uklare hvite båndet ved interfasen ble aseptisk tatt over i et 50 ml sterilt sentrifugerør med 10 til 20 ml RPMI-1640. Cellene ble vasket en gang ved 25°C, deretter sentrifugert 400 x g i 10 minutter ved 25°C. 3. Pelletert PBL ble resuspendert i 1 ml RPMI for hvert opprinnelige volum av 8 ml blod og målt på en Coulter-teller. Kon sentr asj onen ble juserte med RPMI-1640 supple-mentert med glutamin og antibiotika. Cellene ble holdt ved romtemperatur inntil de skulle brukes.

G. Stimulering av HPBL med PHA og LPS.

1. 10 til 40 ml fullblod Som ble tatt ut fra friske pasienter ble overført i hepariniserte rør.

2. Lymfocyttene ble skilt fra det overnevnte blod,

idet man brukte en Ficoll-hypaque-separasjonsteknikk.

3. Forskjellige konsentrasjoner av prøvef orbindel sen ble fremstilt i RPMI-1640. 4. Konsentrasjonen av lymfocytter ble justert i 2 x 10<6>/ml av RPMI-1640. 5. Lymfocyttene ble inkubert med prøveforbindelsen i 90 minutter ved 37°C. 6. Røde blodceller fra sau (SRBC.s) (en til to uker gammelt) ble vasket tre ganger med PBS og fortynnet under en sluttkonsentrasjon på 0,5 % injiserbar RPMI-1640. 7. Det ble fremstilt reaksjonsrør inneholdende følgende:

0,2 ml lymfocytter ( 2 x 106)

0,2 ml 9 % Ficoll i RPMI-I64O)

0,2 ml SRBC'2 (0,5 % i RPMI-1640)

8. De overnevnte reaktanter ble sentrifugert 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur. 9. Sedimentet ble forsiktig resusependert, og en

10 yl prøve ble plassert i et hemocytometer.

10. Antall rosetter ble så målt ved hjelp av et mikro-skop, og enhver lymfocytt som hadde mer enn 3 tilknyttede røde

celler, ble tellet som en rosett.

H. E-rosettdannede celler.

A. Fremstilling av mitogene.

I. Lipopolysaccarid B eller phytohemagglutamin P pulver ble veiet og oppløst i RPMI-1640 til en konsentrasjon på 1000<y>g/ml (1 mg/ml) og filtrert sterilt gjennom en 0,45 U milliporefilter. 2. Oppløsningen ble oppdelt i 1 ml/rør og plassert aseptisk i merkede sterile cryorør og deretter frosset. Prøvene ble ikke frosset om igjen etter delvis bruk, men kan lagres etter et døgn eller 2 ved 4°C. Det lyofiliserte pulver ble holdt avkjølt ved 4°C.

B. Fremstilling av kulturer.

1. PBL ble fremstilt som i SOP nr. 1 -004 i serum-fritt RPMI-1640, tilsatt glutamin og antibiotika-antimycotisk opp-løsning (GIBCO). En tiendedels ml pr. brønn ble tilsatt hver brønn i en mikroplate inneholdende 96 brønner (CoStar Plastics) med en 8-kanals automatisk mikropipettor (Flow-Lab) utstyrt med sterile tupper.

2. Mitogenoppløsningenble tint raskt, og fortynnet

4 ganger til den ønskede konsentrasjon med RPMI-1640.

3. Prøveforbindelsene ble fremstilte som pr. SOP nr. C-002, idet man brukte RPMI-1640 som fortynningsmiddel, og deretter fortynnet 4 ganger til den endelige og ønskede konsentrasjon.

4. 50 <y>l av hver fortynning av mitogen og/eller prøveforbindelsen ble tilsatt 6 paralelle kulturer. Vanlige RPMI-1640 ble brukt i samme mengder i kontrollkulturene til

et total-volum på 0,2 ml/brønn.

5. Kulturene ble inkubert ved 37°C i 95 % fuktig luft med 5 % C0„ (pH = 6,0 - 7,0) i 48 timer. Cellene ble så merket med 0,5 y Ci/brønn H-TdR (tymidin) i ytterligere 18 timer. Cellene ble så høstet ved hjelp av en automatisk multiple-prøve-innhøstning smaskin (M.A. S.H.). Ikke tilsettede celler ble sugd over på glassfiberfilter striper med 0,9 % saltoppløsning (10 vaskinger av hver brønn), og cellene ble oppløst med destillert vann (20 x i hver brønn). Stripene ble så tørket i luften, og gjenværende celle-avsetninger ble skåret vekk fra stripene og hver prøve ble plassert i scintillasjonsampuller. Scintillasjonsvæske-konsentrat (Scintiprep, 1, Fisher Chemicals) ble fortynnet til 1 : 50 med scintillasjonstoluen (Packard) og 1 ml tilsatt hver ampulle. Prøvene ble så bedømt ved hjelp av væskescintillasjons-spektroskopi, og data angitt som midlere tellinger pr. minutt pr. prøvegruppe.

I. Immunoplaqueprøve

A. Fremstilling av NPT15392

1. En oppløsning inneholdende 500 ug/ml NPT 15392 ble fremstilt ved å tilsette en forveiet mengde av den aktive forbindelse i form av et pulver til steril PBS og så lydbehandle oppløsningen i 30 minutter. 2. Bølgelengden på en GCA/McPherson dobbelt-stråle - spektrofotometer ble satt på 250 nm, 3. Nevnte NPT 15392 ble fortynnet 1:10 med 0,2 Normal HC1. 4.. 15 ml 0, 1 normal HC1 ble helt over i et beger. Denne oppløsningen ble brukt for å rense kuvettene. Begge kuvetter ble fylt med 0,1 normal HC1, og bølgelengden ble avlest. Absorbsjonen skulle være innenfor 0,001 til 0,005 fra 0-verdien. 5. Prøvekuvetten ble tømt og den fortynnede opp-løsningen^ av den aktive forbindelse ble tilsatt. 6. Absorbsjonen ble avlest og konsentrasjonen beregnet på føkgende måte: Formel: A ( absorbsjon) X forynningsfaktor X atomvekt (278) =

11.31 g/ml

B. Før dag 0

1. NPT 15392-oppløsningen ble fremstilt ved oppløst 500 ug NPT 15392 pr. ml PBS. 2. Konsentrasjonen ble kontrollert slik det er be-

skrevet ovenfor i avsnitt A.

3. Lageroppløsningen ble plassert i 1 ml prøve og lagret ved -20° i flere måneder. 4. Oppløsningen ble opptint og fortynnet til den forønskede konsentrasjon. C. Agarosebase- plater ble fremstilt på følgende måte: 1. En 1,4 % suspensjon av agarose i PBS (7 g i 500 ml) ble autoklavert i 15 minutter. 2. Idet man brukte en Cornwell-sprøyte ble 3 ml volumer av smeltet agarose aseptisk ført over i Falcon nr. 1006 petriskåler og fordelt til et jevnt lag.

3. Disse plater kan lagres opptil 1 uke ved 4°C

før bruk. Platene ble lagret i en oppned stilling (agar på toppen av platen).

D. Fremstilling av marsvinserum.

1. 10 ml blodprøve ble tatt ut ved gjennomhulling av hovedpulsåren fra 2 til 6 marsvin og plassert i 50 ml Falcon nr. 2070 sentrifugerør uten antikoagulerende midler. 2. Disse rørene ble inkubert i 45 minutter ved 37°C for klumpdannel se. 3. Rørene ble så tatt ut fra inkubatoren og puttet i is i 30 minutter for å skylle ut blodklumpene. 4. Serumet ble aseptisk helt av hvert rør, slått sammen, oppdelt i 1 ml porsjoner og lagret ved -70° inntil de skulle brukes.

E. Immunisering, dag 0

1. Mus ble immunisert på følgende måte: Saueblod

(sau nr. 23) ble mottatt hver uke fra Hyland Lab. Det ble aseptisk oppsamlet i to volumer og siden forent til et blodvolum. 2. 5 10 ml prøver av saueblod i Alsevier ble vasket 3 ganger i steril PBS i en IEC klinisk sentrifuge, som ble satt på nr. 4 (2800 o.pr.minutt) i 10 minutter ved romtemperatur.

3. Pelleten ble resuspendert i 1:10 i steril PBS.

4. En modell Z Coulter teller ble kalibrert i følge

Coulter instruksjonsbok.

5. En 1:10. 000 fortynning er nødvendig for å få en telling i nevnte apparat, og dette ble oppnådd ved først å utføre en 1:100 fortynning i PBS og så fortynne denne opp-løsningen i 1:10 i isotonisk saltoppløsning. Coulter-tellerens terskel ble jusert til en verdi nr. 5. 6. Celletallet ble bestemt og lageroppløsningenfortynnet til 4- x 10 celler/ml. Denne endelige suspensjon ble brukt for immunisering. 7. Hver mus ble immunisert ved en intravenøs injeksjon i den laterale hale venen (varmet i et varmebad på 50°C

for å få en vene-dilatering) med 0,1 ml SRBC-suspen sjon,

og den endelige konsentrasjon av SRBC var 4 x 10^ pr. mus.

F. Behandling

1. Mus ble behandlet ved en intraperitoneal injeksjon på dag 0, 1, 2 og 3- En sprøyte (1cm ) ble utstyrt med en 12,5 mm 26 gauge-nål. Nålen ble ført inn i en vinkel på 4-5° på den høyere siden av linea alba. Et volum på 0,2 ml ble gitt både til prøvedyrene og til kontrolldyrene. 2. Selve prøvedyrene ble gitt 0,2 ml av en for-ønsket konsentrasjon av NPT 15392-oppløsning, og for en mus på 20 g er dette 5 ug/ml.

G. Miltfremstilling, dag 4

1. Miltene ble fjernet aseptisk og plassert indi-viduelt i Falcon nr. 2025 vevskulturrør inneholdende 3 ml MEM. Rørene ble så lagret på is. 2. Nevnte milter ble homogenisert i samme rør ved hjelp av en teflonstav knyttet til en G,K, Heller variabel reversibel motor knyttet til en G.K. Heller 21 motor-kontroll-sett med stilling nr. 6. 3. Homogeniseringstider og virkning bør være ens-artet fra prøve til prøve. 4- Pr.øvene ble så filtrert gjennom en sikt av rustfritt stål på 100 mesh 40 ym og over i et standard-vevkulturrør. Sikten ble renset med 3 ml MEM og celle-suspensjonen lagret på is. 5. Det ble fremstilt en fortynning på 1:1000 for telling i Counter-telleren, og dette ble gjort først og fremst til en fortynning på 1:100 PBS fukt av en 1:10 fortynning i isotonisk oppløsning. 6. Celletallet ble oppnådd og lager suspensjonen ble fortynnet til 1x10 n celler/ml. Coulter-tellerens terskel ble satt på 10. Røde celler ble oppløst med 3 dråper Zap isotonisk oppløsning.

H. Fremstilling av top agar ( 0, 7 %)

I. 35 hundredelsgram av agarose og 0,53 g MEM pulver ble plassert i. en Erlenmeyer-kolbe. 50 ml destillert vann-ble så tilsatt kolben. 2. Oppløsningen ble autoklavert i 15 minutter ved 121° og 1,07 kg/ cm . Den ble sa plassert i et vannbad på 4-<5 >i 5 minutter. pH ble justert til ca, 7,2 ved tilsetning av natriumbikarbonat (0,1 ml Na2C0^). 3. 1 ml porsjoner ble tatt over i 5 ml vevskulturrør på forhånd plassert i vannbadet. Man må tilveiebringe flere ekstrarør for erstatning hvis det skulle utføres feil under utplatningen.

1. Fremstilling av 10 % SRBC- oppiøsning

1 . 5 m] prøver av saueblod (samme type blod som ble brukt under immuniseringen) ble vasket 3 ganger med PBS idet man brukte en IEC klinisk standard-sentrifuge, med hastighet satt på 4 (2800 opm.) i 10 minutter.

2. Etter tredje vaskingen ble cellene resuspendert

i en volum av PBS som var 10 ganger volumet av de pakkede cellene, dvs. 0,5 ml pakket SRBC i forhold til 5 ml PBS.

J. Utplating

Agarplater ble tatt ut fra kjøleskapet og oppvarmet til romtemperatur. De ble merket med 3 paraleller for hver eksperimentgruppe.

2. Agar-fylte rør ble tatt ut fra vannbadet, og en tiendedel av nevnte 10$ SRBC og 0,1 ml miltcellesuspen - sjon ble tilsatt hvert agarrør. Rørene, ble så rystet i en vortexblander. 3. Innholdet av rørene ble umiddelbart helt over i agarplater og dreiet inntil man fikk et glatt lag.

Platene ble så plassert på et horisontalt underlag inntil agaren stivnet. 4. Platene ble inkubert ved 37°C i en fuktig atmosfære bestående av 5 % karbondioksyd og 95 luft i 90 minutter. 5. Marsvinkomplement (se fremstilling i avsnitt D) ble tatt ut fra fryseren, tint ved romtemperatur, og fortynnet til 1: 10 i PBS. 6. Platene ble tatt ut fra inkubatoren og 1 ml fortynnet kompliment ble tilsatt hver plate. 7. Platene ble så inkubert ytterligere 30 til 45 minutter ved 37°C. De ble så tatt ut fra inkubatoren og tellet ved hjelp av skrått lys.

8. Platene kan lagres ved 4°C i oppned stilling,

og telles 24 timer senere.

Sammendrag av de terapeutiske anvendelser slik dette er angitt i arbeidseksemplene.

Forbindelser som fremstilles ifølqe foreliggende oppfinnelse har vist seg å hemme en replikasjon av representative prøver av RNA virus idet man har brukt standard-vevskulturteknikk.

I forbindelse med RNA-virus, så viste det seg at influensavirus som hørte til A-undergruppen ble hemmet ved hjelp av hemabsorpsjonsteknikk. Flere forbindelser fra seriene NPT 15457 og NPT 15458 viste seg å hemme replikasjon av influensavirus ved konsentrajoner som varierte fra 3,6 til 36O n mol/ml.

Andre typer virus av RNA klassen er vist i tabellene 6 og er ansvarlig for de sykdommer som der er angitt. Av alle de sykdommer som er beskrevet, antar man at mist 25 % forårsakes av virus. I tillegg til dette har man isolert en rekke typer virus som har vist seg å gi svulster. Således vil de antiviralemidlene som sådan ha en viss virksomhet mot

svulster og leukemi.

Det ble påvist at en av forbindelsene NPT

15458 hemmet veskten av unormale lymfocytter. Mer spe-

sielt kan angi.s at NPT 154-58 er i stand til å hemme for-meringen av musleukemiske lymfocytter (en L-1210 celle-

linje) i vevskultur. Man fikk en 40 % hemming av L-1210-cellene ved en konsentrasjon av NPT 15458 på 10 ug/ml.

Til slutt er det i tabell 3 angitt data som

viser at ved normal kropps-pH (7,2) så har forbindelsen en god kjemisk stabilitet, men spaltes til den aktive forbindelse NPT 15392 ved alkalisk pH. Som angitt i tabell 9,

så blir estrene, da spesielt NPT 15458 spaltet ved inkubering med animalt vev til NPT 15392. Dette antas å være årsaken til at de foreliggende forbindelser som er en forløper til 15392 har sin biologiske aktivitet.. I tillegg til dette er det i tabell 10 angitt data som viser at man får minst 12 ganger høyere ^blodkonsentrasjon av NPT 15392, den biologisk aktive forbindelse, når man injiserer NPT 15458 intra-peritonealt enn når man bruker NPT 15392 i seg selv. Videre kan det angis som vist i tabell 9 at Veroceller (lever),

og HPBL alle spalter foriøperforbindelsene til den biologisk aktive forbindelsen NPT 15392.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse hemmer mer spesifikt replikasjon eller omformering av virus, modulerer,(forsterker eller hemmer) immunreaksjonen og hemmer veksten av leukemiske lymfocytter. Basert på in-vitro-eksperimenter og de høyere blodnivåer som ble opp-

nådd med disse forbindelser sammenlignet med NPT 15392,

som viser en aktivitet innenfor et konsentrasjonsområde fra 0,01 til 100 ug/ml, så vil forventede doseomr&der være effektive i pattedyr fra 0,0005 - 50 mg/kg kroppsvekt.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser med formelen der R 2 er estergruppen av eddiksyre eller hemiesteren av butandisyre, karakterisert ved at man omsetter en forbindelse med formel (I) der R 2 er erstattet med et hydrogenatom, med et syreanhydrid, et syrehalogenid eller et annet reaktivt derivat som innfører gruppen R 2 for å oppnå forbindelsen med formel (I).