Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych hydroksyalkilopuryn. Zwiazki te sa immunomodulatorami, wykazuja aktywnosc prze- ciwwirusowa i przeciwnowotworowa, w szczegól¬ nosci przeciwbialaczkowa oraz sa inhibitorami en- 5 zymów. Zwiazków tych mozna równiez uzyc do wprowadzania odpowiedniego alkoholu do uklada biologicznego, w niektórych przypadkach ze wzro¬ stem sily dzialania.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie nowe 10 zwiazki o wzorze 1, w którym R1 oznacza grupe Irz. heksylowa, zas R2 oznacza grupe formyIowa, acetylowa, propionylowa, butyrylowa, sukcynylowa, N-karbobenzoksy-glicylowa, N-karbobenzoksy-ala- nylowa lub reszte o-hydroksyfenylo-fosforanowa. lf Kwasowa czesc grupy estrowej R2 moze stanowic np. ugrupowanie niepodstawionych alifatycznych kwasów jednokarboksylowych, takich jak kwasy o i^ atomach wegla, np. kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propionowy, kwas maslowy ugrupo- M wanie nie podstawionego alifatycznego kwasu dwu- karboksylowego, takiego jak kwas bursztynowy.W przypadku kwasów dwukarboksylowych mozliwe Jest utworzenie pólestrów takich jak hemiburszty- nian. 25 Ugrupowanie kwasu aminoalkanokarboksylowego, takiego jak glicyna, alanina, przy czym wprowadza sie je po uprzednim zabezpieczeniu grupy amino¬ wej, ugrupowanie kwasu nieorganicznego, które mozna wprowadzac takze w zwykly sposób, np. ^ stosujac chlorofosforyn o-fenylenu, z otrzymaniem o-hydroksyfenylo-fosforanów.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze zwiazek o wzorze 4, w którym R1 ma wyzej okres¬ lone znaczenie poddaje sie reakcji z bezwodnikiem lub halogenkiem wlasciwego kwasu karboksylowe- go, chlorofosferynem o-hydroksyfenylu lub z od¬ powiednim aminokwasem z zabezpieczona grupa aminowa. Jest ustalonym faktem, ze wiele czynni¬ ków zakaznych, takich jak wirusy, np. wirus gry¬ py, wirus opryszczki pospolitej (HSV), wirus bia¬ laczki Frienda, bakterie i grzyby, powoduje u gos¬ podarza stan immunosupresji, oslabiajac jego obro¬ ne przeciw zakazeniu tymi czynnikami. Z drugiej strony, wiekszosc antymetabolitów o dzialaniu prze- ciwwirusowym, takich jak Arac, powoduje u gos¬ podarza supresje immunologicznego mechanizmu obrony, wykazujac przez to wlasciwosc polegajaca na oslabieniu wlasnego mechanizmu obronnego or¬ ganizmu i zwiekszajac nasilenie zakazen wtórnych.Immunopotencjatorem lub immunomodulatorem jest jakikolwiek czynnik, który albo przywraca oslabiona funkcje immunologiczna, albo wzmaga normalna funkcje immunologiczna albo wykazuje oba te dzialania. Funkcje immunologiczna definiuje sie jako rozwój i ekspresje odpornosci humoralnej (dzialanie przeciwcial), odpornosci komórkowej (dzialanie tymocytów) lub odpornosci nieswoistej (dzialanie makrofagów i granulocytów). Beda to czynniki dzialajace bezposrednio na komórki czyn- 129 094i»994 ne w ekspresji odpowiedzi immunologicznej, wzgled¬ nie na mechanizmy komórkowe lub molekularne, które, z kolei, dzialaja modyfikujaco na funkcje komórek czynnych w odpowiedzi immunologicznej.Wzmozenie funkcji immunologicznej moze wynikac z dzialania czynnika znoszacego mechanizm supre- sji zalezny od ujemnego sprzezenia zwrotnego mie¬ dzy ukladem immunologicznym a wplywami we¬ wnetrznymi lub zewnetrznymi. Tak wiec immuno- potencjatory wykazuja róznorodny mechanizm dzia¬ lania. Niezaleznie od róznorodnosci miejsc dziala¬ nia na komórki i biochemicznego mechanizmu dzia¬ lania immunopotencjatorów ich zastosowania sa potencjalnie te same, to jest polegaja na wzmaga¬ niu swoistej i nieswoistej odpornosci gospodarza. 1. Zasadnicza funkcja ochronna ukladu immuno¬ logicznego jest obrona przed inwazja patogenów, takich jak wirusy, riketsje, Mycoplasma, bakterie, grzyby i ©asozyty wszelkiego rodzaju. Tak wiec, wzmaganie odpowiedzi immunologicznej, w szcze¬ gólnosci gdy jest ona oslabiona, daje liczace sie polepszenie obrony przed zakazeniem (lub zakaze¬ niem pasozytami) przez te patogeny. Immunopoten- cjator jako czynnik samodzielny, lub w polaczeniu z leczeniem przeciwzakaznym, mozna stosowac w przypadku jakiejkolwiek choroby zakaznej i wszy¬ stkich chorób tego rodzaju. 2. Druga funkcja ochronna ukladu immunologicz¬ nego jest obrona przed przeszczepieniem obcych tkanek, albo w sposób naturalny, jak w przypadku zaleznosci plód—matka, albo w sposób nienaturalny, jak przeszczepienie przeprowadzane przez lekarza transplantologa. Immunopotencjatorów mozna rów¬ niez uzyc do ulatwienia odrzucenia plodu lub tkan¬ ki lozyskowej, wzglednie indukowania lub modyfi¬ kowania tolerancji na przeszczepy. 3. Trzecia funkcja ochronna ukladu immunolo¬ gicznego jest obrona przed rozwojem komórek zlos¬ liwych w postaci nowotworu. Immunopotencjatorów mozna uzywac w leczeniu nowotworów w celu wzmozenia zdolnosci do odrzucenia nowotworu, oraz w celu hamowania nawrotów nowotworu po leczeniu w inny sposób. 4. Czwarta funkcja ochronna ukladu immunolo¬ gicznego jest rozpoznawanie antygenów obcych i utrzymywanie niereaktywnosci na antygeny wlas¬ ne przez pozytywne mechanizmy supresorowe. W autoimmunologicznych i pokrewnych zaburzeniach wystepuje reaktywnosc immunologiczna przeciw wlasnym lub zdegenerowanym antygenom, przy czym zwiekszona odpowiedz jest samodestruktyw- na. Immunopotencjatorów mozna równiez uzyc do przywrócenia normalnego mechanizmu supresoro- wego, indukcji tolerancji lub w inny sposób sprzy¬ jania normalnej odpowiedzi immunologicznej.Kazda z ochronnych funkcji ukladu immunolo¬ gicznego mozna modyfikowac przez nieswoiste le¬ czenie immunopotencjatorami jako lekami samo¬ dzielnymi, lub w polaczeniu z innymi czynnikami stosowanymi do zwiekszenia obrony lub do zabicia 5 inwazyjnego patogenu. W dodatku swoista odpor¬ nosc mozna zwiekszyc przez uzycie immunopoten¬ cjatorów w polaczeniu z pewnymi postaciami an¬ tygenów, takimi jak stosowane w szczepionkach, np. wirusami, komórkami nowotworowymi itp. Ten 10 sposób uzycia moze indukowac zarówno swoista odpornosc jak i tolerancje. Przykladem tej ostatniej moze byc uzycie lacznie z antygenem w alergii lub chorobach autoimmunologicznych. Uzycie imrmrao*- potencjatorów moze byc zarówno lecznicze jak i pro- filaktyczne, to ostatnie zwlaszcza przy starzeni^ sie, gdy czesciej spotykane sa zakazenia, procesy auto- immunologiczne i nowotwory. Czestotliwosc poda-; wania oraz drogi podawania sa rózne i moga byc decydujace w otrzymywaniu odpowiedzi ppzytyw- ^ nej lub negatywnej. Jakikolwiek czynnik zwieksza¬ jacy odpowiedz immunologiczna moze ja hamowac w zaleznosci od czestotliwosci podawania oraz daw¬ ki, tak wiec w okreslonych okolicznosciach immu- nopotencjatora mozna uzyc jako czynnika immuno- fc supresyjnego w alergii, chorobach autoimmunolo- gicznych i przy transplantacji.Macierzystym alkoholem, w którego wzorze R1 oznacza heksyl, jest erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo) hipoksantyna. Byla ona badana pod numerem iden- tyfikacyjnym NPT 15 392. Wsród zwiazków otrzy¬ manych sposobem wedlug wynalazku znajduja sie erytro-9-{2-acetoksy-3-nonylo) hipoksantyna (ziden¬ tyfikowana jako NPT 15 458, patrz przyklad I), erytro-9-(2-sukcynoksy-3-nonylo) hipoksantyna (zi- dentyfikowana jako NPT 15 457, potrz przyklad II) i erytro-9-(2-fosfo-3-nonylo) hipoksantyna.Do innych zwiazków otrzymanych sposobem we¬ dlug wynalazku naleza takie zwiazki, jak zamiesz¬ czone w ponizszej tablicy 1, we wszystkich przy¬ padkach, grupa alkilowa o symoblu R1 oznacza grupe Irz. heksylowa.NPT 15 392, jak to uprzednio przedstawiono, wy¬ kazuje aktywnosc przeciwwirusowa, immunomodu- lujaca i przeciwnowotworowa. Wyniki przedsta¬ wione w niniejszym opisie wykazuja, ze: 1) mozna wytworzyc nowe pochodne NPT 15 392, które, 2) moga byc w ukladach biologicznych przeksztalcone do zwiazku czynnego (NPT 15 392), 3) daja wyzszy poziom zwiazku aktywnego we krwi (NPT 15 392), a przez to zwiekszaja sile dzialania NPT 15 392. 50 Nastepujaca tabela 2 podsumowuje wlasciwosci fizyko-chemiczne niektórych nowych zwiazków otrzymywanych sposobem wedllug wynalazku* 4512?)034 ? S « Tabela 1 Symbol zwiazku NPT 15458 NPT 15477 NPT 15483 NPT 15467 NPT 15457 R* C6H13 C6H13 C6H13 CeH13 CeH13 ^6H13 CeH13 C6H13 R** O CH3 — C — ' 0 II CH3 CH20 — O II CH3 CH2 CH2O —- O II H — C — O II HOOC (CH2)2 C — B O ^n2 (NH) C — B O 1 II CH3 CH (NH) C — 1 ° 0—HOC6H5—O—P (—OH) 0— Stala fizyko-chemiczna 1 temp. topn. 150—151°C temp. topn. 122—124°C temp. topn. 168—169°C temp. topn. 219—220°C Rf = 0,17 temp. topn. 137—140°C | temp. topn. 177—180°C temp. topn. 201—203°C * temp. topn. — oznacza temperature topnienia ** B — oznacza grupe N-kajrbobenzyloksylowa Tabela 2 Fizyko-chemiczne wlasciwosci reprezentatywnych przykladów zwiazków o worze 1 Nu¬ mer 1 kol. 1 1 2 Nazwa zwiazku 2 Erytro-9-(2-acetoksy-3- -nonylo)-hipoksantyna (NPT 15 458)* Erytro-9-(2-sukcynoksy- -3-nonylo)-hipoksantyna (NPT 15 457) ** Tempera¬ tura top¬ nienia 3 150— —151°C Analiza elementarna Obli¬ czono 4 C 59,97 H 7,55 N 17,48 Znale¬ ziono 5 59,83 7,42 17,39 Xmax/AmX108 pH 1,0 6 250/9,7 250/— pH 7 7 249.5/10.] 249/— pH 9,5 8 25^/10.06 254/ X min pH 1 9 220 222 pH 7 10 | 222,5 223 * Wysokowydajna chromatografia cieczowa (HPLC), pojedyn czy szczyt Uv z kolumny 2,1X250 mm wypelnionej prepara¬ tem Spherosoirb ODS o wielkosci czastek 5|i, z uzyciem mieszaniny metanol: 0,05 M HjP04 65V# : 35*/# f* .Bojadynezy szczyt z kolumny 4,6 X 250 min wypelnionej preparatem Ultraspheire ODS o wielkosci czastek 5 |i, z uzy¬ ciem mieszaniny metanol: 0,05 M H.FO. 65«/t : 35*/t.Immunopotencjatory otrzymane sposobem wedlug nienia obrony przed zakazeniem wirusami wymie- wynalazku mozna zastosowac mp. w celu zapew- nionymi w tabeli 3.129 094 Tabela 3 Wirus Wirus arena Wirus grypy Rinowirus Wirus polio Wirus rózyczki Wirus choroby Newcastle Ratawirus Wirus zapalenia watroby typu A Wirus wscieklizny Wirus arbo Krowianka Wirus opryszczki pospolitej Wirus ospy wietrznej — pólpasca Wirus ospy wietrznej — pólpasca Adenowirus Wirus zapalenia watroby typu B Wirus choroby pyska i racic Wirus Machupo Klasa RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA Choroba Goraczka Doliny Rift Grypa Przeziebienie Zapalenie przednich rogów rdzenia kregowego Rózyczka Choroba Newcastle Zapalenie zoladka i jelit u niemowlat Zapalenie watroby typu A Wscieklizna Zapalenie mózgu Ospa Opryszczka wargowa — zapalenie mózgu, apryszczka narzadów plciowych Pólpasiec Ospa wietrzna Zakazenie dróg oddechowych Zapalenie watroby typu B Choroba pyska i racic Goraczka krwotoczna Wlasciwosci przeciwwirusowe. Zdolnosc zwiaz¬ ków o wzorze 1 do hamowania namnazania sie wirusa grypy mierzy sie za pomoca odczynu he- madsorpcji. Jak to mozna stwierdzic na podstawie danych zamieszczonych w ponizszej tabeli 5, pro¬ cek NPT 15 458, który jest prawie calkowicie roz¬ szczepiony do NPT 15 392 (aktywny lek), wykazuje zdolnosc do hamowania wzrostu wirusa podobna do zdolnosci wykazywanej przez aktywny lek (NPT 15 392). W rzeczywistosci okazuje sie, ze jesli NPT 15 458 moze byc nieznacznie bardziej sku¬ teczny, to jest prawdqpodobnie zalezne od wiekszej absorpcji sródkomórkowej NPT 15 458. Co do po¬ chodnej sukcynylowej, ujemnie naladowanej w pH 7,2, nie powinno sie oczekiwac latwego pochla¬ niania jej przez komórki i moglaby ona byc mniej skuteczna w tym odczynie.Tabela 5 Porównanie wlasciwosci przeciwwirusowych suk- cyiaoksynonylohipoksantyny (NPT 15 457) i aceto- ksynonylohipoksantyny (NPT 15 458) z wlasciwos¬ ciami przeciwwirusowymi NPT 15 392 30 35 40 Zwiazek nr MPT 15 392 (kontrola) NPT 15 457 NPT 15 458 % zahamowania wzrostu wirusa grypy przy podanych stezeniach 0 0 0 0 0,36* 20 18 26 3,6* 30 0 40 | 10,8* 42 18 80 1 36* 73 13 88 50 55 60 • Stezenie w nanomolach/ml Aktywnosc immunomodulacyjna. Zdolnosc bada¬ nych zwiazków do modulowania aktywnosci ukladu immunologicznego, zarówno in vitro jak i in vivo, mierzy sie uzywajac nastepujacych ukladów: 1. Proliferacja limfocytów indukowana mitogenem, z uzyciem mysich komórek sledziony (in vitro) 2. Proliferacja limfocytów indukowana mitogenem, z uzyciem ludzkich limfocytów krwi obwodowej (HPBL) (in vitro) 3. Wzmozenie aktywnego tworzenia rozetek (in vitro) 4. Wzmozenie tworzenia przeciwciala IgM u myszy uodpornionych krwinkami czerwonymi barana (SRBC) (in vivo). 1. Dane zamieszczone w tabeli 6 jasno wykazuja zdolnosc NPT 15 458 do wzmagania proliferacji limfocytów indukowanej fitohemaglutynina (PHA) z pomiarem przez inkorporacje trytowanej tymidy- ny. W obecnosci NPT 15 438 w stezeniu 50 u.g/kg obserwuje sie okolo 25% wzrost. Podobny wzrost obserwuje sie w obecnosci NPT 15 392 w stezeniu 10 ng/iml. 2. Dane zamieszczone w tablicy 7 jasno wykazu¬ ja, ze równomolowe stezenia NPT 15 457 i NPT 15 458 sa skuteczne we wzmaganiu proliferencji limfocytów indukowanej PHA z uzyciem HPBL.Jest to interesujace w swietle danych zamieszczo¬ nych w ponizszej tabeli 10, które wskazuja na to, ze HPBL rozszczepiaja obydwa estry do NPT 15 392.NPT 15 458, który ulega rozszczepieniu w wyzszym stopniu niz NPT 15 457 (patrz tabela 10) jest bar¬ dziej skutecznym immunopotencjatorem (ponizsza tabela 7: 1,48 w stosunku do 1,28) transformacji limfocytów indukowanej PHA. 3. Jak mozna zauwazyc w ponizszej tabeli 8, za¬ równo NPT 15 457 i NPT 15 458 sa skuteczne w modulowaniu aktywnego tworzenia rozetek przy uzyciu HPBL. Interesujace jest to, ze w ekspery¬ mencie nr 1, w którym uzywa sie limfocytów po-129 094 10 traktowanych placebo, przy bardzo niskim pozio¬ mie aktywnie tworzonych rozetek (immunodeficyt) NPT 15 457 i NPT 15 458 sa tak aktywne jak NPT 15 392 w przywracaniu obnizonej odpornosci do po¬ ziomu normalnego. W eksperymencie nr 2 limfocyty potraktowane placebo daja nienormalnie wysokie wartosci dotyczace aktywnie tworzonych rozetek.W tym przypadku NPT 15 392 i NPT 15 458 sa zdolne do obnizenia wysokiego poziomu normalnych wartosci, co wskazuja rzeczywiste immunomodula- cyjne wlasciwosci tych leków. 4. NPT 15 457 i NPT 15 458 oraz aktywny lek NPT 15 392 podaje sie myszom Balto/c uodpornio¬ nym krwinkami czerwonymi barana (SRBC). Mie¬ rzy sie wytwarzanie przeciwcial przeciw SRBC.Interesujaca jest obserwacja, ze NPT 15 458 i NPT 15 392 sa bardzo skuteczne w modulowaniu wy¬ twarzania przeciwcial IgM. NPT 15 392, na bada¬ nym poziomie, wywoluje 46% zwiekszenie wytwa¬ rzania IgM. Wyzsze dawki NPT 15 392 wywoluja mniejszy wzrost lub obnizenie w stosunku do war- 10 15 20 tosci kontrolnych. Interesujaca jest obserwacja, ze NPT 15 458, który przetwarzany jest do NPT 15 392 i daje co najmniej 10 razy wyzszy poziom NPT 15 392 we krwi (tabela 11) powoduje zahamowanie two¬ rzenia IgM (tabela 9). Mozna tego oczekiwac, po¬ niewaz NPT 15 458 daje bardzo wysoki poziom NPT 15 392, który najprawdopodobniej hamuje tworzenie sie IgM. Dane przedstawione w tabeli 9 wykazuja immunomodulacyjna aktywnosc NPT 15 457 i NPT 15 458. Nalezy zauwazyc, ze wplyw NPT 15 457 jest mniejszy niz wplyw NPT 15 458 i ze mniej NPT 15 457 ulega przeksztalceniu do NPT 15 392 anizeli NPT 15 458 (tatela 11).W tabeli 9a przedstawiono dane ilustrujace im- munoregulacyjne dzialanie innych zwiazków o wzo¬ rze 1, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku.Z tabeli tej wynika, ze zwiazek 15 477 dziala jako immunostymulator, intensywniej dzialajacy niz wolny alkohol NPT 15 392 w tej samej dawce, pod¬ czas gdy zwiazki NPT 15 467, NPT 15 458 oraz NPT 15 483 sa immunoinhibitorami.Tabela 6 Immunomodulacyjne wlasciwosci acetoksynonylohipok santyny (NPT 15 458): stymulacja in vitro proliferacji limfocytów mysich indukowanej mitogenem z uzyciem mysich komórek sledziony Zwiazek nr O NPT 15 392 NPT 15 458 NPT 15 458 Stezenie (ng/ml) 10 ng/ml 10 ng/ml 50 ng/ml Sym¬ bol (C) (D) (D) (D) Wlaczenie (cyTd/min.) —PHA +PHA 137 64,647 117 68,804 153 66,800 138 81,297 S.I.* 471 588 436 589 Stosu¬ nek S.I.D/C 1,25 0,93 1,25 • S. I. — iffideks stymulacji Tabela 7 Immunomodulacyjne wlasciwosci sukcynoksynonylohipoksantyny (NPT 15 457) i acetoksynonylohipoksantyny (Nrf 15 458); wzmozenie proliferencji limfocytów indukowanej mitogenem z uzyciem ludzkich limfocytów krwi obwodowej Zwiazek ., nr NPT 15 392* NPT 15 457 NPT 15 458 Stezenie (n .mole/ml) 0 0,036 0.36 3,6 0 0,036 0,36 3,6 0 0,036 0,36 3,6 Symbol (C) (D) (D) (D) (C) (D) (D) (D) (C) TD) (D) (D) Wlaczenie (cykl/min.) —PHA 379 297 577 381 277 240 228 232 277 214 , 221 238 —PHA 59,404 • .59,167 69,057 67,328 54,015 59,569 59,689 52,149 54,015 59,898 63,858 69,055 S.I.** 156 199 120 176 195 250 261 224 195 280 *** 289*** 290 *** Stosu- 1 nek SJ. I D/C — 1 1,27 0,76 1 1,128 1 — 1 1,28 1 1,33 1 1,14 1 — 1 1,43 1 1,48 1 1,48 1 • wartoóci sa srednia z ttzecti eksperymentów •• S. I. — indeks stymulacji •** P<0,05 ~129 094 U 13 Tabela 8 lOTaunomodulacyine wlasciwosci acetoksynonylohipoksantyny (NPT 15 458) i sukcynoksynonylohipoksantyny (NPT 15 457): wzmozenie aktywnego tworzenia rozetek E Zwiazek nr Placebo (kontrola) NPT 15 392 (kontrola) NPT 15 457 NPT 15 458 Stezenie (n mole/ml) (0) (3,6) (0,36) §-! (3,6) (0,36) % aktywnie tworzonych rozetek K | (x±S.E.) 1 próba nr 1 9,23 ± 2,9 16,2 ± 1,0 24,8 ± 6 * 19,4 ±1,0* próba nr 2 [ 34,2 ±6,6 15,4 ± 2,9 a 1 33,6 ± 2,4 1 23^5 ±1,24 a | • p < 0,06 w stosunLtaii do prób kontralmycli zawierajacych placebo Tabela 9 Immunomodulacyjne wlasciwosci acetoksynonylohipoksantyny (NPT 15 458) i sukcynoksynonylohipoksantyny (NPT 15 457): zahamowanie tworzenia przeciwciala IgM u myszy BALB/C uodpornionych SRBC Eksp. ! nr l 2 1 2 1 1 2 I 1 1 2 Zwiazek nr NPT 15 392 NPT 15 392 NPT 15 457 NPT 15 457 NPT 15 458 NPT 15 458 Kontrola Kontrola Dawka dootrzewnowa 1,80 n mola/kg X 4 0,18 n mola/kg X 4 1,8 n mola/kg X 4 0,18 n mola/kg X 4 1,8 n mola/kg X 4 0,18 n mola/g X 4 placebo X 4 placebo X 4 Ilosc lysinek x ± S.E. 41 ±4 68 ±2 19 ±3 47 ±3 8±1 11 ±1 28 ±2 46 ±2 % wartosci kontrolnych | 146 * 147 * 68* 102 • 28,5 * 23,9 * 100 100 • PC Dane umieszczone w tabeli 11 wykazuja, ze zwiazki badane moga byc absorbowane do krwi po podaniu dootrzewnowym i ze podanie dootrzewnowe NPT 15 458 prowadzi do prawie 12nkrotnie wyz- 50 szego poziomu NPT 15 392, anizeli w przypadku podania NPT 15 392. Dowodzi to w sposób wyraz¬ ny, ze NPT 15 458 i NPT 15 457 moga in vivo two¬ rzyc NPT 15 392 oraz, ze co najmniej jedna z tych pochodnych daje znacznie wyzszy poziom we krwi, 55 co nadaje wyzsza aktywnosc.Przeksztalcenie metaboliczne. Jak to mozna stwierdzic na podstawie danych zamieszczonych w tabeli II, inkubacja „proleków" wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku z komórkami Vero (ko¬ mórki nerki afrykanskiego koczkodana zielonego), homogenatem watroby i ludzkimi limfocytami krwi Obwodowej (HPBL) prowadzi do tworzenia „ak¬ tywnego" leku NPT 15 392. Okazuje sie, ze prze¬ ksztalcenie NPT 15 458 do NPT 15 392 zachodzi w wyzszym stopniu niz NPT 15 457 do NPT 15 392.129 094 13 14 Tabela 9a Wzmozenie tworzenia przeciwcial u myszy BALB/C uodpornionych SPBC Nr próby 1 2 Zwiazek nr Solanka (kontrola) NPT 15 392 NPT 15 467 NPT 15 458 NPT 15 477 NPT 15 483 Solanka (kontrola) NPT 15 467 NPT 15 458 NPT 15 477 NPT 15 483 Dawka 0,5 mg/kg 0,5 mg/kg 0,5 mg/kg 0,5 mg/kg 0,5 mg/kg 0,05 mg/kg 0,05 mg/kg 0,05 mg/kg 0,05 mg/kg % stymulacji w odniesieniu do grupy kontrolnej 82 — 14 — 47 135 — 76 7 1 — 75 1 33 1 ~~ 12 Tabela 10 Tworzenie sie NPT 15 392 z acetoksynonylohipoksantyny (NPT 15 458) i sukcynoksynonylohipoksantyny (NPT 15 457) w ukladach biologicznych i Zwiazek nr NPT 15 392 NPT 15 457 NPT 15 458 Skladnik uaktywniajacy Komórki Vero Homogenat watroby HPBL Komórki Vero Homogenat watroby KPBL Komórki Vero Homogenat watroby HPBL % NPT 15 392* w czasie (godz.) 1 0 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0,5 24 | 1C0 14 70 100 100 | 0 18,2 | 50 100 * oznaczony za pomoca HPLC Tabela 11 Tworzenie sie NPT 15 392 po dootrzewnowym podaniu myszom acetoksynonylohipoksantyny (NPT 15 458) i sukcynoksynonylohipoksantyny (NPT 15 457) Podany zwiazek * NPT 15 392 NPT 15 457 NPT 15 458 Zwiazek nr 1 2 1 2 1 2 Poziom we krwi (fim/ml X 10') 1 NPT 15 392 0,22 0,68 0,47 0,22 8,2 2,7 NPT 15 457 — — 1,4 0,57 — — NPT 15 458 — — — — 0 | 0 * dawka 360 jim/kg15 129 094 Tabela 12 16 Wplyw erytro-Mz-acetoksy-3-nonylo) hikopsantyny na wzrost komórek nowotworowych (bialaczkowych) (in vivo) 1 Zwiazek NPT 15 458 Stezenie 10 ^g/ml Zahamowanie wzrostu (%) 1 L 1210 (mysie) 40 8068 (ludzkie) 1 32 1 Tabela 13 Zestawienie wlasciwosci biologicznych 1 Wlasciwosc 1 Podatnosc na przeksztalcenie 1 w NPT 15 392 1 Warunki chemiczne 1 pH 9,5 1 pH 7,0 Warunki biologiczne HPBL | Watroba Komórki Vero | Mysz Aktywnosc biologiczna Przeciwwirusowa (in vitro) Immunomodulujaca (in vitro) Proliferacja limfocytów Immunomodulujaca (in vitro) 1 Rozetki Immunomodulujaca (in vivo) SRBC —IgM NPT 15 457 Tak Nie 18 14 0 25 Bardzo niska Tak (+14 — 28%) Tak (+166%) Umiarkowana (0—60) NPT 15 458 Tak Nie 100 70 50 100 Tak (88%) Tak (+43^8%) Tak (+ 11%) Tak (—72%) NPT 15 392 — — I — — 1 Tak (73%) | Tak (+12—27%) | Tak (+ 78%) Tak (+ 46%) 1 W celu przeprowadzenia badan wlasciwosci no¬ wych zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wynalazku stosuje sie nastepujace sposoby poste¬ kiwania.I. Sposoby prowadzenia hodowli komórkowych.A. Namnalanie komórek HeLa i Vero. 1. Jednowarstwowe hodowle pochodne zaklada sie z hodowli w butlach 120 cm1 w nastepujacy sposób: 2. Odciaga sie podloze, a jednowarstwowa ho¬ dowle komórek przemywa sie dwukrotnie buforo¬ wanym roztworem soli (PBS) bez wapnia i magne¬ zu o pH 7,2i, w ilosci okolo 60 ml na jedno prze- Inycle. 3. Do kazdej butli dodaje sie w temperaturze 37°C 1 ml roztworu trypsyna-EDTA zawierajacego 0,5 g trypsyny (1:250) i 2 g EDTA (litr zrówno- 50 55 wazonego roztworu soli Hanksa) (HBBS) bez Ca++ i Mg++ i rozprowadza sie na jednowarstwowej ho¬ dowli komórek lagodnie wstrzasajac. 4. Butle umieszcza sie nastepnie w inkubatorze w temperaturze 37°C na okolo 3—5 minut w zalez¬ nosci od czasu wymaganego do rozproszenia komó¬ rek. Wymagane jest reczne wstrzasanie. 5. Do kazdej butli dodaje sie 10 ml plynu wzro¬ stowego i komórki rozprasza sie przez wciaganie zawiesiny i opróznianie pipety. Czynnosc te prze¬ prowadza sie dziesieciokrotnie. 6. Zawartosc serii butli laczy sie i komórki w zawiesinie rozciencza sie plynem wzrostowym do gestosci 7—8,5 X 104 komórek/ml. 7. Plyn wzrostowy sklada sie z nastepujacej kompozycji: minimalne podloze podstawowe Eagle'a (MEM) z solami Earle'a i bufairem HEPES uzupel-129 094 17 18 ittone dodatkiem nastepujacych substancji, jak to -wyszczególniono na 100 ml MEM: 10 ml plodowej surowicy cielecej (FCS) (konco¬ we stezenie = 10%), 1 ml L-glutaminy (200-molowej), 1 ml mieszaniny zawierajacej 10 000 jednostek penicyliny, 10 000 \jjg streptomycyny i 10 000 neomycyny. 8. Pochodne hodowle komórek zaklada sie w plyt¬ kach Costera do hodowli komórkowej zawieraja¬ cych 24 dolki o plaskim dnie, kazdy dolek o pojem¬ nosci 3 ml, dodajac po 1 ml zawiesiny komórek do kazdego dolka. 9. Jednowarstwowych hodowli uzywa sie do do¬ swiadczen gdy prawie osiagaja zlewajacy sie wzrost (okolo 1—2 dni). 10. Do utrzymywania linii komórkowych uzywa sie •oddzielnych butli. Podloza utrzymujace wzrost skla¬ daja sie z MEM + dodatki (patrz stadium 7), z FSC -o koncowym stezeniu zmniejszonym do 5%.B. Krwinki czerwone (RBC). / 1. Pelna krew otrzymuje sie przez naklucie serca swinek morskich samców szczepu Hartly. 2. Okolo 10 ml pelnej krwi miesza sie z 25 ml roztworu Alsever'a, mieszanine te mozna przecho¬ wywac w temperaturze 4°C w okresie do jednego tygodnia. 3. Bezposrednio przed uzyciem RBC przemywa sie trzykrotnie buforowanymi fosforanami, roztwo¬ rem soli (PBS), pH 7,2. 4. Kazdego przemycia dokonuje sie z wirowaniem -zawiesiny RBC przez 10 minut przy 450 X g w tem¬ peraturze pokojowej. 5. Przygotowuje sie 0,4% obj/obj zawiesine RBC iv zrównowazonym roztworze soli Hanksa. 11. Namnazanie wirusów w zarodku kurzym.A. Zakazanie 1. 9—10-dniowe zarodkujace jaja przeswietla sie w celu stwierdzenia zywotnosci i polozenia komory powietrznej, która zaznacza sie na skorupce olów¬ kiem. Jaja budzace zastrzezenia (brak ruchomosci lub ciemna plama) odrzuca sie. 2. Powierzchnie skorupki odkaza sie 70% etano¬ lem i pozostawia do wyschniecia. 3. W skorupce robi sie jalowym ostrym narze¬ dziem maly otwór, okolo 6,35 mm, w naznaczonym •olówkiem okregu zaznaczajacym polozenie komory powietrznej w kazdym jaju. 4. 1/10 ml róznych zawiesin wirusa, 101—10f JSIDN^nl wprowadza sie przez otwór za pomoca 1 cm* strzykawki tuberkulinowej pod katem 45° naruszyc zarodka lub woreczka zóltkowego. 6. Zamyka sie otwór w kazdym jaju kawalkiem '(25,4 mm) tasmy elastycznej i oznacza na niej ro- ¦dzaj zastosowanego wirusa, numer pasazu i date. 7. Jaja inkubuje sie w temperaturze 35—37°C przez 2—6 dni, w zaleznosci od szybkosci rozwoju wirusa. Czas i temperature inkubacji rejestruje sie « innymi danymi majacymi zwiazek z kazdym pasazem.B. Zbiór plynu omoczniowego. 1. Po zakonczeniu okresu inkubacji jaja chlodzi sie w ciagu 3—4 godzin w temperaturze 4°C w ce¬ lu zmniejszenia do minimum krwawienia do jamy omoczniowej podczas zbioru wirusa. 2. Powierzchnie skorupki ponownie odkaza sie 5 70% etanolem i pozostawia do wyschniecia. 3. Odcina sie wierzcholek skorupki wzdluz linii oznaczonej olówkiem za pomoca jalowych nozyczek, a blony otwiera sie jalowymi kleszczykami. 4. Kleszczyki zaglebia sie ostroznie miedzy zaro- m dek a skorupke i odpycha sie zarodek w jedna strone, tworzac „kieszonke" z plynem omocznio- wym. Nalezy starac sie, aby nie nakluc owodni (z wyjatkiem przypadku, gdy zbiera sie równiez plyn owodniowy) i aby zmniejszyc do minimum 15 ryzyko rozerwania sie tetnic lozyskowych. 5. Zbiera sie plyn omoczniowy za pomoca jedno¬ razowych pipet 10 ml z mechanicznym pecherzy¬ kiem prózniowym i przenosi sie go do jalowych jednorazowych probówek wirówkowych. Z kaz- 20 dego jaja mozna zebrac okolo 5—8 ml plynu, 6. Zebrany material wiruje sie przy 1200Xg przez 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatanty przenosi sie do jalowych probówek. * 7. Z kazdej puH pobiera sie próbki do miarecz- 2| kowania i badania jalowoscL Pozostala zawiesine rozdziela sie do jalowych 2 cm9 probówek serolo¬ gicznych i znaczy sie je, podajac nazwe szczepu, numer pasazu i date. 8. Próbki bezzwlocznie zamraza sie w cieklym M azocie i przechowuje w temperaturze —70°C w ultrazamrazarce lub krioaamrazarce z cieklym N* III. Namnazanie wirusa w hodowli komórek. as A. Zakazanie. 1. Wybiera sie do uzycia 24 48 ¦godzinne jedno¬ warstwowe hodowle komórek odpowiedniego typu, zazwyczaj w jednorazowych butlach 250 cm* do hodowli komórkowej, przy wzroscie prawie zlewe- 40 jacym sie. 2. Wszystkie czynnosci zakazania i zbioru doko¬ nuje sie w boksie zapewniajacym bezpieczenstwo biologiczne i uzywa sie tylko mechanicznych urza¬ dzen pipetujacych. Zastosowuje sie technike pracy 49 w warunkach jalowych. 3. Do zastapienia plynu wzrostowego w hodow¬ lach, które przeznaczone sa do zakazenia, uzywa sie 25 ml plynu utrzymujacego. Do hodowli kon¬ trolnych takze dodaje sie po 25 ml plynu utrzy- M mujacego. 4. Wirus siewny rozciencza sie MEM bez suro¬ wicy, zgodnie z informacjami dotyczacymi jego zródla lub informacjami z miareczkowania w po* przednich pasazach i do kazdej hodowli dodaje sie H 0,5 ml otrzymanego rozcienczenia. 5. Hodowle inkubuje sie w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze skladajacej sie z 5% CO| i 95% powietrza przez 48—72 godziny z codzienna obserwacja efektów cytopatycznych (CPE) charak- to terystycznych dla kazdego wirusa.B. Zbiór. 1. Hodowle przeznacza sie do zbioru, gdy CPE osiagaja ocene od 3 do 4+, 0 — bez widocznych efektów cytopatycznych129 094 19 2t l* — 25% kdmArek wykazuje elekty cytdpatyc»e 2* -- 50% komórek wyllltzttje efekty cytopatyozne 3+ — 75% komór* wykasaije efekty cytopatyczne 4P- — 100% komórek wykazuje afekty cytopatyczne 2. Hodowle zamraza *ie i odmraza 3 raay w celu osiagniecia lizy i uruchomienia warstwy koiftórek.Pd trzecim odmrozeniu przenosi sie plyn hodowli do jalowych jednorazowych probówek wirówko¬ wych i Wiruje przy 300 X g w ciagu 30 minut w ortu odwirowania komórkowego dabris. Spra/wdat sie, czy w zawiesinie wirusa nie ma zanieezysaeften bakteryjnych. a. 0upermtarrty bezzwlocznie dzieli sie na próbki 0»fr**4 mi w 3 cm* jalowych probówkach serologicz¬ nych i zamreia w cieklym azocie* 4. W eetu zmiarsjcakowanla przygotowuje sie jednowarstwowe hodowle w plytkach do hodowli komórkowej zawierajacych 24 dolki o plaskim dnie i skaza sia je w spoitób nastepujacy: a. pray^BtoWuje sie lG*krdtne seryjne rozciencze¬ nia wirusa ttfr-1 — lfr~7) limfiym plynem utrzymu¬ jacym, zawieirajiieym 6% plodowej zawiesiny cie¬ lecej. b. i ml kazdego roacieneaenia dodaje sie do po- saczegolnych dolków feft 3 jednakowe próbki). c. m kompletu badan wlacza sie równiez hodowle kontrolne, aawierajace tylko plyn utrzymujacy. 5. Hodowle inkubuje sie w ciagu 48 godzin w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze sklada¬ jacej sie z 5% CO* i »5% powietrza i ocenia jak uprtednto opisano. Oblicza sia miano TCIDs* we¬ dlug metody miareczkowania Reeda i Muncha.C odczyn hemadaotpcji (HAd) 1. Bezposrednio przed przeprowadzaniem odczy¬ nu HAd dekantuje sie podloze z hodowli komórko¬ wych to* plynach. 2. Do k&idego dolka dodaje sie 1 ml plynu u- trzytfBUja&#o. 3i 6o dWóeh serii hodowli kontrolnych dodaje sie sam plyn utrzymujacy. - 4. HOdoWle badane i jedna kontrolna bezzwlocz¬ nie mokttluje sie 0,1 ml rozcienczonego preparatu wirusa. Fótfaatkowe miano ustala sie jak w uprzed¬ nich bttdtthtach HAdFFU. HAdFFU oznacza jed¬ nostki tworzenia ogniw heraadsorlpcji. 5. Inne serie Kontrolne [pozostawia sie nie zafea- zóne dlodftjac samego MEM (jato slejpa inokidacja). 6. Hod/dwle Infcuibuje sie w temperaturze 37°C 15 20 30 35 40 45 W ci^gu IG—18 godzin, jesli nie wskazano inaczei- 7. Po okresie inokulacji podloza dekantuje sia- i komórki pruernywa sie jeden raz z* pomoca PBS w pH 7,2. 8. Dodaje sie zawiesine RBC w ilosci 0£ ml na 1 dolek i pozostawia hodowle na 30 minut w tern* peraturze pokojowej. 9. Nastepaie dekantuje sie zawiesine RBC i prze¬ mywa hodowle 3—3 razy PBS do usuniecia wszyst¬ kich, oprócz swoiscie zwiajzanych* RBC. 14. Na zakonczenie dodaje iie do kazdego dolka 1 rai zrównowazonego roztworu soli Hanka*.(HBBS). 11. Liczenie ognisk hemadsorbowanych RBC po¬ czatkowo przeprowadza sie w odwróconym mikro¬ skopie fazowoHkontrastowym Nikon z uzyciem o- biektywu 4x. 12. We wszystkich przypadkach, wybiera sie do liczenia przynajmniej 5 przypadkowych pól na 1 do¬ lek. 13. Liczenie ognisk HAd przepnowadaai sie sto¬ sujac aparat Bausch&Lomb Omnicon Alpha Ima¬ ge Analyzer. 14. Obraz ^ak mikroskopowego rzuca sie na wi~ dikon wybierajacy* Obra* -ukazuje sie równiez r» ekranie telewizyjnym tak, ze operator moze wy¬ kryc i odliczyc bledy zalezne od debris. Ogniska wykrywa sie przez poziom szarosci i wielkosci obrazu. 15. W celu wyeliminowania liczenia pozostalycl nie z&adsorbowanyeh RB€ programuje sie nadwy- miarowa jednostke Eczaea tak, aby odsiac wyniki pojedynczych RBC. 1$. W ramach analizy statystycznej dokonuje sie analizy danych z uzyciem modelu hierarchicznego analizy wariancji. Zródlem odchylen moze by6 traktowanie, róznice dotyczace domków i blad do¬ swiadczalny zalezny od póLw dolkach. Dla kazdego* dolka oblicza sie srednia zakazonych komórek i blad standardowy sredniej. Srednia A blad stan¬ dardowy oblicza sie równiez dla kazdego rodzaju traktowania przez spulowanie dolków poddanych* lacznie takiemu samemu traktowaniu. Srednia za- kazonych komórek na pole dla kazdego traktowania porównuje sie z kontrola za pomoca testu Dun- nefa do wielokrotnych porównan niezaleznie o& testu F dla calego potraktowanego materialu (patrz ponizsza czesc opisu).Kontrola | Dolek 1 i [ r F 11* F 21 r 3i ^iSEj Dolek 2 F 12 F 22 F 32 x^±SE2 Dane spulowane xc ± SEC n = 9 T*b< Dolek 3 F 13 F 23 F 33 3^±S£, 3la 14 Sposób traktowania | Dolek 1 F' 11 F' 21 r 31 xi' ± SF! Dane spulcwafle | f Dolek 2 r 12 r 22 r 32 ~*% ± SE2 *'±SE'T n = 9 Dolek 3 l r 1* i F' 23 l r 33 1 x/±9V$ j i l .., ,. __ t • F li r€Srfezfentuje nr £ól£12S044 21 IV. Przygotowanie ludzkich Mmfocytó* krwi ob- "Wdowej (HPBL). 22 A. Przygotowanie srodowiska rozdzielajacego Fi- «coll-Hypaque. 1. 2&$ g Fieoll 40Q produkcji Pharmacia, o masie dy destylowanej. Po rozpuszczeniu wiekszosci tego materialu, objetosc doprowadza sie do 250 ml wo¬ da destylowana. 2. 34 g Hypaque (sól sodowa kwasu 3,5-dwuaee- tamido-3,4,6-trójjodobenzoegowego) produkcji Ster- ling Organdcs, masa czasteczkowa = 636 rozpuszcza saa w 100 ml wody destylowanej. 3. Roztwory wyjalawia sie za pomoca saczenia przez saczek railiparowy 0,45 p, i przechowuje w jalowych pojemnikach w temperaturze 4°C, chro¬ niac przed swiatlem. 4. Roztwory robocze przygotowuje sie przez wmieszanie 10 ml roztworu Hypaque z 24 ml roz¬ tworu FócolL Mieszanine ogrzewa sie do tempera¬ tury 25°G ze stalym mieszaniem.B. Wydzielanie PBL z pelnej krwi. 1. Próbki ludzkiej krwit otrzymuje sie przez na¬ klucie zylyt pobierajac do heparynizowanych pro¬ bówek prózniowych. 15—20 ml nie rozcienczonej knfri nawarstwia sie ostroznie na rotwór Ficoll- -Hypaaue w równej ilosci, w 50 ml poliweglan©- wych probówkach wirówkowych, dokonujac tych czynnosci metodami aseptycznymi. 2. Przygotowane próbki wiruje sie w temperatu¬ rze 25°C przy 400 Xg przez 30 minut. Metne pas¬ mo o barwie bialej na granicy fazy aspiruje sie do 50 ml jalowych probówek wirówkowych zawiera¬ jacych 10—20 ml RPMI-1640. Komórki przemywa sie 1 raz w temperaturze 25°C i odwirowuje przy 400 Xg przez 10 minut w temperaturze 25°C. 3. Osadzone PBL zawiesza sie ponownie w 1 ml ftPMI, która to objetosc odpowiada 8 ml pelnej krwi uzytej na poczatku i liczy w liczniku Coul- tera. Gestosc komórek doprowadza stie do odpo¬ wiedniej wartosci za pomoca RPMI-1640 uzupelnio¬ nego glutamina i antybiotykami. Komórki pozo¬ stawia sie w temperaturze pokojowej do momentu uzycia.V. Stymulowanie HPBL za pomoca PHA i LPS. 1. Od zdrowych ochotników pobiera sie 10—40 ml pelnej krwli do heparynizowanych probówek. 2. Limfocyty wydziela sie z krwi metoda wy¬ dzielania z uzyciem Ficoll-Hypaaue. 3. Przygotowuje sie zwiazek badany w róznych stezeniach w RPMI-1640. 4. Gestosc limfocytów doprowadza sie do 2 X lOyml za pomoca RPMI-1640. 5. Limfocyty inkubuje sie ze zwiazkiem bada¬ nym w ciagu 90 minut w temperaturze 37°C. 6. Czerwone krwinki krwi baraniej (SRBC), 1^-2-tygodniowe, przemywa sie 3 razy PBS i roz¬ ciencza do koncowej gestosci 0,5% za pomoca EPMI-1640. 7. W probówkach do przeprowadzenia reakcji -umieszcza sde nastepujace skladniki: 0,2 ml zawiesiny limfocytów (2 X 10e) 0,2 ml 9% Ficoll w RPMI-1640 0,2 ml SRBC (0,5% w RP1NJI-1640). 8. Powyzsze substraty reakcji wiruje sie przy 200 X g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. g 9. Osad lagodnie zawiesza sie ponownie i 10 1 próbki umieszcza w hemocytometrze. 10. Ilosc rozetek liczy sie przy uzyciu mikrosko¬ pu, uwazajac za rozetke kazdy limfocyt z przyla¬ czonymi trzema, lub wiecej, czerwonymi krwin¬ kami 10 15 20 45 50 60 VI. Komórki tworzace rozetki E.A. Przygotowanie mitogenów. 1. Liposacharyd B lub fiitohemaglutamine P w postaci proszku wazy sie i rozpuszcza w RPMI-1640 w stezeniu 1000 ^g/ml (1 mg/ml) i wyjalawia przez saczenie przez saczek miliporowy 0,45n. 2. Roztwory dzieli sie na próbki (1 ml/probówke) wprowadzajac je jalowo do jalowych krioprobó- wek i zamraza. Próbek nie zamraza sie powtórnie po czesciowym uzyciu, ale mozna je przechowywac przez dzien lub dwa w temperaturze 4°C. Liofili¬ zowany proszek przechowuje aie w stanie oziebio¬ nym do temperatury 4°C.B. Przygotowanie hodowli 1. PBL przygotowuje sie jak w SOP nr 1-004 w RPMI-1640 bez surowicy uzupelnionym gluta¬ mina i roztworem antybiotycznym aktynomycyny (GIBCO). Do kazdego dolka mikrotestowych plytek do hodowli komórkowych (CoStar Plastics) zawie¬ rajacych 96 dolków dodaje sie otrzymana zawie¬ sine w ilosci 0,1 ml za pomoca 8-kanalowej auto¬ matycznej mikropipety (Flow Labs), wyposazonej w jalowe koncówki. 2. Roztwór mitogenu rozmraza sie szybko i roz¬ ciencza za pomoca RPMI-1640 do stezenia cztero¬ krotnie wyzszego od pozadanego. 3. Badane zwiazki przygotowuje sie do uzycia wedlug SOP nr C-002 przy uzyciu RPMI-1640 jako rozcienczalnika, rozcienczajac do stezenia cztero¬ krotnie wyzszego od pozadanego stezenia konco¬ wego. 4. 15 |xl z kazdego rozcienczenia mitogenu i/lub badanego zwiazku dodaje sie do 6 równoleglych próbek hodowli komórkowej, podczas gdy do pró¬ bek kontrolnych dodaje sie w tej samej ilosci RPMI-1340 do calkowitej objetosci 0,2 ml/dolek. 5. Hodowle inkubuje sie w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierajacej 95% powie¬ trza i 5% C02 (pH = 6,0—7,0) przez 48 godzin. Na¬ stepnie komórki znakuje sie za pomoca *H-TdR (tymidyny) w ilosci 0,5 uGi/dolek, przez 18 godzin.Komórki zbiera sie za pomoca automatycznego urzadzenia do wielokrotnego zbierania próbek (M.A.S.H). Nie przylegajace komórki aspiruje sie na skrawki saczka z wlókna szklanego z uzy¬ ciem 0,9% roztworu soli (z 10-krotnym starannym przeplukaniem) i doprowadza do lizy komórek z uzyciem wody destylowanej (20-krotne staranne przeplukanie). Skrawki saczka suszy sie nastepnie na powietrzu, po czym pozostale osadzone komór¬ ki wycina ze skrawków i kazda próbke umiesz¬ cza w 3,888 g szklanym naczynku scyntylacyjnym.Koncentrat plynu do scyntylacji (Scintriprep 1,129 094 23 24 produkcji Fischer Chemicals) rozciencza sie w sto¬ sunku 1:50 toluenem o czystosci scyntylacyjnej (Packard) i dodaje po 1 ml do kazdego naczynka.Próbki ocenia sie za pomoca cieczowej spektro¬ skopii! scyntylacyjnej i otrzymane dane wyraza jako srednia zliczen na minute na grupe badana.VII. Badanie immunolysinek.A. Przygotowanie NPT 15 392 1. Sporzadza sie roztwór zawierajacy 500 pg/ml NPT 15 392 za pomoca dodania uprzednio zwazo¬ nej ilosci leku w postaci proszku do jalowego PBS i otrzymany roztwór poddaje dzialaniu ultradzwie¬ ków w ciagu 30 mrihut. 2. Dlugosc fali na spektrofotometrze dwuzwiazko- wym GCA/McPherson nastawia sie na 250 nm. 3. NPT 15 392 rozciencza sie w stosunku 1:10 z uzyciem 0,1 N HC1. 4. 15 ml 0,1 N HO wprowadza sie do zlewki i roztworu tego uzywa sie óo przeplukiwania ku¬ wet. Obydwie kuwety napelnia sie 0,1 N HC1 i od¬ czytuje sie dlugosc fala. Wartosc absorbancji po¬ winna miescic sie w zakresie 0,001—0,005 od war¬ tosci zerowanej. 5. Kuwete przeznaczona na próbke badana opróznia sie i wprowadza do niej rozcienczony lek 6. Rejestruje sie wartosc absorbancji i stezenie oblicza sie w nastepujacy sposób: Wzór: A (absorbancja) — X wspólczynnik rozcienczenia 11,31 X masa czasteczkowa (279 = g/lml B. Przed dniem 0 1. Sporzadza sie roztwór leku NPT 15 392 przez rozpuszczenie 500 pg NPT 15 392/1 ml PBS. 2. Sprawdza sie stezenie wedlug p. A SOP. 3. Roztwór macierzysty dzieli sie na 1 ml próbki i przechowuje w —20°C w ciagu kilku miesdecy. 4. Roztwory rozmraza sie i rozciencza do poza¬ danego stezenia.C. Plytki z agaroza podstawowa przygotowuje sie w sposób nastepujacy: 1. 1,4% zawiesine agarozy w PBS (7 g w 500 ml) autoklawuje sie w ciagu 15 minut. 2. Przy uzyciu strzykawki Cornwella, na plytki Petrfego Falcon nr 1006 rozlewa sie po 3 ml roz¬ puszczonej agarozy w sposób aseptyczny i obraca¬ jac doprowadza sie do powstania równej warstwy. 3. Plytki takie mozna przechowywac przed uzy¬ ciem w okresie do 1 tygodnia w temperaturze 4°C.Plytki przechowuje sie w pozycji odwróconej (agar w górnej czesci plytki).D. Otrzymywanie surowicy swinki morskiej. 1. Od 2—6 swinek morskich pobiera sie 10 ml krwi przez naklucie serca i umieszcza w 50 ml probówce wirówkowej Falcon nr 2070, bez anty- koagulantów. 2. Probówki te inkubuje sie w ciagu 45 minut w temperaturze 37°C w celu utworzenia skrzepu. 3. Nastepnie probówki wyjmuje sie z inkuba¬ tora i umieszcza na lodzie na okres 30 minut w celu retrakcjd. skrzepu. 4. 2 kazdej probówki odciaga sie aseptycznie su- 10 15 20 25 rowicef i po spulowaniu rozdziela na 1 ml próbki^, które przechowuje sie w temperaturze —70°C do^ momentu uzycia.E. Uodpornienie, dzien 0. 1. Myszy uodpornia sie w nastepujacy sposób.Krew barania (owca nr 23) otrzymuje sie co ty¬ dzien z Hyland Labs. Pobiera sie ja aseptycznie do plynu Alsebier'a w ilosci 2 objetosci plynu- na 1 objetosc krwi. 2. 0,5 ml krwi baraniej w plynie Alsevier'a prze¬ mywa sie 3 razy jalowym PBS w klinicznej wi¬ rówce IEC? przy nastawieniu w polozenie 4 (2800^ obr./min), w ciagu 10 minut, w temperaturze poko¬ jowej. 3. Osadzone krwinki zawiesza sie ponownie wr jalowym PBS w stosunku 1:10. 4. Licznik Coultera (model Z) kalibruje sie we¬ dlug instrukcji obslugi 5. Do liczenia komórek w liczniku Coultera po¬ trzebne jest rozcienczenie 1:10 000. Uzyskuje sie je* za pomoca przygotowania pierwszego rozciencze¬ nia 1:100 w F3£- 1 nastepujacym po tym rozcien¬ czeniem tej *irx*j*s*ny izotunem w stosunku 1:10..Próg licznika Coultera nastawia sie na nr 5. 6. Oznacza sie ilosc komórek i roztwór macie¬ rzysty rozciencza sie do 4 X 107 komórek/ml. Tej koncowej zawiesiny uzywa sie do uodpornienia. 7. Kazda z myszy uodpornia sie przez dozylne wstrzykniecie do bocznej zyly ogonowej (ogrzanej1 do 50°C w lazni wodnej w celu jej rozszerzenia) 0,1 ml zawiesiny SRBC, w koncowej ilosci 4 X 10« SRBC/mysz.F. Podawanie leków. 1. Myszom podaje sie leki przez dootrzewnowe- wstrzyknrecie w dniu 0, 1, 2 2 3 1 cm*. Strzykaw¬ ka wyposazona jest w igle 12,7 mm, nr 26. Igle^ wprowadza sie pod katem 45° wzdluz prawej stro¬ ny linea alba. Podaje sie' 0,2 ml, tak myszom o- trzymujacym lek, jak i myszom kontrolnym. 2. Myszom w grupach otrzymujacych lek podaje- sie 0,2 ml roztworu NPT 15 392 o pozadanym ste¬ zeniu, które wynosi dla myszy o wadze 20 g; 5 ug/ml.G. Przygotowanie sledziony, dzien 4. 1. Sledziony pobiera sie aseptycznie, po czym u- mieszcza sie je pojedynczo w probówkach do ho¬ dowli komórkowej Falcon nr 2025 zawierajacym 3 ml MEM. Nastepnie probówki przechowuje sie~ na lodzie. 2. Sledziony homogenizuje sie w tych samych probówkach za pomoca teflonowego tluczka sprze- 55 zofnego z nawrotnym silnikiem z regulacja predko¬ sci G. K. Hellera polaczonym z regulatorem silnika- G. K. Hellera GT-21, nastawionym na polozenie nr 6. 3. Czas homogenizacji i sposób dzialania powi- 60 nien byc jednolity dla kazdej próbki. 4. Nastepnie próbki saczy sie przez sito ze stala nierdzewnej, 100 mesli^ 40 mikronów, do standar¬ dowych probówek do hodowli komórkowej. Sito- przemywa sie 3 ml MEM i zawiesine komórelc te przechowuje na lodzie. 35 402ft 129 004 2t 5^ Przygotowuje sie rozcienczenie 1:1000 do licz¬ nika komórek Coultera. Otrzymuje sie je wpierw rozcienczajac w stosunku 1:10& w FBS, a na¬ stepnie w stosunku 1 :10 w izotonie. 6v Oblicza sie ilosc komórek 1 roztwór macce^ rzysty rozciencza sie do iXW komfoek^nl Próg licznika Coultera nastawia sie na nr 10. Krwinki -czerwone hemolizuje sie trzema kroplami izoto- nu Zap.H. Przygotowanie wierzchniej 'warstwy agaru <0J%). 1. 0,35 g agarozy i 0,33 g MEM w postaci prosz¬ ku umieszcza sie w kolbie Erlenmeyera. Do kolby dodaje sie 5fr ml wody destylowanej. 2. Otrzymana zawiesine autoklawuje sie w ciagu 13 mdnut w temperaturze 121°C i pod cisnieniem 1,032 • 10* Pa. Nastepnie umieszcza sie ja w lazni wodnej w temperaturze tó°C na 5 minut, pH dopro¬ wadza sie do wartosci okolo 7,2 za pomoca doda¬ nia wodoroweglanu sodowego (Q,l ml Na*COs). 3. I ml próbki rozdziela sile do 5 ml probówek do hodowli komórkowej uprzednio umieszczonych w lazni wodnej. Przygotowuje sie- tez kilka dodat¬ kowych probówek zastepczych w przypadku bledu ' przy rozlewaniu na plytki.I. Przygotowanie 10% zawiesiny SRBC 1. 5 ml krwi baraniej, z tej samej partii, fctorei uajyto do uodpornienia, przemywa sie 3 razy F&S z uzyciem klinicznej standardowej wirówki IEC, szybkosc nr 4 (2800 obr./mfin,), wirujac przez 10 minut. 2. Po trzecim przemyciu, komórki zawiesza sie ponownie w objetosci P3S* 10-krotnie wieksze; od objetosci odwirowanych, komórek, to jest 0,5 ml odwirowanych SRBC + PES do 5 ml.J. Rozlewanie na plytki, 1. Plytki agarowe wyjmuje sie z lodówki i po¬ zostawia do ogrzania do temperatury pokojowej.Nastepnie znakuje sie je, po 3 na kazda grupe badana. 2. Probówki z agarem wyjmuje sie z lazni wod¬ nej, po czym dodaje 0,1 ml 10% zawiesiny SRBC $ Q,l ml zawiesiny komórek sledziony do kazdej probówki z agaren^ a nastepnie miesza sie z uzy¬ ciem miksera Vortex. 3. Zawartosc probówek wlewa sie bezzwlocznie ^o plytek z agarem podstawowym, obracajac je az ^to utworzenia sie gladkiej warstwy. Nastepnie plytki ustawia sie na równej powierzchni az do ftezenia agaru. 4. Plytki inkubuje sie w temperaturze 37°C, w wilgotnej atmosferze, zawoieraiacej 5% COa i 95% powietrza, w ciagu 90 minut. a. Dopelniacz swinki morskiej (patrz: Przygoto¬ wanie, punkt D) wyjmuje sde z zamrazarki, roz¬ mraza w temperaturze pokojowej i rozciencza PBS w stosunku 1:10. 6. Plytki wyjmuje sie z inkubatora i dodaje do "kazdej 1 ml rozcienczonego dopelniacza. 7. Plytki inkubuje sie w ciagu dalszych 30^-45 minut w temperaturze 37°C. Nastepnie plytki wyj¬ muje sie z inkubatora i przy ukosnym oswietleniu liczy lysinkL 8. Plytki mozna przechowywac w temperaturze 4°C, odwrócone, po czym, po uplywie 24 godzin, 5 dokonuje sie liczenia.Podsumowanie danych dotyczacych uzytecznosci leczniczej w przykladach roboczych. Poslugujac sie standardowymi metodami hodowli komórko¬ we} wykazano, ze zwiazki wytworzone sposobem w, wedlug wynalazku hamuja nanmazanie si$ repre¬ zentatywnej grupy wirusów RNA. W przypadku wirusów RNA, wykazano za pomoca odczynu he- madsoipcji hamowania namnazania sie wirusa grypy nalezacego do podtypu A. Wykazano, ze 16. wiele zwiazków nalezacych do serii NPT 15 457 i NPT 15 458, hamuje naannazanie sie wirusa gry¬ py w zakresie stezen 3,6—360 nanomoli/ml.Inne wirusy RNA uwidoczniono w tablicy 3.Sa one odpowiedzialne za wymienione choroby. 2* Wiadomo, ze ze wszystkich chorób na swiecie, co najmniej 25% jest spowodowanych przez wirusy.Oprócz tego wyizolowano szereg wirusów, co do których wykazano;, ze powoduja nowotwory. Moz¬ na wiec oczekiwac, ze czynniki przeciwwirusowe 25 maja pewne wlasciwosci przeciwnowotworowe, np. przeciwbialaczkowe.Okreslono aktywnosc jednego z tych czynników, NPT 15 458, jako inhibitora wzrostu nienormalnych limfocytów NPT 15 458. W szczególnosci NPT 15 458 30 jest zdolny do hamowania namnazania sie mysich limfocytów bialaczkowych (linia komórkowa L-1210) w hodowli komórkowej. Osiaga sie tu 40% zahamowanie wzrostu komórek L-1210 w przy¬ padku zastosowania NPT 15 458 w stezeniu 35 10 |ig/ml.Dane zamieszczone w tabeli, 4 wykazuja, ze w normalnym pH organizmu (7,2) zwiazki wykazuja dobra stabilnosc chemiczna, a rozszczepiane sa do aktywnej substancji NPT 15 392 w pH z^sa^jpwym,. 40 Jak mozna zauwazyc w tabeli 109 estry, zwlaszcza NPT 15 458, rozszczepiane sa do NPT 15 392 w wy¬ niku inkubacji z tkankami zwierzecymi. Jest to prawdopodobnie wytlumaczenie dlaczego zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, proteki, 49 wykazuja aktywnosc biologiczna. Oprócz tego, dane umieszczone w tabeli 11 jasno wykazuja co naj¬ mniej 12-krotnie wyzszy poziom we krwi NPT 15 392, biologicznie aktywnej substancji, po do¬ otrzewnowym podaniu NPT 15 458, anizeli po bez- 50 posrednim podaniu myszom NPT 15 392. Dalej, na¬ lezy zauwazyc, ze w tabeli 10 wszystkie komórki Vero (nerka), watroby i HPBL rozszczepiaja pro- lek do biologicznie aktywnego zwiazku NPT 15 392.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna- 55 lazku wyraznie hamuja namnazanie sie wirusów, moduluja (wzmagaja lub hamuja) odpowiedz im¬ munologiczna, a takze hamuja wzrost limfocytów bialaczkowych. W oparciu o wyniki eksperymen¬ tów in vitro oraz biorac pod uwage wyzszy po- 60 ziom we krwi uzyskiwany przy uzyciu tych zwiaz-i ków, w porównaniu do NPT 15 392, wykazujacych aktywnosc w zakresie stezen 0,01—100 ^g/ml, mozna oczekiwac dawek skutecznych dla ssaków w zakresie 0,0005^50 p^/kg. 55 Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna-129 094 27 lazku sa szczególnie skuteczne wobec wirusów RNA. Zwiazki i kompozycje wytworzone sposobem wedlug wynalazku sa uzyteczne w leczeniu (i dzia¬ laniu na komórki) ludzi oraz ssaków takich jak swinie, psy, koty, bydlo, konde, owce, kozy^ myszy, króliki, szczury, swinki morskie, chomiki, malpy rtd.Jesli tego inaczej nie wskazano, wszystkie czesci i udzialy procentowe sa wagowe. Temperatura po¬ dana jest w °C, jesli tego nie wskazano inaczej.Kompozycje moga zawierac, skladac sie zasadniczo lub skladac sie z materialów wytworzonych sposo¬ bem wedlug wynalazku, a sposoby moga zawierac, skladac sie zasadniczo, lub skladac sie ze stadiów opisanych przy wytwarzaniu materialów otrzyma¬ nych sposobem wedlug wynalazku.Kompozycje mozna podawac ssakom zwyklymi drogami, np. doustnie, donosowo, doodbytniczo, dopochwowo lub pozajelitowe Mozna je stosowac jako roztwory do wstrzykiwania np. iroztwory wod¬ ne, lub jako tabletki, pigulki, kapsulki itp.Wynalazek objasniaja blizej nastepujace przy¬ klady.Przyklad L Wytwarzanie erytro-9-(2-aceto- ksy-3-nonylo-hipoksantyny (NPT 15 458) („Acetylo- nonylohipoksantyna"). 2,78 g (10 milimoli) erytro-9-(2-hydroksy-3-nony- lo) hikopsantyny, NPT 15 392) rozpuszcza sie w 120 ml pirydyny i dodaje 3 ml '(30 milimoli) bezwodni¬ ka kwasu octowego. Otrzymany roztwór utrzymuje sie w temperaturze 25°C w oiagu 24 godzin. Na¬ stepnie dodaje sie 50 ml etanolu i otrzymany roz¬ twór odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Operacje te powtarza sie 4 razy w celu usuniecia pirydyny, po czym dodaje sie 150 ml eteru do otrzymanej pozostalosci i utworzone cialo stale wyodrebnia sie przez odsaczenie. Osad prze¬ mywa sie 3 razy eterem, w wyniku czego otrzy¬ muje sie 2,51 g (80%) zwiazku tytulowego o wzo¬ rze 2, w postaci krysztalów o barwie bialej. Tem¬ peratura topnienia 150—151°C. UV Amax (H^, 28 249 nm. Am 10,1 X10*. IR 1700 cm' * 10 15 20 25 30 35 40 pH 5,5) Analiza elementarna dla CnH^N^i: Obliczono: C 59,97, H 7,55 N 17,48* znaleziono: C 59,83, H 7,42 N 17,3fr Chromatografia wstepujaca (bibula Whatman nr 1)* Wartosci Tt: n-butanol (H^O) CH^COOH (2:1:1) = 0,92 etanol/l M octan amonu (14 : 6) = 0,88 izo-npropanol/stezony amoniak (HjO) (7:2:4) = 0,9O Przyklad II. Wytwarzanie erytrOH9-(2-suk— cynoksy-3-nonylohipoksantyny (Sukcynylononylo- hipoksantyna) (NPT 15 457) 600 mg (2,2 milimola) erytro-9-(2-hydroksy-3-no- nylo)hipoksamtyny (NPT 15 392) i 1 mg (10 mili¬ moli) bezwodnika (kwasu bursztynowego rozpuszcza, sie w mozliwie najmniejszej objetosci pirydyny przy mieszaniu. Otrzymany roztwór ogrzewa sie^ lagodnie, w temperaturze okolo 30°C przy ciaglymi, mieszaniu w ciagu 30 dni.Pirydyne usuwa sie przy uzyciu wyparki obro¬ towej i pozostalosc poddaje sie ekstrakcji 20 ml etanolu bezWG£n££9 ** £^£u 48 godzin. Otrzymany roztwór odwirowuje sie i odciek poddaje oczysz¬ czeniu metoda preparatywnej chromatografii cien¬ kowarstwowej (plytki pokryte 2 mm warstwa Silika^ Gel 60) przy uzyciu ukladu n-butanol 2 N NH4OH 10:2 (obj./obj). Etanolem ibezwodnyni eluuje sie- pasmo o Rf = 0,17. Czystosc produktu o wzorze 3 ocenia sie metoda chromatografii 'cienkowarstwo¬ wej Stabilnosc chemiczna.Dane przedstawione w tabeli 4 jasno wykazujar ze estry NPT 15 458 i NPT 15 457 sa stabilne w temperaturze 37°C i obojetnym pH (7,0, wartosc^ fizjologiczna). Dalszym potwierdzeniem budowy tych estrów jest to, ze za pomoca zasadowej hyd¬ rolizy przy pH 9,5 mozna przeksztalcic tak ester acetylowy (NPT 15 458) jak i sukcylynowy (NPT 15 457) w NPT 15 392.Tabela 15 Wplyw róznych wartosci na stabilnosc chemiczna acetoksynonylohipoksantyny (NPT 15 458) i sukcyno- ksynonylohipoksantyny (NPT 15 457) Zwiazek NPT 15 392 (kontrola) NPT 15 457 NPT 15 458 L . n.'' i ¦ i i Stezenie (0,36 jim/ml) (0,36 |am/mj) (0,36 Lun/ml) . Wartosc pH PH 1,0 pH 7,0 pH 9,5 pH 1,0 pH 7,0 pH 9,5 pH 1,0 dH 7,0 DH 9,5 % NPT 15 392 * [ I 100 | ioo r 100 I 2 1 o r 8 l 0 1 8 1 28 1 3 l/a godzimy lrtkubacji w temperaturze 37°C; oznaczenia mateda HPLC129 094 29 30 Przyklad III. Wytwarzanie 9-(2-formylooksy- ~3-i*)nylo)hipoksantymy, NPT 15 467. 30 g (0,104 mola) erytro-5-amino-4-chloro-6-(2- -hydroksy-3-nonyloamino) pirymidyny rozpuszcza sie w 300 ml 98%< kwasu mrówkowego i ogrzewa w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 34 godzin. Po oziebieniu, mieszanine reakcyj¬ na wylewa sie do 500 ml wody z lodem, odsacza wydzielony osad i przemywa go oziebiona woda.Uzyskuje sie 28,8 g (74,8%) produktu (wzór 5) o temperaturze topnienia 218—219°C, który po dwu¬ krotnej krystalizacji z mieszaniny etanolu i wody wykazuje temperature topnienia 219—220°C. Pro¬ dukt ten w widmie w nadfiolecie wykazuje pasmo maksymalnej absorpcji przy dlugosci fali X = 249,5 Xetanol). W widmie w podczerwieni posiada na¬ stepujace pasma absorbcji (KBr): 3100, 2950, 2850, 1720, 1210, 1170. W widmie magnetycznego rezo¬ nansu protonowego NMR (DMSO-de) wykazuje na¬ stepujace sygnaly: 12,23, szerokie (1H), zanika po dodatku DjO, 8,25 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 5,39—5,21 (m, 1H), 4,79—4,58 (m, 1H), 2,52—1,98 imafcowe: M+ — 306.Analiza elementarna: dla wzoru C15H22N4O3: obliczono: C 58,80%, H 7,23%, N 18,28% znaleziono: C 58,82%, H 7,22%, N 18,24% Przyklad IV. Wytwarzanie 9-(2-propionylo- oksy-3-nonylo) hipoksantyny, NPT 15 477. 1 g (3,6 milimoli) erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo) hipoksantyny, 5 ml (30 milimoli) bezwodnika pro- pionowego i 10 ml pirydyny miesza sie w tempe¬ raturze 25°C w ciagu 48 godzin. Po oziebieniu w lazni lodowej, dodaje sie 5 ml metanolu i z calosci oddestylowuje lotne skladniki pod zmniejszonym cisnieniem. Nastepnie dodaje sie dwukrotnie po 20 rnl metanolu i powtarza za kazdym razem od¬ destylowanie pod zmniejszonym cisnieniem. Olejo¬ wa pozostalosc przeprowadza sie w cialo stale za pomoca 30 ml eteru etylowego. Produdkt saczy sie, przemywa dwukrotnie po 20 ml eteru etylowego, nastepnie 20 ml wody, suszy pod zmniejszonym cisnieniem i krystalizuje z octanu etylu. Otrzymu¬ je sie 0,35 g (29%) produktu (wzór 6) o tempera¬ turze topnienia 122—124°C. Temperatura topnienia nie ulega zmianie po dwóch kolejnych krystaliza¬ cjach. Widmo w podczerwieni (KBr): 3450, 3100, 3000, 1740, 1710, 1210 cm—1. Widmo magnetycznego Tezonansu protonowego NMR (DMSO—de): 12,32 {pasmo szerokie, zanika po dodatku E^O), 8,23 (m, 1H), 2,26 (°+, 2H), 1,92 (m, 2H), 1,16—0,99 (m, 19H), 0,79 (t, 3H).Analiza elementarna dla wzoru C^H^N^: obliczono: C # 61,05%, H # 7,84%, N # 16,75% znaleziono: C # 60,94%, H#7,82%, N# 16,22% Przyklad V. Wytwarzanie 9-(2-propylokarbony- looksy-3-nonylo) hipoksantyny, NPT 15 483. 1 g (3,6 milimola) erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo) hipoksantyny, 5 ml (30 milimola) bezwodnika kwa¬ su maslowego i 10 ml pirydyny miesza sie w tem- 20 30 peraturze 25°C w ciagu 48 godzin. Po oziebieniu w lazni z lodem dodaje sie 5 ml metanolu i calosc poddaje oddestylowaniu lotnych skladników pod zmniejszonym cisnieniem. Nastepnie dwukrotnie 5 dodaje sie po 20 ml metanolu, za kazdym razem powtarzajac oddestylowanie lotnych skladników pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc zestala sie za pomoca dodania 50 ml eteru etylowego i o- ziebienia. Produkt saczy sie, przemywa 20 ml ete- 10 ru etylowego i 20 ml wody, po czym suszy pod zmniejszonym cisnieniem i krystalizuje z miesza¬ niny metanolu i wody. Otrzymuje sie 0,95 g (76%) produktu (wzór 7) o temperaturze topnienia 168 —169°C. Próbke dla celów analitycznych trzykrot- 15 nie krystalizuje sie z mieszaniny metanolu i wody.Produdkt taki wykazuje temperature topnienia 170—171°C, w widmie w nadfiolecie maksymalna absorpcje przy JL = 248 (etanol). Widmo magne¬ tycznego rezonansu protonowego NMR (DMSO — de): 12,32 (szerokie, 1H, zanika po dodatku D2O), 8,23 (s, 1H), 8,05 (S, 1H), 5,27^5,15 (m, 1H), 4,67^4,56 (1H), 2,25 (t. 3H), 2,18 (m, 2H), 1,51 (°+, 2H), 1,4— 0,78 (m, 17H).Analiza elementarna dla wzoru C18H2gN403: - obliczono: C # 62,04%, H # 8,10%, N # 16,08% znaleziono: C # 61,91%, H#8,03%, N# 16,18% Przyklad VI. Wytwarzanie 9-(2-N-karbony- looksybenzyloglicynylooksy-3-nonylo) hipoksantyny. 0,7 g (2,5 milimola) erytro-9(2-hydroksy-3-nonylo) hipoksantyny, 0,53 g (2,5 milimola) N-karbonylook- sybenzyloglicyny i 0,55 g (2,6 milimola) dwucyklo- heksylokarbodwuimidu rozpuszcza sie w 10 ml 35 pirydyny. Nastepnie dodaje sie jedna krople kwa¬ su etanosulfonowego i calosc miesza w tempera¬ turze 25°C w ciagu nocy. Nastepnie oddestylowuje sie lotne skladniki pod zmniejszonym cisnieniem, dodaje 30 ml octanu etylu i odsacza wytracony 40 dwucykloheksylomocznik. Przesacz przemywa sie 5% kwasem solnym (50 ml) i 5% wodnym roztwo- rem weglanu sodowego (50 ml), po czym suszy nad bezwodnym siarczanem magnezowym i roz¬ puszczalnik oddestylowuje sie pod zmniejszonym 45 cisnieniem. Pozostalosc krystalizuje sie z miesza¬ niny octanu etylu i eteru etylowego. Otrzymuje sie 0,5 g (42,7%) produktu (wzór 8) o temperaturze topnienia 135—140°C. Dla celów analitycznych próbke produktu trzykrotnie krystalizuje sie z mie- w szaniny octanu etylu i eteru etylowego. Produkt ten wykazuje temperature topnienia 137—140°C.Widmo magnetycznego rezonansu protonowego NMR (DMSO —d6): 12,02 (szerokie, 1H, zanika po dodaniu I^O), 8,24 (s, 1H), 8,06 (d, 1H), 7,37 (t, 1H), 55 7,36 (s, 5H), 5,28—5,16 (1H), 5,06 (s, 2H), 4,62 (m, 1H), 3,75 (d, 2H), 1,99 (m, 2H), 1,15—1,04 (m, UH), 0,79 (t, 3H).Analiza elementarna dla wzoru CuHuNsOs.* obliczono: C # 61,39%, H # 6,65%, N # 14,92% M znaleziono: C # 61,30%, H#6,49%, N# 14,91% Przyklad VII. Wytwarzanie 9-(2-D,L-N-kar- bonylooksybenzyloalanylooksy-3-nonylo) hipoksan¬ tyny. tt 2,1 g (7,5 milimoli) erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)a hi)^s*htyny, 1,7 g (7,6 millmela) D,L-N-karbony- lóxri^be^zyloalanln? i 1,65 g (« milimoli) dwueyk* leneksyiokarbodwuimidu rozpuszcza sie w 30 ml piry&^ny i dodaje Jedna krople, kwasu elanosulfo- nttwege. Calosc miesza sie W temperaturze 29°C w ci^gu nocy. Pod fcmn&jszohyni cisnieniem odde- styfowuje sfe lotne skladniki i dodaje 100 ml ecta- nti etjfcfr, fe© czym oducza wytracony dwucjitlo- hefcfryiomoeznife. Przesacz przemywa sie 5% trwa¬ sz soinytn (100 *al) i 5% wodnym róztwofcem weglanu sodowego (160 ml), suszy nad bezwodnym slar&ranem magnezowym i rozpuszczalnik odde^ s^Jow&Je sie pod Umniejszonym cisnieniem. Pozo- stiftafe kryfetasKfcuje sie z mieszaniny octanu etylu i tbetanbhi. Otrzymuje sie 1,15 g (45,5%) frroduklte (wzór f) o temperaturze topnienia 177^180°C. "W celacn aiiaMycznych prebke ftroffufctu trzykrotnie krystalizuje Sie z mieszaniny octarau nolu. PródijAk ten wyfcafcuje temiperatuTe :to^nienia 1*5—1«^C. ^Midnlo n^aten^yeiaiego readnansu pro¬ tonowego tftilH '01\tóÓ —d«): 1^33 (szeroki, iH, zamka po dookriiu DgÓ), ^32 (s. 1H), 8;05 7,8 *d, 1H), 7,36 i(s, 5H), 5,25^5,13 (m, 1H), 5;06 (s, 2H), 4,58 l,2fl—0^9 ^14n), !0,78 (t, 3H).Analiza elementarna dla wzoru CoH^N^Os: obliczono: C # 62,09%, H # 6,88%, N # 14,48% znaleziono: C # 62,00%, H # 6,W%, N# 14,44% P r z y k l a d VIII. Wytwarzanie dwuestru o-by- aróKsyfenylowó*3*(5-hipoksantyno) nonylowego 2- kwasu fosforowego (Porównaj: T. A. Khwaja i U. B. Reese, Tetrahedron 27, 6189 (1971) oraz T.A.Khwaja, C.-B. Reese i J.C.M. Stewart, J. Chem.Soc. (G), 2092 (1970).B^ztwor d,«62 g (3,3 milimoli) chlorku kwasowe¬ go dwuestru ó-fehylenowego kwasu fosforowego w $ ml acetoriitrylu, W czasie mieszania dodaje sie do zawiesiny 0,834 g (3 milimole) erytro^-^^iy- ditiksy-^-nonyló) hipoksantyny, 0,101 g (3 milimole) trójetyloaminy w 8 ml acetonitrylu. Calosc miesza sie W ciagu nocy w temperaturze 25PC, £rzy czym, po 15—#0 minutach mieszania otrzymuje sie jed¬ norodny roztwór. Nastepnie w czasie mieszania do¬ daje sie 3 ml wody i mieszanie koMynttnije sie w 9 094 32 ciagu 15 minut. Wytraca sie osad o barwie bialej..Dodaje sie dodatkowo 20 ml wody i odsacza wy* tracony osad, przemywa go woda i metanolem.Otrzymuje sie 0,98 g <76% produktu (wzór 10) o temperaturze topnienia 191^185°C. Dla celów ana* litycznych próbke osadu krystalizuje sie z miecza- niny dwumetylosulfotlenku i metanolu. Otrzymana substancja wykazuje temperature topnienia 201-t- —$*3°C. W widmie w nadfiolecie maksymalna a sórpcje wykazuje przy dlugosci lali h= £50 teta»o£k Biadowe potwierdza widmo MMiR Analiza elementarna dla wzoru CajH^NjOeP: obliczono: C^53,3S%, H = 6,07%, N = 12,44%, P= «,8**s £ znaleziono: C=*= 53,83%, H = «;0&%, N = 12,27%, P — «,74% Zastrzezenia patentowe n 1. Sposób wytwarzania pochodnyen hydroksyal— kilopuryn o wzorze 1, w którym R1 oznacza grupe I rz. heksylowa, zas R* oznacza grupe formylowa* acetylowa, propionylowa, butyrylowa, sukeynylewa, N-karbobenzoksy-glicylowa, N-karbdbenzoksy^ala- ^ nylowa lub reszte o-hydroksyfenylofosforano- wa, ftnamlenny lym, ze hydroksyalkilopuryne o wzorze 4, w którym H1 ma wyzej podane znacze¬ nie poddaje sie reakcji z bezwodnikiem lub halo¬ genkiem wlasciwego kwasu karboksylowego, chlo- w rofosforynem o-hydroksyfenylu lub z odpowiednim aminokwasem z zabezpieczona grupa aminowa. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 4, w którym R1 ma wyzej okre¬ slone znaczenie poddaje sie reakcji z bezwodnikiem kwasu mrówkowego, octowego, propionowego lul; maslowego. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 4, w którym R1-ma wy¬ zej okreslone znaczenie poddaje sie reakcji z bez¬ wodnikiem kwasu bursztynowego. 4. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 4, w którym R1 ma wy¬ zej podane znaczenie poddaje sie reakcji z gli¬ cyna, z odpowiednio zabezpieczona grupa aminowa lub alanina w obecnosci dwucykloheksylokarbo— 45 dwuamidu. i129094 OH HC-CH-CH3 R1 OR? Wzór 1 OH N U, *rr^N H H-C — C-CH3 (CH2)5 O-C-CH3 I " CH3 ° Wzór 2 OH fxN s*r^ H HC —C-CH3 I I (CH2)5 0-C-CH2-CH2-C-0H CH3 0 Wzór 3 OH I HC-CH-CH3 I, I R1 OH Wzór U V VSjT 0-C-H C6H,rCH-CH-CH3 Wzór 5 OH CC VSr 0-CO-CH2-NH-CO-0 UgHi^UH-UH UH3 Wzór 8 OH Nx O-CO-CHrCHj C6H,3-CH-CH-CH3 Wzór 6 OH N N, II • CH3 W O-CO-CH-NH-CO-O II C|^z Wzór 9 O -r O-CO-fCHJrCH, C6H13-CH-CH-CH3 OH N^ °%_/° "^hT O"" NOHOH I l (C 6Hi3~CH—CH CH3 zo Wzór 7 Wzór 10 PL PL