CS235514B2

CS235514B2 - Method of hydroxyalkylpurine esters production

Info

Publication number: CS235514B2
Application number: CS811846A
Authority: CS
Inventors: Lionel N Simon; Alfredo Giner-Sorolla; Alvin Guttag
Original assignee: Newport Pharmaceuticals; Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1980-03-14
Filing date: 1981-03-13
Publication date: 1985-05-15
Also published as: PL129094B1; PL230115A1; KR830005224A; KR850000320B1; YU41973B; CA1159827A; IL62258A; YU65181A; IN155441B; HU187324B; JPS572287A; EP0036077B1; NO155579B; PH19148A; PT72665A; RO82509B; AU535052B2; DK115081A; DE3165476D1; EP0036077A3

Description

R* znamená ilkanoyiovou skupinu s 1 iž 5 itomy uh-íku, která je popřípadě v poloze Ω substituováni karboxylovou skupinou nebo ilkinoalovou skupinu se 2 iž 5 itomy uh.íku, která je substituoviná v poloze iiminoskupinou·

Sloučeniny podle vynálezu jsou imimomodulááory, omií účinek proti . virům i proti nádorůo, zvláětě intlleukemlcký účinek i jsou tiká inhibitory enzymů. Tyto sloučeniny se mohou používat tiké k zivedení odpovídaiícího ilkoholu do biologických systémů, v některých přípidech se.zvýěeným účinkem.

⁴

Kyselinová část ořlastlvovaná llkláoalovku skupinou R* může být nipříklid odvozeni od . nesubstituoviných ilifaticých monnkaibojxlových kyselin s 1 iž 5 itomy uh.íku, jiko od kyseliny oravennč, octové, propl^nové, mááslné, vilkové, nebo od áltubbtotukvlných ιΙΙΓβ^Ι^^ aikarbkxylkvých kyseHn, napříklid od kyseliny malonové, fuouOvé, οο^Ι^vé, ji^ti^vé, glutirové i rovněž kyseliny uhičité. S atkarbkxylovýoi kyselinimi se obvykle tvoří poloestery, jiko je hnoiinmionáá, hemifummiáá, hnoimoieát i ' stejně jiko. oβl^цгlkarbknát i ethyl Си^пИ.

Skupini R * může být tiké odvozeni od iminokurboxylové kyseliny nebo aгkomtocké karbkxylové kyseliny.

Způsob výroby esterů hy<aro)χralaalouriáů obecného vzorce I je zi-ožii ni o eobě známém způsobu i spočívá v tom, ži se nechá reigovat hydro:χyalayjp^u’iá obecného vzorce II kde

OH

R¹ OH (II)

R¹ má výěe uvetoný význam^, s kyselinou кdaoкídaljcí llkaáoykovéoe zbytku nebo s jejím m^dridem, zi vzniku sloučeniny obecného vzorce I.

И51' výhodném způsobu se jiko výchozí látky ponuce hydro]qfalaal0¹u?iáů obecného vzorce II, ve kterém ^r1 záameá^á Hxylovou staptau s p^^mý^o řetězcem.

Způsob podle vynálezu se účelně provádí tik, ži se hadrkxyalLkrloιu'iá nechá reigovat N-aárbkblnzkχaglycineo nebo N-aarbobeázo:χyaliáineo v p^íokoňkoto aiiaklkhexalklrbkaiimiae i potom se N-alrbobeáZkχytkupiál odstriní hydrolýzou.

Je potvrzenou skutečností, že mnozí zprostředkovatelé infekcí, jako jsou viry (virus chřipky, HSV, Friend leukemia virus), bakterie a plísně, způsobují potlačení imunního stavu hostitel*, oslabujíc jeho obranu proti nákazám způsobeným zprostředkovateli Infekcí. Mnohé druhé protivirové antimetabolické látky, jako AraC, potlačují obranný imunní mechanismus hostitele a tím mocně působí na oslabení jeho tělesného přirozeného obranného mechanismu a zvyšují druhotnou nákazu.

Imunopotenciátor neboli imunomodulátor je přípravek, který bu<3 obnovuje zeslabenou imunní funkci nebo zvyšuje normální imunní funkci nebo má obě tyto funkce. Imunní funkce je definována jako vývoj s vyjádření humorální {protilátkou zprostředkované) imunity, buněčně (thymocytem zprostředkované) imunity nebo makrofagy a granulocyty zprostředkované odolnosti. Tak logicky zahrnuje přípravky působící přímo na buňky zahrnuté ve vyjádření imunní odezvy nebo buněčné a molekulární mechanismy, které naopak způsobují změnu funkce buněk nahrnutých do imunní odezvy. Zvětšení imunní funkce může být výsledkem účinku přípravku к odstranění potlačujícího mechanismu odvozeného od účinků negativní zpětné vazby endogenní nebo exogenní к imunnímu systému. Imunní potenciátory mají různé mechanismy účinku. Vzdor rozdílnosti umístění buňky při účinku a biochemickému mechanismu účinku imunopotenciátorů, jejich použití jsou v podstatě stejné, to jest ke zvýšené odolnosti hostitele.

Použití imunopotenciátorů

1) Základní ochranná funkce imunního systému se vztahuje к odolnosti proti napadení patogenními organismy, mezi které se zahrnují viry, rickettsie, mykoplesmy, bakterie, houby a paraziti všech typů. Tak zlepšení imunní odezvy zvláště když je snížená, by pochopitelně zlepšilo odolnost proti nákaze nebo zamoření kterýmkoliv ze shora uvedených patogenních organismů. Samotný imunopotenciátor nebo v kombinaci s protiinfekční terapií se může používat při některé nebo všech infekčních chorobách.

2) Za druhou ochrannou funkci imunního systému se pokládá odolnost к transplantaci tkání cizího původu, buď přírodního, jako plodového mateřského původu nebo umělého, jako provedeného transplantování lékařem. Imunopotenciátory se mohou také použít к tomu, aby se usnadnilo vyjití plodových tkání nebo tkáně mateřského lůžka,nebo aby se modifikovala,nebo vzbudila tolerance к transplantované tkáni.

3) Za třetí ochrannou funkci imunního systému se považuje odolnost к zhoubným buňkám vyvinutým jako rakovina. Imunopotenciátory se mohou použít к ošetřování rakoviny tím, Že se zvyšuje odmítání zhoubného nádoru a potlačuje se možnost opakování nádoru po jiných formách terapie.

4) čtvrtá ochranná funkce zahrnuje schopnost rozpoznat cizí a udržovat vlastní nereaktivnost pozitivními potlačovacími mechanismy. Při autoimunních a příbuzných chorobách je imunní reaktivita zaměřena na vlastní antigeny, nebo nadměrné zvýšené odezvy jsou zřejmé jako samodestruktivní. Imunopotenciátory se mohou používat к obnovení normálních tlumicích mechanismů, působících snášenlivost, nebo jinak mohou podporovat normální imunní odezvu.

Každá z ochranných funkcí imunního systému se může změnit nespecifickou terapií se samotnými imunopotenciátory nebo v kombinaci s jinými prostředky používanými ke zlepšení odolnosti nebo к usmrcení patogenů způsobujících napadením

Kromě toho specifická odolnost se může zvýšit za použití imunopotenciátorů ve spojení 8 některými formami antigenu, jako při použití vakcíny, například viru, nádorových buněk a podobně. Toto použití může vést bud к specifické imunitě nebo snášenlivosti. Snášenlivost se může dosáhnout například za použití antigenu při alergii nebo autoimunním onemocnění. Použití imunopotenciátorů může být bud terapeutické nebo profylaktické, přičemž profylaktické použití je vhodné zvláště ve stadiu, když infekce, autoimunita a rakovina jsou obecnější.

Stanovení doby a cesty podání se může měnit a může být rozhodující při stanovení výsledků, zda se dosahuje kladné nebo záporné odezvy· Každý přípravek, který je schopný zvětšit imunní odezvu, může jí potlačit v závislosti na době podání a dávce a tak, za určitých podmínek,by mohl být imunopotenciátor použit jako přípravek ke snížení imunity, pro použití při alergii, autoimunitě a transplantaci·

Základní alkohol, kde R¹ značí hexyl, jc erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)hypoxanthin a ten byl testován pod identifikačním číslem NPT 15392. Mezi sloučeniny podle tohoto vynálezu patří erythro-9-(2-acetoxy-3-nonyl)hypoxanthin (identifikován jako NPT 15458, viz příklad 1), erythro-9-(2-sukcinoxy-3-nonyl)hypoxanthin (identifikován jako NPT 15457, viz příklad 2) a erythro-9-(2-fosfát-3-nonyl)hypoxanthin.

Další sloučeniny podle vynálezu zahrnují například takové, které jsou uvedeny v tabulce 1 . V této tabulce alkylová skupina R¹ znamená vždy n-alkyl.

Tabulka 1

R¹	R²
^C6^H13	0 CH₃CH₂Íj-
^C6^H13	0 CH₃CH₂CH₂Č-
^C6^H13	0 ^CH3^(CH ₂)₁₄C-
^C6^H13	0 CH₃(CH₂)₁₆C-
^C6^H13	0 CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇C- (cis)
^C6^H13	§ HOOCCH₂C-
^C6^H13	0 HOOCCH=GHG- (cis)
^G6^H13	0 HOOCGH=CHC- (trans)
	0
^C6^H13	HOOCCH₂CH₂C-
^C6^H.3	0 HOOC(CH₂)₃C-
^C6^H13	0 CH₂(NH₂)C-
^C6^H13	0 CH₃CH(NH₂)C-
^C6^H13	Я H₂NC(=NH)NHCH₂CH₂GH₂GH(nh₂)c-
	0
^C6^H13	H₂N(CH₂)₄CH(NH₂)£-
^C6^H13	0 CH₃SCH₂CH₂CH(NH₂)C-
^C6^H13	0 (CH₃)₂CHCH₂CH(NH₂)G-

pokračování

R¹

C⁶«¹³

Cflj ^Сб‘⁴¹³ ^C6^H13 •РО₃ ^н ₂ •N0₂

CH.CH ^J ^(acetal acetaldehydu) <Έ^Η1³ glukosid

C^6H1³ ribosid ^C6»¹³ fruktosid

C^6H1³ msamosíd ^C6«13 rhamnosid xylosld ^СбН1³ galaktosid ^C6^H13

СН3 arabioosid

II сн₃ссн₃

HO3CCHhCH₂cC ^СН3 glukosid

СН3 ^CA

-Р0зН₂0

СН38C2H5

Н00ССН₂СН₂СC2H5 glukosid

C^3H7

II СН3С°³«7

H00CCH2CH2C

Tabulka 1 - pokračování

R¹	R²
c₄H₉	0 II CHjC-
^C5^H11	0 ll CHjC-
^C5^H11	0 H00CCH₂CH₂C-
с₅н_п	glukosid
с₅и_п	-řO₃ ^H ₂
^c ₇H,₅	0 lf CHjC-
^C7^H15	0 H00CCH₂CH₂C-
^C7^H15	glukosid
^C8^H17	0 и CHjC-
^C8^H17	0 HOOCCH₂CH₂C-
^C8^H17	glukosid
^C8^H17	-P0₃ ^H ₂

Pro NPT 15392 bylo již dříve doloženo, že má protivirový imunomodulační účinek a účinek proti nádorům.

Výsledky zde předkládané dokládají, že

1) se mohou vyrobit nové deriváty NPT 15392, které se

2) mohou převádět v biologických systémech na účinnou látku (NPT 15392),

3) vedou к vyšší úrovni účinných látek (NPT 15392) v krvi a proto se zvyšuje účinek NPT 15392.

Následující tabulka shrnuje chemické vlastnosti některých sloučenin podle vynálezu.

Tabulka

Chemické vlastnosti representativních příkladů sloučenin uvedených v předmětu vynálezu

	Teplota tání	Analýza
&rr ttwo-9- (2-acetoxy-3-oonnl )-		Vypočteno	Nalezeno
hy^oxanthin (NPT 15458^)x	15C-151 °C .	C 59,97	59,83
		H 7,55	7,42
		N 17,48	17,39

ErytluO-9-(2-sukcino:iQr-3-nonyl)-

hypoxanthin	(NPT 15457)*x	-		-
	λ max/λ max	10³	λ min
pH 1,0	pH 7	pH 9,5	pH 1	pH 7
250/9,7	249,5/10,	,1 254,/10,06	* 220	222,5
250/-	249/-	254/-	222	223

x Vysokotlaká kapalinová chromaatgrrďie (HPLC) - jediný UV pík na sloupci 5 Spherosorbu

ODS 2,1 x 250 mm, · za použití 65% mmthanolu jako rozpouštědla: 35% 0,05 M xx Jediný UV pík na sloupci 5 ^m Ultraspheru ODS 4,6 x 250 mm za pouuití 65% · mmthanolu jako rozpouštědla: 35% 0,05 M ^PO*.

ImirnopooencCátory podle vynálezu se mohou používat například k dosažení odoonosti při napadení viry uvedenými v tabulce A.

Tabulka A

Virus	Třída	Nemoc
Arenavirus	RNA	Rift Valley
Chřipky	RNA	Chřipka
Riinovirus	RNA	Obecné nadhLazení
Polio	RNA	Polio
Spalniček	RNA	Spalničky
Virus Newccssiské choroby	RNA	Newccasiská drůbeží choroba
Rotavirus	. RNA	GasSrosn0eeitids u dětí
Heepaiiis typ A	RNA	Infekční heplSitids
Vztekliny	RNA	Vzteklina
Arbovirus	RNA	ElocfaSitids
Vaacinia	DNA	Neetovice
Herpes Simplex	DNA	EюceaSietds, syfilis
HHrpes Zoster	DNA	Pásový opar
VvsíícIIs Zoster	DNA	Plané neštovice
Adenopirus	DNA	Zánět cest dýchacích
^pSUÍs typ B	DNA	Clwonická hopsaHi-da, Seyrθheppstetds
Virus zlй8obbšjcí bIío-	DNA	Slinlavka a kulhavka
tavku a kulhavku
Machupo	DNA	Celení krve

Sloučeniny jsou zvláště vhodné proti RNA virům.

Sloučeniny a prostředky podle vynálezu.jsou vhodné k ošetřování savců (buněk savců), včetně člověka, vepřů, psů, koček, skotu, koňů, ovcí, koz, máš, králíků, krys, morčat, křečků, opic a podobně.

Pokud není uvedeno jinak, všechny díly a procenta jsou míněny hmoonootně.

Pokud není uvedeno jinak, všechny teploty jsou ve stupních Celsia.

Prostředky mohou zahrnovat, v podstatě sestávat z uvedených maaeečálů, Způsoby mohou zahrnovat, v poddtatě sestávat ze stupňů, které se prováddj s uvedenými maaeeiály.

Prostředky se mohou podávat savcům obvyklou technikou, například orálně, nesálně, rektálně, vaginálně nebo parmterálně. Mohou se používat jako roztoky pro injekce, například ve vodě, nebo jako tablety, pilulky, kapsle a podobně.

Dále se uvádí popis výhodného provedeni.

•Příklad 1

Syntéza ečythčo-9-(2-ace^,tom3“ⁿonyl)-lyprxaothinu (NPT 15458) (acetylnonylhypoxanthinu) vzorce

OH

H-C-C-CHo

I I (chJo — C— CH

1*1 ch₃ o

2,78 g (10 mmo) . . ečythčt-9-(2-)yrdčoxy’3-nonyl)lvptxanthins, NPT 15392 se rozpustí ve 120 ml pyridinu a přidají se 3 ml (30 mmo) anhydridu kyseliny octové. Roztok se udržuje za teploty 25 °^C 24 hodiny. Potom se ^při^dá 50 ml et-hanolu a rozto^k se o^dpt^ař:^í 'do suc^ha za sníženého tlaku. Tento postup se opakuje čtyřikrát, aby se odstraní pyridin. . K odparku se přidá 150 ml etheru a výsledná pevná látka se získá filtrací. Sraženina se třikrát promyje etherem. Získá se tak bílý krystalický ^aat^e^r^j^l o hmotrtosti 2,51 g (80 %, který má Uplota tání 150 až 151 °C. UV_max (Η₂Ο, pH 5^,5) 249 nm. /° 10,1 x 10³, IČ 1 700 cm“' (C=O).

Aialýza pro C^^^N^O-p vypočteno: C 59,97 %, H.7,55 %, N 17,48 %, nalezeno: CC 59,83.%, H 7,42 %, N 17,39 %.

Vzestupná chrtInoatorrfil (papír Whatman +1), hodnota ..: n-butanolHHcC/AcOH (2:1 : 1) = = 0,92; ethanoV 1 ' M octan amonný (14 : 6) = 0,88;

isopropylalkohol/konc. ammniak/HHO (7 : 2 : 4) = 0,90.

Příklad ' . 2 ..

Syntéza erythro^-íí^-u^lcc!n^c^2y-^^i-^nonyl.hiy^p^oxanthin (sskcinylntnylhypoxanthinu) (NPT 15457) vzorce

OH

HC—C — CH

JI (CH-Je O—C-CH, - CH, — C —OH | II II

CHg O O

600 mg (2,2 mol) erythro-9-(2-lyfdroxy-3-nonyl)hypoxanthinu (NPT 15392) a 1 g (10 mmO) anhydridu tyseliny Jantarové se rozpuutí za míchání v minimálním objemu pyridinu. Roztok se opatrně zahřívá (přibližně na 30 °C) za nepřetržitého míchání po dobu 10 dnů.

Na rotační odparce se odstraní ' pyridin a odparek se extrahuje 20 ml absolutního ethanolu po dobu 48 hodin. Tento roztok se odstředí a horní vrstva se čistí preparativní chromátografií na tenké vrstvě (2 mm silikagelu 60, n-butanol : 2 N hydroxid amonný = 10 : 2, objemooě). Pás při Rf = 0,17 se eluuje v absolutním ethanolu. Čistota produktu se zjistí chromatoograií na tenké vrstvě (TLC) a UV spektrofotomtrií.

Chemická stabblita

Údaje uvedené v tabulce 3 jasně doJk^j^ť^e^ají, že estery NPT 15458 a NPT 15457 jsou stabilní, pokud se inkubuuí za teploty 37 °C a neutrálního pH (7,0, fyziologická hodnota). SlkiteČnoot, že hydrolýzou bazických podmínek je možné provést jak acetyl- (NPT 1545S), tak sukeinylester (NPT 15457) na NPT 15392 je dalším potvrzením jejich struktury.

Tabulka 3 /

Účinek změny pH na . chemickou stabilitu acetoxynonylhypoxanthinu (NPT 15458) a sukkinonylhypoxanthinu (NPT 15457)

Sloučenina (koncentrace)	P^H	% NPT 15392^:
NPT . 15392 (0,36 ^uO.)	1.0	100
(kontrolní stanovení)
	7,0	100
	9,5	100
NPT 15457 (0,36 yUUml)	1,0	2
	7,0	0
	9,5	8
NPT 15458 (0,36 ^/ml)	1,0	8
	7,0	0
	9,5	28

^x 3,5 hodi^{nová inkub}ace ^za teploty ³⁷ °^C, stanoveno za pouští v^yso^kotlak^{é k}apalinov^é chrooatoogitie.

Příklad 3

Syntéza 9-(2-formiát-3-nonyl)hypox8nthinu (MV IV-233)

Postup výroby vyjadřuje vztah

Cl

OH

I

HCOOH

OH

qgrtjjCH — ch — CH3

Cg^CH-CH-C^ /m. hm. 278,35/ /m. hm. 306,36/ g (0,104 ool) erythro-5-amino-4-chlor-6-(2-yddoo;)yr33-oorylaMino)pyrimidinu se rozpustí ve 300 ml 98 % tyselioy mravenčí a zahřívá pod zpětným chladičem 34 hodiny. Reakční směs se po ochLazení vylije na 500 Ol ledové vody, sraženina se shromáždí a promyje studenou vodou. Výtěžek činí 28,8 _ g (74,8%), teplota tání: 218 až 219 °C, po dvojnásobné retoystalizaci ze soiěi ethylalkoholu a vody teplota tání vzroste na 219 až 220 °C.

= 249,5_ (C^0H)( ΐδ (KBr) : 3 100, 2 950, 2 850, 1 720, 1 210, 1 170.

NMR (d⁶ - DMSO) : 12,23 (Siro^ (1H), Mizí a D₂0)^, 8^,25 S UH^ 8^,22 S (1H), 8^,07 S (И)^,5,39 - 5,21 sl. (1H), 4,79 - 4,58 sl. (1H). 2,52 - 1,98 sl. (2H), 1,14 - 1,07 sl. (11 H) 0,79 t (3H).

M.S.M* = 306

Analýza pro ^С15^Н22^М4°з:

vypočteno: 58,80 % C, 7,23 % H, 18,28 % N, nalezeno: 58,82 C, 7,22 % H, 16,24 % N.

Příklad 4

Syntéza 9-(2-propionát-^-nonyDtypoxanthinu (AQM 1-151) SK 31,141 Postup výroby vyjadřuje vztah

OH

CgHflCH-CH-C^

OH

CgH^-CH-CH —CH3 /o. hm. 278,35/ /o. hm. 334,43/ g (3,6 mnol) erythro-9-(2-)yfdroxy-3-oonyl))цrpoxanthiou, 5 ml (30 m^oi) aotydridu kyseliny propionové a 10 ml pyridinu se míchá za teploty 25 °C po dobu 48 hodin. Po ochlazení na ledové lázni se přidá 5 ml methylalkoholu a směs se odpaří za sníženého tlaku. Opět se přidá dvakrát 20 ml metyl alkoholu a provede odpeďení. Olejovitý odparek ztuhne přidáním 30 ml ethyletheru. Produkt se odfiltruje a dvakrát pro^je 20 ml ethyletheru, 20 ml vody, suěí ve va^kuu a rekrystaluje z et,hylace^tátu. ^Výt^ěže^k Činí ^0,35 g ⁽²⁹ %. Teplot^{a tá-}í ^{122 až 124} °^Cse po dalších dvou rekrystalizacích -ezoění.

(KBr) : 3 450, 3 100, 3 000, 1 740, 1 710, 1 210.

NMR (d⁶ - DMSO) : 12,32 (Široký, (1H), zmizí s D₂0), 8,23 S (1H), 8,05 S (1H),

5,25 - 5,13 sl. (1H), 4,67 - 4,56 sl. (1H), 2,26 5 (2H), 1,92 si. (2H), 1,16 - 0,99 sl. (19M), 0,79 t (3H).

Analýza pro ^C17^H26^N4°3^:

Vypočteno: 61,05 % C, 7,84 % H, 16,75 % N, nalezeno: 60,94 % C, 7,82 % H, 16,22 % N.

Příklad 5

Syntéza 9~(2-butyrát-3-nonyl)hypoxanthinu (MV IV-292)

Postup výroby vyjadřuje vztah OHOH ^N\\ (CHjICH^CO^O / pyrid i n L jl / ___ l/ OH ,C

III i

CH-CH—CH₃ c₆H₁₃- CH-CH-CH₃

278,35/ /m. hm. 348,43/ o-co-(ch₂)₂-ch₃ g (3,6 mmol) erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)hypoxanthinu, 5 ml (30 mmol) anhydridu kyseliny n-máselné a 10 ml pyridinu se míchá za teploty 25 °C po dobu 48 hodin. Po ochlazení na ledové lázni se přidá 5 ml methylalkoholu a směs se odpaří za sníženého tlaku. Opět se přidá dvakrát 20 ml methylalkoholu a provede odpaření. Olejovitý odparek ztuhne přidáním 50 ml ethyletheru a ochlazením. Produkt se odfiltruje a dvakrát promyje 20 ml ethyletheru, 20 ml vody, suší ve vakuu a rekrystaluje ze směsi methylalkoholu a vody. Výtěžek činí 0,95 g (76 %), teplota tání: 168 až 169 °C.

Vzorek pro analýzu se připraví trojnásobnou rekrystáližací ze směsi methylalkoholu a vody. Teplota tání činí 170 až 171 °C.

^{s X}max. = ^{248 (C}2^H5^OH)·

ЫМН (d⁶ - DMSO) : 12,32 (Široký (1H), zmizí s D₂0), 8,23 S (1H), 8,05 S (1H), 5,27 -5,15 el. (1H), 4,67 - 4,56 (1H), 2,25 t (3H), 2,18 sl. (2H), 1,51 ? (2H), 1,4 - 0,78 sl. (17H).

Analýza pro C3^28¾°3^: vypočteno: 62,04 % C, 8,10 % H, 16,08 % N, nalezeno: 61,91 % C, 8,03 % H, 16,18 % N.

Příklad 6

Syntéza 9-(2-N-karbobenzoxyglycinát-3-nonyl)hypoxanthinu (AGM 1-161)

Postup vyjadřuje vztah

OH

N, CBZ-Gly OH / pyridin N OH DCC I 1 ^C6^H13“^CH“^CH“^CH3

/m. hm. 469,55/ /m. hm. 278,35/

0,7 g (2,5 mmol) erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)hypoxanthinu, 0,53 g (2,5 mmol) N-karbobenzoxyglycinu a 0,55 g (2,6 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) se rozpustí v 10 ml pyridinu. Po přidání jedné kapky kyseliny ethansulfonové se směs míchá přes noc za teploty 25 °C.

Po odpaření za sníženého tlaku se přidá 30 ml ethylacetátu a výsledná sraženina dicyklohexylmočoviny se odfiltruje. Filtrát se promyje 50 ml 5% kyseliny chlorovodíkové a 50 ml 5% roztoku uhličitanu sodného. Roztok se suší síranem hořečnatým, odpaří se za sníženého tlaku.

Odparek se rekryetaluje z ethylacetátu a ethyletheru. Získá se 0,5 g produktu (42,7 %), teplota tání: 135 až 140 °C.

Vzorek pro analýzu se připraví trujndsobnsu rekrys*alizací ze směsi ethylacetátu a ethyletheru, jeho teplota tání činí 137 až 140 °G.

Ič (KBr)

NMR (d⁶ - DMSO) : 12,02 (Široký (1H), zmizí s DgO), 8,24 S (1H), 8,06 d (1H), 7,73 t (1H), 7,36 S (5H), 5,28 - 5,16 (1H), 5,06 S (2H), 4,62 sl. (1H), 3,75 d (2H), 1,99 sl. (2H), 1,15-1,04 sl. (11H), 0,79 t (3H).

Analýza pro ^C24^H31^N5°5^: vypočteno: 61,39 % G, 6,65 % H, 14,92 % N, nalezeno: 61,30 % C, 6,49 % H, 14,91 % N.

Příklad 7

Syntéza 9-(2-D,L-N-karbobenzoxyalaninát-3-nonyl>-hypoxanthinu (AGM 1-167) Postup vyjadřuje vztah \

DL-NCBZ-AIaOH

DCC pyridin ^C6^H13“^CH“^CH”^CH3 /m. hm. 278,35/

2,1 g (7,5 mmol) erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthinu, 1,7 g (7,6 mmol) D,L-N-karbobenzoxyalaninu a 1,65 g (8 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) se rozpustí ve 30 ml pyridinu a přidá 1 kapka kyseliny ethansulfonové. Směs se míchá přes noc za teploty 25 °G, odpaří za sníženého tlaku, přidá 100 ml ethylacetátu a výsledná dicyklohexylmočovina se odfiltruje. Filtrát se promyje 100 ml 5% kyseliny chlorovodíkové a 100 ml 5% roztoku uhličitanu sodného, potom suší síranem hořečnatým a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se rekrystaluje z ethylacetátu a methanolu. Získá se 1,65 g produktu (45,5 %), teplota tání: 177 až 180 °C.

Vzorek pro analýzu se připraví trojnásobnou rekrystalizací ze směsi ethylacetátu a methanolu, jeho teplota tání Činí 185 až 187 °C.

IČ (KBr)

NMR (d⁶ - DMSO) : 12,33 (široký (1H), zmizí s D₂0), 8,22 S <1HJ, 8?05 S <1H), 7,0 d (1H), 7,3ě S (5H), 5,22 - 5,13 sl. (1H), 5,06 3 (2H), 4,56 sl. (1H), 4,19 - 4,11 sl. (1H), 2,0 sl. (2H), 1,20-.0,99 (14H), 0,70 t (3H).

Analýza pro ^C25^H33^M5°5^: vypočteno: 62,09 % C, 6,88 % H, 14,46 % 4, nalezeno: 62,00 % C, 6,75 « H, 14,44 % N.

P ř íkl a· d β

Syntéza 9-(2-0-fenylenhdydrogenfosfát-3-nonyl)hyppoxanthinu (AGM 1-191)

Postup vyjadřuje vztah

(Porovnej T. A. Kwaja a C. B. Reese, Tetrahedron 27. 6189 (1971) a T. A. Kiwaaa, C. B. Reese a J. C. M. Stewart, J. Chem. Soc. (Cl, 2092 (1970)).

Roztok 0?662 g (3,3 mool) o-fenylenfosforoxychloridu v 8 ml acetonntrilu se přidá za . míchání k suspenzi 0,834 g (3 mmo) erythro-9-(.2-hyrdroxy-3-nonyl)-lyrpoxanthinu a 0,101 g (3 mol¹ trietí^lm^u v ⁸ ml aceto^trilu. Směs se míchá za teploty 25 °^{C p}řes noc, přičemž po 15 až 30 minutách se přemění v homogenní roztok. Poté se přidají 3 ml vody za míchání během 15 minut. Vysráží se bílá sraženina. P^:Ldá se dalších 20 ml’ vody a sraženina odfiltruje a promyje vodou i oothanoleo. Získá se 0,98 g produktu (76 %, teplota tání: 191 ^až 195 °C.

Vzorek pro analýzu se připraví reta^2^s^t^i^a^:iza^:í ze soOsi dioeethysulfoxidu i methylalkoholu. Jeho teplota t.ání ^čin^í 2°¹ a^{ž 203} °C ^{UV :} A°ax = ²⁵⁰ ‘W“

NMR (d^{6 -} DMSO)

Analýza pro ¢2^27^^^⁵vypočteno: 53,33 % C, 6,07 « H, 12,44 % N, 6,88 « P, nalezeno: 53,83 % C, 6,09 % H, 12,27 % N, 6,74 % P.

Protivirové vlastnosti

Schopnost ΝΡΤ 15457 a NPT 15458 pooiačit odezvu viru chřipky se stanovuje za použžtí hemoasorpční zkoušky. Jak může být zřejmé z tabulky · 4, výchozí droga NPT 15458, která se ' takřka úplně štěpí na NPT 15392 (aktivní droga), má podobnou schopnost potlačovat růst viru,, jako aktivní droga (NPT 15392). Ve skutečnootí se zdá, že'NPT 15458 může být nepatrně účirnněSí, pravděpodobně v důsledku větší nitrobuněčné'absorpce NPT 15458. U sukcinylového derivátu, který se negativně nabbjí při pH 7,2,by se neočekávalo, že vstupuje do buněk; tak snadno a může být při tomto postupu méně účinný.

Tabulka 4

P^iOv^ái^:í protivirových vlastností sukeinylnonylhypoxlnthinu (NPT 15-457) i acetoxynonyltypoxlnttinu (NPT 15458) s NPT 15392

Droga (g/1) % potlačení růstu viru chřipky

	0,36®	3,^6a	10,8®	361
NPT 15392 (kontrolní stanovení)	20	30	42	73
NPT 15457	18	0	18	13
NPT 15458	26	40	80	88

® Koncentrace v nmol/ml.

Imunomodulační účinek

Schopnost acetoxy- (NPT 15458) a sukeinoxyesteru (NPT 15457) sloučeniny NPT 15392 modulovat imunní systém jak in vitro, tak in vivo, se stanoví za použití následujících systémů :

1. Mitogenu zahrnujícího proliferaci lymfocytů za použití myších slezinných buněk (in vitro).

2. Mitogenu vyvolávajícího proliferaci lymfocytů za použití lymfocytů periferní lidské krve (HPBL) (in vitro).

3. Zvýšení tvorby aktivních roset (in vitro).

4. Zvýšení tvorby IgM protilátky u myší imunizovaných ovčími červenými buňkami krve (SRBC) (in vivo).

1. Údaje uvedené v tabulce 5 jasně dokládají schopnóst NPT 15458 zvětšit PHA vyvolanou proliferaci lymfocytů jak se stanovila při vnesení tritiovaného thymidinu. Při koncentraci NPT 15458 se pozoruje přibližně 25% vzestup. Podobný vzestup se pozoruje s 10 NPT 15392.

2. Údaje uvedené v tabulce 6 jasně dokládají, že ekvimolární koncentrace NPT 15457 a NPT 15458 jsou účinné pro zvětšení proliferace lymfocytů vyvolané PHA za použití HPBL. To je zajímavé při pohledu na údaje uvedené v tabulce 9, které ukazují, že HPBL štěpí oba estery na NPT 15392. NPT 15458, který se štěpí ve větším rozsahu než NPT 15457 (viz tabulka 9) je účinnější potenciátor (tabulka 6, 1,48 proti 1,28) transformace vyvolané PHA.

3. Jak může být zřejmé z tabulky 7, jak NPT 15457, tak NPT 15458 jsou účinné pro modulaci tvorby aktivních roset v HPBL. Je zajímavé poznamenat, že v pokusu * 1, kde lymfocyty ošetřené placebo má velmi nízkou úroveň aktivních roset (imunodefekt), NPT 15457 a NPT 15458 jsou tak účinné jako 15392 v obnovení snížené imunity na normální hladinu. V pokuse+ 2 mají placebo ošetřené kontrolní vzorky mimořádně vysoké hodnoty pro aktivní rosety. V tomto případě NPT 15392 a NPT 15458 jsou schopné snížit vysoké úrovně normálních hodnot a tak do?t kládají správnost imunomodulačních vlastností těchto drog.

4. NPT 15457, NPT 15458 a “aktivní’* droga NPT 15392 se podají myším Balb/c, které byly imunizované ovčími Červenými buňkami krve (SRBC) a stanoví se protilátky vyprodukované к SRBC. Je zajímavé poznamenat, že NPT 15458 a NPT 15392 jsou velmi účinné к modulaci produkce protilátek IgM. NPT 15392 při studii úrovně způsobil 46% zvýšení produkce IgM. Vyšší dávky NPT 15392 jsou příčinou malého zvýšení nebo poklesu proti kontrolním hodnotám. Je zajímavé poznamenat, že NPT 15458, který se převádí na NPT 15392 a vede к alespoň desetinásobně vyšším hodnotám NPT 15392 v krvi (tabulka 10), způsobuje potlačení vzniku IgM (tabulka 8).. To se dalo očekávat, protože NPT 15458 způsobuje velmi vysokou úroveň NPT 15392, která se skoro podobá inhibici vzniku IgM. Údaje uvedené v tabulce 8 dokládají imunomodulační aktivitu NPT 15457 a NPT 15458. Mělo by se ještě poznamenat, že účinek NPT 15457 je menší než účinek NPT 15458 a že se převádí méně NPT 15457 na NPT 15392, než je tomu v NPT 15458 (tabulka 10).

Tabulka 5

Imirnomodulační vlastnosti acetoxynonylhypoxanthinu (NPT 15458): stimulace in vivo proliferace lymfocytů způsobené- mitogenem v meších slezinných buňkách

Vpraveno cpo

Sloučenina	Konnentrace	-PHA	+PHA	S.I.^a	D/C
0			(C)	137	64,647	471	-
NPT	15392	1 0 /lg/ml	(D)	117	68,804	588	1,25
NPT	15458	10/Ug/ml	(D)	153	66,800	436	0,93
NPT	15458	50 /<g/ml	(D)	138	81,297	589	1,25

^aS.I. znamená stimulační index

Tabulka 6

Imu^<^moouli^í^i^:í vlastnosti sukcinoxynonylhypoxanthinu (NPT 154157) a acetoxynonylhypozxanthinu (NPT 15458): zvýáení proliferace lymfočytů způsobené mitogenem v lymfocytech periferní lidské krve

Sloučenina	Konnentrace (nmoo/ml)	Vpraveno cpm	S.I.	D/C
-PHA	, +PHA
NPT 15392^х	0	(C) 379	59,404	156
	0,036	(D) 297	59,167	199	1 ,27
	0,36	(0) 577	69,057	120	0,76
	3,6	(D) 381	67,328	176	1,128
NPT 15457	0	(C) 277	54,015	195	-
	0,036	(D) 240	59,569	250	1 ,28
	0,36	(D) 228	59,689	261	1,33
	3,6	(D) 232	52,149	224	1,14
NPT 15458	0	(C) 277	54,015	195	-
	0,036	(D) 214	59,898	280a	1,43
	0,36 ,	(D) 221	63,858	289®	1 ,48
	3,6	(D) 238	69,055	290®	1,48

x Hodnoty se stanovily ze tří potaisů.

a p < 0,05

T ab nika 7 j

ImшiomoduUaδní vlastnosti acetoxynonylhypoxanthinu (NPT 15458) a sukcinoxynonylhypoxanthinu (NPT 15457): zvýšení tvorby aktivní E-roset

Sloučenina	Konnentrace (nmoo/ml)	% aktivních E-roset	(x + S.E.)
		+ 1	+ 2
Placebo	(0)	9,23 +- 2,9	34,2 + 6,6
(kontrolní
stanové^)
NPT 15392	(3,6)	16,2 + 1,0	-
(kontrolní	(0,36)	-	15,4 i 2,9®
stanovený

Tabulka 7 - pokračování

Sloučenina	Koncentrace	% aktivních	(X + S.E.)
	(nmol/ml)	E-roset
NPT 15457	(3,6)	24,8 + 6“	-
	(0,36)	-	33,6 + 2,4
NPT 15458	(3,6)	19,4 + 1,0®	-
	(0,36)	-	23,25 ♦ 1,24'

^ap < 0,05 proti placebo/kontrolnímu stanovení.

Tabulka 8

Imunologické vlastnosti acetoxynonylhypoxanthinu (NPT 15458) a sukcinoxynonylhypoxan-R thinu (NPT 15457): potlačení produkce Iglí protilátky u myší Balb/c imunizovaných SRBC

IgM plakety % z

Pokus Látka Dávka (i.p.) (x ♦ S.E.) kontrolního stanovení

1	NPT 15392	(1,80 nmol/kg x 4)	41 * 4	146^a
2		(0,18 nmol/kf x 4)	68 + 2	147®
1	NPT 15457	(1,8 nmol/kg x 4)	19*3	68®
2		(0,18 nmol/kg x 4)	47 * 3	102
1	NPT 15458	(1,8 nmol/kg x 4)	⁸ t ¹	28,5®
2		(0,18 nmol/kg x 4)	11 * 1	23,9®
1	Kontrolní
	stanovení	(placebo x 4)	28 + 2	100
2		(placebo x 4)	46 + 2	100

ve srovnání к placebo/kontrolnímu stanovení.

a_p < 0,01

Metabolická konverze

Jak může být zřejmé z tabulky 9, inkubace „výchozích drog” NPT 15457 a NPT 15458 s opičími buňkami Věro (ledvinové buňky africké opice Afričan Green Monkey), játrovým homogenlzátem a lymfocyty periferní lidské krve vede ke vzniku “aktivní” drogy NPT 15392. Konverze NPT 15458 na NPT 15392 se zdá probíhat ve větším rozsahu než konverze NPT 15457 na NPT 15392.

Údaje v tabulce 10 dokládají, že jak NPT 15457, tak NPT 15458, se mohou absorbovat do krve po i.p. podání a že podání NPT 15458 vede к takřka dvanáctinásobně vyšší úrovni NPT 15392 než podání samotného NPT 15392. To se jasně stanoví ze skutečnosti, že NPT 15458 a NPT 15457 mohou produkovat NPT 15392 in vivo a dále, Že u alespoň jednoho z těchto derivátů se dosahuje mnohem vyšší hladiny v krvi, která poskytuje větší účinek.

Tabulka 9

Vznik NPT 15392 z acetoxynonylhypoxanthinu (NPT 15458) a sukcinoxynonylhypoxanthinu (NPT 15457) biologCkýým způsobem

Sloučenina % z NPT 15392® za dobu (h)

0,5 24

NPT 15392

NPT 15457

NPT 15458 a Stanoveno za použití

Tabulka 10

Buňky Věro

Játrový homogenozát HPBL

Buňky V®ro

Játrový homooenozát

HPBL

Buňky Věro

Játrový homooenozát HPBL vysokotlaké kapalinové

100 -100

100 100100 -100

0-0

140 -18,2

-50

700 - .100 chromattoesďie (HPL).

Vznik NPT 15392 po i.p. podání acetoxynonylhypoxanthinu (NPT 15458) a sukcinoxynornrlhypoxmnthinu (NPT 15457) myším

Podaná sloučenina*	Zvíře*	Hladina v krvi ( A/ml x 10'
NPT 15392	NPT 15457	NPT
NPT	15392	1	0,22		-
		2	0,68	-	-
NPT	15457	1	0,47	1,4	-
		2	0,22	0,57	-
NPT	15458	1	8,2	-	0
		2	2,7	-	0

x(360 /x/ke)

Účinek . erythro-9-(2-acetoxy---noryrl)lУppoxtnthinu na růst buněk nádoru (leukémie) in vivo

Sloučenina	(Konncntrace) % potlačení růstu LI210 (^myš) * 8068 (člcwěk)
NPT 15458	(10^/ml) 40 32

Ztyšení produkce protilátky u щУ! Balb/c ionizovaných SRBC

Droga (dávka v m/ke) % stimulace potlačení salinity

Pokus 1

Salinický roztokNPT-15392 (0,5 ад/kg)82

NPT-15467 (Formy-15392) (0,5 ад/kg)-14

NPT-15458 (Acctyl-15392) (0,5 ад/kg)-47

NPT-15477 (Propponny-15392) (0,5 ад/kg)135

NPT-15483 (Butyyry-15392) (0,5 ад/kg)-76

Droga (dávka v m?/kg) % stimulace potlačení salinity

Pokus 2
Salinický · roztok	-
NPT-15467	(Form^li’15392) (0,05 mg/kg)	7
NPT-15458	(lcctyl-15392) (0,05 mg/kg)	-75
NPT 15477	(Propionjy-15392) (0,05 mg/kg)	33
NPT-15483	(But;yry1-15392) (0,05 mg/kg)	-12

Tabulka 11

Souhrn biologických vlastností

VlaStnOSt	NPT 15457	NPT 15458	NPT 15392
Kon^i^l^ibbil.ta na NPT 15392 Chemická: pH 9,5	ano	ano	neproveddielné
?pH 7,0	ne	ne	oβirovθddte1oé
Biologická:
HPBL	18	100	neprovedd telné
Játra	14	70	oeiroveedtd1oé
bm	0	50	neprojed telné
Myš	25	100	oeiroveddtelné
Biologický účinek:
Protivirový (in vitro)	velmi slabý	ano (08 %)	ano (73 %)
Imuno^ionulace (in vitro) Prolf. · lymf.	ano (+14-28 %)	ano(+43-48 %)	ano ( + 12-27 %)
Iiunomindlace (in vitro)
Roseta	ano (+166 %)	ano (+11%)	ano (+78 %)
ImιuronionuUacd (in vivo) SRBC-IgM	střední(0-60)	ano (-72 %)	ano (+46 %)

Pro stanovení vlastností, které jsou diskutovány výše, byly použity dále uvedené postupy.

A. Metody pěstování buněk

A. Rozmmožování buněk Hela nebo Věra

1. Buněčné toltury v 120 cm bance s.e tailtivují z dřívější kultury v monnvvrtvě tímto způsobem:

2. Prostředí se vylije a m□nonvзtva se dvakrát promyje vždy přibližně 50 ml salinického fosfátového pufru neobsahujícího vápník a hořčík (PBS) o pH 7,2.

3. 1 mi , roztoku trypsinu s EDTA, obsahujícího 0,5 g trypsinu ( 1 : 250) g EDDA/lltr vyváženého solného roztoku (HBSS) bez obsahu kationů dvojmocného vápníku a hořčíku, se přidá za teploty 37 °C do každé baňky a disperguje nad monnnvstvnu za opatrného protřepáváoí.

4. Banky se potom umístí v inkubátoru za teploty 37 °C přibližně 3 až 5 minuto v závislosti na době potřebné k vytěsnění buněk. Vyžaduje se ruční protřepiávárin.

5. Do každé baňky se přidá 10 ml růstového media a buňky se dispergují nasáváním suspenze do pipety a jejím vypouštěním. To se opakuje desetkrát.

6. Obsah řady buněk se slije a buňky v suspenzi se zředí růstovým mediem na 7 až

8,5.¹⁰* buněk ne mitotr.

7. Růstové medium sestává z těchto složek: Minimální základní prostředí Eeajles (MEM) s Eiarleovou solí a HEPES pufrem doplněné dále uvedenými látkami vztažerými na 100 ml MEM: 10 ml fatálního telecího séra (konečná koncentrace = 10 %, 1 ml 1-glutaminu (200 mooární) ml 10 000 m.j. penicilinu, 10 000/Ug streptomycinu a.10 000 m.j. neomycinu ve formě směěi.

8. Buňky dřívější kultury se kultivují v Costarově misce pro tkáňové kultury obsahující 24 článků s rovným dnem, kde každý článek má objem 3 ml. Do každého článku se- přidá (1 ml) suspenze kultury buněk.

9. Moooovstvy se ke zkoušce, když dosáhnou vzrůstu, kdy skoro splynou (přibliž- ně 1 až 2 drny.

10. Oddělené buňky se poutojí pro udržení buněčných linií. Uddžovací prostředí sestává z MEM a přísad (viz stupeň 7) s FSC sníženou na 5% konečnou konoce0raci.

B. červené krevní buňky

1. Veškerá krev se získává kardiatickou punkturou ze samců Doorat kmene Hariy.

2. Přibližně 10 ml veškeré krve se smíchá s 25 ml Alseverova roztoku a může se skladovat za te^plo^ty 4 °^C a^{ž 1} týden.

' 3· Těsně před použitím se červené krevní buňky třikrát promyjí salónccýým fosfáooýým pufrem (PBS), pH 7,2.

4· Každé promyyí se dosahuje odstředěním suspenze červených krevních buněk během 10 minut za 450 G při teplotě o ti.

5. Suspenze 0,4 % (objemově) Červeních krevních buněk se připlaví s Hanksovým roztokem HBSS. .

C. Pěstování virů na vejcích

A. Inflace

1. Slepičí vajíčka fertilní devět až deset dní se proovítí ke stanovení životaschopnosti a vzdušný prostor se vyznačí na skořápce tužkou. Problematická vajíčka .(porušení pohybu nebo odbarvení) se vyřadí.

2. Povrch skořápek se des^f^uje 70½ ethanolem a nechá uschnout.

3. Skořápkou se prorazí pomocí sterilního prorážeče vajec malý otvor přibližně 6,3 mim, v tužkou naznačeném kruhu nad vzdušrým prostorem každého vajíčka.

3

4. Otvorem se naočkuje 0,1 ml suspenze různých virů, 10 až 10 - ΕΙΏ^θ/πιΙ , která se zavede ¹ ml ^tu^beskulinoíou ⁱnje^cčo^í stMkačtau pod úriem 4⁵° ^do ftut¹^ z^áro^de^čné^ho výchlipku.

5. Přitom je nutné dát pozor, aby se nezranil zárodek nebo váček žloutku.

6. К uzavření otvoru se použije 2,54 cm kousku plastické folie a každé vajíčko se označí příslušným virem, běžným číslem vajíčka a datem.

7. Vajíčka se inkubují za teploty 35 až 37 °C po dobu 2 až 5 dnů v závislosti na rychlosti růstu virů. Doba inkubace a teplota se zaznamenávají společně s jinými případnými údaji pro každou šarži.

B. Získání allantoisových tekutin

1. Na konci inkubačního období se vajíčka ochladí na 3 až 4 hodiny na teplotu 4 °C, aby se zamezilo vytékání do dutiny zárodečného výchlipku během postupu získání viru.

2. Povrch skořápek se opět desinfikuje 70% ethanolem a nechá oschnout.

3. К odstřihnutí vrchu skořápky podél čáry vyznačené tužkou se použije sterilních nůžek a membrána se odstraní sterilními kleštěmi.

4. Kleště se opatrně vysunou mezi embryo a blánu skořápky a embryo se posune ke straně za vzniku kapsy” allantoisové tekutiny. Je zapotřebí, aby se neprorazila vnitřní plodová blána (s výjimkou případů, kdy se má také získat emnionická tekutina) a aby se snížilo na minimum roztrhnutí placentální arterie.

5. К shromáždění allantoisové tekutiny se použije sterilní 10 ml pipety s mechaniclým vakuovým balónkem a tekutina se přenese do sterilní zkumavky v odstředivce. Z každého vajíčka se může získat přibližně 5 až 8 ml tekutiny.

6. Získaný materiál se odstřeluje při 1 200 G po dobu 10 minut za teploty 4 °C. Vrchní vrstva se přenese do sterilních zkumavek.

7. Vzorky se odeberou z každé jímky к titraci a zkoušky sterility. Zbývající suspenze se beze zbytku rozdělí do sterilních zkumavek na 2 ml séra a označí kmenem, číslem šarže a datem.

8. Alikvoty se bezprostředně zmrazí kapalným dusíkem a ukladují za teploty -70 °C v ultrafrizeru nebo kryoprizeru chlazeném kapalným dusíkem.

D. Rozmnožování viru v tkáňové kultuře

A. Zamoření

1. Za 24 až 48 hodin se vyberou pro použití monovrstvové kultury příslušného typu

V v buněk, které jsou obvykle v 250 cm bance s použitelnou tkáňovou kulturou, a přitom jen splývají.

2. Veškeré zamořování a získávání se provádí v biologicky bezpečnostní pracovně a používá se pouze mechanického pipetovacího zařízení. Přitom se zachovávají sterilní technické postupy.

3. К nahrazení růstového prostředí v kulturách určených к zamoření se použije 25 ml udržovacího prostředí. Kontrolní kultury také obdrží 25 ml udržovacího prostředí.

4. Očkovací virus se zředí MEM prostým sérem podle informace poskytnuté ze zdroje nebo z titrace předchozí šarže a ke každé kultuře (s výjimkou kontrolní kultury) se přidá 0,5 ml tohoto viru.

5. Kultury se inkubuj za teploty 37 °C ve vlhké atmosféře z ⁵ % oxidu uhličitého a % vzduchu po dobu 48 až 72 hodin s denním pozorováním cytopatických účinků (CPE) oharekterisiicých pro každý virus.

B. Získávání

1. Kultury se odstraní k získávání, když CPE dosáhne 3 až 4+ bodů.

- neppzooruí se cytopatické účinky

1+ - 25 % buněk vykazuje cytopatckké účinky

2+ - 50 % buněk vykazuje cytopaiic'ké účinky

3+ -75 % buněk vykazuje cytopatické účinky

4+ - 100 % buněk vykazuje cytopatické účinky

2. KKutury se zmrazí a třikrát rozelhejí aby se rozštěpila a vytlačila vrstva buněk.

Po třetím roztáni se kulturní kapalina přesene do sterilní zkum savky odstředivky a odstřeáuje při 300 G 30 minut, aby se odstranily pozůstatky buněk. Suspenze viru se přezkouší kontaminací bakteriemi.

3. Vrchní vrstva se bezprostředně rovnoměrně rozdělí (0,5’až 1 й.) do 2 ml sterilních zkumavek na sérum a zmrazí kapalným dusíkem.

4. Pro titraol se moonovstva kultury připraví na desky s 24 články s rovným dnem pro tkáňovou kulturu a infikuje se takto:

a) Řada desetinásobných zředění viru se provede v chladném udržovacímprrtSředí

5% ^fetálním telecím sérem ⁽F°S^{) (10}“' a^{ž 10}”^⁾.

b) Jeden ml z každého ředění se přidá do jednotlivých článků v trojím provedení.

c) Kooeroleí kultury obsahuj pouze udržovací prostředí jsou v tom zahrnuty.

5. Kuutury se inkubuj 48 hodin za teploty 37 °C ' ve vlhké atmooféře 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu a vrstvy buněk se bodduí, jak již bylo popsáno. TCID^q titr se vyp^čtá podle titrační metody Reeda a Munnha.

Ca

E. Hemadsoopční zkouška

1. Těsně před provedením HAd zkoušky se prostředí deko^i^i^.je z misek pro buněčnou kulturu.

2. Ke každému zdroji kultury se přidá 1 ml udržovacího prostředí.

3. Dvě serie kontrolních kultur se přidají k samotnému udržovacímu prostředí.

4. Testovací kultury a jedna z kontrolní serie se bezprostředně naočkuj 0,1 ml zředěného virového přípravku. (Zavedené tituiy jsou specifkkovány jako předchozí HAdFFU zkoušky). HAdFFU znamena hemaaeorpční jednotky tvořené fokusy.

5. Další serie kontrolního -provedení se . udržují neinfikované, přičemž se přidává samotný MEM jako neškodná ientklllce.

6. Kuutury se inkubuj za teploty 37 °C po dobu 16 až 18 hodin, pokud není uvedeno jinak.

7. Po době naočkování se prostředí dekantuje a buňky jednou promj pufrem PBS při pH

7,2. _t

8. Ke každému článku se přidá 5/10 ml RBC suspenze a kultury se nechaj 30 minut za teploty místncosi.

9. RBC suspenze se potom dekantuje a kultury se promni dvakrát nebo třikrát pufrem PBS, aby se odstranilo vše a zvláště nadbytek RBC.

10. Konečně se ke každému článku přidá 1,0 ml Hankova roztoku HBSS.

11. Počet fokusů původně hemadeorbovaného RBS se stanoví za pouuití mikroskopu s inverzí fází Nikon a čtyřnásobně zvětšujícím objektivem.

12. Ve všech případech se k stanovení počtu buněk vybere' minimálně pět nahodilých oblastí.

13. Počet HAd fokusů se stanoví pomocí analyzátoru (Bausch & Lomb Onmncon Alpha Image Annayzer).

14. Obraz podle mikroskopu se promítá na obrazovku Vidicon a také se převádí na televizní obrazovku tak, že operátor může stanovit a odjíst chyby v důsledku pozůstatků buněk. Pokusy se stanovuj podle šedé hladiny a velikosti obrazu.

15. K eliminaci počtu výsledných neadsorbovaných RBS, se nadměrná velikost vypočteného modulu programuje na obrazovku, aby prošly jednotlivé RBC.

16. Statistická analýza zahrnuje analýzu údajů za pooužtí analýzy odchylky od soustavy v navrženém moodlu. Zdroj odchylky může . -<být způsoben zpracováním, buňkami při zpracování t a experimmenální chybou v důsledku okoonootí v obbastl buněk střední hodnoty infkkovarných buněk v obbasti a standardní chyby střední hodnoty se vypooítají pro každý článek. Střední hodnoty a standardní chyby se také vypcočtají pro každé ošetření jímaných buněk v souhrnu po všech ošetřeních dohromady. Střední hodnoty infkkovaných buněk na každé ošetření se srovnají s kontrolním stanovením za pouužtí Durnetova násobného porovnávacího testu bez ohledů na celkový F-test pro ošetření (viz tabulka dále).

Tabulka ,

Koonrooní stanovení Ošetření 1

článek 1	článek 2	^článe^k 3	člátaek ¹	Článek 2	článek 3
F 11x	F 12	F 13	F'11	F'12	F'13
F 21	F 22 ‘	F 23	F'21	F'22	F'23
F 31	F 32	F 33	F'31	F'32	F'33
X] . + SE,	x2 + SEg	X3 + SEj	*í ' t ^SE1	x2 + SEg	xj + SE3
souhrn Xq + SEq				xj + SEj
n = 9				n = 9

^{x F} 11 předstevuje oblas^{t +} ·

F. Příprava lymfocytů periferní lidské krve (HPBL)

A. Příprava Ficco! - Hypaque separačního prostředí

1. 22,5 g Ficollu 400 (Pharmacia, molekulová hmotnost asi 400 000) se rozpustí ve 200 ml destilované vody. Když většina ooCeeiálu přejde do roztoku, objem se potom upraví destilovanou vodou nc 250 ml.

2. 34 g H<P^aque (nctrismdiatrizlátu, Sterling Orgacncs, mo^^lová ^0^031 asi 636) se rozpětí ve 100 ml destilované vody.

3. Roztoky se potom sterilně filtrují 0_J^^^f>4.^m oita?optréznío fitteem a skladují v sterilním zásobnicím na teploty ⁴ °C ^bez ^přístu^pu světla.

4. Pracovní roztok se připraví smícháním 10 ml roztoku Hypaque s 24 ml roztoku Ficmu. ftněs se zaseje na ²5 °^C za nepřetrži-tmo míchání.

B. OOddlení PBL od veškeré krve

1· Vzorky lidské krve se získají ve^^unk^mu do heparinizovaných 20ml vzduchoprázdnech zkummaek. 15 až 20 ml nezředlné krve se opatrně převrství rovným objemem Ficll1-Hypaque roztoku v sterilní 50ml polykcgblnátloé zkumavce pro odstředivky za pouuití aseptických podmínek.

2. Připravené vzorky se odstřelují při teplotě 25 °C za přetížení 400 G po dobu 30 · minut. Ostředěný bílý pás na rozhraní se asepticky odsaje do 50ml sterilní zkumavky pro odstřed^ku a ^při.dá 10 a^{ž 20} ml RBU-1640. ^Buňk^y se jernou pro^jí za ^ploty 25 °^C · a pak ods^edí při ^{400 G} b^em 1° minut za teploty ²5 °C.

3. PBL ve formě pelet se opět suspenduje v · 1 ml RPMI na každých 8 ml celkové krve původně pouuité a počítá na ^^te^vě počítači. Konncntrace se upraví pomocí RPMI-1640, které obsahuje glutamin a antibiotika. Buňky se udržují za teploty místnost^ dokud se nepouuiií.

G. Stimulace HPBL a PHA a LPS

1.10 až 40 ml celkové krve se odebere do hepιarizincocné zkumavky od zdravých dobrovolníků.

2. Ljymooyty se odděH od krve uvedené výše ze pouužtí Picdl-Hypaque separační techniky-

3. Pomooí RPMI-1640 se připraví různé koncentrace testované sloučeniny.

4. Koncentrace tymlTocytů se u^praví na ² x l^/ml ^^-1640.

5. Ljy^ooyty se m^buuí s testovanou sloučeninou ⁹⁰ minut za teploty 37 °C.

6. Ovčí červené krevní buňky (SRBO) (1 až 2 týdny staré) se třikrát pglmjí pufrem PBG a zředí-na konečnou koncentraci 0,5 % inj. RPÍI-1640.

7. ^Reakční zkumavky se naplní ta^k, aby dsahovaly: ⁰,² ml la^To^tá ⁽² x

0,2 ml 9% Ficollu v RPMI-1640

0,2 ml SRBC (0,5 % v RPMI-11600.

8. Výše uvedené reaktanty se o^s^-tř^^i^^^zí za přetížení 200 G 5 minut při teplotě о1^пс^1.

9. Sediment se potom opět opatrně suspenduje e 10 Hrmý vzorek se umístí v heoooito·1 mmtru.

10. Pomocí mikroskopu, se potom spočítá počet roset, přičemž některé lymfocyty, které mají 3 nebo více připojených červených buněk se počítají jako rosety·

H. Buňky tvořící E-rosety

A. Příprava mitogenu

I. Prášek lipopolysacharidu В nebo fytohemaglutinu P se odváží a rozpustí v RPHI-1640 na koncentraci 11 (tj. 1 mg/litr) a sterilně filtruje na 0,45 ^zm mikroporézním filt ru.

2. Roztoky se rozdělí na rovné díly (1ml/zkumavku) za aaeptických podmínek do označených sterilních zkumavek pro nízké teploty a zmrazí. Vzorky se po částečném použití znovu nezmrazují, ale mohou se skladovat jeden nebo dva dny za teploty 4 °C. Lyofilizovaný prášek se udržuje v chladničce za teploty 4 °C.

B. Příprava kultur

1. PBL se připraví jako v SOP * I - 004 v RPMI-1640 bez séra při doplnění glutaiaen a antibioticky-antimykotickým roztokem (GIBCO). Pomocí ósmikanálového automatického mikropipetovacího zařízení (Flow Laba.) vybaveného sterilními Špičkami se ke každému článku 96-článkové desky pro mikrotestování kultur (CoStar Plastics) přidá 0,1 ml na článek·

2· Mitogenní roztoky se rychle nechají roztát a čtyřikrát zředí na požadovanou koncentraci pomocí RPMI-1640.

3· Testované sloučeniny se připraví pro použití jako SOPdkC-002 za použití RPMI-1640 jako ředidla a zředí se čtyřikrát na konečnou požadovanou koncentraci.

4. 50/4.1 každého neředění nitrogenu a/nebo testované sloučeniny se přidá к šesti kulturám. čiatý RPMI-1640 se použije ve stejném množství v kontrolních kulturách v celkovém objemu 0,2 ml na článek.

5. Kultury se inkubují za teploty 37 °C ve vlhké atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu (pH ai 6,0 až 7,0) po dobu 48 hodin. Buňky se potom značí 1,85 . 10*/s v 3 v na banku pomocí ^JH-TdR (thymidin) po dobu dalších 18 hodin. Buňky se získávají pomocí zařízení к získání mnohonásobného automaticky odebíraného vzorku (M.A.S.H.)· Neadherentní buňky se odsají na filtru ze skleněhých vláken při shrnutí 0,9 % salinickým roztokem (desetinásobné propláchnutí) a buňky se uvolní destilovanou vodou (dvacetinásobné dobré propláchnutí). Podíl zbavený těkavých složek se důkladně suší na vzduchu, zbytek buněčných usazenin se oddělí od podílu zbaveného těkavých složek a každý vzorek umístí do skleněné scintilační fioly objemu 3,53 ml. Scintilační tekutý koncentrát (Scintiprep\ Fisher Chemicals) se zředí v poměru 1 : 50 toluenem jakosti pro scintilaci (Pachard) a do každé fioly se přidá 1 ml. Vzorky se hodnotí kapalinovou scintilační spektroskopií a údaje se vyjadřují jako* počet impulzů za minutu na testovanou skupinu.

I. Imunozkouška

A. Příprava NPT 15392

1. Roztok obsahující 5002ig/ml NPT 15392 se připraví přidáním předem odváženého množství

práškové drogy к sterilnímu PBS a roztok se sonifikuje po 30 minut.

2. Vlnová délka spektrofotometru (GCA/MePherson double beam) se nastaví na 250 nm.

3. NPT 15392 se zředí 1 : 10 0,1 normální kyselinou chlorovodíkovou.

4. 15 ml 0,1 normální kyseliny chlorovodíkové se vylije do kádinky. Tento roztok se používá к vyplachování kyvet. Dvě kyvety se naplní 0,1 normální kyselinou chlorovodíkovou a odečte se vlnová délka. Absorbce by měla být v rozmezí 0,001 až 0,005 od vynulované hodnoty.

5. Vzorkovací kyveta se vyprázdní a do ní se vnese zředěný roztok drogy.

6. Zaznamená se absorpce a vypočítá se koncentrace. Přitom se použije tohoto vzorce:

A (absorbce) x faktor zředění x atomová hmotnost (278) = g/ml

11,31

B. Před dnem 0

1. Roztok drogy NPT 15392 se připraví rozpuštěním 500^g NPT 15392 na ml PBS.

2. Koncentrace se přezkouší podle odstavce A tohoto popisu.

3. Zásoba se rovnoměrně rozdělí do 1 ml vzorků a skladuje za teploty -20 °C po několik měsíců.

4. Roztok se nechá roztát a zředí na požadovanou koncentraci.

C. Agarózové základní desky se připraví takto:

1. 1,4% suspenze agarózy v PBS (7 g v 500 ml) se umístí v autoklávu na 15 minut.

2. Za použití Cronwellovy injekční stříkačky se třímililitrový objem roztavené agarózy asepticky rozdělí do Petriho misek Falcon * 1006 a vířivým pohybem upraví do formy rovné vrstvy.

3. Tyto desky se mohou skladovat až jeden týden před použitím za teploty 4 °C. Desky se skladují v inverzní poloze (agar na vrchu desky).

D. Příprava séra morčete

1. Kardiatickou punkturou se odebere 10 ml krve ze 2 až 6 morčat a krev se vnese do 50 ml zkumavek pro odstřelování Falcon * 2070 bez antikoagulantu·

2. Tyto zkumavky se inkubují po dobu 45 minut za teploty 37 °C к získání sraženiny.

3. Zkumavky se potom odstraní z inkubátoru a dají na 30 minut na led, aby se zmenšil objem sraženiny.

4. Sérum se asepticky vylije z každé zkumavky, spojí a rozdělí na 1 ml alikvoty a skladuje za teploty -70 °C až do použití.

E. Imunizace, den 0

1. Myši se imunizují takto: Ovcím Hyland Labe se týdně odebírá krev (ovce * 23). Krev se asepticky shromažďuje ve dvou objemech Alseviers na jeden objem krve.

2. Pět desetin mililitru ovčí krve v Alseviers se třikrát proqyje sterilním PBS - v klinické odstředivce IEC, za nastavení * 4(otáčky 2 800/min) po dobu 10 minut při teplotě místnosti.

3. Pelety se opět suspendují v poměru 1 : 10 ve sterilním PBS.

X

2351514 . 4. Coulterův počítač model Z, se kalibruje podle instrukce pro ruční provoz.

5. Ke stanovení počtu buněk na CouHerově pooítači je zapotřebí zředění 1 : 10 000 a to se dosáhne nejprve zředěním 1 : 100 v PBS a potom zředěním tohoto roztoku 1 : 10 isotonickým roztokem. Coult.erův počítač je nastaven na ’ prahovou hodnotu * 5.

⁶. ^Stanoví se počet buně^k a skicovaný roztok z^ředí na 4 x ¹⁰? ^buně^k na mililitr. Tato konečná suspenze se používá k imnniacc.

⁷. fcažfó myš se 1ош^^1 ⁱ.v. injekcí ^do ^terálníl části žíly (zahřátá na 50 °C na vo^dní MznL k roztažen ží^iy) s ^0,1 ° suspenze SRBC. ^KoneČná koncentrace SRBC je 4 x ¹⁰θ na mrš.

F. Ošetřování

1. Myyi se ošetřují i.p. injekcí nultého, prvního, druhého a třetího dne. Injekční st^říka^čka (ojemu 1 °.⁾ je v^ybavena jehlou ^1,27 cm rozměru ²⁶ Jehla se zavádí v 45° úhlu podél pravé strany linea alba. 0,2 ml objem obdrží dvě skupiny ' vystavené p^jgobi^i^ií drog a kontrolně ošetřená skupina.

2. Skupiny vystavené působení drog dostanou 0,2 ml roztoku NPT 15392 požadované koncentrace. U mši o ' hmoonnoti 20 g jde o 5/tg/ol·

G. Příprava sleziny, den 4

1. Sleziny se odstraní acepticky a individuálně umístí do zkumavky pro tkáňovou kulturu Falcon * 2025 obsahující 3 ml MIH. ' Zkumavky se potom skladují v ledu.

2.Sleziny se homodenizují ve stejné zkumavce tefonnovým tloučkeo připojexým k motoru s proměnnou rychlostí (G. K. Heller, spojeným se zařízením pro řízení motoru (G. K. HeUer GT-21) nastaveTým na + 6: .

3. Doba a průběh homodenizacl by míly být u každého vzorku stejné.

4. Vzorky se potom filtrují síeeo z ierezac’ějící oceU o velikosti ok 40/to do standardních zkumavek pro tkáňové kJ-tury. Síto se propláchne 3 ml MEM a suspenze buněk se skladuje v ledu.

5. Provede se zředění l : 1 000 pro spočítání buněk na Cotu.terově počítači tím, že se nejprve řadí 1 : 1 000 s PBS a potom 1 : 10 isotonikýým roztokem.

6. Dostane se počet buněk. Skladovaná suspenze, se zředí na 1 x 10? buněk na milllitr.

Cou^e^v počítač je nastaven na prahovou hodnotu 10. červené buňky se odstraní třemi kapkami isotonického roztoku Zap.

H. fíjprava horního agaru (0,7 %)

I. 0,35 g agarózy a 0,53 g práškového MEM se vnese do Erlenmeyerovy baňky a potom přidá 50 ml destilované vody.

². Rozt,o^k se zahřívá v autoH^vu ¹5 minut na ^plotu ¹²1 °C za tlaku ¹⁰5 k^Pa a potom se umíítí na vo^dní ^lázni o teplot ⁴⁵ °C na 5 minut. Hodnota ^- pH roztah se upraví zhruba na 7,2 přidáním hydroggnilUičitcnl sodného (0,1 ml NagCOo>. -

3. 1 ml dikvoty se disperguj v 5 í- zkumavce pro tkáňovou kiltu™, která byla předem umístěna na vodní lázni. Přitom se pouHje několik zvláštních zkumavek pro opakování pro případ chyby v očkování.

I. Příprava 10 % SRBC roztoku

1. 5 ml ovčí krve (stejné šarže, jako se pouuíIi k · ionizaci) se pro^je třikrát s PBS za pobití klinické standardní odstředivky IEC o rycch-osti * 4 (otáčky 2 800,/min) po dobu 10 minut.

2. Po třetío prostí se buňky opět suspenduj v SesftenásbOnéo objemu PBS než je objem použitých buněk, tj. 0,5 ml SRBC se doplní do 5 ml s PBS.

J. Očkování

1. Azurové desky se vyjmou z chladničky a nechej ohřát na teplotu oíítnnosi. Desky se značí trojnásobně pro každou pokusnou skupinu.

a

2. Zkumavky naplněné agarem se vyjmou z vodní lázně a do každé takové zkumavky se přidá 0,1 ml 10% SRBC a 0,1 ml suspenze slezlnových buněk. Zkumavky se oíchaj na mixeru * Vortex.

3. Obsah zkumavek se hned vylije na desky s agarovou · bází a otáčí vířvvýo pohybem dokud ^se nevytvoří hladW vrstva. Desty se uoíítí na úroveň povrc^hu ^doku^d agar nez^tt^hne.

4. Desty se inkubuj za teploty 37 °C ve v^lhké atíco^^· ^tvo^řen^é 5 % ox^ísu hili^téřio a 15 % vzduchu po dobu 90 oinut.

5· Doplněk z oorrete (viz..příprava, část D) se vyjme z ledničky, nechá roztát při teplotě oísUiooti a zředí 1 : 10 s PBS.

6. Desky se potom vyjmou z inukubátoru a ke každé desce se přidá 1 ml zředěného doplňku.

⁷. ^sty se potom znovu Inkubují 3⁰ a^{ž 45} oinut za ^ploty ³⁷ °C. ^Des^ky se potom v^yjoou z inkubátoru a spoOítaj za pootití šikmého osvětlení.

β. Desky se mohou skla^vat při 4 °^C v ^verzní poloze a spo^ta ^do ²⁴ todin pozdil·

Souhrn terapeutického pcou^í v pracovních příkladech

Bylo doloženo, že předmětné sloučeniny podle vynálezu potlačuj reprezentativní vzorky viru RNA za pouští standardní techniky pro tkáňové kultury. V případě RNA viru, chřipkového viru náležejícího k podtypu A bylo ukázáno, že je · potlačován, při pouští heooadorpční techniky. U několika derivátů řady NPT 15457 a NPT 15458 se ukazuue, že potlačují chřipkové viry za·koncentrace v rozoozí od 3,6 do 360 nooO/ol.

DsIŠí členové třídy virů RNA jsou uvedeny v tabulce 6 a jsou odpovědni za určitá onemocněni. Ze všech charob na světě je, jak známo, alespoň 25 % způsobeno viry. Kromě toho u řady izolovaných virů bylo dokázáno, že způsobuj nádory. Tak se může očekávat, · že p^c^o^tivLnvé přípravky oaj určité protináSsrovt vlastneos!, ^příklad vlastnosti antileukeoické.

Účinek jednoho z těchto přípravků, NPT 15458, jako inhibitoru růstu abnormíáních lymfocytů, byl stanoven. Je pozoruhodné, že NPT 15458 je schopen zabríánt p^ť^Oifera^:³ leukeoických lyofocytů (L-1210 řady buněk) u mli v tkáňové kultuře. 40% potlačení buněk L-1210 se dosahuje pomocí 10/Og/ol NPT 15458.

Konečně údaje uvedené v tabulce 3 utaauj, že při normíání tělesné hodnotě pH (7,2) oaj sloučeniny dobrou chemickou stabblitt, ale v zásadě obbasti pH se · štěpí za „účinnou * látku 15392. Jak se sezná z tabulky 9, estery a zvláště NPT 15458 · se štěpí při inkubaci s živočišnou tkání na NPT 15392. To · předurčuje, proč předmětné sloučeniny, tedy „výchozí mej shodný biologický účinek. Kromě toho údaje uvedené v tabulce 10 jasně dokládaaí, ie sloučeniny podle vynálezu mmaí alespoň dvβnáctináspbně vyááí hladinu NPT 15392 v krvi, než když se NPT 15392 samotný podává ^ším. Přitom vzniká biologicky účinná látka, když se NPT 15458 tntrsleгttsreáloě zavede injekcí. Dále je možné k tabulce 9 pozname^m) že buňky Věro (ledvinové), játrový hPlmpenOzát a HPBL vidy Štěpí zavedenou sloučeninu na biologicky účinnou sloučeninu NPT 15392.

Třída sloučenin podle vynálezu specificky potlačuje viry, mopušuje (mění nebo potlačuje) imunní odezvu a zabraňuje růstu leukemických lymfocytů. Na základě pokusů in vitro a vyšší hladiny v krvi dosahované s těmito sloučeninami, ve srovnání's NPT 15392^ které dokládá účinek nad v rozmezí 0,01 až lO0O<g/ml, je předpokládané dávkové rozmezí účinné pro savce 0,005 až 50 m/kg<

Smě^ž^ri

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou podávat savcům v dávce 1 až 1 000 mg/kg tělesné hmoseosti a může se předvídat, Se budou účinné i při úrovni tak nízké jako 0,005 m/kg.

Sloučeniny se mohou podávat ve formě tablet nebo kappsí člověku a zvířatům a pokud to rozpustnost dovoluje, také ve formě vodných sirupů nebo jako roztoky v oleji, nebo - pokud · jsou sloučeniny nerozpustné - jako suspenze. Typické farmaaeutické smmsi jsou popsány dále.

Kapple

NPT 15458

Avvcel pH 101 (mi]k‘oSkysSalická celulóza)

Suspenze

Vodná suspenze se může zpracovat oρmopí řady · suspendačních prostředků, do kterých se vpraví účinná látka. Mezi suspendační prostředky se zahrnuí takové látky, jako je nstrišmkaabosymmteehlcceušóza, alginát sodný, tragant, Avvcel RC-591 (miikr o toy stoická celulóza), meeihlcelulóza,VVeeuim a xanthanová guma, K suspendačním pros^i^Íedi^l^ům se mohou přidávat takové látky, jako jsou sladidla, ochucovadla, barviva, ochranné prostředty, ochranné koloidy a dispergační prostředky.

Sirupová směs

NPT·15458

Kukkuičný cukr

Destilovaná voda

FD a C Red 40

Sodná sůl sacharinu

Alkohol U.S.P.

Met]hrlosraben U.S.P.

Glycerin

Třešňová esence

Ovocná esence

DDstilovaná voda podle potřeby do

0,1 až 500 mg do 800 mg

0,05 ai 290 mg (nebo meatirnminí úroveň rstρuštnosti)

3,25 g

0,05 g

0,00175 g .

0,00250 g

0,08 g

0,005 g

0,001 g

0,31225 g

0,00825 g ml

Tablety
NPT 15458	0,1 . až 500	mg
//icel pH 101	130	mg
škrob, moodfikovaný	20	mg
Stearát horečnatý US.P.	5	,5 mg
Po lyviny1pyrrolidon	22	mg
tyyelina stearová US.P.	30	mg

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby esterů hydroxyalkýpurinů obecného vzorce I kde (I)

R¹ znamená alkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku a o

R znamená alkanoylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, která je popřípadě v poloze . Ω substituována karboxlovou skupinou nebo alkanoylovou skupinu ' s 2.až 5 atomy uhlíku, která je substituována v poloze a aminoskupinou, vyzneauujc se tím, že se nechá reagovat obecného vzorce II (II) kde ^r1 má výše uvedený význam, s kyselinou odpo^ísjí^ alkanoylovému zbytku nebo s jejím anhydridem, za vzniku sloučeniny obecného vzorce I;
2. Způsob podle bodu 1 , vyznaauujcí se tím, že se jako výchozí látky pobije hydroxya^lkyl^^purⁱ^nu obecné^ vzorce 11 ve rterém ^r1 znamen^{á h}exylovou skupinu s přímým tatězcem.
3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyz^ač^jcí se tím, že se hydrotqrya.lkУl01Učin nechá reagovat s N~kιačbobθnzotςyHlyuineo nebo N-karbobenzo^alaninem v přítomno oti dicyklohexylkarbodimidu a potom se N-karbobenzo^xyskupina odstraní hydrolýzou.