DK158676B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af polymere eller oligomere aminosyrederivater eller fysiologisk acceptable salte deraf. - Google Patents

Description

DK 158676 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte polymere eller oligomere aminosyrederivater med værdifulde biologiske og farmaceutiske virkninger og den i patentkravets 12 6 5 indledning viste almene formel I, hvor R , R , R, R , Y, B , n, t og r har de sammesteds angivne betydninger.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i patentkravets kendetegnende del angivne.

De omhandlede forbindelser er peptider og nedbry-10 des som andre peptider i organismen til monomere (aminosyrederivater), og disse aminosyrederivater har et bredt terapeutisk og præventivt virkningsspektrum over for sygelige forandringer der kan føres tilbage til beskadigelser af "AGAS" (det aerobiosfæriske genetiske adaptions-15 system).

Til belysning af begrebet "AGAS" opregnes i det følgende de vigtigste væv og organer der danner dette system.

a) Alle biologiske grænseflader der står i berø-20 ring med den ydre luft som biosfære (hud og huddannelser, øjets hornhinde og Conjunktiva, mund- og svælghulrum, luftveje og lunge); b) skelet og led (rørknogler og svampeagtige knogler, kugleled, synoviale membraner, skeletmuskulatur); 25 c) de til reguleringen af ionhusholdningen og del tagende organer (transepiteliske transportsystem: tarmtrævler og nyrekanal); d) det til findeling af næringen nødvendige teko-donte (i tandaveolerne med rødder fastgjorte) gebis; 30 e) høre, lugte- og stemmeorganer.

De omhandlede forbindelser udøver således en gunstig biologisk eller terapeutisk virkning på de her opregnede organer eller væv af AGAS-systemet.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstil-35 lede forbindelser virker desuden på følgende funktioner der står i sammenhæng med AGAS-systemet: strålingsbeskyttelse, begunstigelse af sårheling, almindelig aktiverende 2

DK 158676 B

virkning på mesenkym, beskyttelse mod den stadigt voksende infektions- og tilsmudsningsfare hos hud og slimhinder (den fugtige slimhindes lysozymproduktion, aktivering af fimreepiteler i luftvejene osv.), forøget beskyttelse mod 5 de af vira og svampe forårsagede infektioner.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er virksomme mod de stadigt og i høj grad stigende stress-virkninger der er knyttet til livet på fastlandet (fx meteorologisk indflydelse, store for-10 skelle mellem dag- og nattemperatur, forhøjet fare for kvæstelser), idet de stabiliserer adaptionssyndromet og samtidigt afværger glukokortikoidernes perifere vævsskader (som fx skader i bindevævet, kvæstelser af knoglema-trixbestanddele osv.). Udvikling af immunhomøostase (sti-15 gende erkendelsesevne hos legemet om hvilke· celler der er kropsegne og hvilke der ikke er).

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser udøver deres virkning dels umiddelbart, dels over reguleringen af vitamin A metabolismen, ved pro-20 duktion af vitamin A metabolitter med stærkere polær karakter. Denne virkning kan sammenlignes med parathormonets virkning på 25-hydroxycholecalciferol-1a-hydroxylase-en-zymet i nyrekanalen. Ved denne oplysning gøres den brede farmakologiske, kemiske og terapeutiske virkning hos de 25 ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser forståeligt. Virkningsretningerne af forbindelserne er følgende: A) Virkning med vitamin A-karakterj a) Farmakologiske og biokemiske virkninger: for-30 øgende virkning på kondroitinsulfatsyntese; gunstig virkning på sårhelingen eller på den ved indgift af kortison eksperimentelt forringede sårheling hos rotter og hunde; potentierende virkning på vitamin A's virkning hos rotter og høns ved eksperimentelt fremkaldte hypo- eller hyper-35 vitaminoser; dæmpende virkninger på.de ulcerations-betinge-de stress-virkninger hos rotter; begunstigende virkning på degranulationen af mastocyter; forøgende virkning på produktionen af lysozym; virkning på sporstofhusholdningen 3

DK 158676 B

(silicium, zink, kobber, mangan, fluor); fremmende virkning på epiteldannelsen; fremmende virkning på den alkaliske fosfataseaktivitetet; virkningen på den ved lokal indvirkning af vitamin A fremkaldte granulomposedannelse 5 (Granulomsackbildung); det yderst flade forløb af 'dosisvirkningskurven eller ændringen af virkningens fortegn ved store doser; aktiverende virkning på Golgi-apparatet; begunstigende virkning på dannelsen af slim- eller bægercel-ler; forøgende virkning på koncentrationen af vitamin A.

10 b) Klinisk-terapeutiske virkninger: keratokonjunk-tivis sicca; Sjagrens syndrom; rhino-laryngo-pharingitis sicca; ozæna; kronisk bronchitis; sinobronchitis; muco-viscidose; konstitutionelle lungesygdomme hos småbørn; 15 paradentose; hudens og slimhindernes smittetilbøjelighed for vira og svampe; kortison-antagonistik virkning; gunstig virkning på helingen ved operationssår og slimhindesår; erosio colli; pruritusagtige lidelser; nedsættelse af lugte- og smagssansen.

20 B) Virkninger uden vitamin A-karakter a) Farmakologiske og biokemiske virkninger: virkning på blodsukkerniveauet med hensyn til en forbigående 2^ sænkning; forøgende virkning på fosfaturi, sænkende virkning på fosfatniveauet i serum; strålingsbeskyttende virkning; formindskende virkning på den nødvendige tid der går med at nå målet ved labyrintforsøg hos inaktiverede dyr; formindskende virkning på eksperimentelt fremkaldte fluor-og kadmiumtoxikoser; forøgende virkning på den cykliske adenosinmonofosfat-udtømning af nyrerne; dæmpende virkning på symptomerne ved eksperimentelt fremkaldt lathyris-mus; formindskelse af histaminfølsomheden; forøgende virkning på aktiviteten af leverenzymet tyrosinaminotransfe-rase.

JD

4

DK 158676 B

b) Terapeutiske virkninger: svage bestrålingsskader; vitiligo; muskelhypotoni; psykoenergetiserende virkning; gunstig virkning på involutionelle og gerontologiske tilstande samt på de mnestiske funktioner; keloide 5 tilbøjeligheder; spondylosis ankylopoetica; sygdomme hos bevægelsesorganerne på grund af slid; sclerotiske fundus; amyloidose; morphæa; fibrocytisk mastopati.

Ved indgift af de ifølge opfindelsen fremstillede 10 forbindelser er behandlingens tidsmæssige varighed overordentlig forskellig. Mange sygdomme (fx rhino-laryngo-parangitis siccaT bliver ved oral indgift på daglig 3 x 5 yg allerede symptomfri efter to uger, til symptomatisk bedring af andre sygdomme (fx paradentose, Sjogrens syn-15 drom) er det nødvendigt med en til to måneder, ved endnu andre sygdomme (fx spondylosis ankylopoetica) må der behandles i etikvart til et halvt år.

Ud fra de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan der på enkel måde fremstilles 20 ønskede farmaceutiske, forebyggende eller veterinærmedicinske præparater. Præparaterne kan indeholde et enkelt virksomt stof eller en kombination af virksomme stoffer.

Dosis af en ren virksom forbindelse udgør 50-500 ng/dag/ kg legemsvægt og indgives fordelt på tre enkeltdoser.

25 En tablet indeholder 2-20 yg, fortrinsvis 10 yg ak tivt stof foruden biologisk inaktive bærestoffer.

Ved injektionspræparater udgør den hensigtsmæssige dosis pr. ampul 5-10 yg. De virksomme forbindelser kan også indgives som infusion. Suppositorier indeholder 2-30 20, fortrinsvis ca. 10 yg virksomt stof og fremstilledes ud fra kakaosmør eller andre til dette formål egnede syntetiske vokser eller fedtstoffer. Indholdet af den virksomme forbindelse i salver til heling af huden udgør 0,1— 1 yg/g. Salvegrundlaget kan være hydrofilt eller hydrofobt 35 og indeholder de sædvanlige komponenter. De virksomme forbindelser kan desuden formuleres som aerosolpræparater, hvori indholdet ligeledes udgør 0,1- 1 yg/g. Ved formulering 5

DK 158676 B

som perlinguale tabletter indeholder en tablet 10 pg virksom forbindelse, nedbrydningstiden for tabletten ligger på en halv til en time. Polymerer til retarderet afgivelse af det virksomme stof kan fx tilberedes som en su-5 spension og indeholder 1-5 pg virksom forbindelse/g polymer.

I veterinærmedicinen har de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser lignende anvendelsesområder som i humanmedicinen, dvs. fx hudskader (afskalning), sårhe-10 ling og knoglebrud.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i det følgende ved hjælp af nogle eksempler.

Eksempel 1 15 0,52 g (4 mval) a-poly-L-glutaminsyre (polymerisationsgrad 80) (Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 5, 267, 1955) opløses i 10 ml dimetylformamid og opløsningen køles med isvand. Under omrøring tilsættes der 1,39 g (10 mmol) p-2Q nitrofenol og 0,82 g (4 mmol) dicyklohexylkarbodiimid. Efter ti minutter begynder der at udskille sig dicyklohe-xylkarbamid. Blandingen omrøres en dag ved stuetemperatur hvorefter dicyklohexylkarbamidet frafiltreres, ved tilsætning af 0,3 ml iseddike omdannes det ikke omdannede di-25 cyklohexylkarbodiimid ligeledes til dicyklohexylkarbamid og også dette frafiltreres. Opløsningen udhældes i en blanding af 100 ml æter, 100 ml petroleumsæter, 20 ml ætylacetat og 2 ml iseddikesyre. Det udfældede produkt fracentrifugeres, vaskes flere gange, med æter og tørres derpå un-30 der vakuum over svovlsyre. Der vindes 0,80 g a-poly-L-glu-taminsyre-aktivester 1, hvis indhold af p-nitrofenolat udgør 2,6 mval/g.

Det infrarøde spektrum viser følgende maksima for de karakteristiske grupper: NH 3300 cm C=0 (COONP)

__ 1765 cm S C=0 (amid I) 1660 cm C=0 (amid II) 1550 cm S

35 _ i N02 1530 og 1360 cm .

6

DK 158676 B

0,25 g a-poly-L-glutaminsyre-y-p-nitrofenylester-1 opløses i 7 ml pyridin. Under omrøring tilsættes 0,125 g (1 mmol) taurin i 1 ml vand og 0,28 ml (2 mmol) i ti portioner på en sådan måde at reaktionen hele tiden for-5 løber i klar opløsning. Dertil kræves yderligere 1 ml vand. Reaktionsblandingen henstår ved stuetemperatur i tre dage hvorpå den inddampes under vakuum og remanensen tørres. Efter grundig udludning med æter rives remanensen til et pulver. Efter opløsning i vand og efterfølgende lyo-10 filisering vindes 0,20 g a-poly-Y-glutamyltaurin-1. Kro-matogrammet viser en forurening af 0,4% taurin.

Analyse: S 10,1%.

Det infrarøde spektrum udviser følgende maksima _ i for de karakteristiske grupper: OH 3100 cm (bred}; 15 C=0 (amid I) 1650 cm 1: C=0 (amid II) 1550 cm 1; S=0 (S020H) 1220, 1040 og 600 cm"1.

Eksempel 2 2Q 0,26 g (2 mval) a-poly-L-glutaminsyre (polymeri sationsgrad 580) (J.A.C.S. 80, 4631, 1958) kvældes og opløses i 15 ml dimetylformamid. Til opløsningen sættes der under omrøring 0,69 g (5 mmol) p-nitrofenol og 0,41 g (2 mmol) dicyklohexylkarbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres 25 i to dage ved stuetemperatur. Der vindes 0,30 g a-poly-L-glutaminsyre-aktivester-2.

Det infrarøde spektrum udvisr følgende maksima for _i de karakteristiske grupper: C=0 (COOH) 1720 cm . De øvrige bånd er de samme som dem der er beskrevet i eksempel 2Q 1 men de er bredere. Ud fra den vundne a-poly-L-gluta-minsyre-Y-p-nitrofenylester-2 vindes på den i eksempel 1 beskrevne måde 0,27 g lyofiliseret a-poly-y-L-glutamyltau-rin-2. Forureningen af produktet med taurin er ifølge kromatografisk undersøgelse mindre end 0,4%.

25 Analyse: S 7,3%.

Det infrarøde spektrum er identisk med det ovenfor beskrevne.

7

DK 158676 B

Eksempel 3 0,26 g (2 mval) α-L-polyglutaminsyre (polymerisationsgrad 580) opløses i 8 ml dimetylformamid. Opløsningen afkøles til -10°C i en kuldeblanding af is og kog-5 salt. Efter tilsætning af 0,28 ml (2 mmol) triætylamin gelerer opløsningen og selv ved tilsætning af yderligere 8 ml dimetylformamid og intensiv omrøring bliver den ikke flydende igen. Nu tildryppes 0,28 ml (2 mmol) klorkulsyre-isobutylester og efter 30 minutters aktiveringstid 0,16 10 g (2 mmol) cysteamin i 2 ml dimetylformamid. Reaktionsblandingen omrøres ved -5°C i to timer og derpå ved stuetemperatur i fire timer hvorpå den udhældes i en blanding af 50 ml kloroform og 50 ml petroleumsæter. Det udfældede hvide bundfald fracentrifugeres, vaskes flere 15 gange med en blanding af kloroform og petroleumsæter, kvældes nogle gange i alkohol og udfældes derpå med æter.

Der vindes 0,33 g a-poly-y-L-glutamylcysteamin.

Analyse: S 14,7%.

0,16 g a-poly-y-L-glutamylcysteamin suspenderes i 20 5 ml iseddikesyre og derpå tilsættes 1 ml 30%s hydrogen- peroxyd. Reaktionsblandingen henstår ved stuetemperatur i tre dage hvorved opløsningen langsomt klares. Den fortyndes med vand og lyofiliseres derpå. Der vindes 0,20 g hvidt a-poly-y-L-glutamyltaurin hvis kromatografisk fast-25 slåede taurin-forurening udgør 0,5%.

Analyse: S 11,9%.

Det infrarøde spektrum stemmer overens med det allerede beskrevne.

30

Som nævnt nedbrydes de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede polymere og oligomere aminosyre-derivater i organismen til de tilsvarende monomere amino-syrederivater, og det er således dem der udøver den farma-35 kologiske virkning i organismen.

Den skal belyses i det følgende ved to biologiske forsøgsrapporter, A og B. I disse rapporter vises den bio- 8

DK 158676 B

logiske virkning af fire forskellige typer af monomere amino-syrederivater dannet i organismen ved nedbrydning af de oligo-eller polymere forbindelser medr den almene formel I.

5 Biologisk forsøgsrapport A.

Undersøgelse af γ-L-glutamyltaurin,som i nærværende rapport be- tegnes litoralon._ I de efterfølgende tabeller 1-6 er forsøgsresultaterne 10 vist som middelværdier + standardafvigelse med antallet af bestem- -------melser i parantes. Bestemmelse af. om der er signifikant forskel mellem kontrolforsøg og forsøg med behandlede dyr blev foretaget med Students t-test.

15 Tabel 1

Litoralons virkning på vitamin A-koncentrationen i serum.

' Gruppe litoralon vitamin A-koncentration i serum _ug/dag_ 20 I. Kontrol - 28,3 + 0,7 (20) II. 0,1 41,9 + 1,0* (20) III. 0,3 32,9 + 1,1** (20) IV. 1,0 27,4 + 0,6 (20) 25 x P < 0,001 xx P < 0,01 20 Sprague Pawley rotter (10 hanner og 10 hunner) vejende 180-200 g behandledes oralt med de i tabel 1 angivne daglige do-30 ser litoralon i form af en vandig opløsning i en periode på 8 dage. På den 9. forsøgsdag aflivedes dyrene ved dekapitering og blodet opsamledes. Vitamin A-koncentrationen i serumet bestemtes ved Neeld og Pearsons metode.

35

DK 158676B

9

Tabel 2

Virkningen af litoralon og vitamin A på granulomdanneIse frem-kaldt af implanterede vatkugler_ 5 Gruppe Dosis Tør vægt af

Vitamin Ax litoralon granulom . lokal lokal oral " _mg _yg_yg/dag_ I. Kontrol - - - 52+1,0(24) 1Q II.Kontrol +

Opløsningsmiddel - - - 54+3,1(8) III. 2 - - 64+2,5 (8) IV. 2 0,1 - 65 + 2,7 (8) V. - 0,1 73 + 2,9 (8) 15 VI. 2 - 0,1 90 + 4,1 (8) x Hoffmann La Roche

Forskellen er signifikant; mellem gruppe II og III ved 20 P < 0,05, mellem II og V ved P < 0,001, og mellem V og VI ved P < 0,01. Granulomdannelsen bestemtes ifølge Lee et al med Sprague-Dawley hanrotter vejende 110-120 g. Tamponerne fjernedes fra de dorsolaterale subkutane implantationer efter 10 dage og vejedes efter tørring til konstant vægt ved 65°C.

25 30 35

DK 158676B

10

<*-N N *·—Ν I

CM CN CVJ W I I

Η Η H »d Ό d) ^ g w — j) h +i <1 Λ

g O β M

cm r' oo Xi >i U . ft

φ (η «3* "M* ΟΊ M* SI β M w Φ U

pj OO 00 O CSV O d)<u O

y k s s s s ^ +j X bl 4J d* H O OO OO U P- <e +· 0 + 1 +1 +1 -S ®(0 HG) Η ft Μ Η β rtj

d - 3 0) CQ

β M o W Λ O

d) β G) 00 0) Μ + H C ·· oo oo r· o r-' o βΟ +> β h ι< H O -U* CM Η H dl Ό 2 ·Η H fd 05 * ». » »· CP ft 0 1¾

Μ CM O HO CM O ·©· <U ^ W -P

ν' +| +1 + U H ffl Ό d) * 1 uro β ra 05 o P &1 0 H 1-j

ft O g M > M

o raw VO H o · +> o - T) β

ρβ τ* CM CM in Η Ί· H t7> H ft Η H

00 o vo o 00 o oh O u1 m Qj k. k. k. *k k. v k H lp ^ β d

OO OO OO O O' O (S fi W

+l +l +l V -g k 0 S « «~k <U O'

ft O' <J ιί Ή H

OM ro «.

. r~· CM vo Ό +> D d) Ή

m cm n 10 o cn Φ Ό β Η H

g ro in o cn o in o > O · ^θ> -H HOHOHO <D U d > U +1 +1 +1 +| ® <? - *

<Vk C β · β d) H

£__Ιίί d) B W Ό H

£--Ad β Φ S »ro A

ro h >1 λ !> h H IW Q U · _ n n cm H Φ β ft r-l is« ION W1M β·(β0ΐφ ned (¾ n o cm o no O' tp E « d · „p QJ κ ·» ·* *· ^ ·γ4 θ' Ό P5

Ηβ O O O OOO WOH H

<u Φ +1 +1 +1 , 5 ω o « ® O C UH O O' ro .5 <d 1 s- Η h S. u O +> Η β «1 ·

^ m Η H id <u Η H

q. HH M dP ϋ H Cd

i? Γ" H <d 00 O

Q) ril CM H vo o n 4-> S o U β -P

05 σι o r~ o σι o θ' tu 3 ft Φ Φ iu MCJ s s k. ». k. .. o « η ord Ό ro 000000 > i ft B q β j +1 +| +1 Η Μ Η 0 -Μ β c η Β h d ra φ cd <u o 2. H 2 . S å

tn φ &> -Μ A +» -P

ro o ft ni η β d) d 4J

•Η H CM Μ* ft Η β Φ > Φ H

H 3 t" cm in n in Η β O P H > Q

^ kk ·, s k k » U Ό H Cn

H & vo O ιΛ O VO O CP Φ ft β β W

> +1 +1 +1 > O o Id φ ΰ ro | U ft Ό H g Η η Φ o Φ Φ Φ ro oro η +J β Β +J .

ft rj· VO VO CM Ο Φ -P H W -P

•cm *·cm -n g O S '"s ft Φ d) (Ti ro M* -k CM s S3» ·. U Cd Eh O A t> ro 0 HO HO HO d) β I H — Φ t +l +l +1 g s s a « 3 J2 v1 -j- h h ra U enen h >1 3 β d) · d)

-u g g 0 d> ft -0 +> Ai A

s 0 cn A2H<CH0ra

O HP.W>P3edP3B ω η H UcdUftMO

c 0 SnOQtJ'OOAW

Ο P 3 ft ** ft I S -¾ £ h +jqi<o φ η ό A ra ro ω β rf « 3 o H g ”3 ® h ft ο λ „· H v, 9 n c

O ft 3 · Eh rdAJArJOS

ij ro · hh m ra ra <w cu

,_j «1 · u-( h J ft Η H O' H A

Η ο Η Η H + CQ > A Ο x ra

DK 158676 B

1t , οι ω ^ - m <u V£> VO VD Ό +?

'— — —^ E

. 0) O +1

O' XX ™ W

(d XX - o T3 οι h iH ro t n-τ β +J Λ

'i'iHfOrHinrH 0) tf H

. H o m o m o OWE

O ^ ^ *» ** ^ G

^ o o o o o o d “3 H

+ 1 + + M E o 1 m 0) h

0> H

O) <1) H

- β Η M

cn X X ' · (ΰ XX Φ Ό * Φ >α ΙΟ σι ro ΓΜ in ro +i OJ « cnoohioh ro E Φ Φ • ho no mo +* 03> O ****** H 5-t O Φ CN O O O O O O βΦΌίΗ + 1 +1+1 ω β -Θ.

τ 1 α> η Φ h β Ο1 Μ *β ή tu

Cn ft Η β Οι 0 fi 0ι Φ «β XX J « ϋ Η γ- Η es ι© Η m Η Λ Ό >ι Η Η 00 Ο Ο Η ο Ό • Η Ο Η Ο (Μ Ο » φ Ο ____ (γ") ^ *k s ». >» »»> ο nd G ro Ό-ιΗΟΟΟΟΟΟ <1)>Μ ο.+( +ι +ι η ft <d β +> Μ Ό (ΰ Φ Οι Ό β Οΐ \ (D ·Η <4* (d s οι > «0 ·-> ^ S η) ^fin Η·ί ηφ Φ ft Φ β Ό HH mo r- o +1 Λ g Η O Η O Η O β tfi β β ^ §.****** id φ +> Φ •Hr- oo oo oo ft -P > H * 2 +| +| +| £ S Η g Λ S H H H-l Φ ft *8. S -η g. § Ό *g * > W ^ 3 -H ° 3 W 0) Λ g Οι X C +* <3 (dtOOl^CNOVO 5-1 φ η -ri ro σι o in h o ® θ' id κ 0 oo r-l o ho . ’S· « Λ -ri · ****** oi to o tn h m o o o o o o .

.ri +1 +1+1 ^ r° m 2 01 ft Φ 5-1 • > m

rn m · H

ij Η H O' d m O Ό β -rt C o β

0 φ <1) * -Η N

r-l g H 10 O 4-5 XX h m m m vo m r~ ho > (d +JOOOOOO o o rd v G) Λ old η o o o H o * v 5-ι _ η β p l · ** ** ** oo+iftpQtd

o o o o o o o O

01 +1 +1 +| V V <D T3 β c -ri TI I β φ 0 Φ •ri ft ft R > H Oi 3 Φ id h l; ·· ·· +> Φ 5η Oi ο β wwid+JO+i

h CO S5^S^'H

*> oh (d (d h <d h ? h id ft ft β ft j β w h id )i θ' η η vi η φ d 0 5-i q n m Φ m · Ό O 5-1 O O' +· · Η ·Η OS H O' 0 Η +> +53.HO ββ β^4+> (d φ β Η tdrl OiOt »> 2

R ft o J in -H -ri -ri ro S

o ft ft · W W w I

jj o · H tn Ό HR .HH X 5-5 *· φ J o Η Η Ή XX Φ N > 12

DK 158676 B

Tabel 5

Litoralons virkning på Rana dalmatinas metamorfose

Gruppe Kropslængde Halelængde 5 _mm_mm_

Kontrol 45,9+0/2 31,4+0,2 (60)

Behandlede dyr 40,2 + 0,2X 26,7 + 0,2X (60) x Signifikans: P < 0,001 10 Forsøget udførtes med larver af Rana dalmatia med en alder på 30 dage, en kropslængde på 20-25 mm, og med allerede synlige fremspirende bagben. I løbet af en periode på 30 dage blev forsøgsdyrene anbragt i postevand indeholdende 0,5 ug/ml litoralon i to timer hver dag. Kontrolgruppen blev anbragt i 15 postevand uden tilsætning af litoralon. Haletudserne måltes på den 3 0. dag.

Tabel 6 2q Litoralons virkning på blodsukkerniveauet

Gruppe I. Undersøgelse II. Undersøgelse _mg %___mg %_

Kontrol 94 + 3,6 (10) 94 + 4,09 (10)

Behandlede dyr 82,4 +3,8 (10) 81 + 1,32 (10) 25

Signifikans ved I. undersøgelse: P < 0,05 Signifikans ved II. undersøgelse: P < 0,01

Hvide CGY-hanrotter med legemsvægt 160-180 g anvendtes til forsøget. Dyrene holdtes på en standard diæt. Der blev taget blodprøver på den 5. forsøgsdag efter 18 timers faste. Blodsukkerbestemmelserne udførtes efter metoden ifølge E. Hultman. Litoralon blev indgivet oralt i daglige doser på 1 ug/kg.

35 13

DK 158676 B

Biologisk forsøgsrapport B.

Undersøgelse af γ-aspartyltaurin og derivater deraf 1. β-aspartyl-N-metyltaurin 5 a) Virkning på blodsukkerniveauet ’ Kontrol 107 mg %

Behandlede dyr 93 mg %

Signifikans: P < 0/05

Til prøverne anvendtes 20-20 rotter. Målingerne gennem-10 førtes efter 18 timers faste. Den anvendte dosis var 1 μgAg legemsvægt i 4 dage i form af en opløsning ved oral indgift.

b) Virkning til forøgelse af, vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Fremkaldt vitamin A yg% 15 yg/200 g legemsvægt 0 8,5 5 11,‘0 1 11,5 0,3 12,5 20 0,1 16,1

0,05 14,S

0,01 12,5 0,005 10,5

Signifikans: P < 0,01

Til forsøgene anvendtes 20-20 Wistar ’hanrotter med legemsvægt 200-220 g.

Forsøgsperiode: 6 dage.

c) Virkning på blodets siliciumniveau:

Silicium (mg/g blod) _0 timer_20 dage_40 dage_

Kontrolgruppe 0,110+0,004 0,120+0,010 0,154+0,015

Behandlingsgruppe I 5 yg/dag 0,100+0,005 0,315+0,014XX 0,345+0,015XX · 35

Behandlingsgruppe

II 10 yg/dag 0,107+0,009 0,370+0,1B'XX 0,360+0,017XX

xx Signifikans: P < 0,001

. DK 158676B

14

Resultaterne er signifikante fra den 13. dag ved signifikansniveauet P < 0,01 og fra den 20. dag ved niveauet P < 0,001. Forsøgene udførtes på indavlede hankaniner med legemsvægt 2,5-3 kg. Den aktive bestanddel blev indgivet oralt i de i tabellen viste 5 daglige doser. Bestemmelsen af silicium udførtes ifølge Gaubatz's metode (Gaubatz E., Klin. Wschrft. 14, 1753, 1935) i 5 ml blodprøver, som blev taget fra dyrenes ørevene.

d) Virkningen af β-aspartyl-N-metyl-taurin og vitamin A på den 10 granulomfremkaldende virkning forårsaget af implantation af vat:

Gruppe Dosis Vægt af tør-

Vitamin Ax β-aspartyl-N- Sranulom metyl'taurin lokal lokal oral mg yg yg/dag 15--

Kontrol I. - - - 54+1,7

Kontrul II. + opløsningsmiddel - - - 55+3,4

Behandlingsgruppe III. 2 - - 66+12,5

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 67+2,6 ^ Behandlingsgruppe V. - - 0,1 79+2,8

Behandlingsgruppe VI. 2 - 0,1 96+4,4 x Hoffmann la Roche

Forskellene er signifikante som følger: 25 Mellem gruppe II og III P < 0,05, mellem gruppe II og V P < 0,001 og mellem gruppe V og VI P < 0,01.

Bestemmelsen af granulom udførtes på Sprague-Dawley hanrotter med legemsvægt 110-120 g ved metoden ifølge Lee et al (Lee K.H., Fu Ch.Ch., Spencer M.R. Tong T.G. og Poon R.J., Pharm.

30 Sci., 62, 895, 1973). De dorsolateralt subkutant implanterede tamponer fjernedes efter 10 dage og måltes efter tørring ved 65°C til konstant vægt.

2. β-Asparfyl-homotaurin.

35 a) Virkning på blodsukkerniveauet

Kontrolgruppe 105 mg%

Behandlet gruppe 94 mg% 15

DK 158676 B

Signifikans/ antal forsøgsdyr og forsøgsmetode var som angivet under pkt. 1 a) ovenfor.

5 b) Forøgende virkning på vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Fremkaldt vitamin A

yg/200 g legemsvægt _ugl_ 0 -8/6 5 12/0 10 1 13/5 0,3 *14,0' 0/1 15/8 0,05 15,0· 0,01 12,0 15 _0,005_10,0_

Signifikans, antal forsøgsdyr og forsøgsmetode var som angivet ovenfor under pkt. Ib).

c) Virkning på blodets siliciumniveau: 20 -

Silicium (mg/g blod) _ 0 timer_20 dage_40 dage_

Kontrolgruppe 0,104+0,009 0,134+0,015 0,157+0,020

Behandlingsgruppe xv vv I. 5yg/dag 0,094+0,007 0,309+0,01¾^ 0,340+0,014 25 _ - _

Behandlingsgruppe II, 10 ug/dag 0,109+0,010 0,372+0,120 0,363+0,018

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode som angivet ovenfor under pkt. 1 c).

30 35 16

DK 158676 B

d) Virkningen af β-aspartyl-homotaurin og vitamin A på den granu-lomfremkaldende virkning af implantation af vat;_

Dosis Vægt af tørret

Vitamin Ax- β-aspartyl- 9ranuiom 5 lokal homotaurin mg lokal oral _y g yg/dag_ .

Kontrolgruppe I - - - 52+1,5

Kontrolgruppe II - - - 53+3,2 + opløsningsmiddel

Behandlingsgruppe III. 2 - - 64 + 3.2,3

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 65+2,4

Behandlingsgruppe V. - - 0,1 77+2,6

Behandlingsgruppe VI. 2 - 0,1 94+4,2 x Hoffmann la Roche 15

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode var som angivet ovenfor under punkt ld).

3. y-Glutamyl-kolaminfosfat.

2o a) Virkning på blodsukkerniveauet

Kontrolgruppe 104 mg%

Behandlingsgruppe 93 mg%

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og dosering var som angivet ovenfor under punkt la).

25 b) Forøgende virkning på vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Vitamin A-virkning yg/200 g legemsvagt _yg%_ 0 8,8 30 5· 12,3 1 13,4 0,3 14,3 0,1 16,0 ‘0,05 15,5 35 0,01- 11,2 0,005_ . _9^2_ 17

DK 158676 B

d) Virkningen af γ-glutamyl-kolaminfosfat og vitamin A på den granulomfremkaldende virkning af vatimplantation i_

Dosis Vægt af tørret granulom

Vitamin Ax γ-glutamyl- mg 5 lokal kolaminfosfat mg lokal oral _y g yg/dag_ i

Kontrolgruppe I. - - 49 + 1,2

Kontrolgruppe II. + opløsningsmiddel - - - 50+2,9 10 Behandlingsgruppe III. 2 - 61 + 12,0

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 62+2,1

Behandlingsgruppe V. - - 0,1 74+2,3

Behandlingsgruppe Vi. 2 - 0,1 91+3,9 . _ x Hoffmann la Roche 15

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement samt bestemmelsesmetode var som angivet under 1 d) ovenfor.

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode var som angivet ovenfor under punkt 1 b).

20 c) Virkning på blodets siliciumniveau:

Silicium (mg/g blod) _0 timer_20 dage_40 dage_

Kontrolgruppe 0,106+0,011 0,136+0,017 0,159+0,022 25 Behandlingsgruppe I 5 yg/dag 0,096+0,009 0,311+0,016 0,340+0,017 x

Behandlingsgruppe VY vv II 10 yg/dag 0,111+0,011 0,374+0,121xx 0,365+0,019xx

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmel-30 sesmetode var som angivet ovenfor under punkt 1 c).

35

Claims (4)

1. 5 NH-CH-CO*- (NH-CHR6-CO) -Y I r (CH0) I I 2 η 1 CO-N-CH-(CH„).-B I \ o 2 t R R 10 hvor R betegner hydrogen, alkoxykarbonyl med 1-4 kulstofatomer i alkoxydelen eller fenyl-C1_4alkoxykarbonyl som eventuelt er substitueret med metoxy eller nitro, 2 R betegner hydrogen eller en karboxylgruppe, R betegner hydrogen eller metyl, g 15. betegner en gruppe med formlen -(CH0) -CO-N-CH - (CH0). - B1
2. 2. I i« 2 t R R Y betegner hydroxy eller C^_4alkoxy,
3. 20 B1 betegner -S020H eller -OPO(OH2), n betegner tallet 1 eller 2, t betegner tallet 1 eller 2, r angiver en gennemsnitlig polymerisationsgrad indtil en molekylvægt på højst 2000, 25 eller fysiologisk acceptable salte deraf, kendetegnet ved at en forbindelse med den almene formel NH - CH - (CH-). - B1 II I h 2 t
4. 30. R^ 2 1 ' hvor R, R og t har de ovenfor angivne betydninger og B har en af de for B angivne betydninger eller betegner -SH, omsættes med en a-poly-aminodikarboxylsyre-m-aktiveret ester med den almene formel 35 DK 158676 B R1 - NH - CH - CO -fNH - CH - CO] - Y (CT2) \ <CH2)n J III hå1 \ toV 7 r 5 hvor R , Y, n og r har de ovenfor angivne betydninger og COA betegner en aktiveret estergruppe, hvorpå man oxyderer en vunden forbindelse, der indeholder en gruppe -SH på pladsen for B , hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse 10 med formel X til et fysiologisk acceptabelt salt deraf eller omdanner et vundet salt til den fri forbindelse I. 15 " 20 25 30 35