NO146430B

NO146430B - Analogifremgangsmaate ved fremsitlling av nye, terapeutisk aktive aminosyrederivater

Info

Publication number: NO146430B
Application number: NO751504A
Authority: NO
Inventors: Laszlo Feuer; Arpad Furka; Ferenc Sebestyen; Jolan Hercsel; Erzsebet Bendefy
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1974-04-29
Filing date: 1975-04-28
Publication date: 1982-06-21
Also published as: NO149036B; ATA624777A; DK442577A; DK245783D0; DE2518160C2; DK442377A; AT351007B; BG26517A4; ATA624877A; AU499173B2; SU747419A3; DK155672B; DK442977A; CH624098A5; CS209857B2; DK155433C; DK159654B; DK155732B; NO751504L; AT361902B

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte ved fremstilling av nye, terapeutisk aktive aminosyrederivater. Fremgangsmåteforbindelsene har verdifulle biologiske og farma-søytiske virkninger.

De ifølge oppfinnelsen fremstilte aminosyrederivater fremgår av innledningen til kravet, og de anvendte fremgangsmåter er angitt i kravets karakteristikk.

Blant fremgangsmåteforbindelsene må på grunn av deres, biologiske aktiviteter, særlig Y-L-glutamyl-taurin fremheves, hvilken forbindelse har formelen:

og som har et bredt terapeutisk og preventivt virkningsspektrum for sykelige forandringer som middelbart eller umiddelbart er tilbakeførbare til skader ved "AGAS" (aerobiosfæriske genetiske adapsjonssystem).

For forklaring av begrepet "AGAS" oppregnes i det følgende de viktigste vev og organer som danner dette system.

a) Alle biologiske grenseflater som står i berøring med den ytre luft som biosfæren (hud og hudvev, Cornea og

Konjunktiva, munn- og halshulen, pusteveier og lunger);

b) Skjelett og lemmer (rørknokler og svampaktige knoker, kuleledd, synovialmembran, skjelettmuskulatur); c) De organer som tar del i reguleringen av ionehudholdningen (transepiteliske transportsystem: tarmtotter og nyrekanaler); d) Det for findeling av næringen nødvendige thecodonte (i tann-alveolene med røtter festede) tannsett; e) Høre-, lukte- og stemmeorganer.

Fremgangsmåteforbindelsene utøver altså en gunstig biologisk, henholdsvis terapeutisk virkning på de her oppregnede organer, henholdsvis.vev av AGAS-systemet.

Fremgangsmåteforbindelsene virker videre på de følgende funksjoner som står i sammenheng med AGAS-systemet: Strålebe-skyttelsesVirkning, begunstiger sårlægning, alminnelig aktiverende virkning på Mesenchyma, beskyttelse mot den stadig økende infeksjons- og tilsmusningsfare av hud og slimhinner (Lysozym-dannelse på den fuktige slimhinne, aktivering av flimmerepiteler i luftveiene osv.), øket beskyttelse mot de av virus og sopper forårsakede infeksjoner.

Mot de stadig og i høy grad økende stressvirkninger (f.eks. meterologiske innflytelser, sterke forskjeller mellom dag- og nattemperatur, øket risiko for skade) i livet på fastlan-det er fremgangsmåteforbindelsene virksomme idet de stabiliserer adapsjonssyndromet og samtidig avverger de perifere vevskader av glucocorticoider (således f.eks. skader på bindevevet, skader på knokkelmatriksen osv.). Utvikling av immun-homøostase (øket er-kjennelsesevne hos kroppen, for hvilke celler er kroppegne og

hvilke ikke er det).

Fremgangsmåteforbindelsene utøver sin virkning tildels umiddelbart, til dels over styringen av vitamin A-metabolismen, ved dannelse av vitamin A-metabolitter gir sterkere polar karakter. Denne virkning er sammenlignbar med den for parathormonets på 25-hydroxy-cholecalciferol-la-hydroxylase-enxymet i nyrekana-lene. Ved denne forklaring blir den brede farmakologiske, biokjemiske og terapeutiske virkning av fremgangsmåteforbindelsene forståelig. Virkningsretningene av forbindelsene er følgende:

A) Virkninger med vitamin A karakter:

a) Farmakologisk og biokjemiske virkninger: Merket sulfat innebygges i høy grad i brystbensbrusken hos rotter henholdsvis øyelinsen, lever- og lungevev hos hønsefostre; radio-aktivt merket fosfor innebygges i øket grad brystbensbrusken hos rotter; chondroitinsulfatsyntese-økende virkning; gunstig virkning på sårlægning henholdsvis den ved administrasjon av cortison eksperimentelt nedsatte sårlægning hos rotter og hunder; potensiell virkning på virkningen av vitamin A på eksperimentelt fremkalt hypo- henholdsvis hypervitaminoser i rotter og hunder; dempende virkninger på ulcus-betingende stressvirkninger hos rotter; begunstigende virkning på degranulasjon av mastocyter; økende virkning av produksjonen av Lysosym; virkning på hushold-ningen av sporelementene (silicium, zink, kobber, mangan, fluor); fremmende virkning på epiteldannelse; økende virkning av den alkaliske fosfataseaktivitet; den utøvede virkning på den ved lokal innvirkning av vitamin A frem-kalte granulomsekkdannelse; det meget flate forløp av dose-virkningskurven henholdsvis endringen i fortegn av virkningen ved store doser; aktiverende virkning på golgi-1 apparatet; begunstigende virkning på dannelsen av begerceller; økende virkning på konsentrasjonen av vitamin

A.

b) klinisk-terapeutiske virkninger: keratocunjunctivis sicca; Sjogren-syndrom; rhino-laryngo-pharyngitis sicca;

ozaena; kronisk brbnkit, sinobronchitis; Mucoviscidose; konstitusjonelle lungesykdommer hos småbarn; paradentose; infeksjonstilbøyelighet hos hud og slimhinner overfor virus og fungus; cortison-antagonistisk virkning; gunstig virkning på lægning ved operasjonssår og slimhinnesår; erosio colli; pruritus-aktig; nedsettelse av lukt- og smakssans.

Virkning uten vitamin A-karakter:

a) Farmakologiske og biokjemiske virkninger: Virkning på blodsukkerspeilet i form av den forbigående senkning;

økende virkning på fosfaturiet, senkende virkning på fos-forspeilet i serum; strålebeskyttende virkning; ved laby-rintforsøk med inaktive dyr nedsetter virkning på den tid som kreves for å nå målet; nedsettende virkning på eksperimentelt fremkalt fluor- og cadmiumtoxikose; økende virkning på den cykliske adenosinmonofosfat-uttømning av nyrene; begrensende virkning på symptomene av eksperimen-

telt fremkalt Lathyrismus; nedsettelse av histaminfØlsom-het; økende virkning på aktiviteten av leverenzymet Tyrosinaminotransferase. b) Terapeutiske virkninger: svake stråleskader; viti-ligo; muskelhypotoni; psykoenergetiserende virkning;

gunstig virkning på involutionelle og gerontologiske til-stander såvel som på mnestiske funksjoner; cheloide tilbøyeligheter; Spondylosis ankylopoetica; på slitasje bestående lidelser i bevegelsesorganene; sclerotisk fun-dus; amyloidose;' morfea; fibrocystisk mastopathia.

Ved administrasjon av fremgangsmåteforbindelsene er varigheten av behandlingen meget forskjellig. Mange sykdommer (f.eks. Thino-laryngo-pharyngitis sicca) blir ved oral administrasjon av 3 x 5 mikrogram daglig symptomfri allerede etter 2 uker, for symptomatisk bedring av andre sykdommer (f.eks. paradentose, Sjogren-Syndrom) er 1 til 2 måneder nødvendig, ved nok andre sykdommer (f.eks. spondylosis ankylopoetica) og behandlingen fortsettes i 1/4 til 1/2 år.

Av fremgangsmåteforbindelsene kan på enkel måte fremstilles farmasøytiske, preventive, kosmetiske henholdsvis vete-rinærmedisinske preparater etter ønske. Preparatene kan inne-holde et enkelt virkestoff eller en virkestoffkombinasjon.

Dosen av rent virkestoff utgjør 50 - 500 ng pr. dag og kg legemsvekt og administreres fordelt på tre enkeltdoser.

En tablett inneholder 2 - 20 ug, fortrinnsvis 10 ug virkestoff og dessuten biologisk inerte bærere (f.eks. melkesuk-ker, stivelse) såvel som de vanlige tabletteringshjelpemidler (granuleringsmidler og glidemidler, som f.eks. polyvinylpyrroli-don, gelatin, talkum, magnesiumstearat,"Aerosil' osv.).

På grunn av de overordentlig små doser er det hensiktsmessig å tilsette virkestoffet til tablettmassen allerede før granuleringen i form av en oppløsning. På denne måte blir virkestoffet jevnt fordelt. Det lille virkestoffinnhold gjør det dessuten mulig ved fremstilling av mange millioner tabletter årlig å fremstille disse i et stort laboratorium og da til en pris som er akseptabel for enhver pasient. Virkestoffene er stabile, tablettene kan derfor bringes i handelen uten angivel-se av en frist for bruken. Virkestoffinnholdet av protrahert virkende tabletter henholdsvis spansulære kapsler kan ligge ved 10 - 20 ug. Ved injeksjonspreparater utgjør den hensiktsmessi-ge dose pr. ampulle 5-10 Ug, og preparatet kan eventuelt tilberedes som pulverampuller, hvori virkestoffet foreligger blandet med et indifferent, vannoppløselig fortynningsmiddel. De parenterale administrasjoner kan foretas intramuskulært, sub-cutant eller intravenøst. I den angitte konsentrasjon skader virkestoffene hverken vev eller karvegger. Virkestoffene kan også administreres som infusjon. Stikkpiller inneholder 2-20, fortrinnsvis ca. 10 Mg virkestoff og fremstilles av kakaosmør eller av syntetiske vokser eller fett (f.eks. den i Forbunds-republikken Tyskland fremstilte "Imhausen-Masse") som er egnet for dette formål. Virkestoffinnholdet av kosmetiske eller til lægning av hud tjenende salver utgjør 0,1-1 yg/g. Salvebasis kan være hydrofil eller hydrofob og inneholder de vanlige be-standdeler: f.eks. cholesterin, paraffin, glycerol, lanolin, kakaosmør, linolje osv. Virkestoffene kan videre opparbeides som aerosolpreparater, idet virkestoffinnholdet likeledes utgjør 0,1 - 1 ug/g- Ved opparbeidelsen som perlinguale tabletter inneholder en tablett 10 ug virkestoff, og oppløsningstiden av tabletten ligger ved \ - 1 time. Polymerer for å retardere av-givelsen av virkestoffet kan f.eks. tilberedes som suspensjoner og inneholder 1-5 Ug' virkestoff pr. g polymer. Injeksjonspreparater med protrahert virkning kan enten fremstilles under anvendelse av høymolekylære polymerer eller av de med høymoleky-lære organiske baser (f.eks. Histon, Protamin) dannede salter av fremgangsmåteforbindelsene, idet en ampulle inneholder 10 - 20 Ug virkestoff. Pudder for kosmetiske eller hudlægningsformål tilberedes i de vanlige bærestoffer (f.eks. talkum) og inneholder 0,1 - g virkestoff pr- g pudder. For øyenbehandling fremstilles forbindelsene som dråper henholdsvis som salver som er blandbare eller ikke med tårevæsken; og virkestoffinnholdet av disse preparater utgjør 0,1-1 Ug/g. Barn skal gis fremgangsmåteforbindelsene i en dosering på ca. 0,3 yg pr. kg legemsvekt.

De sterile preparater fremstilles hensiktsmessig ved sterilfiltrering.

Den ønskede preventive farmakologiske, henholdsvis kosmetiske virkning av de ovenfor anførte preparater kan økes og utvides ved tallrike kombinasjoner. Som mulige biologisk aktive tilsetninger anvendes i første rekke de følgende uttryk-kelig nevnte: Vitaminene A, C, E og K, sporelementer, cortison og dets derivater, progesteron, skjoldbruskkjertelhormoner, radio-mimetiske og immunsupressivt virksomme stoffer, psykofarmaca, særlig psychosedativer, timoleptica, organiske siliciumforbin-delser, gerontologiske preparater, stoffer som senker 'chole-sterinspeilet i blodet, orale antidiabetica, inflammasjonshem-mende stoffer, antihistaminer osv. Doseringen av disse aktive tilsetninger er i alminnelighet den samme som ved de vanlige terapeutiske doser ved anvendelse av stoffene alene.

Fremgangsmåteforbindelsene kan også anvendes som tilsetning til næringsmiddel- henholdsvis legemiddel-forblandinger. De bevirker dels en vektøkning, dels nedsetter de behovet for vitamin A henholdsvis forbedrer de dennes metabolisme. Videre øker forbindelsene resorpsjonen av sporelementene, deres speil i blodet heves. Ved anvendelse av forbindelsene som tilsetning til dyrefor utgjør doseringen oralt hensiktsmessig 200 ng/kg og dag. Blandet i foret tilsvarer dette omtrent en konsentrasjon på 1 - 2 ug/kg, henholdsvis 1-2 mg/tønne for, dvs. en konsentrasjon på 0,001 - 0,002 ppm. I lys av disse meget lave konsen-trasjoner er anvendelsen som forstofftilsetning ytterst økono-misk. Fortrinnsvis blandes forbindelsene til vitamin-forblandinger eller anvendes i mikrokapsler, som foruten fremgangsmåteforbindelsene inneholder andre nødvendige forstofftilsetninger. Forbindelsene kan videre anvendes i drikkevannet, i slikkesal-tet eller eventuelt' ,også som spray.

I veterinærmedisinen har fremgangsmåteforbindelsene lignende anvendelsesområder som i humanmedisinen, dvs. f.eks. hudskader (avskalinger), sårlægning, knokkelbrudd, osv.

Det er en felles strukturegenskap hos alle forbindelsene med den generelle formel (I), at de inneholder en i a-stilling substituert dicarboxylsyre eller dens også på andre steder ytterligere su-bstituerte derivat, over hvis w-carboxylgruppe med en syreamidbinding er bundet et primært eller sekundært alkylamin, som foruten forskjellige substituenter på sine alkyl-sidekjeder i w-stilling inneholder en gruppe med sterkt sur karakter.

Gjenstanden for foreliggende oppfinnelse er analogi-fremgangsmåter ved fremstilling av forbindelsene med den generelle formel (I), dens salter og optiske isomerer. Forbindelsene fremstilles ifølge oppfinnelsen som angitt i kravets karakteristikk.

Ved den utførlige beskrivelse av utførelsesformene av foreliggende fremgangsmåte skal først fremgangsmåtevarianten i) omtales, ifølge hvilken forbindelsene med den generelle formel (I) fremstilles ved dannelse av en syreamidbinding. Ved denne blir et på amino- eller på anino- og a-carboxylgruppen med en beskyttelsesgruppe, henholdsvis flere beskyttelsesgrupper,

eller også med andre grupper substituert derivat av en a-aminodicarboxylsyre over sin u>-carboxylgruppe koblet f.eks. til 2-aminoethansulfonsyre, 3-aminopropansulfonsyre eller 2-fosfon-ethanolamin. Ved utformningen av syreamidbindingen kan forskjellige beskyttelsesgrupper anvendes. Den best egnede koblings-metode er aktivester-metoden (monografi for dannelse og selektiv fjernelse av beskyttelsesgrupper og koblingsmetoder: E.Schroder, K. Liibke: The Pepl^.des, Vol.l: Methods of peptide synthesis, Academic Press, 1965).

Ifølge variant h) av foreliggende fremgangsmåte kan man også gå frem ved at man acylerer cystamin eller dets substituerte derivater på aminogruppen ved a-aminodicarboxylsyre-derivater. Acyleringen av cystamin kan utføres ved forskjellige metoder (aktivestermetoden, fremgangsmåten med blandet anhydrid). De derved erholdte forbindelser kan ifølge fremgangsmåtevariant

f) omsettes med hydrogenperoxyd eller persyrer, hvorved disulfid-bindingen spaltes oxydativt og der dannes en forbindelse med den

generelle formel (I).

Likeledes fører fremgangsmåtevariant d) til forbindelse med den generelle formel (I) idet der først fremstilles oi-amidet av en ot-aminodicarboxylsyre, som i amindelen istedenfor en sterkt sur funksjonell gruppe inneholder en annen funksjonell gruppe, f.eks. en sulfhydryl- eller sulfinsyrefunksjon. Fra disse forbindelser fremstilles de ønskede forbindelser ved oxydasjon. Er den funksjonelle gruppe et halogenatom eller en p-toluensulfonylgruppe (J. Chem. Soc. 824, 1964), fåes ved substi-tusjon med alkalisulfit eller alkalihydrogensulfit forbindelser med den generelle formel (I), som inneholder en sulfogruppe. Forbindelser med den generelle formel (I), som inneholder en hydrogensulfat- eller dihydrogenfosfatgruppe, fåes ved forest-ring av hydroxylgruppeholdige forbindelser. Inneholder utgangs-forbindelsen en sulfonsyreestergruppe, fåes forbindelsene med den generelle formel (I) ved skånsom partiell hydrolyse.

Videre kan man gå ut fra glutamin eller asparagin eller deres substituerte derivater (med unntagelse av syreamidet). I dette tilfelle blir ifølge fremgangsmåtevariant e) et syre-amid-hydrogenatom som har sur karakter substituert med metal-lisk natrium og den på denne måte erholdte forbindelse omdannes ved omsetning med 2-bromethansulfonsyre eller dets salter eller alkensulfonsyre til en forbindelse med den generelle formel (I). Som utgangsforbindelse anvendes w-amider av a-aminodicarboxyl-syrer, f.eks. u)-vin<y>lamidet eller et co-amid, i hvilket amin-komponenten er en nitrogenholdig ringforbindelse med tre ledd (aziridin). Til begge forbindelsestyper kan adderes alkali-eller alkalihydrogensulfit, hvorved forbindelser med den generelle formel (I) dannes.

Ved fremgangsmåtevariant g) dannes først alkalisaltet av ct-aminoglutarimid eller ct-aminosuccinimid og dette alkyleres så på imidnitrogenet. Som alkyleringsmiddel kan f.eks. anvendes 2-bromethansulfonsyre eller 3-brompropansulfonsyre. Det på denne måte erholdte N-sulfoethyl-, henholdsvis N-sulfopropyl-derivat, blir så partielt hydrolysert i svakt alkalisk medium, hvorved der overveiende dannes u-amidet fra ringforbindelsen. Dette kan befries for de små mengder a-amid ved ioneutbytnings-kromatografi.

Eksempel 1

Fremstilling av y- L- glutamyltaurin

(a) 40,85 g (0,11 mol) carbobenzyloxy-L-glutaminsyre-a-benzylester (Liebigs annaler 655, 200, 1962) oppløses i 500 ml acetonitril. Oppløsningen avkjøles under utelukkelse av luftfuktighet til -15° C. Under omrøring tildryppes oppløsningen først 15,4 ml (0,11 mol) triethylamin og derpå 15,4 ml (0,11 mol) klormaursyreisobutylester. Reaksjonsblandingen omrøres ved -15° C i 40 minutter, og tilsettes så 28 ml (0,2 mol) triethylamin, og derpå 11,26 g (0,05 mol) cystamin-hydroklorid og tilslutt 250 ml acetonitril. Blandingen omrøres i nok 2 timer ved

-15° C, og derpå ved værelsetemperatur i ytterligere 4 timer.

Ved utløpet av reaksjonstiden inndampes blandingen

ved 30° C i vakuum. Residuet opptaes under omrøring og avkjø-ling i 200 ml isvann og blandingen inndampes ved 35° C på nytt i vakuum. Residuet innføres sammen med 250 ml vann og 500 ml. ethylacetat i en skilletrakt og den organiske fase fraskilles. Den organiske fase utrystes etter hverandre med først 250 ml

vann, derpå med 2 x 250 ml 5 %-ig natriumcarbonatoppløsning,

derpå med 2 x 250 ml IN saltsyre og tilslutt med 250 ml vann.

(Fra den ved utrystning med natriumcarbonatoppløsning erholdte vandige fase kan ved surgjøring med saltsyre og utrysting med ether ca. 5 g ikke omsatt carbobenzyloxy-L-glutaminsyre-a-benzylester gjenutvinnes). Ethylacetatfasen tørres over vann-fritt natriumsulfat og inndampes så i vakuum ved 30° C til tørrhet. Et tykt, oljeaktig residuum fåes, som straks størk-

ner til en krystallinsk masse. Denne rives med 250 ml absolutt ether, og krystallene frafiltreres. Råproduktet (40 - 42 g) omkrystalliseres fra en blanding av 100 ml ethylacetat og 170

ml ether. Man får 2?,3 g N,N'-bis-(N-carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl)--cystamin som smelter med 91 - 92° C.

Elementæranalyse for C44H5oN4°ioS2 ^M = 859 ,05^

Beregnet: C 61,52 %, H 5,89 %, N 6,52 %, S 7,46 %

Funnet : C 60,85 %, H 5,91 %, N 6,61 %, S 7,72 % (b) 25,77 g (0,03 mol) av det i eksempel l(a) erholdte N, N 1 -

bis-(N-carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)- L-glutamyl)-cystamin opp-løses i 75 ml iseddik. Til den i isen avkjølte oppløsning tildryppes i løpet av 15 minutter en friskt tilberedt blanding av 75 ml 30 %-ig hydrogenperoxyd og 225 ml iseddik. Etter tilsetning taes kjølingen bort og reaksjonsblandingen omrøres ved værelsetemperatur i 4 timer. Derpå inndampes i vakuum ved 30°C Det oljeaktige produkt tørres først i eksikator over fosforpentoxyd og derpå over fast kaliumhydroxyd. Man får 28,5 g carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin. Råproduktet kan uten rensing anvendes til fremstilling av y-L-glutamyltaurin.

(c) 26,32 g (55 mmol) av det i eksempel 1(b) fremstilte carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin oppløses i 50 ml iseddik. Oppløsningen tilsettes 4 mol hydrogenbromid oppløst i 50 ml iseddik. En livlig carbondioxydutvikling iakttaes. Reaksjonsblandingen hensettes ved værelsetemperatur i 2 timer

og inndampes så i vakuum ved 30° C. Det oljeaktige residuum oppløses i 170 ml vann og utrystes med 5- x 70 ml ether. Vannfasen inndampes i vakuum ved 35° C. Man får 20,42 g y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin, som omkrystalliseres fra 90 %-ig ethanol.

Smp. 204 - 208°C.

Rf (n-butanol-pyridin-iseddik-vann (15:10:3:12) = 0,53 R4 (n-butanol-iseddik-vann 4:1:1) = 0,39 (d) 20,42 g av det i eksempel 1(c) erholdte y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin oppløses i 150 ml IN kaliumhydroxydoppløsning. Oppløsningen hensettes ved værelsetemperatur i 4 timer og på-føres så på en Dowex® 50 x 2 (Fluka, 100 - 200 mesh) kolonne 2 cm i diameter og 100 cm høy. Der elueres med vann. Regnet fra begynnelsen av utvaskningen oppfanges 300 ml eluat. Dette inndampes i vakuum ved 35° C. Det oljeaktige residuum krystalliseres ved tilsetning av 8 - 10 ml vann og ca. 100 ml ethanol. Etter filtrering, vasking med alkohol og tørring får man 13,7 g Y-L-glutamyltaurin. Det krystallinske produkt omkrystalliseres fra 80 %-ig vandig alkohol. Man får 9,79 g rent produkt, hvilket tilsvarer 70 % beregnet på N,N'-bis-(N-carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl)-cystamin.

Det dannede y-L-glutamyltaurin har et IR-spektrum som for de katakteristiske grupper oppviser følgende maksima: •0NH3+ x OH 3600-2400; NH (amid) 3315; CO (carboxyl) 1758; -) CO (amid) 1666 ; -5 NH3<+> 1576; ■) S03~ 1296, 1031 cm"<1.>

Eksempel 2

Fremstilling av y- L- glutamyltaurin

(a) 5,29 mg (1,1 mmol) av det i eksempel 1(b) fremstilte carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin oppløses i 5 ml ln kaliumhydroxydoppløsning og hensettes ved værelsetemperatur i 4 timer. Derpå utrystes oppløsningen med 3 x 3 ml ether. Vannfasen påføres på en med Dowex 50x2 fyllt kolonne (1 cm i diameter og 20 cm høy) og elueres med vann. Man oppfanger 50 ml oppløsning som inndampes i vakuum ved 35° C til tørrhet. Man får rå carbobenzyloxy-y-L-glutamyltaurin som renses ved papirelektroforese ved pH 6,5. Den relative bevegelighet i forhold til cysteinsyren utgjør 1,05.

Rf (n-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,57

(b) Det ifølge eksempel 2(a) fremstilte carbobenzyloxy-y-L-glutamyltaurin oppløses i 2 ml iseddik inneholdende 4 mol hydrogenbromid. Blandingen hensettes ved værelsetemperatur i 1/2 time og inndampes så i vakuum ved 35°C. Residuet tritureres flere ganger med ether og skilles så fra etheren ved dekantering.

Råproduktet omkrystalliseres flere ganger fra 80 %-ig ether. Man får 2,0 2 g rent sluttprodukt, hvilket tilsvarer et utbytte på 66 % beregnet på N,N'-bis-(N-carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl)-cystamin. Det rene produkt smeltet ved 219 - 220° C. (a}20 = +14° (vann, c = 1,02). Den relative bevegelighet i forhold ?il cysteinsyre med papirelektroforese ved pH 6,5 er 0,73, ved pH 1,8 0,53.

R^ (n-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,19.

Analyse for C^^OgS (M = 254,27).:

Beregnet: C 33,07 %, H 5,55 %, N 11,02 %, O 37,75 %, S 12,61 % Funnet : C 33,15 %, H 5,76 %, N 10,94 %, O 37,53 %, S 12,17 %

Eksempel 3

Fremstilling av y- L- glutamyltaurin

5,79 g (12,1 mmol) av det i eksempel l(b) fremstilte carbobenzyloxy-y<->(a-benzyl)- L-glutamyltaurin oppløses i en blanding av 100 ml ethanol og 25 ml vann og hydrogeneres under rysting i nærvær av 0,5 g 10 %-ig palladiumkull som katalysator. Katalysatoren tilsettes hensiktsmessig i to porsjoner, hver på 0,25 g. Når ingen hydrogenopptagelse lengre skjer, filtreres oppløsningen og inndampes så ved 30° C i vakuum. Det oljeaktige residuum tørres i eksikator og fosforpentoxyd. Man får 3,1 g y<->L-glutamyltaurin, som er godt oppløselig i vann men ikke opp-løselig i alkohol. Ved tilsetning av litt vann og alkohol i små porsjoner kan produktet krystalliseres. Det krystallinske råprodukt smelter ved 202 - 204° C.

Råproduktet omkrystalliseres flere ganger fra 80%-ig ethanol. Man får 2,02 g rent sluttprodukt, hvilket tilsvarer et utbytte på 66% beregnet på N,N'-bis-[N-carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl]-cystamin. Det rene produkt smeltet ved 219 - 220°C. [a^° = +14° (vann, c = 1,02). Den relative bevegelighet i forhold til cysteinsyre med papirelektroforese ved pH 6,5 er 0,73, ved pH 1,8 0,53.

Rf (n-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,19.

Analyse for C^-^N^S (M = 254,27):

Beregnet: C 33,07%, H 5,55%, N 11,02%, 0 37,75%, S 12,61% Funnet: C 33,15%, H 5,76%, N 10,94%, 0,37,53%, S 12,17%

IR-spektret oppviser for de karakteristiske grupper følgende maksima: •J NH3+ x OH 3600-2400; -J NH (amid) 3315; s> CO (carboxyl) 1758 ; ■) CO (amid) 1666 ; ^ NH3<+> 1576; •5S03~ 1296, 1031 cm"<1>.

Eksempel 4

Fremstilling av y- L- glutamyltaurin

5,42 g (11 mmol) carbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-benzyl)-y-p-nitrofenylester (Chem. Ber. 9_6 , 204, 1963) oppløses i 50 ml pyridin. Oppløsningen avkjøles til 0° C og i løpet av h time tildryppes under intens omrøring en oppløsning av 1,25 g (10 mmol) taurin. Derpå tilsettes blandingen 3,08 ml (22 mmol) triethylamin, og avkjølingen og røringen stanses. Blandingen hensettes ved værelsetemperatur i 72 timer og inndampes så i vakuum. Residuet oppløses i 50 ml vann og den gule oppløsning tilsettes IN saltsyre inntil den avfarves. For å-fjerne p-nitro-fenolet utrystes oppløsningen med 10 x 50 ml ether. Vannfasen inndampes i vakuum. Man får 6,9 g carbobenzyloxy-Y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin-triethylammoniumsalt.

Forbindelsen hydrogeneres katalytisk som beskrevet .i eksempel 3, og oppløsningsmidlét fjernes ved inndampning i. vakuum. For å fjerne triethylamin oppløses materialet i litt vann og påføres på en Dowex<®> 50x2 kolonne 2 cm i diameter og 40 cm høy. Der elueres med vann. Man oppfanger ca. 120 ml eluat som inndampes i vakuum ved 35° C. Krystallisasjon og iso-lering av produktet skjer som beskrevet i eksempel 3. Man får 1,72 g y-L-glutamyltaurin, hvilket tilsvarer 68% utbytte beregnet på taurin.

IR-spektret var som angitt i eksempel 3.

Eksempel 5

(a) 0,48 g (1 mmol) carbobenzyloxy-ct-L-glutamyl— (y-p-notrofenylester)-glycinethylester (Acta Chim. Acad. Sei. Hung. 65, 375 , 1890) oppløses i 6 ml ethylacetat. Oppløsningen avkjø-les med isvann. Ved 0° C tilsettes.oppløsningen først 0,08 g

(1 mmol) cysteamin i 1 ml dimethylformamid, og tildryppes så 0,14 ml (1 mmol) triethylamin. Langsomt begynner et bunnfall å utfelles. Reaksjonsblandingen holdes ennu noen tid i isvann, hensettes så én dag ved værelsetemperatur og fortynnes til slutt med en 1:1-blanding av ether og ethylacetat. Bunnfallet frasentrifugeres og vaskes først med en 4:1 blanding av ether og ethylacetat og derpå flere ganger med ether. Etter tørring over svovelsyre vaskes bunnfallet tre ganger med IN saltsyre.

to ganger med vann, to ganger med mettet natriumhydrogencarbo-natoppløsnlng og tilslutt igjen to ganger med vann, og tørres så i vakuum over svovelsyre. Man får 0,35 g carbobenzyloxy-a-L-glutamyl- (y-cysteamin) -glycinethylester , hvilket tilsvarer et utbytte på 85 %.

Analyse for Cl8<H>25<06N>3<S> (M = 411,4):

Beregnet: C 52,6 %, H 6,13%, S 7,8 %

Funnet : C 53,4 i, H 6,5 I, S 7,7 8

Det infrarøde spektrum oppviser følgende maksima for de karakteristiske grupper: NH 3310 cm"<1>, C=0 (COOEt) 1748 cm"<1>, C=0 (Z) 1690 cm-1, C=0 (amid) 1655 cm"<1>.

100 mg carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-cysteamin)-glycinethylester oppløses i 2 ml iseddik og oppløsningen tilsettes 0,5 ml 30 %-ig hydrogenperoxyd. Reaksjonsblandingen hensettes i 4 timer under isvannavkjøling. Reaksjonens gang følges ved papirelektroforese. Etter fortynning med vann lyofiliseres reaksjonsblandingen. Man får sluttproduktet i form av et skum. Man får 0,11 g carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycin-ethylester (95 %) .

b) 100 mg av den ifølge eksempel 5(a) fremstilte carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinethylester oppløses i en

blanding av 1 ml trifluoreddiksyre og 1 ml konsentrert saltsyre. Oppløsningen holdes i 3 timer ved 35° C i et lukket skyterør. Derpå inndampes oppløsningen i vakuum, residuet digereres med ether og n-hexan og inndampes så påny. Man får et hvitt amorft stoff som ved elektroforetisk undersøkelse viser seg å være enhetlig og gir en positiv ninhydrinflekk. Produktet er a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycin. Utbytte er 0,06 g (88 %).

Analyse for C9<H>3<0>7S (M=311,3)

Beregnet: S 10,3 %

Funnet : S 10,0 %

Det infrarøde spektrum viser følgende maksima for de kjennetegnende grupper: NH* 3100 cm"<1> (bredt); OH (COOH)

3200 cm<_1> (bredt); C=0 (COOH) 1730 cm"1; C=0 (amid-I) 1680 cm<-1>, C=0 (amid-II) 1560; S=0 (SO2OH) 122o cm"<1> (intensiv);

S=0 (S020~) 1045 cm"<1> (intensiv).

Hydrolyse: 20 mg av forbindelsen holdes i 1 ml 6N saltsyre i

et tilsmeltet glassrør i 24 timer ved 105° C. Etter avkjøling underkastes en prøve av oppløsningen elektroforese ved pH 1,8. Oppløsningen inneholder glutaminsyre, glycin og taurin. (c) 100 mg av det i eksempel 5(b) fremstilte a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycin oppløses i 25 ml av en 0,2 molar ammoniumhydrogencarbonatpuffer med pH 8,5. Oppløsningen tilsettes 1 mg carboxypeptidase A oppløst i 0,5 ml vann. (Produsent av enzymet: Serva, Heidelberg). Blandingen holdes ved 37° C i termostat i 24 timer og lyofiliseres så. I det tørre lyofilisat kan Y~L-glutamyltaurin og glycin påvises. Det rene y^-glutamyl-taurin kan utvinnes ved elektroforese eller kromatografi på en Dowex 50 kolonne.

Eksempel 6

Fremstilling av y- L- glutamyltaurin

(a) 0,47 g (1 mmol) carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-p-nitrofenylester)-glycinmethylester oppløses i 6 ml pyridin. Under isavkjøling tilsettes oppløsningen først 0,125 g (1 mmol) taurin i 2 ml vann, og derpå 0,28 ml (2 mmol) triethylamin i så små porsjoner at oppløsningen alltid forblir klar. Reaksjonsblandingen hensettes ved værelsetemperatur i 3 dager. Etter inndampning i vakuum fåes en olje som etter digerering i ether og derpå i petrolether føres i vakuum over svovelsyre. Man får carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinmethylester. (b) 100 mg av den ifølge eksempel 6(a) fremstilte carbobenzyloxy-a-L-glutamyl- (y -taurin) -gly cinmethylester omsettes med 4,ml 2N eddiksurt hydrogenbromid ved værelsetemperatur, inntil alt stoff er gått i oppløsning (ca. 30 min). Den erholdte klare oppløsning heldes i 30 ml ether og hensettes på et kjølig sted i 1 dag. Det dannede bunnfall frasentrifugeres, vaskes flere ganger med ether og tørres så i vakuum over kaliumhydroxyd, svovelsyre og fosforpentoxyd. Som den elektroforetiske under-søkelse viser fåes hydrogenbromidet av a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinmethylesteren i praktisk talt ren form. (c) Det ifølge eksempel 6(b) erholdte salt omsettes under isvannavkjøling i 3 timer med 2 ml IN natriumhydroxydoppløsning. Hydrolysens gang følges ved elektroforese. Reaksjonsblandingen underkastes en ioneutbytning med 10 ml Dowex 50 i H -formen og lyofiliseres så. Da elektroforesen fremdeles viser forurens-ninger, omkrystalliseres produktet flere ganger fra vandig ethanol for å få den tilsvarende renhet. Man får 40 mg (59 "%) a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycin.

Det infrarøde spektrum oppviser følgende maksima for de karakteristiske grupper: NH 3310-1, NH3+ 3100 cm"1 (bredt), C=0 (COOH) 1730 cm"1, C=0 (amid I) 1650 cm"1, C=0 (amid II)

1570 cm"1, S=0 1220 (intensiv), 1045 cm"<1> (intensiv).

(d) 100 mg av det i eksempel 6 (c) fremstilte ct-L-glutamyl-(Y-taurin)-glycin oppløses i 25 ml av en 0,2 molar ammoniumhydrogencarbonatpuffer med pH 8,5. Oppløsningen tilsettes 1 mg carboxypeptidase A oppløst i 0,5 ml vann. (Produsent av enzymet: Serva, Heidelberg). Blandingen holdes ved 37°C i termostat i 24 timer og lyofiliseres så. I det tørre lyofilisat kan Y-L-glutamyltaurin og glycin påvises. Det rene y-L-glutamyl-taurin kan utvinnes ved elektroforese eller kromatografi på en Dowex 50 kolonne.

IR-spektret oppviser for de karakteristiske grupper følgende maksima: NH^ x OH 3600-2400; ^ NH (amid) 3315;

CO (carboxyl) 1758 ; >> CO (amid) 1666 ; -3 NH_,+ 1576 ; JS0~ 1296 ,

-1 J 3

1031 cm x.

Eksempel 7

Fremstilling av y- L- glutaminhomotaurin

(a) 1,08 3 g (2,2 mmol) carbobenzyloxy-L-gluta.minsyre-(a-benzyl)-y-p-nitrofenylester oppløses i 6 ml av en blanding av pyridin og vann i forholdet 2:1. Oppløsningen tilsettes først 278 mg (2 mmol) homotaurin og derpå 0,59 ml (4,2 mmol) triethylamin. Den gule oppløsning hensettes ved værelsetempera-

<

tur i 72 timer og inndampes så i vakuum. Det oljeaktige residuum oppløses i vann, nøytraliseres med saltsyre og ekstraheres så med ether i 8 timer i en kontinuerlig ekstraktor for å fjerne p-nitrofenolen. Vannfasen inndampes i vakuum. Man får 1,68 g carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylhomotaurin.

(b) Hele mengden av det ifølge eksempel 7(a) fremstilte materiale (1,68 g) oppløses i 10 ml 50 %-ig vandig ethanol, tilset-

tes så 0,3 g 10 %-ig palladiumaktivkull og hydrogen føres gjennom suspensjonen i 4 timer. Derpå filtreres oppløsningen og inndampes i vakuum. Residuet oppløses 1 - 2 ml vann og føres over en Dowex 50 x 2 (H -formen) kolonne med 1 cm diameter og 35 cm høyde. Man eluerer med vann. 50 ml eluat oppfanges og inndampes så i vakuum. Som residuum får man 440 ml y-L-glutamylhomotaurin, hvilket tilsvarer et utbytte på 82 %. Den ved pH 6,5 foretatte elektroforese viser en liten forurensning av delvis nøytrale, delvis sure stoffer (homotaurin, hhv. glutaminsyre). Produktet kan renses f.eks. ved preparativ elektroforese.

Såvel ved den ved pli 6,5 som i den ved pH 1,8 foretatte elektroforese vandrer forbindelsen i retning av katoden. Dens relative bevegelighet i forhold til .cysteinsyre utgjør

ved pH 6,5 0,68, og ved pH 1,8 0,50.

Rf (n-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,19.

Det dannede y-L-glutamylhomotaurin gir et IR-spektrum

som for de karakteristiske grupper viser følgende maksima:

■) -NH = 3345; -0 NH3+, OH = 3200-2200, \) CO = 1740;

•OCO-NH = 1645; >) S03~ = 1240, 1190, 1150, 1038, J-NH = 1570, 1535 >)S03~ = 590 cm"<1>

Eksempel 8

Fremstilling av y- L- glutamyl- N- methyltaurin

(a) 1,083 g ( 2, 2 mmol) carbobenzyloxy-L-glutaminsyre- (a-benzyl-y-p-nitrofenylester omsettes på den i eksempel 7 beskrevne måte med 278 mg (2 mmol) N-methyltaurin. Man får 1,59 g carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl-N-methyltaurin. (b) Hele mengden av det ifølge eksempel 8(a) fremstilte materiale (1,59 g) hydreres på den i eksempel 7(b) beskrevne måte. Man får 4 23 mg y-L-glutamyl-N-methyltaurin, hvilket tilsvarer et utbytte på 79%.

Forbindelsen vandrer såvel ved pH 6,5 som ved pH 1,8

i papirelektroforese i retning av anoden. Den relative bevegelighet i forhold til cysteinsyre: pH 6,5: 0,68; pH 1,8: 0,49.

Rf (N-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,16.

Eksempel 9

Fremstilling av y- L- glutamyl- L- cysteinsyre

(a) 2,87 g (6,6 mmol) carbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-benzyl)-y-p-nitrofenylester oppløses i 20 ml pyridin og tilsettes en oppløsning av 1,25 g (6 mmol) L-cysteinsyremonohydrat i en blanding av 17 ml vann og 17 ml pyridin. Etter tilsetning av 2,6 ml (18,6 mmol) triethylamin hensettes reaksjonsblandingen ved værelsetemperatur i 72 timer. Derpå inndampes oppløsningen i vakuum ved 30° C. Residuet oppløses i 20 ml vann, gjøres sur med konsentrert saltsyre og utrystes så med 15 x 10 ml ether. Vannfasen inndampes i vakuum ved 35° C. Man får carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl-L-cysteinsyre. (b) Det i eksempel 9(a) fremstilte produkt oppløses i 20 ml vann, tilsettes 0,3 g 10%-ig <p>alladium-aktivkull, og hydrogen føres gjennom suspensjonen i 3 timer. Reaksjonsblandingen opparbeides på den i eksempel 7(b) beskrevne måte. Man får y-L-glutamyl-L-cysteinsyre som smelter ved 187°C. Den relative bevegelighet i forhold til cysteinsyre ved papirkromatografi:

ved pH 6,5: L21; ved pH 1,8: 0,54.

Den dannede y-L-glutamyl-L-cysteinsyre har et IR-spektrum som for de karakteristiske grupper viser følgende maksima:

■0 NH (amid) 3423; ^ NH3+' 0H 3300-2200 OCO (carboxyl) 1748, 1712; 0 CO (amid) 1627; -)NH (amid) 1527; 0 SO ~ 1221, 1109, 1043; S03" 525 cm"<1>

Eksempel 10

Fremstilling av y- L- glutamylcholaminfosfat

(a) 1,083 g (2,2 mmol) carbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-benzyl)-y-p-nitrofenylester oppløses i 6 ml av en blanding av pyridin og vann i forholdet 2:1. Oppløsningen tilsettes så 2,8 mg (2 mmol) cholaminfosfat (US patentskrift nr. 2 730 542) og

derpå 0,87 ml (6,2 mmol) triethylamin. Reaksjonsblandingen hensettes ved værelsetemperatur i 72 timer og inndampes så i vakuum. Den videre opparbeidelse skjer på den i forbindelse med carbobenzyloxy-y- (a-benzyl) -L-glutamylhomotaurin (eksempel 7) beskrevne måte. Man får 1,25 g carbenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylcholaminfosfat. (b) Hele mengden av det i eksempel 10(a) utvundne produkt (1,25 g) underkastes katalytisk hydrogenering for å fjerne beskyttelsesgruppene. Hydrogeneringen såvel som rensningen ved ioneutbytning foretas på den i sammenheng med fremstillingen av y-L-glutamylhomotaurin (eksempel 24) beskrevne måte. Man får 470 mg y-L-glutamylcholaminfosfat hvilket tilsvarer et utbytte på 91 %. Produktet inneholder imidlertid, som det fremgår av papirelektroforese, som forurensning ca. 15 - 20 % cholaminfosfat. Som rensningsfremgangsmåte kommer blandt annet elektroforese på tale.

Ved papirelektroforese vandrer forbindelsen såvel ved pH 6,5 som ved pH 1,8 i retning av anoden. Den relative bevegelighet i forhold til cysteinsyre: pH 6,5: 0,75; pH 1,8: 0,36.

Rf (n-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,18.

Eksempel 11

Fremstilling av @- L- aspartyltaurin

(a) 526 mg (1,1 mmol) carbobenzyloxy-L-asparaginsyre-(a-benzyl-6-p-ni.trofenylester (Chem. Ber. 9_7, 1789, 1964) oppløses i 5 ml pyridin. Oppløsningen avkjøles til 0° C og derpå tilsettes i små porsjoner en oppløsning av 125 mg (1 mmol) taurin i 2 ml vann og derpå 0,28 ml (2 mmol) triethylamin. Reaksjonsblandingen hensettes ved værelsetemperatur i 48 timer og inndampes så i vakuum. Residuet oppløses i 5 ml vann, og den til å begynne med gule oppløsning tilsettes IN saltsyre inntil den er avfarvet. For å fjerne p-nitrofenolen utrystes oppløsningen med 10 x 5 ml ether. Vannfasen inndampes i vakuum. Man får 478 g carbobenzyloxy-S-(a-benzyl)-L-aspartyltaurin. (b) Hele mengden av det i eksempel 11(a) utvundne produkt oppløses i 6 ml 50 %-ig vandig ethanol. Oppløsningen tilsettes 100 mg 10 %-ig palladiumaktivkull og hydrogeneres så ved 4 tim-ers gjennomledning av hydrogengass. Etter filtrering og inndampning i vakuum fjernes triethylaminet på den i sammenheng med fremstillingen av y-L-glutamylhomotaurin (eksempel 7(b)) beskrevne måte ved ioneutbytning. Man får 172 mg p-L-aspartyltaurin hvilket tilsvarer et utbytte på 71 %. Produktet er foru-renset med taurin, hvilket blandt annet kan fjernes ved elektroforese.

Ved papirelektroforese vandrer forbindelsen såvel ved pH 6,5 som ved pH 1,8 til anoden. Den relative bevegelighet i forhold til cysteinsyre: pH 6,5: 0,77; pH 1,8: 0,58.

Rf (n-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,16

Eksempel 12

Fremstilling av p- L- aspartylhomotaurin

(a) 526 mg (1,1 mmol) carbobenzyloxy-L-asparginsyre-( a-benzyl)-j3-p-nitrofenylester og 1,39 g (1 mmol) homotaurin omsettes på den i eksempel 11(a) beskrevne måte. Man får carbobenzyloxy-Ø-(a-benzyl)-L-aspartylhomotaurin. (b) Det i eksempel 12(a) erholdte produkt hydrogeneres katalytisk på den i eksempel 7(b) beskrevne måte. Man får 203 mg (84%) [3-L-aspartylhomotaurin.

Ved papirelektroforese vandrer forbindelsen såvel ved pH 6,5 som ved pH 1,8 i retning av anoden. Den relative bevegelighet i forhold til cysteinsyre: pH 6,5: 0,72; pH 1,8: 0,53.

Rf (n-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,17.

Eksempel 13

Fremstilling av 3- L- aspartylcholaminfosfat

(a) Carbobenzyloxy-L-asparaginsyre-(a-benzyl)-3_p-nitro-fenylester og cholaminfosfat omsettes med den i eksempel 10(a) beskrevne måte. Man får carbobenzyloxy-g-(a-benzyl)-L-aspartylcholaminfosfat. (b) Det i eksempel 13 (a) utvundne stoff hydrogeneres katalytisk på den i eksempel 7(b) beskrevne måte. Man får (3-L-aspartylcholaminfosfat.

Ved papirelektroforese vandrer forbindelsen såvel ved pH 6,5 som ved pH 1,8 i retning av anoden. Den relative bevegelighet i forhold til cysteinsyre: pH 6,5: 0,81; pH 1,8: 0,40.

Rf (n-butanol-pyridin-iseddik-vann 15:10:3:12) = 0,14.

Eksempel 14

Y-L-glutamintaurin (fremstilt ifølge ovenstående eks-empler, kan renses ved omkrystallisasjon på følgende måte: 300 mg rå forbindelse oppløses ved værelsetemperatur under omrør-ing i 5 ml vannfri dimethylsulfoxyd. Den opaliserende oppløs-ning filtreres og filteret utvaskes med 0,5 ml dimethylsulfoxyd. Filtratet forenes med vaskevæsken og tilsettes 55 ml absolutt ethanol. Blandingen hensettes ved værelsetemperatur i 12 timer, derpå frafiltreres forbindelsen, den vaskes med 2,5 ml absolutt ethanol og tørres i vakuumeksikator over fosforpentoxyd til kon-stant vekt. Man får 240 mg krystallinsk Y-L-glutamyltaurin (utbytte av omkrystallisasjonen: 80 %).

Istedenfor ethanol kan der til omkrystalliseringen anvendes de samme mengder dioxan, ether eller aceton. Kvaliteten av det krystallinske produkt er i alle tilfelle den samme. Smeltepunkt (etter Boetius): 218 - 219°C. Produktet er skikt-kromatografisk enhetlig.

Eksempel 15

På den for fremstillingen av glutaminsyre-y-amider egnede måte (Acta Chim. Acad. Sei. Hung. 6_4 , 285, 1970) fremstilles carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylcholamin. 4,14 g (14 mmol) av dette produkt oppløses i 50 ml absolutt pyridin og tilsettes 9 g (33 mmol) dif enylf osf orsyreklorid.. Reaks jonsblan-dingen holdes ved 0° C i 12 timer og fortynnes så med 80 ml kloroform. Det utskilte produkt frafiltreres, vaskes med for-tynnet saltsyre og deretter med vann, og tørres til slutt i eksikator over kaliumhydroxyd. Den tørre forbindelse oppløses

i 15 ml iseddik som inneholder 3,3 mol/l hydrogenbromid, oppløs-ningen hensettes i 15 minutter og inndampes så i vakuum ved

35° C. Residuet oppløses i 30 ml IN natriumhdroxydoppløsning og oppløsningen hensettes i 1 time ved værelsetemperatur. Derpå innstilles dens pH-verdi med eddiksyre på 4, og for å fjerne fenol og benzylalkohol ekstraheres oppløsningen med 3 x 30 ml ether. Vannfasen bringes på en kolonne med Dowex 50 i H - formen, og elueres med vann. Eluatet inndampes i vakuum og residuet omkrystalliseres fra en blanding av aceton og vann i forholdet 2:1. Man får 0,8 g y-L-glutamylcholaminfosfat.

Eksempel 16

4,68 ml (5 mmol) fosforoxyklorid inndryppes under av-kjøling ved omrøring i 1,8 ml vann (Biochem. Preparations 6_,

76, 1958). Oppløsningen tilsettes i små porsjoner 1,9 g (10 mmol) y-L-glutamylcholainin (fremstilt fra carbobenzyloxy-Y-(ct-benzyl)-L-glutamylcholamin ifølge eksempel 15). Blandingen omrøres ved 60° C i 2 timer, etter avkjøling under omrøring tilsettes 0,7 2 ml vann og derpå hensettes ved værelsetemperatur i 2 timer. Derpå tildryppes under omrøring 10 ml 96 %-ig ethyl-alkohol og deretter 10 ml ether. Reaksjonsblandingen hensettes ved 4° C over natten, og tilsettes så 5 ml 96 %-ig ethanol.

Den utfelte forbindelse frafiltreres, vaskes først med ethanol og derpå med ether, og omkrystalliseres til slutt fra en blanding av ethanol og vann. Man får 1,75 g y-L-glutamylcholaminfosfat.

Eksempel 17

4,14 g (10 mmol) carbobenzyloxy—^- (a-benzyl)-L-glu-tamylcholamin oppløses i 40 ml pyridin og oppløsningen avkjøles til -10° C. I små porsjoner tilsettes under intens omrøring 2,1 g (11 mmol) p-toluensulfonylklorid. Reaksjonsblandingen omrøres ved 0° C i 3 timer og heldes så på 40 g smeltende is. Det utskilte bunnfall frafiltreres, vaskes med vann og omkrystalliseres til slutt fra en blanding av ethanol og petrolether. Produktet underkastes katalytisk hydrogenering på den i eksempel 5 beskrevne måte. Det etter hydrogeneringen erholdte og tørrede stoff oppløses i 30 ml vann, og oppløsningen tilsettes 10,1 g

(40 mmol) natriumsulfit-heptahydrat. Oppløsningen omrøres ved 40° C i 24 timer og inndampes så i vakuum. Residuet oppløses i litt vann og påføres på en kolonne med Dowex 50, fra hvilken den elueres med vann. Eluatet inndampes i vakuum og residuet tørres over kaliumhydroxyd. Etter omkrystallisasjon fra 80 %-ig ethanol fåes 1,6 g y-L-glutamyltaurin.

Eksempel 18

Til 4,14 g (10 mmol) carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylcholamin tilsettes 15 ml thionylbromid, og blandingen omrøres i 3 timer. Derpå tilsettes ether, det utfelte bunnfall frafiltreres og omkrystalliseres fra en blanding av aceton og petrolether. Den erholdte forbindelse oppløses i en blanding av dimethylformamid og vann, og oppløsningen tilsettes under omrør-ing 10,1 g (40 mmol) natriumsulfit-heptahydrat. Blandingen om-røres i 24 timer ved værelsetemperatur og derpå i ytterligere 6 timer ved 50° C, og filtreres tilslutt. Den klare oppløsning inndampes i vakuum, og residuet hydrogeneres katalytisk på den i eksempel 5 beskrevne måte. Den etter hydrogeneringen erholdte og tørrede forbindelse oppløses i litt vann, påføres en kolonne med Dowex ® 50 og elueres med vann. Eluatet inndampes i vakuum og residuet omkrystalliseres fra 80 %-ig ethanol. Man får 1,2 g Y —L-glutamyltaurin.

Eksempel 19

3,71 g (10 mmol) carbobenzyloxy-L-glutaminsyre-a-benzylester oppløses i 60 ml acetonitril. Oppløsningen avkjøles til -15° C og tilsettes under omrøring først 1,4 ml (10 mmol) klormaursyreisobutylester og derpå 1,4 ml (10 mmol) triethylamin. Reaksjonsblandingen omrøres i 30 minutter ved -15° C og derpå tilsettes 2,05 g (10 mmol) bromethylamin-hydrogenbromid, 1,4 ml (10 mmoli triethylamin og 40 ml acetonitril avkjølt til -15° C. Blandingen omrøres ved -15° C i 2 timer og derpå i nok 4 timer ved værelsetemperatur. Derpå filtreres og filtratet inndampes i Vakuum ved 35° C. Residuet oppløses i en blanding av dimethylformamid og vann, og oppløsningen tilsettes 10,1 g natriumsulfit-heptahydrat. Etter opparbeidelse av blandingen på den i eksempel 18 beskrevne måte får man 1,4 5 g y-L-glutamyl-taurin.

Eksempel 20

3,02 g (10 mmol) carbobenzyloxy-L-glutamin-natriumsalt (Liebigs Annalen 640, 145, 1961) oppløses i 50 ml dimethylformamid. Oppløsningen tilsettes en 12 mmol natriumhydrid inneholdende oljeaktig suspensjon, og oppvarmes så i 2 timer under utelukkelse av luftfuktighet. Derpå tildryppes oppløsningen 2,11 g (10 mmol) bromethansulfonsurt natrium i 50 ml dimethylformamid og blandingen oppvarmes videre i 2 timer. Derpå inndampes i vakuum, residuet ekstraheres med ether og tørres så. Den tørre forbindelse oppløses i vann, bringes på en kolonne

med Dowex<®> 50 og eineres med vann. Eluatet inndampes i vakuum og residuet tørres over kaliumhydroxyd. Den tørrede forbindelse hydrogeneres katalytisk på den i eksempel 3 beskrevne måte.

Etter omkrystallisasjon fra ethanol/vann får man 1,55 g y- L-glutamyltaurin.

Eksempel 21

2,58 g (10 mmol) L-N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-fthali-mid (J. Pharm. Sei. 5J7, 757, 1968) oppløses i en med absolutt ethanol fremstilt natriumethylatoppløsning. Oppløsningen inndampes i vakuum, residuet oppløses i 50 ml dimethylformamid og oppløsningen tilsettes under omrøring 2,25 g (11 mmol) brom-methansulfonsurt natrium. Blandingen oppvarmes i 2 timer og inndampes så i vakuum. Residuet oppløses i vann, anbringes på

en kolonne med Dowex ® 50 og elueres med vann. Eluatet inndampes i vakuum og det erholdte residuum kokes i 3 timer i 100 ml 0,5N saltsyre. Etter inndampning av oppløsningen tilsettes materialet 30 ml ethanol og 0,7 ml 72 %-ig hydrazinydrat, og blandingen kokes i. 1 time. Derpå inndampes blandingen i vakuum. Residuet taes opp i 25 ml 2N saltsyre og blandingen holdes ved

50° C i 10 minutter og hensettes så ved værelsetemperatur i 30 minutter. Det utskilte faste stoff fjernes ved filtrering, filtratet inndampes i vakuum og residuet tørres i eksikator over kaliumhydroxyd. Det tørrede stoff oppløses i en blanding av vann, eddiksyre og maursyre i volumforholdet 90:8:2, og opp-løsningen påføres på o en kolonne med Dowex ® 1 med 2 cm diameter og 100 cm høyde. Kolonnen bringes først i likevekt med den nevnte oppløsningsmiddelblanding. Først elueres med den nevnte oppløsningsmiddelblanding, og man oppfanger 400 ml eluat. Denne fraksjon inneholder Y~L-glutamyltaurin. Derpå elueres med 0,5N saltsyre, idet der likeledes oppfanges 400 ml eluat. Denne fraksjon inndampes til tørrhet i vakuum ved 35° C. Residuet tørres i eksikator over fast natriumhydroxyd og omkrystalliseres så fra 80 %-ig ethanol. Man får 1,07 g Y~L-glutamyltaurin.

Eksempel 22

4,43 g (10 mmol) carbobenzyloxy-L-pyroglutaminsyre-dicyclohexylaminsalt (Liebigs Annalen 640, 145, 1961), 1,25 g (10 mmol) taurin og 0,84 g (10 mmol) riatriumhydrogencarbonat oppløses i 50 ml vann. Oppløsningen oppvarmes i 4 timer (eller hensettes ved værelsetemperatur i 24 timer) og inndampes så i vakuum. Residuet oppløses i vann, påføres en kolonne méd

Dowex ®50 og elueres med vann. Eluatet inndampes. Den erholdte forbindelse hydrogeneres katalytisk på den i eksempel 3 beskrevne måte. Etter omkrystallisasjon fra en ethanol-vann-blanding får man 2,03 g y-L-glutamyltaurin.

Eksempel 23

7,38 g (15 mmol) carbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-benzyl)-Y-p-nitrofenylester og 1,41 g (10 mmol) cholaminsulfat

(P. A. Leighton: Am. Chem. Soc. 6_9, 1540, 1947) omsettes med hverandre på den i eksempel 7(a) beskrevne måte. Opparbeidelsen av reaksjonsblandingen, fjernelsen av beskyttelsesgruppen ved katalytisk hydrering og rensning av produktet skjer på den i eksempel 3 beskrevne måte. Man får 1,75 g Y-L-glutamyl-cholaminsulfat (64,7%). Smeltepunkt: 164-166°C.

Det infrarøde spektrum oppviser for de karakteristiske grupper følgende maksima: Y-NH- = 3365, yNH3 + OH = 3200-2400;

YCO = 1748, yCO-NH = 1660; YS03~ = 1260, 1186, 1155,

989, 829,

-NH- = 1565, 1540

S03~ = 580, 595 cm"<1>.

Claims

Analogifremgangsmåte ved fremstilling av nye terapeutisk aktive aminosyrederivater med den generelle formel:

hvor

R er hydrogen eller alkyl med 1-4 carbonatomer, R^ er hydrogen eller carboxyl,

B<1> er -SH, -S02OH, -0S0 OH eller -OPO(OH)2,

n er et helt tall fra 1 til 4,

m er et helt tall fra 1 til 3, og

t er et helt tall fra 1 til 3,

og deres farmakologisk godtagbare salter og optisk aktive isomerer,

karakterisert ved at man a) i forbindelser med den generelle formel: 5 1 7 hvor R, R , B , n, m og t er som ovenfor angitt, og R er alkoxycarbonyl med 1-4 carbonatomer, eller aralkoxycarbonyl med 7-9 carbonatomer som eventuelt er substituert med én eller flere av substituentene halogen, alkoxy eller nitro,

fjerner beskyttelsesgruppen R^ ved acidolyse , hydrolyse,

eller katalytisk hydrogenering, eller b) underkaster en forbindelse med den generelle formel:

hvor R, R 5 , B 1 , n, m og t er som ovenfor angitt, og A 2er (1) alkoxy med 1-4 carbonatomer, eller (2) aralkoxy med 7-9 carbonatomer som eventuelt i p-stillingen kan være substituert med alkoxy eller nitro, eller (3) gruppen (-NH-CH-CO) -Y- hvor R<6> er

R<6 >hydrogen eller alkyl med 1-4 carbonatomer, Y er hydroxy eller

alkoxy med 1-4 carbonatomer, og r er et helt tall fra 1 til 10, en alkalisk eller enzymatisk hydrolyse, en acidolyse eller hydrogenolyse, eller c) i en forbindelse med den generelle formel: 5 17 3 hvor R, R B , R , n, m og t er som ovenfor angitt, og A er (1) alkoxy med 1-4 carbonatomer eller (2) en eventuelt i p-stillingen med alkoxy eller nitro substituert aralkoxygruppe med 7-9 carbon-7 3

atomer, fjerner beskyttelsesgruppene R og A samtidig ved acidolyse, alkalisk hydrolyse eller hydrogenolyse, eller d) underkaster en forbindelse med den generelle formel:

hvor R, R5, n, m og t er som ovenfor angitt, og A er (1) hydroxy, (2) alkoxy med 1-4 carbonatomer, (3) en eventuelt i p-stillingen med alkoxy eller nitro substituert aralkoxygruppe med 7-9 carbonatomer, eller (4) gruppen (-NH-CH-CO) -Y hvor R , r og Y er som ovenfor angitt under (b3);

R6 r

R1 er (1) hydrogen, (2) alkoxycarbonyl med 1-4 carbonatomer eller (3) aralkoxycarbonyl med 7-9 carbonatomer eventuelt substituert med én eller flere av substituentene halogen, alkoxy eller nitro; og

B 2er -SH, -SOOH, -0H, p-toluensulfonyloxy, halogen eller -SC^R^0 hvor R<10> er alkoxy med 1-4 carbonatomer, eller aralkoxy;

oxydasjon eller hydrolyse, omsetter med alkali- eller alkalihydrogensulfit, forestrer med svovelsyre eller fosforsyre eller et derivat derav;

og så eventuelt fjerner den eller de på u>-amino- og/eller uu-carboxylgruppene bundne beskyttelsesgrupper, eller e) for fremstilling av forbindelser med formel I hvor B1 er en sulfonylholdig gruppe, omsetter en forbindelse med den generelle formel: 11 12

hvor R , A og n er som ovenfor angitt, R er hydrogen eller alkyl med 1-4 carbonatomer, og R1^ er alkalimetall,

med alkalimetallsalter av halogenalkylsulfonsyrer, og så eventuelt fjerner de på io-amino- og/eller o>-carboxylgruppene bundne beskyttelsesgrupper; eller f) for fremstilling av forbindelser med formel I, hvor B<1> er -S02OH,

oxyderer en forbindelse med den generelle formel:

hvor R, R 5 , R 7 , n, m og t er som ovenfor angitt, og A 4er hydroxy, aralkoxy, fortrinnsvis benzyloxy, substituert aralkoxy, fortrinnsvis p-methoxybenzyloxy eller p-nitrobenzyloxy, og så fjerner 7 4

beskyttelsesgruppene R og A ', eller g) for fremstilling av forbindelser med formel I hvor B<1> er -S02OH, hydrolyserer en forbindelse med formelen: 15 1 2 hvor R , R , B , n, m og t er som ovenfor angitt; og R er hydrogen, eller R 1 og R 2 danner sammen med det nitrogenatom til hvilket de er bundet, en fthalimidogruppe, eller h) for fremstilling av forbindelser med formel I hvor B1 er -SC^OH, omsetter en forbindelse med den generelle formel: 7 4 7

hvor R, A og n er som ovenfor angitt, og A er hydroxy, p-nitro-fenyloxy, pentaklorfenyloxy eller alkoxycarbonyloxy med 2-4 carbonatomer,

med en forbindelse med den generelle formel:

hvor R, R~*, m og t er som ovenfor angitt, oxyderer den erholdte forbindelse med den generelle formel (VII) og fjerner beskyttelsesgruppene R^ og * eller i) omsetter en forbindelse med den generelle formel (XVIII) med en forbindelse med den generelle formel:

hvor R, R 5 , B 1, m og t er som ovenfor angitt, og fjerner beskytt-7 4

elsesgruppene R og A ', eller j) i forbindelser med den generelle formel: 5 7 14

hvor R, R , R , B , A , n, m og t er som ovenfor angitt, i valg-fri rekkefølge avspalter beskyttelsesgruppen R 7 ved acidolyse og beskyttelsesgruppen A 4ved alkalisk hydrolyse,

og eventuelt overfører de erholdte forbindelser til deres farmakologisk godtagbare salter eller frigjør dem fra deres salter.