DK155732B

DK155732B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af aminosyrederivater

Info

Publication number: DK155732B
Application number: DK442477AA
Authority: DK
Inventors: Laszlo Feuer; Arpad Furka; Ferenc Sebestyen; Jolan Hercsel; Erzsebet Bendefy
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1974-04-29
Filing date: 1977-10-06
Publication date: 1989-05-08
Also published as: ES453305A1; DK155672B; DK155433C; NL183186C; AU499173B2; JPS6012347B2; DK442377A; DK159267C; DD122377A5; CS209857B2; DK158676C; NO810816L; DK245783A; AT359084B; EG11847A; SE7504828L; IL47149A; DK159267B; ES436986A1; FR2279388B1

Description

DK 155732B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte aminosyre-derivater med den almene formel R1-NH-CH-CO-A1

5 I

(CHo) I

I 2 η 1

CO-N-CH-(CH0 ) -B

I '2 2 t

R R

11 12 hvor A , B , R, R , R , n og t har de i krav 1 1 s indled-10 ning angivne betydninger, eller fysiologisk acceptable salte eller optisk aktive antipoder deraf.

Disse forbindelser har værdifulde biologiske eller farmakologiske virkninger.

Blandt de ifølge opfindelsen fremstillede forbin-15 delser skal på grund af dens biologiske virkning navnlig fremhæves γ-L-glutamyltaurin, der har formlen H„N-CH-COOH Å I CH„ I Å

CH2 XXIV

20 C0-NH-CH2-CH2-S020H

og som har et bredt terapeutisk og præventivt virkningsspektrum over for sygelige forandringer der kan føres tilbage til beskadigelser af "AGAS" (det aerobiosfæri-25 ske genetiske adaptionssystem).

Til belysning af begrebet "AGAS" opregnes i det følgende de vigtigste væv og organer der danner dette system.

a) Alle biologiske grænseflader der står i berø-30 ring med den ydre luft som biosfæren (hud og huddannelser, øjets hornhinde og Conjunktiva, mund- og svælghulrum, luftveje og lunge); b) skelet og led (rørknogler og svampeagtige knogler, kugleled, synoviale membraner, skeletmuskulatur); 35 c) de til reguleringen af ionhusholdningen delta gende organer (transepiteliske transporsystem: tarmtrævler og nyrekanal); 2

DK 155732B

d) det til findeling af næringen nødvendige teko-donte (i tandaveolerne med rødder fastgjorte) tandsæt; e) høre-, lugte- og stemmeorganer.

De omhandlede forbindelser udøver således en gun-5 stig biologisk eller terapeutisk virkning på de her opregnede organer eller væv af AGAS-systemet.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser virker desuden på følgende funktioner der står i sammenhæng med AGAS-systemet: strålingsbe-10 skyttelse, begunstigelse af sårheling, almindelig aktiverende virkning på mesenkym, beskyttelse mod den stadigt voksende infektions- og tilsmudsningsfare hos hud og slimhinder (den fugtige slimhindes lysozymproduktion, aktivering af fimreepiteler i luftvejene), forøget beskyt-15 telse mod de af vira og svampe forårsagede infektioner.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er virksomme mod de stadigt og i høj grad stigende stress-virkninger der er knyttet til livet på fastlandet (fx meteorologisk indflydelse, store 20 forskelle mellem dag- og nattemperatur, forhøjet fare for kvæstelser), idet de stabiliserer adaptionssyndromet og samtidigt afværger glukokortikoidernes perifere vævsskader (som fx skader i bindevævet, kvæstelser af knoglema-trix-bestanddele). Udvikling af immunhomøostase (stigende 25 erkendelsesevne hos legemet om hvilke celler der er kropsegne og hvilke der ikke er).

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser udøver deres virkning dels umiddelbart, dels over reguleringen af vitamin A metabolismen, 30 ved produktion af vitamin A metaboliter med stærkere polær karakter. Denne virkning kan sammenlignes med parathormonets virkning på 25-hydroxycholecalciferol-1oclhy-droxylase-enzymet i nyrekanalen. Virkningsretningerne af forbindelserne er følgende: 35 3

DK 155732B

Δ) Virkninger med vitamin A-karakterer: a) Farmakologiske og biokemiske virkninger:

Forøgende virkning på kondroitinsulfatsyntese; gunstig virkning på sårhelingen eller på den ved indgift af kortison eksperi- 5 mentelt forringede sårheling hos rotter og hunde; potenserende virkning på vitamin A's virkning hos rotter og høns ved eksperimentelt fremkaldte hypo- eller hypervitaminoser; dæmpende virkning på de ulcerations-betingede stress-virkninger hos rotter; begunstigende virkning på degranulationen af mastocyter; forøgende virkning på 10 produktionen af lysozym; virkning på sporstofhusholdningen (silicium, zink, kobber, mangan, fluor); fremmende virkning på epiteldannelsen; fremmende virkning på den alkaliske fosfataseaktivi-tet; virkning på den ved lokal indvirkning af vitamin A fremkaldte granulomposedannelse (Granulomsackbildung); det yderst flade for-15 løb af dosis-virkningskurven eller ændringen af virkningens fortegn ved store doser; aktiverende virkning på Golgi-apparatet; begunstigende virkning på dannelsen af slim- eller bægerceller; forøgende virkning på koncentrationen af vitamin A.

20 b) Klinisk-terapeutiske indikationer: keratokonjunktivis sicca; Sjogrens syndrom; rhino-laryngo-pharingitis sicca; ozæna; kronisk bronchitis; sinobronchitis; mucoviscidose; konstitutionelle lungesygdomme hos småbørn; paradentose; hudens og slimhindernes smittetilbøjelighed for vira og svampe; kortison-antagonistisk 25 virkning; gunstig virkning på helingen ved operationssår og slimhindesår; erosio colli; pruritusagtige lidelser; nedsættelse af lugte- og smagssansen.

30 B) Virkninger uden vitamin A-karakter a) Farmakologiske og biokemiske virkninger: virkning på blodsukkerniveauet med hensyn til en forbigående sænkning; forøgende virkning på fosfaturi, sænkende virkning på fosfatniveauet t 35 i serum; strålingsbeskyttende virkning; formindskende virkning på 4

DK 155732B

den nødvendige tid der går med at nå målet ved labyrintforsøg hos inaktiverede dyr; formindskende virkning på eksperimentelt fremkaldte fluor- og kadmiumtoxikoser; forøgende virkning på den cykliske adenosinmonofosfat-udtømning af nyrerne; dæmpende virkning 5 på symptomerne ved eksperimentelt fremkaldt lathyrismus; formindskelse af histaminfølsomheden; forøgende virkning på aktiviteten af leverenzymet tyrosinaminotransferase.

b) Terapeutiske indikationer: svage bestrålingsskader; vitiligo; muskelhypotoni; psykoenergetiserende virkning; gunstig 10 virkning på involutionelle og gerontologiske tilstande samt på de mnestiske funktioner; keloide tilbøjeligheder; spondylosis ankylo-poetica; sygdomme hos bevægelsesorganerne på grund af slid; scle-rotisk fundus; amyloidose; morphæa; fibrocytisk mastopati.

I veterinærmedicinen har de ifølge opfindelsen fremstil-15 lede forbindelser lignende anvendelsesområder som i humanmedicinen, dvs. fx hudskader (afskalning), sårheling og knoglebrud.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del angivne. - ·

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles forbin-20 delserne med den almene formel I ved dannelse af en syreamidbinding. Herved sammenkobles et ved aminogruppen eller ved amino- og a-karboxyl-gruppen med en eller flere beskyttelsesgrupper eventuelt substitueret derivat af en α-aminodikarbonsyre over sin ω-karboxyl-gruppe med fx 2-aminoætansulfonsyre, 3-aminopropansulfonsyre eller 25 2-fosfonætanolamin. Ved dannelsen af syreamidbindingen kan der anvendes forskellige beskyttelsesgrupper. Koblingsmåden er aktivester-metoden (monografi vedrørende opbygning og selektiv fjernelse af beskyttelsesgrupper og koblingsmetoder: E. Schroder, K. Liibke: The peptides, bind 1: Methods of peptide 30 synthesis, Academic Press, 1965).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i det følgende ved hjælp af nogle eksempler.

35 5

DK 155732B

Eksempel 1 5,42 g (li mmol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben-zyl)-y-p-nitrofenylester (Chem, Der. 96, 204» 1963) opløses i 50 5 ml pyridin. Opløsningen afkøles til 0°C og inden for en halv time tildryppes der under intensiv omrøring en opløsning af 1,25 g (10 mmol) taurin i 20 ml vand. Derpå sættes der 3»08 ml (22 mmol) tri-ætylamin til blandingen og afkøling og omrøring afbrydes. Blandingen henstår ved stuetemperatur i 72 timer og inddampes derpå 10 under vakuum. Remanensen opløses i 50 ml vand og der sættes IN saltsyre til den gule opløsning indtil den affarves. For at fjerne p-nitrofenolen rystes opløsningen ti gange med 50 ml æter hver gang. Den vandige fase inddampes under vakuum. Der vindes 6,9 g kar bobenzyloxy-γ- (α-benzyl )-L-glut amyltaurin-triætylammoniumsalt.

15 Relativ mobilitet i forhold til cysteinsyre ved papirelektroforese ved pH 6,5 er 0,5.

20 Eksempel 2 1,082 g (2,2 mmol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben-zyl)-y-p-nitrofenylester opløses i 6 ml af en blanding af pyridin og vand i forholdet 2:1. Til opløsningen sættes først 278 mg (2 . 25 mmol) homotaurin og derpå 0,59 ml (4,2 mmol) triætylamin. Den gule opløsning henstår ved stuetemperatur i 72 timer og inddampes derpå under vakuum. Den olieagtige remanens opløses i vand, neutraliseres med saltsyre og ekstraheres derpå til fjernelse af p-nitrofenol i en kontinuerlig ekstraktør med æter i otte timer. Den vandige fase 30 inddampes under vakuum. Der vindes 1,68 g karbobenzyloxy-y-(a-ben-zyl)-L-glutamylhomotaurin. Relativ mobilitet i forhold til cysteinsyre ved papirelektroforese ved pH 6,5 er 0,49.

35 6

DK 155732B

Eksempel 3 1.083 g (2,2 mmol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben-zyl)—y—p—nitrofenylester omsættes på den i eksempel 2 beskrevne 5 måde med 278 mg (2 mmol) N-metyltaurin. Der vindes 1,59 g karbo-benzyloxy-y-(α-benzyl)-L-glutamyl-N-metyltaurin. Dets relative mobilitet i forhold til cysteinsyre ved papirelektroforese ved pH 6,5 er 0,49.

1q Eksempel 4 2,87 g (6,6 mmol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben-zyl)-y-p-nitrofenylester opløses i 20 ml pyridin og der tilsættes en opløsning af 1,25 9 (6 mmol) L-cysteinsyremonohydrat i en blan-15 ding af 17 ml vand og 17 ml pyridin. Efter tilsætning af 2,6 ml' (18,6 mmol) triætylamin henstår reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 72 timer. Derpå inddampes opløsningen under vakuum ved 30°C. Remanensen opløses i 20 ml vand, syrnes med koncentreret saltsyre og rystes derpå 15 gange med 10 ml æter hver gang. Den 20 vandige fase inddampes under vakuum ved 35°C. Der vindes karboben-zyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl-L-cysteinsyre. Forbindelsens relative mobilitet 1 forhold til cysteinsyre ved papirelektroforese ved pH 2,0 er 1,03.

2b Eksempel 5 1.083 g (2,2 mmol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben-zyi)—y—p—nitrofenylester opløses i 6 ml af en tilberedt blanding af pyridin og vand i forholdet 2:1. Til opløsningen sættes først 30 282 mg (2 mmol) kolaminfosfat (US patentskrift nr. 2.730.542) og derpå 0,87 ml (6,2 mmol) triætylamin. Reaktionsblandingen henstår ved stuetemperatur i 72 timer og inddampes derpå under vakuum. Den videre oparbejdning foregår på den måde der er beskrevet i forbindelse med karbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylhomotaurin (eksem-35 pel 2). Der vindes 1,25 g karbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl-kolaminfosfat. Produktets relative mobilitet i forhold til cysteinsyre ved papirelektroforese ved pH 2,0 er 0,9,

DK 155732B

7

Eksempel 6 526 mg (1,1 mmol) karbobenzyloxy-L-asparaginsyre-(oc-benzyl)-|3-p-nitrofenylester (Chem.Ber. 97, 1789, 1964) opløses i 5 ml pyridin. Opløsningen afkøles til 0°C hvorpå der 5 i små portioner tilsættes en opløsning af 125 mg (1 mmol) taurin i 2 ml vand efterfulgt af 0,28 ml (2 mmol) triætyl-amin. Reaktionsblandingen henstår ved stuetemperatur i 48 timer og inddampes derpå under vakuum. Remanensen opløses i 5 ml vand og til den i begyndelsen gule opløsning sættes 1N 10 saltsyre indtil opløsningen er affarvet. Til fjernelse af p-nitrofenol udrystes opløsningen ti gange med 5 ml æter hver gang. Den vandige fase inddampes under vakuum. Der vindes 478 mg karbobenzyloxy-ø-(a-benzyl)-L-aspartyltaurin. Denne forbindelses relative mobilitet i forhold til cysteinsyre 15 ved papirelektroforese ved pH 6,5 er 0,51.

Eksempel 7 526 mg (1,1 mmol) karbobenzyloxy-L-asparaginsyre-(a-2Q benzyl)-β-p-nitrofenylester og 139 mg (1 mmol) homotaurin omsættes på den i eksempel 6 beskrevne måde. Der vindes kar-bobenzyloxy-|3-(a-benzyl)-If-aspartylhomotaurin. Dets relative mobilitet i forhold til cysteinsyre ved papirelektroforese ved pH 6,5 er 0,5.

25

Eksempel 8

Karbobenzyloxy-L-asparaginsyre-(α-benzyl)-β-p-nitro-fenylester og kolaminfosfat omsættes med hinanden på den i 2Q eksempel 5 beskrevne måde. Der vindes karbobenzyloxy-/3-(cx-benzyl)-L-aspartylkolaminfosfat. Dets relative mobilitet i forhold til cysteinsyre ved papirelektroforese ved pH 2,0 er 0,9.

35 8

DK 155732B

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelsers biologiske virkning skal i det følgende belyses i to biologiske forsøgsrapporter, A og B. I disse forsøgsrapporter vises den biologiske virkning for fire forskellige typer af 5 forbindelser med den almene formel I. De undersøgte forbindelser har alle ubeskyttede N-terminale og C-terminale grupper, 1 1 dvs. R er hydrogen og A er hydroxy. Forbindelser med den al- mene formel I, hvor R er forskellig fra hydrogen og/eller hvor 1 A er forskellig fra hydroxy har den samme biologiske virkning 10 som de tilsvarende ubeskyttede aminosyrederivater, idet man må forvente at beskyttelsesgrupperne fraspaltes i organismen.

Biologisk forsøgsrapport A.

15

Undersøgelse af γ-L-glutamyltaurin som i nærværende .rapport betegnes litoralon.

I de efterfølgende tabeller 1-6 er forsøgsresultaterne vist som middelværdier + standardafvigelse med antallet af bestem-2Q melser i parentes. Bestemmelse af om der er signifikant forskel mellem kontrolforsøg og forsøg med behandlede dyr blev foretaget med Students t-test.

Tabel 1 25 Litoraions virkning på vitamin A-koncentrationen i serum.

Gruppe litoralon vitamin A-koncentration i serum _ug/dag_mg %_ I. Kontrol - 28,3+0,7 (20) 30 II. 0,1 41,9 + 1,0X (20) III. 0,3 32,9 + 1,1XX (20) IV. 1,0 27,4 + 0,6 (20) x P < 0,001 25 xx P < 0,01

DK 155732B

9 20 Sprague Dawley rotter (10 hanner og 10 hunner) vejende 180-200 g behandledes oralt med de i tabel 1 angivne daglige doser litoralon i form af en vandig opløsning i en periode på 8 dage. På den 9. forsøgsdag aflivedes dyrene ved dekapitering og 5 blodet opsamledes. Vitamin A-koncentrationen i serumet bestemtes ved Neeld og Pearsons metode.

Tabel 2

Virkning af litoralon og vitamin A på granulomdannelse frem- 10 kaldt af implanterede vatkuqler_

Gruppe Dosis Tør vægt af . x .,, Ί granulom

Vitamin A litoralon lokal lokal oral y 15 mg ug yg/dag_ I. Kontrol - - - 52 + 1,0 (24) II. Kontrol +

Opløsningsmiddel - - - 54+3,1(8) III. 2 - - 64 + 2,5 (8) 20 “ IV. 2 0,1 - 65 + 2,7 (8) V. - - 0,1 73 + 2,9 (8) VI. 2 - 0,1 90 + 4,1 (8) x Hoffmann La Roche 25

Forskellen er signifikant: mellem gruppe II og III ved P < 0,05, mellem II og V ved P < 0,001, og mellem V og VI ved P < 0,01. Granulomdannelsen bestemtes ifølge Lee et al med ^ Sprague-Dawley hanrotter vejende 110-120 g. Tamponerne fjernedes fra de dorsolaterale subkutane implantationer efter 10 dage og vejedes efter tørring til konstant vægt ved 65°C.

35

DK 155732B

10

cm cm cm ω i I

Η Η Η Ό Ό (U OJ

— — — Hi h 4J < Λ

g O C W

cm r-~ oo Λ >i U ft

con •tf'd' <r ^ w fi W ^ & U

ft o o oo o to 0) Cl) 0 O - - » - - » +i Λ fcr> -P Cn H o oo oo Η 3.Π3-ΡΟ + 1 +1 +1 «. °d m <u 1 1 iw ft ro h d rfj T3 s 3 dl 01

3 Μ o ω Λ U

0) d © oo © W + H d

oo co r·» o r~ o CO 4J d H

λ; Η O «S' CM HH φ ·© 2 ·Η Ή d

to »». - » κ» tr> ft O

o CM Ο HO CM O ·& (D <c S-l CO 4-1 fccj +| +1 +1 tfl H CQ Ό 0) C (0 c ω

03 0 M &> 0 -η H

ft O g X > X

O co tn

CD H CT *4-10 - T3 C

Pi ^ CM CM ΙΟ Η·Μ* H O' H ft Η Ή 00 Ο CD Ο 00 Ο Ο Η 0 Ο1 (¾¾ - - «. - »% «. Η tT » 43 d o o o o o o o ti O d 3 ® + 1 +1 +1 <5 o © v Ό » Xi ©

^ IH CT

ft tn < (0 <h H

0 W d Φ

. r^cMco'04-iD<DlP

CD CM H CD OH <DO C 4-1 H

e (0 cn o cn o m o > o · H tn 03 U.....- ε O CD ft •Η HOHOHO φ O Ό > >i 3 P - C <D η

S__Id (D ε w Ό -H

4J A4 U © S <>d Λ crf Ή ί>ι »C ^ Η M4 Q U · !4 CO CM H CD d ft

Η Γ— CM CD CM in CM d · Λ tj! CD

nrfl ft coo cm o ho tT tn £ d 'd

+) cj * * ~ «· - «· Η σι Ό . K

r-IG OOOOOO BOH *H

CD 03 +1 +1 +1 in 03 ο d CD

n g Η H co CT

B H CD I - 4-1 H

ft H O 4J h d -Q. ·

m H'H'dCDCHH

Q. Η H J4 dP Ο ·Η d * 1^* H d 00 0 © rij CM H CO OH 4-1 ε CT H d 4-1

03 <ro r- o cto tT ίτ 3 ft <D <D

<h HO **· » ». vv OroCH»d tS

(0 OOOOOO > I ft ε 0 c d) +1 +1 +1 H to H 0 4-1 d C η ε ·Η Ό « CD d

So cd m cd ε ε o, CD tT 4-1 Λ 4-1 +j c o ft © -H d 0) TJ +»

-H H CM *=r ft H d CD > (D

h 2 cm in co in h 3 0 k -Η > Ω

Kc* p,j ^ ^ ^ v η M *d 'H Cn -H 2 co o tn o co o tn φ ft d d co ·

> +1 +1 +1 ^ ε 0 © d <u\ O

•a ε n -p 3 © μ ft ^ μ ε n Η © o © © © d ocfl H 4-1 d ε +* ft "3· CO CD CM O (D 4-1 Ή — 03 4-*

»•cm »-cm «-Η ε ο ε - ft © <D

tr> d •M' - cm »< ^ » H d E-> U Λ ^ e U HO HO HO © d I H ·— © H +1 +1 +1 β 5 «a ^ ^ y c___ © 43 ·»— d u « y -f- Η ·Η 01 H tntn H >1 2 d © · © •η ε ε © © ft o 4-) λ! λ > Otn 44 Η <3 Η Ο 0) ο Η 44 03 & Ρ3 d Η 3 £

01 HH MdM ftMO

c O ScnOQCTOOXl© O M 2 ft - h I 6 +* *4 .

H 44 ft <| O ©·ΗΤ3 44Μ d © d < rø dOHdO© c. q. Offl · tT H O Ή 44 O ft« -54 ©ΛίΑίΟε 4J 3 · HH H CO 03 Ή © •Η Η · Η H id ft H »H tT H 44 j O Η Η H+ 03ί>44θΧθ3 1 1

DK 155732B

tn 0) Λ ^ r*. (O Φ

VD l£> Ο Ό P

^ · §

O P

tn XX m tn id X X <l> Ό σι H rH ri in «tf β Ρ Λ «tf H m H m Η Φ tu

• Honono O-HIS

o ·. - - - - - > p

O O o O O O (Otfl-H

+i +1 +1 ϋ s

tn rH

G) Q) -rH

C rH ω tn XX p id XX Φ Ό · O) O ΰφ πν mn Ρ Φ Ρ β C\| O O rH O rH id g φ Φ • rH O Cl O ri O P 01> O »»»·«·*»"* Η p 0 Φ

CMOOOOOO Ρ Φ U P

+ | +1 +| W a -Θ.

φ ·Ρ φ

Ρ β tn w id Η Φ tn χ Η C

tn 0 β tn Φ ιΰ XX to φ in Όη'ΗΓΜνοΗΐη Η ,β U >ι rHHCOOOrH ο Ό • rH Ο Η Ο ΓΗ Ο - Φ Φ r—. η ****** ο χ3 β id UHOOOOOO Φ > Ρ Ο +1 +1 +1 V η ·Ρ Ρ rH > tn Λ ft id β -Ρ 13 Φ Φ tn Ό β tn \ φ ·Ρ «tf Φ tn > -Ρ

g tn «ud Η U

w ιΰ fltn h^1 H«i Φ a Φ Ρ T3 HH LD o r* O Ρ Λ

g rH O rH O rH O fi M id P

^ j3 ****** * id φ -Ρ φ •HP' OO oo oo Ai P > rH U +1 +1 +1 -ri P p·

φ ρ ·Η Ρ Ό. P

X) (d <-H -Ρ Ρ Φ a

<d φ -Ρ β Ό D 'O

EH > w 5 0

•Η ·Η Ή rH

a W Φ Λ g tn X G -ρ ρ υ Ό(Λ IN οω ΡΦγΗγΗ

•Η >d <!Ό ΙΛΗ hO φ tn Id S

Ο Ο Ο rH Ο Η Ο Ό.Ρ •η . ^ ^ ~ t n οι ο t n

i-η tn o o o o o o id P

ri +1 +1+1 Ό Ρ P |d

01 (p φ P

• > P

οι η · ·Η 4J rH rH tn 13

qj o 13 P

irj β O β

o φ Φ - ·Η N

h s H 'V ° ^ t! η -π ro m in vd nr- H o > (d P oo mo oo oo id v Φ Λ

0(3 rH O O O rH O * * Ρ Η P

(¾ . * * * * V«. O O P (I, ρ β

O O O O O O O O

tn +| +| +1 v v Φ τι β d β Φ O Φ •p Hl Al p > H tn d Φ id h v* ·· ·· Ρ Φ ρ ©.

u dtnoioiidPOP

•ri β Old ββΡβΡ-Η

*> OtnHO (didPid-P

h id idX. At X P a: PI β οι h idO P tn -ρ -ρ οι -ρ φ β o P\ O Ρ- Ρ Ρ Φ P · u

O P 0 tn Ρ ·ρ ·ρ (¾ ·ρ tn O

Η ΡΡ^-ΡΟβββΑίΡ id Φ β ·Ρ PlrH tn tn tn Φ P Qj O PI tn ·ρ ·Ρ ·ρ ci g o a « · ω to in i _ ρ d . η mu •ρρ · Η η X Ρ-Φ Η Η Η XX Φ Ν > 12 DK 1557328

Tabel 5

Litoralons virkning på Rana dalmatina's metamorfose

Gruppe Kropslængde Halelængde 5 _mm_mm_

Kontrol 45,9 +0/2 31,4+0,2 (60)

Behandlede dyr 40,2 + 0,2X 26,7 + 0,2X (60) x Signifikans: P < 0,001 i η

Forsøget udførtes med larver af Rana dalmatina med en alder på 30 dage, en kropslængde på 20-25 mm, og med allerede synlige fremspirende bagben. I løbet af en periode på 30 dage blev forsøgsdyrene anbragt i postevand indeholdende 0,5 yg/ml litoralon i to timer hver dag. Kontrolgruppen blev anbragt i 15 postevand uden tilsætning af litoralon. Haletudserne måltes på den 30. dag.

Tabel 6 2Q Litoralons virkning på blodsukkerniveauet

Gruppe I. Undersøgelse II. Undersøgelse _mg %_mg %_

Kontrol 94 + 3,6 (10) 94 + 4,09 (10)

Behandlede dyr 82,4 + 3,8 (10) 81+1,32 (10) 25

Signifikans ved I. undersøgelse: P < 0,05 Signifikans ved II. undersøgelse: P < 0,01

Hvide CGY-hanrotter med legemsvægt 160-180 g anvendtes til forsøget. Dyrene holdtes på en standard diæt. Der blev taget 2Q blodprøver på den 5. forsøgsdag efter 18 timers faste. Blodsukkerbestemmelserne udførtes efter metoden ifølge E. Hultman.

Litoralon blev indgivet oralt i daglige doser på 1 yg/kg.

35 13

DK 155732B

Biologisk forsøgsrapport B.

Undersøgelse af diverse forbindelser med formel I.

1. β-aspartyl-N-metyltaurin 5 a) Virkning på blodsukkerniveauet Kontrol 107 mg %

Behandlede dyr 93 mg %

Signifikans: P < 0,05

Til prøverne anvendtes 20-20 rotter. Målingerne gennem-10 førtes efter 18 timers faste. Den anvendte dosis var 1 yg/kg legemsvægt i 4 dage i form af en opløsning ved oral indgift.

b) Forøgende virkning på vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Kone., vitamin A, mg% 15 yg/200 g legemsvægt 0 (kontrol) 8,5 5 11,0 1 11,5 0,3 12,5 20 0,1 16,1 0,05 14,8 0,01 12,5 0,005 10,5 2,. Signifikans: P < 0,01

Til forsøgene anvendtes 20-20 Wistar hanrotter med legemsvægt 200-220 g.

Forsøgsperiode: 6 dage.

c) Virkning på blodets siliciumniveau:

Silicium (mg/g blod) 0 timer 20 dage_40 dage_

Kontrolgruppe 0,110+0,004 0,120+0,010 0,154+0,015

Behandlingsgruppe 15 yg/dag 0,100+0,005 0,315+0,014 0,345+0,015

Behandlingsgruppe II 10 yg/dag 0,107+0,009 0,370+0,119 0,360+0,017 xx Signifikans: P < 0,001 14

DK 155732B

Resultaterne er signifikante fra 20. dag ved niveau P < 0,001. Forsøgene udførtes på indavlede hankaniner med legemsvægt 2,5-3 kg. Den aktive bestanddel blev indgivet oralt i de i tabellen viste daglige doser. Bestemmelsen af silicium udførtes i-5 følge Gaubatz's metode (Gaubatz E., Klin. Wschrft. 14, 1753, 1935) i 5 ml blodprøver, som blev taget fra dyrenes ørevene.

Hver gruppe bestod af fem dyr.

d) Virkning af j3-aspartyl-N-metyl-taurin og vitamin A på den 10 granulomfremkaldende virkning forårsaget af implantation af vat:_

Gruppe Dosis Vægt af tør-

Vitamin Ax 3-aspartyl-N- ret 9ranulom

t . IRCT

metyltaurm lokal lokal oral 15 _mg_yg yg/dag____

Kontrol I. - - - 54+1,7

Kontrol II. + opløsningsmiddel - - - 55+3,4

Behandlingsgruppe III. 2 - - 66+12,5 2g Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 67 + 2,6

Behandlingsgruppe V. - - 0,1 79+2,8

Behandlingsgruppe VI. 2 - 0,1 96+4,4 x Hoffmann la Roche 25 Forskellene er signifikante som følger:

Mellem gruppe II og III P < 0,05, mellem gruppe II og V P < 0,001 og mellem gruppe V og VI P < 0,01.

Bestemmelsen af granulom udførtes på grupper på hver fem Sprague-Dawley hanrotter med legemsvægt 110-120 g ved me-30 toden ifølge Lee et al (Lee K.H., Fu Ch.Ch., Spencer M.R.

Tong T.G. og Poon R.J., Pharm. Sci., 62, 895, 1973). De dor-solateralt subkutant implanterede tamponer fjernedes efter 10 dage og måltes efter tørring ved 65°C til konstant vægt.

35 15

DK 155732B

2. β-Aspartyl-homotaurin, a) Virkning på blodsukkerniveauet

Kontrolgruppe 105 mg%

Behandlet gruppe 94 mg% 5 Signifikans, antal forsøgsdyr og forsøgsmetode var som angivet under pkt. 1 a) ovenfor.

b) Forøgende virkning på vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Koncentration vitamin A

10 pg/200 g legemsvægt mg% 0 (kontrol) 8,6 5 12,0 1 13,5 0,3 14,0 15 0,1 15,8 0,05 15,0 0,01 12,0 0,005_10,0_

Signifikans, antal forsøgsdyr og forsøgsmetode var som angivet ovenfor under pkt. Ib).

c) Virkning på blodets siliciumniveau:

Silicium (mg/g blod) 25 _0 timer _20 dage_40 dage__

Kontrolgruppe 0,104+0,009 0,134+0,015 0,157+0,020

Behandlingsgruppe I. 5yg/dag 0,094+0,007 0,309+0,014 0,340+0,014

Behandlingsgruppe II. 10 pg/dag 0,109+0,010 0,372+0,120 0,363+0,018ΛΛ 30 Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmel sesmetode som angivet ovenfor under pkt. 1 c).

35 16

DK 155732B

d) Virkning af β-aspartyl-homotaurin og vitamin A på den granu-lomfremkaldende virkning af implantation af vat;_

Dosis Vægt af tørret

Vitamin Ax β-aspartyl- granulom 5 lokal homotaurin g mg lokal oral _μg yg/dag_

Kontrolgruppe I - - - 52+1,5

Kontrolgruppe II - - - 53+3,2 + opløsningsmiddel 10 Behandlingsgruppe III. 2 - - 64+12,3

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 65+2,4

Behandlingsgruppe V. - - 0,1 77+2,6

Behandlingsgruppe VI._2_ 0,1_94 + 4,2__ x Hoffmann la Roche 15

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode var som angivet ovenfor under punkt ld).

3. γ-Glutamyl-kolaminfosfat.

a) Virkning på blodsukkerniveauet 20

Kontrolgruppe 104 mg%

Behandlingsgruppe 93 mg%

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og dosering var som angivet ovenfor under punkt la).

25 b) Forøgende virkning på vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Vitamin A-koncentration yg/200 g legemsvægt_mg%_________ 0 (kontrol) 8,8 30 5 12'3 1 13,4 0,3 14,3 0,1 16,0 0,05 15,5 0,01 11,2 35 0,005_9j2_ 17

DK 155732B

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode var som angivet ovenfor under punkt 1 b).

c) Virkning på blodets siliciumniveau: 5 Silicium (mg/g blod) _0 timer_20 dage_40 dage_

Kontrolgruppe 0,106+0,011 0,136+0,017 0,159+0,022

Behandlingsgruppe xx I 5 yg/dag 0,096+0,009 0,311+0,016 0,340+0,017 .. Behandlingsgruppe vv xx 10 II 10 yg/dag 0,111+0,011 0,374+0,121xx 0,365+0,019

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode var som angivet ovenfor under punkt 1 c).

d) Virkning af γ-glutamyl-kolaminfosfat og vitamin A på den 1 s granulomfremkaldende virkning af vatimplantation;_

Dosis Vægt af tør ret granulom

Vitamin Ax γ-glutamyl- mg lokal kolaminfosfat mg lokal oral 2Q _yg yg/dag_

Kontrolgruppe I. - - - 49+1,2

Kontrolgruppe II. + opløsningsmiddel - - - 50+2,9

Behandlingsgruppe III. 2 - 61 + 12,0

Behandlingsgruppe IV. 2 .0,1 - 62+2,1 25 Behandlingsgruppe V. - - 0,1 74+2,3

Behandlingsgruppe VI. 2 - 0,1 91+3,9 x Hoffmann la Roche

Signifikans, ntal forsøgsdyr, arrangement samt bestem:-melsesmetode var som angivet under ' 1 d) ovenfor.

35

Claims

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af amino-syrederivater med formlen

5 R1-NH-CH-CO-A1 ( CEL· ) I I 2 n -i CO-N-CH-(CH9 ) -B I 2 * ^ R R hvor 10. er hydroxy, C^_^alkoxy eller fenyl-C^^alkoxy; B1 er en gruppe med formlen -S020H eller-OPO(OH)2; R er hydrogen eller alkyl med 1-4 kulstofatomer; R er hydrogen, _^alkoxykarbonyl eller fenyl-C^^alkoxy-karbonyl; 2 15. er hydrogen eller karboxyl, n er 1 eller 2 og t er 1 eller 2, eller fysiologisk acceptable salte eller optisk aktive antipoder deraf, kendetegnet ved at man omsæt-20 ter en optisk aktiv eller racemisk forbindelse med den almene formel r'-nh-ch-coa (CH2)n II

25 COA2 1 1 hvor R , A og n har de ovenfor angivne betydninger, og 2 A er p-nitrofenoxy, pentaklorfenoxy eller alkoxykarbo-nyloxy med 2-4 kulstofatomer i alkoxydelen, med en op-30 tisk aktiv eller racemisk forbindelse med den almene formel NH- CH -(CEL·).-B1 III R Å2 2 * 35 2 1 hvor R, R , B og t har de ovenfor angivne betydninger, _ DK 155732B hvorefter man om ønsket omdanner den således vundne forbindelse til et fysiologisk acceptabelt salt deraf eller frigør den fra et salt og/eller fremstiller den vundne forbindelse i optisk aktiv form ved opspaltning af et vun-5 det racemisk produkt.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at en forbindelse med den almene formel II, fortrinsvis en N-karbobenzyloxyaminodikarboxylsyre-oc-benzyl-ω-ρ-nitrofenylester, omsættes med en forbindelse med den almene 10 formel III, fortrinsvis med taurin, N-metyltaurin, homo-taurin, kolaminfosfat eller cysteinsyre, i nærværelse af vandig pyridin. 15 20 25 30 35