DK155433B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af aminosyrederivater eller fysiologisk acceptable salte deraf - Google Patents

Description

DK 155433 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte aminosyrederivater med værdifulde biologiske og farmaceutiske virkninger.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede aminosyrederivater har den almene formel 5

NH--CH-COOH

2 I

Wn 1 CO-N-CH-(CH,),-B1 |l, 10 R R2 hvor B er en gruppe med formlen -SC^OH eller -ΟΡΟ(ΟΗ)2/ R er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-4 kulstof** 15 atomer, 2 R er et hydrogenatom eller en karboxylgruppe, n er 1 eller 2, og t er 1 eller 2, eller er fysiologisk acceptable salte eller optisk aktive antipoder deraf.

20

Disse forbindelser har værdifulde biologiske eller farmakologiske virkninger. Alle de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er hidtil ukendte.

Blandt de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser skal på grund af dens biologiske virkning navnlig fremhæves v-L-25 glutamyltaurin, der svarer til formlen · h.n-ch-cooh 2 i CKp

30 [ * XXIV

CH0 I 2 C0-NH-CH2-CH2-S020H og som har et bredt' terapeutisk og 35 præventivt virkningsspektrum over for sygelige forandringer der kan føres tilbage til beskadigelser af "AGAS" (det aerobiosfæri-ske genetiske adaptionssystem).

2

DK 155433 B

Til belysning af begrebet "AGAS" opregnes i det følgende de vigtigste væv og organer der danner dette system.

a) Alle biologiske grænseflader der står i berøring med den ydre luft som biosfæren(hud og huddannelser, øjets hornhinde 5 og Conjunlctiva, mund- og svælghulrum, luftveje og lunge); b) skelet og led (rørknogler og svampeagtige knogler, kugleled, synoviale membraner* skeletmuskulatur); c) de til reguleringen af ionhusholdningen deltagende organer (transepiteliske transportsystem: tarmtrævler og nyreka- 1 o nal); d) det tii findeling af næringen nødvendige tekodonte (i tandaveå)lerne med rødder fastgjorte) tandsæt; e) høre-, lugte-o g stemmeorganer.

De omhandlede forbindelser udøver således en gunstig bi-15 ologisk eller terapeutisk virkning på de her opregnede organer eller væv af AGAS-systemet.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser virker desuden på følgende funktioner der står i sammenhæng med AGAS-systemet: strålingsbeskyttelse, begunsti-20 gelse af sårheling, almindelig aktiverende virkning på mesenkym, beskyttelse mod den stadigt voksende infektions- og tilsmudsningsfare hos hud og slimhinder (den fugtige slimhindes lyso-zymproduktion, aktivering af fimreepiteler i luftvejene osv.), forøget beskyttelse mod de af vira og svampe forårsagede infek-25 tioner.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er virksomme mod de stadigt og i høj grad stigende stress-virkninger der er knyttet til livet på fastlandet (fx meteorologisk indflydelse, store forskelle mellem dag- og 30 nattemperatur, forhøjet fare for kvæstelser), idet de stabiliserer adaptionssyndromet og samtidigt afværger glukokortikoi-dernes perifere vævsskader (som fx skader i bindevævet, kvæstelser af knoglematrixbestanddele osv.). Udvikling af immun-homøostase (stigende erkendelsesevne hos legemet om hvilke cel-35 ler der er kropsegne og hvilke der ikke er)..

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser udøver deres virkning dels umiddelbart, 3

DK 155433 B

dels over reguleringen af vitamin A metabolismen, ved produktion af vitamin A metaboliter med stærkere polær karakter.

Denne virkning kan sammenlignes med parathormonets virkning på 25-hydroxycholecalciferol-1a-hydroxylase-enzymet i nyrekanalen. Virkningsretningerne af forbindelserne er følgende: 5 A) Virkninger med vitamin A-karakter: a) Farmakologiske og biokemiske virkningers forøgende virkning på kondroitinsulfatsyntese; gunstig virkning på sårhelingen eller på den ved indgift af kortison eksperimentelt 10 forringede sårheling hos rotter og hunde; potentierende virkning på vitamin A's virkning hos rotter og høns ved eksperimentelt fremkaldte hypo- eller hypervitaminoser; dæmpende virkninger på de ulcer ations-betingede stress-virkninger hos rotter; begunstigende virkning på degranulationen af mastocyter; forøgende virkning på 15 produktionen af lysozym; virkning på sporstofhusholdningen (silicium, zink, kobber, mangan, fluor); fremmende virkning på epiteldannelsen; fremmende virkning på den alkaliske fosfatasealctivitet; virkningen på den ved lokal indvirkning af vitamin A fremkaldte granulomposedannelse (Granulomsackbildung); det yderst flade for-20 løb af dosis-virkningskurven eller ændringen af virkningens fortegn ved store doser; aktiverende virkning på Golgi-apparatet; begunstigende virkning på dannelsen af slim- eller bægerceller; forøgende virkning på koncentrationen af vitamin A.

25 b) Klinislc-terapeutiske virkninger: keratokonjunktivis sicca; Sjogrens syndrom; rhino-laryngo-pharingitis sicca; ozæna; kronisk bronchitis; sinobronchitis; mucoviscidose; konstitutionelle lungesygdomme hos småbørn; paradentose; hudens og slimhindernes ^ smittetilbøjelighed for vira og svampe; kortison-antagonistisk virkning; gunstig virkning på helingen ved operationssår og slimhindesår; erosio colli; pruritusagtige lidelser; nedsættelse af lugte- og smagssansen.

35

DK 155433 B

4 B) Virkninger -uden vitamin A-karakter a) Farmakoligiske og biokemiske virkninger: virkning på blodsukkerniveauet med hensyn til en forbigående sænkning; forøgende virkning på fosfaturi, sænkende virkning på fosfatniveauet 5 i serum; strålingsbeskyttende virkning; formindskende virkning på den nødvendige tid der går med at nå målet ved labyrintforsøg hos inaktiverede dyr; formindskende virkning på eksperimentelt fremkaldte fluor- og kadmiumtoxikoser; forøgende virkning på den cykliske adenosinmonofosfat-udtømning af nyrerne; dæmpende virkning ^ ‘ på symptomerne ved· eksperimentelt fremkaldt lathyrismus; formindskelse af histaminfølsomheden; forøgende virkning på aktiviteten af leverenzymet tyrosinaminotransferase.

b) Terapeutiske virkninger: svage bestrålingsskader; 15 vitiligo; muskelhypotoni; psykoenergetiserende virkning; gunstig virkning på involutionelle og gerontologiske tilstande samt på de mnestiske funktioner; keloide tilbøjeligheder; spondylosis ankylo poetica; sygdomme hos bevægelsesorganerne på grund af slid; scle-rotisk fundus; amyloidose; morphæa; fibrocytisk mastopati.

20

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan anvendes til tilsætning til lægemiddelblandinger. De forbedrer vitamin A metabolismen. Desuden forøges resorptionen af sporgrundstoffer ved hjælp af forbindelserne idet sporgrundstoffernes koncentration i blodet hæves.

25 I veterinærmedicinen har de ifølge opfindelsen fremstil lede forbindelser lignende anvendelsesområder som i humanmedicinen, dvs. fx hudskader (afskalning), sårheling og knoglebrud.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i det følgende ved hjælp af nogle eksempler.

35

DK 155433 B

O

Eksempel 1 a) Karbobenzyloxy-γ-(g-benzyl)-L-glutamyltaurin 40,85 g (0,11 mol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-a-ben- zylester (Liebigs Annalen 655, 200, 1962) opløses i 500 ml aceto- nitril. Opløsningen afkøledes til -15°C under udelukkelse af luft-5 fugtigheden. Til opløsningen sættes dråbevis under omrøring først 15,4 ml (0,11 mol) triætylamin og derpå 15,4 ml (o,11 mol) klormy-resyreisobutylester. Reaktionsblandingen omrøres ved -15°C i 40 minutter og derpå tilsættes 28 ml (0,2 mol) triætylamin efterfulgt af 11,26 g (0,05 mol) cystamin-hydroklorid og til sidst 250 ml ace- 10 tonitril. Blandingen efteromrøres ved -15 C i yderligere to timer og derpå i yderligere fire timer ved stuetemperatur.

Efter reaktionstidens udløb inddampes blandingen ved 30°C

under vakuum. Remanensen optages under omrøring og afkøling i 200 ml isvand og blandingen inddampes påny ved 35°C under vakuum. Re-15 manensen indføres sammen med 250 ml vand og 500 ml ætylacetat 1 en skilletragt og den organiske fase skilles fra. Den organiske fase udrystes i den nævnte rækkefølge først med 250 ml vand, derpå to gange med 250 ml 5% natriumkarbonatopløsning hver gang og derpå to gange med 250 ml IN saltsyre og til sidst med 250 ml vand. (Ud fra den ved udrystningen med natriumkarbonatopløsning vundne vandige fase kan der ved syrning med saltsyre og udrystning med æter genvindes ca. 5 g ikke omsat karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-oc-ben-zylester). Ætylacetatfasen tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes derpå under vakuum ved 30°C til tørhed. Der vindes en 25 tyk, olieagtig remanens som hurtigt stivner til en krystallinsk masse. Denne rives med 250 ml absolut æter hvorpå krystallerne frafiltreres. Det rå produkt (40-42 g) omkrystalliseres fra en blanding af 100 ml ætylacetat og 170 ml æter. Der vindes 29,3 g N, N' -bis-/N-lcarbobenzyloxy-y- (α-benzyl )-L-glutamyl7-cystamin med smeltepunkt 91-92°C.

Beregnet for CMH.nN,0inSo (M = 859,05): C 61,52 H 5,89 N 6,52 S 7,46 fundet: C 60,85 H 5,91 N 6,61 S 7,72% 35 6

DK 155433 B

25,77 g (0,3 mol) af det ovenfor vundne N,N’- bis-^N-Icarbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl7-cystamin opløses i 75 ml iseddilcesyre. Den i is afkølede opløsning sættes i løbet af 15 minutter dråbevis til en frisk tilberedt blanding af 75 ml 30%s hydrogenperoxyd og 225 ml iseddikesyre. Efter tilsætningen 5 fjernes kølingen og reaktionsblandingen omrøres i fire timer ved stuetemperatur. Derpå inddampes der under vakuum ved 30°C. Det olieagtige produkt tørres i en elcssilckator først over fosforpent-oxyd og derpå over fast kaliumhydroxyd. Der vindes 28,5 g lcarbo-benzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin. Det rå produkt kan uden rensning anvendes til fremstilling af y-L-glutamyltaurin.

b) Ύ-L- QLutamyltaurin 5,79 g (12,1 mmol) af det ifølge eksempel 1 a) fremstillede 15 karbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin opløses i en blanding af 100 ml ætanol og 25 ml vand og hydrogeneres under rystning i nærværelse af 0,5 g 10%s palladiumkulstof som katalysator. Efter at hydrogenforbruget er ophørt filtreres opløsningen hvorpå den inddampes ved 30°C under vakuum. Den olieagtige remanens tørres i 20 ekssikkator over fosforpentoxyd. Der vindes 3,1 g γ-L-glutamyltaurin der let opløses i vand men ikke i alkohol. Ved tilsætning af en lille smule vand og alkohol i små portioner kan produktet krystalliseres. Det krystallinske råprodukt smelter ved 202-204°C.

Råproduktet omkrystalliseres flere gange fra 80%s æta-25 nol. Der vindes 2,02 g rent slutprodukt som beregnet ud fra N,N'-bis-/N-karbobenzyloxy-y-(α-benzyl)-L-glutamyl7-cystamin svarer til et udbytte på 66%. Det rene produkt smelter ved 219-220°C. a^° = +14° (vand, c = 1,02). Den relative bevægelighed i forhold til cysteinsyre ved papirelelctroforese gennemført ved pH 6,5 ud-3 0 gør 0,73, ved pH 1,8 0,53.

Rp (n-Butanol/pyridin/iseddike/vand 15:10:3:12) = 0,19.

Beregnet for CyHy^OgS (m = 254,27): C 33,07 H 5,55 N 11,02 0 37,75 S 12,61 fundet: C 33,15 H 5,76 N 10,94 0 37,53 S 12,17%.

35 7

DK I ‘i54’:; 3 B

Eksempel 2 a) Ύ-(a-Benzyl)-L-glutamyltaurin 26,32 g (55 mmol) af det ifølge eksempel 1 a) fremstillede lcarbobenzyloxy-y-(oc-benzyl)-L-glutamyltaurin opløses i 50 ml is-5 eddikesyre. Til opløsningen sættes 4 mol brombrinte opløst i 50 ml iseddike. Der iagttages en livlig kulstofdioxydudvikling. Reaktionsblandingen henstår ved stuetemperatur i to timer og inddampes derefter under vakuum ved 30°C. Den olieagtige remanens opløses i 170 ml vand og rystes fem gange med 70 ml æter hver gang.

Den vandige fase inddampes ved 35°C under vakuum. Der vindes 20,42 g y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin som omkrystalliseres fra 90%s ætanol .

Rp (n-Butanol/pyridin/iseddike/vand 15:10:3:12) = 0,53 Rp (n-butanol/iseddike/vand 4:l:l) = 0,39.

15 b) γ-L-Glutamyltaurin

Det ifølge eksempel 2a) vundne y-(oc-benzyl)-L-glutamyltau-rin (20,42 g) opløses i 150 ml IN kaliumhydroxydopløsning. Opløsningen henstår i fire timer ved stuetemperatur og overføres derpå til en kolonne på 2 x 100 cm fyldt med "Dowex" 50 x 2 (Fluka, 100-200 mesh) der befinder sig i H -cyklus. Der elueres med vand. Beregnet fra begyndelsen af udvaskningen opsamles 300 ml eluat. Dette inddampes under vakuum ved 35°C. Den olieagtige remanens krystalliseres ved tilsætning af 8-10 ml vand og ca. 100 ml ætanol.

25 Efter filtrering, vask med alkohol og tørring vindes 13,7 g y-L-glutamyltaurin. Det krystallinske produkt omkrystalliseres fra 80%s vandig ætanol. Der vindes 9,79 g rent produkt som regnet ud fra N,N'-bis-/N-lcarbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl7-cystamin svarer til et udbytte på 10%.

30

Eksempel 3 ϊ-L-Glutamyltaurin 5,42 g (11 mmol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben-zyl)-y-p-nitrofenylester (Chem. Ber. 96, 204, 1963) opløses i 50 ml pyridin. Opløsningen afkøles til 0°C og inden for en halv time tildryppes der under intensiv omrøring en opløsning af 1,25 g (lo mmol) taurin i 20 ml vand. Derpå sættes der 3,08 ml (22 mmol) tri- 8 π i*' Ί Γ Γ / 7 Ο U ί\ ! ·. ι ϋ 'τ j C Ο ætylamin til blandingen, afkølingen og omrøringen afbrydes. Blandingen henstår ved stuetemperatur i 72 timer og inddampes derpå under vakuum. Remanensen opløses i 50 ml vand og der sættes IN saltsyre til den gule opløsning indtil den affarves. Por at fjerne p-nitrofenolen rystes opløsningen ti gange med 50 ml æter hver gang. Denne vandige fase '.nddampes under vakuum. Der vindes 6,9 g karbobenzyloxy-γ-(α-benzyl)-L-glutamyltaurin-triætylammoniumsalt.

Substansen hydrogeneres katalytisk på den i eksempel lb beskrevne måde og opløsningsmidlet fjernes ved inddampning under vakuum. For at fjerne triætylaminen opløses stoffet i en lille smule vand og overføres til en "Dowex" 50 x 2-lcolonne på 2 x 40 cm.

10

Der elueres med vand." Der opsamles ca. 120 ml eluat og dette inddampes derpå under vakuum ved 35°C. Krystallisation og isolering af produktet sker på den måde der er beskrevet i eksempel lb. Der vindes 1,72 g γ-L-glutamyltaurin som i forhold til taurin svarer til et udbytte på 68%, smp. 219-220°C, = +14° (c = 1, i vand).

Eksempel 4 γ-D-Glutamyltaurin

Karbobenzyloxy-γ- (α-benzyl) -D-g-lutamyltaurin-triætylammo-20 niumsalt fremstillet på den i eksempel 3 beskrevne måde hydrogeneres katalytisk på samme måde som i eksempel 3. Det vundne γ-D-glutamyl-taurin smelter ved 219-220°C, a^° = -13,9° (c = 1, i vand).

Eksempel 5 25 ---------- a) Karbobenzyloxy-Y-L-glutamyltaurin 529 mg (1,1 mmol) af det ifølge eksempel 1 a) fremstillede karbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin opløses i 5 ml IN kaliumhydroxydopløsning og henstår i fire timer ved stuetempera-30 tur. Derpå udrystes opløsningen tre gange med 3 ml æter hver gang. Den vandige fase overføres på en med "Dowex" 50 x 2 fyldt kolonne på 1 x 20 cm og elueres med vand. ("Dowex" er et i Danmark indregistreret varemærke). Der opsamles 50 ml opløsning som inddampes til tørhed under vakuum ved 35°C. Der vindes råt karbobenzyloxy-35 γ-L-glutamyltaurin som renses ved papirelektroforese gennemført ved pH 6,5· Den relative bevægelighed i forhold til cysteinsyre udgør 1,05-

Rp (n-Butanol/pyridin/iseddike/vand 15:10:3:12) = 0,57.

DK 155433 B

9 b) γ-L-Glutamyltaurin

Det ifølge eksempel 5a) vundne karbobenzyloxy-y-L-gluta-myltaurin opløses i 2 ml iseddike der indeholder 4 mol brombrinte. Blandingen henstår ved stuetemperatur i en halv time og inddampes derpå ved 35°C under vakuum. Remanensen rives fire gange med æter 5 og skilles derpå fra æteren ved dekantering. Det vundne γ-L-glu-tamyltaurin omkrystalliseres på den i eksempel 3 beskrevne måde.

Eksempel 6 γ-L-Glutamyltaurin,mononatriumsalt 10 ----- .

25,4 mg (0,1 mmol) γ-L-glutamyltaurm opløses i 2 ml vand og der sættes 10 ml 0,01 N natriumhydroxydopløsning til opløsningen. Blandingen inddampes ved 30°C under vakuum. Den hvide krystallinske remanens tørres i elcssikkator over fosforpen toxyd.

15 Der vindes et mononatriumsalt af γ-L-glutamyltaurin. Produktet har intet skarpt smeltepunkt, begynder at skrumpe ved 200°C, dets farve bliver stadig mørkere, og ved ca. 250°C forkuller det. Produktet er lige dårligt opløseligt i metanol og ætanol.

Eksempel 7 20 ---------- a) Karbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(γ-taurin)-glycin-ætylester_ 0,48 g (l mmol) karbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-p-nitro- fenylester)-glycinætylester (Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 65, 375, 2 5 1970) opløses i 6 ml ætylacetat. Opløsningen afkøles med isvand. Ved 0°C sættes der først 0,08 g (l mmol) cysteamin i 1 ml dimetyl-formamid til opløsningen hvorpå der tildryppes 0,14 ml (l mmol) triætylamin. Der begynder langsomt at udfælde sig et bundfald. Reaktionsblandingen henstår yderligere i nogen tid i isvand hvor-på den henstår endag ved stuetemperatur og til sidst fortyndes med en blanding i forholdet 1:1 af æter og ætylacetat. Bundfaldet fracentrifugeres og vaskes først med en blanding af æter og ætylacetat i forholdet 4:1 og derpå flere gange med æter. Efter tørring over svovlsyre vaskes bundfaldet tre gange med IN saltsyre, to gange med vand, to gange med mættet natriumhydrogenkarbonatopløsning

DK 155433B

10 og til sidst atter to gange med vand hvorpå det tørres under vakuum over svovlsyre. Der vindes 0,35 g karbobenzyloxy-cc-L-glutamyl-(y-cysteamin)-glycinætylester svarende til et udbytte på 85%.

Beregnet for C]_8H25°6N3S = 411,4): C 52,6 H 6,1 S 7,8 5 fundet: C 53,4 H 6,5 S 7,7%

Det infrarøde spektrum udviste følgende maksima for de karakteristiske grupper: NH 3310 cm”1, C=0 (C00C2H^) 1748 cm”1, 0=0 (Z) 1690 cm”1, 0=0 (amid) 1655 cm”1.

100 mg karbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-cysteamin)-glycin-10 ætylester opløses i 2‘ ml iseddike og der sættes 0,5 ml 30%s hydro-genperoxyd til opløsningen. Reaktionsblandingen henstår i fire timer under isafkøling. Reaktionens fremadskriden følges med papir-elektroforese. Efter fortynding med vand lyofiliseres reaktionsblandingen. Slutproduktet vindes i form af et skum. Der vindes 15 0,11 g (95%) karbobenzyloxy-oc-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinætyl- ester.

b) a-L-Glutamyl-(γ-taurin)-glycin 2Q 100 mg af det ifølge eksempel ya) fremstillede karboben- zyloxy-a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinætylester opløses i en blanding af 1 ml trifluoreddilcesyre og 1 ml koncentreret saltsyre. Opløsningen holdes i tre timer ved 35°C i et lukket bomberør. Derefter inddampes opløsningen under vakuum, remanensen udludes flere gange med æter og n-hexan og inddampes påny. Der vindes et hvidt 2 5 amorft stof der ved elektroforetisk undersøgelse viser sig som en enhed og giver en positiv ninhydrinplet. Produktet er a-L-glutamyl-(γ-taurin)-glycin. Udbytte 0,06 g (88%).

Beregnet for C^H^NgOyS (m = 311,3): 30 8 10·3 fundet: S 10,0%.

Det infrarøde spektrum udviste følgende maksima for de karakteristiske grupper: NH* 3100 cm"1 (bred); OH (C00H) 3200 cm 1 (bred); 0=0 (C00H) 1730 cm”1; 0=0 (amid-l) 1680 cm”1; 0=0 (amid-ll) 1560 ; S=0 (SOpOH) 1220 cm"1 (intensiv); S=0 (SOpO") 1045 cm”1

J J

(intensiv).

11

DK 155433 B

Hydrolyse: 20 mg af stoffet holdes i 1 ml 6N saltsyre i et tilsmeltet glasrør i 24 timer ved 105°C. Efter afkøling udtrækkes prøven af opløsningen ved elektroforese ved pH 1,8. Opløsningen indeholder glutaminsyre, glycin og taurin.

5 c) Karbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(γ-taurin)-glycin- metylester_ 0,47 g (1 mmol) karbobenzyloxy-a-L-glutamyl-^-p-nitro-fenylester)-glycinmetylester opløses i 6 ml pyridin. Under isafkøling sættes først 0,125 g (1 mmol) taurin i 2 ml vand og derpå 10 o,28 ml (2 mmol) triætylamin til opløsningen i så små portioner at opløsningen hele tiden forbliver klar. Reaktionsblandingen henstår ved stuetemperatur i tre dage. Efter inddampning under vakuum • vindes en olie som efter grundig udludning i æter og derpå i petroleumsæter tørres under vakuum over svovlsyre. Der vindes karboben-15 zyioxy-a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinmetylester.

d) a-L-Glutamyl-(γ-taurin)-glycin 100 mg af den ifølge eksempel 7c) fremstillede karboben-zyloxy-a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinmetylester omsættes med 4 ml 20 2N eddikesurt brombrinte ved stuetemperatur indtil den samlede mængde stof er gået i opløsning (ca. 30 minutter). Den vundne klare opløsning udfældes i 30 ml æter og henstår derpå på et koldt sted i en dag. Det fremkomne bundfald fracentrifugeres, vaskes flere gange med æter og tørres derpå under vakuum over kaliumhy-25 droxyd, svovlsyre og fosforpentoxyd. Det fremgår af den elektroforetiske undersøgelse at hydrogenbromidet af a-L-glutamyl-(γ-taurin) glycinmetylesteren vindes i praktisk talt ren form.

Det vundne salt omsættes under afkø- 30 ling med isvand i tre timer med 2 ml N natnumhydroxydopløsning. Hydrolysens fremadskriden følges elektroforetisk. Reaktionsblandingen underkastes ionbytning med 10 ml "Dowex" 50 i H+-form hvorefter den lyofiliseres. Da elektroforesen endnu viser forureninger omkrystalliseres produktet flere gange fra vandigt ætanol indtil der er opnået en tilsvarende renhed. Der vindes 40 mg (59%) a-L-glutamyl-(γ-taurin)-glycin.

12

DK 155433 B

Det infrarøde spektrum udviser følgende maksima for de karakteristiske grupper: NH 3310 cm""1; NH* 3100 cm 1 (bred; 0=0 (COOH) 1730 cm-1; C=0 (amid i) 1650 cm”1; C=0 (amid II) 1570 cm”1; S=0 1220 (intensiv), 1045 cm-1 (intensiv).

5 e) Y-L-Glutamyltaurin 100 mg af det under pkt. a+b eller c+d i nærværende eksempel fremstillede a-L-glutamyl-(γ-taurin)-glycin opløses i 25 ml af en 0,2 molær ammoniumhydrogenkarbonatpuffer med en pH-værdi på 8,5. Til opløsningen sættes 1 mg karboxypepti-10 dase A opløst i 0,5 ml vand. JFremstiller af enzymet: Serva,

Heidelberg). Blandingen holdes i 24 timer ved 37°C i termostat hvorpå den lyofiliseres. I det tørrede lyofilisat kan der eftervises Ύ-L-glutamyltaurin og glycin. Det rene γ-L-gluta-myltaurin kan vindes ved elektroforese eller kromatografi 15 på en "Dowex" 50-kolonne.

Eksempel 8 a) Karbobenzyloxy-γ-(α-benzyl)-L-glutamylhomotaurin 1,082 g (2,2 mmol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben- zyl)-y-p-nitrofenylester opløses i 6 ml af en blanding af pyridin og vand i forholdet 2:1. Til opløsningen sættes først 278 mg (2 mmol) homotaurin og derpå 0,59 ml (4,2 mmol) triætylamin. Den gule opløsning henstår ved stuetemperatur i 72 timer og inddampes derpå 25 under vakuum. Den olieagtige remanens opløses i vand, neutraliseres med saltsyre og ekstraheres derpå til fjernelse af p-nitrofenol i en kontinuerlig ekstraktør med æter i otte timer. Den vandige fase inddampes under vakuum. Der vindes 1,68 g karbobenzyloxy-γ-(a-ben-zyl)-L-glutamylhomotaurin.

30 b) γ-L-Glutamylhomotaurin

Den samlede mængde af det ifølge eksempel 8a) fremstillede stof (1,68 g) opløses i 10 ml 50%s vandig ætanol hvorpå der tilsættes 0,3 g 10^s palladium-aktivkul og der ledes hydrogen gennem suspen-35 sionen i fire timer. Derpå filtreres opløsningen og inddampes under vakuum. Remanensen opløses i 1-2 ml vand og til fjernelse af tri-

DK 155433 B

13 ætylamin .føres den til en kolonne på 1 x 35 cm med "Dowex" 50 x 2 på H+-form. Der elueres med vand. Der opsamles 50 ml eluat hvorel ter der inddampes under vakuum. Som remanens vindes 4Ί0 ml γ-L-glutamylhomotaurin hvilket svarer til et udbytte på 82%. Den ved pH 6,5 udførte elektroforese udviser en ringe mængde forurening 5 af dels neutrale, dels sure forbindelser (homotaurin eller gluta-minsyre). Produktet kan fx renses ved præparativ elektroforese.

Både ved elektroforese gennemført ved pli 6,5 og ved ele troforese gennemført ved pil 1,8 vandrer forbindelsen i retning <af katoden. Bevægeligheden i forhold til cysteinsyre udgør ved pH 6, 1q 0,68, ved pH 1,8 0,50.

Rp (n-Butanol/pyridin/iseddike/vand 15:10:3:12) = 0,19-Eksempel 9 a) Karbobenzyloxy-Y-(α-benzyl)--L-glutamyl-N-metyltaurin 1,083 g (2,2 mmol) karbobenyzloxy-L-glutaminsyre-(a-ben- zyl)-y-p-nitrofenylester omsættes på den i eksempel 8a) beskrevne måde med 278 mg (2 mmol) N-metyltaurin. Der vindes 1,59 g karbo-benzyloxy-γ-(α-benzyl)-L-glutamyl-N-metyltaurin.

20 b) Y-L-Glutamyl-N-metyltaurin

Den samlede mængde af det ifølge eksempel 9 a) fremstille stof (1,59 g) hydrogeneres katalytisk på den i eksempel 8 b) beskrev ne måde. Der vindes 423 mg γ-L-glutamyl-N-metyltaurin hvilket svarer til et udbytte på 79%. Både ved pH 6,5 og ved pH 1,8 vandrer 25 forbindelsen ved papirelektroforese i retning af katoden. Bevægeligheden i forhold til cysteinsyre: pH 6,5: 0,68; pH 1,8: 0,49.

• (n-Butanol/pyridin/iseddike/vand 15:10:3:12) = 0,16.

Eksempel 10 30 ----------- a) Karbobenzyloxy-γ-(α-benzyl)-L-glutamyl-L-cysteinsyre 2,87 g (6,6 mmol) lcarbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben-Zyi)-y-p-nitrofenylester opløses i 20 ml pyridin og der tilsættes en opløsning af 1,25 g (6 mmol) L-cysteinsyremonohydrat i en blan-35 ding af 17 ml vand og 17 ml pyridin. Efter tilsætning af 2,6 ml — ψ

DK155433B

14 (18,6 mmol) triætylamin henstår reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 72 timer. Derpå inddampes opløsningen under vakuum ved 30°C. Remanensen opløses i 20 ml vand, syrnes med koncentreret saltsyre og rystes derpå 15 gange med 10 ml æter hver gang. Den vandige fase inddampes under vakuum ved 35°C. Der vindes karboben-5 zyloxy-γ- (α-benzyl)-L-glutamyl-L-cysteinsyre.

b) T-L-Glutarnyl-L-cysteinsyre

Det ifølge eksempel 10a) fremstillede produkt opløses i 20'ml vand, der tilsættes 0,3 g 10%s palladium-aktivt kul og der 10 ledes hydrogen gennem suspensionen i tre timer. Reaktionsblandingen oparbejdes på den i eksempel '8 b) beskrevne måde. Der vindes γ-L-glutamyl-L-cysteinsyre som smelter ved 187°C. I forhold til cy-steinsyre er bevægeligheden ved papirkromatografi: ved pH 6,5: 1,21; ved pH 1,8;: 0,54.

15

Eksempel 11 a) Karbobenzyloxy-γ- (ct-benzyl) -L-glutamylkolaminf osf at 1,083 g (2,2 mmol) karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-(a-ben- 20 zyl)-y-p-nitrofenylester opløses i 6 ml af en tilberedt blanding af pyridin og vand i forholdet 2:1. Til opløsningen sættes først 282 mg (2 mmol) kolaminfosfat (USA-patentskrift nr. 2.730.542) og derpå 0,87 ml (6,2 mmol) triætylamin. Reaktionsblandingen henstår ved stuetemperatur i 72 timer og inddampes derpå under vakuum. Den 25 videre oparbejdning foregår på den måde der er beskrevet i forbindelse med karbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylhomotaurin (eksempel 8a). Der vindes 1,25 g karbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl-kolaminfosfatj.

b) T-L-Glutamylkolaminfosfat

Den samlede mængde af det i eksempel 11a) vundne produkt (1,25 g) hydrogeneres katalytisk for at fjerne beskyttelsesgrupperne. Hydrogeneringen såvel som rensningen ved ionbytning foretages på den måde der er beskrevet i eksempel 12b i forbindelse med fremstillingen af γ-L-glutamylhomotaurin. Der vindes 470 mg y-L-glutamylkolaminfosfat hvilket svarer til et udbytte på 91%. Det fremgår dog af papirelektroforese at produktet indeholder en foru-

DK 155433 B

15 rening på ca. 15-20% kolaminfosfat. Som rensningsmetode kommer bl.a. elektroforese på tale.

Ved papirelektroforese vandrer forbindelsen såvel ved pH 6,5 som ved pH 1,8 i retning af katoden. Bevægeligheden i forhold til cysteinsyre er: pH 6,5: 0,75; pH 1,8: 0,36.

5 Rp (n-Butanol/pyridin/iseddilce/vand 15:10:3:12) = 0,18.

Eksempel 12 a) Karbobenzyloxy-β-(a-benzyl)-L-aspartyltaurin 526 mg (1,1 mmol) lcarbobenzyloxy-L-asparaginsyre-(a-ben-zyl)-p-p-nitrofenylester (Chem.Ber. 97, 1789, 1964) opløses i 5 ml pyridin. Opløsningen afkøles til 0°C hvorpå der i små portioner tilsættes en opløsning af 125 mg (l mmol) taurin i 2 ml vand efterfulgt af 0,28 ml (2 mmol) triætylamin. Reaktionsblandingen hen-15 står ved stuetemperatur i 48 timer og inddampes derpå under vakuum. Remanensen opløses i 5 ml vand og til den i begyndelsen gule opløsning sættes en N saltsyre indtil opløsningen er affarvet. Til fjernelse af ρ-nitrofenol udrystes opløsningen ti gange med 5 ml æter hver gang. Den vandige fase inddampes under vakuum. Der vindes 20 478 g karbobenzyloxy-β-(a-benzyl)-L-aspartyltaurin.

b) β-L-Aspartyltaur in

Den samlede mængde af det i eksempel 12a) vundne produkt opløses i 6 ml 50%s vandig ætanol. Til opløsningen sættes 100 mg 10%s palladium-aktivt kul hvorpå der hydrogeneres under indføring 25 af hydrogengas i fire timer. Efter filtrering og inddampning under vakuum fjernes triætylaminen fra produktet ved ionbytning på den måde der allerede er beskrevet i forbindelse med fremstillingen af γ-L-glutamylhomotaurin i eksempel 8 b). Der vindes 172 mg β-L-30 aspartyltaurin hvilket svarer til et udbytte på 91%. Produktet er forurenet med lille mængde taurin som bl.a. kan fjernes ved elektroforese.

Ved papirelelctroforese vandrer forbindelsen både ved pH 6,5 og ved pH 1,8 mod katoden. Bevægeligheden i forhold til cy~ 35 steinsyre: pH 6,5: 0,77; pH 1,8: 0,58.

Rp (n-Butanol/pyridin/iseddilce/vand 15:10:3:12) = 0,16.

Eksempel 13

DK 155433 B

16 a) Karbobenzyloxy-β-(a-benzyl)-L-aspartylhomotaurin 526 mg (1,1 mmol) karbobenzyloxy-L-asparaginsyre-(a-ben-zyl)-p-nitrofenylester og 139 g (l mmol) homotaurin omsættes på den 5 i eksempel 12 a) beskrevne måde. Der vindes karbobenzyloxy-β-(a-benzyl)-L-aspartylhomotaurin.

b) β-L-Aspartylhomotaurin

Det ifølge eksempel 13a) vundne produkt hydrogeneres ka-10 talytisk på den i eksempel 8. b) beskrevne måde. Der vindes 203 mg (84/0 β-L-aspartylhomotaurin.

Ved papirelektroforese vandrer forbindelsen både ved pH

6,5 og ved pH 1,8 i retning af katoden. Bevægeligheden i forhold til cysteinsyre er: pH 6,5: 0,72; pH 1,8: 0,53.

15 R^ (n-Butanol/pyridin/iseddike/vand 15:10:3:12) = 0,17.

Eksempel 14 a) Karbobenzyloxy-β-(o-benzyl)-L-aspartylkolaminfosfat 2 Karbobenzyloxy-L-asparaginsyre-(α-benzyl)-β-ρ-ηΐtrofenyl- ester og kolaminfosfat omsættes med hinanden på den i eksempel Ha) beskrevne måde. Der vindes karbobenzyloxy-β-(α-benzyl)-L-aspartyl-kolaminfosfat.

b) β -L-Asparty lkolaminf osf at 25 —;—-

Det ifølge eksempel 14 a) vundne stof hydrogeneres katalytisk på den i eksempel 8b) beskrevne måde. Der vindes β-L-aspartyl-kolaminfosfat.

Ved papirelektroforese vandrer forbindelsen både ved pH 3Q 6,5 og ved pH 1,8 i retning af katoden. Bevægeligheden i forhold til cysteinsyre: pH 6,5: 0,81; pH 1,8: 0,40.

Rp (n-Butanol/pyridin/iseddike/vand 15:10:3:12) = 0,14.

35

Eksempel 15

DK 155433 B

17 T-L-Glutamylkolaminfosfat På den til fremstilling af glutaminsyre-y-amider egnede måde (Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 64, 285, 1970) fremstilles lcarbc 5 benzyloxy-y-(a:-benzyl)-L-glutamyllcolamin. 4,14 g af dette produkt (10 mmol) opløses i 50 ml absolut pyridin og der tilsættes 9 g (33 mmol) difenylfosforsyrelclorid. Realctionsblandingen holdes i tolv timer ved 0°C og fortyndes derefter med 80 ml kloroform. Det udskilte produkt frafiltreres, vaskes med saltsyre og derpå med 10 vand og tørres til sidst i ekssiklcator over lcaliumhydroxyd. Det vundne karbobenzyloxy-γ-(a-benzyl)-L-glutamylkolaminfosfat opløse: i 15 ml iseddikesyre der indeholder 3,3 mol/1 brombrinte og opløsningen henstår i 15 minutter hvorefter den inddampes under vakuum ved 25°C. Remanensen opløses i 30 ml IN natriumhydroxyd og opløs-15 ningen henstår ved stuetemperatur i en time. Derpå indstilles pH= værdien på 4 med eddikesyre og til fjernelse af fenol og benzyl-alkohol ekstraheres opløsningen tre gange med 30 ml æter hver gang. Den vandige fase overføres til en kolonne med "Dowex" 50 på H+-form og elueres med vand. Eluatet inddampes under vakuum 20 og remanensen omkrystalliseres fra en blanding af acetone og vand i forholdet 2:1. Der vindes 0,8 g γ-L-glutamylkolaminfosfat„ t 25 30 35

DK 155433 B

18

Biologisk forsøgsrapport A.

Undersøgelse af γ-L-glutamyltaurin som i nærværende rapport betegnes litoralon.

5 I de efterfølgende tabeller 1-6 er forsøgsresultaterne vist som middelværdier + standardafvigelse med antallet af bestemmelser i parantes. Bestemmelse af om der er signifikant forskel mellem kontrolforsøg og forsøg med behandlede dyr blev foretaget med Students t-test.

10

Tabel 1

Litoralons virkning på vitamin A-koncentrationen i serum.

Gruppe litoralon vitamin A-koncentration i serum 15 _yg/dag_ I. Kontrol - 28,3 + 0,7 (20) II. 0,1 41,9 + 1,0X (20) III. 0,3 32,9 + 1,1XX (20) IV. 1,0 27,4 + 0,6 (20) 20 - x P K 0,001 xx P < 0,01 20 Sprague Dawley rotter (10 hanner og 10 hunner) vejende 25 180-200 g behandledes oralt med de i tabel 1 angivne daglige do ser litoralon i form af en vandig opløsning i en periode på 8 dage. På den 9. forsøgsdag aflivedes dyrene ved dekapitering og blodet opsamledes. Vitamin A-koncentrationen i serumet bestemtes ved Neeld og Pearsons metode.

30 35 19

DK 155433 B

Tabel 2

Virkningen af litoralon og vitamin A på granulomdannelse frem-kaldt af implanterede vatkugler_;_;__ 5 Gruppe Dosis Tør vægt af

Vitamin Ax litoralon granulom lokal lokal oral g mg μ g yg/dag I. Kontrol - - - 52+1,0(24} 1q II.Kontrol +

Opløsningsmiddel - - - 54+3,1 (8) III. 2 - 64 + 2,5 (8) IV. 2 0,1 - 65 + 2,7 (8) V. - 0,1 73 + 2,9 (8) 15 vi. 2 - 0,1 90 + 4,1 (8) x Hoffmann La Roche

Forskellen er signifikant: mellem gruppe II og III ved 20 P < 0,05, mellem II og V ved P < 0,001, og mellem V og VI ved P < 0,01. Granulomdannelsen bestemtes ifølge Lee et al med Sprague-Dawley hanrotter vejende 110-120 g. Tamponerne fjernedes fra de dorsolaterale subkutane implantationer efter 10 dage og vejedes efter tørring til konstant vægt ved 65°C.

25 30 35

DK 155433 B

20

N ---s '-' I

CM 04 CM Ml I

Η Η Η Ό Ό Φ « g — ^ — φ H +> ri! Λ

g O β W

CM I" 00 Λ >1 U Pj

VOM «3· ^ to fi 03'— O' O

(li o o co o cn o φ Φ O

Cj v * * ^ ** * H rC tn 4-1 tn

i—[ O O O O O M 3- Hi 4J O

+ | +| +1 "Θ. “(0 IH <U

m a μ η β ri!

T3 O 11 CQ

β Η o Μ Λ U

0) CO) 00 (D Μ + Η β ·* co co r- o f^· σν β O +)βΗ ri! rio ri' CM rH .-Η φ Ό Ϊ3 Η ·Η (ti

CO - *. - >· - *· tn ft O

U cm o ho.cmo ·©· Φ «3 Μ ω t; « +i +i +i » d ® ’S m ω iH (ti β to CQ o M tn 0 ή ·Η pH O g ^ > Μ o to to vo Η ΟΊ ·+>ο*·Όβ

pj *3· CM CM in (Η Η· H (Ji H ft Η H

00 O VD O 00 O OtH 0 tn ρη p i ^ * * *> v ^ !—i tn 1 v -β (ti

OO oo oo o Cn o (ti β CQ

+ 1+1+1 « ug m

v *ϋ »· Λ <U

m tn

Ai tn ri! β m rH

o ω β ·& . Γ" CM VO »β +1 D Φ Ή

Cl) CM H1 M VO O M 0) Tti β -P -H

g rti in o mo in ο > 0 · M tn to U ' - > ' *· £ 0 II I ft •Η HO HO HO Φ U Ό > u + 1 +1 +1 £ J> g« J· β β *. β φ γ-h S___(ti 0) E W Ό ·Η

+j---.¾ Μ Φ S «(ti A

β Ή >ί β > ·Η rH VH Q Ο · Μ Μ CM -Η Φ β Ρη rH CM VD CM m CM β · ti in φ ro nj Aimocmomo in in £ ti Ό j 4j y ^ * ^ ·* >» *· ·Η tn 'φ Pi —ir; OOOOOO (β Ο H +1 φ φ +1 +1 +1 , in W o Id Φ n g SH r-H vo tn

m -Η Φ I *> + rH

S u Ο +> Η β "©. ·

^ m H Vf Id (I in H

n, Η Η H dP 0 -H (ti * P·» H (tj 00 0 φ ri! cm ι-i vo om -P E σν Μ β + to σι ο r-~ ο σ> ο & in 3 ft Φ Φ iw tao v ·. ·. ·. «»V o ffi Ή >ti Ό nj oooooo > i Gi E Ο g J +1 +1 +1 h w rH 0 + β r* Η E Η ti tl Φ « Φ ο φ Ph Φ , E é

tn φ tn + Λ + -P

β Ο ft φ Η β Φ ^ +>,

•H rH CM Ί* ft Η β Φ > Φ H

H 3 P' CM MM Μ Η β Ο PH > O

v Ai ^ Μ Ό H tn •r-i κβ vo o in o vo o tn Φ Ph β β tn ·

> +1 +1 +1 > p Φ (ΰ Φ U

β φ p ft Ί3 P g <P

^ ΗΦΟΦΦΦΦ o ns η +> β ε +> , Ο, Μ* VO VO (Μ Ο Φ -Ρ *Η tfl 4-) * CM -CM *· Μ Ε ο Ε ·~* Ρη φ Φ tn β ·μ< >. cm - η1 ·· Η ti Eh U Λ > β ο Η Ο rH Ο rH Ο φ d I Η w Φ •Η +| +| +| β (ti cG j (ti Ρ ______ φ λ ^ ^ ϋ ϋ Μ h + Η Η ιη U tn tn Η >ι S β Φ · ® .η ε s φφ.ριο + +ιλ 5 ο tn ,¾ η < η ο μ ? Ο Ηβ.ω^ΡΡ(ΰίΗβε 01 «Η ιΗ p (ti Ρ ft Ρ Ο d ο ZMOQtnooXJtn ° i ft ri! o φ Ή -d +» « rt Φ β S 3 3 o h S ti Φ U Q. OCQ * 0» rH 0 « +}

O ft fti · Eh (tiAl^lOE

+> a · HH Htntn+ιΦ

_1 t · . I I I_I . Γ*1. aaJ »*! VW jJ

21

DK 155433 B

tn W

(0 CD

νο vo ο Ό -tø

>—· ^ *-» S

. (D

o 4-> tn XX w 5Jj tø XX „.g σι η H ro in C ·Ρ Λ ςΓ Η ΓΟ Η LO Η cd tn • ho no ro o 'drog riOOOOOO (βω Ή +ι +ι +i ,n e g

D-l 0) H

tji H

<D <D -H

G h m tn XX M · ns XX CD Ό · «

h vd σι m cm in m -tø (D tø G

(NO OH ^ H nJEtUQ) • ho η ο η o -tø ω >

O vxhh**. H tø O CD

(NOOOOOO G CD TJ tø + 1 +1+1 “ £ m «

φ *H (D

tø G O' w

(β -H <D

tn X H G

tn 0 G Ο* <D

«β XX 2 JS b

Ter-HCNOHin H G Ό

HH 00 O OH O 'O

• HO HO (NO * Ο) Φ _

η -.- - — -- ο Ό G fiJ

fOHOOOOOO 0)> M

0 +1 +1 +1 v ^ ^ H > tn o CU te G -tø

>b rd (D

tn Ό G tn \ J| Ή 'f Λ O' > M £ δ tn β(β η Ό

--'(ΰ'Μ'ΐηΗ^ΗΐΟ (D&iQSG

ΤβΗΗΐηΟΓ-Ο + rn A .,

C HO HO HO G tø id M

^ ^ · -- -- -- IS 0) 4 CD

-Hr-oooooo -X -tø > h u +1 +1 +1 Tl & ’H u

n\ H .|4 M-t M

Λ 3 Η -H JH ® ft ω CD -H G -ο Ό ·ϋ ^ > 01 5 3 -Η Η

3 tø CD A

S t n X G -tø

G re o cn ^ cm o vo G CD fH H

•r{ O O lA rl t*-· Ο φ CD fø K

Π Ο O HO Η Ο Ό· H

ar| · «i * η h tJl CD O

H IDOOOOOO Φ M a _ h +1 +1+1 Ό o tø « » . * $ b “ h h tn Tf m O Td 3

irt GOG

0 fl) <D - -Η N

^ c H Td O tø n *H m ro in vo nr«· ho fc* id +j oo cn ο oo o o (d v CD Λ

Old HO Ο O HO ^ M G

n. , - v - - -- ο ο H Cu Λ fd

ooooooo _ _ O

tn + | +| +| v v CD rø G

S’ Tl G CD 0 CD

H ft G tø > H tn

3 CD Cd H

jj ···· +-> (D M ©.

tj G ω ω id tø o *w

η c 0 , S S +i S -H -H

►> 0 H i(d (d H .03 Ή

P H Jd I JSC* ,44 3 DX iHl G

0J H i(d tø O' HH tø Η CD

c o o O- ! «Η «Μ CD 'CM * Ό

O tø O O' +3 HH ft Ή & O

Η 1» -tø HO G G G ^4 -tø

(d cd G ή GH tn tn tn dJ

tø (¾ O Gi & ;tø ‘3 7 s o ft x; · ω co ω i 4j g · h , m -g nd »HH X tø - <y

Tabel 5

DK 155433 B

22

Litoralons virkning på Rana dalmatina's metamorfose

Gruppe Kropslængde Halelængde _ mm_mm_ 5 Kontrol 45,9 + 0,2 31,4 + 0,2 (60)

Behandlede dyr 40,2 + 0,2X 26,7 + 0,2X (60) x Signifikans: P < 0,001 1 q Forsøget udførtes med larver af Rana dalmatia med en alder på 30 dage, en kropslængde på 20-25 mm, og med allerede synlige fremspirende bagben. I løbet af en periode på 30 dage blev forsøgsdyrene anbragt i postevand indeholdende 0,5 yg/ml litoraion i to timer hver dag. Kontrolgruppen blev anbragt i 15 postevand uden tilsætning af litoraion. Haletudserne måltes på den 30. dag.

Tabel 6

Litoralons virkning på blodsukkerniveauet 20

Gruppe I. Undersøgelse II. Undersøgelse _mg %_mg %_

Kontrol 94 + 3,6 (10) 94 + 4,09 (10)

Behandlede dyr 82,4+3,8 (10) 81+1,32 (10) 25 Signifikans ved I. undersøgelse: P < 0,05 Signifikans ved II. undersøgelse: P < 0,01

Hvide CGY-hanrotter med legemsvægt 160-180 g anvendtes til forsøget. Dyrene holdtes på en standard diæt. Der blev taget blodprøver på den 5. forsøgsdag efter 18 timers faste. Blodsuk-30 kerbes teinmel serne udførtes efter metoden ifølge E. Hul tman. Litoralon blev indgivet oralt i daglige doser på 1 yg/kg.

35

DK 155433 B

23

Biologisk forsøgsrapport B.

Undersøgelse af syntetisk γ-aspartyltaurin og derivater deraf.

5 1. β-aspartyl-N-metyltaurin a) Virkning på blodsukkerniveauet

Kontrol 107 mg %

Behandlede dyr 93 mg %

Signifikans: P < 0f05

Til prøverne anvendtes 20-20 rotter. Målingerne gennemførtes efter 18 timers faste. Den anvendte dosis var 1 yg/kg legemsvægt i 4 dage i form af en opløsning ved oral indgift.

b) Virkning til forøgelse af vitamin A-niveauet i serum 15 Oral dosis Fremkaldt vitamin A yg% yg/200 g legemsvægt 0 (kontrol) 8,5 5 11,0 1 11,5 20 0^3 12,5 0,1 16,1 0,05 14,8 0,01 12,5 0,005 10,5 25 Signifikans: P < 0,01

Til forsøgene anvendtes 20-20 Wistar hanrotter med legemsvægt 200-220 g.

Forsøgsperiode: 6 dage.

30 c) Virkning på blodets siliciumniveau:

Silicium (mg/g blod) _ 0 timer_2® dage_40 dage

Kontrolgruppe H0,0©4 0,120+0,©lø 0,154+0,015

Behandlingsgruppe 35 15 yg/dag 0,100+0,005 0,315+0,014** 0,345+0,015

Behandlingsgruppe vy II 10 yg/dag 0,107+0,009 0,370+0,119** 0,360+0,017**

DK 155433 B

24

Resultaterne er signifikante fra den 13. dag ved signifikansniveauet P < 0/01 og fra den 20. dag ved niveauet P < 0,001. Forsøgene udførtes på indavlede hankaniner med legemsvægt 2,5-3 kg. Den aktive bestanddel blev indgivet oralt i de i tabellen viste 5 daglige doser. Bestemmelsen af silicium udførtes ifølge Gaubatz's metode (Gaubatz E.f Klin. Wschrft. 14, 1753, 1935) i 5 ml blodprøver, som blev taget fra dyrenes ørevene.

d) Virkningen af β-aspartyl-N-metyl-taurin og vitamin A på den .jq granulomfremkaldende virkning forårsaget af implantation af vat;

Gruppe Dosis Vægt af tør-

Vitamin Ax (3-aspartyl-N- rf 9ranulom metyltaurin lokal lokal oral mg jig jig/dag ^ Kontrol I. - - - 54+1,7

Kontrol II. + opløsningsmiddel - - - 55+3,4

Behandlingsgruppe III. 2 - - 66+12,5

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 67+2,6 20 Behandlingsgruppe V. - - 0,1 79 + 2,8

Behandlingsgruppe VI. 2 - 0,1 96+4,4 x Hoffmann la Roche

Forskellene er signifikante som følger: 25 Mellem gruppe II og III P < 0,05, mellem gruppe II og V P < 0,001 og mellem gruppe V og VI P < 0,01.

Bestemmelsen af granulom udførtes på Sprague-Dawley hanrotter med legemsvægt 110-120 g ved metoden ifølge Lee et al (Lee K.H., Fu Ch.Ch., Spencer M.R. Tong T.G. og Poon R.J., Pharm.

3Q Sci., 62, 895, 1973). De dorsolateralt subkutant implanterede tamponer fjernedes efter 10 dage og måltes efter tørring ved 65°C til konstant vægt.

2. β-Asparfeyl-homotaurin.

25 a) Virkning på blodsukkerniveauet

Kontrolgruppe 105 mg%

Behandlet gruppe 94 mg%

Signifikans, antal forsøgsdyr og forsøgsmetode var som angivet

DK 155433 B

25 b) Forøgende virkning på vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Fremkaldt vitamin A

yg/200 g legemsvægt yg% 0 (kontrol) 8,6 5 5 12,0 1 13,5 0,3 14,0 0,1 15,8 0,05 15,0 10 0,01 12,0 _0,005_10,0_

Signifikans, antal forsøgsdyr og forsøgsmetode var som angivet ovenfor under pkt. Ib).

1 5 c) Virkning på blodets siliciumniveau;

Silicium (mg/g blod) _0 timer_20 dage_40 dage

Kontrolgruppe 0,104+0,009 0,134+0,015 0,157+0,020 on Behandlingsgruppe I. 5yg/dag 0,094+0,007 0,309+0,014 0,340+0,014 '

Behandlingsgruppe II. 10 yg/dag 0,109+0,010 0,372+0,120 0,363+0,0185^

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode som angivet ovenfor under pkt. 1 c).

25 d) Virkningen af β-aspartyl-homotaurin og vitamin A på den granu= lomfremkaldende virkning af implantation af vat:____

Dosis Vægt af tørret 3Q Vitamin Ax β-aspartyl- granulom lokal homotaurin g mg lokal oral ______yg yg/dag_

Kontrolgruppe I - ~ - 52+1,5

Kontrolgruppe II - - - 53+3,2 35 + opløsningsmiddel

Behandlingsgruppe III. 2 - - 64+12,3

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 65+2,4

Behandlingsgruppe V. - - 0,1 77+2,6

DK 155433B

26 x Hoffmann la Roche

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode var som angivet ovenfor under punkt ld).

5 3. γ-Glutamyl-kolaminfosfat.

a) Virkning på blodsukkerniveauet

Kontrolgruppe 104 mg%

Behandlingsgruppe 93 mg%

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og dosering var som angivet ovenfor under punkt la).

b) Forøgende virkning på vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Vitamin A-virkning ^ yg/200 g legemsvægt yg% 0 (kontrol) 8,8 5 12,3 1 13,4 0,3 14,3 20 0/1 16,0 0,05 15,5 0,01 11,2 0,005_9j_2_

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmel-25 sesmetode var som angivet ovenfor under punkt 1 b).

c) Virkning på blodets siliciumniveau;

Silicium (mg/g blod) 0 timer 20 dage 40 dage 30 -2-2-

Kontrolgruppe 0,106+0,011 0,136+0,017 0,159+0,022

Behandlingsgruppe I 5 yg/dag 0,096+0,009 0,311+0,016 0,340+0,017

Behandlingsgruppe II 10 yg/dag 0,111+0,011 0,374+0,12lxx 0,365+0,019 55 Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmel sesmetode var som angivet ovenfor under punkt 1 c).

DK 155433 B

27 d) Virkningen af γ-glutamyl-kolaminfosfat og vitamin A på den granulomfremkaldende virkning af vatimplantation;_

Dosis Vægt af tørret granulom

Vitamin Ax γ-glutamyl- mg 5 lokal kolaminfosfat mg lokal oral _μ g ug/dag_

Kontrolgruppe I. - - - 49+1,2

Kontrolgruppe II. + opløsningsmiddel - - - 50+2,9 10 Behandlingsgruppe III. 2 - - 61+12,0

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 62+2,1

Behandlingsgruppe V. - - 0,1 74+2,3

Behandlingsgruppe VI. 2 - 0,1 91+3,9 x Hoffmann la Roche

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement samt bestemmelsesmetode var som angivet under 1 d) ovenfor.

20 25 30 35

Claims (4)

1. 5. I <|H2>n 1 CO-N-CH-(CH,).-B1 I l2 2 * R R 1. hvor er en gruppe med formlen -SO2OH eller -OPOfOH^/ R er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-4 kulstofatomer, 2 R er et hydrogenatom eller en karboxylgruppe, n er 1 eller 2 og 15 t er 1 eller 2, eller fysiologisk acceptable salte eller optisk aktive antipoder deraf, kendetegnet ved at 4 a) beskyttelsesgruppen R i en racemisk eller optisk aktiv forbindelse med den almene formel 20 4 R-NH-CH-COOH (f2>n HA CO-N—CH-(CH0) .-B1 I I 2 t
2. 25. R1 hvor 4 R er en alkoxykarbonylgruppe med 1-4 kulstofatomer i alkoxydelen, en aralkoxykarbonylgruppe med 7-9 kulstofatomer i aralkoxydelen, eller en fenoxykarbonylgruppe der eventuelt har en halogen-, alkoxy-eller nitrosubstituent i fenylringen, og Rr R , B , n og t har de ovenfor angivne betydninger, afspaltes ved acidolyse, hydrogenolyse, behandling med natrium eller behand-ling med fortyndet ammoniumhydroxyd, eller DK 155433 B b) en racemisk eller optisk aktiv forbindelse med den almene formel HoN-CH-C0A3
3. 5 I 5 (CHp). | 2 n IIB CO-N—CH — (CH0) '-B1 M2 2 * R R 10 hvor 3 A er en alkoxygruppe med 1-4 kulstofatomer, en aralkoxygrup-pe med 7-9 kulstofatomer, eller en gruppe med den almene formel -(NH-CH-CO) -Y
4. 1. I 5 Γ 15 rd 5 hvor R er et hydrogenatom, en alkylgruppe, en aralkyl- gruppe, en hydroxysubstitueret aralkylgruppe eller en hete-roaralkylgruppe, Y er en hydroxygruppe, en alkoxygruppe med 1-4 kulstofatomer 20 eller en aralkoxygruppe med 7-9 kulstofatomer, r er et helt tal fra 1-10, og 2 1 R, R , B , n og t har de ovenfor angivne betydninger, underkastes acidolyse, hydrogenolyse eller enzymatisk hydrolyse, eller 25 c) beskyttelsesgrupperne bundet til α-aminogruppen og a-karb-oxylgruppen i en racemisk eller optisk aktiv forbindelse med den almene formel R4-NH-CH-CO-A3 30 I (<j:H2)n IIC CO-N—CH-(CHJ . -B1 I \2 2t R R n j- 2 4 3 1 ό~> hvor R, R , R , A , B , n og t har de ovenfor angivne betydninger, eller i et salt deraf, fraspaltes samtidig ved acidolyse, alkalisk hydrolyse, hydrogenolyse eller behandling med I DK 155433 B natrium, hvorefter man om ønsket omdanner en ved en hvilken som helst af metoderne a)-c) vunden forbindelse til et fysiologisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et salt og/eller fremstiller en vundet forbindelse i en optisk 5 aktiv form ved opspaltning af et vundet racemisk produkt. 10 15 20 25 35