DK155520B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af aminosyrederivater eller fysiologisk acceptable salte deraf - Google Patents

Description

DK 155520 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmå-de til fremstilling af hidtil ukendte aminosyrederivater med værdifulde biologiske og farmaceutiske virkninger.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede amino-5 syrederivater har den almene formel R^-NH-CH-COA1

«rVn I

io co-n-(ch2) t“ so2oh

R

1 1 hvor A , R, R , n og t har de i krav 1's indledning angivne betydninger, eller er et fysiologisk acceptabelt salt deraf eller ^ en optisk aktiv isomer deraf.

Disse forbindelser har værdifulde biologiske eller farmakologiske virkninger. Alle de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er hidtil ukendte.

Blandt de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser 2o skal på grund af dens biologiske virkning navnlig fremhæves γ-L-glutamyltaurin, der svarer til formlen H-N-CH-COOH 2 !

ch9 XXIV

25 f2

C0-NH-CH2-CH2-S020H

og som har et bredt terapeutisk og præventivt virkningsspektrum over for sygelige forandringer der kan føres tilbage til beska-2o digelser af "AGAS" (det aerobiosfæriske genetiske adaptionssystem) .

Til belysning af begrebet "AGAS" opregnes i det følgende de vigtigste væv og organer der danner dette system. 1 a) Alle biologiske grænseflader der står i berøring med den ydre luft som biosfæren (hud og huddannelser, øjets hornhinde og Conjunktiva, mund- og svælghulrum, luftveje og lunge);

DK 155520B

2 b) skelet og led (rørknogler og svampeagtige knogler, kugleled, synoviale membraner, skeletmuskulatur); c) de til reguleringen af ionhusholdningen deltagende organer (transepiteliske transportsystem: tarmtrævler og nyreka- 5 nal); d) det til findeling af næringen nødvendige tekodonte (i tandaveolerne med rødder fastgjorte) tandsæt; e) høre-, lugte-o g stemmeor ganer.

De omhandlede forbindelser udøver således en gunstig bi-10 ologisk eller terapeutisk virkning på de her opregnede organer eller væv af AGAS-systemet.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser virker desuden på følgende funktioner der står i sammenhæng med AGAS-systemet: strålingsbeskyttelse, begunstigelse af 15 sårheling, almindelig aktiverende virkning på mesenkym, beskyttelse mod den stadigt voksende infektions- og tilsmudsningsfare hos hud og slimhinder (den fugtige slimhindes lysozymproduktion, aktivering af fimreepiteler i luftvejene osv.)/ forøget beskyttelse mod de af vira og svampe forårsagede infektioner.

20

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er virksomme mod de stadigt og i høj grad stigende stress-virkninger der er knyttet til livet på fastlandet (fx meteorologisk indflydelse, store forskelle mellem dag- og nattemperatur, forhøjet fare for kvæstelser), idet de stabiliserer adaptions-25 syndromet og samtidigt afværger glukokortikoidernes perifere vævsskader (som fx skader i bindevævet, kvæstelser af knoglematrix-bestanddele osv.). Udvikling af immunhomøostase (stigende erkendelsesevne hos legemet om hvilke celler der er kropsegne og hvilke der ikke er).

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser udøver deres virkning dels umiddelbart, dels over reguleringen af vitamin A metabolismen, ved produktion af vitamin A me-taboliter med stærkere polær karakter. Denne virkning kan sammenlignes med parathormonets virkning på 25-hydroxycholecalciferol-Ια-hydroxylase-enzymet i nyrekanalen. Virkningsretningerne af forbindelserne er følgende:

DK 155520 B

3 A) Virkninger med vitamin A-karakter: a) Farmakologiske og biokemiske virkninger: forøgende virkning på kondroitinsulfatsyntese; gunstig virkning på sårhelingen eller på den ved indgift af kortison eksperi- 5 mentelt forringede sårheling hos rotter og hunde; potentierende virkning på vitamin A's virkning hos rotter og høns ved eksperimentelt fremkaldte hypo- eller hypervitaminoser; dæmpende virkning på de ulcerations-betingede stress-virkninger hos rotter; begunstigende virkning på degranulationen af mastocyter; forøgende virkning på 10 produktionen af lysozym; virkning på sporstofhusholdningen (silicium, zink, kobber, mangan, fluor); fremmende virkning på epiteldannelsen; fremmende virkning på den alkaliske fosfataseaktivitet; virkningen på den ved lokal indvirkning af vitamin A fremkaldte granulomposedannelse (Granulomsackbildung); det yderst flade for-15 løb af dosis-virkningskurven eller ændringen af virkningens fortegn ved store doser; aktiverende virkning på Golgi-apparatet; begunstigende virkning på dannelsen af slim- eller bægerceller; forøgende virkning på koncentrationen af vitamin A.

20 b) Klinisk-terapeutiske virkninger: keratokonjunktivis sicca; Sjogrens syndrom; rhino-laryngo-pharingitis sicca; ozæna; kronisk bronchitis; sinobronchitis; mucoviscidose; konstitutionelle lungesygdomme hos småbørn; paradentose; hudens og slimhindernes smittetilbøjelighed for vira og svampe; kortison-antagonistisk 25 virkning; gunstig virkning på helingen ved operationssår og slimhindesår; erosio colli; pruritusagtige lidelser; nedsættelse af lugte- og smagssansen. 1 B) Virkninger uden vitamin A-karakter a) Farmakologiske og biokemiske virkninger: virkning på blodsukkerniveauet med hensyn til en forbigående sænkning; forøgende virkning på fosfaturi, sænkende virkning på fosfatniveauet 35 i serum; strålingsbeskyttende virkning; formindskende virkning på

DK 155520 B

4 den nødvendige tid der gå?med at nå målet ved labyrintforsøg hos inaktiverede dyr; formindskende virkning på eksperimentelt fremkaldte fluor- og kadmiumto xiko s er; forøgende virkning på den cykliske adenosinmonofosfat-udtømning af nyrerne; dæmpende virkning 5 på symptomerne ved eksperimentelt fremkaldt lathyrismus; formindskelse af histaminfølsomheden; forøgende virkning på aktiviteten af leverenzymet tyrosinaminotransferase.

b) Terapeutiske virkninger: svage bestrålingsskader; vitiligo; muskelhypotoni; psykoenergetiserende virkning; gunstig 10 virkning på involutionelle og gerontologiske tilstande samt på de mnestiske funktioner; keloide tilbøjeligheder; spondylosis ankylo-poetica; sygdomme hos bevægelsesorganerne på grund af slid; scle-rotisk fundus; amyloidose; morphæa; fibrocytisk mastopati.

I veterinærmedicinen har de ifølge opfindelsen fremstil-15 lede forbindelser lignende anvendelsesområder som i humanmedicinen, dvs. fx hudskader (afskalning), sårheling og knoglebrud.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del angivne.

Acyleret cystamin eller et derivat deraf substitueret 20 ved aminogruppen med et α-aminodikarbonsyrederivat kan således omsættes med hydrogenperoxyd eller med persyre hvorved disulfid-bindingen spaltes oxydativt og der opstår en forbindelse med den almene formel I.

Hvis den funktionelle gruppe i udgangsmaterialet er en 25 p-toluensulfonylgruppe (J. Chem. Soc. 824, 1964) vindes der ved substitutionen med alkalimetalsulfit eller alkalimetalhydrogen-sulfit forbindelser med den almene formel I. Hvis udgangsforbindelsen indeholder en sulfonsyreestergruppe vindes forbindelserne med den almene formel I ved skånsom partiel hydrolyse.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i det følgende ved hjælp af nogle eksempler.

35

DK 155520B

5

Eksempel 1 a) Fremstilling af udgangsmateriale 40,85 g (0,11 mol) lcarbobenzyloxy-L-glutaminsyre-a-ben-zylester (Liebigs Annalen 655, 200, 1962) opløses i 500 ml aceto-5 nitril. Opløsningen afkøledes til -15°C under udelukkelse af luftfugtigheden. Til opløsningen sættes dråbevis under omrøring først 15,4 ml (0,11 mol) triætylamin og derpå 15,4 ml (0,11 mol) klormy-resyreisobutylester. Realetionsblandingen omrøres ved -15°C i 40 minutter og derpå tilsættes 28 ml (0,2 mol) triætylamin efterfulgt 10 af 11,26 g (0,05 mol) cystamin-hydroklorid og til sidst 250 ml ace-tonitril. Blandingen efteromrøres ved -15°C i yderligere to timer og derpå i yderligere fire timer ved stuetemperatur.

. Efter reaktionstidens udløb inddampes blandingen ved 30°C under vakuum. Remanensen optages under omrøring og afkøling i 200 15 ml isvand og blandingen inddampes påny ved 35°C under vakuum. Remanensen indføres sammen med 250 ml vand og 500 ml ætylacetat i en skilletragt og den organiske fase skilles fra. Den organiske fase udrystes i. den nævnte rækkefølge først med 250 ml vand, derpå to gange med 250 ml 5%s natriumkarbonatopløsning hver gang og derpå 20 to gange med 250 ml IN saltsyre og til sidst med 250 ml vand. (Ud fra den ved udrystningen med natriumkarbonatopløsning vundne vandige fase kan der ved syrning med saltsyre og udrystning med æter genvindes ca. 5 g ikke omsat karbobenzyloxy-L-glutaminsyre-ct-ben-zylester). Ætylacetatfasen tørres over vandfrit natriumsulfat og 25 inddampes derpå under vakuum ved 30°C til tørhed."Der vindes en tyk, olieagtig remanens som hurtigt stivner til en krystallinsk masse. Denne rives med 250 ml absolut æter hvorpå krystallerne frafiltreres. Det rå produkt (40-42 g) omkrystalliseres fra en blanding af 100 ml ætylacetat og 170 ml æter. Der vindes 29,3 g 30 N,N'-bis-^N-karbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl7-cystamin med . smeltepunkt 9l-92°C.

Beregnet for C44H50N4010S2 (M = 859,05): C 61,52 H 5,89 N 6,52 S 7,46 fundet: C 60,85 H 5,91 N 6,61 S 7,72.%.

35

DK 155520B

6 b) Fremgangsmåden ifølge opfindelsen 25,77 g (0,3 mol) af det ifølge eksempel la) vundne N,N'-bis-/N-karbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl7-cystamin opløses i 75 ml iseddikesyre. Den i is afkølede opløsning sættes i løbet 5 af 15 minutter dråbevis til en frisk tilberedt blanding af 75 ml 30%s hydrogenperoxyd og 225 ml iseddikesyre. Efter tilsætningen fjernes kølingen og reaktionsblandingen omrøres i fire timer ved stuetemperatur. Derpå inddampes der under vakuum ved 30°C. Det olieagtige produkt tørres i en ekssikkator først over fosforpent-10 oxyd og derpå over fast kaliumhydroxyd. Der vindes 28,5 g karbo- benzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin.Den relative motilitét af dette produkt i forhold til cysteinsyre ved papirelektrofo-rese er 0,5 ved pH 6,5.

15 Eksempel 2 4,14 g (10 mmol) karbobenzyloxy-y-(oc-benzyl)-L-glutamyl-kolamin opløses i 40 ml pyridin og opløsningen afkøles til -10°C.

I små portioner tilsættes under intensiv omrøring 2,1 g (li mmol) 20 p-toluensulfonylklorid. Reaktionsblandingen omrøres ved 0°C i tre timer og ud'hældes derefter på 40 g smeltende is. Det udskilte bundfald frafiltreres, vaskes med vand og omkrystalliseres til sidst fra en blanding af ætanol og petroleumsæter. Produktet underkastes katalytisk hydrogenering med 10%s palladiumkulstof som katalysator. Det __ efter hydrogeneringen vundne og tørrede stof opløses i 30 ml vand, og der sættes 10,1 g (40 mmol) natriumsulfit-heptahydrat til opløsningen. Opløsningen omrøres ved 40°C i 24 timer og inddampes derefter under vakuum. Remanensen opløses med en lille mængde vand og bringes over på en kolonne med "Dowex" 50 hvorfra der elueres med 3Q vand. Eluatet inddampes under vakuum og remanensen tørres over kaliumhydroxyd. Efter omkrystallisation fra 80%s ætanol vindes 1,6 g y-L-glutamyltaurin med smp. 219-220°C.

35

DK 155520 B

7

Eksempel 3 a) Karbobenzoxy-L-glutaminsyre-a-benzyl-y-cysteamid (Udgangsforbindelse) I 5 ml absolut ætylacetat opløses 0,49 g (1 mmol) karbo-5 benzoxy-L-glutaminsyre-a-benzyl-y-p-nitrofenylester. Under afkøling i isvand tildryppes der 0,08 g (1 mmol) cysteamin i 1 ml dimetylformamid. Efter tilsætning af 0,14 ml (2 mmol) triætyl-amin holdes reaktionsblandingen i nogle timer på 0°C, hvorefter den henstår ved stuetemperatur i 2 dage. Reaktionsblandin-10 gen inddampes under vakuum og remanensen optages i 20 ml ætylacetat. Ætylacetatopløsningen vaskes tre gange med N saltsyre, to gange med vand og derpå med en 5%s natriumkarbonatopløsning flere gange indtil den gule farve forsvinder. Efter vask gentagne gange med vand tørres opløsningen over natriumsulfat og 15 inddampes under vakuum. Det tilbageværende råprodukt (0,35 g) optages med æter og tørres.

Beregnet for C22H27°5N2S (M = 431,5): C 61,3 H 6,3 S 7,4 Fundet: C 62,0 H 6,3 S 8,0%.

20 Infrarødt spektrum: NH: 3320, C=0 (COObenzyl): 1740, C=0 (Z) 1695, C=0 (amid-I): 1650, C=0 (amid-II): 1560 cm"1.

Tyndtlagskromatografi: i et system af n-butanol/eddikesyre/py-ridin/vand (30:60:20:24) efterlades en samlet klorpositiv plet.

25 b) Karbobenzyloxy-γ-(α-benzyl)-L-glutamyltaurin I 2 ml iseddike opløses 10 cg karbobenzoxy-L-glutamin-syre-a-benzyl-y-cysteamid og der tilsættes 0,5 ml 30%s hydro-genperoxyd. Reaktionsblandingen henstilles i 4 timer under af-30 køling med isvand. Der udtages prøver hver time fra reaktionsblandingen og reaktionens fremadskriden kontrolleres ved elek-troforese. Efter opløsning af reaktionsblandingen i vand frysetørres reaktionsblandingen.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede 35 forbindelsers biologiske virkning skal i det følgende belyses i to biologiske forsøgsrapporter, A og B. I disse forsøgsrapporter vises den biologiske virkning for forskellige typer af

DK 155520B

8 forbindelser med den almene formel I. De undersøgte forbindelser har alle ubeskyttede N-terminale og C-terminale grupper, 1 1 dvs. R er hydrogen og A er hydroxy. Forbindelser med den al-mene formel I, hvor R er forskellig fra hydrogen og/eller

-I

5 hvor A er forskellig fra hydroxy har den samme biologiske virkning som de tilsvarende ubeskyttede aminosyrederivater, idet man må forvente at beskyttelsesgrupperne fraspaltes i organismen.

10 15 20 25 1 35

DK 155520 B

9

Biologisk forsøgsrapport A.

Undersøgelse af γ-L-glutamyltaurin som i nærværende rapport betegnes litoralon.

5 I de efterfølgende tabeller 1-6 er forsøgsresultaterne vist soro middelværdier + standardafvigelse med antallet af bestemmelser i parantes. Bestemmelse af om der er signifikant forskel mellem kontrolforsøg og forsøg med behandlede dyr blev foretaget med Students t-test.

10

Tabel 1

Litoralons virkning på vitamin A-koncentrationen i serum.

Gruppe litoralon vitamin A-koncentration i serum 15 _yg/dag____ I. Kontrol - 28,3 + 0,7 (20) II. 0,1 41,9 + 1,0X (20) III. 0,3 32,9 + 1,1XX (20) IV. 1,0 27,4 + 0,6 (20) 20 x P <; 0,001 xx P < 0,01 20 Sprague Dawley rotter (10 hanner og 10 hunner) vejende 25 180-200 g behandledes oralt med de i tabel 1 angivne daglige do ser litoralon i form af en vandig opløsning i en periode på 8 dage. På den 9. forsøgsdag aflivedes dyrene ved dekapitering og blodet opsamledes. Vitamin A-koncentrationen i serumet bestemtes ved Neeld og Pearsons metode.

30 35

DK 155520B

10

Tabel 2

Virkningen af litoralon og vitamin A på granulomdannelse frem-kaldt af implanterede vatkugler_ 5 Gruppe Dosis Tør vægt af

Vitamin Ax litoralon granulom lokal lokal oral mg yg yg/dag I. Kontrol - - - 52 + 1,0 (24) 10 II.Kontrol +

Opløsningsmiddel - - - 54 + 3,1 (8) III. 2 - - 64+2,5 (8) IV. 2 0,1 - 65 + 2,7 (8) V. - 0,1 73 + 2,9 (8) 15 VI. 2 - 0,1 90 + 4,1 (8) x Hoffmann La Roche

Forskellen er signifikant: mellem gruppe II og III ved 20 P < 0,05, mellem II og V ved P < 0,001, og mellem V og VI ved P < 0,01. Granulomdannelsen bestemtes ifølge Lee et al med Sprague-Dawley hanrotter vejende 110-120 g. Tamponerne fjernedes fra de dorsolaterale subkutane implantationer efter 10 dage og vejedes efter tørring til konstant vægt ved 65°C.

25 1 35

DK 155520B

11

CN CM CN ΟΙ I I

H iH Η ΐ 0) ^ O

^ ^ QJ rH -P <C Λ

g O β W

Ο) Γ"' 00 ,β >Ί .U (¾

von ^ *3* ov'a1 to C tø '— (Τ' U

04 o o oo o σι o <U (D O

rj ^ - 4-1 ,β 4*1 (Τ'

P-l O O O O O M β. β 4-> O

+ 1 +1 +1 «void m<u Ύ iw O, n r-t β <tj ra - β φ co

β M O 01 Λ U

0) CO) 00 φ 01 + *H β ** 00 00 [— O t"~ <7\ β O 4-1 C Η <C iHO (M iHH φ Ό 2 *H -H td 01 »» ** ^ *» *» (Τ' fc O 1¾ O NO H O <N O $. o rt! M 01 4) u cn o r-1 oi H CQ Ό 0) * 1 H id β 01 rn O Μ θ’ O Η ·Η “ P4 O g * > * Q to to vo iH 0\ *4-10 *· Ό β

Qi rrCN CM LO rH Η* iH (Τ' Η Η ·Η 00 O VOO 00O O-H O O' m n, «. ·. ·. ·. «· ·> » H (Ji s Λ ro

oo 00 00 o Cn O <d β fQ

+ 1 +1+1 td O m + l v »d ·* X5 Φ m (τ' 04 &l idj Id Ή ri

Orø td Ό.

. f- cm vo Ό -U D <U *H

φ (n ^ n vø o η <ΰ Ό ρ 4J Ή g β mo no mo > 0 · η σ> m O...... £ O ω « o.

.p h o H o h o fl) U 'O > C, J.I +| +1 +10) tr> £, β β «· β <D Η £______ td Φ g Β Ό ·Η 7j ---- Μ Μ Φ S «β Λ % ·Η >, Λ > -Η

Η VH Q υ * H

m η ·<Η Φ β 1¾ ,Η t'» CM VO (Μ ΙΠ CM β * 2 !? «2

η β PM no cm ο η ο 01 Ε. ^ J

ij rj ^ ^ ·Η Ο^Ό (μ i c* Ο Ο Ο Ο Ο Ο (I) Ο *Η ΜΗ II +1 +1 +1 w 3 « S « g, «I · i ; ^ .

5, HH54<*>0-Hfd rr r-· η β oo o φ < NH VOOn „ £ § * n S m co σ> o t~-o σ» o (T> tr> β ft QJ Φ

uj HU ·. «. * *- - * 0814-1°¾ 'O

β o O O O O O > I p4 g O β j 4.1 +| +1 Η 01 iH O 4J β d M H g ·Η Ό 01 φ β

Φ η Φ U <ΰ g E

2, u φ tn +> Æ 4J 3

en β, φ -Η β φ *d 4J

Η ° Η CM ^ ft Η β φ > β

_i 2 r- n tn n in Η β o Μ ·Η > Q

V n, ^ « *. ·. ^ Η Ό -H &i Ή H voouiovn© ^ S S1 S 5 S ,ί > +1 +1 +i ^ ΗΦοαίβββ .β ιΗ 4J β g +* Q, VO tO NO Φ44·Η tO + -cm e o g - ft 2 2! rn ifl » N ' "· ΜβΕ^ΟΛρ G u HO HO rHO 0) β 1 H - 0) •H +1 +| + β β GI hI <d ^

P__1 _!_ φ ί ^ ^ fi (J M

S--+ Η -H 03 vj Orvtyi Η>ι2βΦ·0 H g g ΦΦΡηΟ-Ο-^Ό S G οεπ^Ή^ΉΟΟΙ ^ o ΗΡ.Μ5Μβ}Ηβ£

rn Η rH Μ β P Dj P O

c o ζηοαεποοΛΟ)

o u 2 S-fnlg-PE

4J 04 rfJO <D Ή d 41 M

β Φ β < w n 2 H n p fl

·, η. o ffl · CyiiHO'^-H

O Λ W βΛίΛ0g jj e · HH M 0) W M-t Φ

DK 155520 B

12

tji W

^ ^ — (d <l) vo vo «3 Ό +j ~ w w *1

O -P

Cn XX N » ta xx ^ m ^ ΌσιΗΗΓΟιη^ Ρ -Ρ Λ <j η η Η lo ή QJ Cn

• Hocoomo 'OWE

o ----- K pP

O O O O O O Id W ·Ρ +i +i +i ϋ i -π

Dl rH

φ Q) -H

ρ η ω rt XX Φ ΐ * <u T) yo σ\ com ion -P O P £ C\J O O i—I VD H idSOfl) • r-1 O M O CO O ^ > q ^ ^ k >k ^ w Η P O 01

CM O O O O O O P ω P

+ 1 +1 + WPS.

Tl o) -H O)

P P Cn w (d -H (D

O' X Η P

tn 0 P O' W

ni XX _, !S iS b £— —i CM VD rH m ΉΛΌ ϊ*1 HH 00 O O rH O Ό • HO HO MO -00 Λ(Τ) - - -- -- ° ^ g $

HH OO OO OO <D>P

O +1 +1 +1 v t t "

o cu id Ρ -P

M T) O O

tn Td Ρ O' \ ω ·η τ id c tn > e(d h ij •—<d '»in H'tf hvo O) ft 5! 3 t3 hh in o r- o -P Λ .,

g hohoho pwrdP

^ cd <D -P 0) •H In OO OO oo Λ +> > Η o +1 +1 +1 id -a p ni ι-i .-j m » η Λ 3 H Tj £ ® £ fd O -H g, ^ ^ $

^ > W ·? 3 .Η H

C w 0) Λ

g D1 X P -P

h (docn^fMOO *· Si. rj 'd

Η h (Ti o in H r- o (UD^jdE

o ΟΟΗΟΗΟ . ·®· P _

e|_J · k K ». S *. »I D^WO tO

—i lO O O O O O O rø P t _ H +1 +1+1 « o u g " . h g ΰ

U) Μ · -H

11 h rt t? d

% OOP

H POP

O 0) ® - Ή M

Η I Η H O -P

η h cnm tn cd nr- ho ►> O

+) o o σ> o o o o o (d v d) Λ o id HOOOHO * ^ ^ Λ Ti 3

0, . - .. ^ - - - o o m (¾ Λ P

ooooooo __ _ O

5? -M TI TI p G) 0 O

•H fL| Ph P > H D»

g 0) (d H

tt .. ·. 4-> O) P S

u P 01 W Id -Ρ O- «Η

Η PO PP+IP-P-H

s o ή id id h (d -H

? Hid ^rXP^PlP

to Η (d p tn Ή -H W -H 0) C O P OP. Ή Ή 0) Ή 1 d o P 0 θ' -Ρ ·Ρ 'P P5 ·Ρ S' η Η -Ρ -Ρ^-ΡΟ ΡΡ g* -ft (d (!) ρ ·Ρ pp 5 J ϊοτ,ΰ

1. n. 0 PI IP -Ρ Ή Η Μ E

O £ & · W W W I

ΰ a · H in Ό •Hp .HH X p - « n rn t_i t_i l-ι ω Μ ί> ' · V-. -

Tabel 5

DK 155520B

13

Litoralons virkning på Rana dalmatina's metamorfose

Gruppe Kropslængde Halelængde mm_ran_ ^ Kontrol 45,9 + 0,2 31,4 + 0,2 (60)

Behandlede dyr 40,2 + 0,2X 26,7 + 0,2X (60) x Signifikans: P < 0,001

Forsøget udførtes med larver af Rana dalmatia med en 10 alder på 30 dage, en kropslængde på 20-25 mm, og med allerede synlige fremspirende bagben. I løbet af en periode på 30 dage blev forsøgsdyrene anbragt i postevand indeholdende 0,5 yg/ml litoralon i to timer hver dag. Kontrolgruppen blev anbragt i postevand uden tilsætning af litoralon. Haletudserne måltes på...

15 den 30. dag.

Tabel 6

Litoralons virkning på blodsukkerniveauet 2g Gruppe I. Undersøgelse II. Undersøgelse _mg %_mg %_

Kontrol 94 + 3,6 (10) 94 + 4,09 (10)

Behandlede dyr 82,4 + 3,8 (10) 81 + 1,32 (10)

Signifikans ved I. undersøgelse: P < 0,05 25 Signifikans ved II. undersøgelse: P < 0,01

Hvide CGY-hanrotter med legemsvægt 160-180 g anvendtes til forsøget. Dyrene holdtes på en standard diæt. Der blev taget blodprøver på den 5. forsøgsdag efter 18 timers faste. Blodsukkerbestemmelserne udførtes efter metoden ifølge E. Hultman. Litoralon blev indgivet oralt i daglige doser på 1 yg/kg.

35 14

DK 15S520B

Biologisk forsøgsrapport B.

Undersøgelse af syntetisk γ-aspartyltaurin og derivater deraf.

1. β-aspartyl-N-metyltaurin 5 a) Virkning på blodsukkerniveauet Kontrol 107 mg %

Behandlede dyr 93 mg %

Signifikans: P < 0,05

Til prøverne anvendtes 20-20 rotter. Målingerne gennem-10 førtes efter 18 timers faste. Den anvendte dosis var 1 yg/kg legemsvægt i 4 dage i form af en opløsning ved oral indgift.

b) Virkning til forøgelse af vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Fremkaldt vitamin A yg% 15 yg/200 g legemsvægt 0 (kontrol) 8,5 5 11,0 1 11,5 0,3 12,5 20 0,1 16,1 0,05 14,8 0,01 12,5 0,005 10,5

Signifikans: P < 0,01

Til forsøgene anvendtes 20-20 Wistar hanrotter med legemsvægt 200-220 g.

Forsøgsperiode: 6 dage.

c) Virkning på blodets'siliciumniveau:

Silicium (mg/g blod) __0 timer_20 dage_40 dage_

Kontrolgruppe 0,110+0,004 0,120+0,010 0,154+0,015

Behandlingsgruppe

15 yg/dag 0,100+0,005 0,315+0,014XX 0,345+0,015XX

35 “

Behandlingsgruppe

II 10 yg/dag 0,107+0,009 0,370+0,119XX 0,360+0,017XX

xx Signifikans: P < 0,001

DK 155520B

15

Resultaterne er signifikante fra den 13. dag ved signifikansniveauet P < 0,01 og fra den 20. dag ved niveauet P < 0,001. Forsøgene udførtes på indavlede hankaniner med legemsvægt 2,5-3 kg. Den aktive bestanddel blev indgivet oralt i de i tabellen viste 5 daglige doser. Bestemmelsen af silicium udførtes ifølge Gaubatz's metode (Gaubatz E., Klin. Wschrft. 14, 1753, 1935) i 5 ml blodprøver, som blev taget fra dyrenes ørevene.

d) Virkningen af β-aspartyl-N-metyl-taurin og vitamin A på den 10 granulomfremkaldende virkning forårsaget af implantation af vat:

Gruppe Dosis Vægt af tør-

Vitamin Ax B-aspartyl-N- ret 9railulom metyltaurin lokal lokal oral mg Ug ug/dag 15 —----------------

Kontrol I. - - 54+1,7

Kontrol II. + opløsningsmiddel - - - 55+3,4

Behandlingsgruppe III. 2 - - 66+12,5

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 67+2,6 20 ~

Behandlingsgruppe V. - - 0,1 79+2,8

Behandlingsgruppe VI. 2 - 0,1 96+4,4 x Hoffmann la Roche

Forskellene er signifikante som følger: 25 Mellem gruppe II og III P < 0,05, mellem gruppe II og V P < 0,001 og mellem gruppe V og VI P < 0,01.

Bestemmelsen af granulom udførtes på Sprague-Dawley hanrotter med legemsvægt 110-120 g ved metoden ifølge Lee et al (Lee K.H., Fu Cb.Ch., Spencer M.R. Tong T.G. og Poon R.J., Pharm.

30 Sci., 62, 895, 1973). De dorsolateralt subkutant implanterede tamponer fjernedes efter 10 dage og måltes efter tørring ved 65°C til konstant vægt. 1 β-Aspar tyl-homotaurin; 35 a) Virkning på blodsukkerniveauet

Kontrolgruppe 105 mg%

Behandlet gruppe 94 mg%

Signifikans, antal forsøgsdyr og forsøgsmetode var som angivet

DK 155520B

16 b) Forøgende virkning på vitamin A-niveauet i serum

Oral dosis Fremkaldt vitamin A

yg/200 g legemsvægt _yg%_ 0 (kontrol) 8,6 5 5 12,0 1 13,5 0,3 14,0 0,1 15,8 0,05 15,0 10 0,01 12,0 _0,005_10,0_

Signifikans, antal forsøgsdyr og forsøgsmetode var som angivet ovenfor under pkt. Ib).

15 c) Virkning på blodets siliciumniveau;

Silicium (mg/g blod) _0 timer_20 dage_40 dage_

Kontrolgruppe 0,104+0,009 0,134+0,015 0,157+0,020 20 Behandlingsgruppe

I. Spg/dag 0,094+0,007 0,309+0,014xx 0,340+0,014XX

Behandlingsgruppe

II. 10 ug/dag 0,109+0,010 0,372+0,120 0,363+0,018XX

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmel-25 sesmetode som angivet ovenfor under pkt. 1 c).

d) Virkningen af β-aspartyl-homotaurin og vitamin A på den granu- lomfremkaldende virkning af implantation af vat:_

Dosis Vægt af tørret 30 Vitamin Ax β-aspartyl- Jfanulom lokal homotaurin ^ mg lokal oral _μg yg/dag_

Kontrolgruppe I - - - 52+1,5

Kontrolgruppe II - - - 53+3,2 35 + opløsningsmiddel

Behandlingsgruppe III. 2 - - 64+12,3

Behandlingsgruppe IV. 2 0,1 - 65+2,4

Behandlingsgruppe V. - - 0,1 77+2,6

Rphandlinasarnnnp VT_ 2 — Π.1

DK 155520B

17 x Hoffmann la Roche

Signifikans, antal forsøgsdyr, arrangement og bestemmelsesmetode var som angivet ovenfor under punkt ld).

5 10 15 20 25 30 35

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et amino- syrederivat med den almene formel

5 R1-NH-CH-COA1 "fVn 1 CO-N-(CH„),-SO-OH I Å t 2 R hvor i 10. er hydroxy, C^_4alkoxy eller fenyl-C^^alkoxy, R er hydrogen eller C^_4alkyl, R^ er hydrogen, _4alkoxykarbonyl eller fenyl-C^_3al~ koxykarbonyl, n er 1 eller 2, og 15 t er 2 eller 3, eller et fysiologisk acceptabelt salt deraf eller en optisk aktiv isomer deraf, kendetegnet ved at a) en optisk aktiv eller racemisk forbindelse med den 2 0 almene formel R1-NH-CH-COA1 (CH0) i 2 n 1 CO-N--(CH0) -B I 2 t

25 R 1 1 hvor A , R, R , n og t har de ovenfor angivne betydninger 35 2. og B er en gruppe med formlen -SH eller -S-S-R , hvor R . i er en gruppe vundet ved fjernelse af gruppen B fra for-30 bindeisen med den almene formel II, oxyderes, eller b) en optisk aktiv eller racemisk forbindelse med den almene formel DK 155520B R^NH-CH-COA1 ( CEL· ) I 2 n 2 CO-N-(CH0 ).-B j Δ t R 5 i i hvor A , R, R , n og t har de ovenfor angivne betydninger 2 og B er p-toluensulfonyloxy, omsættes med et alkalimetal-sulfit eller alkalimetalbisulfit, hvorefter den således ved en hvilken som helst af metoderne a)-b) vundne forbin-10 delse om ønsket omdannes til et fysiologisk acceptabelt salt eller frigøres fra et salt og/eller fremstilles i optisk aktiv form ved opspaltning af et vundet racemisk produkt .

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1a), kendete g-15 net ved at en forbindelse med den almene formel II omsættes med permyresyre eller en blanding af iseddikesyre og hydrogenperoxyd. 20 25 1 35