CH617183A5

CH617183A5 -

Info

Publication number: CH617183A5
Application number: CH539075A
Authority: CH
Inventors: Laszlo Feuer; Arpad Furka; Ferenc Sebestyen; Jolan Hercsel-Szepespataky; Erzsebet Bendefy-Dobay
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1974-04-29
Filing date: 1975-04-28
Publication date: 1980-05-14
Also published as: NO146430C; AT351007B; DK155520B; CS209857B2; CH621334A5; ATA624877A; AR218222A1; DE2518160A1; BG26370A4; BE828546A; DK245783A; FI65990C; GB1504541A; FR2279388A1; CA1051802A; AT359085B; DD125070A5; ES436986A1; DE2559989C3; PL111746B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die in den Ansprüchen 1, 9 und 18 definierten Verfahren zum Herstellen der neuen Aminosäurederivate der Formeln (I), (V) und (X), in welchen die Symbole die angegebene Bedeutung haben.

Ein Teil dieser Verbindungen verfügt über wertvolle pharmakologische Eigenschaften. Wieder andere dieser Verbindungen stellen Intermediäre für die Herstellung von Stoffen mit wertvollen biologischen bzw. pharmakologischen Wirkungen dar. Alle diese Verbindungen sind neu.

Unter den neuen Verbindungen ist aufgrund seiner biologischen Wirkungen besonders das y-L-Ghitamyl-taurin hervorzuheben, das der Formel (XXIV)

H-H - CH - COOH * !

ce0 (:cxiv)

! *

CO - HH - CHg - CH2- S020E

entspricht und für mittelbar oder unmittelbar auf Verletzungen des «AGAS» (aerobiosphärisches genetisches Adaptionssystem) zurückführbare krankhafte Veränderungen über ein breites therapeutisches und präventives Wirkungsspektrum verfügt.

Zur Erläuterung des Begriffes «AGAS» werden im folgenden die wichtigsten Gewebe und Organe aufgezählt, die dieses System bilden.

a) alle biologischen Grenzflächen, die mit der Aussenluft als Biosphäre in Berührung stehen (Haut und Hautgebilde, Cornea und Conjunktiva, Mund- und Rachenhöhle, Atemwege und Lunge);

b) Skelett und Gliedmassen (Röhrenknochen und schwammartige Knochen, Kugelgelenke, synoviale Membran, Skelettmuskulatur);

c) die an der Regulierung des Ionenhaushaltes teilnehmenden Organe (transepithelisches Transportsystem: Darmzotten und Nierenkanäle);

d) das für die Zerkleinerung der Nahrung benötigte theko-donte (in der Zahnalveole durch Wurzel befestigte) Ge-biss;

e) Hör-, Geruchs- und Stimmorgane.

Die neuen Verbindungen üben also auf die hier aufgezählten Organe bzw. Gewebe des AGAS-Systems eine günstige biologische bzw. therapeutische Wirkung aus.

Die neuen Verbindungen wirken ferner auf die folgenden, mit dem AGAS-System in Zusammenhang stehenden Funktionen: Strahlenschutzwirkung, die Wundheilung begünstigende, das Mesenchym allgemein aktivierende Wirkung, Schutz gegen die ständig steigende Infektions- und Verschmutzungsgefahr von Haut und Schleimhäuten (Lysozymerzeugung der feuchten Schleimhäute, Aktivierung der Flinlmerepithelien in den Atemwegen usw.), gesteigerter Schutz gegen die von Viren und Pilzen verursachten Infektionen.

Gegen die sich ständig und in hohem Masse steigernden Stresswirkungen (z. B. meteorologische Einflüsse, starke Unterschiede zwischen Tag- und Nachttemperatur, erhöhte Verletzungsgefahr) des Lebens auf dem Festland sind die erfin-dungsgemässen Verbindungen wirksam, indem sie das Adap-tionssyndrom stabilisieren und gleichzeitig die peripheren Gewebeschäden der Glucochorticoide abwehren (so z. B. Schäden des Bindegewebes, Verletzungen des Knochenmatrixbestandes usw.). Entwicklung der Immun-Homoeostase (gesteigertes Erkenntnisvermögen des Körpers, welche Zellen körpereigen sind und welche nicht ).

Die erfindungsgemässen Verbindungen üben ihre Wirkung zum Teil unmittelbar, zum Teil über die Lenkung des Vitamin-A-Metabolismus, durch die Erzeugung von Vitamin-A-Met-aboliten stärker polaren Charakters aus. Diese Wirkung ist der des Parathormons auf das 25-Hydroxy-cholecalciferol-l-a-hy-droxylase-Enzym der Nierenkanäle vergleichbar. Durch diese Erläuterung wird die breite pharmakologische, biochemische und therapeutische Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen verständlich. Die Wirkungsrichtungen der Verbindungen sind folgende:

A. Wirkungen mit Vitamin-A-Charakter a) Pharmakologische und biochemische Wirkungen: Markierte Sulfate werden in erhöhtem Masse in den Schwertknorpel der Ratte bzw. die Augenlinse, das Leber- und Lungengewebe des Hühnerembryos eingebaut; radioaktiv markierter Phosphor wird in gesteigertem Masse in den Schwertknorpel der Ratte eingebaut; die Chondroitinsulfatsynthese steigernde Wirkung; günstige Wirkung auf die Wundheilung bzw. die mittels Verabreichung von Cortison experimentell verschlechterte Wundheilung bei Ratten und Hunden; die die Wirkung des Vitamins A potenzierende Wirkung bei an Ratten und Hühnern experimentell hervorgerufenen Hypo- bzw. Hypervitaminosen; die die ulcus-bedingten Stresswirkungen mässigenden Wirkungen bei Ratten; die Degranulation .von Mastocyten begünstigende Wirkung; steigernde Wirkung auf die Produktion von Lysosym; Wirkung auf den Haushalt der Spurenelemente (Silicium, Zink, Kupfer, Mangan, Fluor); fördernde Wirkung auf die Epithelbildung; steigernde Wirkung auf die alkalische Phosphatase-Aktivität; die auf die durch lokale Einwirkung von Vitamin A hervorgerufene Granulomsackbildung ausgeübte Wirkung; der sehr flache Verlauf der Dosis-Wirkungskurve bzw. die Änderung des Vorzeichens der Wirkung bei grossen Dosen; aktivierende Wirkung auf den Golgi-Apparat; begünstigende Wirkung auf die Bildung von Kelchzellen; steigernde Wirkung auf die Konzentration des Vitamins A.

b) Klinisch-therapeutische Wirkungen: keratocunjunctivis sicca; Sjögren-Syndrom; rhino-laryngo-pharyngitis sicca; Ozaena; chronische Bronchitis; Sinobronchitis; Mucoviscidose; konstitutionelle Lungenerkrankungen bei Kleinkindern; Para-dentose; Ansteckungsneigung der Haut und der Schleimhäute für Viren und Pilze; cortison-antagonistische Wirkung; günstige Wirkung auf den Heilvorgang bei Operationswunden und Schleimhautwunden; erosio colli; pruritusartige; Herabsetzung des Geruchs- und Geschmackssinnes.

B. Wirkungen ohne Vitamin-A-Charakter a) Pharmakologische und biochemische Wirkungen: Wirkung auf den Blutzuckerspiegel im Sinne einer vorübergehenden Senkung; steigernde Wirkung auf die Phosphaturie, senkende Wirkung auf den Phosphorspiegel im Serum; radiopro-tektive Wirkung; bei Labyrinthversuchen mit inaktiven Tieren

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die zur Erreichung des Ziels nötige Zeit vermindernde Wirkung; vermindernde Wirkung auf experimentell hervorgerufene Fluor- und Cadmiumtoxikose; die cyclische Adenosinmo-nophosphat-Entleerung der Niere steigernde Wirkung; die Symptome experimentell hervorgerufenen Lathyrismus mässi-gende Wirkung; Verminderung der Histaminempfindlichkeit; steigernde Wirkung auf die Aktivität des Leberenzyms Tyrosi-naminotransferase.

b) Therapeutische Wirkungen: schwache Strahlenschäden; Vitiligo; Muskelhypotonie; psychoenergetisierende Wirkung; günstige Wirkung auf involutionelle und gerontologische Zustände sowie auf die mnestischen Funktionen; cheloide Neigungen; Spondylosis ankylopoetica; auf Abnutzung beruhende Erkrankungen der Bewegungsorgane; sclerotischer Fundus; Amyloidose; Morphea; fibrocystische Mastopathie.

Bei der Verabreichung der neuen Verbindungen ist die Zeitdauer der Behandlung ausserordentlich unterschiedlich. Manche Krankheiten (z. B. Rhino-laryngo-pharyngitis sicca) werden bei oraler Verabreichung von täglich 3x5 Mikrogramm bereits nach zwei Wochen symptomfrei, zur symptomatischen Besserung anderer Krankheiten (z. B. Paradentose, Sjögren-Syndrom) sind ein bis zwei Monate erforderlich, bei wieder anderen Krankheiten (z. B. Spondylosis ankylopoetica) muss ein viertel bis ein halbes Jahr behandelt werden.

Aus den neuen Verbindungen können in einfacher Weise beliebige pharmazeutische, präventive, kosmetische bzw. veterinärmedizinische Präparate hergestellt werden. Die Präparate können einen einzigen Wirkstoff oder aber eine Wirkstoffkombination enthalten. Die Dosis an reinem Wirkstoff beträgt 50—500 Nanogramm pro Tag und Kilo Körpergewicht und wird verteilt auf drei Einzeldosen verabreicht.

Eine Tablette enthält 2—20 Mikrogramm, vorzugsweise 10 Mikrogramm Wirkstoff und ausserdem biologisch inerte Trägerstoffe (z. B. Milchzucker, Stärke) sowie die üblichen Tablettierungshilfen (Granulier- und Gleitmittel, wie z. B. Poly-vinylpyrrolidon, Gelatine, Talkum, Magnesiumstearat, Aerosil usw.).

Wegen der ausserordentlich kleinen Dosis ist es zweckmässig, den Wirkstoff noch vor dem Granulieren in Form einer Lösung der Tablettenmasse zuzusetzen. Auf diese Weise wird der Wirkstoff gleichmässig verteilt. Der geringe Wirkstoffgehalt ermöglicht übrigens, den Wirkstoff auch im Falle der Herstellung vieler Millionen Tabletten jährlich im Massstabe eines grossen Laboratoriums herzustellen, und zwar zu einem Preis, der für jeden Kranken akzeptabel ist. Die Wirkstoffe sind stabil, die Tabletten können daher ohne Angabe einer Frist für den Verbrauch in den Handel gebracht werden. Der Wirk-stoffgehalt von verzögert wirkenden Tabletten bzw. spansula-ren Kapseln kann bei 10-20 Mikrogramm liegen. Bei Injektionspräparaten beträgt die zweckmässige Dosis pro Ampulle 5-10 Mikrogramm, und das Präparat kann gewünschtenfalls als Pulverampulle bereitet werden, in der der Wirkstoff mit einem indifferenten, wasserlöslichen Streckmittel vermischt vorliegt. Die parenterale Applikation kann intramuskulär, subcutan oder intravenös vorgenommen werden. In der angegebenen Konzentration schädigen die Wirkstoffe weder Gewebe noch Gefässwände. Die Wirkstoffe können auch als Infusion appliziert werden. Suppositorien enthalten 2—20, vorzugsweise etwa 10 Mikrogramm Wirkstoff und werden aus Kakaobutter oder aus für diesen Zweck geeigneten synthetischen Wachsen oder Fetten (z. B. der in der Bundesrepublik Deutschland hergestellten Imhausen-Masse) gefertigt. Der Wirkstoffgehalt von kosmetischen oder der Heilung der Haut dienenden Salben beträgt 0,1-1 Mikrogramm/g. Die Salbengrundlage kann hydrophil oder hydrophob sein und enthält die üblichen Komponenten: z. B. Cholesterin, Paraffin, Glycerin, Lanolin, Kakaobutter, Leinöl usw. Die Wirkstoffe können ferner als Aerosolpräparate formuliert werden, wobei der Wirkstoffgehalt ebenfalls

0,1-1 Mikrogramm/g beträgt. Bei der Formulierung als perlinguale Tablette enthält eine Tablette 10 Mikrogramm Wirkstoff, die Zerfallszeit der Tablette liegt bei einer halben bis einer Stunde. Polymere zur retarden Abgabe des Wirkstoffes können z. B. als Suspension bereitet werden und enthalten 1-5 Mikrogramm Wirkstoff/g Polymer. Injektionspräparate mit retarder Wirkung können entweder unter Verwendung hochmolekularer Polymere oder aus den mit hochmolekularen organischen Basen (z. B. Histon, Protamin) gebildeten Salzen der erfindungsgemässen Verbindungen formuliert werden, wobei eine Ampulle 10-20 Mikrogramm Wirkstoff enthält. Puder für kosmetische oder Hautheilzwecke werden mit den üblichen Trägerstoffen (z. B. Talkum) bereitet und enthalten 0,1-1 g Wirkstoff/g Puder. Für die Augenheilkunde werden die Verbindungen als Tropfen bzw. als mit der Tränenflüssigkeit mischbare oder nichtmischbare Salben formuliert; der Wirkstoffgehalt dieser Präparate beträgt 0,1-1 Mikrogramm/g. Kindern sollen die erfindungsgemässen Verbindungen in einer Dosierung von etwa 0,3 Mikrogramm pro Kilo Körpergewicht verabreicht werden.

Die sterilen Präparate werden zweckmässig durch Sterilfiltration hergestellt.

Die gewünschte präventive pharmakologische bzw. kosmetische Wirkung der oben aufgeführten Präparate kann durch zahlreiche Kombinationen gesteigert und ergänzt werden. Als mögliche biologisch aktive Zusätze sollen in erster Linie die folgenden ausdrücklich genannt und ihre Verwendung unter Schutz gestellt werden:

Die Vitamine A, C, E und K, Spurenelemente, Cortison und seine Derivate, Progesteron, Schilddrüsenhormone, ra-diomymetisch und immunsupressiv wirksame Substanzen, Psy-chopharmaca, vor allem Tranquillizer, Timoleptica, organische Siliziumverbindungen, gerontologische Zubereitungen, den Cholesterinspiegel des Blutes senkende Stoffe, orale Antidiabetica, entzündungshemmende Stoffe, Antihistamine usw. Die Dosierung dieser aktiven Zusätze ist im allgemeinen die gleiche wie die gewöhnliche therapeutische Dosis bei der alleinigen Anwendung der Substanzen.

Die neuen Verbindungen können auch als Zusatz zu nutri-ven bzw. Arzneiprämixen verwendet werden. Sie bewirken zum Teil eine Gewichtszunahme, zum Teil vermindern sie den Bedarf an Vitamin A bzw. verbessern dessen Metabolismus. Ferner wird durch die Verbindungen die Resorption der Spurenelemente gesteigert, ihr Spiegel im Blut wird angehoben. Bei Verwendung der Verbindungen als Zusatz zu Tierfutter beträgt die Dosierung oral zweckmässig 200 Nanogramm/kg und Tag. In das Futter gemischt entspricht das ungefähr einer Konzentration von 1-2 Mikrogramm/kg beziehungsweise 1-2 mg/Tonne Futter, d. h. einer Konzentration von 0,001 bis 0,002 ppm. Im Hinblick auf diese sehr niedrigen Konzentrationen ist die Verwendung als Futtermittelzusatz äusserst wirtschaftlich. Vorzugsweise werden die Verbindungen Vit-aminprämixen zugemischt oder in Mikrokapseln verwendet, die die erfindungsgemässen Verbindungen neben anderen notwendigen Futtermittelzusätzen enthalten. Die Verbindungen können ferner beim Tränken mit dem Trinkwasser, im Lecksalz oder fallweise auch als Spray angewendet werden.

In der Veterinärmedizin haben die neuen Verbindungen ähnliche Anwendungsgebiete wie in der Humanmedizin, d. h. zum Beispiel Hautschäden (Schälen), Wundheilung, Knochenbrüche usw.

Es ist eine gemeinsame Struktureigenschaft aller Verbindungen der allgemeinen Formel (I), dass sie eine in a-Stellung substituierte Dicarbonsäure oder deren auch an anderen Stellen noch substituiertes Derivat über dessen w -Carboxylgruppe mit einer Säureamidbindung an ein primäres oder sekundäres Alkylamin gebunden enthalten, welches ausser verschiedenen

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Substituenten an seiner Alkylseitenkette in w-Stellung eine Gruppe stark sauren Charakters enthält.

Von den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können auch die polymeren oder oligomeren Derivate gebildet werden. Diese Verbindungen werden durch Reaktion von a-Po-lyaminodicarbonsäure-a>-aktivestern — z. B. a-Poly-L-glut-aminsäure-y-p-nitrophenylester —mit Taurin, Homotaurin oder Cysteamin erhalten (im Falle des Cysteamins ist auch noch eine Oxydation erforderlich). Diese Polymere können notwendigenfalls zu den monomeren Verbindungen der allgemeinen Formel (I) abgebaut werden. Dies kann z. B. durch Hydrolyse mit Carboxypeptidase oder Leucinaminopeptidase geschehen.

Beispiel 1

40,85 g (0,11 Mol) Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-a-benzylester (Liebigs Annalen 655,200,1962) werden in 500 ml Acetonitril gelöst. Die Lösung wird unter Ausschluss der Luftfeuchtigkeit auf —15° C gekühlt. Unter Rühren werden der Lösung zuerst 15,4 ml (0,11 Mol) Triäthylamin, dann 15,4 ml (0,11 Mol) Chlorameisensäureisobutylester zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei —15° C 40 Minuten lang gerührt und dann mit 28 ml (0,2 Mol) Triäthylamin, anschliessend mit 11,26 g (0,05 Mol) Cystaminhydrochlorid und schliesslich 250 ml Acetonitril versetzt. Das Gemisch wird bei —15° C noch zwei Stunden lang, dann bei Zimmertemperatur noch vier Stunden lang nachgerührt.

Nach Ablauf der Reaktionszeit tfird das Gemisch bei 30° C im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird unter Rühren und Kühlen in 200 ml Eiswasser aufgenommen und das Gemisch bei 35° C im Vakuum erneut eingedampft. Der Rückstand wird zusammen mit 250 ml Wasser und 500 ml Äthyl-acetat in einen Trenntrichter eingebracht und die organische Phase .abgetrennt. Die organische Phase wird nacheinander erst mit 250 ml Wasser, dann zweimal mit je 250 ml 5 %iger Natriumcarbonatlösung, dann zweimal mit je 250 ml In Salzsäure und schliesslich mit 250 ml Wasser ausgeschüttelt. (Aus der beim Ausschütteln mit Natriumcarbonatlösung erhaltenen wässrigen Phase können durch Ansäuern mit Salzsäure und Ausschütteln mit Äther ungefähr 5 g nicht umgesetzter Carbo-benzyloxy-L-glutaminsäure-a -benzylester zurückgewonnen werden.) Die Äthylacetatphase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum bei 30° C zur Trockne eingedampft. Ein dicker, öliger Rückstand wird erhalten, der bald zu einer kristallinen Masse erstarrt. Diese wird mit 250 ml absolutem Äther verrieben, die Kristalle werden abfiltriert. Das Rohprodukt (40-42 g) wird aus einem Gemisch von 100 ml Äthylacetat und 170 ml Äther umkristallisiert. Es werden 29,3 g N,N'-bis-[N-CarbobenzyIoxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyll-cystamin erhalten, das bei 91—92 °C schmilzt.

Elementaranalyse für C44HsoN4010S2 (M = 859,05):

Ber.: C 61,52 H 5,89 N 6,52 S 7,46%

Gef.: C 60,85 H 5,91 N 6,61 S 7,72%

Beispiel 2

25,77 g (0,03 Mol) des gemäss Beispiel 1 erhaltenen N,N'-bis-[N-Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl]-cyst-amins werden in 75 ml Eisessig gelöst. Der in Eis gekühlten Lösung wird innerhalb von 15 Minuten ein frisch bereitetes Gemisch aus 75 ml 30%igem Wasserstoffperoxyd und 225 ml Eisessig zugetropft. Nach der Zugabe wird die Kühlung abgenommen und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur 4 Stunden lang gerührt. Anschliessend wird im Vakuum bei 30° C eingedampft. Das ölige Produkt wird im Exsiccator zuerst über Phosphorpentoxyd, dann über festem Kaliumhydroxyd getrocknet. Man erhält 28,5 g Carbonbenzyloxy-y-(a-ben-zyl)-L-glutamyltaurin. Das rohe Produkt kann ohne Reinigung zur Herstellung des y-L-Glutamyltaurins verwendet werden.

Beispiel 3

26,32 g (55 mMol) des gemäss Beispiel 2 hergestellten Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurins werden in 50 ml Eisessig gelöst. Der Lösung werden 4 Mol Bromwasser-5 stoff, gelöst in 50 ml Eisessig, zugesetzt. Eine lebhafte Koh-lendioxydentwicklung ist zu beobachten. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang stehengelassen und dann im Vakuum bei 30° C eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 170 ml Wasser gelöst und fünfmal mit je io 70 ml Äther ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird bei 35° C im Vakuum eingedampft. Man erhält 20,42 g y-(a-Benzyl)-L-glutamyltaurin, das aus 90%igem Äthanol umkristallisiert wird.

Rf (n-B ut anol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15 15:10:3:12) = 0,53

Rf (n-Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:1) = 0,39.

Beispiel 4

529 mg (1,1 mMol) des gemäss Beispiel 2 hergestellten 20 Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurins werden in 5 ml In Kaliumhydroxydlösung gelöst und bei Zimmertemperatur 4 Stunden lang stehengelassen. Danach wird die Lösung dreimal mit je 3 ml Äther ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird auf eine mit Dowex 50 x 2 gefüllte Säule von 1. x 20 cm 25 aufgebracht und mit Wasser eluiert. Es werden 50 ml Lösung aufgefangen und im Vakuum bei 35° C zur Trockne eingedampft. Man erhält rohes Carbobenzyloxy-y-L-glutamyltaurin, welches durch bei pH 6,5 durchgeführte Papierelektrophorese gereinigt wird. Die auf Cysteinsäure bezogene relative Beweg-30 lichkeit beträgt 1,05.

R{ (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,57.

Beispiel 5

35 5,79 g (12,1 mMol) des gemäss Beispiel 2 hergestellten Carbobenzyloxy-y - (a -benzyl) -L-glut amyltaurins werden in einem Gemisch von 100 ml Äthanol und 25 ml Wasser gelöst und unter Schütteln bei Anwesenheit von 0,5 g 10%iger Palladiumkohle als Katalysator hydriert. Der Katalysator wird 40 zweckmässig in zwei Portionen zu je 0,25 g zugesetzt. Nachdem kein Wasserstoffverbrauch mehr stattfindet, wird die Lösung filtriert und dann bei 30° C im Vakuum eingedampft. Der ölartige Rückstand wird im Exsiccator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Man erhält 3,1 g y-L-Glutamyltaurin, das in Was-45 ser sehr gut, in Alkohol nicht löslich ist. Durcfi Zusatz von wenig Wasser und Alkohol in kleinen Portionen kann das Produkt kristallisiert werden. Das kristalline Rohprodukt schmilzt bei 202-204° C.

Das Rohprodukt wird aus 80%igem Äthanol mehrmals so umkristallisiert. Man erhält 2,02 g reines Endprodukt, was — auf N,N' -bis- [N-Carbobenzyloxy-y- (a -benzyl) -L-glutamyl]-cystamin bezogen — einer Ausbeute von 66% entspricht. Das reine Produkt schmilzt bei 219—220° C. [a]D2U = +14° C (Wasser, c = 1,02). Die auf Cysteinsäure bezogene relative 55 Beweglichkeit bei bei pH 6,5 durchgeführter Papierelektrophorese beträgt 0,73, bei pH 1,8, 0,53.

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,19.

Analyse für (^H^OeS (M = 254,27):

60 Ber.: C 33,07 H 5,55 N 11,02 O 37,75 S 12,61%

Gef.: C 33,15 H 5,76 N 10,94 O 37,53 S 12,17%

Beispiel 6

Das gemäss Beispiel 3 erhaltene y-(a-Benzyl)-L-glutamyl-65 taurin (20,42 g) wird in 150 ml In Kaliumhydroxydlösung gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur 4 Stunden lang stehengelassen und dann auf eine mit im H+-Zyklus befindlichem Dowex 50 x 2 (Fluka, 100—200 mesh) gefüllte Säule der

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Masse 2 x 100 cm aufgebracht. Eluiert wird mit Wasser. Vom Beginn des Auswaschens an gerechnet werden 300 ml Eluat aufgefangen. Dieses wird im Vakuum bei 35° C eingedampft. Der ölige Rückstand wird durch Zugabe von 8—10 ml Wasser und etwa 100 ml Äthanol kristallisiert. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Alkohol und Trocknen erhält man 13,7 g y-L-Glutamyltaurin. Das kristalline Produkt wird aus 80%igem wässrigem Alkohol umkristallisiert. Man erhält 9,79 g reines Produkt, was auf N,N'-bis-[N-Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl]-cystamin bezogen einer Ausbeute von 70% entspricht.

Beispiel 7

5,42 g (11 mMol) Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-(p.-benzyl)-y-p-nitrophenylester (Chem. Ber. 96, 204,1963) werden in 50 ml Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf 0° C gekühlt und innerhalb einer halben Stunde unter intensivem Rühren eine Lösung von 1,25 g (10 mMol) Taurin in 20 ml Wasser zugetropft. Dann wird das Gemisch mit 3,08 ml (22 mMol) Triäthylamin versetzt, Kühlen und Rühren werden abgestellt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 72 Stunden lang stehengelassen und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser gelöst und der gelben Lösung so lange In Salzsäure zugesetzt, bis sie sich entfärbt. Zwecks Entfernung des p-Nitrophenols wird die Lösung zehnmal mit je 50 ml Äther ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird im Vakuum eingedampft. Man erhält 6,9 g Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyltaurin-triäthylammoniumsalz.

Die Substanz wird auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise katalytisch hydriert und das Lösungsmittel durch Eindampfen im Vakuum entfernt. Zwecks Entfernung des Tri-äthylamins wird die Substanz in wenig Wasser gelöst und auf eine Dowex-50 x 2-Säule von 2 X 40 cm aufgebracht. Eluiert wird mit Wasser. Man fängt ungefähr 120 ml Eluat auf und dampft dieses dann im Vakuum bei 35° C ein. Kristallisation und Isolieren des Produktes geschehen auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise. Man erhält 1,72 g y-L-Glutamyltaurin, was auf Taurin bezogen einer Ausbeute von 68% entspricht.

Beispiel 8

Das gemäss Beispiel 4 erhaltene Carbobenzyloxy-y-L-glu-tamyltaurin wird in 2 ml 4 Mol Bromwasserstoff enthaltendem Eisessig gelöst. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur eine halbe Stunde lang stehengelassen und dann bei 35° C im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mehrmals mit Äther verrieben und dann von dem Äther durch Dekantieren abgetrennt. Das gewonnene y-L-Glutamyltaurin wird auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise umkristallisiert.

Beispiel 9

25,4 mg (0,1 mMol) y-L-Glutamyltaurin werden in 2 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 10 ml 0,01n Natriumhydroxydlösung versetzt. Das Gemisch wird bei 30° C im Vakuum eingedampft. Der weisse kristalline Rückstand wird im Exsiccator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Man erhält das Mo-nonatriumsalz des y-L-Glutamyltaurins. Das Produkt hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt bei 200° C zu schrumpfen, seine Farbe wird fortschreitend dunkler, und bei etwa 250° C verkohlt çs. Das Produkt ist in Methanol und Äthanol gleichermassen schlecht löslich.

Beispiel 10

Zu 7,5 mg (30 /<Mol) y-L-Glutamyltaurin werden 10 ml absoluten Methanols gegeben, welches pro Liter 0,5 Mol Chlorwasserstoff enthält. Die Suspension wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang gerührt. Das reine Produkt wird durch absteigende Papierchromatographie isoliert, wobei eines der folgenden beiden Fliessmittel verwendet werden kann:

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,27

Rf (n-Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:1) =0,14.

Man erhält y-(a-Methyl)-L-Glutamyltaurin.

Beispiel 11

Die Veresterung wird auf die im Beispiel 10 beschriebene Weise vorgenommen, jedoch wird Chlorwasserstoff enthaltendes Äthanol verwendet. Man erhält y-(a-Äthyl)-L-Glutamyl-taurin.

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,37

Rf (n-Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:1) =0,22.

Beispiel 12

25,4 mg (0,1 mMol) y-L-Glutamyltaurin werden in 100 wl 2n Natriumhydroxydlösung gelöst. Die Lösung wird auf 0° C gekühlt und dann in je 5 Minuten Abstand mit drei Portionen von insgesamt 36 ul Acetanhydrid und 180 fû 4n Natriumhydroxydlösung versetzt, wobei intensiv gerührt wird. Die alkalische Lösung wird mit Wasser auf 2 ml verdünnt und dann bei Zimmertemperatur 12 Stunden lang stehengelassen. Zwecks Entfernung der Natriumionen wird die Lösung auf eine Dowex 50 x 2-Säule von 1 x 10 cm aufgebracht und mit Wasser eluiert. 50 ml Eluat werden aufgefangen und im Vakuum bei 35° C eingedampft. Das erhaltene Produkt ist N-Acetyl-y-L-glutamyltaurin. Es wird in Wasser gelöst und durch bei pH 6,5 durchgeführte Papierelektrophorese gereinigt. Die auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit beträgt 1,22.

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,25.

Beispiel 13

25,4 mg (0,1 mMol) y-L-Glutamyltaurin werden mit 13 fA Benzoylchlorid benzyliert, wobei nach der in Beispiel 12 für das Acetylieren gegebenen Vorschrift gearbeitet wird. Nach Entfernen der Natriumionen auf der Dowexsäule und dem Eindampfen des Eluats erhält man N-Benzoyl-y-L-glutamyl-taurin, das mittels bei pH 6,5 durchgeführter Papierelektrophorese gereinigt wird. Die auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit beträgt 1,06.

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,47.

Beispiel 14

0,48 g (1 mMol) Carbobenzyloxy-a-L-gIutamyl-(y-p-nitro-phenylester)-glycinäthylester (Acta Chim. Acad. Sei. Hung. 65, 375,1970) werden in 6 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit Eiswasser gekühlt. Bei 0° C werden der Lösung zuerst 0,08 g (1 mMol) Cysteamin in 1 ml Dimethylformamid zugegeben, dann 0,14 ml (1 mMol) Triäthylamin zugetropft. Langsam beginnt ein Niederschlag auszufallen. Das Reaktionsgemisch wird noch einige Zeit in Eiswasser, dann 1 Tag lang bei Zimmertemperatur stehengelassen und schliesslich mit einem 1:1-Gemisch von Äther und Äthylacetat verdünnt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und zuerst mit einem 4:1-Gemisch von Äther und Äthylacetat, dann mit Äther mehrmals gewaschen. Nach dem Trocknen über Schwefelsäure wird der Niederschlag dreimal mit In Salzsäure, zweimal mit Wasser, zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schliesslich noch zweimal mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum über Schwefelsäure getrocknet. Man erhält 0,35 g Carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-cysteamin)-glycinäthylester, was einer Ausbeute von 85 % entspricht.

Analyse für Ca8H2S06N3S (M = 411,4):

Ber.: C 52,6 H 6,1 S 7,8%

Gef.: C 53,4 H 6,5 S 7,7%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

617 183

8

Das Infrarot-Spektrum weist für die charakteristischen Gruppen folgende Maxima auf: NH 3310 cm-1, C=0 (COOEt) 1748 cm"1, C=0 (Z) 1690 cm"1, C=0 (Amid) 1655 cm-1.

100 mg Carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-cysteamin)-gly-cinäthylester werden in 2 ml Eisessig gelöst und der Lösung 0,5 ml 30%iges Wasserstoffperoxyd zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird unter Eiswasserkühlung 4 Stunden lang stehengelassen. Der Fortgang der Reaktion wird papierelektrophore-tisch verfolgt. Nach Verdünnen mit Wasser wird das Reaktionsgemisch lyophilisiert. Man erhält das Endprodukt in Form eines Schaumes. 0,11 g Carbobenzyloxy-a -L-glutamyl-(y-tau-rin)-glycinäthylester (95 %) werden gewonnen.

Beispiel 15

0,47 g (1 mMol) Carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-p-nitro-phenylester)-glycinmethylester werden in 6 ml Pyridin gelöst. Unter Eiskühlung werden der Lösung zuerst 0,125 g (1 mMol) Taurin in 2 ml Wasser, dann 0,28 ml (2 mMol) Triäthylamin in so kleinen Portionen zugesetzt, dass die Lösung immer klar bleibt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur drei Tage lang stehengelassen. Nach dem Eindampfen im Vakuum wird ein Öl erhalten, das nach gründlichem Digerieren in Äther, dannJn Petroläther im Vakuum über Schwefelsäure getrocknet wird. Man erhält Carbobenzyloxy-a-L-glutamyl-(y-taurin) -glycinmethylester.

Beispiel 16

100 mg des gemäss Beispiel 14 hergestellten Carbobenzyl-oxy-a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinäthylesters werden in einem Gemisch aus 1 ml Trifluoressigsäure und 1 ml konz. Salzsäure gelöst. Die Lösung wird 3 Stunden lang bei 35° C in einem verschlossenen Bombenrohr gehalten. Danach wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit Äther und n-Hexan mehrmals digeriert und dann erneut eingedampft. Man erhält einen weissen amorphen Stoff, der sich bei elektrophoretischer Untersuchung als einheitlich erweist und einen positiven Ninhydrinfleck gibt. Das Produkt ist a-L-Glut-amyl-(y-taurin)-glycin. Ausbeute: 0,06 g (88%).

Analyse für C9H17N307S (M = 311,3):

Ber.: S 10,3%

Gef.: S 10,0%

Das Infrarotspektrum weist für die kennzeichnenden Gruppen folgende Maxima auf: NH3+ 3100 cm-1 (breit); OH (COOH) 3200 cm"1 (breit); C=0 (COOH) 1730 cnT1; C=0 (Amid-I) 1680 cm"1; C=0 (Amid-II) 1560; S=0 (S020H) 1220 cm-1 (intensiv); S=0 (S020~) 1045 cm-1 (intensiv).

Hydrolyse: 20 mg der Substanz werden in 1 ml 6n Salzsäure in einem zugeschmolzenen Glasröhrchen 24 Stunden lang bei 105° C gehalten. Nach dem Abkühlen wird eine Probe der Lösung bei pH 1,8 der Elektrophorese unterzogen. Die Lösung enthält Glutaminsäure, Glycin und Taurin.

Beispiel 17

100 mg des gemäss Beispiel 15 hergestellten Carbobenzyl-oxy-a-L-glutamyl-(y-taurin)-glycinmethylesters werden mit 4 ml 2n eisessigsaurem Bromwasserstoff bei Zimmertemperatur umgesetzt, bis die gesamte Substanz in Lösung gegangen ist (ungefähr 30 Minuten). Die erhaltene klare Lösung wird in 30 ml Äther gegossen und an einem kühlen Ort 1 Tag lang stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abzentrifu-giert, mehrmals mit Äther gewaschen um dann im Vakuum über Kaliumhydroxyd, Schwefelsäure und Phosphorpentoxyd getrocknet. Wie die elektrophoretische Untersuchung ausweist, wird das Hydrogenbromid des a-L-Glutamyl-(y-tau-rin)-glycinmethylesters in praktisch reiner Form erhalten.

Beispiel 18

Das gemäss Beispiel 17 erhaltene Salz wird unter Eiswasserkühlung 3 Stunden lang mit 2 ml n Natriumhydroxydlösung umgesetzt. Das Fortschreiten der Hydrolyse wird elektropho-retisch verfolgt. Das Reaktionsgemisch wird mit 10 ml Dowex 50 in H+-Form einem Ionenaustausch unterworfen und dann lyophilisiert. Da die Elektrophorese noch Verunreinigungen anzeigt, wird das Produkt bis zum Erreichen der entsprechenden Reinheit aus wässrigem Äthanol mehrfach umkristallisiert. Man erhält 40 mg (59%) a-L-Glutamyl-(y-taurin)-glycin.

Das Infrarot-Spektrum weist für die charakteristischen Gruppen folgende Maxima auf: NH 3310 cm-1; NH3+ 3100 cm'1 (breit); C=0 (COOH) 1730 cnT1; C=0 (Amid-I) 1650 cm'1; C=0 (Amid-II) 1570 cnT1; S=0 1220 (intensiv), 1045 cm-1 (intensiv).

Beispiel 19

100 mg des nach Beispiel 16 oder 18 hergestellten a-L-Glutamyl-(y-taurin)-glycins werden in 25 ml eines 2m Ammo-niumhydrogencarbonat-Puffers vom pH-Wert 8,5 gelöst. Der Lösung wird 1 mg Carboxypeptidase A, gelöst in 0,5 ml Wasser, zugesetzt (Hersteller des Enzyms: Serva, Heidelberg). Das Gemisch wird 24 Stunden lang bei 37° C im Thermostaten gehalten und dann lyophilisiert. In dem trockenen Lyophilisat kann y-L-Glutamyltaurin und Glycin nachgewiesen werden. Das reine y-L-Glutamyltaurin kann durch Elektrophorese oder Chromatographie auf einer Dowex-50-Säule gewonnen werden.

Beispiel 20

1,083 g (2,2 mMol) Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-(a-benzyl)-y-p-nitrophenylester werden in 6 ml eines im Verhältnis 2:1 bereiteten Gemisches von Pyridin und Wasser gelöst. Der Lösung werden zuerst 278 mg (2 mMol) Homotaurin, dann 0,59 ml (4,2 mMol) Triäthylamin zugesetzt. Die gelbe Lösung wird bei Zimmertemperatur 72 Stunden lang stehengelassen und dann im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wird in Wasser gelöst, mit Salzsäure neutralisiert und dann zur Entfernung des p-Nitrophenols in einem kontinuierlichen Extraktor mit Äther 8 Stunden lang extrahiert. Die wässrige Phase wird im Vakuum eingedampft. Man erhält 1,68 g Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylhomotaurin.

Beispiel 21

Die gesamte Menge der gemäss Beispiel 20 hergestellten Substanz (1,68 g) wird in 10 ml 50%igem wässrigem Äthanol gelöst, dann werden 0,3 g 10%ige Palladiumaktivkohle zugegeben und durch die Suspension 4 Stunden lang Wasserstoff geleitet. Danach wird die Lösung filtriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 1—2 ml Wasser gelöst und zur Entfernung des Triäthylamins auf eine in H+-Form befindliche Dowex-50x 2-Säule der Masse 1 x 35 cm aufgebracht. Es wird mit Wasser eluiert. 50 ml Eluat werden aufgefangen und dann im Vakuum eingedampft. Als Rückstand erhält man 440 ml y-L-Glutamylhomotaurin, was einer Ausbeute von 82% entspricht. Die bei pH 6,5 vorgenommene Elektrophorese weist eine geringe Verunreinigung durch teils neutrale, teils saure Substanzen (Homotaurin bzw. Glutaminsäure) aus. Das Produkt kann z. B. durch präparative Elektrophorese gereinigt werden.

Sowohl bei der bei pH 6,5 wie auch bei der bei pH 1,8 vorgenommenen Elektrophorese wandert die Substanz in Richtung der Kathode. Ihre auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit beträgt bei pH 6,5 0,68, bei pH 1,8 0,50.

R{ (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) =0,19.

5

10

15

20

25

30

35

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9

617 183

Beispiel 22

1,083 g (2,2 mMol) Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-(a-benzyl)-y-p-nitrophenylester werden auf die in Beispiel 20 beschriebene Weise mit 278 mg (2 mMol) N-Methyltaurin umgesetzt. Man erhält 1,59 g Carbobenzyloxy-y-(«-benzyl)-L-glut-amyl-N-methyltaurin.

Beispiel 23

Die gesamte Menge des gemäss Beispiel 20 hergestellten Stoffes (1,59 g) wird auf die im Beispiel 21 beschriebene Weise katalytisch hydriert. Man erhält 423 mg y-L-Glut-amyl-N-methyltaurin, was einer Ausbeute von 79% entspricht.

Die Substanz wandert sowohl bei pH 6,5 wie auch bei pH 1,8 in der Papierelektrophorese in Richtung der Kathode. Auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit: pH 6,5: 0,68; pH 1,8: 0,49.

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,16.

Beispiel 24

2,87 g (6,6 mMol) Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-(a-benzyl)-y-p-nitrophenylester werden in 20 ml Pyridin gelöst und mit einer Lösung von 1,25 g (6 mMol) L-Cysteinsäuremo-nohydrat in einem Gemisch von 17 ml Wasser und 17 ml Pyridin versetzt. Nach Zusatz von 2,6 ml (18,6 mMol) Triäthylamin wird das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur 72 Stunden lang stehengelassen. Danach wird die Lösung im Vakuum bei 30° C eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst, mit konz. Salzsäure angesäuert und dann 15mal mit je 10 ml Äther ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird im Vakuum bei 35° C eingedampft. Man erhält Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamyl-L-cysteinsäure.

Beispiel 25

Das gemäss Beispiel 24 hergestellte Produkt wird in 20 ml Wasser gelöst, mit 0,3 g 10%iger Palladiumaktivkohle versetzt und durch die Suspension 3 Stunden lang Wasserstoff geleitet. Das Reaktionsgemisch wird auf die in Beispiel 21 beschriebene Weise aufgearbeitet. Man erhält y-L-Glutamyl-L-cysteinsäure, die bei 187° C schmilzt. Auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit bei der Papierchromatographie: bei pH 6,5: 1,21; bei pH 1,8: 0,54.

Beispiel 26

1,083 g (2,2 mMol) Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-(a-benzyl)-y-p-nitrophenylester werden in.6 ml eines im Verhältnis 2:1 bereiteten Gemisches aus Pyridin und Wasser gelöst. Der Lösung werden zunächst 282 mg (2 mMol) Cholaminphos-phat (US-Patentschrift Nr. 2 730 542) und dann 0,87 ml (6,2 mMol) Triäthylamin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 72 Stunden lang stehengelassen und dann im Vakuum eingedampft. Die weitere Aufarbeitung erfolgt auf die im Zusammenhang mit Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylhomotaurin (Beispiel 20) beschriebene Weise. Man erhält 1,25 g Carbonbenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylcholaminphosphat.

Beispiel 27

Die gesamte Menge des gemäss Beispiel 26 gewonnenen Produktes (1,25 g) wird zwecks Entfernung der Schutzgruppen katalytisch hydriert. Die Hydrierung sowie die Reinigung durch lonenaustausch wird auf die im Zusammenhang mit der Herstellung des y-L-Glutamylhomotaurins (Beispiel 21) beschriebene Weise vorgenommen. Man erhält 470 mg y-L-Glut-amylcholaminphosphat, was einer Ausbeute von 91 % entspricht. Das Produkt enthält jedoch, wie die Papierelektrophorese ausweist, als Verunreinigung ungefähr 15 bis 20% Chol-

aminphosphat. Als Reinigungsverfahren kommt unter anderem die Elektrophorese in Frage.

Bei der Papierelektrophorese wandert die Substanz sowohl bei pH 6,5 wie auch bei pH 1,8 in Richtung der Kathode. Auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit: pH 6,5: 0,75; pH 1,8: 0,36.

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,18.

Beispiel 28

526 mg (1,1 mMol) Carbobenzyloxy-L-asparaginsäure-(a-benzyl)-/?-p-nitrophenylester (Chem. Ber. 97, 1789,1964) werden in 5 ml Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf 0° C gekühlt und dann in kleinen Portionen eine Lösung von 125 mg (1 mMol) Taurin in 2 ml Wasser, anschliessend 0,28 ml (2 mMol) Triäthylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 48 Stunden lang stehengelassen und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 5 ml Wasser gelöst und die am Anfang gelbe Lösung bis zu ihrer Entfärbung mit In Salzsäure versetzt. Zur Entfernung des p-Nitrophenols wird die Lösung zehnmal mit je 5 ml Äther ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird im Vakuum eingedampft. Man erhält 478 g Carbobenzyloxy-/3-(a-benzyl)-L--aspartyltaurin.

Beispiel 29

Die gesamte Menge des gemäss Beispiel 28 gewonnenen Produktes wird in 6 ml 50 %igem. wässrigem Äthanol gelöst. Die Lösung wird mit 100 mg 10%iger Palladiumaktivkohle versetzt und dann durch 4 Stunden langes Einleiten von Wasserstoffgas hydriert. Nach dem Filtrieren und Eindampfen im Vakuum wird das Triäthylamin auf die im Zusammenhang mit der Herstellung von y-L-GIutamylhomotaurin (Beispiel 21) bereits beschriebene Weise durch lonenaustausch aus dem Produkt entfernt. Man erhält 172 mg/3-L-Aspartyltaurin, was einer Ausbeute von 71 % entspricht. Das Produkt ist tnit wenig Taurin verunreinigt, welches unter anderem durch Elektrophorese entfernt werden kann.

Bei der Papierelektrophorese wandert die Substanz sowohl bei pH 6,5 wie auch bei pH 1,8 zur Kathode. Auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit: pH 6,5: 0,77; pH 1,8: 0,58.

R{ (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 0,16.

Beispiel 30

526 mg (1,1 mMol) Carbobenzyloxy-L-asparginsäure-(a-benzyl)-/3-p-nitrophenylester und 139 g (1 mMol) Homotaurin werden auf die im Beispiel 28 beschriebene Weise zur Reaktion gebracht. Man erhält Carbobenzyloxy-/3-(a-benzyl)-L--aspartylhomotaurin.

Beispiel 31

Das gemäss Beispiel 30 erhaltene Produkt wird auf die im Beispiel 21 beschriebene Weise katalytisch hydriert. Man erhält 203 mg (84%) ß-L-Aspartylhomotaurin.

Bei der Papierelektrophorese wandert die Substanz sowohl bei pH 6,5 wie auch bei pH 1,8 in Richtung Kathode. Auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit: pH 6,5: 0,72; pH 1,8: 0,53.

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15 :10:3 :12) = 0,17.

Beispiel 32

Carbobenzyloxy-L-asparaginsäure-(a-benzyl)-/?-p-nitro-phenylester und Cholaminphosphat werden auf die im Beispiel 26 beschriebene Weise miteinander umgesetzt. Man erhält Carbobenzyloxy-/i-(ö-benzyl)-L-aspartylcholaminphosphat.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

617 183

10

Beispiel 33

Der gemäss Beispiel 32 gewonnene Stoff wird auf die im Beispiel 21 beschriebene Weise katalytisch hydriert. Man erhält ß -L-Aspartylcholaminphosphat.

Bei der Papierelektrophorese wandert die Substanz sowohl bei pH 6,5 wie auch bei pH 1,8 in Richtung Kathode. Auf Cysteinsäure bezogene relative Beweglichkeit: pH 6,5: 0,81; pH 1,8: 0,40.

Rf (n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser 15:10:3:12) = 10,14.

Beispiel 34

y-L-Glutamintaurin (gemäss Beispiel 5, 6, 7, 8 oder 19 hergestellt) wird durch Umkristallisieren auf folgende Weise gereinigt: 300 mg rohe Substanz werden bei Zimmertemperatur unter Rühren in 5 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxyd gelöst. Die opalisierende Lösung wird filtriert und das Filter mit 0,5 ml Dimethylsulfoxyd ausgewaschen. Das Filtrat wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt und mit 55 ml absolutem Äthanol versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 12 Stunden lang stehengelassen, dann die Substanz abfiltriert, mit 2,5 ml absolutem Äthanol gewaschen und im Vakuumexsicca-tor über Phosphorpentoxyd bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Man erhält 240 mg kristallines y-L-Glutamyltaurin (Ausbeute der Umkristallisation: 80%).

Anstelle von Äthanol kann zum Umkristallisieren auch die gleiche Menge Dioxan, Äther oder Aceton verwendet werden. Die Qualität des kristallinen Produktes ist in allen Fällen die gleiche. Schmelzpunkt (nach Boetius): 218-219° C. Das Produkt ist schichtchromatographisch einheitlich.

Beispiel 35

Auf die für die Herstellung von Glutaminsäure-y-amiden geeignete Weise (Acta Chim. Acad. Sei. Hung. 64, 285,1970) wird Carbobenzyloxy-y-(cc-benzyl)-L-glutamylcholamin hergestellt. 4,14 g dieses Produktes (10 mMol) werden in 50 ml absolutem Pyridin gelöst und mit 9 g (33 mMol) Diphenylphos-phorsäurechlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 12 Stunden lang bei 0° C gehalten und danach mit 80 ml Chloroform verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert, mit verdünnter Salzsäure und danach mit Wasser gewaschen und schliesslich im Exsiccator über Kaliumhydroxyd getrocknet. Die trockene Substanz wird in 15 ml Eisessig gelöst, der 3,3 Mol/1 Bromwasserstoff enthält, die Lösung 15 Minuten lang stehengelassen und dann bei 35° C im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml In Natriumhydroxydlösung gelöst und die Lösung bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang stehengelassen. Dann wird ihr pH-Wert mit Essigsäure auf 4 eingestellt, und zwecks Entfernung des Phenols und des Benzylalkohols wird die Lösung dreimal mit je 30 ml Äther extrahiert. Die wässrige Phase wird auf eine in H+-Form befindliche Dowex-50-Säule aufgebracht und mit Wasser eluiert. Das Eluat wird im Vakuüm eingedampft und der Rückstand aus einem 2:1-Gemisch von Aceton und Wasser umkristallisiert. Man erhält 0,8 g y-L-Glutamylcholaminphosphat.

Beispiel 36

4,68 ml (5 mMol) Phosphoroxychlorid werden unter Kühlen und Rühren in 1,8 ml Wasser eingetropft (Biochem. Préparation 6, 76, 1958). Der Lösung werden in kleinen Portionen 1,9 g (10 mMol) y-L-GIutamylcholamin zugesetzt (hergestellt aus Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylcholamin gemäss Beispiel 35). Das Gemisch wird bei 60° C 2 Stunden lang gerührt, nach dem Abkühlen unter Rühren mit 0,72 ml Wasser versetzt und dann bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang stehengelassen. Anschliessend werden unter Rühren 10 ml 96%iger Äthylalkohol und danach 10 ml Äther zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei 4° C eine Nacht lang stehengelassen und dann mit 5 ml 96%igem Äthanol versetzt. Die ausgefallene Substanz wird abfiltriert, zuerst mit Äthanol, dann mit Äther gewaschen und schliesslich aus einem Gemisch von Äthanol und Wasser umkristallisiert. Man erhält 1,75 gy-L-Glutamylcholaminphosphat.

Beispiel 37

4,14 g (10 mMol) CarbobenzyIoxy-y-(a-benzyl)-L-glut-amylcholamin werden in 40 ml Pyridin gelöst und die Lösung auf —10° C gekühlt. In kleinen Portionen werden unter intensivem Rühren 2,1 g (11 mMol) p-Toluolsulfonylchlorid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 0° C 3 Stunden lang gerührt und dann auf 40 g schmelzendes Eis gegossen. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und schliesslich aus einem Gemisch von Äthanol und Petroläther umkristallisiert. Das Produkt wird auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise einer katalytischen Hydrierung unterzogen. Der nach dem Hydrieren erhaltene und getrocknete Stoff wird in 30 ml Wasser gelöst, die Lösung wird mit 10,1 g (40 mMol) Natriumsulfit-heptahydrat versetzt. Die Lösung wird bei 40° C 24 Stunden lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und auf eine Dowex-50-Säule aufgebracht, von der er mit Wasser eluiert wird. Das Eluat wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand über Kaliumhydroxyd getrocknet. Nach Umkristallisieren aus 80%igem Äthanol werden 1,6 g y-L-Glutamyltaurin erhalten.

Beispiel 38

Zu 4,14 g (10 mMol) Carbobenzyloxy-y-(a-benzyl)-L-glutamylcholamin werden 15 ml Thionylbromid gegeben, und das Gemisch wird 3 Stunden lang gerührt. Danach wird Äther zugesetzt, der sich ausscheidende Niederschlag abfiltriert und aus einem Gemisch von Aceton und Petroläther umkristallisiert.

Die erhaltene Substanz wird in einem Gemisch aus Dimethyl-formamid und Wasser gelöst, und der Lösung werden unter Rühren 10,1 g (40 mMol) Natriumsulfit-heptahydrat zugesetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur, dann weitere 6 Stunden bei 50° C gerührt und schliesslich filtriert. Die klare Lösung wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise katalytisch hydriert. Die nach dem Hydrieren erhaltene und getrocknete Substanz wird in wenig Wasser gelöst, auf eine Do-wex-50-Säule aufgebracht und mit Wasser eluiert. Das Eluat wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand aus 80%igem Äthanol umkristallisiert. Man erhält 1,2 gy-L-Glut-amyltaurin.

Beispiel 39

3,71 g (10 mMol) Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-a-benzylester werden in 60 ml Acetonitril gelöst. Die Lösung wird auf —15° C gekühlt und unter Rühren zuerst mit 1,4 ml (10 mMol) Chlorameisensäureisobutylester, dann mit 1,4 mL (10 mMol) Triäthylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten lang bei —15° C gerührt, dann werden 2,05 g (10 mMol) Bromäthylamin-hydrobromid, 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin und 40 ml auf -15 °C gekühltes Acetonitril zugesetzt. Das Gemisch wird bei —15° C 2 Stunden lang, dann bei Zimmertemperatur noch weitere 4 Stunden lang gerührt. Anschliessend wird filtriert und das Filtrat im Vakuum bei 35° C eingedampft. Der Rückstand wird in einem Gêmisch aus Di-methylformamid und Wasser gelöst und die Lösung mit 10,1 g Natriumsulfit-heptahydrat versetzt. Nach Aufarbeiten des Gemisches auf die im Beispiel 38 beschriebene'Weise erhält man 1,45 g y-L-Glutamyltaurin.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

617 183

Beispiel 40

4,43 g (10 mMol) Carbobenzyloxy-L-pyroglutaminsäure-dicyclohexylamin-Salz (Liebigs Annalen 640, 145, 1961), 1,25 g (10 mMol) Taurin und 0,84 g (10 mMol) Natriumhy-drogencarbonat werden in 50 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird 4 Stunden lang erwärmt (oder bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang stehengelassen) und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Wasser gelöst, auf eine Do-wex-50-Säule aufgebracht und mit Wasser eluiert. Das Eluat wird eingedampft. Die erhaltene Substanz wird auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise katalytisch hydriert. Nach Umkri-5 stallisieren aus einem Äthanol-Wasser-Gemisch erhält man 2,03 g y-L-Glutamyltaurin.

s

Claims

617 183

/ <1

W - CH - CÛ - A

(CH,)

1

- CII - CO

^ (L0), I ?

cckaJ

- A-t

(u)
2'n

CO - N - (CHz)m - S R

oxydiert und in den erhaltenen Verbindungen die vorhandenen Schutzgruppen entfernt, sowie die so erhaltenen Verbindungen der Formel (V) in ihre Salze überführt oder aus ihren Salzen freisetzt.

2'n

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der allgemeinen Formel (II), vorzugsweise N-Carbobenzyloxyaminocarbonsäure-a-benzyl-co -p-nitrophenylester in einem Gemisch aus Pyridin und Wasser mit Verbindungen der allgemeinen Formel (III), vorzugsweise mit Taurin, N-Methyltaurin, Homotaurin, Cholaminphosphat oder Cysteminsäure, umsetzt.

(2)

umsetzt und in den erhaltenen Verbindungen die vorhandenen Schutzgruppen entfernt, sowie gegebenenfalls die so erhaltenen Verbindungen der Formel (I) in ihre Salze umsetzt oder aus ihren Salzen freisetzt.

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

R -

HH - CH - COA (f2>D

CO - ÏJ - (CH)

I lo

R

(CH2)t - BJ

(i)

R

wonn

R1 für ein Wasserstoffatom, eine Alkoxycarbonyl-, Cyclo-alkoxycarbonyl-, Aralkoxycarbonylgruppe, durch Halogen, Alkoxy oder Nitro substituierte Aralkoxycarbonylgruppe, durch Alkyl substituierte Aryloxycarbonylgruppe oder Acyl-gruppe,

A1 für eine Hydroxylgruppe oder eine Alkoxy-, Cycloal-koxy-, gegebenenfalls substituierte Aralkoxygruppe mit 1—4 Kohlenstoffatomen im Alkylteil,

R für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1—4 Kohlenstoffatomen,

R2 für ein Wasserstoffatom oder eine Carboxylgruppe und B1 für -S020H, -0S020H oder -OPO(OH)2 steht, n eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 und t 1 oder 2 bedeutet,

sowie von Salzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der allgemeinen Formel (II)

H

\

/

h

■ OH - CO

CO »

Â*
3

617 183

in welcher eine vorhandene a-Aminogruppe und/oder a-Carboxylgruppe geschützt ist und A7 eine Hydroxyl-, Azid-, Suc-cinimidoxy-, p-Nitrophenyloxy-, Pentachlorphenyloxygruppe oder Alkoxycarbonylgruppe mit 2—4 Kohlenstoffatomen bedeutet,

mit Verbindungen der allgemeinen Formel (VII)

im i

E

(\an umsetzt, die erhaltenen Verbindungen der allgemeinen Formel (VIII)

H

\

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppen mit eisessigsaurem Bromwasserstoff, mit in Alkohol gelöstem, trockenem Salzsäuregas oder mit Trifluoressigsäure entfernt.

45

50

55

M - GH - COA

CO - N - (CH2)m-S020H

R

wonn

R1 für ein Wasserstoffatom, eine Alkoxycarbonyl-, Cyclo-alkoxycarbonyl-, Aralkoxycarbonylgruppe, durch Halogen, Alkoxy oder Nitro substituierte Aralkoxycarbonylgruppe, durch Alkyl substituierte Aryloxycarbonylgruppe oder Acyl-gruppe,

A1 für eine Hydroxylgruppe, eine Alkoxy-, Cycloalkoxy-, gegebenenfalls substituierte Aralkoxygruppe mit je 1—4 Kohlenstoffatomen im Alkylteil,

R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1—4 Kohlenstoffatomen bedeutet,

n für eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 und m für 2 oder 3 steht,

sowie von Salzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der allgemeinen Formel (II)

60

R
4

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppen durch katalytische Hydrierung
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in N-Carbobenzyloxy-a-benzylester-derivaten die Carbobenzyloxy-Schutzgruppe durch Verseifen, beispielsweise mit essigsaurem Bromwasserstoff, entfernt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Salzes, dadurch gekennzeichnet, dass eine erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einem Alkali- oder Erdalkalihy-droxyd oder -carbonat oder mit einer organischen Base umgesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer erhaltenen Verbindung der Formel (I) die freie a-Aminogruppe entsprechend R1 acyliert.

7

in welcher eine vorhandene a-Aminogruppe und/oder a-Carboxylgruppe geschützt ist und A7 eine Hydroxyl-, Azid-, Suc-cinimidoxy-, p-Nitrophenyloxy-, Pentachlorphenyloxygruppe oder Alkoxycarbonyloxygruppe mit 2-4 Kohlenstoffatomen bedeutet, mit Verbindungen der allgemeinen Formel (III)

HET !

R

(OH) -(CH2)t - B1

I O

R'

(m)
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer erhaltenen Verbindung der Formel (I) die

30 a-Carboxylgruppe entsprechend A1 verestert.
9. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (V)
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der allgemeinen Formel (II), vor-

s zugsweise N-Carbobenzyloxyaminodicarbonsäure-a-benzyl-w-p-nitrophenylester, in einem Gemisch aus Pyridin und Wasser oder N-Carbobenzyloxyaminodicarbonsäure-a-benzylester in Form seines gemischten Anhydrids mit Cystamin umsetzt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,

io dass man die Verbindungen der allgemeinen Formel (VIII) mit einem Gemisch aus Eisessig und 30%igem Wasserstoffperoxyd umsetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppen mit eisessigsaurem Bromwasser-

is stoff, mit in Alkohol gelöstem, trockenem Salzsäuregas oder mit Trifluoressigsäure entfernt.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen der allgemeinen Formel (IX), vorzugsweise von N-Carbobenzyloxy-a-benzylester-Derivaten,
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen der allgemeinen Formel (IX), vorzugsweise von N-Carbobenzyloxy-a-benzylester-Derivaten,

25 die Schutzgruppe durch Verseifen entfernt.
15. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Salzes, dadurch gekennzeichnet, dass eine erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (V) mit einem Alkali- oder Erdalkali-hydroxyd oder -carbonat oder mit einer organischen Base um-

30 gesetzt wird.

15 entfernt.
16. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer erhaltenen Verbindung der Formel (V) die a-Aminogruppe entsprechend R1 acyliert.
17. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,

35 dass man in einer erhaltenen Verbindung der Formel (V) die a-Carboxylgruppe entsprechend A1 verestert.
18. Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (X)

R1 - IM - OH - CüA1

CO - im - (oh) - (CH2)t - B1

(X)

wonn

R1 für ein Wasserstoffatom, Alkoxycarbonyl-, Cycloalko-xycarbonyl-, Aralkoxycarbonylgruppe, durch Halogen, Alkoxy oder Nitro substituierte Aralkoxycarbonylgruppe, durch Alkyl substituierte Aryloxycarbonylgruppe oder Acylgruppe,

A1 für eine Hydroxylgruppe, Alkoxy-, Cycloalkoxy-, gegebenenfalls substituierte Aralkoxygruppe mit je 1-4 Kohlenstoffatomen im Alkylteil,

R2 für ein Wasserstoffatom oder eine Carboxylgruppe, B1 für -S020H, -OSOzOH, OPO(OH)2 steht,

n eine ganze Zahl zwischen 1 und 3,

t 1 oder 2 bedeutet,

sowie von Salzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (XI)

ii3 - N - OH - CÜ0H

I I

0=C -(CH2)n

(XJJ

R£

^ worin R3 eine Gruppe der Formel R15-0-C-

O

in der R15 für Alkylgruppe mit 1—4 Kohlenstoffatomen, Cy-cloalkylgruppe, gegebenenfalls substituierte Aralkyl- oder gegebenenfalls substituierte Arylgruppe steht, bedeutet,

55 und n die obige Bedeutung hat, oder deren Salz mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (XII)

60

H2N-CH-(CH2)t-B1 R2

(XII)

oder deren Salz, worin R2, B1 und t wie oben definiert sind, umgesetzt und die Schutzgruppe R3 abgespaltet wird und dass gegebenenfalls eine Verbindung der Formel (X) in ein Salz 65 übergeführt oder aus einem Salz freigesetzt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel (XI), vorzugsweise Py-roglutaminsäure, mit Taurin oder Homotaurin umsetzt.

617183
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Salzes, dadurch gekennzeichnet, dass eine erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (X) mit einem Alkalioder Erdalkalihydroxyd oder -carbonat oder mit einer organischen Base umgesetzt wird.

20 die Carbobenzyloxy-Schutzgruppe mit eisessigsaurem Bromwasserstoff entfernt.

20

25

(il) K"
21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer erhaltenen Verbindung der Formel (X) die a-Aminogruppe entsprechend R1 acyliert.
22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer erhaltenen Verbindung der Formel (X) die a-Carboxylgruppe entsprechend A1 verestert.