FI67848C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara esrar av 9-substituerade hypoxantinderivat - Google Patents

Description

67848

Menetelmä terapeuttisesti käytettävien 9-substituoitujen hypoksantiinijohdannaisten estereiden valmistamiseksi

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä tera-5 peuttisesti käytettävän yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava

OH

rV> 10 HC CH CH~

« I J

'1 '2

R OR

1 2 jossa R on 1-8 hiiliatomia sisältävä alkyyli ja R on .jtj karboksyylihapon esteriryhmä. Yhdisteet ovat immunosäätä-jiä, niillä on viruksia ja kasvaimia vastaava teho, varsinkin antileukemiateho ja ne ovat myös entsyymi-inhibiitto-reita. Yhdisteitä voidaan myös käyttää vastaavan alkoholin viemiseen biologiseen järjestelmään, jolloin tällä eräissä 2Q tapauksissa on kasvanut teho.

Esteriryhmän R^ happo-osa voi olla esimerkiksi subs-tituoimattoman alifaattisen monokarboksyylihapon happotähde, esim. 1-18 hiiliatomia sisältävistä hapoista kuten muurahaishappo, etikkahappo, propionihappo, voihappo, valeriaanahappo, 25 isovaleriaanahappo, kapronihappo, kapriinihappo, lauriini-happo, palmitiinihappo, steariinihappo, öljyhappo; tai substituoimattoman alifaattisen dikarboksyylihapon, esim. malonihapon, fumaarihapon, maleiinihapon, meripihkahapon, glutaarihapon happotähde. Dikarboksyylihappojen kanssa 2q muodostuu tavallisesti puoliestereitä, esim. hemimalonaatti, hemifumaraatti, hemimaleaatti ja hemisukkinaatti.

Kaavan (I) mukaisia estereitä valmistetaan siten, 2 että kaavan (I) mukaisen yhdisteen, jossa R :n paikalla on vety, annetaan reagoida karboksyylihappoanhydridin tai 25 karboksyylihappohalogenidin kanssa.

Δ 67848

On näytetty toteen, että monet infektioiden aiheuttajat kuten virukset (influenssavirus, HSV, Friendin leukemisvirus), bakteerit ja sienet aiheuttavat kantajassaan immuniteetin alenemisen heikentäen 5 hänen puolustuskykyään infektioiden aiheuttajien aikaansaamaa tulehdusta vastaan. Useimmat muut virusten vastaiset antimetaboliitit kuten Arac aiheuttavat kantajansa immunologisten puolustusmekanismien heikkenemisen ja tekevät siten mahdolliseksi kehon omien luon-10 nollisten puolustusmekanismien vähenemisen ja sekundää-ri-infektioiden lisääntymisen.

Immunovahvistaja tai immunosäätäjä on jokainen aine, joka joko palauttaa entiselleen heikentyneen immuunivasteen tai vahvistaa normaalia immuunivastet-15 ta tai vaikuttaa molemmin tavoin. Immuunivaste määritellään humoraalisen (vasta-ainevälitteisen) immuniteetin tai soluvälitteisen (tymosyyttivälitteisen) immuniteetin kehittymiseksi ja ilmenemiseksi tai makrofaafi-ja granulosyyttivälitteiseksi vastustuskyvyksi. Se kä-20 sittää loogisesti aineet,jotka vaikuttavat immuunivasteen ilmenemiseen osallistuviin soluihin suoraan tai solu- tai molekyylimekanismeihin, jotka vuorostaan modifioivat immuunivasteeseen osallistuvien solujen toimintaa. Immuunivasteen lisääntyminen voi olla seu-25 rauksena siitä, että aine kumoaa heikentävät mekanismit, jotka johtuvat immuunijärjestelmälle endogeenisis-tä tai eksogeenisistä negatiivisistä feedback vaikutuksista. Siten iitmnovahvis lajilla on vaihtelevia vaikutus- 67848 mekanismeja. Huolimatta vaihtelevuudesta jota esiintyy sekä siinä, mihin kohtaan solussa immunovahvistajat vaikuttavat, että niiden biokemiallisessa vaikutusmekanismissa niiden käyttö on olennaisesti sama, toisin 5 sanoen kantajan vastutuskyvyn lisääminen.

Immunovahvistajien käyttö 1) Immunosysteemin pääasiallinen suojavaikutus koskee vastustuskykyä patogeenien, joihin kuuluvat virukset, riketsiat, mykoplasmat, bakteerit, sienet 10 ja kaiken tyyppiset parasiitit, hyökkäystä vastaan.

Siten immuunivasteen vahvistaminen, varsinkin mikäli se on heikentynyt, on omiaan parantamaan vastustuskykyä minkä tahansa yllä mainitun patogeenin aiheuttamaa tulehdusta tai vaivaa vastaan. Immunovahvistajaa 15 voidaan käyttää yksin tai yhdessä infektiota vastustavan hoidon kanssa kaikkiin infektiosairauksiin.

2) Immunosysteemin toisen suojavaikutuksen oletetaan olevan vastustuskyky vieraita kudossiirroksia vastaan, ovatpa nämä sitten luonnollisia kuten sikiö-emo- 20 suhteessa tai keinotekoisia kuten kudossiirtolääkärin suorittamat. Immunovahvistajia voidaan käyttää myös sikiö- tai istukkakudosten poistumisen aikaansaamiseen tai sietokyvyn modifiointiin tai aikaansaavtiin siirrännäisten suhteen.

25 3) immunosysteemin kolmannen suojavaikutuksen oletetaan olevan vastustuskyky pahanlaatuisten solujen kehittymistä vastaan kuten syövän ollessa kyseessä. Immunovahvistajia voidaan käyttää syövän hoitoon kasvaimen torjumisen vahvistamiseksi ja kasvaimen uusiutuko misen ehkäisemiseen muun tyyppisten hoitojen jälkeen.

4) Neljäs suojavaikutus käsittää kyvyn tunnistaa vieras ilmiö ja säilyttää inerttisyys sitä kohtaan positiivisilla suppressorimekanismeilla. Autoimmuniteetissa ja sen kaltaisissa häiriötiloissa inmunoreaktiivisuus 4 67848 itse antigeenejä kohtaan tai vahvistuneet, kohonneet reaktiivisuudet ovat ilmeisiä ja ne ovat itsetuhoa aiheuttavia. Immunovahvistjia voidaan käyttää normaalien suppressorimekanismien palauttamiseen ennalleen, 5 sietokyvyn aikaansaamiseen ja muutenkin normaalin immuunivasteen edistämiseen.

Jokaista immunosysteemin suojavaikutusta voidaan muuttaa epäspesifisellä hoidolla joko iirmunovahvista-jilla yksin tai yhdessä noiden aineiden kanssa, joita 10 käytetään vastutuskyvyn parantamiseen tai hyökkäävän patogeenin tappamiseen. Lisäksi voidaan spesifistä vastustuskykyä lisätä käyttämällä immunovahvistajia yhdistettynä jonkinlaiseen antigeeniin kuten rokotteissa, joissa käytetään esimerkiksi viruksia, kasvainsolu-15 ja jne. Tämän käytön tarkoituksena voi olla joko spesifisen immuniteetin tai sietokyvyn aikaansaaminen. Viimemainitusta esimerkkinä voidaan esittää käyttö antigeenin kanssa allergiassa tai autoimmuniteettisairauksissa. Immunovahvistajien käyttö voi olla joko hoitavaa tai en-20 naita ehkäisevää: viimeksi mainittua varsinkin myöhemmällä iällä, jolloin tulehdukset, autoimmuniteetti ja syöpä ovat yleisempiä. Annon ajoitus ja antotavat vaih-televat ja ne voivat olla kriittisiä, koska ne voivat ratkaista, saavutetaanko positiivinen tai negatiivinen 25 tulos. Mikä tahansa aine, joka kykenee lisäämään immuunivastetta voi inhiboida sitä ajoituksesta ja annostuksesta riippuen; siten tietyissä olosuhteissa immunovahvista jaa voidaan käyttää immunoheikentävänä aineena allergiassa, autoimmuniteetissa ja siirrännäisissä.

30 Kun R1 on heksyyli, on vastaava alkoholiosa erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)hypoksantiini, jota on tutkittu tunnusnumerolla NPT 15392. Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluvia yhdisteitä ovat erytro-9-(2-asetoksi-3-nonyyli)hypoksantiini (tunnus NPT 15458, 5 67848 katso esimerkki) ja erytro-9-(2-sukkinoksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (tunnus NPT 15457, katso esimerkki 2).

Muita keksinnön piiriin kuuluvia yhdisteitä ivat esimerkiksi taulukossa 1 esitetyt. Taulukossa 1 kaikki alkyyli-1 5 ryhmät R ovat n-alkyylejä.

67848

Taulukko 1 5 r1 r2 0 C6H13 CH3CH2C- 0

II

10 C6H13 CH3CH2CH2C- 0 C6H13 CH3(CH2)14C-

15 O

C6H13 ch3(Ch2)16c~

O

C6H13 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)70 (cis) 20

O

II

c6h13 hoocch2c- o 2 5 1' C6Hi3 HOOCCH=CHC- (cis)

O

H

C6H13 HOOCCH=CHC- (trans) 30

O

II

c6h13 hoocch2ch2co- 0

II

35 C6H13 HOOC(CH2)3C- 7 67848

Taulukko 1 (jatkoa) 0 CH3 CH3C~ 0 5 " C Hr CH-C- 2 5 3 0 C~Hc HOOCCH_CH_C-

Z D Z Z

o 10 C3H7 CH3a- o C3H7 HOOCCH2CH2C- o 15 C4H9 CH3^~

O

C5H11 CH3^- 0 ΟςΗ HOOCCH_CH_C-

20 571 * Z

O

c?h15 ch3c- o C7H15 HOOCCH2CH2C- 25 o C8H17 CH3^- 0

CgH17 HOOCCH2CH2C- 30 8 67848 ΝΡΤ 15392:n on aikaisemmin osoitettu omaavan virusten vastainen, immunosäätävä ja kasvainten vastainen teho .

Tässä esitetyt tulokset osoittavat että (1) voidaan 5 valmistaa 15392:n uusia johdannaisia, jotka (2) voivat muuttua biologisessa järjestelmässä aktiiviaineeksi (NPT 15392), (3) saavat aikaan aktiiviaineen (NPT 15392) suurempia pitoisuuksia veressä ja siten lisäävät NPT 15392:n tehoa.

10 Seuraavassa taulukossa esitetään yhteenvetona muutamien keksinnön mukaisten yhdisteiden kemialliset ominaisuudet.

Vaatimusten mukaisia yhdisteitä tyypillisesti edustavien esimerkkiyhdisteiden kemialliset ominaisuudet_ 15 Sulamis- teo- todet- piste ria tu

Erytro-9-(2-asetoksi-3-nonyyli)- hypksantiini (NPT 15458)* 150-151 c C 59,97 59,83 H 7,55 7,42 2Q N 17,48 17,39

Erytrp-9-(2-sukkinoksi-3-nonyy-li)hypoksantiini(NPT-15457)xx / xlO3 max m mm pH 1,0 pH 7 pH 9,5 pH 1 pH 7 25 250/9,7 249,5/10,1 254/10,06 220 222,5 250/- 249/- 254/ 222 223 XHLPC - Yksinkertainen UV-huippu 5^,u spherosorb 30 0DS 2,1 x 250 mm-kolonnissa käytettäessä liuottimena 65 % metanoli: 35 % 0,05 M H^PO^.

^Yksinkertainen UV-huippu 5^u ultrasphere 0DS 4,6 x 250 mm-kolonnissa käytettäessä liuottimena 65 % metanoli: 35 % 0,05 M H3PO4.

9 67848

Keksinnön mukaisia inmunovahvistajia voidaan käyttää esimerkiksi kestokyvyn aikaan saamiseksi taulukossa A esitettyjen virusten hyökkäystä vastaan.

Taulukko A

5 Virus Luokka Sairaus

Arenavirus RNA Rift Valley-kuume

Influenssa RNA Influenssa

Rhinovirus RNA Tavallinen vilustu minen 10 Polio RNA Polio

Measles RNA Vihurirokko

Newcastle disease-virus RNA Newcastlen tauti

Rotavirus RNA Lasten suolistotu lehdus 15 Hepatiittivirus A RNA Epideeminen hepatiitti

Rabies RNA Vesikauhu

Arbovirus RNA Enkefaliitti

Vaccinia DNA Isorokko

Herpes simplex DNA Yskänrokko-enkefa- liitti,sukupuoliko tauti

Herpea zoster DNA Vyöruusu

Varicella zoster DNA Vesirokko

Adenovirus DNA Hengitystieinfektio

Hepatiittivirus B DNA Krooninen hepatiitti, 25 vakava hepatiitti

Suu- ja sorkkatautivirus DNA Suu- ja sorkkatauti

Machupo DNA Hemorraginen kuume

Yhdisteet ovat erityisen käyttökelpoisia RNA-viruksia vastaan.

30 Keksinnön mukaiset yhdisteet ja koostumukset ovat käyttökelpoisia nisäkkäiden (ja näiden solujen) käsittelyyn mukaanlukien ihminen, sika, koirat, kissat, nautakarja, hevoset, lampaat, vuohet, hiiret, kaniinit, rotat, marsut, hamsterit, apinat jne.

10 67848

Mikäli toisin ei ole ilmoitettu, ovat kaikki prosentit painoprosentteja.

Kaikki lämpötilat on ilmoitettu Celsius-asteina, mikäli toisin ei ole mainittu.

5 Koostumukset voivat sisältää, koostua olennai sesti tai koostua esitetyistä aineista ja menetelmät voivat sisältää, koostua olennaisesti tai koostua vaiheista, jotka on esitetty näiden aineiden yhteydessä.

Koostumuksia voidaan antaa nisäkkäille tavano- 10 maisilla tavoilla, esim. oraalisti, nenän kautta, rek-taalisesti, vaginaalisti tai parenteraalisti. Niitä voidaan käyttää ruiskeina annettavina liuoksina, esim. vedessä, tai tabletteina, pillereinä, kapseleina jne.

Edullisten sovellutusmuotojen kuvaus 15 Esimerkki 1

Erytro-9-(2-asetyylioksi-3-nonyyli)hypoksan-tiinin (NPT 15458) ("Asetyylinonyylihypoksantiini) synteesi 20

OH

Ar\ k, ly , H - C- C-CH3 30 (CE.)_ 0- C-CH-, 2 5 μ 3 0 CH_ j

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)hypoksantiini, NPT 15392 (2,78 g, 10 mmol) liuotettiin pyridiiniin 67848 (120 ml) ja lisättiin etikkahappoanhydridiä (3 ml, 30 mmol). Liuos pidettiin 25°C:ssa 24 tuntia. Lisättiin etanolia (50 ml) ja liuos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Tämä toimenpide toistettiin 4 kertaa pyri-5 diinin poistamiseksi. Jäännökseen lisättiin eetteriä (150 ml) ja muodostunut kiinteä aine otettiin talteen suodattamalla. Sakka pestiin kolmesti eetterillä. Saatiin valkea kiteinen aine. (2,51 g, 80 %), sp.l50-151°C .

UVmax(H20, pH 5,5) 249 nm· \ 10,1 x 1q3' IR 1700 «n"1 10 (C=0) .

Analyysi yhdisteelle ci6H24N4^3 Las,cettu: c 59,97, H 7,55, N 17,48. Todettu: C 59,83, H 7,42, N 17,39.

Nouseva kromatografia (VJhatman-paperi W 1) Rf-arvot: n-butanoli/H20/Ac0H (2:1:1) = 0,92; etanoli/ 1 M ammo-15 niumasetaatti (14:6) = 0,88; iso-propanoli/väkevä am-moniakki/H20 (7:2:4) = 0,90.

Esimerkki 2 E rytro-9-(2-sukkinoksi-3-nonyy1i)hypoks anti i-20 nin (sukkinyylinonyylihypoksantiini) (NPT 15457) synteesi

25 X

I I > I i 30 HC- C-CR, I |

<CH,), O- C-CH2-CH2- C-OH

I II 1 CH3 o o 67848 600 mg erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)hypoksantiinia (NPT 15392) (2,2 mmol) ja 1 g meripihkahappoanhydridiä (10 mmol) liuotettiin minimimäärään pyridiiniä sekoittaen. Liuosta kuumennettiin varovasti (noin 30°C) sekoitta-5 en jatkuvasti 10 vuorokauden ajan.

Pyridiini poistettiin käyttäen pyörivää haihdu-tinta ja jäännöstä uutettiin 20 ml :11a absoluuttista etanolia 48 tuntia. Tämä liuos sentrifugoitiin ja emäliuos puhdistettiin preparatiivisella ohutkerroskromatografi-10 alla (2 mm piigeeli 60, n-butanoli : 2N NH^OH 10:2, ti-lavuusosia). Rf-arvossa 0,17 oleva nauha eluoitiin absoluuttiseen etanoliin. Tuotteen puhtaus määritettiin ohutkerroskromatografiällä ja UV-spektrofotometrialla.

Kemiallinen pysyvyys 15 Taulukossa 3 esitetyt tulokset osoittavat sel västi, että esterit NPT 15458 ja NPT 15457 ovat pysyviä inkuboitaessa 37°C:ssa ja neutraalissa pH:ssa (7,0, fysiologinen arvo). Se seikka,että emäksinen hydrolyysi pH:ssa 9,5 voi muuttaa sekä asetyyli- (NPT 20 15458) että sukkinyyliesterit (NPT 15457) NPT 15392:ksi on lisätodiste niiden rakenteesta.

13 67848

Taulukko 3 pH:n vaihtelun vaikutus asetoksinonyylihypoksantiinin (NPT 15458) ja sukkinoksinonyylihypoksantiinin (NPT 15457) kemialliseen pysyvyyteen_ 5

Yhdiste (pitoisuus _ % NPT 15392* NPT 15392 (.36 ym/ml) pH 1.0 100 (vertailu) 15 pH 7.0 100 PH 9.5 100 NPT 15457 (0.36 ym/ml) pH 1.0 2 pH 7.0 0 20 pH 9.5 8 NPT 15458 (0.36 ym/ml) pH 1.0 8 pH 7.0 0 pH 9.5 28 25 X 3,5 tunnin inkubointi 37°C:ssa, määritetty käyttäen HPLC.

67848

Virusten vastaiset ominaisuudet NPT 15457:n ja NPT 15458:n kyky estää influenssaviruksen lisääntymistä määritettiin käyttäen hemad-sorptiokoetta. Kuten nähdään taulukosta 4 esituotteella 5 NPT 15458, joka lohkeaa lähes täydellisesti NPT 15392:ksi (aktiivinen lääkeaine), on samanlainen kyky estää virusten kasvua kuin aktiivisella lääkeaineella (NPT 15392). Itse asiassa näyttää siltä, että NPT 15458 voi olla hieman tehokkaampi, mikä mahdolli-10 sesti johtuu NPT 15458:n suuremmasta solunsisäisestä adsorptiosta. Sukkinyylijohdannaisen, joka on negatiivisesti varautunut pH:ssa 7,2, ei voitaisi olettaa tunkeutuvan yhtä helposti soluun eikä se olisi tässä kokesssa yhtä tehokas.

^ Taulukko 4

Sukkinoksinonyylihypoksantiinin (NPT 15457) ja ase-toksinonyylihypoksantiinin (NPT 15458) virusten vas-taisten ominaisuuksien vertailu NPT 15392:een_ 2q Lääkeaine (g/ml) % Influenssaviruksen kasvun esto 0 0,36a 3,6a 10,8a 36a NPT 15392 0 20 30 42 73 (vertailu) NPT 15457 0 18 0 18 13 25 NPT 15458 0 26 40 80 88 apito.isuus nmol/ml

Immunosäätävä vaikutus NPT 15392:n asetoksi- (NPT 15458) ja sukkinoksi -3φ (NPT 15457) esterien kyky säädellä immunosysteemiä määritettiin sekä in vitro että in vivo seuraavilla kokeilla: 1. Mitogeenilla indusoitu imusolujen lisääntyminen käyttäen hiiren pernasoluja (in vitro).

2. Mitogeenilla indusoitu imusolujen lisäänty- 15 67848 minen käyttäen ihmisen perifeeriveri-imusoluja (HPBL) (in vitro).

3. Aktiivisten kerästen (rosettien) muodostumisen lisääminen (in vitro) 5 4. IgM-vasta-aineen muodostumisen kasvu hiiris sä, jotka on inmunoitu lampaan veren punasoluilla (SRBC) (in vivo).

1. Taulukossa 5 esitetyt arvot osoittavat selvästi NPT 15458:n kyvyn lisätä PHA:n aiheuttamaa imu- 10 solujen lisääntymistä mitattuna tritioidun tymidiinin avulla. Todettiin noin 25 %:n nousu käytettäessä NPT 15458:n pitoisuutta 50^ug/ml. Samanlainen kasvu havaittiin käytettäessä 10^,ug/ml NPT 15392: a.

2. Taulukossa 6 esitetyt arvot osoittavat sel-15 västi, että ekvimolaariset määrät NPT 15457:ä ja NPT 15458:a ovat tehokkaita kohottamaan PHA:n aiheuttamaa imusolujen lisääntymistä käytettäessä HPBL. Tämä on mielenkiintoista taulukossa 9 esitettyjen tulosten valossa,, jotka osoittavat että HPBL lohkaisee 20 kummankin esterin NPT 15392:ksi. NPT 15458, joka lohkeaa suuremmassa määrin kuin NPT 15457 (katso taulukko 9) on tehokkaampi vahvistaja (taulukko 6, 1,48 vast. 1,28) PHA:n aikaansaamalle muuttumiselle.

3. Kuten voidaan huomata taulukosta 7 sekä 25 NPT 15457 että NPT 15458 ovat tehokkaita säätämään aktiivisten rosettien muodostusta HPBL:ssa. On mielenkiintoista havaita että kokeessa W=l, jossa placebo-käsitellyillä imusoluilla on hyvin vähän aktiivirosette-ja (immunovajavuus) NPT 15457 ja NPT 15458 palautta-30 vat alentuneen immuniteetin normaalitasolle yhtä tehokkaasti kuin NPT 15392. Kokeessa #2 placebo-käsittelyis-sä vertailunäytteissä on epänormaalin korkeita aktiivi-rosettien määriä. Tässä tapauksessa NPT 15392 ja NPT 15458 pystyvät alentamaan normaaliarvojen korkeat 35 tasot ja osoittavat siten todeksi näiden lääkeaineiden 1 6 67848 immunosäätävät ominaisuudet.

4. NPT 15457:ää ja NPT 15458:aa ja "aktiivista" lääkeainetta, NPT 15392, annettiin Balb/c-hiirille, jotka oli immunoitu lampaan veren punasoluilla SRBC.

5 Määritettiin vasta-aineen muodostuminen SRBCreen. On mielenkiintoista havaita, että NPT 15458 ja NPT 15392 olivat erittäin tehokkaita IgM-vasta-aineiden muodostumisen säätelyssä. Tutkituissa pitoisuuksissa NPT 15392 suurentaa IgMrn muodostumista 46 %:lla.

10 Suuremmat NPT 15392-annokset aiheuttavat pienemmän kohoamisen tai pienentävät muodostumista vertailuarvoihin nähden. On mielenkiintoista havaita, että NPT 15458, joka muuttuu NPT 15392:ksi ja johtaa ainakin 10-kertaisiin veren NPT 15392-pitoisuuksiin (tauluk-15 ko 10) saa aikaan IgM-muodostumisen estymisen (taulukko 8). Tämän oletetaan johtuvan siitä, että NPT 15458 saa aikaan hyvin suuria NPT 15392-pitoisuuksia, jotka mitä todennäköisimmin inhiboivat IgMrn muodostumista. Taulukossa 8 esitetyt tulokset osoittavat NPT 15457:n 20 ja NPT 15458rn immunosäätävän tehokkuuden. Huomattakoon, että NPT 15457:n teho on pienempi kuin NPT 15458:n teho ja että pienempi osa NPT 15457rää muuttuu NPT 15392rksi kuin NPT 15458raa (taulukko 10).

17 67848

Taulukko 5

Asetoksinonyylihypoksantiinin (NPT 15458) immunosää-tävät ominaisuudet: In vivo mitogeeni-indusoidun imusolujen lisääntymisen stimuloituminen hiiren pernaso-^ luissa

Sykliä minuutissa yhteensä

Yhdiste (pitoisuus ng/ml) -PHA +PHA S.I.a D/C

10------ 0 (C) 137 64,647 471 NPT 15392 10 ng/ml (D) 117 68,804 588 1.25 NPT 15458 10 ng/ml (D) 153 66,800 436 .93 15 NPT 15458 50 ng/ml (D) 138 81,297 589 1.25 g S.I. on stinulaatioindeksi

Taulukko 6 18 67848

Sukkinoksinonyylihypoksantiinin (NPT 15457) ja asetok-sinonyylihypoksantiinin (NPT 15458) immhnosäätävät ominaisuudet; mitogeeni-indusoidun imusolujen lisäänty- 5 misen kasvu ihmisen perifeeri-veri-imusoluissa.

Sykliä minuutissa yhteensä

Yhdiste n mol /ml -£HA +EHA S.I. D/C

10 ΝΡΓ 15392* 0 (C) 379 59,404 156 0.036 (D) 297 59,167 199 1.27 0.36 (D) 57T 69,057 120 .76 • 3.6 (D) 381 67,328 176 1.128 NPT 15457 0 (C) 277 54,015 195 0.036 (D) 240 59,569 250 1.28 20 0.36 (D) 228 59,689 261 1.33 3.6 (D) 232 52,149 224 1.14 NPT 15458 0 (C) ' 277 54,015 195 25 0.036 (D) 214 59,898 280a 1.43 0.36 (D) 221 63,858 289a 1.48 3.6 (D) 238 69,055 290a 1.48 arvot ovat kolmen kokeen keskiarvoja 30 a p40,05 19

Taulukko 7 67848

Asetoksinonyylihypoksantiinin (NPT 15458) ja sukkinok-sinonyylihypoksantiinin (NPT 15457) inmunosäätävät ominaisuudet: Aktiivisten E-roSettien muodostumisen lisääntyminen % aktiiveja Pitoisuus E-rosetteja 10

Yhdiste n mol /fal) (x ί S.E«) #1 $2

Placebo (0) 9.23 ± 2.9 34.2 ± 6.6 15 (vertailu) NPT 15392 (3.6) 16.2 ± 1.0 (Vertailu) (0.36) - 15.4 ± 2.9a 20 NPT 15457 (3.6) 24.8 ± 6a (0.36) - 33.6 ± 2.4 25 -:- NPT 15458 (3.6) 19.4 ± 1.0a (0.36) - 23.25 ± 1.24a 30 a p< 0,05 placebo-vertailunäytteeseen nähden

Taulukko 8 20 67848

Asetoksinonyylihypoksantiinin (NPT 15458) ja sukki- noksinonyylihypoksantiinin (NPT 15457) immunosäätä- vät ominaisuudet: IgM-vasta-aineen tuotannon esto 5 SRBC-immunoiduissa Balb/C-hiirissä

Koe § IgM-plakke- Vertai- # - , _ja luarvosta * Aine Annos i.p. (X ± S.E.) % 1 NPT 15392 (1.80 n mol Ag x 4) 41 ± 4 146a 2 (.18 n mol Ag x 4) 68 ± 2 147a 15________ _ 1 NPT 15457 (1.8 n mol Ag x 4) 19 ± 3 68a 2 (.18 n mol Ag x 4) 47 ± 3 102 20 1 NPT 15458 (1.8 n mol Ag x 4) 8 ± 1 28.5a 2 (.18 n mol /g x 4) 11 ± 1 23.9a 25 1 Vertailu (placebo x 4) 28 ± 2 100 2 (placebo x 4) 46+2 100 a D < 0 01 verrattuna placebo-vertailunäytteeseen 30 - 21 67848

Metabolinen muuttuminen

Kuten voidaan nähdä taulukosta 9 "esiasteiden" NPT 15457 ja NPT 15458 inkubointi yhdessä "vero"-solujen (Afrikkalaisen vihreän apinan munuaissoluja), 5 maksahomogenaatin ja ihmisen perifeeri-veri-imusolu-jen (HPBL) kanssa johtaa "aktiivisen" lääkeaineen NPT 15392 muodostumiseen. NPT 15458 näyttää konvertoituvan NPT 15392:ksi suuremmassa määrin kuin NPT 15457.

10 Taulukon 10 arvot osoittavat, että sekä NPT

15457 että NPT 15458 voivat absorboitua vereen i.p.-annon jälkeen ja että NPT 15458:n anto johtaa lähes 12 kertaa suurempiin NPT 15392:n pitoisuuksiin kuin jos annetaan NPT 15392:a sellaisenaan. Tämä todistaa 15 selvästi, että NPT 15458 ja NPT 15457 voivat tuottaa NPT 15392:a in vivo ja edelleen, että ainakin toinen näistä johdannaisista saa aikaan paljon suurempia pitoisuuksia veressä ja siten suuremman aktiivisuuden.

22 67848

Taulukko 9 NPT 15392:n muodostuminen asetoksinonyylihypoksan-tiinista (NPT 15458) ja sukkinoksinonyylihypoksan- tiinista (NPT 15457) biologisesti.

5

Yhdiste % NPT 15392a aikana (h) _0_0_£_5_24_ NPT 15392 Vero-solut 100 - 100

Maksa-homoge- 10 naatti 100 100 HPBL 100 - 100 NPT 15457 Vero-solut 0 - 0

Maksa-homoge- naatti 0 14 15 HPBL 0 - 18,2 NPT 15458 Vero-solut 0 50

Maksahomogenaatti 0 70 HPBL 0 - 10 0 20

a Määritetty käyttäen HPLC

Taulukko 10 23 6 7 8 4 8 NPT 15392:n muodostuminen, kun asetoksinonyylihypok- santiinia (NPT 15458) ja sukkinoksinonyylihypoksan- tiinia annettiin i.p. hiirille 5

Annettu Eläin f/ Pitoisuus veressä Cum/mlxlO^) yhdiste NPT 15392 NPT 15457' NPT 15458 NPT 15392 1 0,22 2 0,68 10 NPT 15457 1 0,47 1,4 2 0,22 0,57 NPT 15458 1 8,2 - 0 2 2,7 - 0 15 X (360^um/kg)

Erytro-9-(2-asetoksi-3-nonyyli)hypoksantiinin vaiku-2Q tus kasvainsolujen (leukemia) kasvuun in vivo

Yhdiste (pitoisuus) Kasvun esto, % 8068 ( ihminen) _L1210(hiiri__ NPT 15458 (10 ug/ml 40 32

Taulukko 11 24 6 7 8 4 8

Yhteenveto biologisista ominaisuuksista Ominaisuus_NPT 15457__NPT 15458_NPT 15392 e:

Muutettavissa NPT 15392:ksi Kemiallisesti pH 9,5 Kyllä Kyllä Ei käyttökelpoinen pH 7,0 Ei Ei Ei käyttökelpoinen

Biologisesti HPBL 18 100 Ei käyttökelpoinen

Maksa 14 70 Ei käyttökelpoinen

Vero 0 50 Ei käyttökelpoinen

Hiiri 25 100 Ei käyttökelpoinen Ί ^

Biologinen aktiivisuus

Virusten vastainen (in Hyvin Kyllä Kyllä (73 %) vitro heikko (88 %)

Immunosäätä-20 vä(in vitro)

Imusolujen li- Kyllä Kyllä sääntyminen (+14-28 %) (+43-48 %) Kyllä(+12-27 %)

Imuunosäätävä (in vitro) Kyllä Kyllä Kyllä

Pesette ja (+166 %) (+11 %) (+78 %) 2 b

Immunosäätä- Kohtalainen Kyllä Kyllä vä (in vivo) (0-60) (-72 %) (+46 %)

SRBC-IgM

Seuraavia menetelmiä käytettiin yllä esitettyjen aminai-3Q suuksien määrittämiseksi.

25 67848 A. Soluvil jelymenetelmät A."Hela"- tai "vero"-solujen lisääntyminen 1. Soluviljelmiä kasvatetaan 120 cm3:n pulloissa yksisolukerroksina seuraavalla tavalla: 5 2. Väliaine kaadetaan pois ja yksisolukerros pestään kahdesti käyttäen pesukertaa kohti 50 ml kalsiumista ja magnesiumista vapaata fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS) pH:ssa 7,2.

3. Lisätään yksi ml trypsiini-EDTA-liuosta, joka ^ sisältää 0,5 g trypsiiniä (1:250) ja 2,0 g EDTA:a litrassa Hanksin tasapainotettua suolaliuosta (Hanks balanced salt solution, HBSS) jossa ei ole Ca++ eikä

Mg++, 37°C:ssa kuhunkin pulloon ja dispergoidaan yksisolu- kerrokselle ravistamalla kevyesti.

15 4. Pullot sijoitetaan sitten inkubaattoriin 37°C:een noin 3-5 minuutiksi riippuen ajasta, joka tarvitaan solujen siirtymiseen paikoiltaan. On tarpeen ravistella käsin.

5. Kymmenen ml ravintoliuosta lisätään kuhunkin 20 pulloon ja solut hajotetaan siihen imemällä suspensio pipettiin ja poistamalla se siitä. Tämä tehdään kymmenen kertaa.

6. Pullosarjan sisällöt yhdistettiin ja suspensio laimennettiin solujen suhteen ravintoliuoksella pitoi- 25 suuteen 7-8,5 x 10^ solua/ml.

7. Ravintoliuos käsitti seuraavan koostumuksen: Earle-suoloja ja HEPES-puskuria sisältävä Minimun Essential Medium Eagles (MEM) täydennettynä lisäämällä seuraavia aineita 100 ml:aa kohti MEM: 30 10 ml sikiöasteisen vasikan seerumia (loppu- pitoisuus 10 %) 1 ml 1-glutamiinia (200-molaarista) 1 ml seosta, jonka muodostivat 10 000 yksikköä penisilliiniä, 10 OOO^ug streptomysiiniä 35 ja 10 000 neomysiiniä.

26 67848 8. Soluja kasvatetaan Costar-kudosviljel joista kullakin on 24 tasapohjaista syvennystä, kunkin syvennyksen tilavuuden ollessa 3 ml; soluviljelys-suspensiota (1 ml) pannaan jokaiseen syvennykseen.

5 9. Yksisolukerroksia käytetään tutkimukseen, kun niillä on melkein yhtenäinen kasvusto (noin 1-2 vuorokautta) .

10. Solu Iinjojensäilyttämiseen käytetään eri pulloja. Säilytysliuos koostuu MEM:sta sekä lisäaineista 10 (katso kohta 7) kuitenkin niin, että FSC-määrä on vähennetty vastaamaan loppupitoisuutta 5 %.

B. Veren punasolut 1. Verta otetaan sydänpunktiolla Hartly-rotui-sista urosmarsuista.

15 2. Noin 10 ml verta sekoitetaan 25 ml:aan

Alsever-liuosta ja sitä voidaan säilyttää 4°C:ssa enintään 1 viikko.

3. Juuri ennei käyttöä veren pmasolu t (RBC) pestään kolmesti fosfaatti-puskuroidulla suolaliuok- 20 sella (PBS), pH 7,2.

4. Jokaisen pesun jälkeen punasolususpensiota sentrifugoidaan 10 minuuttia 450 g:n voimalla huoneenlämmössä.

5. Tehdään 0,4-tilavuusprosenttinen veren puna-25 solususpensio Hanksin tasapainotetun suolaliuoksen avulla.

C. Virusten lisääntyminen munassa A. Infektointi 1. Yhdeksästä kymmeneen vuorokautta haudotut 50 kananmunat valaistaan elinvoimaisuuden toteamiseksi ja ilmarakon sijainti merkitään kuoreen lyijykynällä. Kyseenalaiset munat (ei liikettä tai värin haalistuminen) hylätään.

2. Kuoren pinta desinfioidaan 70-%:sella etano-55 lilla ja sen annetaan kuivua.

27 67848 3. Kuhunkin munaan tehdään pieni reikä kuoren läpi steriilillä munanlävistimellä noin 6 mm päähän lyi-jykynäviivasta, jolla ilmarakon paikka on merkitty tämän kehän sisäpuolelle.

r 2 i 5 4. 0,1 ml eri virussuspensioita,. 10 - 10 EID50^i ympätään reiän läpi 1 ml:n tuberkuliiniruiskulla 45°:n kulmassa älläntois-onteloon. Varotaan vahingoittamasta sikiötä tai keltuaispussia.

6. Noin 2,5 cm:n muoviteippipaloja käytetään reikien sulkemiseen ja kukin muna varustetaan tiedolla kyseessä olevasta viruksesta, munan juoksunumerolla ja päivämäärällä.

7. Munia inkuboidaan 35-37°C:ssa 2-5 vuorokautta virusten kasvunopeudesta riippuen. Inkubointiaika 15 ja -lämpötila merkitään muistiin samoin kuin muut asiaankuuluvat tiedot kustakin tapauksesta.

B: Virusten talteenotto allantois-nesteestä 1. Inkubointiajän lopuksi munat jäähdytetään 3-4 tunnin ajan 4°C:ssa, jotta nesteen valuminen allan-20 tois-onteloon virusten talteenoton aikana on mahdollisimman vähäistä.

2. Kuoren pinta desinfioidaan taas 70-%:sella etanolilla ja sen annetaan kuivua.

3. Steriileillä saksilla leikataan kuoresta 25 pala lyijykynäviivaa pitkin ja kalvot poistetaan steriileillä pihdeillä.

4. Pihdit työnnetään varovasti sikiökalvon ja kuorikalvon väliin ja sikiö työnnetään sivuun jolloin muodostuu "tasku" allantois-nesteelle. Varo- 30 taan rikkomasta sisintä sikiökalvoa, amnionia (paitsi tapauksissa, joissa viruksia otetaan talteen myös amnionesteestä), ja pyritään vahingoittamaan istukka-valtimoita mahdollisimman vähän.

28 6 7 8 4 8 5. Steriiliä, valmiiksi varattua 10 ml:n pipettiä jossa on mekaaninen tyhjöpullo, käytetään allan-tois-nesteen ottamiseen ja sen siirtämiseen steriiliin, valmiiksi varattuun sentrifugointiputkeen. Jo- 5 kaisesta munasta voidaan ottaa talteen noin 5-8 ml.

6. Talteen otettu aines sentrifugoidaan 1200 g:11a 10 minuuttia 4°C:ssa.Emäliuokset siirretään steriilei-hin koeputkiin.

7. Jokaisesta erästä otetaan näyteet titratta- 10 vaksi steriilisyyden toteamiseksi. Jäljellä oleva suspensio jaetaan 2 ml:n seerumiputkiin ja merkitään kuhunkin tiedot kannasta,juoksunumero ja päivämäärä.

8. Näytteet jäädytetään välittömästi nestety-pessä ja varastoidaan -70°C:ssa ultrajäädyttimessa tai 15 N2~kryojäädyttimessä.

D. Virusten lisääntyminen kudosviljelmässä A. Infektointi 1. Sopivan solutyypin 24-48 tunnin pintaviljel- 2 miä (monolayer), tavallisesti 250 cm :n kudosviljelmä- 20 pulloissa, valitaan käytettäväksi, kun kasvu on selvästi yhtenäinen.

2. Kaikki infektointi- ja talteenottotoimenpi-teet suoritetaan biologisessa suojakaapissa ja käytetään ainoastaan mekaanisia pipetointilaitteita. Nouda- 25 tetaan steriilitekniikkaa.

3. Infektoitavien viljelmien ravintoliuos korvataan 25 ml:lla säilytysliuosta. Myös vertailuviljel-miin lisätään 25 ml säilytysliuosta.

4. Siemenvirus laimennetaan seerumittcmalla 30 MEM:lla valmistajan antaman ohjeen mukaan tai aikaisemmista titraustuloksista saatujen tietojen perusteella, ja kuhunkin viljelmään (vertailunäytteitä lukuunottamatta) lisätään 0,5 ml.

5. Viljelmiä inkuboidaan 37°C:ssa kosteassa 35 kaasutila ssa jossa on 5 % C02, 95 % ilmaa, 48-72 tuntia, näytteet tarkastetaan päivittäin kullekin virukselle 29 6784 8 luonteenomaisen sytopaattisen vaikutuksen (CPE) kehittymisen havaitsemiseksi.

B. Talteenotto 1. Viljelmät poistetaan virusten talteenottoa 5 varten, kun CPE saavuttaa arvon 3-4+.

0 ei näkyvää sytopaattista vaikutusta 1+ - 25 % soluista osoittaa sytopaattisen vaikutuksen 2+ - 50 % soluista osoittaa sytopaattisen vaikutuksen 10 3+ - 75 % soluista osoittaa sytopaattisen vaikutuksen 4+ -100 % soluista osoittaa sytopaattisen vaikutuksen 2. Viljelmät jäädytetään ja sulatetaan kolme 15 kertaa soluketon hajottamiseksi ja siirtämiseksi paikaltaan. Kolmannen sulatuskerran jälkeen viljelmäneste siirretään steriiliin sentrifugointiputkeen ja sentrifu-goidaan 30 0 g:11a 30 minuuttia solujäännösten poistamiseksi. Tämä virussuspensio tutkitaan bakteerikontami- 20 naation havaitsemiseksi.

3. Emäliuokset jaetaan välittömästi (0,5-1 ml) 2 ml:n steriileihin seerumiputkiin ja jäädytetään nestetypessä.

4. Titraamista varten 24 tasapohjaista syvennys-25 tä käsittävät kudosviljemälevyt valmistetaan ja infek- toidaan seuraavasti: a) Viruksen kymmenkertaisten laimennosten sarja tehdään kylmään säilytysliuokseen, joka on 5-%:nen va- -1 -7 sikkasikiöseerumi (FCS) (10 - 10 ).

b) Yksi ml kutakin laimennosta pannaan yksittäisiin syvennyksiin kolmena rinnakkaismäärityksenä.

c) Tehdään vertailuviljelmät, jotka sisältävät vain säilytysliuosta.

30 6784 8 5. Viljelmiä inkuboidaan 48 tuntia 37°C:ssa kosteassa, 5 % CC>2 / 95 % ilmaa sisältävässä tilassa 5 ja solukerroset arvostellaan kuten edellä on kuvattu. TCID[.0-arvot määritetään Reed & Munchin titrausmene-telmän mukaan.

E. Hemadsorptiotutkimus 1. Juuri ennen hemadsorptiokokeen suoritusta 10 poistetaan kasvuneste dekantoimalla soluviljelylevyiltä.

2. Yksi millilitra säilytysliuosta lisätään jokaiseen viljelmäsyvennykseen.

3. Kahteen vertailuviljelmäsarjaan lisätään ainostaan säilytysliuosta.

15 4. Kaksi koeviljelmää ja yksi vertailuviljelmä ympätään välittömästi 0,1 ml:11a viruslaimennosta (lisättävät määrät arvioidaan edeltävien HAdFFU-kokei-den mukaan). HAdFFU on hemadsorptiopesäkkeitä muodostava yksikkö.

20 5. Muut vertailunäytesarjät pidetään infektoimat- tomina, lisätään ainoastaan MEM sokeasiirrokseksi.

6. Viljelmiä inkuboidaan 37°C:ssa 16-18 tuntia mikäli ei toisin ole ilmoitettu.

7. Inkubointiajän jälkeen kasvuneste dekantoi - 25 daan pois ja solut pestään kerran PBSrlla pHrssa 7,2.

8. 0,5 ml RBS-suspensiota lisätään kuhunkin syvennykseen ja viljelmät pidetään 30 minuuttia huoneen lämpötilassa.

9. RBC-suspensio dekantoidaan ja viljelmät pes- 30 tään kahdesta kolmeen kertaan PBS:lla muiden paitsi erityisesti sitoutuneiden veren punasolujen poistamiseksi.

10. Lopuksi lisätään kuhunkin syvennykseen 0,1 ml Hanksin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS).

31 67848 11. Hemadsorboituneet punasolupesäkkeet lasketaan aluksi käyttäen Nikon inverted-phase-contrast-mikroskooppia ja 4X-objektiivia.

12. Kussakin tapauksessa valitaan vähintään 5 viisi satunnaista kenttää syvennystä kohti laskettaviksi.

13. HAd-pesäkkeiden laskenta täydennetään käyttäen Baussch & Lomb Omnicon Alpha Image Analyzeria.

14. Mikroskooppikentän kuva heijastetaan 10 Vidicon-heijastimelle. Se esitetään myös televisioruudussa niin että havainnoitsija voi huomata ja vähentää laskuista virheet, jotka johtuvat jäännöksistä. Pesäkkeet tunnistetaan harmausasteesta ja kuvakoosta.

15. Jotta vältettäisiin jäljellä olevien ad-15 sorboitumattomien punasolujen laskeminen muodostetaan ylisuuri laskentayksikkö yksittäisten punasolujen erottamiseksi .

16. Tilastolliseen analyysiin kuuluu tulosten erittely varianssianalyysin avulla. Hajonta voi johtua 20 menettelystä, menetelmässä käytetystä näytesyvennyksis-tä ja koevirhetekijästä, joka johtuu syvennysten tutkittavista kentistä. Kullekin syvennykselle lasketaan infektoituneiden solujen lukumäärän keskiarvo kenttää kohti sekä keskiarvon keskihajonnat. Myös kullekin 25 kokeelle määritetään keskiarvot ja keskihajonnat yhdistämällä kokeessa käytetyt syvennykset ryhmiksi. Kussakin kokeessa saatua infektoituneiden solujen määrän keskiarvoa kenttää kohti verrataan vertailunäytteiden vastaavaan arvoon käyttäen Dunnetsin kerrannaisvertai-30 lumenetelmää ottamatta lukuun koko kokeen F-testiä.

32 67848

Vertailu Koe 1

Syven- Syven- Syven- Syven- Syven- Sy- nys 1 nys 2 nys 3 nys 1 nys 2 vennys 5 F 11* F 12 F 13 F' 11 F* 12 F' 13 F 21 F 22 F 23 F' 21 F' 22 F* 23 F 31 F 32 F 33 F1 31 F* 32 F133 -1 1 χχ ± 3¾ x2 ± SE2 x3 ± SE3 Χχ ± SEl x2 ± 3¾ x3 ± ^3 10 i

Ryhmittäin ^ χ SE X^ i SE.^ n = 9 n = 9 ^ x Fll tarkoittaa kenttää j/ 20 F. Ihmisen perifeeriveri-imusolujen (HPBL)preparointi A. Ficoll-Hypaque-erotusväliaineen valmistus ^ 1. 22,5 g Ficoll 400:aa (Pharmacia, M.W. = 400 000) liuotetaan 200 ml:aantislattua vettä. Kun suurin osa aineesta on liuennut, säädetään tilavuus 250 ml:ksi tislatulla vedellä.

2. 34 g Hypaque'ia (natriumdiatriotsaatti, Ster-30 ling Organics, M.W. = 636) liuotetaan 100 ml:aan tislattua vettä.

3. Liuokset suodatetaan sitten 0,45 ^um:n milli-pore-suodattimen läpi ja säilytetään steriileissä astioissa 4°C:ssa suojassa valolta.

35 67848 4. Käytettävät liuokset valmistetaan sekoittamalla keskenään 10 ml Hypaque-liuosta ja 24 ml Ficoll-liuosta. Seos lämmitetään 25°C:een jatkuvasti sekoittaen.

B. Perifeeriveri-imusolujen erottaminen verestä 5 —------;——-- 1. Ihmisverinäytteet otetaan laskimopunktiol-r la heparinoituihin 20 ml:n vakutainer-putkiin. 15-20 ml laimentamatonta verta siirretään varovasti kerrokseksi yhtä suuren Ficoll-Hypaque-liuosmäärän päälle sterii-leihin 50 ml:n polykarbonaattisentrifugointiputkiin 10 aseptisesti- 2. Valmistettuja näytteitä sentrifugcidaan . · 25°C:ssa, 400 x g, 30 minuuttia. Rajapinnalla oleva· nukkamainen valkoinen vyöhyke imetään aseptisesti 50 ml:11a steriiliin sentrigugointiputkeen, jossa on 15 10-20 ml RPMI-1640. Solut pestään kerran 25°C:ssa 400 x g kymmenen minuuttia 25°C:ssa.

3. Pallosiksi yhteenliittyneet perifeeriveri-imusolut suspendoidaan uudelleen 1 ml:aan RPMI:tä jokaista alunperin käytettyä 8 verimillilitraa kohti 20 ja lasketaan Coulter-laskimelia. Väkevyyttä säädetään käyttäen RPMI-1640:aa, jota on täydennetty glutamii-nilla ja antibiooteilla. Solut pidetään huoneenlämmössä kunnes niitä käytetään.

25 G. Ihmisen perifeeriveri-imusolujen stimulointi PHA:lla (phytohemagglutiini) ja LPS:lla (lipopoly-sakkaridi).

1. 10 - 40 ml:n verinäytteet otetaan terveistä vapaaehtoisista heparinoituihin putkiin.

30 2. Lymfosyytit erotetaan tästä verestä Ficoll- hypaque-tekniikalla.

3. Valmistetaan tutkittavan yhdisteen eri väke-vyisiä liuoksia RPMI-1640:aan.

67848 4. Lymfosyyttinen väkevyys säädetään arvoon 2 x 106/ml RPMI-1640:aa.

5. Lymfosyytteja inkuboidaan tutkittavan yhdisteen kanssa 90 minuuttia 37°C:ssa.

6. Lampaan veren punasolut (SRBC) (1-2 viikkoa 5 vanhoja) pestään 3 kertaa PBSrlla ja laimennetaan loppuväkevyyteen 0,5 % RPMI-1640:11a.

7. Koeputkiin pannaan seuraava sisältö: 0,2 ml lymfosyytteja (2 x 106) 0,2 ml 9 %:ista Ficollia RPMI-1640:ssa 10 0,2 ml SRBC (0,5 % RPMI-1640: ssa) 8. Yllä mainittujen reagensseja sentrifugoidaan 200 x g:n voimalla 5 minuuttia huoneen lämpötilassa.

9. Laskeuma suspendoidaan sitten varovasti uudelleen ja 10,ui:n näyte asetetaan hemosytometriin.

15 ' 10. Rosettien lukumäärä lasketaan sitten mikroskoopin avulla, jolloin jokainen imusolu, johon on kiinnittynyt vähintään 3 punasolua lasketaan rosetiksi.

H. E-rosetteja muodostavat solut A. Mitogeenien preparointi 1. Lipopolysakkaridi B- tai fytohemagglutiini P-jauhetta punnitaan ja liuotetaan RPMI-1640:aan väkevyyteen 1000^ug/ml (1 mg/ml) ja steriloidaan suodattamalla 0,45 ^um:n millipore-suodattimen.

2. Liuokset jaetaan (1 ml/putki) aseptisesti 25 etiketillä varustettuihin steriileihin kryoputkiin ja jäähdytetään. Näytteitä ei jäädytetä uudelleen sen jälkeen kun osa niistä on käytetty vaan niitä voidaan säilyttää vuorokausi tai kaksi vuorokautta 4°C:ssa. Lyofilisoitu jauhe säilytetään jäähdytettynä 4°C:ssa.

35 6784 8 B. Viljelmien valmistus 1. Perifeeriverilymfosyytit preparoidaan kuten SOP ^I-004:ssa seerumi ttomaan RPMI-1640: aan, jota on täydennetty g]utamiinilla ja antibiootti-antimykootti-5 liuoksella (GIBCO). 0,1 ml siirretään 96 syvennystä käsittävän mikrotestiviljelylevyn (CoStar Plastics) kuhunkin syvennykseen 8-kanavaisella automaattisella mikropipetillä (Flow Labs.), joka on varustettu ste-liileillä kärjillä.

10 2. Mitogeeniliuokset sulatetaan nopeasti ja laimennetaan RPMI-1640:11a väkevyyteen, joka on haluttuun väkevyydeen nähden nelinkertainen.

3. Tutkittavat yhdisteet preparoidaan käyttöä varten kuten SOP W C-002:ssa käyttäen laimentimena 15 RPMI-1640:aa, ja laimennetaan väkevyyteen, joka on haluttuun loppuväkevyyteen nähden nelinkertainen.

4. 50^,ul kutakin mitogeenilaimennosta ja/tai tutkittavaa yhdistettä lisätään kuuteen rinnakkais-viljelnään. Pelkkää RPMI-1640-aa käytetään samat 20 määrät vertailuviljelmissä kokonaismäärään 0,2 ml/ syvennys.

5. Viljelmiä inkuboidaan 37°C:ssa kosteassa kaasutilassa, jossa on 95 % ilmaa, 5 % C02:ta (pH - 6,0 - 7,0) 48 tuntia. Solut merkitään sitten 3 25 käyttäen 0,5 j uCi/syvennys H-TdR (Tymidiini) vielä 18 tunniksi. Solut kerätään käyttäen automaattista moninkertaisnäytteen ottolaitetta (M.A.S.H.). Irtonaiset solut imetään lasikuitusuodinliuskoille 0,9-prosenttisella suolaliuoksella (10 syvennyksen 30 huuhtelut) ja solut hajotetaan tislatulla vedellä (20 syvennyksen huuhtelut). Liuskat kuivataan täysin ilmassa, jäljellä olevat solusaostumat leikataan pois liuskoista ja kukin näyte asetetaan 1 gramman lasiseen tuikepulloon. Tuikenestekonsentraatti (Scintp- 35 rep 1, Ficher Chemicals) laimennetaan 1:50 "sointi 1- 36 67848 lation grade"-tolueenilla (Packard) ja laimennosta lisätään 1 ml kuhunkin pulloon. Näytteet arvostellaan nestetuikespektroskopialla ja arvot ilmoitetaan koeryhmän tuikemäärän keskiarvona minuuttia kohti.

5 I Iinnunop lakki tutkimus A. NPT 15392:n preparointi 1. Valmistetaan liuos, joka sisältää NPT 15392:ta 500^,ug/ml lisäämällä etukäteen punnittu määrä lääkejauhet-ta steriiliin PBS:ään ja sonikoimalla liuosta 30 minuu- 10 tin ajan.

2. GCA/McPherson kaksoissädespektrofotometrin aallonpituus säädetään 250 nm:iin.

3. NPT 15392 laimennetaan 1:10 0,1-normaalisella HCl:11a.

15 4. 15 ml 0,1-normaalista HCl:a kaadetaan dekantte- rilasiin. Tätä liuosta käytetään kyvettien huuhteluun. Kumpikin kyvetti täytetään 0,1-normaalisella HCl:11a ja luetaan aallonpituus. Absorbanssin tulisi olla alueella 0,001- 0,005 no11a-lukemaan verrattuna.

20 5. Näytekyvetti tyhjennetään ja siihen pannaan lääkeainelaimennosta.

6. Luetaan absorbanssi ja lasketaan väkevyys seuraavasti:

Kaava: A (absorbanssi) x Laimennustekijä x Atanipaino 25 TTJi (278) = 9/ml B. Ennen Q-vuorokautta 1. Tehdään NPT 15392-liuos liuottamalla 500^,ug NPT 15392:ta millilitraa kohti PBS:ää.

2. Pitoisuus määritetään edellä kuvatun kohdan 30 3. Liuos jaetaan 1 ml:n näytteiksi ja säilytetään -20°C:ssa useita kuukausia.

4. Liuokset sulatetaan ja laimennetaan haluttuun pitoisuuteen.

37 6 7 8 4 8 C. Agar-aqar-pohjalevyt tehdään seuraavasti 1. Agar-agarin 1,4-prosenttista suspensiosta PBSrssä (7 g 500 ml:ssa) pidetään autoklaavissa 15 minuuttia.

5 2. Cornwell-ruiskulla siirretään 3 ml:n erät sulaa agar-agaria aseptisesti Falcon #=1006 petrimal-joihin, joita pyöritellään tasaisen kerroksen muodostamiseksi .

3. Näitä levyjä voidaan säilyttää enintään vii-10 kon ajan 4°C:ssa ennen käyttöä. Levyt säilytetään ylösalaisin (agar-agar levyn yläosassa).

D. Marsun seerumin preparointi 1. Otetaan 10 ml verta sydänpunkt jolla 2 -:6 marsusta ja pannaan se 50 ml:n Falcon 2070-15 sentrifugointiputkeen ilman antikoaguloivia aineita.

2. Näitä putkia inkuboidaan 45 minuuttia 37°C:ssa hyytymän muodostamiseksi.

3. Putket poistetaan sitten inkubaattorista ja pannaan jäihin hyytymän kutistamiseksi kokoon.

20 4. Seerumi kaadetaan aseptisesti pois jokaisesta putkesta, erät yhdistetään jä jaetaan 1 ml:n eriin, jotka säilytetään -70°C.*ssa käyttöön saakka.

E. Immunointi, 0-vuorokausi 1. Hiiret immunoidaan seuraavasti: Lampaan verta 25 (lammas φφ 23) saadaan viikoittain Hyland-laboratorioilta.

sekoitetaan aseptisesti kahteen Alseviers-tilavuusosaan yhtä veritilavuusosaa kohti.

2. 0,5 ml lampaanveri-Alseviers-seosta pestään kolmasti steriilissä PBSrssä IEC-kliinisessä sentrifu- 30 gissa säädöllä -ft 4 (2800 rpm)10 minuuttia huoneenlämmössä .

3. Muodostunut pallo suspendoidaan uudelleen 1:10 steriiliin PBS:ään.

38 67848 4. Malli Z Coulter-laskin kalibroidaan Coulter Instruction Manualin mukaisesti.

5. Coulter-laskimella suoritettavaan solujen laskemiseen tarvitaan 1:10000 laimennos ja se saadaan 5 tekemällä ensin 1:100 laimennos PBS:ssä ja laimentamalla tämä sitten isotonisesti 1:10. Coulter-laskimen kynnys asetetaan asentoon i/ 5.

6. Määritetään solujen lukumäärä ja varastoliuos 7 laimennetaan pitoisuuteen 4 x 10 solua/ml. Tätä 10 loppususpensiota käytetään iirmunointiin.

7. Jokainen hiiri immunoidaan injektoimalla i.v. hännän kylkisuoneen (lämmitetty 50°C:ssa vesihauteessa suonen laajentamiseksi) 0,1 ml SRBC-suspensiota; lopullinen SRBC-määrä on 4 x 10^ hiirtä kohti.

15 F. Käsittely 1. Hiiret käsitellään injektoimalla i.p. päivinä 0, 1, 2 ja 3. Ruisku (1 ml) on varustettu puolen tuuman (26 gauge) neulalla. Neula viedään sisään 45°:n kulmassa linea alban sivua pitkin. Sekä lääkeaineella 20 käsiteltäville että vertailuaineella käsiteltäville ryhmille ruiskutetaan 0,2 ml:n annos.

2. Lääkeairceryhmille annetaan 0,2 ml halutun väkevyistä NPT 15392-liuosta, joka 20 g:n hiirelle on 5^,ug/ml.

25 G. Pernan preparointi, vuorokausi 4 1. Pernat poistetaan aseptisesti ja siirretään yksittäin Falcon # 2025-kudosviljelmäputkiin, joissa on 3 ml MEM. Putket säilytetään jäissä.

2. Pernat homogenoidaan samassa putkessa teflon- 30 survimella, joka on liitetty G.K.Heller-moottoriin (variable speed reversiblemotor), jossa on G.K.Heller GT-21 moottorin säätäjä asennossa φφ 6.

39 67848 3. Homogenointiajän ja tehon tulisi pysyä samana kaikissa näytteissä.

4. Sen jälkeen näytteet suodatetaan 100 meshin (aukon halkaisija 0,149 mm) 40 mikronin ruostumatonta terästä olevan 5 suolan läpi vakiokudosviljelmäputkeen. Seula huuhdotaan 3 ml: 11a MEM ja solususpensio varastoidaan jäissä.

5. Tehdään 1:1000 laimennos solujen laskentaa varten Coulter-laskimessa ja se saadaan tekemällä ensin 1:100 laimennos PBS:ssä ja sitten 1:10 laimennos isotoni- 10 seen suolaliuokseen.

6. Lasketaan solujen lukumäärä ja laimennetaan 7 varastoliuos arvoon 1 x 10 solua/ml. Coulter-laski-men kynnys asetetaan arvoon 10. Punasolut hajotetaan kolmella tipalla Zap-isotonista suolaliuosta.

15 H. Pinta-agar-agarin valmistus (0,7 %) 1. 0,35 g agar-agaria ja 0,53 g MEM-jauhetta pannaan Erlenmeyer-pulloon. Sitten lisätään 50 ml tislattua vettä pulloon.

2. Liuosta pidetään autoklaavissa 15 minuuttia 20 121°C:ssa ja 1,03 barin paineessa. Sen jälkeen se siir retään vesihauteeseen 45°:een 5 minuutiksi. pH säädetään noin arvoon 7,2 lisäämällä natriumbikarbonaattia (0,1 ml Na2CC>3) .

3. 1 ml:n erät liuosta siirretään 5 ml:n kudos-25 viljelmäputkiin, jotka on etukäteen pantu vesihauteeseen. Käytetään useita ylimääräisiä putkia, joilla voidaan korvata mahdollisesti syntyvät virheelliset pin-taviljelmät.

I. 10-%:isen SRBC-liuoksen valmistus 30 1. 5 ml lampaanverta (samaa erää kuin käytettiin immunoinnissa) pestään kolmesti PBS:ssä käyttäen IEC Clinical Standard sentrifugia, nopeus (2800 rpm) 10 minuuttia.

40 6784 8 2. Kolmannen pesun jälkeen solut suspendoidaan uudelleen PBS:ään, jota käytetään kymmenkertainen tilavuus paakkuuntuneiden solujen tilavuuteen verrattuna, esim. 0,5 ml pakkuuntuneita SRBC, vastaa 5 ml PBS.

^ J. Pintahajoitus

Agar-Agaralustat poistetaan jääkaapista ja niiden annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan. Niihin kiinnitetään etiketit käyttäen kolmea rinnakkaisnäytettä kutakin koeryhmää kohti.

2. Agar-agaria sisältävät putket poistetaan vesihauteesta. ‘0,1 ml 10-%:tista SRBC-liuosta ja 0,1 ml pernasolususpensiota lisätään kuhunkin agar-agar-put-keen. Putkia ravistetaan Vortex-sekoittimella.

3. Putkien sisällöt kaadetaan välittömästi 15 agar-levyille ja näitä pyöritellään kunnes muodostuu tasainen kerros. Maljat asetetaan vaakasuoralle alustalle ja pidetään siinä kunnes agar-agar kiinteytyy.

4. Maljoja inkuboidaan 37°C:ssa kosteassa kaa-sutilassa, joka sisältää 5 % CO2 ja 95 % ilmaa, 90 min.

2 0 5. Marsukomplementti (katso valmistus, kappale D) poistetaan jäädyttimestä, sulatetaan huoneen lämmössä ja laimennetaan 1:10 PBStllä.

6. Maljat poistetaan inkubaattorista ja 1 ml laimennettua komplementtia lisätään kuhunkin maljaan.

25 7. Maljoja inkuboidaan sitten vielä 30-45 mi nuuttia 37°C:ssa. Maljat poistetaan sitten inkubaattorista ja lasketaan käyttäen sivuvaloa.

8. Maljoja voidaan säilyttää 40C:ssa ylösalaisin ja laskenta suorittaa vasta jopa 24 tuntia myöhemmin.

20 Yhteenveto terapeuttisista käyttötavoista käyttöesimerkeissä Tämän keksinnön kohteena olevien yhdisteiden on osoitettu inhiboivan RNA-viruksille luonteenomaisen näytteen lisääntymistä, kun on käytetty vakiokudosvil-jelmätekniikkaa. RNA-virusten osalta alalajiin A kuuluvan 41 67848 influenssaviruksen osoitettiin inhiboituvan käytettäessä hemadsorptiotekniikkaa.Useiden NPT 15457- ja NPT 15458-sarjojen jäsenten osoitettiin inhiboivan influenssaviruksen lisääntymistä pitoisuuksissa, 5 jotka vaihtelivat alueella 3,6 - 360 nmol/ml.

Muita RNA-luokan viruksia on esitetty taulukossa 6 samoin kuin niiden aiheuttamat sairaudet. Kaikista maailman sairauksista vähintäin 25 %:n tidetään olevan virusten aiheuttamia.Lisäksi on eristetty joukko vi-10 ruksia,joiden on osoitettu aiheuttavan kasvaimia. Tämän vuoksi virusten vastaisten aineiden voidaan itsensä olettaa omaavan syövänvastaisia, esim. leukemiaa vastustavia ominaisuuksia.

Erään näistä aineista, NPT 15458:n teho epä-15 normaalien lymfosyyttien kasvun inhibiittorina on määritetty. NPT 15458 on merkittävän tehokas inhiboimaan hiiren leukemialymfosyyttejä (L-1210 solulinja) kudos-viljelmässä. NPT 15458:n väkevyyfellä/10^ug/ml saavutettiin L-1210-solujen 40-%:inen inhiboituminen.

20 Taulukossa 3 esitetyt arvot osoittavat lopuksi, että tavallisessa kehon pHrssa (7,2) yhdisteillä on hyvä kemiallinen pysyvyys mutta ne lohkeavat "aktii-viaineeksi" NPT 15392 emäksisessä pH:ssa. Kuten havaitaan taulukosta 9, lohkeavat esterit, varsinkin 25 NPT 15458 inkuboitaessa eläinkudoksen kanssa NPT 15392:ksi.Oletettavasti tästä johtuu keksinnön mukaisten yhdisteiden, lääkkeen "esiasteiden" biologinen teho. Lisäksi osoittavat taulukossa 10 esitetyt arvot selvästi, että saavutetaan vähintään 12-kertaisia 30 NPT 15392:n, biologisesti "aktiivin" aineen, pitoisuuksia veressä, kun NPT 15458:aa injektoidaan i.p. verrattuna pitoisuuksiin, joita saavutetaan annettaessa NPT 15392:a itseään hiirille. Edelleen, kuten voidaan nähdä taulukosta 9 "vero"-solut (munuaiset), maksa ja 42 6 7 8 4 8 HPBL kaikki lohkaisevat "esiasteen" biologisesti aktiiviksi NPT 15392:ksi.

Keksinnön raukaisten yhdisteiden ryhmä erityisesti inhiboi virusten lisääntymistä, säätää (vahvistaa 5 tai inhiboi) immuunivastetta ja inhiboi leukemialymfo-syyttien kasvua. In vitro-kokeiden ja näiden yhdisteiden avulla saavutettavien, NPT 15392:een verrattuna korkeampien veriarvojen perusteella, jotka osoittavat tehon pitoisuusalueella 0,01 - 100^,ug/ml, ovat oletetut, ni-10 säkkäille tehokkaat annosmäärät alueella 0,005-50 mg/kg.

Esillä olevan keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan syöttää nisäkkäälle annoksena 1-1000 mg/kg kehon painokilogramraaa kohti ja niiden voidaan olettaa olevan tehokkaita jopa niin pieninä annoksina kuin 0,000-5 mg/kg. 15 Niitä voidaan antaa tabletteina tai kapseleina ihmisille ja eläimille ja liukoisuudesta riippuen vesi-siirappeina tai öljyliuoksina tai mikäli on kyseessä liukenematon yhdiste, suspensiona.

Claims (3)

67848

1. Menetelmä terapeuttisesti käytettävän yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava 5 OH ^JV'\ k m N \ N-

10 HC-CH-CH I I -i '1 '2 R OR 1. jossa R on 1-8 hiiliatomia sisältävä alkyyli ja R on karboksyylihapon esteriryhmä, tunnettu siitä, 2 15 että kaavan (I) mukaisen yhdisteen, jossa R :n paikalla on vety, annetaan reagoida karboksyylihappoanhydridin, tai karboksyylihappohalogenidin kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n - n e t t u siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R on 20 n-heksyyli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n - 2 n e t t u siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R on hemisukkinaatti.