NO152445B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av terapeutisk aktive 9-(hydroksylalkyl)puriner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser med formelen

der X er OH, NH , SH, OR eller SR der R er alkyl med 1-4 karbonatomer eller benzyl, R 1 er H eller alkyl med 1-8 karbonatomer, R<2 >er H eller metyl, Y er saltet av et amin med formelen der R 3 og R 4er lavere alkyl, f. eks. 1-4 karbonatomer, og n er et helt tall fra 2 til 4, og der z er et helt tall fra 1 til 10, med p-acetamidobenzosyre som er brukbare som immunomodulatorer, som antivirale midler og i spesifikke tilfeller har antitumor-virkning. Forbindelsene som angitt ovenfor fremstilles ved at en forbindelse med formelen

omsettes med en forbindelse med formelen (Y) z.

Når R 2er H, øker nærværet av Y den immunoregulerende virkning

og den antivirale virkning. Hvis X er N^, er det en immunoinhiberende virkning, men ingen immunostimulerende (immunopotensierende) virkning.

Den immunoregulerende virkning synes å øke med økende kjedelengde for R 1, i det minste fra metyl til og med heksyl. Fortrinnsvis er R^ n-alkyl, f. eks. metyl, etyl, n-propyl, n-butyl, n-amyl, n-heksyl, n-heptyl eller n-oktyl. R 2 er fortrinnsvis metyl. R kan være metyl, etyl, n-propyl, n-butyl, isopropyl o.s.v. Når X er N^, kan forbindelsen være tilstede som fri base eller

som et salt med en ikke-toksisk syre, d.v.s. en farmasøytisk aksep-tabel syre, f. eks. saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosfor-syre, sitronsyre, melkesyre, vinsyre, salicylsyre, acetylsalicyl-syre, eddiksyre, propionsyre, p-toluensulfonsyre, metansulfonsyre, maleinsyre, ravsyre, malonsyre eller adipinsyre.

I den nedenfor følgende beskrivelse av forbindelsen står forkortelsen DIP.PAcBA når Y er tilstede for dimetylamino-2-propa-nol-p-acetamidobenzoat. Hvis ikke et tall følger denne angivelse i parentes, f. eks. (10), er Y 3. Hvis det følger et tall i parentes etter forkortelsen DIP.PAcBA, angir tallet antallet mol Y-grupper som er tilstede pr. 1 mol av 9-(hydroksyalkyl)-purin.

I tabell 1 nedenfor antas forbindelsene å være rene bortsett fra forbindelsen 15443, som antas også å inneholde et salt i tillegg til forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

En immunomodulator er en forbindelse som regulerer immuno-responsen. Således dekker den både immunostimulering (immunopotens-ering) og immunoinhibering. Immunostimulering er selvfølgelig brukbar ved oppbygning av immunitet. Immunoinhibering er også nyttig på forskjellige områder. F. eks. er denne virkning brukbar ved organtransplantering, f. eks. nyre- eller hjertetransplantering, for å forhindre avstøting av det nye organ.

I tabellene som viser immunopotensieringsegenskapene for forbindelsene, antyder et + eller en - immunostimulerende henholds-vis immunoinhiberende egenskaper. Tallet null antyder at forbindelsen hverken har immunopotensierende eller immunoinhiberende virkning.

I enkelte av tabellene er det også inkludert forskjellig'e forbindelser der X ikke ligger innenfor det som kreves. Disse ikke krevede forbindelser har som regel relativt lav virkning og er tatt med for å vise det faktum av X-gruppen- kan ha en betyde-lig virkning på forbindelsenes egenskaper.

Et mitogen er et stoff som induserer celleproliferering slik dette oppstår under immunisering.

Tabell 1 (unntatt forbindelsene 15427 og 15423) viser forbindelser som er brukbare ifølge oppfinnelsen.

Forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er brukbare ved behandling av pattedyr (eller celler fra pattedyr) inkludert mennesker, griser, hunder, katter, kveg, hester, sauer, geiter, mus, kaniner, rotter, marsvin, hamstere, aper o.s.v.

Hvis ikke annet er angitt, er alle deler og prosentandel-er på vektbasis.

Alle temperaturer er angitt i °C hvis ikke annet er angitt.

Andre forbindelser innenfor oppfinnelsens ramme er angitt i Tabell la nedenfor der basisformelen er den samme som i Tabell 1. I tabellene 1 og la er alkylgruppene for R<1> alle n-alkyl•

Fremstilling av NPT 15410

27,9 mg eller 0,1 millimol 9-(2-hydroksy-3-nonyl)-6-hydroksypurin, NPT 1539 2 og 77,1 mg eller 0,3 millimol 2-hyd-roksypropyl, dimetylammonium 4-(acetylamino)-benzoat (DIP*PAcBA) ble nøyaktig veid og oppløst i 105 ml 0,25%-ig natriumkarbonat for å oppnå en 0,1%-ig oppløsning av NPT 15410 (den forbindelse som oppsto fra NPT 15392 og (DIP<*>PAcBA) i et 1:3 molforhold).

Bevis på kompleksdannelse.

Faseoppløselighetsstudier utført med NPT 15392 og DlP-PAcBA viste at NPT 15392 har øket oppløselighet ved økende konsentrasjoner av DIP-PAcBA under konstante pH-betingelser. Dette indikerer at det skjer en gjensidig påvirkning.i oppløs-ningen hvorved det dannes et kompleks.

I Stedet for molforholdet 1:3 (NPT 15392 og DIP-PAcBA) dannes det andre komplekser ved å benytte molforhold på 1:1 og 1:10.

Den antivirale virkning er vist i tabellene 2 og 3.

Biologisk virkning

Metoder

Anti- influensavirkning ( Hemadsorbsjonsprøve)

Ved infeksjon av et monosjikt av vevkulturceller av influensavirus forandres celleoverflaten slik at marsvinery-trocytter kan adsorberes til celleoverflaten. Antallet foki av adsorberte celler (hemadsorbsjon fokidannende enheter HAFFU) er et kvantitativt mål på infektiviteten. Metoden er som følger.

Monosjiktene subdyrkes på følgende måte: Mediet ble helt av og monosjiktet vasket to ganger med omtrent 50 ml pr. vasking med kalsium- og magnesiumfri fosfatbuffersaltopp-løsning (PBS), ("GIBCO +419") ved pH 7,2. 1 ml trypsin EDTA-oppløsning ("GIBCO +530L") inneholdende 0,5 g trypsin (1:250) og 2.0 g EDTA/liter modifisert Puck's saltoppløsning A tilsatt ved 37°C til hver kolbe og dispergert over monosjiktet under forsiktig rysting. Kolbene ble deretter plassert i en inkubator ved 37°C i omtrent 3 til 5 minutter, avhengig av tiden som var nødvendig for å fordele cellene. Leilighetsvis rysiting var nødvendig. 10 ml av et podemedium ble tilsatt til hver kolbe og cellene ble dispergert ved innsuging og utpressing av suspensjonen fra pipetten. Innholdet av en serie kolber ble slått sammen og cellene i suspensjonen ble fortynnet med podemedium til 7 til 8,5 ganger 10 4 celler pr. ml. Podem^diet besto av følgende sammensetning: "Minimum Essential Medium Eagles (MEM) med Earle's salter og HEPES buffer (GIBCO +236") supplementert ved tilsetting av følgende stoffer til 87 ml MEM:

10 ml fosterkalveserum ("FCS-GIBCO +614HI")

1 ml L-glutamin ("200 Molar-GIBCO +503")

1 ml klortetracyklin (5000 g/ml) ("GIBCO =1=528")

1 ml 10.000 enheter penicillin, 10.000 g streptomycin og 10.000 g neomycinblanding ("PSN-GIBCO +564") Cellene ble subkulturert til Linbro vevkulturskåler. Skålene besto alle av 24 flate bunnbrønner med 3 mm kapasitet pr. brønn og 1 ml cellekultursuspensjon ble tilsatt til hver av disse.

Den følgende dag ble mediet fjernet og erstattet med nytt podingsmedium. Monosjiktene ble benyttet for forsøk når de nådde en tilstand der de var så og si konfluente, dvs. ca.

3 til 4 dager.

Idet Linbro-skål HeLa cellekulturene var ferdige for forsøk, se under celler, ble mediet dekantert og 1 ml opprett-holdelsesmedium (MEM med FCS redusert til 3%) inneholdende forbindelsen som skulle prøves ved en gitt konsentrasjon ble tilsatt til 4 replikate kulturer i en skål.

Det ble benyttet en serie forskjellige medikamentkon-sentrasjoner innen området 2,3 til 150 g/ml. Opprettholdelses-mediet alene ble benyttet for kontrollkulturene. Etter inngi-velse av medikamentet og kontrollmediet, ble 0,1 ml av den fortynnede viralsuspensjon tilsatt til forsøksgruppene og infiserte kontrollkulturer. Saltoppløsning alene ble tilsatt til ikke infiserte kontrollkulturer. Linbor-skålene ble deretter inkubert ved 37°C i 18 timer hvoretter media i alle grupper ble suget av. Hver kultur ble vasket 1 gang med PBS. Saltoppløsningen ble suget av og 0,5 ml av en 0,4%-ig (volum/ volum) suspensjon av røde blodceller fra marsvin i PBS ble tilsatt til hver kulturbrønn. Kulturene forble ved romtemperatur i 30 min. hvoretter mediet ble dekantert og kulturen vasket 2 ganger med PBS for å fjerne alle bortsett fra de spesifikt bundede røde celler. Etter den tredje vasking, ble opprett-holdelsesmedium tilsatt til alle kulturer.

Et Howard mikrometer øyestykke (C8 385) ble ført inn

i okularet i et Nikon invertfase kontrastmikroskop. Hver kultur ble avsøkt med et 4 x lavpapir objektiv og direkte tellinger av hemadsorberte røde celler foretatt ved bruk av øyestykke-nettet som feltmarkør. Partielle eller totale felter ble tellet pr. eksperimentelle gruppe avhengig av det resulterende antall og tettheten av hemadsorberte celler i de infiserte kontrollkulturer. Forstørrelser på 60 ganger eller 150 ganger ble valgt for å oppnå de beste betingelser for opptelling av de hemadsorberte celler. Feltfaktorer ble beregnet for å telle hemadsorbsjonen ved 60 ganger og 150 ganger forstørrelse. Ved 60 ganger forstørrelse ble den totale felttelling beregnet ved bruk av en multiplikasjonsfaktor på 55,5. Ved 150 ganger for-størrelse var multiplikasjonsfaktoren 273. Multiplikasjonsfak-torer på 55,5 hhv. 273 representerte et totalt antall felter ved 60 hhv. 150 ganger forstørrelse. Antallet felter som ble tellet varierte fra 3 til 5 pr. brønn med 3 til 4 brønner pr. behandlingsgruppe benyttet (se rådatatabellene i resultatsek-sjonen for antallet undersøkte felter). Midlere og standard feil ble beregnet og de oppnådde data ble bedømt ved bruk av Student<1>s t-prøveanalyse.

Biologisk virkning

Anti- herpesvirkning - ( plateprøve)

Infeksjon av vevkulturceller med Herpesvirkus forårsaket cellelyse. Etter en periode ble disse lyserte celler gjort synlige som små klare områder (plater) på et sjikt av celler. Innarbeiding av en prøvesubstans i mediet vil redusere antall plater hvis det er i stand til å forhindre virusrepli-kasjon. Metoden er som følger:

Stoffer og metoder

Virus

Det ble benyttet herpes hominis type 2 oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC), Bethesda, Maryland, ATCC *VR 540, Lot 3D. De lypotiliserte virale suspensjoner

ble rekonstituert med 1 ml sterilt destillert J^O. Virusene ble ført 2 ganger gjennom HeLa cellemonosjikt. Vevkultursuper-natantene ble slått sammen, dispensert i 1 ml mengder og lagret

ved -70°C. Titeren for denne arbeidslagersuspensjon ble funnet å være 10 ^ TCID^q/0,1 ml (2 dagers inkubering).

Herpes virusplateprøve

Vero-celler i log-vekstfasen ble subkulturert ved en konsentrasjon på 1x10^ celler/ml i 50 ml Falcon-flasker i Eagle's Minimum Essential Medium (MEM), supplementert med 10% fosterkalveserum FCS og antibiotika. Media ble skiftet dagen etter poding. Veromonosjiktene nådde konfluens den andre dag etter poding og med cellene i logfasen ble kulturene benyttet for plateprøven.

Kulturmedia ble helt av og monosjiktene ble vasket en gang med fosfatbuffret saltoppløsning PBS. Diverse forskjellige fortynninger åv arbeidslagervirussuspensjonen ble preparert og hver kulturkolbe ble infisert med 0,5 ml av en av virusfor-tynningene tilsatt til FCS-fritt medium. Dette medium inneholdt medikamentet ved en konsentrasjon på 150 yg/ml. Kontroller ble fremstilt med medium fritt for medikament.

Virusadsorbsjonen ble tillatt å skride frem i 2 timer ved 37°C i løpet av hvilket tidsrom kulturene ble rystet forsiktig hvert 15. minutt. Deretter ble de forskjellige media helt av og monosjiktene ble vasket en gang med 10 ml PBS.

Agarose ble fremstilt ved en konsentrasjon på 6% vekt/ volum i 50 ml PBS. Ét lagermedium av MEM supplementert med 2% FCS ble fremstilt. Medikamentet ble tilsatt til noen av lagermediene ved 150 yg/ml. De tre oppløsninger ble holdt ved 47°C. I tillegg ble det gjort ferdig en 1:10 fortynning av sammenslåtte humane antiherpessera. Akkurat foran behandlings-begynnelsen ble 15 ml av agaroseoppløsningen tilsatt til 85 ml medium. Ytterligere 15 ml agarose ble tilsatt til 85 ml medi-kamentmedium.

Hvert av de vaskede monosjikt i en forsøksgruppe ble behandlet enten med 5 ml agarosemedium eller med 5 ml agaro-se/medikamentmedium. I en annen forsøksgruppe ble hvert monosjikt behandlet enten med 0,2 ml antiherpessera i 5 ml grunn-medium, eller med 0,2 ml antiherpessera i 5 ml medikament-medium. Antiherpessera ble benyttet i stedet for agarose for å lokalisere plater ved nøytralisering av tilstedeværende fri virus i mediet. Kolbene ble holdt ved romtemperatur i 5 min. hvoretter de ble inkubert ved 37°C i 2 dager. Replikatkulturer

ble benyttet for de fleste behandlingsgrupper.

10 ml PBS ble deretter tilsatt til hver kolbe. Over-sjiktene ble rystet mildt og ble deretter helt ut av kolbene. Monosjiktene ble fuktet med en oppløsning av 0,5% vekt/volum krystallfiolett i 50% metanol i 3 ganger destillert H20.

Platene ble tellet enten direkte ved transmittert fluoreserende lys og makrobetraktning eller ved bruk av lysmikroskopi for mikroplater. Mikroplatene ble tellet ved å trekke gjennomsnitten av tre felter pr. forsøksgruppe under 150 gangers forstørrelse.

I andre forsøk på antiviral virkning oppnådde man de følgende resultater.

Ytterligere prøver på antiviral virkning for forbindelse NPT 15410 er vist i Tabell 3a.

Immunomoduleringsvirkningen er vist i Tabell 4.

1. Mitogenindusert musemiltcelleprøve

Musemiltceller inneholder en populering av både B- og

T lymfocytter som kan stimuleres ved et antall fremmede sub-stanser (f.eks. plantemitogener slik som Con A) til proliferering. Denne økede proliferering er en indikasjon på øket celle-mediert immunitet. Metoden nedenfor beskriver systemet som ble benyttet for å bedømme prøvesubstanser som immunopotensiatorer.

Stoffer

Concanavalin A (Calbiochem, La Jolla, California),

Lot +210073, lyofilisert i NaCl, ble først fremstilt som en 1%-ig oppløsning og fortynnet som en 2 gangers konsentrasjon for hver fortynning (0,5, 1,0, 2,5 yg/ml).

Dyr

Seks til åtte uker gamle Balb/c og C^H innavlede mus ble oppnådd fra følgende kilder: Flow research Animals, Inc., Dublin, Virginia; Charles River Breeding Laboratories, Wilming-ton, Massachusetts; Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana og Lionel Strong Foundation, San Diego, California.

Celler

Tre til fem mus ble avlivet og milten ble fjernet asep-tisk. Forenede milter ble finoppdelt og knust med sterile pin-setter og deretter presset gjennom et dobbeltsjikt nylonduk. Cellesuspensjonen ble vasket en gang med 15 ml "RPMI 1640" hvortil det var satt 5% kalvefosterserum og antibiotika. Cellene ble dyrket ved en konsentrasjon på 10^ celler pr. 0,1 ml pr. brønn i mikroplater. Kulturene ble inkubert i nærvær eller fravær av mitogen i en fuktiggjort atmosfære inneholdende 5% CC^

i 48 timer. Prøveforbindelsen ble tilsatt til kulturene i for-skjellig konsentrasjon sammen med mitogen.

Proliferering

Prolifereringen ble prøvet ved graden av inkorporering av 1.0 Ci ( H) tymidin over en 18 timers inkuberingsperiode. Kulturene ble høstet ved hjelp av en "MASH"-enhet og tymidin-inkorporering ble prøvet ved væskescintilasjonsspektrometri. Kulturene ble tatt i triplikat og de oppnådde data ble uttrykt som middelverdier pluss eller minus standard feilen for det eksperimentelle middel. Medikamentstimuleringsindekser over kontrollverdier ble også beregnet og oppført grafisk.

2. Mitogenindusert humanperiferblodlymfocytter

Det foreligger et klinisk behov for terapeutiske midler for å øke immunresponsen hos pasienter med defekt eller under-trykket immuntilstand slik det foreligger i viralsykdommer eller kreft. Ved å studere evnen for forskjellige midler til å øke prolifereringen av humanperifer blodlymfocytter i respons pa fremmedstoffer kan man identifisere midler med immunopotensierende virkning i mennesker. Denne prosedyren er den som nylig er angitt og også beskrevet av J. W. Hadden i "Infect. & Immunity", februar 1976, side 382-387, spesielt 382-383. 3. Makrofagene representerer en underpopulasjon av hvite blodceller og som er en viktig komponent i immunsystemet for kontroll både av cellulær og humoral immunitet. Prøvesy-stemet som er beskrevet nedenfor, bedømmer stoffene som under-søkes som potensiatorer av makrofagfunksjonen.

Phytohemagglutinin (PHA) (HA-17) ble oppnådd fra Burroughs Wellcome. Et preparat inneholdende makrofagmitogen faktor (MMF) og Makrofag aktiveringsfaktor (MAF) ble fremstilt fra antigenstimulerte immune lymfekjertellymfocytter (marsvin) som tidligere beskrevet av Hadden et al i "Nature" 257, 483-485 (1975). Partiell rensing av dette preparat ved vakuumdia-lyse og "Sephadex G-100" kolonnekromatografi ga en aktiv fraksjon innen området 35 til 70.000 dalton og oppvisende både mitogenerende og aktiverende egenskaper. Den aktive fraksjon ble benyttet både ved proliferering- og aktiveringsprøvene.

Metoder

Ficoll-hypaque rensede humane perifere blodlymfocytter ble fremstilt og PHA-indusert lymfocyttproliferering ble prøvet ved inkorporering av tritierte trimidin som beskrevet av Hadden et al i "Cell. Immunol." 20, 98-103 (1975). Hver forbindelse ble analysert i nærvær av suboptimale, optimale og supraoptimale konsentrasjoner av PHA (0.001, 0,01 hhv. 0,1 enheter/ml). Parafinoljeinduserte marsvinperitoneal makrofager ble preparert og inkubert som monosjiktkultur (over 98% rene makrofager). Lymfokin (MMF)-induserte proliferering ble prøvet inkorporering av tritiert tymidin ved 3. og 5. dyrkingsdag som beskrevet av Hadden et al, "Nature", 257, 483-485 (1975). Lymfokin (MAF)-indusert makrofagaktivering med henblikk på å drepe Listeria monocytogenes etter 5 dagers dyrking i nærvær eller fravær av MAF ble gjennomført i løpet av en 6 timers periode som beskrevet av Hadden og England i "Immunopharmacology", side 87-100 (Plenum Press, 1977). Phagocytose ble kvantitativt bedømt i løpet av en 20 minutters eksponering til Listeria monocytogener ved å telle antallet makrofager inneholdende bakterier og antallet bakterier pr. fagocytisk celle på gramdynkede monosjikt i Labtek kammere. Intracellulær utryddelse av bakterier ble bedømt ved å telle antallet celler inneholdende bakterier og antallet bakterier pr. celle 10 timer etter den opprinnelige 20 min. eksponering. Parallelle forsøk der makrofagene ble lysert og intracellulære bakterier ble dyrket bekrefter gyldigheten av bakterialvirkningen bestemt på denne måte i dette system. Medikamentene ble benyttet i hvert av de tre systemer over serielogkonsentrasjonsområder i triplikat i nærvær og fravær av mitogen eller lymfocin. Hver type forsøk ble gjennomført minst tre ganger. Tidligere forsøk antyder en responsparallellitet til farmakologisk modulering hva angår prolifererings- og aktiveringsprøver.

Biologisk virkning

Antileukemisk virkning ( inhibering av L- 1210- vekst)

Leukemiske celler isolert fra mus med L-1210 tumor dyrkes in vitro og veksten kan måles ved å telle antallet celler i kulturen i løpet av et visst tidsrom. Inkorporering av en prøvesubstans i mediet vil forhindre veksten av de leukemiske celler, en indikasjon på et effektivt antileukemisk middel.

<I>^q (konsentrasjonen av medikament som inhiberer veksten av L-1210) i prosent for de prøvede forbindelser var som følger:

Prøvesysternet som ble benyttet er angitt nedenfor.

For å måle inhibering av leukemicelle ( L- 1210) vekst

Man undersøkte om det var tilstrekkelig cellevekst i lagringskulturen. Det ble benyttet celler 48-72 timer etter overføring.

Medikamentet ble veid ut i 50 ganger den ønskede slutt-konsentrasjon og seriefortynnet.

Det ferdige mediumet ble fremstilt ved å bruke 500 ml "McCoy's 5A medium", 15% kalvefosterserum, 5 ml penicillin-streptomycinoppløsning og 5 ml antibiotika-antimycotikaoppløs-ning og det hele ble satt hen ved romtemperatur.

Ved å benytte sterilteknikk ble det tilsatt 0,1 ml medikamentfortynning til hvert rør.

Det ble tilsatt en egnet mengde celler til det frem-stilte medium. Etter blanding ble en 0,5 ml prøve fjernet, anbrakt i en ampulle inneholdende 9,5 ml saltoppløsning og man foretok en telling i en "Coulter Counter". En multiplikasjon med 40 av tellingen for å kompensere 40 gangers fortynningen (0,5 ml til 0,5 ml saltoppløsning) hvoretter det anvendte inokulum ble tellet. 5 ml cellesuspensjon tilsettes til hvert rør. Flasken ble rystet for hvert 4. rør for å sikre en mer enhetlig forde-ling av cellene.

Korkene ble festet og det hele ble anbrakt i en CO^-inkubator ved 36-38°C i 96 timer.

Etter 96 timer ble rørene fjernet fra inkubatoren og man gjennomførte en telling av innholdet for hvert av rørene i en "Coulter Counter". Alle tellinger ble multiplisert med 40 og man tok gjennomsnittet for 4 telleringer for hver medi-kamentfortynning. Hvis tellingen er mindre enn inokulum-tellingen, oppføres 100% inhibering. Hvis tellingen er større enn gjennomsnittet av 8 kontrolltellinger, ble det anført 0% inhibering. For alle andre tellinger ble det benyttet følgende formel:

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har vist seg å inhibere replikering av en representativ prøve både av RNA- og DNA virus ved å bruke standard vevkulturteknikker. Når det gjelder RNA-virus, viste diverse influensavirusstammer. tilhørende både A- og B subtypene å bli inhibert ved å bruke hemadsorbsjons-teknikken (avsnitt II, B). De spesifikke forbindelser som ble funnet å inhibere influensavirusreplikasjon (type A/USSR 90)

er vist i tabell 1. Forskjellige typer av seriene NPT 15392, NPT 15410, NPT 15417 og NPT 15418 viste seg å inhibere replikasjon av minst 4 forskjellige stammer av influensavirus ved konsentrasjoner i området fra 1 til 150 g/ml.

I tillegg har forskjellige forbindelser fra seriene NPT 15410 og 15392 vist seg å inhibere replikasjon av Herpes Simplex virus, en virus fra DNA-klassen virus og en virus ansvarlig for alvorlige mukokutane skader i mennesker sammen med den dødelige Herpes encephalitis. Andre fra denne klasse virus er ansvarlig for munn- og klovsyke hos svin og storfe pg infeksiøs rhinotracheitis hos katter og kennelhoste hos hunder. Sogar konsentrasjoner mindre enn 100 yg/ml NPT 15392 og 15410 ble funnet å redusere platedannelse forårsaket av Herpes Simplex virus i en grad på over 90%. Andre fra RNA- og DNA-klassen virus er vist i tabell 5 og er ansvarlige for den angitte sykdom. Av alle sykdommer i verden er minst 25% kjent som forårsaket av virus. I tillegg er et antall virus isolert og disse er vist å gi tumorer. Således kan visse antivirale midler i seg selv også forventes å ha en viss antitumorvirk-ning.

Det er et påvist faktum at mange infeksiøse stoffer slik som virus (influensavirus, HSV, Friend leukemivirus), vakterier og fungi forårsaker en immunundertrykket tilstand hos verten, noe som svekker forsvaret mot infeksjoner på grunn av infeksiøse stoffer. De fleste andre antivirale antimetabo-littstoffer slik som AraC, forårsaker en undertrykkelse av vertens immunforsvarsmekanisme, noe som potensielt svekker legemets egen naturlige forsvarsmekanisme og øker sekundær-infeksjonene.

Tabell 4 ovenfor angir resultatene for en bedømmelse av et antall av de foreliggende forbindelser som potensiatorer for immunrespons. Det ble benyttet tre forskjellige prøvesystemer. Den første omfattet en måling av evnen av prøveforbindelsen til

å øke evnen for muselymfocytter til å prolifere som svar på et plantemitogen (Con A). Den andre omfattet måling av evnen for prøveforbindelsen til å øke humanlymfocyttprolifereringen i ren-spons på et annet plantemitogen (PHA). Det tredje system målte evnen for prøveforbindelsene til å øke makrofagprolifereringen som respons på et naturlig lymfokin (MMF, Macrophage mitogenfaktor). Denne sistnevnte respons, prolifering og aktivering av makrofager, er vist å være involvert ved utryddelse av bakterier, virus og tumorceller av denne klasse hvite blodceller.

Signifikant potensiering av innunoresponsen ble observert med forbindelsene 15392, 15410 og 15418.

Til slutt ble virkningen for visse av disse midler, NPT 15392 og 15410, som inhibitorer for veksten av abnormale lymfocytter bestemt. Vanligvis er begge stoffer istand til å inhibere prolifereringen av museleukemilymfocytter (en L-1210 cellelinje)

i vevkultur. En 50% inhibering av L1210 celler ble bevirket av NPT 15392 ved 28 ug/ml og av NPT 15410 ved 54 yg/ml. Evnen til

å inhibere leukemiske lymfocytter ved konsentrasjoner som stimu-lerer vanlige lymfocytter er en unik egenskap som ikke hittil har vært kjent i andre forbindelsesklasser.

Produktene ifølge foreliggende oppfinnelse hører til en klasse stoffer som spesifikt inhiberer replikasjon av RNA- og DNA-virus, modulerer (potensierer)immunoresponsen og inhiberer veksten av leukemiske lymfocytter. Basert på in vitro eksperimenter som viser virkningen over et konsentrasjonsområde på 0,01 til 150 yg/ ml, er effektive områder i pattedyr fra 0,05 til 500 mg/kg. Ute-blivelse av giftighet er bemerket ved nivåer på 1500 mg/kg i mus for visse forbindelser i seriene.

Potensiering av biologiske virkninger ved PIP PAcBA

Av de forbindelser som er beskrevet i tabell 1 er NPT 15392 og NPT 15446 nye forbindelser. Også nye er de DIP-PacBA salter som er angitt i denne tabell, nemlig 15428, 15447, 15437, 15432, 15434, 15444, 15418 og 15410. NPT 15392, NPT 15417, NPT 15426 er alle vist å ha signifikant antiinfluensavirkning i seg selv. I et tilfelle, med NPT 15392, potensierte tilsetting av DIP-PAcBA saltet til NPT 153 92 for å oppnå 15410 ikke antiinflu-ensavirkningen. Når det gjelder 15417, medførte tilsetning av DIP-PAcBA saltet for å oppnå 15418 en potensiering av antiinflu-ensavirkningen. En oppsummering av den relative evne for DIP-PA cBA salter til potensiering av de forskjellige biologiske virkninger er angitt nedenfor.

Formålet med dette studium var å bestemme virkningene av in vivo behandling av mus med forbindelsene NPT 15392 og 15410 på

den etterfølgende virkning på miltceller isolert fra disse dyr og bedømt in vitro med henblikk på prolifereringsresponsen på mitogen,-concanavalin A (Con A).

Prosedyre

In vivo behandling

Ni Balb/C hanmus, 8-9 uker gamle og med en vekt på 18 til 20 gram ble delt i 3 grupper. En gruppe ble behandlet 2 ganger daglig i 1 dag, morgen og aften, med en oral dose NPT 153 92 ved 10 mg/kg. Den andre gruppe ble behandlet på samme måte med NPT 15410 og 20 mg/kg. En tredje gruppe ble gitt saltoppløsning som placebokontroll.

In vitro miltcelleprøve: Cellepreparering

Den følgende dag ble hver gruppe avlivet og milten fjernet og slått sammen. Miltene ble finhakket og cellene vasket i RPMI-164 0-medium supplert med 2 mm glutamin og antibiotika. Cellekonsentrasjonen for hvert preparat ble bestemt ved hjelp av en Coulter-counter og justert til 5x10 celler pr. ml med RPMI-medium.

Mikrotiterplateprøve

Mikrotiterprøver ble utført i 0,2 ml inkuberinger inneholdende 5x10^ celler og Con A eller Con A og forbindelser i de indikerte konsentrasjoner. Alle prøver ble foretatt med 6 repli-kater og sammenlignet med en blank prøve kun inneholdende celler. Prøveplatene ble inkubert ved 37°C i 5% CO„ i 4 dager. Under denne siste 18-20 timers inkubering ble 0,5 ml <3>HTdR (10 y Ci/ml, 6 Ci./iti mol) tilsatt til hver kultur. Kulturene ble samlet med en multippel automatisk prøvehøster (MASH) enhet og innarbeidet <3>HTdR bestemt ved hjelp av en "Beckman LS 8000" væskeintillasjons-teller som et mål på celleprofileringen. Resultatene er anført som forholdet mellom virkningen i kulturer behandlet med Con A eller Con A og forbindelser og blanke kulturer.

In vivo behandling med enten forbindelse 15392 eller 15410 øker en etterfølgende respons for miltcellene in vitro mot Con A stimulering ved en suboptimal mitogenkonsentrasjon (5 yg/ml). Således øket forbindelsen 15410 stimuleringsforholdet til 100:1 sammenlignet med 55:1 med placeboen. Ingen signifikant forskjell ble stimulert med en mer optimal konsentrasjon av Con A (10 yg/ml).

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk

   aktiv forbindelse med formelen

   der X er OH, NH ^ , SH, O1R eller SR der R er alkyl med 1-4 karbonatomer eller benzyl, R er H eller alkyl med 1-8 karbonatomer, R 2er H eller metyl, og Y er saltet av et amin med formelen 3 4

   der R og R er lavere-alkyl, n er et helt tall fra 2 til 4,

   og der z er et helt tall fra 1 til 10, med p-acetamidobenzosyre, karakterisert ved at den omfatter å omsette en forbindelse med formelen

   med en forbindelse med formelen (Y) z.