DK149857B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 9-(2-hydroxyalkyl)-purinsalte - Google Patents

Description

149857

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 9- (2-hydroxyalkyl)-purinsalte af formlen 00 - "" I 2

HC- CH - R

I 1 1

Rx OH

hvor X er OH, NH2, SH, OR eller SR, hvor R er alkyl med 1-4 carbonatomer eller benzyl, B?· er H eller alkyl med 1-8 carbon= 3 2 atomer, R er H eller methyl, Y er saltet af en amin med formlen R3

10 4^H(cnH2n)OH

R

3 4 hvor R og R er lavere alkyl med 1-4 carbonatomer, og n er et helt tal fra 2 til 4,med p-acetamidobenzoesyre, og hvor z er et helt tal fra 1 til 10, hvilke forbindelser er nyttige som immunomodulatorer, som virusmodvirkende midler og i specielle tilfælde er tumormodvirkende.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at . en forbindelse af formlen 20 x to iSc-CH-R2 25 ! 2 R1« hvor X, R og R har ovennævnte betydning, omsættes med 1-10 mol af saltet Y.

Når R2 er H, forøger nærværelsen af Y den immunoregulerende virkning og virkningen mod vira. Hvis X er NH2/ er der immuno= 30 inhiberende virkning med ingen immunostimulerende (immunopo- tentierende) virkning.

Immunoregulerende virkning viser sig at stige med voksende kædelængde af R1, i det mindste fra methyl til og med hexyl. R^ er 2 149857 fortrinsvis n-alkyl, dvs. methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, 2 n-amyl, n-hexyl, n-heptyl eller n-octyl. R er fortrinsvis methyl. R kan være methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, isopropyl etc. Når X er NH2 ,kan forbindelsen foreligge som den fri base 5 eller som saltet med en ikke-toksisk syre, dvs. farmaceutisk acceptabel syre, f.eks. saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre, phosphorsyre, citronsyre, mælkesyrer, vinsyre, salicyl= syre, acetylsalicylsyre, eddikesyre, propionsyre, p-toluen= sulfonsyre, methansulfonsyre, maleinsyre, ravsyre, malonsyre 10 og adipinsyre.

Aminer til dannelse af saltet med para-acetamidobenzoesyre har formlen 15 R3 Γ>(εηΗ2η)0Η r4/ 3 4 hvor R og R er c^_4 alkyl, f.eks. methyl, ethyl, propyl, 20 isopropyl eller butyl, og n er helt tal fra 2 til 4. Typiske eksempler på sådanne aminer omfatter dimethylaminoethanol, dimethylaminoisopropanol, diethylaminoethanol, diethylamino= isobutanol, diethylaminoisopropanol, methylethylaminoethanol, diisobutylamino-N-butanol, dimethylaminopropanol, dimethyl= 25 amino-N-butanol, diisobutylaminoethanol, dimethylaminobutanol, dibutylamino-N-butanol, dibutylaminoethanol, dipropylamino= ethanol og diisopropylaminoethanol. Den for tiden foretrukne amin er dimethylaminoisopropanol.

30

Ved beskrivelsen af forbindelserne nedenfor betegner forkortelsen DIP.PAcBA dimethylamino-2-propanol-p-acet= amidbenzoat. Med mindre et tal i parentes, f.eks. (10),følger denne forkortelse, så er Y 3. Hvis et tal i parentes,følger forkortelsen DIP.PAcBA, betegner tallet antallet af mol Y-35 grupper,som findes pr. mol af 9-(hydroxylalkyl)purinet.

3 149857

En immunomodulator er en forbindelse , som regulerer immunreaktionen. Den omfatter således både immunostimulering (immuno= potentiering) og immunoinhibering. Immunostimulering er natur-5 ligvis nyttig ved opbyggelse af immunitet. Immunoinhibering er også nyttig på en række områder. Immunoinhibering er f.eks. nyttig ved organtranspiantationer, f.eks. nyre- og hjertetransplantationer , for at hindre udstødning.

20 I tabellen, som viser forbindelsernes immunopotentierende egen skaber, angiver et (+) eller et (-) henholdsvis immunostimu-lerende eller immunoinhiberende egenskaber. Tallet 0 angiver, : at forbindelsen hverken havde immunopotentierende virkning eller immunoinhiberende virkning.

15 I nogle af tabellerne indgår adskillige forbindelser, hvor X ikke falder inden for det i kravene anførte. Disse forbindelser, som falder udenfor patentkravene,har som regel forholdsvis lave aktiviteter og er medtaget for at illustrere , at 2o den kendsgerning, at X-gruppen kan have en signifikant virk ning på forbindelsernes egenskaber.

Et mitogen er et stof, som inducerer celleproliferation, som optræder under immunisering.

25

Produkterne fremstillet-Lfølge opfindelsen er nyttige til behandlingen af pattedyr (og celler af pattedyr) inklusive mennesker, svin. hunde, katte, kvæg, heste, får, geder, mus, kaniner, rotter, marsvin, hamstere, aber, etc.

30

Med mindre andet er anført, er alle dele og procenter vægtdele og vægtprocenter.

Alle temperaturer er i °C,med mindre andet er anført.

35

Produkterne kan administreres til pattedyrene på sædvanlig måde f.eks. oralt, nasalt, rektalt, vaginalt, enteralt eller paren-teralt. De kan anvendes som injicerbare opløsninger f.eks. i vand eller som tabletter, piller, kapsler, etc.

4 ' 149857 I det følgende beskrives fremstillingen af en ræKKe udgangsmaterialer (metode A-G) samt fremgangsmåden ifølge opfindelsen (metode H);

Metode A

5 9-(2-HYDROXY-l-PROPYL)HYPOXANTHIN (NPT 15446)

nh2 OH

uf > — uC>

10 AcOH

CE^— CH — CH3 CH2 — CH — CH3

OH OH

15 9-(2-hydroxy-l-propyl)adenin (I, 4,0 g, 20,7 mmol) blev suspen deret i 50% eddikesyre (20 ml),og natriumnitrit (4 g, 58 mmol) blev langsomt tilsat. Blandingen blev omrørt ved 25°C i 3 timer. Den resulterende opløsning blev inddampet til tørhed og iso= propanol tilsat. Denne operation blev gentaget 1 gang. Den 20 faste rest blev kogt i isopropanol og filtreret. Filtratet blev inddampet og krystalliseret ved tilsætning af acetone. Omkrystallisation skete fra isopcopanøl/methanol (98:2). Der blev opnået et farveløst krystallinsk produkt. Udbytte 3,3 g (82%), smp. 244-250°C, uv (H2Oj pH 5,5), λ max 250 nm.

25

Metode B

9-(2-HYDROXY—1-PROPYL)-6-CHLORPURINER 30 Cl |C1 Cl

-J\x"NH2 (C.H.OKCH

V il +h2n-ch2-ch-ch3 -»T F -l±J f|T\ ^ιΛΓ1 I ^N^SNH-CH0-CH-CH,

c OH 2 I 3 I

QH CH~

35 I

CH

/ \ HO CH3 5 ^ 149857

Der anvendtes metoderne ifølge Schaeffer, H.J. Vogel, D. og Vince, R., J. Med. Chem. 8, 502 (1965); og Schaeffer, H.J. og Vince, R., J. Med. Chem. 10, 689 (1967).

5 En opløsning af 5-amino-4,6-dichlorpyrimidin (I, 20 g, 0,12 mol) i 11% ethanolisk opløsning af isopropanolamin (200 ml) blev tilbagesvalet i 8 timer. Reaktionsblandingen blev inddampet til en sirup, ethanol tilsat og derpå inddampet igen. Denne operation blev gentaget én gang. Den resulterende sirup blev hældt 10 i vand (300 ml), hvilket giver en krystallinsk masse. Denne blev frasepareret ved filtrering, vasket med vand og tørret til opnåelse af 19 g rå 9-(2-hydroxy-l-propylamino)-5-amino-6-chlorpyrimidin (II).

15 Den rå forbindelse II blev suspenderet i triethylorthoformiat (120 ml), hvortil der blev sat ethanosulfonsyre (5 dråber).

Efter 15 minutters forløb var alt fast stof opløst, og opløsningen blev holdt ved 25°C natten over. Inddampning i vakuum gav en tyk sirup, som blev underkastet højvakuum inddampning 20 til fjernelse af isopropanolaminoverskuddet. Ved krystalli sation med xylen blev der opnået 5 g råmateriale.

Metode c 25 9-(2-HYDROXY-l-PROPYL)ADENIN (NPT 15431)

Cl r f*2

NTNH,/MeOH

kX> -k* Ll> CH2 CH3 CH2 — CH — CH3 °H Ih 35 9-(2-hydroxy-l-propyl)-6-chlorpurin. (I, 9 g, 42,4 mmol) blev opløst i mættet methanolisk ammoniak og ammoniumchlorid (50 mg). Blandingen blev opvarmet ved 130°C i en bombe i 6 timer. Den resulterende opløsning blev inddampet til tørhed 6 149857 og omkrystalliseret fra ethanol/acetone. Udbytte = 6,68 g af et farveløst krystallinsk produkt (81%), smp. 193-194°C, uv (H20i pH 5,5) Amax 260 nm, tyndtlagskromatografi (TLC) 5 i CHC13 : MeOH (5:1) Rf 0,44.

Analyse beregnet for CgH^NgO : C, 49,73; H, 5,74; N, 36,25; Fundet: C, 49,56; H, 5,62; N, 36,22.

10 Metode p 9-(1-HYDROXYETHYL)-6-MERCAPTOPURIN (NPT 15435)

Cl NH2 SH

SH = C ^

Co-- GQ

ch2-ch2oh ch2-ch2oh 20

Der anvendtes metoden ifølge Schaeffer og Bhargava, Bioche= mistry 4, 71 (1965). 1 2 3 4 5 6 40 9-(1-hydroxyethyl)-6-chlorpurin (I, 2 g, 0,01 mol) og thio= 2 urinstof (0,76 g, 0,01 mol) blev opløst i ethanol (15 ml) og 3 tilbagesvalet i 30 min. Det resulterende bundfald blev filtre 4 ret fra og suspenderet i vand til dannelse af en opslæmning.

5

Neutralisation med natriumacetat gav farveløse krystaller. Ud- 6 bytte 1,5 g (76%) .

Smp. 278“280°C, uv (H20, P1* 5,5) Amax 320, 230 nm.

Metode E 35 9-HYDROXYETHYLHYPOXANTHIN (NPT 15425) 149857 7

Cl OH

0c;> ^ 60

I I

CH2—CH2OH ch2- CH2OH

Der anvendtes metoden ifølge Schaeffer, H.J. og Bhargava, P.S., Biochemistry 4, 71 (1965).

6-chlor-9-hydroxyethylpur.in, III (4 g) , blev langsomt sat til 5 . varmt ΙΊ NaQK (30 ml) og tilbagesvalet i 2 timer. Reaktionsblan dingen afkøles i is og neutraliseres med iseddikesyre. Efter filtrering fjernes dele af uomsat III. Produktet omkrystalliseres fra methanol og vaskes med acetone. Farveløse krystaller. Udbytte 1 g (28%). Smp. 274°C, uv (H20, pH 5,5) , Amax 250 nm.

10

Metode F

9-(1-HYDROXY-2-PROPYL)ADENIN (NPT 15433) 15 Cl NH2 CX> 60 /\ Λ ch3 ch2oh ch3 ch2oh

Der anvendtes fremgangsmåden ifølge Schaeffer, H. og Schwender, 25 C., J. Pharm. Sci., 60, 1204 (1971). Ligeledes Schaeffer et al., J. Med. Chem. 15, 456 (1972).

9-(l-hydroxy-2-propyl)-6-chlorpurin(I, 2,0 g, 9,4 mmol) blev suspenderet i methanol/ammoniak (30 ml),og ammoniumchlorid (50 mg) 3ø blev tilsat som katalysator, og blandingen opvarmet til 130°C

8 149857 i 4 1/2 time. Opløsningen blev inddampet til tørhed. Omkrystallisation fra ethanol af det opnåede råprodukt gav farveløse nåle. Udbytte « 1,15 g (63%) . Smp. = 215-216°C. uv (H20, pH 5,5), Amax 260 nm.

5 Metode G

9—(1-HYDR0XY-2-PR0PYL)HYPOXANTHIN (NPT 15443) jra2 PH

do —, do i ; 15 i /'\ « χχ / \ H-^cr ch9oh h3c ch2oh j * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 9-(l-hydroxy-2-propyl)adenin (I, 4g, 21 mmol) blev opløst i 2 50% eddikesyre (20 ml), natriumnitrit (4 g, 58 mmol) tilsat 3 og blandingen omrørt ved 25°C i 3 1/2 time. Opløsningen blev 4 inddampet til tørhed 2 gange med isopropanol. Resten blev 5 optaget i isopropanol og filtreret, bundfaldet fjernet og 6 filtratet inddampet til dannelse af en gel, som størknede 7 ved tilsætningen af acetone. Udbytte = 3,65 g (90%) farve 8 løse krystaller. Omkrystalliseret fra isopropanol/methanol 9 (98:2), smp. = 202-207°C, TLC i CHCl3:MeOH (5:1), 1 plet 10

Rj “ 0,30, uv (H20, pH 5,5) = Amax 250 nm.

11

Metode h· FREMSTILLING AF NPT 15410 25 0,1 mmol 9-(2-hydroxy-3-nonyl)-6-hydroxypurin, NPT 15392) (27,9 mmg) og 0,3 mmol 2-hydroxypropyl-2-dimethylammonium- 4-(acetylamino)benzoat (DIP.PAcBA) (77,1 mg) blev afvejet nøjagtigt og opløst i 105 ml 0,25% natriumcarbonat (NaCX^) til opnåelse af 0,1% opløsning af NPT 15410 (forbindelsen dannet af NPT 15392 og (DIP.PAcBA) i et 1:3 molært forhold).

149857 9

BEVIS FOR KOMPLEKSDANNELSE

Faseopløselighedsstudier gennemført med NPT 15392 og DIP.PAcBA viser, at NPT 15392 har forøget opløselighed med voksende kon-5 centrationer af DIP.PAcBA under konstante pH-betingelser. Det te er tegn på, at der optræder en reaktion i opløsning til dannelse af et kompleks. I stedet for molforholdet på 1:3 (NPT 15392 og DIP.PAcBA) dannes andre komplekser ved anvendelse af molforhold på 1:1 og 1:10.

10

Faseopløselighedsstudierne blev foretaget på følgende måde:

Opløsninger af 0; 0,5 og 1,0 molær DIP.PAcBA med 0,1 M phos-phat ved pH 7,4 mættedes med NPT 15392 ved 30,0°C. Efter 3 15 dages ækvilibrering på et rystet bad og mellemliggende ju steringer af pH efter behov filtreredes opløsningerne og analyseredes ved HPLC. Analysebetingelserne var:

Kolonne: Spherisorb 10 μ ODS 4,6 x 250 mm 20 Opløsningsmiddel: 60% methanol, 40% 0,05M phosphat pH 3

Detektor: 254 nm absorbans.

Der vandtes følgende resultater: · 25 DIP-PAcBA NPT 15392

Koncentration Koncentration (Molær) (Molær) 0 3,16 x 10“3 30 0,5 1,06 x 10~2 1,0 2,27 x 10-2 Følgende udtryk for associationskonstanten benyttedes: 35 K = hældning/[CQ(1-hældning)]

Hvor C = iboende opløseligehed for NPT15392, K = 6,3.

149857 10

Virusmodvirkende aktivitet er vist i tabellerne 1 og 2.

Tabel 1

INHIBERING AF INFLUENZAVIRUSREPLIKATION VED HJÆLP AF 9-(HYDROXYALKYL)PURINER

(Ϊ) Virusstamme: Influenza A

3 USSR/90 (H^) HC-CH-R2 >1 1

Rx OH

% inhibering af haamadsorp-

Test- Forbindelse tion Foci koncentration forbin- (yg/mlj Testforbindelse seise rir.···' P1 R2" ' X Y j<10 10-100 ?100 _ L5437 Η H SH DIP»PAcBA 65 65 L5447 H CH3 OH DIP-PAcBA 10 26 34 L5432 H CH3 m2 DIP -PAcBA 48 62 L5434 CH3 H NH2 DIP- PAcBA 41 62 L5444 CH3 H OH DIP· PAcBA 44 54 L541R CgH13 H ' OH DIP PAcBA 16 46 52 L5410 CgH13 CH3 OH DIP PAcBA 58 96 96 L5110 - - - DIP PAcBA 0 0 20 11 149857

Tabel 2

INHIBERING AF HERPESVIRUSREPLIKATION VED HJÆLP AF 9-(HYDROXYALKYL)PURINER

6θ - ™· I 2

HC - CH - R

II I

Rx OH

___Forbindelse_______

Procent NPT nr. R1 R2 X Y inhibe- _:_____ring--

15418 c6Hi3 h oh DIP»PAcBA

15410 c6Hi3 CH3 OH· DIP»PAcBA 98% 12 149857 BIOLOGISK AKTIVITET Metoder

Virkning mod influenza - (hæmadsorptionsprøve)

Efter infektion af et monolag, af vævskulturceller med influenzavirus ændres celleoverfladen således, at marsvineerythrocyter kan adsorberes på celleoverfladen. Antallet af adsorberede cellers samlingssteder (hanadsorption fokusser, som danner 5 enheder på HAFFO) er et kvantitativt mål for ineffektivitet.

Metoden er som følger.

Monolagene blev subkultiveret på følgende måde: Mediet blev hældt af,, og monolaget vasket to gange med omkring 50 ml 10 calcium- og magnesiumfri phosphatpufret saltvand (PBS) (GIBCO

nr. 419) ved en pH-værdi på 7,2 pr. vask. En ml trypsin-EDTA-opløsning (GIBCO nr. 530L) indeholdende 0,5 g trypsin (1:250) og 2,0 g EDTA/liter Modified Puck’s Saline A blev tilsat ved 37°C til hver kolbe og dispergeret over monolaget med svag 15 omrystning. Kolberne blev så anbragt i en inkubator ved 37°C

i ca. 3-5 min. afhængig af den tid, som kræves til at fjerne cellerne. Det var nødvendigt ind imellem at omryste. 10 ml plantemedium blev sat til hver kolbe og cellerne dispergeret ved at opsuge og afgive suspensionen fra pipetten. Indholdet 20 fra en række kolber blev forenet,og cellerne i suspensionen 4 blev fortyndet med plantemedium til 7-8,5 x 10 celler/ml. Plantemediet havde følgende sammensætning: Minimun Essential Medium Eagels (MEM) med Earle's salte og Hepes puffer (GIBCO nr. 236) suppleret ved tilsætning af følgende stoffer som 25 specificeret til 87 ml MEM: 10 ml fætal kalveserum (FCS-GIBCO nr. 614HI) 1 ml L-glutamin (200 molær-GIBCO nr. 503) 1 ml chlortetracyklin (5000 g/ml GIBCO nr. 528) 30 1 ml af 10.000 enheder penicil, 10.000 g streptomycin og 10.000 neomycinblanding (PSN-GIBCO nr. 564)

Cellerne blev subkultiveret i Linbro vævskulturbakker. Bakker-35 149857 13 ne bestod af 24 flade bundbrønde (bottom wells) hver med en 3 ml kapacitet pr. brønd. Cellekultursuspensionen (1 ml) blev sat til hver brønd.

5 Den følgende dag blev mediet fjernet og erstattet med frisk plantemedium. Monolaqene blev anvendt til undersøgelse, da de nåede en tilstand, hvori de var næsten konfluente (ca.

3-4 dage).

10 Da Linbro-bakke-Hela cellekulturerne var klar til undersøgelse (se celler) blev mediet dekanteret, og 1 ml vedligeholdelsesmedium (MEM med FCS reduceret til 3%) indeholdende forbindelsen, der skal afprøves ved en given koncentration, blev sat til 4 gentagelseskulturer i en bakke.

15

En række forskellige lægemiddelkoncentrationer varierende fra 2,3 til 150 g/ml blev anvendt. Vedligeholdelsesmedium alene blev anvendt til kontrolkulturer. Efter administrationen af lægemiddel og kontrolmedium blev 0,1 ml af den fortyndede vi-20 russuspension tilsat til forsøgsgrupper og inficerede kontrol

kulturer. Saltvand alene blev sat til ikke-inficerede kontrolkulturer. Linbro-bakkerne blev så inkuberet ved 37°C i 18 timer, hvorefter medier i alle qrupper blev opsuget. Hver kultur blev vasket én gang med PBS. Saltvandet blev opsuget,og 0,5 ml af 25 en 0,4% volumen/volumen marsvine-rød-lalodcellesuspension i PBS

blev sat til hver kulturbrønd. Kulturerne forblev ved stuetemperatur i 30 min, hvorefter mediet blev dekanteret og kulturen vasket to gange med PBS til fjernelse af alt bortset fra de specifikt bundne røde celler. Efter den tredje vaskning 30 blev vedligeholdelsesmedium sat til alle kulturer.

Et Howard mikrometer okular (C8385) blev anbragt i okularet af et Nikon omvendt fase kontrastmikroskop. Hver kultur blev undersøgt nøje med et 4 x lavt påpirobjektiv og direkte optæl-35 ninger af hæmadsorberede røde celler blev foretaget under an vendelse af okulargitteret som områdemærker. Delområder eller fuldstændige områder blev talt pr. forsøgsgruppe afhængigt af de resulterende tal og densiteten af hæmadsorberede celler 14 149857 i de inficerede kontrolkulturer. Forstørrelse på 60 gange eller 150 gange blev valgt til opnåelse af de bedste betingelser for optælling af de hæmadsorberede celler. Områdefaktorer blev beregnet til optælling af hæmadsorption ved 60 5 gange og 150 gange. Ved 60 gange forstørrelse blev det sam lede områdetal beregnet under anvendelse af en multiplikationsfaktor på 55,5. Ved 150 gange forstørrelse var multiplikationsfaktoren 273. Multiplikationsfaktorerne på 55,5 og 273 repræsenterer det samlede antal områder ved-iiønholdsvis 60 gange og 10 150 gange. Antallet af områder, der blev talt, varierede , fra 3 til 5 pr. brønd med 3-4 brønde pr. anvendt ‘behandlings-gruppe (se rådatatabeller i resultatsafsnit for antal undersøgte områder). Middel og standardfejl blev beregnet,og data-en blev vurderet under anvendelse af student t-test analyse.

15

BIOLOGISK AKTIVITET

Virkning mod herpes - (plaque-prøve) 20 Infektionen af vævskulturceller ved hjælp af herpes-virus forårsagede cellelyse. Efter en perioder gøres disse lyserede celler synlige som et lille klart område (plaque) på et lag af celler. Inkorporeringen af teststof i medierne vil reducere antallet af plaque, hvis det er i stand til at hindre 25 virusreplikation. Metoden er som følger:

MATERIALER OG METODER

Virus 30

Der blev anvendt Herpes hominis type 2 indkøbt fra American Type Culture Collection (ATTC), Bethesda, Maryland, ATTC nr.

VR 540, Lot 3d. Den lypotiliserde virussuspension blev rekonstitueret med 1 ml sterilt,destilleret vand. Virussen blev 35 to gange ledt gennem Hela-cellemonolagene. De øverste lag af vævskulturen blev forenet, dispenseret i 1 ml prøver og lagret ved -70°C. Titeren af denne arbejdslagersuspension -4 viste sig at være 10 TCID5Q/0,1 ml (2 dages inkubation).

40

Herpes-vlrus plague-prøve 15 14&857

Vero-celler i log-’vækstfase blev subkultiveret ved en koncen-5 tration på 1 x 10 celler/ml i 50 ml Falcon kolber i Eagle's Minimun Essential Medium (MEM) suppleret med 10% fætal kalveserum (FCS) og antibiotika. Medier blev ændret dagen efter 5 plantningen. Vero-monolagene var løbet sammen den anden dag efter plantningen,og med cellerne i log-fasen blev kulturerne anvendt til plaque-prøven.

Kulturmedier blev hældt af, og monolagene blev vasket én gang 10 med phosphat-pufret saltvand (PBS) . Adskillige forskellige for tyndinger af arbejdslagervirussuspensionen blev fremstillet, og hver kulturkolbe blev inficeret med 0,5 ml af én af virusfortyndingerne tilsat til FSC-frit medium. Dette medium indeholdt lægemiddel ved en koncentration på 150 pg/ml. Der blev 15 fremstillet kontroller med medium uden lægemiddel.

Virusadsorption fik lov til at forløbe i 2 timer ved 37°C, i hvilket tidsrum kulturerne blev bevæget svagt hvert 15. min. Derpå blev medierne hældt af, og monolagene blev vasket 20 én gang med 10 ml PBS.

Der blev fremstillet agarose ved en koncentration på 6% vægt/volumen i 50 ml PBS. Et lagermedium af MEM suppleret med 2% FCS blev fremstillet. Lægemiddel blev tilsat til 25 noget af lagermediet ved 150 yg/ml. De tre opløsninger blev holdt ved 47°C. Desuden blev en 1;10 fortynding af forenet human anti-herpes-sera gjort klar. Netop før behandlingens start blev der sat 15 ml af agaroseopløsningen til 85 ml medium. Andre 15 ml agarose blev sat til 85 ml lægemiddel-30 medium.

Hvert af de vaskede monolag i én gruppe af iforsøg blev behandlet enten med 5 ml agarosemedium eller med 5 ml agarose-lægemid= del-medium. I en anden gruppe forsøg blev hvert monolag behand-35 let endten med 0,2 ml anti-herpes-sera i 5 ml lagermedium el ler med 0,2 ml anti-herpes-sera i 5 ml lægemiddelmedium. Anti- 149857 16 herpes-sera blev anvendt i stedet for agarose til at lokalisere plaque ved neutralisation af eventuelt fri virus i mediet. Kolberne fik lov til at forblive ved stuetemperatur i 5 min., hvorefter de blev inkuberet ved 37°C i 5 dage. Triplikatkul-5 turer blev anvendt til de fleste behandlingsgrupper.

10 ml PBS blev derpå sat til hver kolbe. De øverste lag blev rystet svagt og derpå hældt ud af kolberne. Monolagene blev plettet med opløsning af 0,5% vægt/volumen krystalviolet i 10 50% methanol i tripeldestilleret ^0.

Plaque blev talt enten direkte ved hjælp af transmiterede fluorscerende lys og makroovervågning eller ved anvendelse af lysmikroskopi til mikroplaque. Mikroplaque blev talt ved 15 at tage gennemsnittet af tre områder pr. forsøgsgruppe under 150 gange forstørrelse.

I andre forsøg vedrørende virkning mod virus blev der opnået følgende resultater.

20

Forbindelse % inhibering ved ug/ml Virus 0,1-1,0 1,0-10 10-100 >100

15418 — — >70 >70 Influenza A

25 svin 1976 15410 50-70 30-50 570 >70 (svin) w—ikke testet o 30

Yderligere anti-virusaktivitetstests af forbindelse NPT 15410 er vist i tabel 3.

17 149857

Tabel 3 INHIBERING AF INFLUENZAVIRUS REPLIKATION VED HJÆLP AF NPT 15410 5

Virus Koncentrationsområde (yg/ml) 0,01-1,0 1,0-10,0 10,0-100 Ϊ00 A/svin/7 6 (Ηχ^Νχ) +++a ++ ++++ ++++ A/Texan/77 (¾¾) ++ + ++++ ++++ A/Dunedin/73 (H3N2) NT NT ± ++ A/Jap/305 (H^) NT NT ++++ ++++ A/PRg (HqN,) ++ ++ ++++ +++ A2 Hong Kong (H^) NT NT ++ +++ a) NT = ikke testet + =10-20% inhibering 20 ί =20-30% inhibering ++ =30-50% inhibering +++ = 50-70% inhibering ++++ = >70% inhibering 25

Immunomodulationsaktivitet er vist i tabel 4. 1 35 13" 149857

Tabel 4

MODULATION AF CELLEMEDIERET IMMUNITET VED HJÆLP AF 9-(HYDROXYALKYL) PURINER

1 ί ) · W3 I 2

' HC - CH - R

il 1

Rx OH

Forbindelse ΝΡΤ nr. R1 R2_X Y__

15418 CgHi3 H OH DIP-PAcBA

15410 C6Hi3 CH3 oh DIP-PAcBA

Maksimal procentisk ændring

Mitogen-induceret | Mitogen-induceret(PHA) NPT ' (Con A) muse Human Lymf. Prolif.

lymf. Prolif. .

__0,01-1? 0 1,0-10 10-100 0,01-1, 0 1, 0-10 10-100 15418 41 73 26 15410 140 40 40 30-50 60 <19 U9857

Maksimal procentrisk ændring (forts.) NPT nr; -Dynffokirife.'~induceret· (MMP) marsvinemarkrbfag-prolif.

__0,01-1.0 1. 0-10 '10-100___ 15418 12 80 -50 15410 12 23 5 Adskillige forbindelser blev afprøvet for mitogeninduceret murin lymfocytproliferation med følgende resultater:

Forbindelse % stimulering ved yg/ml 10 01-1,0 1,0-10 10-100 >100 15410 >50 30-50 30-50 ikke testet 15418 20-30 >50 20-30 ikke testet BIOLOGISK AKTIVITET 15

Immunomodulerende prøve

De følgende tre prøvemetoder anvendes til at vurdere teststoffernes evne til at modulere aktiviteten af adskillige 20 klasser af celler i immunsystemet. I disse systemer er det muligt at identificere både immunopotentierende virkning (vist ved en forøgelse af den undersøgte parameter) såvel som immunoundertrykkende virkning (vist ved en inhiberering af den undersøgte parameter).

25 1. Mi togen-induceret muse-miltcelle-prø.ve

Muse-miltceller indeholder en population af både B- og T-lymfocyter, der kan stimuleres ved hjælp af en række frem-30 medstoffer (f.eks. plantemitogener såsom Con A) til hastig formering. Denne forøgede formering er et tegn på forøget celleformidlet immunitet. Metoden nedenfor beskriver systemet, der anvendes til at vurdere teststoffer som immunopo-tentiatorer.

35 20 14as57

MATERIALER

Concanavalin A (Calbiochem, La Jolla, California), Lot nr. 210073, lyofiliseret i NaCl blev fremstillet først som en 1% opløsning og fortyndet som en 2 gange koncentration til 5 hver fortynding (0,5, 1,0, 2,5 ug/ml).

6-8 uger gamle hanr-Balp/c og C^H indavlede mus blev opnået 10 fra de følgende kilder: Flow research Animals, Inc., Dublin,

Virginia; Charles River Bredding Laboratories, Wilmington, Massachusetts; Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana; og Lionel Strong Foundation, San Diego, California.

15 Celler 3-5 mus blev aflivet ved at halsen blev vredet om og miltene udtaget aseptisk. Skyllede milte blev hakket og revet med sterile pincetter, derpå klemt gennem et dobbelt nylonnet.

20 Cellesuspensionen blev vasket én gang med 15 ml RPMI 1640 (vævskulturmedium fra Roswell Park Memorial Institute) suppleret med 5% fætal kalveserum og antibiotika. Celler

C

blev dyrket ved.en koncentration på 10 celler/0,1 ml/kilde i mikroplader. Kulturer blev inkuberet i nærværelse eller 25 fraværelse af mitogen i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CC>2 i 48 timer. Testforbindelsen blev sat til kulturer ved forskellige koncentrationer samtidig med mitogen.

Proliferation 30

Proliferation blev bestemt ved hjælp af graden af inkorpo- 3 rering af 1,0 Ci af [ H] thymidin i løbet af en 18 timers inkubationsperiode. Kulturer blev høstet ved hjælp af en MASH enhed (Otto Hiller Co., Madisom, Wisconsin) og thymi= 35 din inkorporering blev bestemt ved væske scintillation- spektrometri. Kulturer blev gennemført i triplikat og data er udtrykt som middelværdier plus eller minus standardfej- 149857 21 len for den eksperimentelle middelværdi. Lægemiddelstimuleringsindekser i forhold til kontrolværdier blev også beregnet og anført grafisk.

5 2. Mitogen-induceret human periferal blodlymfocytter

Der eksisterer et klinisk behov for terapeutiske midler til at forstærke immunreaktionen i patienter med utilstrækkelig eller undertrykt immuntilstand , således som de eksi-sterer ved virussygdomme eller cancer. Ved at studere midlernes evne til at undertrykke proliferationen af human periferal blodlymfocytter i reaktion på et fremmed stof kan man identificere midler med immunopotentierende virkning hos mennesker. Fremgangsmåden er den netop anførte,og den er ligeledes beskrevet af Hadden, J.W., Infect. & Immunity, februar 1976, side 282-387, specielt side 382-383.

3. Makrophagen repræsenterer en underpopulation af hvide blodceller, som er en vigtig komponent i immunsystemet ved 2q regulering af både cellulær og humuralt immunitet. Det ne denfor beskrevne prøvesystem vurderer de undersøgte stoffer som potentiatorer for makrofagfunktion.

Fytohæmaglutinin (PHA) (HA-17) blev indkøbt fra Burroughs Wellcome. Et præparat indeholdende mikrofag mitogen faktor

“ J

(MMF) og makrophag aktiverings faktor (MAF) blev fremstillet af antigenstimuleret immunlymfeknudelymfocytter (marsvin), som tidligere beskrevet af Hadden et al, Nature 257, 483-485 (1975). Delvis rensning af dette præparat ved vakuum-dialyse og sefadex G-100 søjlekromatografi gav en aktiv fraktion i intervallet fra 35-70.000 daltons, som udviser både mitogene og aktiverende egenskaber. Den aktive fraktion blev anvendt i både proliferation- og aktiveringsprøverne .

35

Metoder

Ficoll-hypaque rensede human periferal blodlymfocytter blev fremstillet,og PHA-induceret lymfocyt proliferation blev bestemt ved inkorporeringen af tritieret thymidin som be- 149857 22 skrevet i Hadden et al, Cell. Immunol. 20, 98-103 (1975).

Hver forbindelse blev analyseret i nærværelse af suboptima- le,optimale og supraoptimale koncentrationer af PHA (henholdsvis 0,01, 0,01, 0,1 enheder/ml). Paraffinolie-induceret marsvineperitoneal makrofager blev fremstillet og inkuberet 5 som monolagkultur ( 98% rene makrofager). Lymfokin (MMF)- induceret proliferation blev bestemt ved inkorporeringen af tritieret thymidin ved 3 og 5 dages kultur,som beskrevet Hadden et al, Nature 257, 483-485 (1975). Lymfokin (MAF)-induceret makrofagaktivering til udryddelse af Listeria 10 monocytogener efter 5 dages kultur i nærværelse eller fra værelse af MAF blev gennemført i løbet af en 6 timers periode, som beskrevet i Hadden and England, Immunopharmaco= logy, side 87-100 (Plenum Press, 1977). Fagocytosis blev msngdebestemt i løbet af en 20 min. behandling med Listeria 15 monocytogener ved.at tælle antallet af makrofager indehol dende bakterier og antallet af bakterier pr. phagocytcelle på g plettet monolag i Laptek kamre. Intracellulær udryddelse af bakterier blev vurderet ved at tælle antallet af celler med indhold af bakterier og antallet af bakterier/celle 20 6 timer efter de første 20 min. behandling. Parallelforsøg, hvori makrofagerne blev lyseret og intracellulære bakterier blev dyrket, bekræfter gyldigheden af bakterieaktivitet bestemt på denne måde i dette system. Lægemidlerne blev anvendt i hver af de 3 systemer over serier log. koncentrations-25 interval i triplikat i nærværelse og fraværelse af mitogen eller lymfokin. Hver forsøgstype blev gennemført mindst 3 gange. Tidligere forsøg viser en parallellisme af reaktion på farmakologisk modulation i proliferations- og aktiveringsprøverne .

30

BIOLOGISK VIRKNING

Anti-leukæmisk virkning (inhibering af L-1210 vækst) 35 Leukæmiske celler isoleret fra mus med L-1210 tumoren dyr kes in vitro,og deres vækst kan måles ved at tælle antallet af celler i kulturen i løbet af en tidsperiode. Inkubere-ringen af et teststof i medierne vil hindre væskten af de leukæmiske celler et tegn på et effektivt anti-leukæmisk middel.

23 149857

IgQ (koncentration af lægemiddel som hæmmer væksten af L-1210) ved % for de afprøvede forbindelser var som følger:

Forbindelse Koncentration (mikrogram/ml) - 15410 54 5 15418 70

Nedenfor er anført det anvendte prøvesystem.

Til måling af inhibering af leukæmisk celle-(L-1210) vækst 10

Se efter at der er en passende cellevæskt i lagerkulturerne. Anvend celler 48-72 timer efter overførslen er sket.

Afvej lægemidlerne ved 50 gange den ønskede slutkoncentra-15 tion og foretag seriefortyndinger.

Tilbered slutmediet under anvendelse af 500 ml McCoy's 5A medium, 15% fætal kalveserum, 5 ml penicillin-streptomycin-opløsning og 5 ml antibiotisk-antimykotisk opløsning og 20 lad henstå ved stuetemperatur.

Anvend steril teknik, tilsæt 0,1 ml af lægemiddelopløsningerne til hvert rør.

25

Tilsæt en passende mængde celler til det fremstillede medium. Efter blanding fjern en prøve på 0,5 ml, anbring den i et prøveglas indeholdende 9,5 ml saltvand og tæl på Coulter tælleren. Multiplicer tallet med 40 for at kompensere for fortyndingen på 40 gange (0,5 ml i 0,5 ml saltvand og op-30 tegn inokulet).

Tilsæt 5 ml cellesuspension til hvert rør. Skvulp kolben rundt hver fjerde rør for at sikre en mere ensartet cellefordeling.

35 24 149857 Tætn kapslerne og anbring i CC^-inkubatoren ved 36-38°C i 96 timer.

Fjern efter 96 timers forløb rørene fra inkubatoren og be-5 stem indholdet i hver på Coulter tælleren. Multiplicer alle tallene med 40. og tag gennemsnittet af 4 optællinger for hver lægemiddelfortynding. Hvis tallet er under inoku-. let angiv 100% inhibering. Hvis tallet er over middelværdien af de 8 kontroltal angiv 0% inhibering. For alle andre 10 tal anvend følgende formels

Gennemsnit af celler/ml i behandlet kultur . -_inok_ulum i celler/ml- χ i0 = % overlevelse

Gennemsnit af celler/ml i kontrol-kulturer - inokulum i celler/ml 100% -% overlevelse = inhibering af vækst på grund af behandling.

^ Do omhandlede forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen har vist sig at inhibere replikationen af en repræsentativ prøve af både RNA- og DNA-vira under anvendelse af standardvævs-> kulturteknikker. I tilfældet af RNA-vira viste det sig, at adskillige stammer af influenzavirus, som hører til både ^ A- og B-subtyperne, blev inhiberet under anvendelse af hæm- adsorptionsteknikken (afsnit II, B). De specifikke forbindelser, som viste sig at inhibere influenzavirusreplikation (type A/USSR 90), er vist i tabel 1. Adskillige medlemmer af serierne -NPT 15410 og NPT 15418 viste sig at 30 inhibere .replikationen af mindst fire -forskel lige stammer af influenzevirus ved koncentrationer fra 1 til 150 g/ml.

Det har desuden vist sig, at adskillige medlemmer af serien 35 npt 15410 inhiberer replikationen af Herpes Simplex

Virus, et medlem af DNA—klassen af vira, og en virus,- , som er ansvarlig for alvorlige mukokutane læsioner hos mennesker , sammen med den alvorlige herpes encefalitis. Andre 40 149857 25 medlemmer af denne klasse af vira er ansvarlige for mund-og klovsyre hos svin og kvæg og infektiøs rhinotracheitis hos katte og kennelhoste hos hunde. Selv koncentrationer under 100 yg/ml NPT 15410 viste sig at redu-5 cere plaque-dannelse forårsaget af Herpes Simplex Virus i en udstrækning på over 90%. Andre medlemmer af RNA- og DNA-klassen af vira er vist i tabel 5 og er ansvarlige for de anførte sygdomme. Af alle sygdomme i verden ved man, at mindst 25% er forårsaget af vira. Der er desuden blevet isoleret en række vira, som man har vist frembringer tumorer. Virusmodvirkende midler kan således forventes i sig selv at have visse tumormodvirkende egenskaber.

Den ovennævnte tabel 4 angiver resultaterne af en vurdering ^ af en række af disse omhandlede forbindelser som potentia- torer for immunreaktionen. Der blev anvendt tre forskellige testsystemer. Den første involverer et mål på testforbindelsens evne til at forøge muselymfocytters evne til at proliferere i reaktion på en plantemitogen (Con A). Det 2Q andet omfatter måling af testforbindelsernes evne til at forøge human lymfocyt proliferation i reaktion på en anden plantemitogen (PHA). Det tredje system måler disse teststoffers evne til at forøge makrophag proliferation i reaktion på en naturlig lymfokin (MMF, Macrophage Mitogenic 2,_ Facto) . Denne sidste reaktion,proliferationen og aktivering af makrophagen har vist sig at være involveret i udryddelsen af bakterier, vira og tumorceller ved denne klasse af hvide blodceller.

Signifikant potentiering af immunoreaktionen er blevet observeret ved 15410 og 15418.

Endelig er aktiviteten af NPT 15410 som inhibitor for væksten af unormale lymfocytter blevet bestemt. Det er ^ bemærkelsesværdigt, at stoffet er i stand til at inhibere proliferationen af museleukæmilymfocytter (en-L-1210 cellelinie) i vævskultur. En 50% inhibering af L-1210 celler blev bevirket af NPT 15410 ved 54 pg/ml. Evnen til at inhibere 149857 26 leukæmilymfocytter ved koncentrationer, som stimulerer normale lymfocytter, er en enestående egenskab, som man ikke kender hos stoffer i nogen anden klasse.

5 Forbindelserne fremstillet ifølae den foreliggende opfindelse er medlemmer af en klasse stoffer,scm -specifikt inhiberer replika-tionen af ENA- og DNA-virus, modulerer (potentierer) immunreaktionen og inhiberer væksten af leukæmilymfocytter. Baseret på in vitro forsøg, som påviser aktivitet over et 10 koncentrationsinterval fra 0,01 til 150 iig/ml, er dosis områder, der er effektive i pattedyr, 0,05-500 mg/kg. En v.

mangel på toksicitet er blevet konstateret ved koncentrationer på 1500 ml/kg i mus for bestemte numre af denne serie.

15

Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen kan f.eks. anvendes til at tilvejebringe modstandsdygtighed overfor invasion af de i tabel 5 anførte vira. 1 27 149857

Tabel 5

Virus Klasse Sygdom

Arenavirus RNA Bjergkløftsyge

Influenza RNA Influenza 5 Rhinovirus RNA Almindelig forkølelse

Poliovirus RNA Polio Mæslinger RNA Røde hunde

Newcastle syge- virus RNA Newcastle syge JO · Rotavirus RNA Gastroenteritis hos børn Hæpatitis type A RNA Infektiøs hæpatitis

Rabies virus RNA Rabies

Arbovirus RNA Encephalitis

Vaccinia virus DNA Kobber j5 Herbes Simples Virus DNA Koldbrand, hjernebetændelse, kønssygdom

Herpes Zoster DNA Helvedesild

Varicella Zoster DNA Skoldkopper

Adenovirus DNA Respiratorisk

Hepatitis type B DNA Kronisk Hepatitis, alvorlig 20 hepatitis

Mund og klovsyge virus DNA Mund og klovsyge

Machupo virus Blødningsfeber 25

UDFORMNINGER

Forbindelserne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse kan gives til et pattedyr i en dosis fra 1-1000 mg/kg legemsvægt og antages at være aktiv ved koncentrationer O Λ helt ned på 0,05 mg/kg. LD^, som bestemt i mus for NPT 15410 givet intraparenteralt, var 4.300 mg/kg, og givet subkutant 4.900 mg/kg.

De kan administreres i tablet- eller kapselform til menne- sker, og hvor opløseligheden tillader i form af sirupper eller injicerbare opløsninger eller i tilfældet med uopløselighed som suspensioner.

35 „„ 149857 28 IN VIVO BEHANDLING AF MUS MED NPT 15410:

VIRKNING PÅ IN VITRO STIMULERINGEN AF MILTCELLE PROLI= FERATION VED HJÆLP AF CONCANAVALIN A

5 -

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme virkningen af inurivo-behandling af mus med NPT 15410 på den efterfølgende aktivitet af miltceller isoleret fra disse dyr og undersøgt in vitro med hensyn 10 til deres proliferative reaktion på mitogenet, Conanavalin A (Con A).

FREMGANGSMÅDE 15 -

In vivo behandling 9.-Balp/c hanmus, .8-9 uger gamle, som vejede 18-20 g, blev ✓ 2Q delt i to grupper. En gruppe blev behandlet to gange dagligt (i 1 dag) om morgenen og aftenen med en oral dosis •af NPT 15410 på 20 mg/kg. En anden gruppe, der blev doseret med saltvand, tjente som en placebo kontrol.

25

In vitro miltcelleprøve: Cellepræparation

Den efterfølgende dag blev hver'gruppe aflivet og miltene udtaget og samlet. Miltene blev pakket og cellerne vasket i RPMI-30 1640 medium (Grand Island Biologicals) suppleret med 2 mm glutamin og antibiotika. Cellekoncentrationen af hvert præparat blev bestemt ved hjælp af en Coulter tæller og ind- g stillet til 5 x 10 celler/ml med RPMI-medium.

35 149857 29

Mikrotiterpladeprøve

Mikrotiterprøver blev gennemført i 0,2 ml inkubationer inde- 5 holdende 5 x 10 celler og Con A eller Con A og NPT 5 15410 ved den anførte koncentrationer. Alle prøver blev gen nemført med 6 replikater og sammenlignet med en blindprøve kun indeholdende celler.· Prøvepladerne blev inkuberet ved 37°C i 5% CC>2 i 4 dage. I de sidste 18-20 timers inkubation blev der sat 0,5 ml 3HTdR (10 μ Ci/ml, 6 Ci/m mol) til •^q hver kultur. Kulturerne blev høstet med en multipel auto- matisk prøvehøster (MASH) enhed, og det inkorporerede HTdR bestemt med en Beckman LS 8000 væskescintillationstæller som et mål for celleproliferation. Resultaterne er angivet som forholdet af aktiviteten i kulturer behandlet med 15 ' Con A eller Con A og NPT 15410 over for bl indkul turerner. .

In vivo-behandling med NPT 15410 forøger den efterfølgende reaktion af miltcellerne in vitro overfor Con A stimulering ved en suboptimal mitogenkoncentration (5 pg/ml). NPT 2o 15410 forøger således stimuleringsforholdet til 100:1 i sammenligning med 55:1 med placeboen. Der opnås ikke nogen signifikante forskelle med NPT 15410 behandling, når cellerne stimuleres med en mere optimal koncentration af Con A (10 μσ/ml).

25

Virkningen af efterfølgende in vitro-behandling af Con A stimulerede celler med NPT 15410 med 1 ,ug/ml blev også afprøvet. Forbindelsen viste -en udpræget evne til at forøge Con A stimuleringen specielt ved den 30 suboptimale mitogenkoncentration (5 yg/ml) og i mindre ud strækning ved 10 yg/ml. Ved 5 yg/1 Con A er stimuleringen ved hiælp af NPT 15410 3,3 gange Con A's alene.

35 Disse resultater viser en immunomodulerende virkning af NPT 15410 på miltcelle proliferation. Forbehandling af dyr med NPT 15410 vil sensibilisere cellerne til efterfølgende mitogenisk stimulering,hvorimod

Claims (4)

149857 cellerne, hvis de in vitro udsættes for N?T 15410 efter mite-genisk stimulering,vil forøge den proliferative reaktion, specielt under betingelser hvor reaktionen på mitogen alene er lav. Patentkrav. 5

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af 9-(2-hydroxyal= kyl)-purins alte af formlen

10 X · <«, N

15 I . ' HC- CH- R2 R1 OH 2q hvori X er OH, N^, SH, OR eller SR (hvor R er alkyl med 1-4 carbonatomer eller benzyl), R^ er H eller alkyl med o 1-8 carbonatomer, R er H eller methyl, Y er saltet af en amin af formlen R3 25 ^N(C H,JOH a n 2n E4 hvor R3 og R4 er lavere alkyl med 1-4 carbonatomer, n er et helt tal fra· 2 til 4, med p-acetamidobenzoesyre ,og z er et helt 30 tal fra 1 til 10, kendetegnet ved, at en forbindelse af formlen 35