FI68234C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara koplexer av 6-substituerade 9-hydroxialkylpuriner - Google Patents

Description

rRl M1. KUULUTUSJULKAISU £ η Ο ΎΛ 11 utlAggningsskrift 0 0^04 *^ (^5) Patentti myönnetty 12 C8 1935 (51) Ky.lk.4/lnt.a.* C 07 D 473/26, C 07 C 91/06, 103/46 SUOMI —FINLAND (21) Pttenttihikemu* — Patenuntöknlng 792849 (22) Hakemlipäivä— Ansöknlngsdag 13.09.79 (FI) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 13.09.79 (41) Tullut Julkiseksi — Blivit offentllg qj gg

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväkslpanon Ja kuul.julkaisun pvm.- ,n Oh 8ς

Patent- och register Styrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skrlften publicerad ju.u^.oj (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begird priorltet 15.09.78 USA(US) 942802 (71) Newport Pharmaceuticals International, Inc., 1590 Monrovia Boulevard, Newport Beach, California,

Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 1275 York Avenue,

New York, New York, USA(US) (72) Lionel Norton Simon, Santa Ana, California,

John Winthrop Hadden, New York, New York, USA(US) (74) Oy Kolster Ab (54) Menetelmä terapeuttisesti käytettävien 6-substituoitujen 9-hydroksi-a1 kyy1ipuriin ien kompleksien valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av terapeutiskt användbara komplexer av 6-substituerade 9~hydroxialkylpuriner

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käytettävien 6-substituoitujen 9-hydroksialkyylipuriinien kompleksien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava

X

I f / <Y)z HC-CH-R2 R1 Eh jossa X on NH9 tai HO, on H tai 1-8 hiiliatomia sisältävä alkyyli, R on H tai metyyli, Y on amunisuola, joka muodostuu p-asetamidobentsoehaposta tai jostain muusta tavallisesta far- 2 68234 maseuttisesti hyväksyttävästä haposta ja amiinista, jolla on kaava R3

^><CnH2n)0H

3-1+ jossa R ja R ovat alempia alkyylejä ja n on kokonaisluku kahdesta neljään, ja jossa z on luku yhdestä kymmeneen.

Nämä kompleksit ovat käyttökelpoisia immunomodulaatto-reina, viruksia vastustavina aineina ja niillä joissakin tapauksissa on kasvaimia vastustavaa vaikutusta. Nämä kompleksit ovat sellaisinaan uusia.

2

Kun R on H, Y:n läsnäolo voimistaa immuniteettiä säätelevää vaikutusta ja viruksia vastustavaa vaikutusta. Jos X on NH2, ilmenee immuniteettiä estävää vaikutusta, mutta ei immuniteettiä stimuloivaa (immuniteettiä synnyttävää) vaikutusta.

Immuniteettiä säätelevä vaikutus näyttää kasvavan R^in ketjun pituuden kasvaessa, ainakin metyylistä heksyyliin saakka. Rx on edullisesti n-alkyyli, toikin sanoen metyyli, etyyli, n-propyyli, n-butyyli, n-amyyli, n-heksyyli , n-heptyyli, tai n n-oktyyli. on edullisimmin metyyli. Kun X on NH0, yhdiste voi olla vapaan emäksen muodossa tai jonkin myrkyttömän, toisin sanoen farmaseutti sesti hyväksyttävän hapon, esim kloorivety-hapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, sitruunahapon, maitohapon, viinihapon, salisyylihapon, asetyylisalisyylihapon, etikkahapon, propionihapon, p-tolueenisulfonihapon, metaanisul-fonihapon, maleiinihapon, meripihkahapon, malonihapon tai adi-piinihapon suolana.

Tyypillisiä esimerkkejä amiineista amiinisuclassa ovat dimetyyliaminoetanoli, dimetyyliamiinipropanoli, dietyyliamino-etanoli, dietyyliaminoisobutanoli, dietyyliaminoisopropanoli, metyylietyyliaminoetanoli, di-isobutyyliamino-N-butanoli, dimet-yyliaminopropanoli, dimetyyliamino-N-butanoli, dibutyyliamino-N-butanoli, dibutyyliaminoetanoli, dipropyyliaminoetanoli ja di-isopropyyliaminoetanoli. Tässä yhteydessä edullisin amiini on dimetyyliaminoisopropanoli, z on edullisimmin 3.

Il 3 68234

Vaikkakin on edullista käyttää yhdisteitä, joissa Y on amiinin R3

/N(CnH2n>0H

p-asetamidobentsoehapon kanssa muodostettu suola, voidaan myös käyttää suoloja, joissa happo on jokin farmaseuttisesti hyväksyttävä happo, muu kuin p-asetamidobentsoehappo, esimerkiksi kloorivetyhappo, rikkihappo, bromivetyhappo, fosforihappo , etikkahappo, propionihappo, malonihappo, maitohappo, sitruuna-happo, viinihappo, p-tolueenisulfonihappo, adipiinihappo, ma-leiinihappo, meripihkahappo, metaanisulfonihappo, salisyylihappo, asetyylisalisyylihappo.

Alla olevissa yhdisteiden kuvauksissa lyhenne DIP.PacBA tarkoittaa dimetyyliamino-2-propanoli-p-asetamidobentsoaattia. Ellei tätä lyhennettä seuraa suluissa oleva numero, esimerkiksi (10), on Z 3. Mikäli lyhennettä DIP.PAcBA seuraa suluissa oleva numero, tämä numero merkitsee läsnä olevien Y-ryhmien mooli-määrää yhtä 9-(hydroksialkyyli)-puriinimoolia kohden.

Immunomodulaattori on yhdiste, joka säätelee immuunireaktioita. Käsite kattaa sekä immuniteetin stimulaation että immuniteetin estämisen. Immuniteetin stimulaatio on tietenkin hyödyllinen luotaessa immuniteettiä. Immuniteetin estämisellä on niin ikään käyttöä joillakin aloilla. Se on hyödyllinen esimerkiksi elinten siirroissa, kuten munuaisten ja sydämen siirrossa elimistön hylkimisreaktion estäjänä.

Yhdisteiden immuniteettiä synnyttäviä ominaisuuksia esittelevissä taulukoissa plus-merkki (+) ja miinus-merkki (-) merkitsevät immuniteettiä stimuloivia tai immuniteettiä estäviä ominaisuuksia vastaavasti. Numero 0 tarkoittaa, että yhdisteellä ei ole immuniteettiä synnyttävää eikä sitä estävää vaikutusta.

Mitogeeni on aine, joka aiheuttaa solujen lisäkasvua, kuten immunisaatiossa tapahtuu.

Taulukossa 1 käyvät ilmi keksinnössä käyttökelpoiset komp-leksiyhdisteet. Myös vastaavat kantayhdisteet (yhdisteet, jotka 11 68234 eivät sisällä ryhmää y) ovat mukana vertailun vuoksi sekä iden-tifointisyistä.

TauLukossa 1 mainitut synteettiset menetelmät L ja K on kuvattu yksityiskohtaisemmin jäljempänä.

Kaikki osuudet ja prosenttimäärät ovat paino-osia ja paino-%, ellei toisin ole mainittu.

Kaikki lämpötilat ovat Celsius-asteita, ellei toisin ole ilmoitettu.

Taulukko 1 9-(hydroksi-alkyyli)-puriinien kemiallisten ominaisuuksien yhteenveto Λ ,vv f · Y 2

HC-CH-R

1 1 Ϊ R 0H Synteettinen N.0 Yhdiste menetelmä - 2 _pr_pr_x_y_

15425 H H OH D

15428 H H OH DIP.PAcBA L

15446 H CH3 OH A

15447 H CH3 OH DIP.PAcBA L

15431 H CH3 NH2 - B

15432 H CH3 NH2 DIP.PAcBA L

15433 CH3 H NH2 G

15434 CH3 H NH2 DIP.PAcBA L

15443 CH3 H OH H

15444 CH3 H OH DIP.PAcBA L

15417 C6H13 H OH I

15418 C6H13 H 0H DIP.PAcBA L

15392 C6H13 CH3 OH J

15410 C6H13 CH3 0H DIP.PAcBA L

15426 C6Hi3 ch3 nh2 HC1 Salt K

5 68234

No. UV-spektrit Alkuaineanalyysi kons .

_Sp.°C ^maks. frjnin. 10 ^ pH_C_H ! N

•jchoc 97U 250 222.5 11.93 7 1 250 219 11.0 1 254 221.5 12.53 10 15428 -- 250 223.5 ΪΤ70 7 15446 244-5 250 220 10.6 1 254 223.5 12.1 10 15447 --- 261 228 15.8 7 lask. 49.73 5.74 36.25 15431 188 259 231 15.4 1 saatu 49.56 5.62 36.22 261 225 15.7 10 15432 “ “ -- 261.5 228 13.56 7 15433 215-16 259 231 13.26 1 261 224.5 13.80 10 15434 25Ö 22~3 7TT2 7 15443 198-199 250 218 6.91 1 255 225.5 7.91 10 15444 ~~ ---- 250 224 11.09 7 lask. 59.07 7.65 21.16 15417 226 250 220 10.37 1 saatu 59.01 7.55 21.24 255 223 11.96 10 15418 - 250 224 12.1 7 lask. 60.41 7.97 20.13 15392 202 248 222 13.3 1 saatu 60.47 7.86 20.08 254 220 14.1 10 15410 ---- 261 230 9777 7 lask. 53.58 7.71 22.32 15426 176-9 259 233 9.60 1 saatu 53.56 7.67 22.34 _251 235_9.77 10_

Muita keksinnön piiriin kuuluvia yhdisteitä on esitetty seuraavassa taulukossa la, jonka peruskaavio on sama kuin taulukossa 1. Taulukoissa 1 ja la R^:tä tarkoittavat alkyyliryhmät ovat kaikki n-alkyylejä.

68234

Taulukko la Yhdiste _X_Y__ C_H,0 OH- OH DIP.PAcBA(lO) bio o C_H,„ CH0 OH DIP.PAcBA(l) ulo o H CH„ OH DIP.PAcBAC10)

O

H CH3 OH DIP.PAcBAC1)

CH3 CH3 OH DIP.PAcBA

C^Hc H OH DIP.PAcBA

C3Hy H OH DIP.PAcBA

C2H5 CH3 OH DIP.PAcBA

C3H? CH3 OH DIP.PAcBA

C^Hg H OH DIP.PAcBA

C4Hg CH3 OH DIP.PAcBA

CcH,, H OH DIP.PAcBA

C5H11 CH3 OH DIP.PAcBA

C„H,, H OH DIP.PAcBA

/ Ib

C„H.c CH0 OH DIP.PAcBA

/Ib o

0οΗη„ H OH DIP.PAcBA

o /

CgH17 CH3 OH DIP.PAcBA

H CH3 OH DIP.PAcBA(lO) H CH3 OH DIP.PacBA(l) 68234 7 Lähtöaineiden valmistus:

Menetelmä A

9-( 2-hydroksi-l-propyyli)-hypoksantiini (NPT 154-46) fo*. &

N ÄCOH

CHr—· CH —CH3 CH^-CH—CH3

2 i I

OH 0H

9-(2-hydroksi-l-propyyli)-adeniinia (I, 4,0 g, 20,7 mmoo-lia) suspendoitiin 50 %:seen etikkahappoon (20 ml) ja lisättiin hitaasti natriumnitriittiä (4 g, 58 mmoolia). Seosta sekoitettiin 25 :ssa 3 tuntia. Saatu liuos haihdutettiin kuiviin ja lisättiin isopropanolia; tämä toimenpide toistettiin vielä kerran. Kiinteää jäännöstä keitettiin isopropanolissa ja suodatettiin. Suodos haihdutettiin ja kiteyttäminen suoritettiin lisäämällä asetonia. Uudelleen kiteytys tapahtui isopropanolin ja metano-lin seoksesta (98:2); saatiin väritön kiteinen tuote.

Saanto 3,3 g (82 %), sp. 244-250°, UV (H20; pH 5,5) maks 250 nm.

Menetelmä B

9-(2-hydroksi-l-propyyli)-6-klooripuriini (lähtöaineiden lähtöaine) 8 68234 n'iF' 2+h n-ch -ch-ch—> I T —LL-i^ I |Γ ^ I II 2 2 J 3 l^N>^H-<I2-CH-CH ' ^ JX.N/

OH J N I

OH ' CH0

CH

/ \ HO CH3 Käytettiin H.J. Schaefferin, D. Vogelin ja R. Vincen menetelmää, J. Med. Chero. 8, 502 (1965); ja H.J. Schaefferin ja R. Vincen menetelmää, J. Med. Chem· 10, 689 (1967).

Keitettiin palautusjäähdyttäen 8 tuntia liuosta, joka sisälsi 5-amino-k,6-diklooripyrimidiiniä (I, 20 g, 0,12 moolia) isopropanolin 11 %:sessa etanoliliuoksessa (200 ml). Reaktioseos haihdutettiin siirappimaiseksi, lisättiin etanolia ja haihdutettiin uudelleen; tämä toimenpide toistettiin vielä kerran.

Saatu siirappimainen aine kaadettiin veteen (300 ml), jolloin saatiin kiteinen massa. Tämä koottiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin saaden 19 g 9-(2-hydroksi-l-propyyliamino)- 5-amino-6-klooripyrimidiinin (II) raakatuotetta.

Yhdisteen II raakatuote suspendoitiin trietyyliorto-formiaattiin (120 ml), johon lisättiin etaanisulfonihappoa (5 tippaa). 15 minuutin kuluttua kiinteä aine oli kokonaan liuennut ja liuosta seisotettiin 25°:ssa yön ajan. Vakuumissa haihduttamalla saatiin paksu siirappi, josta vielä vakuumissa painetta alentamalla poistettiin haihduttamalla ylimääräinen isopropano-liamiini. Ksyleenistä kiteyttämällä saatiin 5 g raakatuotetta.

Il 9 ·

Menetelmä B

9-(2-hydroksi-l-propyyli)-adeniini (NPT 15431) 68234

Cl .NH2 ÖQ .¾¾ CxJ> CH5—CH—CH, CH^-CH —CH, I 1

OH ÖH

9-(2-hydroksi-l-propyyli)-6-klooripuriinia liuotettiin (I, 9 g, 42,4 mmoolia) ammoniakin kyllästettyyn metanoliliuok-seen ja ammoniumkloridiin (50 mg). Seos kuumennettiin pommiput-kessa 130°:seen kuudeksi tunniksi. Saatu liuos haihdutettiin kuiviin ja jäännös kiteytettiin uudestaan etanoli/asetoni-seok-sesta. Saanto = 6,68 g väritöntä kiteistä tuotetta. (81 %), sp. 193-194°, UV (H20; pH 5,5) foaks 260 nm, TLC CHCl^MeOH-seoksessa (5:1) 0,44.

Analyysi: laskettu kaavalle CgH^NgO: C, 49,73 ; H, 5,74; N, 36,25; Saatu: C, 49,56, H, 5,62; N, 36,22.

10 68234

Menetelmä D

9-hydroksietyyli-hypoksantiini (NPT 15425)

Cl OH

CjO

j j

CHJ—CH2OH CH2~CH2OH

Käytettiin H.J. Schaefferin, ja P.S. Bhargavan menetelmää, Biochemistry 4, 71 (1965).

Lisättiin 6-kloori-9-hydroksietyyli-puriinia, III (4 g), hitaasti lämpimään 1 N NaOHiiin (30 ml) ja keitettiin palautus-jäähdyttäen 2 tuntia. Reaktioastia jäähdytettiin jäillä ja seos neutraloitiin jääetikalla. Suodatukseen jälkeen reagoimaton osa yhdisteestä III poistettiin suodattamalla. Tuote kiteytettiin metanolista ja pestiin asetonilla. Värittömiä kiteitä. Saanto 1 g. (28 %); sp. 274°; UV (H20, pH 5,5), Xmaks 250 nm.

Il

Menetelmä G

9-(l-hydroksi-2-propyyli)-adeniini (NPT 15433) 11 68234

Cl nh2 I II V NH3/MeOH χ | || ^ i3o° >

CH CH

/ \ /\ CH3 ch2oh ch3 ch2oh Käytettiin H. Schaeffetin ja C. Schwenderin menetelmää, J. Pharm. Sei., 60, 1204 (1971). Käytettiin myös Schaefferin et ai. menetelmää, J. Med. Chem. 15, 456 (1972).

9-(l-hydroksi-2-propyyli)-6-klooripuriinia (I, 2,0 g, 9,4 mmoolia) suspendoitiin metanoli/ammoniakki-seokseen (30 ml) ja lisättiin ammoniumkloridia (50 mg) katalyytiksi ja kuumennettiin seos 130°:seen 4,5 tunniksi; liuos haihdutettiin kuiviin. Kiteyttämällä saatu raakatuote etanolista saatiin värittömiä neulasia. Saanto = 1,15 g (63 %), sp. = 215-216°, UV (H20, pH 5,5) ^.maks 260 nm.

68234

Menetelmä H

9-(l-hydroksi-2-propyyli)-hypoksantiini (NPT 15443)

NH2 OH

CjC") CjC)

Ac Oh '

/\ /K

h3C ch2oh h3c CH2OH

I II

9-(l-hydroksi-2-propyyli)-adeniinia (I, 4 g, 21 mmoolia) liuotettiin 50 %:seen etikkahappoon (20 ml), lisättiin natrium-nitriittiä (4 g, 58 mmoolia) ja seosta sekoitettiin 25°:ssa 3,5 tuntia. Liuos haihdutettiin kuiviin kahdesti isopropanolilla. Jäännös otettiin talteen isopropanolilla ja suodatettiin, soastuma hylättiin ja suodos haihdutettiin, jolloin muodostui geeli, joka asetonia lisättäessä jähmettyi. Saanto = 3,65 (90 %) värittömiä kiteitä. Tuote kiteytettiin uudelleen isopro-panoli/metanoli-seoksesta (98:2). Sp. = 202-207°, TLC CHCl^/-MeOH-seoksella (5:1) 1 täplä Rf = 0,30, UV (H20, pH 5,5) /[ maks 2 5C nm.

Menetelmä I Yhdiste NPT 15417 Käytettiin Schaefferin et ai menettelyä, Journal of Pharmaceutical Sciences 16:1204-1210.

Tuote on yhdiste XL Schaefferin et ai taulukossa III.

ti 68234 13

Menetelmä J

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (NPT 15392)

Juoksukaavioista 1 ja 2 käy ilmi erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyylD-hypoksantiinin (Nonyylihypoksantiini, VIII) synteesi-vaiheiden luonnos. H.J. Schaefferin ja C.F. Schwenderin menetelmään, J. Med. Chem., 17, 6 (1974), erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyy-1 i)-6-klooripuriiniin johtavaan reaktiosarjaan tehdyt parannu).set on mainittu. Viimeinen vaihe, 6-klooripuriinijohdannaisen (VII) hydrolyysi, jolla päästään nonyylihypoksantiiniin (VIII), on A. Giner-Sorollan, C. Gryten, A. Bendichin ja G. B. Brownin julkaisussa J. Org. Chem. 34,.2157 (1969) esittämän halogeeni-puriinien hydrolysointimenetelmän sovellutus.

Vaihtoehtoinen tie, toisin sanoen erytro-9-(2-hydroksi- 3-nonyyli)-adeniinin (EHNA) (IX), nitrosointi, jolla päästään Nonyylihypoksantiiniin (VIII) (esitetty juoksukaaviossa 2), käsittää kloorijohdannaisen (VII) muuttamisen ennalta ammonolyy-sillä aminopuriiniksi (IX, EHNA), mitä seuraa nitrosointi Nonyylihypoksantiinin (VIII) saamiseksi.

Juoksukaavio 1

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-nonyyli)-hypoksantiinin (VIII) synteesin luonnos

Vaihe 1 Asetamidononaani-2-oni (II) 2-amino-oktaanohapon asylointi (CH3CO)20 ' CH^” [CH2] g~CH — COOH-> CHy-(CH2]-y-CH2—COCH3

| 701 I

nh2 nh2 1

II

w 68234

Vaihe 2 Asetamidononaani-2-onin hydrokloridi (III)

Asetamidononaani-2-onin hydrokloridin muodostaminen CH~ [CH2] —CH-COCH3—'-) CHj- [CH2] g— CH— COCH3 nh2 nh2-hci

II III

Vaihe 3 Eryro-3-amino-2-nonanoli (IV)

Asetamidononaani-2-onin hydrokloridin pelkistäminen KBH4 CHx— [CH-] = CH COCH,-> CH:r— ICH,] r—CH—CH—CH, 3 I 3 75% 3 [I 3 NH2*HC1 nh2 oh

III IV

(Nuolen alla olevat luvut tarkoittavat saantoa prosentteina)

Vaihe M· Erytro-S-araino-^-kloori-G-(2-hydroksi-3-nonyyli-amino)-pyrimidiini (VI)

Erytro-3-mino-2-nonanolin kondensointi G-amino-1*, 5-diklooripyrimidiiniä il 68234 15

Cl Cl NH-, lCJH2]5

Il I 2 :iÄT* L 1

^ κ,^^-Cl CHOH ^ *?H

I 1

γη CH

CH3 / \

CH3 [CH2J5 CHOH

ch3

V IV VI

Vaihe 5 Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-klooripurii-ni (VII)

Erytro-5-amino-4-kloori6-(2-hydroksi-3-nonyyliamino)-pyrimidiinin (V) renkaan sulkeminen.

Cl Cl

N<^\p-NH2 (C2H5 0)3CH

L JL 100% W

I CH

CH / \

/\ CH3- ICH2]5 CHOH

ch3 [ch215 choh ch^ ch3 16 68234

Vaihe 6 Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (VIII) (Hydrolysoimalla 6-kloorapuriinijohdannainen)

OH

L 1004 | N |

CH

/ \ / \ „

CH [ CH 2 ] 5 CHOH [CH2] 5 ^HOH

L3 / CHj CH3 1

II

VI11 68234 17

Juoksukaavio 2

Erytro-9-(2-hydroksx-3-nonyyli)-hypoksantiinin (VIII) vaihtoehtoinen valmistustie

Vaihe la Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniini (IX) Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-klooripurii-nin (VII) ammonolyysi

Cl Cl N NH3 \ wX/ ujL.)

.CH CH

/ \ /X

CH3—tCH2]5 ^HOH CH— [CH2]5 CHOH

CH, .1 3 ch3

VII IX

Vaihe 2b Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (VIII) erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniinin (IX) nitrosointi 18 68234 nh2 oh w ^ '0c>

I L

/ \ / \

CH^-[CH215 CHOH CH3 ICH2]5 j0H

CH3 CH3

IX VIII

3-asetamidononaani-2-oni (II) (CH3CO)2) CH3— [CH2J—CH-COOH-Ϊ CH3— [CH2J 5 CH-COCH3 I 70% 1 NH2 NH2

I II

Seosta, joka sisälsi 2-amino-l-oktaanohappoa (I, 200 g) 1,26 moolia) asetanhydridissä (960 ml) sekä pyridiiniä (640 ml), kuumennettiin kiehuvalla vesihauteella 4 tuntia. Reaktioseos haihdutettiin vakuumissa ja jäännös erotettiin 6-8 kertaa 5 %:sella NaHCO^rn vesiliuoksella (400 ml) ja eetterillä (400 ml). Yhdistetyt eetteriuutteet kuivattiin vedettömällä MgS04:llä ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 3-asetamidononaani-2~ onin raakatuote, 154 g (70 %).

Il 19 ' 3-amino-2-nonanonin hydrokloridi (III) 68234 HCl CHi— [CH-J-r— CH-COCH,-» CH=-[CH,],- CH-COCH, 3 2 5 I 3 . 67% 3 I 3 - NH, NH, ‘HCl II 2 III 2

Edullisessa toimenpiteessä saatu raakatuote (154 g) liuotettiin kloorivetyhapon konsentroituun vesiliuokseen (1,540 ml) ja keitettiin palautusjäähdyttäen 2 tuntia ja haihdutettiin sitten kuiviin vaJcuumissa. Saatu kiinteä aine kiteytettiin uudelleen lämpimästä etanoliliuoksesta (200 ml) ja jäähdytettiin sitten 25°:seen. Tähän liuokseen lisättiin eetteriä (600 ml). Tällöin ilmestyi valkea kiteinen saostuma; suspensiota seisotettiin 5°:ssa yön ajan. Saostuma koottiin ja pestiin eetterillä (kerran 100 ml :11a) jolloin saatiin 125 g (67 %) valkeata kiteistä tuotetta, sp. 112°, hajoaa;

Mikäli kiteinen aine ei olisikaan valkoista tai sen sulamispiste olisi alhainen, se olisi kiteytettävä uudelleen hiilen avulla tetrahydrofuraanista. Tätä toimenpidettä suoritettaessa käytettiin 150 ml hydrofuraania 100 g hydrokloridin (III) raakatuotetta kohden.

Erytro-3-amino-2-nonanoli (IV) KBH.

CH^-ICH-]* CH COCH,-^ CH= [ CH - ] r— CH r-CH — CH _ 3 5 I 75« 3 2 5 / \

NH2*HC1 NH2 OH

III IV

3-amino-2-nonanolin hydrokloridia (43,8 g, 0,226 moolia) liuotettiin absoluuttiseen metanoliin (150 ml) ja jäähdytettiin -10°:seen jää-suolahauteessa. 1/ Lisättiin kalium-boorihydridiä (24,4 g, 0,45 moolia) pieninä annoksina 2/ 2-3 tunnin aikana. Seosta pidetään sitten -10°:een ja -15°:een välisessä 20 68234 lämpötilassa 3 tuntia 3,4/ ja annettiin hitaasti lämmetä huoneen lämpötilaan (22°) ja sekoitettiin sitten yön ajan (20 h) huoneen lämpötilassa. Seos haihdutettiin sen jälkeen kuiviin (siirappimaiseksi) vakuumissa ja erotetaan vedellä (150 ml) ja kloroformilla (150 ml). Vesikerros uutettiin vielä (3 x) kloroformilla (100 ml kukin). Kloroformikerros kuivattiin MgSO^illä ja haihdutettiin vakuumissa, jolloin saatiin hieman kellertävä öljymäinen tuote. Tämä neste tislattiin vakuumissa (0,15 mm Hg) 95 - 100°:ssa, jolloin saatiin puhdas erytro-3-amino-2-nonano-li, 26,4 g, 75 % saanto, sp. 81-86°.

1. Jäähdytettäessä yhdisteen III liuosta saostuu hiukan ainetta; tällä ei ole vaikutusta reaktion lopputulokseen.

2. Tässä kohdassa kyseinen menetelmä eroaa Schaefferin et ai. menetelmästä. Schaeffer lisää etikkahapon samanaikaisesti KBH^:n kanssa pitäen pH:n välillä 5-6. On havaittu, että neutralointi saa aikaan KBH^:n häviötä ja että yli 5:n olevat pH-arvot ovat vielä mahdollisia. Vieläkin tärkeämpi on se seikka, että etikkahapon ja KBH^:n samanaikainen lisääminen (kuten Schaeffer ehdottaa) tekee reaktiosta hyvin vaikeasti hallittavan. Lämpötila kohoaa huomattavasti ja aiheutuu saantohäviöi-tä ja/tai tuotteen laatu kärsii.

3. On suositeltavaa käyttää tehokasta sekoitusta reaktion asianmukaisen kulun varmistamiseksi, sillä reaktio on päättynyt vasta kun kaliumboorihydridikokkareet ovat kokonaan kadonneet.

4. Jäähdyttäminen 0°:seen, kuten Schaeffer et ai kuvaavat (menetelmä D, rivi 4 ja siitä edelleen) on riittämätöntä. On parempi pitää reaktion lämpötila selvästi 0°:seen alapuolella; parasta on pitää se alle -10°:ssa koko ajan. Mikäli lämpötila pääsee kohoamaan yli -10°:seen saattaa aiheutua huomattavia saantohäviöitä.

II

21 68234

Erytro-5-amino-4-kloori-6- (2-hydroksi-3-nonyyliami.no )- pyrimidiini (VI) 91 ci f iT'”"2 n-^V-nh* kA, . ^ Γ ™2oh ^ I 2

CH

/ \

CH3 ICH2J- CHOH

5 I

CH3

v IV VI

25°:ssa sekoittamalla valmistettiin ;seos, joka sisälsi 4,6-dikloori-5-aminopyrimidiiniä (V, 24,6 g,O,15 moolia) ja erytro-3-amino-2-nonanolia (IV, 26,2 g, 0,164 moolia) 1-penta-nolissa (1,080 ml) ja tributyyliamiinissa (350 ml). Saatua suspensiota keitettiin palautusjäähdyttäen typpikaasukehässä 28 h (liukeneminen tapahtui noin puolessa tunnissa). Tässä vaiheessa reaktiotuotteesta otettu näyte antoi UV:llä Anaks 267 ja 297 nm (H20, pH 5,5).

Saatu liuos konsentroitiin kuumalla vesihauteella 10 mm:n paineessa siirappimaiseksi ja haihdutettiin edelleen öljyhau-teella 0,1 mm:ssä ja 100°:ssa saaden tahmea neste, johon lisättiin n-heksaania (450 ml). Seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 1 tunti ja kuuma kellertävä pinnalle noussut heksaani erotettiin pyöreäpohjäisen kolvin pohjalle jääneestä nesteestä.

Saadusta vaaleanruskeasta öljystä haihdutettiin vakuumissa viimeisetkin jätteet heksaanista ja se liuotettiin sitten kloroformiin (150 ml). Tämä kloroformiliuos uutettiin 8 kertaa NaHCOgin kyllästetyllä vesiliuoksella (250 ml kullakin kerralla). Kloroformikerros erotettiin sitten, kuivattiin (natrium- tai magnesiumsulfaatilla) ja haihdutettiin vakuumissa (0,1 mm) 40°:ssa _______— — 11 ____ 22 68234 (vesihaude), jolloin saatiin ruskea, jäähtyessään kiteytyvä öljy. Tätä ainetta voidaan käyttää sellaisenaan seuraavassa vaiheessa tai se voidaan puhdistaa seuraavasti: Saatu öljy liuotettiin 75-100 ml:aan kloroformia ja tähän lisättiin n-heksaania (noin 300 ml), jolloin saostunut valkea kiteinen aine suodatettiin jäähtyneestä liuoksesta. (Uuttaminen suoritetaan 4-8 kertaa, kunnes hiilidioksidia ei enää vapaudu). Tämä käsittely . toistettiin vielä kaksi kertaa. Saanto: 23,3 g (54 %), UV Amaks 267 , 297 (HgO, pH 5,5), sp. 113-116°C.

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-klooripuriini (VII)

Cl Cl I (OC2H5)3CH q ·\ 100%

l I

/ \ / \

CH3 lCH2J5 ^0011 CH3—lCH2J5 CHOH

ch3 ch3 1

VII

Edellä saatu erytro-5-amino-4-kloori-6-(2-hydroksi-3-nonyyliamino)-pyramidiiniä sisältävä siirappimainen raakatuote (11,48 g, 40 mmoolia) liuotettiin trietyyliortoformiaat-tiin (106 ml) ja kloroformiin (34 ml), etaanisulfonihap-poa (10 tippaa) lisättiin liukenemisen helpottamiseksi. Liuosta seisotettiin 25°:ssa yön ajan, ja haihdutettiin se sitten siirappimaiseksi vakuumissa. Saanto 11,7 g (kvantitatiivinen).

Tämä erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-klooripuriinin (VII) raa-katuotteesta koostuva siirappi käytettiin seuraavassa vaiheessa. Amaks. 2 64 nm.

23 68234

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (VIII) (6-klooripuriinijohdannaisen hydrolyysillä)

Cl OH

k X> (X>

I I

CH

/ \ / \

CH3-tCH2U CH0H [CH~] _ CHOH

I / I

CH3 / c»3 CH3

VII VIII

Suspensiota, joka sisälsi erytro-6-kloori-9-(2-hydroksi- 3-nonyyli)-puriinia (VII, 4,0 g, 13,4 mmoolia) 0,5 N naOHrssa (40 ml), keitettiin palautusjäähdyttäen 2 tuntia ja jäähdytettiin se sitten. Neutralointi jääetikalla ja jäähdyttäminen antoi erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiinin (VIII) kiteisenä saostumana, joka suodatettiin ja kuivattiin. Saanto: 3,8 g (kvantitatiivinen), sp. 196°, UV maks (pH 5,5) 251 nm.

Näin saatu raakatuote (VIII) osoittautui homogeeniseksi paperikromatografiällä (3 liuotinta) ja antoi negatiivisen tuloksen Cl -testillä (kuparilanka ja liekki; sulatus natriumin kanssa, happamaksi tekemisen ja hopeanitraatti).

Kiteytettäessä raakatuotenäyte kolme kertaa uudelleen etanolin vesiliuoksesta (katso puhdistaminen) saatiin värittömiä kiteitä. Sp. 202°. Laskettu kaavalle (VIII): C, 60,41; H, 7,97, N, 20,13. Saatu: C, 60,47; H, 7,86; N, 20,08.

2* 68234

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiinin (VIII) puhdistaminen

Nonyylihypoksantiinin (VIII) raakatuote puhdistetaan uudelleen kiteyttämällä. Epäpuhdas aine liuotetaan kuumentamalla painoonsa nähden 6-10 kertaiseen määrään etyylialkoholia ja lisätään tilavuudeltaan yhtä suuri määrä HjO. Liuosta käsitellään hiilellä erlenmeyerkolvissä ja se suodatetaan seliitillä kuumana. Liuosta haihdutetaan jatkuvasti sekoittaen sähkölevyllä.

Vettä lisätään pieninä annoksina haihtuneen tilavuusmäärän tilalle, kunnes muodostuu runsas saostuma. Liuosta haihdutetaan jatkuvasti kaiken etyylialkoholin poistamiseksi lisäten samalla vettä, jotta seoksen tilavuus pysyy noin 8-12 kertaisena saostuman painoon nähden. Ainehäviö on noin 10 % kullakin kiteytyskerralla. Kahdella kiteyttämisellä sulamispiste saatiin kohoamaan 202°:seen ja kiteinen tuote oli väritön, kun raakatuote taas oli hieman keltainen tai vaaleanpunainen ja suli 192°:ssa.

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniini. HC1 (IX)

Cl NH2 rtö ^ 6:> N J N | ’«Cl

CH /CH

/ \ X \ CK3- (CI12J5 CHOH CHj-(CII3). Vuon CH3 CHj 1

IX

25 6 8 2 3 4

Edeltävissä vaiheissa saatu erytro-9-( 2-hydroksi-3-nonyyli)- 6-klooripuriinin (VII) öljymäinen raakatuote liuotettiin ammoniakin kyllästettyyn metanoliliuokseen 300 ml ja ammoniumklori-diin (1 g) 80-100°:ssa 1 tunnin ajan ruostumattomasta teräksestä valmistetusssa pommiputkessa (Parr Instruments). Jäähdytyksen jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Lisättiin metano-lia ja haihdutettiin uudestaan (3 kertaa) ylimääräisen ammoniakin poistamiseksi.

Siirappimainen jäännös liuotettiin absoluuttiseen metyylialkoholiin ja kuivan HCl-kaasun annettiin kuplia siihen pitäen lämpötila· alle 20°:ssa (jäävesihauteella). Kun HCl:ää oli kuplitet-tu puoli tuntia, seos jäähdytettiin 5°:seen. Saostuma koottiin lasisintterillä, pestiin kylmällä metyylialkoholilla ja kuivattiin ilmassa. Saanto 6,0 g (92 %), sp. 173-175°, hajoaa, UV Ä.maks 260 nm (H20, pH 5,5).

Vaihtoehtoinen tie erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)- hypoksantiinin (VIII) valmistamiseksi (Deaminoimalla VII) nh2 oh

I NaNO- I

I |T ^ -) I (Γ *1_.*/ Ac OH; N HCl ^ j ~ N |

CH CH

/ \ / \ CH3- [CH2]5 CHOH CH3 ICH2]5 CH3 CH3 VII Vili

Liuokseen, joka sisälsi eTytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniiniä (IX., 4,0 g, 14 nunoolia) 50 %:sessa etikkahapossa (20 ml) ja 1 N HCl (3,2 ml), lisättiin natriumnitriittiä (5,6 g, 71 nunoolia) 25°: ssa koko ajan sekoittaen. Sekoitusta jatkettiin 2 tuntia 25°:ssa. Tämän jälkeen ajettiin UV-spektri. Kun UV Amaks saavutti arvon 250 nm, liuos neutraloitiin 2 N Na0H:lla.

26 68234

Saatu saostuma suodatettiin ja pestiin i^Ojlla. Saanto = 3,03 g (75 %), sp. = 195°.

Analyyttinen näyte kiteytettiin uudelleen (3 kertaa) vedestä, jolloin saatiin 202°:ssa sulava tuote. Analyysi: Laskettu kaavalle C-^H^N^: C, 60,HO; H, 7,96; N, 20,13. Saatu: C, 60,HO; H, 7,90; N, 20,12.

Lopputuotteiden valmistus:

Menetelmä K

Yhdiste NPT 15H26 Käytettiin H.J. Schaefferin ja S.F. Schwenderin menetelmää, J. Med. Chem. 17:6 (197H).

Menetelmä L

Yhdisteen NPT 15H10 valmistaminen 0,1 mnoolia 9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-hydroksi-puriinia, NPT 15392 (27,9 mg) ja 0,3 mmoolia 2-hydroksipropyyli-dimetyyli-ammonium-H-(asetyyliamino)-bentsoaattia (DIP.PacBA) (77,1 mg) punnittiin tarkasti ja liuotettiin 105 ml:aan 0,25 %:sta natriumkarbonaattia (Na2C0g), jolloin saatiin NPT 15H10:n 0,1 %:nen liuos (yhdiste muodostui NPT 15392:sta ja DIP.PAcBA:sta mooli-suhteella 1:3).

Todisteita kompleksinmuodostuksesta NPT 15392:11a ja DIP.PAcBA:11a suoritetut faasien liu-koisuustutkimukset osoittivat, että NPT 15392:n liukoisuus kasvaa DIP.PAcBA:n konsentraation kasvaessa olosuhteissa, joissa pH on vakio. Tämä osoittaa, että liuoksessa tapahtuu kompleksia muodostavaa vuorovaikutusta.

Moolisuhteen 1:3 sijasta (NPT 15392 ja DIP.PAcBA) voidaan käyttää moolisuhdetta 1:1 ja 1:10 ja muodostaa muita komplekseja.

Kompleksinmuodostus (NPT 15392 + DIP.PAcBA) osoitettiin kokeellisesti seuraavalla tavalla:

Koe 1: Kompleksinmuodostus D^Oissa

Liuoksen preparointi ja koeolosuhteet:

Valmistettiin erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)hypoksantii-nin (NPT 15392) liuokset D20:hon (NPT 15392:n pitoisuus 0,5 mg/ml), ja dimetyyliamino-2-propanoli-p-asetamidobentsoaatti (DIP.PAcBA) 27 68234

lisättiin niin, että sen pitoisuudet olivat C, 0,1 ja 0,2 M. Liuoksen pD puskuroitiin arvoon 7,4 fosfaatilla (0,01 M). Kunkin liuoksen protoni-NMR rekisteröitiin käyttäen 3-trimetyyli-silyyli-l-propaanisulfonihappoa (DS3) sisäisenä standardina. Yhdisteen NPT 15392 puriinirenkaan asemissa 2 ja 8 olevien protonien kemialliset siirtymät (suhteessa DSS:ään) on esitetty seuraavassa: A A

s A ,s A

Liuos (ppm) siirtymä (ppm) siirtymä H2 H2 H8 H g NPT 15392 8,2321 - 8,1760 NPT 15392 + 0,1 M DIP.PAcBA 8,2152 0,0170 8,1336 0,0424 NPT 15392 + 0,2 M DIP.PAcBA 8,1893 0,0428 8,0952 0,0941 DIP.PAcBA:n määrien kasvaessa on havaittavissa H2~ ja Hg-protonien kemiallisten siirtymien jatkuva lasku. Sitä vastoin NPT 15392:n alifaattisen sivuketjun protoneilla ei ole havaittavissa mitattavaa siirtymää.

Koe 2: Kompleksinmuodostus DMSO-DqO:ssa NPT 15392:n liukoisuuden lisäämiseksi valmistettiin NPT 15392:n ja DIP.PAcBArn liuokset väliaineeseen, joka sisälsi 80 % dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja 20 % D20.

Liuosten preparointi ja koe-olosuhteet:

Valmistettiin liuokset, jotka sisälsivät (a) yhdistettä NPT 15392 (0,1 M) ja (b) yhdistettä NPT 15392 (0,1 M) sekä DIP.PAcBA (0,3 H), väliaineeseen, jossa oli 80 % dg-DMSO ja 20 % D20. Molempien liuosten protoni-NMR rekisteröitiin käyttäen tetrametyylisilaani (TMS) sisäisenä standardina.

NPT 15392:n puriinirenkaan asemissa 2 ja 8 olevien vetyjen sekä sivuketjun asemissa 1 ja 9 olevien vetyjen kemialliset siirtymät (suhteessa TMSrään) on esitetty seuraavassa: 28 6 8 2 3 4 S Δ S Δ s Δ 5 Δ

Liuos (ppm) siirtymä (ppm) siirtymä (ppm) siirtymä (ppm) siirtymä H2 H2 H8 HS Hl H1 Hg Hg NPT 15392 8,346 - 8,147 - 0,947 - 0,784 (0,1 M) 1,017 NPT 15392 (0,1 M) + DIP.PAcBA 8,168 0,178 8,124 0,023 0,968 0,02 0,783 0,001 (0,3 M) 1,037 0,02 Tässä liuottimessa sekä H2 että Hg osoittavat nousevia siirtymiä DIP.PAcBA:n läsnäollessa, kuten myös alifaattisen sivuketjun asemassa 1 olevat vedyt. Hg-vetyjen siirtymän muutos on merkityksetön.

Näissä kokeissa on osoitettu, että NPT 15392:n H2~ ja Hg-vedyillä on nousevat siirtymät DIP.PAcBA:n läsnäollessa. Siirtymien suuruus on riippuvainen läsnäolevan DIP.PAcBArn konsentraatiosta. NPT 15392:n väkevämmissä liuoksissa DMS0:ssa nouseva siirtymä on myös havaittavissa alifaattisen sivuketjun asemassa 1 olevilla vedyillä, mutta ei asemassa 9. Nämä havainnot osoittavat DIP.PAcBA:n läheistä liittymistä NPT 15392:teen, jossa PAcBA:n aromaattinen rengas voi varjostaa puriinin proto-neita NMR:n magneettisen kentän vaikutukselta.

29 68234

Virusten vastainen vaikutus on esitetty taulukoissa 2 ja 3. Taulukko 2 9-(hydroksialkyyli)-puriinien influenssaviruksen monistumista estävä vaikutus

X

N

N [ ^ (γ)

L 1]^ N/ ’ 3 Viruskanta: Influenssa A

N liC-CH-R2 USSR/aotH^p R1 Ϊη

Testi- Heiradsorptiopesäkkeiden prosen- yhdiste Yhdiste tueelinen estyminen testiyhd.

n:o ____pitoisuuksilla (pg/ml/__ _____R2 X__Y <10 10-100 >100_

151+25 H H OH

15428 H H OH DIP.PAcBA - - 15446 H CH3 OH - 2 0 0 15447 H CH3 OH DIP.PAcBA 10 26 34 15431 H CH3 NH2 - 22 0 15432 H CH3 NH2 DIP.PAcBA 48 62 15433 CH3 H NH2 - 32 0 15434 CH3 H NH2 DIP.PAcBA 41 62 15443 CH3 H OH - 0 0 15444 CH3 H OH DIP.PAcBA 44 54 15417 Cgl-L^ H OH - 18 58 60 15418 Cgfi^ H OH DIP.PAcBA 16 46 52 15392 Cgti^ CH3 OH - 85 100 100 15410 C-H, „ CH0 OH DIP.PAcBA 58 96 96 15426 CgH13 CH3 NH2 - 50 96 100 15110 - - - DIP.PAcBA 0 0 20 IMI I I 1 30 6 8 2 3 4

Taulukko 3 9-(hydroksialkyyli)-puriinien herpes-viruksen monistumista estävä vaikutus

X

L I / ( 3

X-N N

I 2

HC-CH-R

U

R OH

NPT Täplät (PFU) Prosen- n:o Yhdiste __ tuaalinen R1 ^ R2 X I Y~ Testi Kontorol- estyminen :15-150) li ______’g/ml)___ 15392 C6H13 CH3 oh 98 %

15*117 CcH.. „ CH„ OH

olo o

15418 C H 0 H OH DIP.PAcBA

b 1 o 15410 C H H OH DIP.PAcBA 98 % b lö 11 31 68234

Biologiset vaikutukset

Menetelmät

Influenssaa vastustava vaikutus - (Hemadsorptio-tutkimus)

Tartutettaessa kudosviljelmäsolujen yksisolukerrokseen influenssavirus solut muuttuvat siten, että niiden pintaan voi absorboitua marsun punasoluja. Solujen absorptiopesäkkeiden lukumäärä (hemadsorptiopesäkkeitä muodostavat yksiköt, hemadsorption foci forming units HAFFU) on tarttuvuuden kvantitatiivinen mitta-luku. Menetelmä on seuraavanlainen.

Yksisolukerroksista tehtiin alaviljelmät seuraavasti: Väliaine kaadettiin pois ja yksisolukerros pestiin kaksi kertaa, noin 50 ml:11a kullakin kerralla, kalsiumin ja magnesiumin vapaalla fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS), (GIBCO *H*419), jonka pH oli 7,2. Kuhunkin pulloon lisättiin 37°C:ssa yksi millitra trypsiini-EDTA-liuosta (GIBCO #S 30L), joka sisälsi 0,5 g trypsiiniä (1:250) ja 2,0 g EDTA yhtä litraa modifioitua Puck'In suolaliuos A:ta kohden, ja kevyesti ravistamalla levitettiin se yksisolukerroksen päälle. Pullot siirrettiin sitten inkubointi-laitteeseen 37°C:seen noin 3-5 minuutiksi riippuen siitä, kuinka kauan solujen irtoaminen kesti. Silloin tällöin tapahtuva ravistelu oli tarpeen. Kuhunkin pulloon lisättiin 10 ml ymppäysväli-ainetta ja solut dispergoitiin imemällä suspensiota pipettiin ja puhaltamalla se ulos. Erään pullosarjan sisällöt yhdistettiin ja suspension sisältämien solujen pitoisuus laimennettiin ymppäys- 4 väliaineella välille 7-8,5 x 10 solua/ml. Ymppöysväliaine koostui seuraavasta yhdistelmästä: Eagle'in Minimum Essential Medium (MEM), joka sisälsi Earle'n suoloja ja HEPES-pkuskuria (GIBCO ^36) ja johon oli lisätty 87 ml:aa MEM kohden seuraavat aineet: 10 ml vasikansikiön seerumia (FCS-GIBCO #614HI) 1 ml L-glutamiinia (200 Molar-GIBCO ^503) 1 ml klooritetrasykliiniä (5000 g/ml, GIBCO^528) 1 ml seosta, joka sisälsi 10,000 yksikköä penisilliiniä, 10,000 yUg streptomysiiniä ja 10,000 neomy-siiniä (PSN-GIBCO ^564) 32 6 8 2 3 4

Soluista tehtiin alaviljelmä Linbro'n kudosviljelmäalus-toilla. Kussakin alustassa oli 24 tasapohjaista syvennystä, joiden tilavuus oli 3 ml; soluviljelmäsuspens.iota (1 ml) lisättiin kuhunkin syvennykseen.

Seuraavana päivänä väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella ymppäysväliaineella .Yksisolukerrokset käytettiin kokeisiin, kun ne olivat saavuttaneet tilan, jossa ne olivat lähes yhteen kasvaneita (noin 3-4 päivää).

Kun Linbro-alustalla saadut Hela-soluviljelmät olivat valmiita kokeisiin (kts solut), väliaine dekantoitiin ja viljelmiin lisättiin 1 ml testiyhdisteitä sisältävää ylläpitoväliai-netta (MEM laimennettuna 3 %:ksi FCS:llä) siten, että alustalla aina neljään viljelmään tuli sama pitoisuus testiyndistettä.

Käytettiin sarjaa erisuuruisia pitoisuuksia, jotka vaih-telivat 2,3:sta 150:een ^ug/ml. Kontrolliviljelmissä käytettiin pelkkää ylläpitoväliainetta. Kun testiyhdistettä sisältävä ja kontrolliyäliaine oli lisätty, kokeiluviljelmäryhmiin ja tartutettaviin kontrolliviljelmiin lisättiin 0,1 ml laimennettua virus-suspensiota. Tartuttamattomiin kontrolliviljelmiin lisättiin ainoastaan suolaliuosta. Linbro-alustoja inkuboitiin sitten 37°C:ssa 18 tuntia, minkä jälkeen kustakin ryhmästä imettiin pois väliaineet. Kukin viljelmä pestiin kerran PBSrllä. Suolaliuos imettiin pois ja kuhunkin viljelmän sisältävään syvennykseen lisättiin 0,5 ml marsun punasolujen 0,4 %:ista (v/v) PBS-suspensiota. Viljelmiä pidettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, minkä jälkeen väliaine dekantoitiin ja viljelmä pestiin kaksi kertaa PBS:llä kaikkien muiden paitsi spesifisesti sitoutuneiden solujen poistamiseksi. Kolmannen pesun jälkeen kaikkiin viljelmiin lisättiin ylläpito-väliainetta .

Nikon-merkkiseen käänteisfaasikontrastimikroskooppiin liitettiin Howard-merkkinen okulaarin mikrometri (C8385). Kutakin viljelmää tarkasteltiin 4-kertaisella vähän suurentavalla objektiivilla ja hemadsorboituneiden punasolujen määrä laskettiin suoraan käyttäen mikrometrin ristikkoa kentän rajaajana. Kentät laskettiin kokeiluryhmillä joko kokonaan tai osittain riippuen tartutetuilla kontrolliviljelmillä saaduista hemabsorboituneiden

II

33 68234 solujen määristä ja tiheyksistä. Parhaat olosuhteet hemabsorboitu-neiden solujen määrän laskemiseksi saatiin aikaan 60-kertaisella ja 150-kertaisella suurennuksella. Hemabsorption selville saamiseksi laskettiin kehttäkertoimet 60-kertaiselle ja 150-kertaiselle suurennukselle. 60-kcrtaisella suurennuksella kentän kokonaismäärä laskettiin käyttäen kerrointa 55,5. 150-kertaisella suurennuksella kerroin oli 273. Kertoimet 55,5 ja 273 edustavat kenttien kokonaislukumäärää vastaavasti. Laskettujen kenttien määrä vaihteli kolmesta viiteen kutakin laskettua viljelmää kohden, joita oli 3-4 kussakin käsitellyssä ryhmässä (tutkittujen kenttien lukumäärä käy ilmi tulos-osassa olevista käsittelemättömien tietojen taulukoista). Aineistosta laskettiin keskiarvot ja standardipoikkeamat ja sen luotettavuutta arvioitiin käyttäen studentin t-testianalyysiä.

Biologiset vaikutukset

Herpfeksen vastainen vaikutus - (Täplätutkimus)

Herpesvirustartunta aiheuttaa kudosviljelmissä solujen liukenemista. Tietyn ajan kuluttua nämä liuonneet solut näkyvät pienenä kirkkaana alueena (täplänä) solukerroksessa. Testattavan aineen lisääminen väliaineeseen vähentää täplien määrää, mikäli tämä aine pysyy estämään viruksen monistumisen. Menetelmä on seuraavanlainen:

Tutkimusmateriaalit ja menetelmät .Virus Käytettiin herpes hominis-tyyppiä 2, ATCC VR 540, erä 3D, joka oli hankittu laitoksesta . American Type Culture Collection (ATCC), Bethesda, Maryland. Lyofilisoitu virussuspensio rekonstruoitiin 1 ml:lla steriiliä tislattua HgO. Virus valutettiin kahdesti He-La-solujen yksisolukerrosten läpi. Kudosviljelmän supernatantit yhdistettiin ja jaettiin 1 ml:n suuruisiin osiin, joita säilytettiin -70°C:ssa. Tämän varastosuspension tiitterin havaittiin -4.

oleyan 10 TCID^g/0,1 ml (2 vuorokauden inkubointi).

Täplätutkimus Herpes-viruksella

Logaritmisessa kasvuvaiheessa olevista Vero-soluista tehtiin alaviljelmä pitoisuudella 1 x 105 solua/ml 50 ml:n Falcon-pulloissa Eagle'n Minimum Essential Medium'issa (MEM), johon oli lisätty 10 % vasikansikiön seerumia (FCS) ja antibiootteja. Väliaine vaihdettiin ymppäystä seuraavana päivänä. Vero-solujen yksisolukerrokset saavuttivat konfluentin tilan toisena 34 68234 päivän ymppäyksen jälkeen ja solujen ollessa logaritmisessa kasvuvaiheessa viljelmiä käytettiin täplätutkimukseen.

Viljelyväliaine kaadettiin pois ja yksisolukerrokset pestiin kerran fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Viruksen varastosuspensiosta valmistettiin useita laimennoksia ja kukin viljelmäpullo ympättiin 0,5 ml:11a yhtä viruslaimennosta, joka oli lisätty FSC:tä sisältämättömään väliaineeseen.

Tämä väliaine sisälsi testiyhdistettä 150 ^ug/ml. Kontrollit valmistettiin käyttäen testiyhdisteitä sisältämätöntä väliainetta.

Virus-absorption annettiin edetä 2 tunnin ajan 37°C:ssa, minä aikana viljelmiä heiluteltiin kevyesti 15 minuutin välein. Väliaineet kaadettiin pois ja yksisolukerrokset pestiin kerran 10 ml:11a PBS.

Valmistettiin 50 ml:aan PBS agaroosiliuos, jonka pitoisuus oli 6 % w/v. Valmistettiin MEM-varastoväliaine, johon lisättiin 2 % FCS. Osaan varastoväliaineesta lisättiin testiyhdistet-tä 150 ^ug/ml. Näitä kolmea liuosta säilytettiin 47°C:ssa. Lisäksi valmistettiin 1:10-laimennos ihmisen anti-herpesseerumista.

Juuri ennen käsittelyä lisättiin 15 ml agaroosiliuosta 85 ml:aan väliainetta. Toiset 15 ml agaroosiliuosta lisättiin 85 ml:aan testiyhdistettä sisältävää väliainetta.

Yhden koeryhmän pestyt yksisolukerrokset käsiteltiin joko 5 ml :11a agaroosia sisältävää väliainetta tai 5 ml :11a agaroosia ja testiyhdistettä sisältävää väliainetta. Toisen koeryhmän yksisolukerrokset käsiteltiin joko 0,2 ml:11a anti-herpessee-rumia, joka oli sekoitettu 5 ml:aan varastoväliainetta tai 0,2 ml:11.:: anti-herpsesseerumia, joka oli sekoitettu 5 ml:aan testiyhdistettä sisältävää väliainetta. Anti-herpesseerumia käytettiin agaroosin sijasta täplien paikallistamiseen neutralisoimalla sillä kaikki väliaineessa olevat vapaat virukset. Pullojen annettiin olla huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, minkä jälkeen niitä inkuboitiin 37°C:ssa 2 vuorokautta. Useimmissa käsitellyissä ryhmissä viljelmiä käytettiin kolmin kappalein.

Kuhunkin pulloon lisättiin 10 ml PBS. Liuosta ravisteltiin viljelmän päällä kevyesti ja kaadettiin se sitten pois pulloista. Yksisolukerrokset värjättiin sitten kristallivioletilla, josta oli valmistettu 0,5 %:nen (w/v) liuos 50 % metanolia sisältävään kolmasti tislattuun veteen.

ti 35 68234 Täplät laskettiin joko suoraan läpäisevän fluoresoivan valon ja makrotarkastelun avulla tai sitten käyttäen mikroskooppia mikrotäplien havaitsemiseen. Mikrotäplät laskettiin ottaen keskiarvo kolmesta kentästä kussakin koeryhmässä 150-ker-taisella suurennuksella.

Muissa viruksia vastustavien vaikutusten testeissä saatiin seuraavat tulokset.

Yhdiste Inhibitio-% eri pitoisuuksilla (g/ml) Virus 0,1-1,0 1,0-10 10-100 >100

15392 30-50 — >70 >70 Influenssa A

Sika 1976

15417 — 50-70 >70 — Influenssa A

Sika 1976

“WV

15418 — — >70 ^70 Influenssa A

Sika 1976 15426 20-30 30-50 50-70 50-70 (Venäläinen) 15410 50-70 30-50 >70 >70 (Sika)

Yhdisteellä NPT 15410 tehtyjä virusten vastaisten vaikutusten testejä on esitetty lisää taulukossa 3a.

36 68234

Taulukko 3a NPT 15410:n influenssa-viruksen monistumista estävä vaikutus

Pitoisuusalue (pg/ml)

Virus .01-1.0 1.0-10.0 10.0-100 >100 A/sika/7 6 (H, N,) + + +a ++ + + + + + + + + lsw 1 A/Texas/77 (HgN2) ++ + ++++ ++++ A/Dunedin/73 (HgN2) NT NT - + + A/Jap/305 (H2N2) NT NT ++++ ++++ A/PRg (HqN1) ++ NT ++++ +++ A2 Hong Kong (H^) NT NT \ ++ +++ i _|_I_1_ aNT = ei testattu + = 10-20 % estyminen + = 20-30 % estyminen ++ = 30-50 % estyminen +++ = 50-70 % estyminen ++++ = >70 % estyminen

Immunomodulaatiovaikutus ilmenee taulukosta 4.

il 37 6 8 2 3 4

Taulukko 4 9-(hydroksialkyyli)-puriinien aikaansaama soluvälitteisen immuniteetin modulaatio

X

N

I* Γ > -(Y>3 I 2

HC - CH - R

R1 £h ___Yhdiste______

NPT No. R1· R2 X Y

15425 H H OH

15428 H H OH DIP.PAcBA

15446 H CH3 OH

15447 H CH3 OH DIP.PAcBA

15431 H CH3 NH2

15432 H CH3 NH2 DIP.PAcBA

15433 CH3 H NH2 -

15434 CH3 H NH2 DIP.PAcBA

15443 CH3 H OH

15444 CH3 H OH DIP.PAcBA

15417 C6H13 H OH

15418 C6H13 H 0H DIP.PAcBA

15392 C6H13 CH3 0H

15410 C6H13 CH3 NH2 DIP.PAcBA

15426 C6H13 CH3 NH2 38 68234

Maksimaalinen prosentuaalinen muutos NPT No. Mitogeenillä (Con A) Mitogeenillä (FHA) Lymfokiinillä (MMF) aiheutettu imusolujen aiheutettu ihmisen aiheutettu marsun lisäkasvu hiirillä imusolujen lisäkasvu makrofagien. lisäkasvu .01-1.0 1.0-10 10-100 .01-1.0 1.0-10 10-100 0.1-1.0 1.0-10 10-100 15425 11 0 100 0 0 15428 15445 6 12 0 0 00 0 00 15447 15431 -15 -27 -47 0 00 15432 15433 +15 -23 -65 53 0 -50 15434 15443 +17 +27 +27 0 +13 0 +20 0 15444 15417 0 0 0 0 0 -50 13 -50 15418 41 73 26 12 80 -50 15392 172 162 -72 11-15 20 -50 33 23 15410 140 40 40 30-50 60 12 23 15426 -50 -85 -91 6 -41 il 39 68234

Useilla yhdisteillä suoritettiin mitogeenilla aiheutetun hiiren imusolujen lisäkasvun testi seuraavin tuloksin:

Yhdiste Stimulaatio-% eri pitoisuuksilla (^ug/ml) 01-1.0 1.0-10 10-100 >100 15392 >50% 30-50% 30-50% ei testattu 15426 o 0 0 ei testattu 15410 >50 30-50 30-50 ei testattu 15417 000 15418 20-30 >50 20-30 ei testattu

Biologiset vaikutukset

Iromunomodulaat iotutkimus Käytettiin seuraavia kolmea tutkimusmenetelmää tutkittaessa testiyhdisteiden kykyä moduloida immuunijärjestelmän useiden eri soluluokkien aktiivisuutta. Näissä järjestelmissä voidaan tunnistaa sekä immuniteettiä synnyttävä vaikutus (jota ilmentää tutkittavan parametrin suurentuminen) että immuniteettiä heikentävä vaikutus (jota ilmentää tutkittavan parametrin estyminen) .

1. Mitogeenilla aiheutetun hiiren pernasolujen lisäkasvun tutkimus

Hiiren pernasolut sisältävät joukon B- ja T-imusolujen, jotka voidaan stimuloida lisääntymään eräillä vierailla aineilla (esim. kasvimitogeeneillä, kuten Con A). Tämä lisäkasvu on osoitus lisääntyneestä soluvälitteisestä immuniteetistä. Alla on esitetty menetelmä, jolla tutkittiin testiyhdisteiden ominaisuuksia immuniteettiä synnyttävinä aineina.

68234

Tutkimusmateriaali

NaCl:llä lyofilisoidussa Concavalin A:sta (Calbiochem,

La Jolla, California), erä #210073, valmistettiin ensiksi 1-prosenttinen liuos ja sitä tehtiin sitten peräkkäin kaksinkertaisia laimennoksia. (0,5, 1,0, 2,5 g/ml).

Koe-eläimet

Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja Balb/c- ja C^H-kan-taisia uroshiiriä hankittiin seuraavista lähteistä: Flow Reseach Animals, Inc., Dublin, Virginia; Carles River Breeding Laboratories, Wilmington, Massachusetts; Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana; ja Lionel Strong Foundation,

San Diego, California.

Solut

Kolmesta viiten hiirtä surmattiin vääntämällä niskanikamat pois paikoiltaan ja pernat poistettiin aseptisesti. Yhdistetyt pernat hienonnettiin ja sekoitettiin steriileillä pihdeillä; sitten ne puristettiin kaksinkertaisen nylonverkon läpi. Solu-suspensio pestiin kerran 15 ml :11a RPMI 1640, johon oli lisätty 5 % vasikansikiön seerumia ja antibiootteja. Soluja viljel-tiin mikrolevyillä pitoisuuden ollessa 10 solua/0,1 ml/viljelmä. Viljelmiä inkuboitiin mitogeenin läsnä ollessa tai ilman niitä 5 % CO2 sisältävässä kosteassa ilmakehässä 48 tuntia. Testiyhdis-tettä lisättiin viljelmiin yhdessä mitogeenin kanssa.

Lisäkasvu • 3

Solujen lisäkasvua tutkittiin /-H/-tymidiinillä jonka radioaktiivisuus oli 1,0 ^,uCi seuraamalla sen imeytymisastetta. Viljelmät kerättiin MASH-yksiköllä (Otto Hiller Co., Madison, Wisconsin) ja tymidiinin imeytyminen mitattiin nestetuikespektro-metrillä. Viljelmiä valmistettiin kolmin kappalein ja tulokset esitettiin keskiarvona plus tai miinus kokeellisen keskiarvon standardipoikkeama. Kontrolliarvoille laskettiin myös testiyhdis-teiden stimulaatioindeksit ja niitä käsiteltiin graafisesti.

2. Mitogeenillä aiheutettu ihmisen ääreisveren imusolujen lisäkasvu

Immuunireaktioita lisääviä aineita tarvitaan terapeuttisiin tarkoituksiin etenkin potilailla, joilla ilmenee puutteellista tai alentunutta immuniteettiä, kuten tapahtuu virustautien *fl 68234 tai syövän yhteydessä. Tutkittaessa tiettyjen aineiden kykyä lisätä ihmisen ääreisveren imusolujen kasvua, joka on aiheutunut vastineena vieraan aineen läsnäololle, voidaan löytää aineita, joilla on immuniteettia synnyttävä vaikutus ihmiseen. Tässä käytetään edellä esitettyä menetelmää sekä myös J.W. Haddenin teoksessa Infect. & Immunity, helmikuu, 1976 sivuilla 382-387, etenkin sivuilla 382-383 kuvaamaa menetelmää.

3. Makrofagit ovat eräs valkosolujen alaryhmä, joka on tärkeä immuunijärjestelmän osatekijä ja vaikuttaa sekä soluvälitteiseen että nesteimmuniteettiin. Alla kuvattu tutkimusmenettely mittaa tutkittavien aineiden ominaisuuksia makrofagien toiminnan kiihdyttäjinä.

Burroughs Wellcomeflta hankittiin fytohemagglutiinia (PHA) (HA-17). Antigeenillä stimuloiduista imusolmukeperäisistä imusoluista (marsu) valmistettiin makrofagien mitogeenitekijää (Macrophage Mitogen Factor, MMF) ja makrofageja aktivoivaa tekijää (Macrophage Activating Factor, MAF) sisältävä valmiste Haddenin et ai aiemmin julkaisussa Nature 257, 483-485 (1975) kuvaaman menetelmän mukaisesti. Puhdistamalla tämä valmiste osittain vakuumidialyysillä ja Sephadex G-100 pylväskromatografiällä saatiin välillä 35-70.000 daltonia aktiivinen fraktio, jolla oli sekä mitogeenisiä, että aktivoivia ominaisuuksia. Tätä aktiivista fraktiota käytettiin sekä lisäkasvu- että aktivointitutkimuksissa.

Menetelmät

Valmistettiin Ficoll-hypaque-menetelmällä puhdistettuja ihmisen ääreisveren imusoluja ja PHA:11a aiheutettua imusolujen lisäkasvua tutkittiin tritiumia sisältävän tymidiinin imeytymisen perusteella Haddenin et ai julkaisussa Cell. Immunol. 20, 98-103 (1975) kuvaamalla tavalla. Kukin yhdiste analysoitiin subopti-maalisella, optimaalisella ja supraoptimaalisella PHA-pitoisuu-della (.001, .01, 0.1 yksikköä/ml vastaavasti). Valmistettiin parafiiniöljyllä aikaansaatuja marsun peritoneaalisia makrofageja ja inkuboitiin niitä yksisolukerrrosviljelmänä (> 98 % puhtaita makrofageja). Lymfokiinillä (MMF) aiheutettua lisäkasvua tutkittiin tritiumia sisältävän tymidiinin imeytymistä seuraamalla 3 ja 5 vuorokautta vanhoilla viljelmillä Haddenin et ai julkaisussa Nature 257, 483-485 (1975) kuvaamalla 42 68234 tavalla. Lymfokiinillä (MAF) aktivoitua makrofagien kykyä tappaa Listeria monocytogenes-bakteereja tutkittiin 5 vuorokautta vanhoilla viljelmillä 6 tunnin jaksoissa MAF:n läsnä ollessa ja ilman sitä Haddenin ja Englandin teoksessa Immunopharmacology (Plenum Press, 1977) sivuilla 87-100 kuvaamalla tavalla. Fagosytoosin määrä mitattiin saattamalla makrofagit alttiiksi Listeria monocytogenes-bakteereille 20 minuutiksi ja laskemalla bakteereja sisältävien makrofagien määrä ja bakteerien määrä kutakin fagosyyttistä solua kohden gram-värjätyillä yksisoluker-roksilla Labtek-kammioissa. Solujen sisällä tapahtuva bakteerien kuoleminen mitattiin laskemalla bakteereja sisältävät solut ja bakteerien määrä solua kohden 6 tuntia alkuperäisestä 20 minuuttia kestäneestä tartutuksesta. Rinnakkaiskokeet, joissa makrofagit hemolysoitiin ja solujen sisältämiä bakteereja viljeltiin, vahvistivat bakteerien aktiviteettimääritysten luotettavuuden tässä järjestelmässä. Kussakin kolmessa järjestelmässä käytettiin testiyhdisteitä logaritmisena konsentraatiosarjana kolmin kappalein kussakin tapauksessa sekä mitogeenin tai lymfokiinin läsnä ollessa tai ilman niitä. Kutakin koetyyppiä toistettiin vähintään kolme kertaa. Aiemmat kokeet osoittivat samansuuntaisia reaktioita farmakologiseen modulaatioon lisäkasvu- ja aktivoin-titutkimuksissa.

Biologiset vaikutukset

Leukemiaa vastustava vaikutus (L-1210-solujen kasvun estyminen) L-1210-kasvainta kantavista hiiristä eristettyjä leuke-miasoluja viljeltiin in vitro ja niiden lisääntymistä mitattiin laskemalla solujen lukumäärä viljelmässä tiettynä ajanjaksona. Testiyhdistettä lisättäessä kasvualustaan leukemiasolujen kasvu estyy, mikä on merkki tehokkaasta leukemiaa vastustavasta aineesta .

I^q (L-1210-kasvun 50 %:sesti estävä pitoisuus) oli testattavilla yhdisteillä seuraavanlainen:

Yhdiste Pitoisuus (/Ug/ml) 15392 28 15410 54 15417 47 15418 70 . * t 43 68234

Tutkimusmenetelmä on esitetty alla.

Leukemia solujen (L-121Q) kasvun estymisen mirtaaminen

Tarkastettiin, että kussakin perusviljelmässä oli riittävää solukasvua. Soluja käytettiin 48-72 tuntia siirrosten jälkeen.

Testiyhdisteet punnittiin haluttuun lopulliseen pitoisuuteen nähden 50-kertaisina määrinä ja tehtiin sitten liuoksista sarjalaimennukset.

Kasvatusväliaine valmistettiin käyttäen 500 ml McCoy'n 5A-väliainetta, 15 % vasikansikiön seerumia, 5 ml penisilliini-streptomysiiniliuosta ja 5 ml antibiootti-antimykoottiliuosta ja annettiin seistä huoneen lämpötilassa.

Käyttäen steriiliä tekniikkaa lisättiin 0,1 ml testiyhdis-teiden laimennoksia kuhunkin putkeen.

Valmiiseen väliaineeseen lisättiin sopiva määrä soluja. Sekoituksen jälkeen otettiin 0,5 ml:n näyte» se pantiin 9,5 ml suolaliuosta sisältävään putkeen ja laskettiin solut Coulter-laskimella. Tulos kerrottiin 40:llä 40-kertaisen laimennuksen kompensoimiseksi (0,5 ml 0,5 ml:aan suolaliuosta) ja merkittiin tällä siirroksella saatu tulos muistiin.

Solususpensiota lisättiin 5 ml kuhunkin putkeen. Suspen-siopulloa ravisteltiin joka neljännen putken jälkeen solujen tasaisen jakautumisen varmistamiseksi.

Putkien tulpat suljettiin ja ne asetettiin CO2~inkubaat-toriin 35-38°:seen 96 tunniksi.

96 tunnin kuluttua putket otettiin inku^ aatt.oris*a ja kunkin sisältö laskettiin Coulter-laskimella. Kukin tulos kerrottiin 40.:llä ja jokaisella testiyhdisteen laimennoksella laskeminen suoritettiin neljä kertaa ja määritettiin näiden keskiarvo, minkä jälkeen kukin tulos kerrottiin 40:llä. Mikäli laskemisen tulokseksi saatiin siirrokselle saatua arvoa pienempi luku, merkittiin estyminen 100 %:seksi. Mikäli tulos oli suurempi kuin kahdeksan vertailukokeen keskiarvo, merkittiin estyminen 0-prosenttiseksi. Muilla tuloksilla käytettiin seuraavaa kaavaa: Solujen keskimäärä/ml käsitellyissä yil] elmissä5iirroJ<stn^lum.aär.ä/ml χ 1Q0 = pros?ntuaalir,e„

Solujen keskimäärä/ml vertailuviljel- hengissä pysyminen missä - siirroksen solumäärä/ml 44 68234 ΤΓ ii.

100 % - Prosentuaalinen hengissä pysyminen = käsittelyn aikaan saama kasvun estyminen.

Tämän keksinnön kohteena olevien yhdisteiden on osoitettu estävän sekä RNA- että DNA-virusnäytteen lisääntymistä standardia kudosviljelmätekniikkaa käyttäen. RNA-viruk-sista useilla sekä A- että B-alatyyppeihin kuuluvilla viruskannoilla voitiin osoittaa inhibitiota hemadsorptiotekniikkaa käyttäen. (Osa II, B). Ne nimenomaiset yhdisteet, joilla havaittiin influenssaviruksen inhibitiota (tyyppi A/USSR 90), on esitetty taulukossa 1. Useiden sarjan NPT 15392, NPT 15410, NPT 15417 ja NPT 15418 jäsenten osoitettiin estävän vähintään neljän eri influenssa-viruskannan lisääntymistä konsentraatioalueella 1-150 ^ug/ml.

Lisäksi useiden sarjan NPT 15410 ja NPT 15392 jäsenten on osoitettu estävän Herpes Simplex-viruksen, DNA-virusluokkaan kuuluvan, tappavan Herpes encephalitis-viruksen ohella vakavia mukokutaanisia vammoja ihmiselle aiheuttavan viruksen monistumista. Muut tähän luokkaan kuuluvat virukset aiheuttavat suu- ja sorkkatautia sioissa ja nautakarjassa ja tarttuvaa rinotrakeiit-tia kissoissa ja kennel-yskää koirissa. Jopa 100 ^ug/ml pienemmillä NPT 15392- ja NPT 15410-pitoisuuksilla havaittiin Herpes Simplex-viruksen aiheuttaman täplänmuodostuksen vähenemistä yli 90 %:sesti. Mainittuja tauteja aiheuttavat RNA- ja DNA-luokan virukset ja niiden aiheuttamat taudit käyvät ilmi taulukosta 5. Kaikista maailman taudeista vähintään 25 % tiedetään virusten aiheuttamiksi. Lisäksi on eristetty useita viruksia, joiden on todettu aiheuttavan kasvaimia. Niinpä viruksia vastustavien aineiden voisi sellaisinaan olettaa omaavan kasvannaisia vastustavia ominaisuuksia.

Monien tartunnanaiheuttajien, kuten virusten (influenssavirusten, HSV:n Friendin leukemiaviruksen), bakteerien ja sienien on varmasti todettu aiheuttavan tartunnan kantajassa heikentyneen immuniteettitilan, joka alentaa elimistön kykyä puolustautua tartunnaiheuttajia vastaan. Useimmat viruksia vastustavat anti-metaboliset aineet kuten Arac aiheuttavat kantajan immuunimeka-nismin heikentymistä saaden näin aikaan tilan, jossa ruumiin luontainen puolustusmekanismi saattaa heiketä ja sekundaarisen infektion vaara lisääntyä.

1,5 68234

Immunopotentiaattori tai immunomodulaattori on mikä tahansa aine, joka joko palauttaa ennalleen alentuneen immuuni-toiminnan tai lisää normaalia immuunitoimintaa tai tekee molempia. Immuunitoiminta tarkoittaa nesteimmuniteetin (vasta-aine-välitteisen), soluimmuniteetin (tymosyyttivälitteisen) tai makrofagi- tai jyvässoluvälitteisen vastustuskyvyn kehittymistä ja ilmenemistä. Sen piiriin kuuluvat luonnollisesti aineet jotka vaikuttavat suoraan immuunireaktioiden ilmenemiseen osallistuviin soluihin tai solu- ja molekyylimekanismeihin, jotka puolestaan vaikuttavat säädellen immuunireaktioihin osallistuvien solujen toimintaa. Immuunitoiminnan lisääntyminen voi johtua aineesta, joka toiminnallaan kumoaa immuunijärjestelmään kohdistuvista sisä- tai ulkopuolisista negatiivisista palautevaikut-teista peräisin olevia immuniteettiä heikentäviä mekanismeja. Siten immunopotentiaattoreilla on erilaisia toimintamekanismeja. Huolimatta immunopotentiaattoreiden vaihtelevista vaikutuskoh-dista solussa ja niiden erilaisista biokemiallisista toiminta-mekanismeistä, niiden käyttösovellutus on oleellisesti sama: toisin sanoen isännän vastustuskyvyn lisääminen.

Immunopotentiaattoreiden sovellutukset 1) Immuunijärjestelmän pääasiallinen suojatoiminta on patogeenien hyökkäysten torjuminen mukaan lukien virukset, riket-sia, mykoplasma, bakteerit, sienet ja kaiken tyyppiset loiset. Siten immuunireaktioiden voimistuminen, etenkin jos ne ovat heikentyneet, on omiaan parantamaan vastustuskykyä minkä tahansa yllä mainitun patogeenin tarttumista tai sen aiheuttamia vaivoja vastaan. Immunopotentiaattoria voidaan käyttää sellaisenaan tai yhdessä tarttumista vastustavan hoidon kanssa missä tahansa tarttuvassa taudissa tai kaikissa niistä.

2) Immuunijärjestelmän toisena suojatehtävänä pidetään sen aikaan saamaa vieraiden kudosten hylkimisvaikutusta3 joka voi olla luonnollinen, kuten sikiön ja äidin välisessä suhteessa tai sitten luonnollisesta poikkeava, kuten lääkärin suorittamien elinten siirtojen yhteydessä. Immunopotentiaattoreita voidaan käyttää myös helpottamaan sikiö- tai istukkakudosten hylkimistä tai säätelemään tai synnyttämään siirrosten sietokykyä.

π 46 6 8 2 3 4 3) Immuunijärjestelmän kolmantena suojavaikutuksena pidetään pahanlaatuisen solukehityksen, kuten syövän vastustamista. Immunopotentiaattoreita voidaan käyttää syövän hoidossa lisäämään kasvainta hylkivää vaikutusta ja estämään kasvaimen uusiutumista muiden hoitomuotojen jälkeen.

4) Neljäs suojavaikutus sisältää kyvyn tunnistaa vieraat vaikuttajat ja säilyttää reagoimattomuus elimistön oman immuunijärjestelmän sisällä positiivisin heikennysmekanis-mein. Auto-immuunitiloissa ja niiden kaltaisissa häiriöissä ilmenee omia antigeenejä vastaan suuntautuneita immuunireaktioita tai yleensä liioitellun voimakkaita immuunireaktioita, joilla on itsetuhovaikutus. Immunopotentiaattoreita voidaan käyttää normaalien heikennysmekanismien palauttamiseen, sietokyvyn luomiseen tai muuten edistämään normaaleja immuunireaktioita.

Kutakin immuunijärjestelmän suojavaikutusta voidaan säädellä ei-spesifisellä hoidolla pelkästään immunopotentiaattoreilla tai yhdessä muiden vastustuskykyä lisäävien tai elimistöä uhkaavaa patogeeniä tappavien aineiden kanssa. Lisäksi spesifistä vastustuskykyä voidaan voimistaa käyttämällä immunopotentiaattoreita yhdessä jonkin antigeenin kanssa, kuten rokotuskäytössä esimerkiksi viruksen, kasvainsolun jne kanssa. Näin saadaan aikaan joko spesifistä immuniteettiä tai sietokykyä. Jälkimmäisestä voidaan esimerkkinä mainita käyttö antigeenin kanssa allergioissa tai auto-immuunisairauksissa. Immunopotentiaattoreiden käyttö voi olla joko hoitavaa tai ehkäisevää; jälkimmäinen tulee kysymykseen etenkin iäkkäillä potilailla, joilla infektiot, auto-immuniteetti ja syöpä ovat yleisempiä. Antamisajankohta ja antamistavat voivat vaihdella ja niiden kriittisyys määräytyy sen mukaan, onko tuloksena positiivinen tai negatiivinen vaste.

Mikä tahansa immuniteettiä lisäävä aine voi myös estää sitä annoksen suuruudesta ja sen antamisajankohdasta riippuen; siten tietyissä olosuhteissa immunopotentiaattoria voidaan käyttää immuniteettiä heikentävänä aineena allergioissa, auto-immuniteet-titapauksissa ja elinten siirroissa.

Edellä olevassa taulukossa 4 on esitetty tulokset tutkimuksista, joilla on mitattu eräiden tutkittavien yhdisteiden ominaisuuksia immuunireaktioiden potentiaattoreina. Käytet- 47 682 34 tiin kolmea erilaista testausmenettelyä. Ensimmäisessä mitattiin testiyhdisteen kykyä voimistaa hiiren imusolujen kasvi-mitogee-nilla (Con A) aiheutettua lisäkasvua. Toisessa mitattiin testattavien yhdisteiden kykyä voimistaa ihmisen imusolujen eräällä toisella kasvimitogeenillä (PHA) aiheutettua lisäkasvua. Kolmas tutkimus mittasi näiden testiyhdisteiden kykyä voimistaa luonnollisen lymfokiinin aikaan saamaa (MMF, Macrophage Mitogen Factor) makrofagien lisäkasvua. Tämän jälkimmäisen ilmiön, makrofagien lisäkasvun ja aktivoitumisen, on osoitettu liittyvän tämän valkosoluluokan bakteereita, viruksia ja kasvainsoluja tuhoavaan toimintaan.

Merkittävää immunireaktioiden potentiaatiota havaittiin yhdisteillä 15392, 15410 ja 15418.

Useilla näistä aineista NPT 15392 ja 15410 on lisäksi määritetty niiden vaikutus epänormaalien imusolujen kasvun estäjinä. Molemmat aineet kykenevät selvästi estämään hiiren leukemiasolujen (L-1210-solukanta) lisääntymistä kudosviljelmissä. L-121Q-solujen 50 %:nen estyminen ilmeni yhdisteen NPT 15392 pitoisuudella 2 8^,ug/ml ja yhdisteen NPT 15410 pitoisuudella 54 ^ug/ml. Kyky estää leukeemisia imusoluja normaaleja imusoluja stimuloivilla pitoisuuksilla on ainutlaatuinen ominaisuus, jota ei tunneta millään muulla aineryhmällä.

Tämän keksinnön mukaiset tuotteet kuuluvat aineryhmään, joka spesifisesti estää RNA- ja DNA-virusten lisääntymistä, moduloi (potentoi) immuunireaktioita ja estää leukeemisten imu-solujen kasvua. Yhdisteiden vaikutusta pitoisuusalueella 9,01-150 ^ug/ml osoittavien in vitro kokeiden perusteella tehokkaaksi annosteluväliksi on nisäkkäillä saatu 0,05 - 500 mg/kg. Eräät sarjan yhdisteet on havaittu myrkyttömiksi hiirillä vielä 1 500 mg;n/kg pitoisuustasoilla.

Keksinnön mukaisia immunipotentiaattoreita voidaan käyttää esimerkiksi vastustuskyvyn luomiseen taulukossa 5 esitettyjä viruksia vastaan.

48 68234

Taulukko 5

Virus Luokka Tauti

Arenavirus RNA Rift Valley-kuume

Influenssa RNA Influenssa

Rhinovirus RNA Tavallinen vilustuminen

Poliovirus RNA Polio

Rubella RNA Tuhkarokko

Newcastlen sairaus- RNA Newcastlen sairaus virus

Rotavirus RNA Maha-suolitulehdus lapsissa

Hepatitis, tyyppi A RNA Tarttuva keltatauti

Rabies-virus RNA Vesikauhu

Arbovirus RNA Aivokuume

Vaccinia-virus DNA Isorokko

Herpes Simplex-virus DNA Yskänrokko, aivokuume, su kupuolitauti

Herpes Zoster DNA Vyöruusu

Varicella Zoster DNA Vesirokko

Adenovirus DNA Hengityselininfektio

Hepatitis, tyyppi B DNA Krooninen maksatulehdus, vaikea maksatulehdus

Suu- ja sorkkatauti-virus DNA Suu- ja sorkkatauti

Machupo-virus DNA Hemorraginen kuume s il 149 68234 DIP.PAcBA:n aiheuttama biologisten vaikutusten voimistuminen NPT 15392:11a, NPT 15*417 :llä ja NPT 15426:11a on osoitettu olevan merkittävää ifluenssaa vastustavaa vaikutusta sellaisinaan. DIP.PAcBA:n lisääminen NPT 15392:teen 15410:n muodostamiseksi ei voimista influenssaa vastustavaa vaikutusta. NPT 15417:n tapauksessa DIP.PAcBA:n lisääminen 15418:n muodostamiseksi voimistaa influenssaa vastustavaa vaikutusta. Alla olevassa taulukossa on esitetty DIP.PAcBA-suolojen suhteellinen kyky voimistaa eri biologisia vaikutuksia.

DIP.PAcBA- Anti- Anti-leukemia- Immuno-

Yhdiste suola_influenssa_potentiaatio_potentiaatio 15392 15410 molemmat yhtä kyllä kyllä aktiivisia 15417 15418 kyllä - kyllä 15446 15447 kyllä 15431 15432 kyllä 15433 15434 kyllä 15443 15444 kyllä

Hiirten in vivo-käsittely NPT 15392:11a ja NPT 15410:11a: vaikutus Concavalin A:11a in vitro aiheutettuun perna-solujen kasvun stimulointiin Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää, mitä vaikutusta hiiren in vivo käsittelyllä yhdisteillä NPT 15392 ja 15410 on näistä eläimistä eristettyjen pernasolujen myöhempään aktiivisuuteen ja arvioida in vitro näiden solujen kasvuvasti-netta mitogeenillä, Concavalin A:11a (Con A).

Menettely In vivo-käsittely

Yhdeksän urospuolista 8-9 viikkoa vanhaa 18-20 g painavaa Balb/c hiirtä jaettiin kolmeen ryhmään. Yksi ryhmä käsiteltiin kahdesti päivässä (yhden päivän ajan), aamulla ja iltapäivällä antamalla suun kautta 10 mg:n annos kg:aa kohti NPT 15392:ta. Toinen ryhmä käsiteltiin samalla tavalla NPT 15410:llä annoksen ollessa 20 mg/kg. Kolmas ryhmä sai annoksen suolaliuosta ja toimi siten kontrolliryhmänä.

.60 68234

Pernasolujen in vitro-tutkimus: Solujen valmistaminen Seuraavana päivänä kukin ryhmä tapettiin ja pernat poistettiin ja yhdistettiin. Pernat hienonnettiin ja solut pestiin RPMI-1649-väliaineella (Grand Island Bilogicals), johon oli lisätty 2 mm glutamiinia ja antibiootteja. Kunkin valmisteen solupitoisuus määritettiin Coulter-laskimella ja säädettiin ar-0 voon 5 x 10 solua/ml RPMI-väliaineella.

Mikrotiitterilevykoe

Mikrotiitterikokeita suoritettiin 0,2 ml:n inkubaatioil- 5 la, jotka sisälsivät 5 x 10 solua 3a Con A:n tai Con A:n 3a yhdisteitä mainittuina pitoisuuksina. Kaikki kokeet suoritettiin kuusin kappalein ja jokaista verrattiin ainoastaan soluja sisältävään nollakokeeseen. Koelevyjä inkuboitiin 37°C:ssa 5 %:sessa CC^-'Ssa 4 vuorokautta. Viimeisten 18-20 :n inkubaatiotunnin aikana kuhunkin viljelmään lisättiin 0,5 ml HTd.R (10 jiCi/ml, 6 Ci/moo- li). Viljelmät kerättiin multippelillä automaattisella näytteen- 3 kerääjäyksiköllä (MASH) ja niiden sisältävä HTdR määritettiin Beckman LS 8000 nestetuikelaskurilla solukasvun mittalukuna. Tulokset taulukoitiin Con A:11a tai Con A:11a ja yhdisteillä käsiteltyjen viljemien aktiivisuuksien suhteina nollakoeviljel-miin.

In vivo-käsittely joko yhdisteellä 15392 tai yhdisteellä 15410 voimistaa pernasolujen reaktiota in vitro Con A:11a optimaalisen alapuolella olevalla mitogeenipitoisuudella (5 jig/ml) aiheutettuun stimulaatioon. Yhdiste 15410 kohotti stimulointi-siihteen arvoon 100:1 verrattuna nollakokeella saatuun arvoon 55:1. Mitään merkittäviä eroja yhdisteiden 15392 ja 15410 välillä ei havaittu, kun soluja stimuloitiin optimaalisella Con A-pitoisuudella (10 jag/ml).

Myös Con A:11a stimuloitujen solujen myöhemmän NPT 15392:11a ja 15410:11a tapahtuvan in vitro-käsittelyn vaikutus testattiin. Kumpikin yhdiste osoitti selvää kykyä lisätä Con A-stimulaatiota, etenkin optimaalisen alapuolella olevalla mitogeenipitoisuudella (5 jig/ml) ja vähäisemmässä määrin pitoisuudella 10 jig/ml Con A:n pitoisuudella 5 jig/ml NPT 15392 :n aiheuttama stimulaatio on 2,8-kertainen verrattuna Con A:11a yksinään 51 68234 aiheutettuun stimulaatioon, kun taas NPT 15410:11a lisäys oli 3,3-kertainen.

Nämä tulokset osoittavat yhdisteiden immunomoduloivaa vaikutusta pernasolujen kasvuun. Eläinten käsittely ennalta jommalla kummalla yhdisteellä herkistää solut myöhempää mito-geenistä stimulaatiota varten, kun taas solujen käsittely yhdisteillä in vitro mitogeenillä aiheutetun stimulaation jälkeen voimistaa kasvureaktiota, etenkin olosuhteissa, joissa reagoin-tiherkkyys mitogeeniin on alhainen.

Yhdistelmät

Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan syöttää nisäkkäille 1-1000 mg ruumiin painokiloa kohden ja niiden katsotaan katsotaan vaikuttavan jo niinkin alhaisella annostustasolla kuin 0,05 mg/kg. LD^Q-arvo määritettiin yhdisteelle NPT 15410 hiirillä ja oli intraperitoneaalisesti annettaessa 4,3000 mg/kg, kun taas ihonalaisesti annettaessa se oli 4,9000 mg/kg. Yhdistettä NPT 15392 annettiin hiirille annosten ollessa 1000 mg/kg, eikä yhdisteen aheuttamia kuolemia voitu havaita.

Yhdisteitä voidaan antaa tabletteina tai kapseleina ja mikäli liukoisuus sallii, myös siirappeina tai ruiskutettavina liuoksina, kun taas liukenemattomat voidaan antaa suspensioina.

Claims (2)

68234 52

1. Menetelmä terapeuttisesti käytettävien 6-substituoitujen 9-hydroksialkyylipuriinien kompleksien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava X > (ϊ)2 IC-^H-R2 R1 OH jossa X on NH tai HO, R on H tai 1-8 hiiliatomia sisältävä alkyy-2 ^ li, R on H tai metyyli, Y on amiinisuola, joka muodostuu p-ase-tamidobentsoehaposta tai jostain muusta tavallisesta farmaseuttisesti hyväksyttävästä haposta ja amiinista, jolla on kaava E3 /N,CnH2„>0H R4 . 3 4 jossa R ja R ovat alempia alkyylejä ja n on kokonaisluku kahdesta neljään, ja jossa z on luku yhdestä kymmeneen, tunnettu siitä, että vastaavista 6-substituoiduista 9-hydroksialkyyli-purii-neista ja suolasta Y valmistetaan seos moolisuhteessa, joka voi vaihdella suhteesta 1:1 aina suhteeseen 1:10, seos liuotetaan ja muodostunut kompleksi erotetaan liuoksesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että valmistetaan kompleksi, jossa R on n-heksyyli, 2 R on CH^- ja Y on dimetyyliaminoisopropanolin p-asetamidobentsoe-hapon kanssa muodostettu suola. Il