CS251060B2

CS251060B2 - 9-(hydroxyalkyl)purines' derivatives salts production method

Info

Publication number: CS251060B2
Application number: CS796226A
Authority: CS
Inventors: Lionel N Simon; John W Hadden
Original assignee: Newport Pharmaceuticals; Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1978-09-15
Filing date: 1979-09-14
Publication date: 1987-06-11
Also published as: NO152445C; KR840000552A; ZA793973B; AU5055779A; DE2964211D1; ES484167A1; ATE1949T1; HU182544B; FI68234B; IE48827B1; DK385679A; NO792792L; EP0009154A1; AU527851B2; IN153099B; MX6521E; DK149857C; PL119685B1; JPS5547683A; RO77565A

Description

ČESKOSLOVENSKA SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA (19) POPIS VYNÁLEZU K PÁIENTD 251O6O (11) (W) (22) Přihlášeno 14 09 79(21) (PV 6226-79} (51) Int. Cl.4 C 07 D 473/00 (32) (31) (33) Právo přednosti od 15 09 78(942802) Spojené státy americké oHad pro vynálezy•A OBJEVY (40) Zveřejněno 18 09 86 (45) Vydáno 15 08 88 (72)

Autor vynálezu SIMON LIONEL NORTON, SANTA ANA, KALIFORNIE, HADDEN JOHN WINTHROP, NEW YORK, NEW YORK (Sp. st. a.) (73)

Majitel patentu NEWPORT PHARMACEUTICALS INTERNATIONAL, INC., NEWPORT BEACH, KALIFORNIE, SLOAN-KETTERING INSTITUTE FOR CANCERRESEARCH, NEW YORK, NEW YORK (Sp. st. a.) (54) Způsob výroby solí derivátů 9-(hydroxyalkyI)purinů

Vynález je založen na zjištění, že slouče-niny obecného vzorce

I 4 1R OH (I) ve kterém X značí OH, NHž nebo SH, R1 značí atom uhlíku nebo alkylovou sku- pinu s 1 až 8 atomy uhlíku, R2 značí atom Vodíku nebo methylovou skupinu, Y značí sůl aminu obecného vzorce R3 \

N(CnH,n)OH / R4 251060 ve kterém R3 a R4 zinačí inižší alkylovou skupinu s1 až 4 atomy uhlíku a n značí celé číslo* 2 až 4,s kyselinou p-acetamidobenzooviou a ve kte-rém z značí číslo od 1 až 10,jsou použitelné jako imunomodulátory ja-ko antivirově účinné látky a ve specifickýchpřípadech mají protinádorovOu účinnost.Sloučeniny a přípravky, ve kterých z značí1 až 10 jsou nové.

Když R2 značí atom vodíku, přítomnost Ystupňuje imuno-regulačiní účinnost a antivi-rovou účinnost. Když X značí NHz, látkyvykazují imunoinhibiční účinnost, avšak ni-koliv imunostimulační (imumopotenciační)účinnost.

Imunoregulačiní účinnost se jak se zdázvyšuje s narůstající délkou řetězce u R1,alespoň od methylové skupiny po hexylo-vou skupinu, R1 je s výhodou n-alkylováskupina, tj. methylová, ethylová, n-propylo-vá, n-butylová, n-amylová, n-hexylová, n--heptytová nebo n-oktylová skupina. R2 jes výhodou methylová skupina. R může zna-menat methylovou, ethylovou, n-propylovOiu,n-butylovou, isopropylovou skupinu atd. Výhodná skupina aminů pro přípravu so-lí s kyselinou p-acetamidtobenzoovou má o-becný vzorec 251060 R5 \

N(C„H2n)OH R6 ve kterém R5 a R6 značí nižší alkyloviou skupinu, na-příklad methylovou, ethylovou, propylovou,isopropylovou nebo butylovou a n značí celé číslo 2 až 4.

Typickými příklady takových aminů jsoudimethylaminoethanol,dimethylaminoisopropanol,diethylaminoethanol,diethylaminoiSobutamol,dlethylaminoisopropanol,methylethylaminoethanol,disobutylamino-N-butanol,dimethylamiinopropanol,dimethylamino-N-butanol,diisobutylaminoethanol,dimethylaminobutanol,dibutylamino-N-butaniol,idibutylaminoethamol,idipropylaminoethanol adiisOpropylaminoethaimol. Výhodným aminem je dimethylaminoisopro-panol. Symbol z značí 1 až 10, s výhodouz značí 3. Avšak z může být rovněž 1, 2, 4,5, 6, 7, 8, 9 nebo 10. Při popisu níže uvedených sloučenin na-místo dimethylamino-2-propanol-p-aceta-midobenzoátu se užívá zkratky DIP-PAcBA.Když číslo v závorce, například (10] ná-sleduje po této zkratce, potom Y značí 3.Jestliže číslo v závorce následuje po zkrat-ce DIP-PAcBA, potom číslo ukazuje početmol skupin Y přítomných na 1 mol 9-(hyd-roxyalkyljpurinu.

Imunomodulátor je sloučenina, která re-guluje hnunoodpovědi. Pokrývá tedy jak i-munostimulaci (imunopotenciaci), tak imu-inoinhibici. Imunostimulace je pochopitelněpoužitelná při tvorbě imunity. Imunolnhibi-ce má rovněž použití v řadě oblastí. Napří-klad je použitelná pro transplantaci orgá-nů, například ledvin nebo srdce v prevenciodmítnutí organismem.

Imunopotenciační vlastnosti sloučeninplus (-)-] nebo minut ( —), uvedené v ta-bulkách, značí imunostimulační nebo imu-noinhibiční vlastnosti. Číslo 0 ukazuje, žesloučenina nemá ani imunopotenciační ú-činnost ani imunOinhibiční účinnost.

Mitogen je látka, která indukuje proilife-raci buněk, ke které dochází během imuni-zace.

Syntetický způsob L uvedený v tabulce 1je popsán podrobněji v další části.

Sloučeniny podle vynálezu jsou použitel-né při léčbě savců (a buněk savců] včetnělidí, vepřů, psů, koček, hovězího dobytka,koní, ovcí, koz, myší, králíků, krys, morčat,křečků, opic atd.

Není-li uvedeno jinak, všechny díly aprocenta jsou hmotnostní.

Není-li uvedeno jinak, všechny teplotyjsou ve stupních Celsia. Přípravky mohou obsahovat nebo sestá-vat převážně nebo úplně z látek dále uve-dených a způsoby mohou zahrnovat pře-vážně nebo· úplně stupně popsané s těmi-to látkami. Přípravky lze podávat savcům obvyklýmzpůsobem, například orálně, nasálně, rek-tálně, vaginálně, enterálně nebo parente-rálně. Lze jich používat ve formě injekč-ních roztoků, například ve vodě nebo· jakotablet, pilulek, tobolek atd. 251060

Tabulka 1

Souhrn chemických vlastností 9-(hydrO|xyalkyl jpurinů

Číslo sloučeniny R1 význam symbolů ve vzorci Y syntetický způsob R2 X 15428 H H OH DIP.PAcBA L 15437 H H SH DIP.PAcBA L 15447 H CH3 OH DIP.PAcBA L 15432 H ch3 NH2 DIP.PAcBA L 15434 CH3 H NH2! DIP.PAcBA L 15444 CH3 H OH DIP.PAcBA L 15418 CeHtf H OH DIP.PAcBA L 15410 Č6H13 CH3 OH DIP.PAcBA L Další sloučeniny vyrobitelné způsobem Alkylové skupiny značící R1 u sloučenin podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v ta- uvedených v tabulce 1 a tabulce la mají bulce la níže; základní obecný vzorce těch- přímý řetězec. to sloučenin je stejný, jako je Oibecný vzo-rec sloučenin uvedených v tabulce 1.

Tabulka la

Sloučenina Rl R2 X Y CeHi3 CH3 OH DIP.PAcBA(lO) CsHl3 CH3 OH DIP.PAcBA[l) H CH3 OH DIP.PAcBA (10) H CH3 OH DIP.PAcBA (1) CHs CH3 OH DIP.PAcBA C2H5 H OH DIP.PAcBA C3H7 H OH DIP.PAcBA C2H5 CH3 OH DIP.PAcBA C3H7 CHs OH DIP.PAcBA C4H9 H OH DIP.PAcBA C4H9 CH3 OH DIP.PAcBA C5H1Í H OH DIP.PAcBA C5H11 CH3 OH DIP.PAcBA C7H15 H OH DIP.PAcBA C7H15 CH3 OH DIP.PAcBA C8Hl7 H OH DIP.PAcBA C«Hl7 CHs CH DIP.PAcBA Č6H13 CH3 OCHs DIP.PAcBA CeHi3 H OCH3 DIP.PAcBA CH3 H OCHS DIP.PAcBA H H OCH3 DIP.PAcBA H CH3 OCHS DIP.PAcBA C6H13 CH3 OC2H5 DIP.PAcBA CeHl3 H OC2H5 DIP.PAcBA C6H13 CH3 OC3H7 DIP.PAcBA 251060 8

Sloučenina

R1 R2 X Y CH3 H OC3H7 DIP.PAcBA H H OC3H7 DIP.PAcBA H CH3 OC3H7 DIP.PAcBA G6H13 CH3 OC4H9 DIP.PAcBA CeHi3 H OC4H9 DIP.PAcBA H H OC4H9 DIP.PAcBA H CH3 OC4H9 DIP.PAcBA CHs CH3 OC4H9 DIP.PAcBA CH3 H OC4H9 DIP.PAcBA C6H13 CH3 SCH3 DIP.PAcBA C6Hl3 H SCH3 DIP.PAcBA CH3 CH3 SCH3 DIP.PAcBA CHs H SCH3 DIP.PAcBA H H SCH3 DIP.PAcBA H CH3 SCH3 DIP.PAcBA CeHi3 CH3 SC4H9 DIP.PAcBA C6H13 H SC4H9 DIP.PAcBA CH3 H SC4H9 DIP.PAcBA H H 9C4H9 DIP.PAcBA H CH3 SC4H9 DIP.PAcBA H CH3 OH DIP.PAcBA (10) H CH3 OH DIP.PAcBA(l) CeH]3 H O-benzyl DIP.PAcBA C6H13 CH3 O-beinzyl DIP.PAcBA CeHi3 CH3 S-benzyl DIP.PAcBA CeHi3 H S-benzyl DIP.PAcBA

Způsob L Příprava NPT 15410 27,9 mg {0,1 mmol) 9-(2-hydroxy-3-no-nyl)-6-hydrolxypurinu, NPT 15392 a 77,1 mg(0,3 mmol) 2-hydroxypropyldimethylartíoni-um-4-(acetylamino)benzoátu bylo přesně na-váženo a rozpuštěno ve 105 ml 0,25% roz-toku uhličitanu sodného za vzniku 0,1%roztoku NPT 15410 (sloučenina vzniklá zNPT 15392 a [DIP.PAcBA] v molárním po-měru 1 : 3). Důkaz tvorby komplexu

Studie fázové rozpustnosti prováděné sNPT 15392 a DIP.PAcBA ukazují, že NPT15392 má zvýšenou rozpustnost při vzrůsta-jících koncentracích DIP.PAcBA za podmí-nek konstantní hodnorty pH. To ukazuje, žev roztoku dochází k interakci za vznikukomplexu. Místo mdlárního poměru 1 : 3 (NPT15392 a DIP.PAcBA) za použití molárníchpoměrů 1 : 1 a 1 : 10 vznikají jiné komple-xy.

Antivirová aktivita je ukázána v tabulce2 a 3. 2 5 1 O 6 OTabulka 2

Inhibice viru chřipky replikací 9-(hydroxyalkyl)puriny

Kmen viru: Chřipka ASSSR/90(NiNi) 14 1

R OH

Zkouš. Sloučenina si. e. R1 R2 X % inhibice hemadstorpce tokůkonc. (jUg/ml)Zkoušená látka <10 10—100 >100 15435 H H SH _ 50 10 15437 H H SH DIP.PAcBA 65 65 15446 H CH3 OH — 2 0 0 15447 H CH3 OH DIP.PAcBA 10 26 34 15431 H CH3 NH2 — 22 0 15432 H CH3 NH2 DIP.PAcBA 48 62 15427 CH3 H Cl — 15423 CH3 H Cl — 2 13 6 15433 CH3 H NH2 — 32 0 15434 CH3 H NH2 DIP.PAcBA 41 62 15443 CH3 H OH — 0 0 15444 CH3 H OH DIP.PAcBA 44 54 15417 CeHi3 H OH — 18 58 60 15418 CsHl3 H OH DIP.PAcBA 16 46 52 15392 CeHi3 CH3 OH — 86 100 100 15410 C6H13 CH3 OH DIP.PAcBA 58 96 96 15426 CeHi3 CH3 NH2 — 50 96 100 15110 — — — DIP.PAcBA 0 0 20

Tabulka 3

Inhibice replikace viru Herpes 9-(hydroxyalkyl)puriny λ

U I

R OH NPT č. R1 Sloučenina Povlaky (PFU)Test Kontrola (15—150 g/ml) % inhibice R2 X Y 15392 CeHi3 CHs OH _ 98 15417 C6H13 CH3 OH 15418 C6H13 H OH DIP.PAcBA 15410 CeHi3 H OH DIP.PAcBA 98 251060

Biologická účinnostMetody

Protichřipková účinnost — (zkouška hem-adsorpce)

Po infik-a-ci jednovrstevné tkáňové buněč-né kultury virem chřipky se buněčný po-vrch mění tím způsobem-, že erytrocy-tymorčat mohou být -adsorbovány buněčnýmpovrchem. Počet ohnisek adsorbovanýchbuněk (hemadsorpce ohnisek vytvářejícíjednotky HAFFU) je kvantitativním měřít-kem infekčnosti. Metoda se provádí násle-dujícím postupem.

Monovrstvy byly subkultivovány následu-jícím způsobem: médium bylo odlito a mo-novrstva byla promyta dvakrát asi po 50 mlsolného roztoku s fosfátovým pufrem pros-tého' vápníku -a- hořčíku (PBSj, GIBCO 419) při pH 7,2. Byl přidán 1 ml rozto-ku trypsin-EDTA (GIBCO ## 530L), obsa-hujícího 0,5 g trypsinu (1 : 250) a 2,0 gEDTA/litr modifikovaného Puickov-a solnéhoroztoku A, bylo přidáno při teplotě 37 °Cdo, každé baňky -a dispergováno mírným po-třepáním nad mon-ovrstvou. Baňky byly u-místěny v inkubátoru při teplotě 37 °C podobu asi 3 až 5 minut v závislosti na časepotřebném ke zpracování buněk. Bylo- za-potřebí občasné potřepání. Do každé baň-ky bylo přidáno 10 ml kultivačního média abuňky dispergovány natažením a vypuze-ním suspenze z pipety. Obsahy série baněkbyly shromážděny a buňky v suspenzi bylyzředěny kultivačním médiem do koncentra-ce 7 až 8,5 X 10* buněk/ml. Kultivační mé-dium sestávalo z následujícího složení: mi-nimální esenciální médium Eagles (MEM)se solemi Earleho- a Hepesovým pufrem(GIBCO 236) doplněné přidáním násle-dujících látek specifikovaných pro 87 mlMEM: 10 ml fetálního telecího séra(FCS-GIBCO 614HI) 1 ml L-glutaminu (200 molární GIBCO503) 1 ml chlortetracyklinu (5 000 ,ug/mlGIBCO 528) 1 ml směsi 10 000 jednotek penicilinu, 10 000 jednotek streptomycinu a10 000 jednotek neomycinu(PSN-GIBCO 564).

Buňky byly subkultivovány v tkáňovýchmiskách Linbro. Misky měly 24 plochýchspodních ploch objemu 3 ml na každou; dokaždé misky byl přidán 1 ml suspenze tká-ňové kultury. Následující den bylo médium odstraněnoa nahrazeno čerstvým kultivačným médiem.Monovrstvy byly používány k pokusům, kdyždosáhly stavu, kdy byly z valné části splý-vavé (přibližně 3 až 4 dny).

Když buněčné kultury HeLa v Linbro· mis- 10 kách byly připraveny ke zkoušení (viz buň-ky) médium bylo dekantováno a, 1 ml udr-žovacího média (MEM -a FCS redukovanéhon-a 3%), obsahujícího zkoušenou látku sdanou koncentrací byl přidán ke 4 repliko-vaným kulturám na misce.

Bylo použito rozličných koncentrací látekpohybujících se od 2,3 do- 150 mg/ml. Sa-motné udržovací médium bylo používáno- kekontrole kultur. Po přidání látky a kontrol-ního, média bylo- k pokusným skupinám in-fikovaným kontrolním kulturám přidáno 0,1mililitru zředěné suspenze virů. K neiinfiko-v-aným kontrolním kulturám byl přidán pou-ze rniztok chloridu sodného-. Linbro miskybyly potom inkubovány při teplotě 37C|C podobu 18 hodin, načež média všech skupinbyla odsáta. Každá kultura byla promytajednou PBS. Roztok chloridu sodného bylodsát a ke každé kultuře bylo přidáno 0,5mililitru 0,4% objem/objem suspenze ery-tro-cytů morčat v PBS. Kultury byly pone-chány po- dobu 30 minut při teplotě míst-nosti, potom bylo médium dekantováno akultura byla promyta dvakrát PBS k od-stranění všech, kromě specificky vázanýcherytrocytů. Po třetím prolmytí bylo- ke všemkulturám přidáno udržovací médium.

Do okuláru kontrastního mikroskopu sinvertní fází z.n. Nikon byl vložen okulárH-owardova mikrometru (C8385). Každá kul-tura byla hodnocena 4 X low papírovýmobjektivem s použitím okulárové mřížky, ja-ko- značkovače piole bylo prováděno příméhodnocení počtu hemadsorb-ovaných erytro-cytů. Parciální -nebo úplná pole byla hodno-cena v experimentální skupině v závislosti,na výsledném počtu a hustotě hemadsorb-o-vaných buněk u infikovaných kontrolníchkultur. Bylo- voleno zvětšení 60 X nebo150 X, aby byly získány optimální podmínkypro výčet hemadsorbov-aných buněk. Bylyvypočteny faktory polí pro stanovení hem-adsorpce při zvětšení 60 X a 150 X. Při še-desátimásobném zvětšení bylo vypočtenocelkové množství polí tím, že bylo násobe-no faktorem 55,5. Při sto-padesátinásobnémzvětšení bylo násobeno faktorem 273. Fak-tor násobení 55,5 a 273 znamená celkovémnožství polí při zvětšení 60 X -a 150 X. Po-čet vyčíslených polí se pohyboval od tří dopěti na jednu misku u tří -až čtyř misek po-užívaných u pokusné skupiny (viz hrubéúdaje tabulek v oddíle výsledků týkajícíchse počtu sledovaných polí). Byly vypočte-ny průměrné a standardní chyby a data by-la hodnocena za použití studenťs t-zkušeb-ní analýzy.

Biolog'cká účinnost Účinnost proti viru herpes — (povlakovýtest)

Infekce buněk tkáňové kultury virem Her-pes způsobuje lyži buněk. Po č-ase tyto ly- 251060 11 12 ziované buňky se jeví jako tenká čirá ob-last (povlak] na vrstvě buněk. Inkcrpora-ce zkoušené látky do média redukuje po-čet povlaků, jestliže je schopna zabránit re-plikaci virů. Mettoda spočívá v následují-cím:

Materiály a metody

Virus

Bylo používáno- viru herpes hominis typu2 dodaméln od American Type Culture Gol-lection (ATGC), Bethesda, Maryland,ATCC /--/ 540, šarže 3D. Lyoďilizovaná sus-penze virů byla rekonstituována 1 ml ste-rilní destilované vody. Virus prošel dvakrátmonovrstvami HeLa-buněk. Supernatantytkáňové kultury byly spojeny, rozděleny po1 ml -a uchovávány při teplotě —70 °C. Titrtéto pracovní zásobní suspenze byl nalezen10~4 tqidsq/o,! m] (po dvou dnech inkuba-ce].

Povlaková zkouška na virus Herpes

Vard-buňky v logaritmické růstové fázibyly subkultivovány v koncentraci 1 X 105buněk/ml v 50 ml Falconových baňkách vEaglově minimálním esenciálním médiu(MEM), doplněném 10% fetálním telecímsérem (FCS) a antibiotiky. Média byla mě-něna v den následující po kultivaci. Věromoinovrstvy dosáhly splývavosti druhý denpo- kultivaci a s buňkami v logaritmické fá-zi byly kultury užity v povlakové zkoušce.

Zi-vná média byla odlita a moinovrstvy by-ly promyty jedinou roztokem chloridu sod-ného s fosfátovým pufrem (PBS). Bylo při-praveno několik různých ředění pracovnízásobní suspenze virů a každá kultivačníbaňka byla infikována 0,5 ml některého ře-dění virů přidaného k médiu prostému FSC.Toto médium obsahovalo látku v koncen-traci 150 ^g/ml. Kontroly byly připraveny smédiem bez látky.

Adsorpce virů byla ponechána probíhat poi dobu 2 hoďn při teplotě 37 °C, běhemkteréžto doby byly kultury každých 15 mi-nut mírně otáčeny. Potom byla média odli-ta a monovrstvy byly promyty jednou 10 mlPBS.

Agaróza byla připravena v koncentraci6 % hmotnost/objem v 50 ml PBS. Bylo při-praveno zásobní médium MEM doplněné2% FCS. K některému zásobnímu médiu by-la přidána zkoušená látka v koncentraci 150(Ug/ml. Tři roztoky byly udržovány při tep-lotě 47 °C. Kromě toho bylo znovu přidánosmíšené lidské antiherpetické sérum v ře-dění 1 : 10. Těsně před začátkem zkouškybylo k 85 ml média přidáno 15 ml roztokuagarózy. Dalších 15 ml agarózy bylo přidá-no k 85 ml média se zkoušenou látkou.

Ke každé z promytých monovrstev v jed-né skupině pokusů bylo přidáno bud' 5 mlmédia s agarózou nebo 5 ml média obsahu-jícího agarózu a zkoušenou látku. V jinéskupině pokusů bylo ke každé monovrstvěpřidáno buď 0,2 ml antiherpes-séra v 5 mlmédia nebo 0,2 ml antiherpes-séra v 5 mlmédia se zkoušenou látkou. Aintiherpes-sé-rum bylo používáno namísto agarózy k lo-kalizaci povlaků pomocí neutralizace vod-ného viru v médiu. Baňky byly ponechánypo dobu 5 minut při teplotě místnosti, na-čež byly inkuhovány po dobu dvou dní přiteplotě 37 °C. U většiny pokusných skupinbylo použito trojnásobných kultur.

Do každé baňky bylo přidáno 10 ml PBS.Nanesené vrstvy byly mírně třepány a po-tom odlity z baněk. Monovrstvy byly vybar-veny roztokem 0,5 % hmotnost/objem krys-talové violeti v 50% methanolu s trojnásob-ně destilovanou vodou. Povlaky byly odečí-tány buď přímo pomocí fluorescenčníhosvětla a makropozorováním, nebo za použitísvětelného mikroskopu pro mikropovlaky.Mikropovlaky byly hodnoceny vypočtenímprůměru tří polí u pokusné skupiny při sto-padesátinásobném zvětšení. V dalších zkouškách antivirové účinnos-ti byly získány následující výsledky.

Slouče- nina % inhibice při ug/ml Virus 0,1 až 1,0 1,0 až 10 10 až 100 >100 15392 30 až 50 — >70 >70 chřipka A vepřů1976 (Hlsw—Ni) 15417 — 50 až 70 >70 chřipka A vepřů1976 (Hlsw-Ni) 15418 ·*“ >70 >70 chřipka A vepřů1976 (Hlsw~Nt) 15426 20 až 30 30 až 50 50 až 70 50 až 70 (Ruská) 15410 50 až 70 30 až 50 >70 >70 (vepřů)

Další zkoušky antivirové účinnosti sloučeniny NPT 15410 jsou uvedeny v tabulce 3a. 251060

Tabulka 3a

Inhibice replikace viru chřipky pomocí NPT 15410

Virus Rozmezí koncentrace (^g/ml) i 0,01—1,0 1,0—10,0 10,0—100 >100 A (vepřů) 76 (HlswNi) +++'* ++ ++++ ++H—)- A (Texas) 77 (HsNz) H—l· + ++++ ++++ A(Dunedin)73 (H3N2) NT NT + ++ A(Jap)305 (H3N2) NT NT ++++ ++++ A/PRs (H0N1) H—l· H—l· +H—1—h +++ AžHong Kong (H2N2) NT NT ++ +++ aNT — nezkoušeno· +++- 50 až 70 % inhibice + = 10 až 20 % inh'bice ++++ = >70 % inhibice -)- = 20 až 30 % inhibice -j—(- = 30 až 50 % inhibice Imunomodulačiní aktivita Je uvedena v bulce 4.

Tabulka 4

Modulace imunity zprostředkované buňkami pomocí 9- (hydraxyalkyl) purinů

HC-CH-R u i

R OH

Slouče- nina NPT č. R1 R2 , X Y 15417 C6H13 H OH — 15418 C6H13 H OH DIP.PacBA 15392 CeHt3 CH3 OH — 15410 CeHis CH3 OH DIP.PAeRA 15426 C6H13 CH3 NH2 —

Maximální procentuální změna NPT č. Mitogenem indukovaná Mitogenem indukovaná (PHA) (Con A) prolit lymf. myší prolit, lid. nymf. 0,01—1,0 1,0—10 10—100 0,01—1,0 1,0—10 10—100 15417 0 0 0 0 0 —50 15418 41 73 26 15392 172 162 —72 11—15 20 -50 15410 140 40 40 30—50 60 251060 13 54

Maximální procentuální změna — pokračování NPT č. Lymfokiinem (MMF = makroifágovýmitogenní faktor) (morče) indukovanámakrofágová proliferace 0,01-- 1,0 1,0—10 10—100 15417 13 -50 15418 12 80 —50 15392 33 23 15410 12 23 Několik látek bylo zkoušeno na mitogenem indukovanou pťoliferaci myších lymfo- cytů s následujícími výsledky: afetó:~ Slouče- % stimulace v ug/ml nina 0,1-1,0 1,0—10 10—100 >100 15392 >50 30—50 30—50 nehodnoceno 15410 >50 30—50 30—50 nehodnoceno 15417 0 0 0 0 15418 20-30 >50 20—30 nehodnoceno'

Biologická účinnost

Imionomodulační zkouška

Používá se následujících tří zkoušek k vy-hodnocení schopnosti zkoušených látek mo-dulovat aktivitu několika tříd buněk v i-munitním systému. V těchto systémech jemožné identifikovat jak imunopotenciačníúčinnost (průkaz pomocí zvyšování hodno-cených parametrů], tak i imumosupresivníúčinnost (průkaz pomocí inhibice hodnoce-ných parametrů]. 1. Zkouška na buňkách sleziny myši indu-kovaných mitogenem

Buňky sleziny myší obsahují populaci lym-focytů B i T, které lze stimulovat k prolife-raci řadou cizích látek (například rostlin-nými mitogeny například Coin A). Tato zvý-šená proliferace je ukazatelem zvýšené pře-dané buněčné imunity. Níže uvedený způsobpopisuje systém používaný k hodnocení lá-tek jato imunopoteinciátorů.

Materiály

Konkanavaliin A (Calbiochem, La jolla,California] šarže 210073, lyofilizovaný vchloridu sodném, byl připraven nejprve ja-to 1% roztok ia ředěn jako 2X koncentracepro jednotlivá ředění (0,5, 1,0, 2,5 ,ug/ml).

Zvířata Šest až osm týdnů staří samci myší kme-ne Balb/c a C3H byly získáni z následují-cích zdrojů. Fltíw Research Animals, lne.,Dublin, Virginia; Charles River Breeding La-boratories, Wilmitigton, Massachusetts; Lo-bottory Supply Ciompany, Indianapolis, Indi-ána; Liionel Stdong Foundation, San Diege,California.

Buňky Tři až pět myší bylo usmrceno odstraně-ním mozku a sleziny byly vyňaty za asep-tických podmínek. Shromážděné sleziny by-ly riozkoustovány a rozdrásány sterilnímiklíšťkami, potom filtrovány dvojitou vrst-vou nylonového síta. Suspenze buněk bylapromyta jednou 15 ml RPMI 1610 doplně-ného 5% fetálním telecím sérem a antibio-tiky. Buňky byly kultivovány na mikrqdes-kách v koncentraci 103 buiněk/0,1 ml/miska.Kultury byly inkubOvány v přítomnosti ne-bo nepřítomnosti mitogenu ve vlhčené at-mosféře obsahující 5 % kysličníku uhličité-ho po dobu 48 hodin. Zkoušené látky bylypřidávány ke kulturám v různých koncen-tracích s mitogenem.

Proliferace

Proliferace byla hodnocena stupněm in-korporace 3,7 s_1 3H-thymidinu po, dobu 18hodin inkubace. Kultury byly izolovány po-mocí MASH zařízení (Otto Hiller Co., Ma-dison, Wiscoínsin) a intorporace thymidinubyla hodnocena pomocí kapalinové scinti-lační spektrometrie. Kultury byly provádě-ny třikrát a data jsou vyjádřena ve forměplus a minus standardních chyb experimen-tálních průměrů. Ukazatele stimulace po-mocí látek spolu s kontrolními hodnotamibyly rovněž vypočteny a znázorněny gra-ficky. 2. Mitogenem indukované lidské lymfocytyperiderní krve

Existuje klinická potřeba terapeutickýchčinidel, která by zvyšovala imunitní odpo-věď u pacientů s nedostatečnými nebo po-tlačenými imunitními stavy, jaké existujenapříklad u pacientů s virovými choroba-mi nebo rakovinou. Během studia schoplnots- 251060 15 ti činidel zvyšovat proliferaci lymfocytů pe-riferní krve lidí jako odpověď ina cizí látky,lze identifikovat činidla s imuinopoténclačníúčinností u lidí. Jedná se o právě uváděnýzpůsob a popsaný rovněž J. W. Haddenem,Infect. and Immunity, únor 1976, str. 382až 387, zejména strany 382 až 383. 3. Makrofág představuje subpopulaci leu-kooytů, které jsou důležitou složkou imu-nitního systému při kontrole celulární i ho-morální aktivity. Systém zkoušky, uvedenýníže, hodnotí látky studované jako poten-ciátory funkce makrtofágu.

Fytohemaglutinin (FMA) (HA-17) byl do-dán firmou Burroughs Wellcome. Preparátobsahující makirofágový mitogenový faktor(MMF) a makrOfágOvý aktivační faktor(MAF) byl připraven z antigenem stimulo-vaných, imunních lymfocytů z lymfotickýchuzlin (morče), jako bylo již popsáno Had-denem se sp. v Nátuře 257, 483 až 485(1975). Parciální čištění tohoto preparátuvakuůvOu dialýzou a sloupcovou chromato-grafií na Sephadexu G-100 poskytl© aktiv-ní frakci v rozmezí 35 až 70 000 daltOnů,vykazující mitogenní i aktivační vlastnosti.Aktivní frakce bylo použito' v proliferačníchi aktivačních zkouškách.

Metody

Ficoll-hypaque čištěné lymfocyly z lidsképeriferní krve byly připraveny a inkorpo-rací tritiovanéhO' thymidinu, jak je to po-psáno, Haddenem se sp., Cell. Immunol. 20,98 až 103 (1975), byla zkoušena PHA-iindu-kiovaná proliferace lymfocytů. Jednotlivélátky byly analyzovány v suboptimálních,optimálních a supraoptimálních, koncentra-cích PHA (0,001, 0,01, 0,1 jedmotek/ml). By-ly připraveny parafinovým olejem induko-vané peritOneální makrofágy a inkuboványjako jedinovrstevná kultura (98% čisté ma-krofózy). Byla hodnocena proliferace indu-kovaná lymfokinem (MMF) pomocí tritto-vaného thymidinu po 3 až 5 dnech na kul-tuře, jak je to, popsáno Haddenem se sp.,Nátuře 257, 483 až 485 (1975). Po dobu 6hodin byla prováděna lymfokinem (MAF)indukovaná aktivace roakrofágu za účelemusmrcení Listeria monoicytogeines po dobu5 dní v kultuře v přítomnosti nebo nepří-tomnosti MAF, jak je to' popsáno, Haddenema Englandem, Immunopharmiacology, str. 87až 100, (Plenům Press 1977). Fagocytózabyla hodnocena kvantitativně po, dvacetimi-nutové expozici Listeria moinocytogenes vy-počtením množství bakterií Obsahujícíchmakrofágy a počtu bakterií na fagocytic-kou buňku v grampiozitivníích mOinovrst-vách v Labtekově komůrce. Intracelulárníusmrcení bakterií bylo hodnoceno počtemmnožství buněk obsahujících bakterie a po-čtem bakterií/buňka, 6 hodin po počátečnídvacetiminutové expozici. Paralelně prová-děné pokusy, při nichž byly makrofágy ly- 16 zovány a intracelulární bakterie kultivová-ny, potvrzují hodnotu bakteriální účinnostistanovené tímto způsobem v tomto, systému.Zkoušené látky byly používány v každém zetří systémů v rozmezí sériové log. koncen-trace trojnásobně v přítomnosti a nepří-tomnosti mitogenu nebo lymfokinu. Každýpokus byl proveden nejméně třikrát. Před-chozí pokusy ukazují paralelnost odezvy nafarmakologickou modulaci ve zkouškáchproliferace a aktivace.

Biologická aktivita

Antileukemická aktivita (inhibice růstu L-1210 Růst

Leukemické buňky izolované z myší s ná-dorem L-1210 byly kultivovány in vitro ajejich růst byl měřen hodnocením počtu bu-něk v kultuře za určité časové období. In-korporace zkoušené látky do prostředí za-brání růstu leukemických buněk, což je u-kazatelem účinné antileukemlcké látky. 150 (koncentrace zkoušené látky inhibu-jící růst L-1210) v procentech zkoušené lát-ky byly následující:

Sloučenina Koncentrace (miknogramy/ml) 15392 28 15410 54 15417 47 15418 70

Použitý systém zkoušení je uveden níže. Míra inhibice růstu leukemických buněk (L-1210) Růst

Dochází k adekvátnímu růstu buněk v zá-sobních kulturách za použití buněk 48 až72 hodin po, provedeném přenesení.

Zkoušená látka se navažuje v padesátiná-sobku požadované konečné koncentrace aprovádí se sériové ředění. Příprava konečného média probíhá za po-užití 500 ml NcGoyova 5A média, 15% fe-tálního telecího, séra, 5 ml roztoku penici-lim-streptomycin a 5 ml antibiotickoatimy-kotického, roztoku a nechá při teplotě míst-nosti. Za použití sterilní techniky se do kaž-dé zkumavky přidá 0,1 ml ředění zkoušenélátky.

Poté se přidá příslušné množství buněkk připravovanému médiu. Po smíchání se o-debere 0,5 ml vzorku, umístí do lahvičkyobsahující 9,5 ml roztoku chloridu sodné-ho, a provede odpočet na Coulterově počíta-či. Hodnota se vynásobí čtyřiceti, aby bylokompenzováno ČtyřiqetinásObné ředení (0,5 17 18

2 5 1 O *? O mililitru do 0,5 ml roztoku chloridu sodné’ho a spočte inokulum). Přidá se 5 ml suspenze buněk do každézkumavky a otáčí zkumavkami, aby bylazajištěna jednotná distribuce buněk.

Utěsní se čepičky a umístí při 36 až 38 °Cv inkubátoru s atmosférou kysličníku uhli-čitého po dobu 96 hodin. Po uplynutí 96 ho-din se vyjmou zkumavky z inkubátoru a hodnotí obsah každé zkumavky na Ooulte-rově počítači. Výsledek se násobí čtyřicetia stanoví průměr čtyř hodnot pro jednotí'-vé ředění zkoušené látky, jestliže je vý-sledek menší než inokulum, zaznamená sehodnota 100 % inhibice. Pro, všechna ostat-ní hodnocení se používá následujícího, vzor-ce: průměrný počet buoěk/mlve zkoušené kultuře — inokulumv buňkách/ml___ průměrný počet buněk/mlv kontrolních kulturách —inokulum v buňkách/ml X 100 = % přežití 100 % — % přežití = inhibice růstu způ-sobená látkou. U sloučenin podle vynálezu bylo naleze-no, že inhibují replikaci reprezentativníhovzorku RNK a DNK virů za použití technikystandardních tkáňových kultur. V případěRNK virů bylto· dokázáno, za použití techni-ky hemadsorpce (sekce II, B), že několikkmenů chřipkového viru náležejících k sub-typům A a B je inhibováno. Nalezené speci-fické sloučeniny inhibující replikaci chřip-kového, viru (typ A/SSSR 90], jsod uvedenyv tabulce 1. U několika členů sérií NPT15392, NPT 15410, NPT 15417 a NPT 15418bylo nalezetnlo, že inhibují replikaci nejmé-ně čtyř různých kmenů chřipkového, viru vkoncentracích pohybujících se od 1 do, 150^g/ml.

Kromě toho, u několika členů sérií NPT15410 a 15392 bylo dokázáno, že inhibujíreplikaci viru Herpes Simplex, člena virůDNK třídy a virů odpovědných za vážná mu-cokutánní poškození u lidí, spolu s fatálníherpetickou encefalitidou. Ostatní členovététo třídy virů jsou odpovědní za chorobypaznehtů a tlam vepřů a hovězího dobytkaa infekcí thinotracheitis a kašle u psů. Užv koncentracích nižších ,než 100 ^g/ml NPT15392 a 15410 bylo nalezeno, že redukujívznik povlaků až do, >90%, které vyvolá-vá virus Herpes Simplex. Další členové tří-dy DNK uvedení v tabulce 5 jsou z dpověd-ni za specifikované choroby. Je známto, žeze všech chorob na světě nejméně 25 % jevyvoláváno viry. Kromě toho bylo izolová-no, množství virů, o nichž byl dokázáno, ževyvolávají nádory. U antivirových činideljako takových lze očekávat, že mají někte-ré protimádorové vlastnosti.

Je ověřenou skutečností, že četná infekč-ní činidla, například viry (virus chřipky,HSV, Friendův virus leukemie), bakterie ahouby vyvolávají imunodepresivní stav uhostitele, čímž oslabují jeho obranu protiinfekci infekčními činidly. Většina dalšíchantivirových antimetabolitů, například AraC,způsobuje potlačení imunitních ^brannýchmechanismů hostitele, čímž vzniká poten-ciál snižující přirozené tělesné obranné me-chanismy a stupňuje sekundární infekci.

Imunopotenciátor nebo imunomodulátor jekterékoliv činidlo, která buď obnovuje po-tlačenou imunhní funkci nebo zvyšuje nor-mální imunitní funkci, nebo obojí. Imunit-ní funkce je def nována jako rozvinuti a vy-jádření humoráliní (zprostředkováno proti-látkou) imunity, buněčné (zprostředkova-né thymocyty) imunity nebo makro,fágy agranulocyty zprostředkované rezistence.

To zahrnuje togcky činidla působící pří-mo na buňky zúčastněné při vyjádření i-munitní Odpovědi nebo na buněčné moleku-lární mechanismy, které opět se účastní mo-difikace funkce a buněk zúčastněných naimunitní odpovědi. Zvýšení imunitní funkcemůže být výsledkem působení činidla ruší-cího supresívní mechanismy odvozené ne-gativními endogenními nebo, exogennímivlivy zpětné vazby k imunitnímu systému.Imunitní potenciáttory mají rozličné mecha-nismy účinku. Vzdtor rozličnosti buněčné ú-č:nnosti a biochemickému mechanismu ú-čínnosti imuinopoteinciátorů, jejich aplika-ce je v podstatě stejná; tj. zvyšovat rezisten-ci hostitele.

Aplikace imunopotenciátorů 1J Principiální ochranná funkce imunit-ního systému se týká rezistence vůči inva-zi pathogenů, včetně virů, rickettsií, myko-plazmy, bakterií, hub a parazitů všeho, dru-hu. Zdokonalení imunitní odpovědi, zejmé-na v případě, kdy je snížena, by mělo, ztood-noť.tslně zlepšit rezistenci při infekci nebonapadení některým z výše uvedených pa-togenů. Imunopotenciátor samotný nebo vkombinaci s antiInfekční terapií lze apliko,-vat na kteronkoTv z infekčních chorob. 2} Druhá ochranná funkce mumitního sy-stému je uvaž svána jako rezistence protitransplantátu cizí tkáně, buď přirozené, ja-ko ve vztahu plod — matka; nebo nepřiro-zené, jak je prováděna transplantujícím lé-kařem. Imunopotenciátorů může být použi-to rovněž k snadnějšímu vypuzení plodo-vých nebo, placentálních tkání nebo, k modi-fikaci či k navození snášenlivosti k trans-plantátům. 2 5 1 0 6 0 19 20 3] Třetí (ochranná funkce imunitního sy-stému je uvažována jako rezistence k ma-lignímu rozvoji buněk, například u rakovi-ny. Imunopotenciátorů jako prostředků kléčbě rakoviny lze použít ke zvyšování re-jekce nádorů a inhibice recidiv nádorů ná-sledujících po jiných formách terapie. 4) Čtvrtá ochranná funkce zahrnujeschopnost rozeznat cizorodost a udržovatjejí netečnost pozitivními supresivními me-chanismy. U autoimunitních a příbuznýchchorob jsou zřejmé imunitní reakce řízenévlastními antigeny nebo neúměrně zvýše-né odezvy, které jsou autodestruktivní. I-munopotenciátorů lze používat k obnovenínormálních supresivních mechanismů, k in-dukci snášenlivosti nebo k jiné podpořenormální imunitní odpovědi.

Každou z ochranných funkcí imunitníhosystému lze modifikovat nespecifickou te-rapií samotnými jmunopoteuciátory nebov kombinaci s dalšími činidly používanýmike zdokonalení rezistence nebo k usmrce-ní invazních patogenů. Kromě toho, lze spe-cifickou rezistenci zvyšovat použitím imu-mopotencutorů ve spojení s některou for-mou antigemu jako u vakcíny, za použitínapříklad viru, nádorové buňky apod. Totopoužití může spočívat buď v indukci spe-cifické imunity nebo snášenlivosti. Ta bymohla být uvedena příkladně použtím s an-tigeuem při alergii nebo autoimunhníchchorobách. Použití imunopotenciátorů můžebýt buď terapeutické nebo profylaktické;toto zejména ve stáří, kdy jsou obvyklejšíinfekce, autohnunita a rakovina. Doba pod-dání a způsoby jsou variabilní a mohou býtkritické při stanovení pozitivních nebo ne-gativních výsledků odpovědí. Kterékoliv či-nidlo schopné zvyšovat imunitní odpověď jimůže v závislosti na čase a dávce inhibovat;hnunopotenciátorů by mohlo být použito zajistých okolností jako imunosupresivníhočinidla při alergiích, autoimunitě a trans-plantaci.

Tabulka 4 nahoře udává výsledky hodno-cení množství těchto zkoušených látek ja- ko potenciátorů imunitní odpovědi. Bylopoužito tří odlišných zkušebních systémů.Prvý zahrnuje míru schopnosti zkoušenélátky zvyšovat schopnost lymfocytů myšíproliferovat jato reakce na rostlinný mito,-gen (Con A). Druhý zahrnuje stanoveníschopnosti zkoušených látek zvyšovat pro-liferacl lidských lymfocytů jako, reakce nadruhý rostlinný mitogen (PHA). Třetí sy-stém měří schopnost těchto zkoušených lá-tek zvyšovat makrofágovou proliferaci ja-ko, reakci n,a přirozený lymfokin (MMF,Macrophage Mitogenic Factor). Tato posled-ní reakce, proliferace a aktivace makrofá-gů, jak se ukázalo, je zúčastněna při usmr-cování bakterií, virů a nádorových buněktouto, třídou leukocytů. Význačná po-tenciace imunitní odezvy by-la pozorována u 15392, 15410 a 15418.

Konečně byla stanovena účinnost něko-lika těchto, činidel NPT 15392 a 15410 jakoinhibitorů růstu abnormálních lymfocytů.Obě látky jsou schopné inhibovat prolifera-ci leukemických lymfocytů myší (L-1210buněčné linie) v tkáňové kultuře. 50% in-hibice 1,-1210 buněk byla uskutečněna po-mneí NPT 15392 v koncentraci 28 ^g/ml aNPT 15410 v koncentraci 54 ^g/ml. Schop-nost inhibovat leukemické lymřocyty v kon-centracích, které stimulují normální lymfo-cy.ty, je jedinečnou, dosud neznámou vlast-ností v kterékoliv jiné skupině látek.

Sloučeniny podle vynálezu jsou členy tří-dy látek, které specificky inhibují replika-ci RNK a DNK virů, modulují (po,tunelují)imunitní odpověď a inhibují růst leukemic-kých lymfocytů. Na základě pokusů in vit-ro, které ukazují účinnost v rozmezí kon-centrace 0.01 až 150 pg/ml, rozmezí účin-ných látek u savců je 0,05 až 500 mg/kg.Netoíxičnost při dávkách 1 500 mg/kg u my-ší byla zaznamenána u několika členů této,série.

Imumiopotenciátorů podle vynálezu lzepoužívat například při zvyšování rezistenceprot' invazním virům uvedeným v následu-jící tabulce 5. 231080 21 22

Tabulka 5

Virus Třída Choroba Arenavirus RNA Rift Valley-ská horečka Influenza RNA chřipka Rhinovirus RNA nachlazení Poliovirus RNA dětská c-brna spalničky RNA spalničky Virus newcastleské horečky RNA Newcastleská horečka Rotavirus RNA gastroemteritida u dětí Hepatitis Typ A RNA infekční hepatiť.da virus vztekliny RNA vzteklina Arbovirus RNA encefalitida Vaccinia virus DNA plané neštovice Herpes Simplex Virus DNA opar rtů, encefaliťda, pohlavní choroby Herpes Zoster DNA opar pásový Varicella Zoster DNA plané neštovice Adenovirus DNA respirační choroby Hepatitis typ B DNA chronická hepatitida, akutní hepatiťda virus slintavky a kulhavky DNA slintavka a kulhavka Machupo virus e hemoragická horečka Poteinciace biologických účinností pomocí 15392, NPT 15417, NPT 15426 mají všechny DIP.PAcBA významnou pnotichřipkOvou účinnost. V jed-nom případě (u NPT 15392) přidání Z látek popsaných v tabulce 1, NPT DIP.PAcBA soli k NPT 15392 za vznku 15410 15392 a NPT 15446 jsou ntové látky, chrá- nepotencuje protichřipkovou účinnost. V něné US patentem č. 4 221 910 (čs. paten- případě NPT 15417, přidání DIP.PAcBA soli tem č. 241 023] autora Alfreda Giner-Soxol- za vzniku 15418 potencuje proťchřipktovou ly. Nové jsou i DIP.PAcBA soli uvedené v účinnost. Souhrn poměrné schopnosti této tabulce, jmenovitě 15428, 15437, 15447, DIP.PAcBA solí potencovat různé biologm- 15432, 15434, 15444, 15418 a 15410. NPT ké účinnosti je uveden níže.

Tabulka 6

Sloučenina DIP.PAcBA sůl Proti chřipce oběstejně účinné Potenciace antileukemie Imunopotenc: 15392 15410 obě stejně účinné ano ano 15417 15418 ano — ano 15435 15437 ano — —. 15446 15447 ano — — 15431 15432 ano — — 15433 15434 ano — — 15443 15444 ano — — Léklové formy

Sloučeniny podle vynálezu lze podávatsavcům v dávce 1 až 1 000 mg/kg tělesnéhmotnosti a předpokládá se o· nich, že jsouúčinné v dávkách nižších než 0,05 mg/kg.LDso stanovená u myší pro NPT 15410, po-dávané intraperitoneálně, byla 4 300 mg/kg,při subkutánním podání byla 4 900 mg/kg.NPT 15392 byla podávána myším v dávkách1 000 mg/kg a nebyl pozorován úhyn zví-řat, způsobený zkoušenou látkou.

Lze je podávat v tabletách nebOi tobolkáchlidem a kde to dovoluje rozpustnost ve for-mě sirupů nebo Injekčních roztoků nebo vpřípadě nerozpustností ve formě suspenzí.Typicky farmaceuticky přípravek je popsánníže:

Tobolka: NPT 15410 50 až 500 mg

Avicel pH 101 (mikrokrystalická celulóza] ad 800 mgSuspenze:

Vodné suspenze lze připravit s řadou sus-penzních činidel přidaných k účinné látce.Takovými suspenzními činidly jsou napří-klad látky jako sodná sůl karboxymethylce-lulózy, sodná sůl kyseliny algintové, tragant,avicel RC-591 (mikrocelulóza), methylcelu-lóza, Veegum, xanthanOvá guma. Kromě sus-penzních činidel lze přidávat taková činid-la jako sladidla, aromatizační prostředky,

2 5 1 Ο β O 23 24 barviva, konzervační látky, ochranné kolo-idy a disperzní činidla.

Složení tabulet: NPT 15410 50 až 500 mg Avicel pH 101 130 mg škrob, modifikovaný 20 mg stearan horečnatý U.S.P. 5,5 mg polyvimylpyrrolidom 22 mg kyselina stearová U.S.P. 20 mg Příprava sirupu NPT 15410 25 až 125 mg (nebo na maximálníhladině rozpustnosti) kukuřičný cukr 3,25 g destilovaná Voda 0.05 g FD a C červeň 40 0,00175 g sodná sůl sacharinu 0,00250 g alkohol U.S.P. 0,08 g methylparabem U.S.P. 0,005 g propylparabem U.S.P. 0,001 g glycerin 0,31225 g třešňové aroma 0,00825 g ovocné aroma 0,00825 g destilovaná voda q. s. ad. 5 ml

Léčení myší in vivo NPT 15392 a NPT15410: Účinek na stimulaci proliferace bu-něk sleziny konkamavalinem A Účelem této studie bylo stanOvd účinkyléčby myší i:n vivo látkami NP'r 15392 a15410 na následnou aktivitu buněk slezinyizolovaných z těchto zvířat a hodnocenýchin vitro na jejich proliferativní odezvu namitoigein, bonkanavalin A (Oon A).

Postup Léčba in vivo

Devět samců myší Balb/C, stáří 8 až 9týdnů, hmotnosti 18 až 20 g, bylo rozdělenodo tří skupin. Jedna skupina byla léčenadvakrát denně (jeden den), ránioi a odpo-ledne orální dávkou NPT 15392 10 mg/kg.Druhá skupina byla léčena podobně NPT15410 dávkou 20 mg/kg. Třetí skupina dáv-kami chloridu sodného, který sloužil jakoplacebo.

Zkouška buněk sleziny In vitrOc preparacebuněk Následující den byla každá skupina u- smrcenu, vyňaty sleziny a shromážděny. Sle-ziny byly rozmělněny a buňky promyty vRPMI-1640 médiu (Grand Island Bioloigicals)s přídavkem 2 mm glutaminu a antibiotik.Koncentrace buněk v každém preparátu by-la stanovena na Oouterově počítači a nasta-vena na 5 X 108 buněk/ml s RPMI médiem.

Mikrotitrační zkouška na desce

Mikrotitrační zkoušky byly prováděny v0,2 ml inkubacím obsahujících 5 X 105 bu-něk a Oon A nebo Oon A a sloučeniny v u-vedemých koncentracích. Všechny zkouškybyly prováděny s 6 opakováním a srovnányse slepým pokusem obsahujícím pouze buň-ky. Zkušební desky byly iinkubovány přiteplotě 37 °C v 5% kysličníku uhličitém podobu 4 dní. Během posledních 18 až 20 hla-din inkubace byto přidáno 0,5 ml 3HTdR (10(uCi/ml, 6 Ci/mmol) ke každé kultuře. Kul-tury byly izolovány násobným automatic-kým izolačním zařízením (MASH) a inkor-porovaný 3HTdR byl stanoven Beckmano-vým LS 8000 kapalinovým scintilačním po-čítačem formou míry proliferace buněk. Vý-sledky jsou tabulnvány jako· poměr účin-nosti v kulturách s Con A nebo s Oon A alátkou proti slepým pokusům. Působení sloučeniny 15392 i 15410 in vi-vo zvyšuje následnou odpověď buněk slezi-ny, in vitro, na Coin A stimulaci v subopti-mální mitogenní koncentraci (5 (Ug/ml).Sloučenina 15410 zvyšovala takto poměr sti-mulace na 100 : 1 ve srovnání 55 : 1 a pla-cebem. U sloučeniny 15392 nebo 15410 ne-byly pozorovány význačnější rozdíly v pů-sobení, když se buňky stimulují optimálníkoncentrací Con A (10 ng/ml). Byly hod-noceny rovněž účinky in vitro následnéhopůsobení NPT 1539? a 15410 v dávce 1 μgna mililitr na buňky stimulované Con A. O-bě sloučeniny vykazují zřetelnou schopnostzvyšovat stimulaci Con A, zejména při sub-oiptimální koncentraci mitogenů (5 ,ug/ml),v menším rozsahu při 10 pg/ml. Při kon-centraci 5 ,ug/l Ocin A, stimulace NPT 15392je 2,8 X vyšší než Con A samotným, zatímcopro NPT 15410 je 3,3 X vyšší.

Tyto výsledky ukazují imunomodulační ú-činek těchto látek podle vynálezu a proli-feraci buněk sleziny. Premedikace zvířatbuď sloučeninami, které zcitlivují buňky knásledující mitogenní stigulaci, zatímco ex-pozice buněk in vitro vůči sloučeninám pomitogenní stimulaci zvýší proliferační od-pověď zejména za podmínek, kdy tato od-pověď ina samotný mitogen je nízká.

Claims

253060 25 PREDMET vynálezu

1. Způsob výroby solí derivátů 9-(hydro-xyalkyljpurinů obecného vzorce I

HC-CH

R OH 0) ve kterém z znamená číslo 1 až 10, X znamená skupinu OH, NHa nebo SH, R1 znamená vodík nebo Ci až Ce-alkyl, R2 znamená vodík nebo methyl, Y znamená sůl kyseliny p-acetamidoben- zoové s aminem obecného vzorce III R3 N(CnH2n)OH R4 (ΠΙ) kde R3 a R4 značí Ci až Ci-alkyl, an značí číslo· 2 až 4, vyznačující se tím, že sloučenina obecnéhovzorce II

U IR OH (H) ve kterém X, R4 a R2 mtají výše uvedené významy,se uvádí do reakce s 1 až 10 moly soli ky-seliny p-acetamidoibenzoové odvozené odvýše uvedené sloučeniny obecného vzorce III.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozí slou- čeniny výše uvedeného· obecného vzorce IIza vzniku sloučeniny obecného· vzorce I,v němž R1 značí vodík nebo Ci až Ca m-al-kyl, z má stejný význam jako v bodě 1, Yznačí sůl kyseliny p-acetamidobenzcové saminem obecného vzorce III udaného· v bo-dě 1, kde n má stejný význam jako v bodě1, R3 a R4 zinačí Ci—Ci-alkylové skupiny, R2značí vodík nebo methyl a X značí skup!-nu OH, NH2 nebo SH.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozí slou-čeniny výše uvedeného obecného vzorce IIze vzniku sloučeniny obecného· vzorce I,ve kterém. R1 značí atom vodíku mého n-al-kylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku az má stejný význam jako v bodě 1, Y značísůl kyseliny p-acehamidobenzoové s aminemobecného· vzorce III, udaného v bodě 1, kden má stejný význam jako v bodě 1 a R3 aR4 značí Cl—-Ci-alkylové skupiny, R2 značívodík nebo methyl a X značí skupinu OH,NHi nebo· SH.
4. Způsob podle bodu 3, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozí slou-čeniny výše uvedeného obecného vzorce 11za vzniku sloučeniny obecného vzorce I,ve kterém R1 značí atom vodíku nebo· n-al-kytovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, a.z má stejný význam jako v bodě 1, Y zinačísůl kyseliny· p-acetamidobeinzobvé s aminem,obecného· vzorce III udaného· v bodě 1, kden má stejný význam jako· v bodě 1, a R2, R3R4 a X značí totéž jako· v bodě 3.
5. Způsob podle bodu 4 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozí slou-čeniny výše uvedeného obecného vzorce JIza vzn:ku sloučeniny obecného vzorce I,ve kterém R1 značí n-heixylovon skupinu, az má stejný význam jako v bodě 1, Y značísůl kyseliny p-acetamidobenzcové s aminemobecného· vzorce III udaného v bodě 1, kden má stejný význam jako· v bodě 1, a R2, R3,R4 a X značí totéž jako· v bodě 3.
6. Způsob podle bodu 1, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozí slou-čeniny výše uvedeného· obecného· vzorce IIza vzniku sloučeniny obecného· vzorce I,ve kterém R1 má význam jako· v bodě 1 a Xzinačí OH-, NHg- nebo SH-skupinu, a z mástejný význam jako· v bodě 1, Y značí sůlkyseliny p-acetamidobenzcové s aminem o·-becného vzorce III, udaného v bodě 1, kden má stejný význam jako v bodě 1, a R2, R3a R4 značí totéž jako v bodě 3.
7. Způsob podle bodu 6, vyznačující setím, že se potužívá odpovídající výchozí slou-čeniny výše uvedeného· obecného vzorce ÍIza vzniku sloučeniny obecného vzorce I,ve kterém R1 má význam jako v bcdě 1 a Xznačí OH-skupinu, a z má stejný významjako· v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-acet-amidobenzoové s aminem obecného· vzorce 251060 27 28 III udaného v bodě 1, kde n má stejný vý-znam jaklo v bodě 1, ,a R2, R3 a R4 značítotéž jako v bodě 3.
8. Způsob podle bodu 6, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchto-zí slou-čeniny výše uvedeného- obecného- vzorce IIza vzniku sloučeniny obecného vzorce I,ve kterém R1 má význam jako v bodě 1 a Xznačí NHz-skupinu a z má stejný významjako v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-acet-amidobenzoové s aminem obecného vzorceIII udaného v bodě 1, kde n má stejný vý-znam jako v bodě 1, a R2, R3 a R4 značí to-též jako v bodě 3.
9. Způsob podle bodu 6, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozí slou-čeniny výše uvedeného obecného vzorce IIza vzniku sloučeniny obecného vzorce I,ve kterém R1 má význam jako v bodě 1 a Xznačí SH-skupinu a z má stejný význam ja-ko v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-aceta-mido-benzoové s aminem obecného vzorceIII udaného v bodě 1, kde n má stejný vý-znam jako· v bodě 1, a R2, R3 a R4 značí to-též jako- v bodě 3.
10. Způsob podle bodu 6 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozí slou-čeniny výše uvedeného obecného vzorce IIza vzniku sloučeniny obecného vzorce I,ve kterém R1 má význam jako v bodě 1 a R2značí atom vodíku, a z má stejný významjako v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-aceta-midobenzoové s aminem Obecného vzorceIII udaného v bodě 1, kde n má stejný vý-znam jako v bodě 1, a R3, R4 a X značí to-též jako- v bodě 3.
11. Způsob podle hodu 10, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorce II za vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve které R1 má význam jako v bodě 1, Xznačí OH-skupinu a z má stejný význam ja-ko v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-aceta-midobenzioové s aminem obecného vzorce III udaného' v bodě 1, kde n má stejný vý-znam jako v bodě 1, a R2, R3 a R4 značí to-též jako v bodě 3.
12. Způsob podle bodu 10 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorce II za vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve které R1 má význam jako v bodě 1, Xznačí NHz-skupinu a z má stejný významjako v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-aceta-midobeinzoové s aminem obecného vzorce III udaného- v bodě 1, kde n má stejný vý-znam jako v bodě 1, a R2, R3 a R4 značí to-též jako v bodě 3.
13. Způsob podle bodu 10, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorceII za vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve kterém R1 má význam jako v bodě 1 aX značí SH-skupinu a z má stejný významjako- v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-aceta-midobenzoové s aminem obecného- vzorce III udaného v bodě 1, kde n má stejný vý-znam jako v bodě 1, a R2, R3 a R4 značí to-též jako- v bodě 3.
14. Způsío-b podle bodu 6 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorceII za vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve kterém R1 má význam jako- v -bodě 1 aR2 značí methylovou skupinu a z má stejnývýznam jako- v bodě 1, Y značí sůl kyselinyp-acetamidobenaoové s aminem obecnéhovzjorce III udaného v bodě 1, kde n málstejný význam jako v bodě 1, a R3, R4 a Xznačí totéž jako v bodě 3.
15. Způsob p-o-dle bodu 14, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorce II za vzniku sloučeniny obecného- vzorceI, ve kterém R1 má význam j-ako- v bodě 1,X značí OH-skupinu a z má stejný významjako v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-aceta-midijbenzoio-vé s aminem obecného vzorce III udaného- v -bodě 1, kde n má stejný vý-znam j-ako v bodě 1, a R2, R3 a R4 značí to-též jako v bodě 3.
16. Způsob pio-dle bodu 14 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorce II za vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve kterém R1 má význam jako v bc-dě 1,X značí NHž-skupinu a z má stejný významjako v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-acet-amidobe-nzoiové s aminem -obecného- vzorce III udaného- v hodě 1, kde n má stejný vý-znam jako v bodě 1, a R2, R3 a R4 značí to-též jako- v bodě 3.
17. Způs-ob p-o-dle bodu 14 vyznačující setím, že se používá odpovídající výcho-zísloučeniny výše uvedeného obecného vzorceII za vz .iku sloučeniny obecného vzorceI, ve kterém R1 má stejný význam j-ako- vbodě 1, X značí SH-skupinu a z má stejnývýznam jako v bodě 1, Y značí sůl kyselinyp-acetamidoibeínzo-ové s aminem -obecnéhoYzo-rce III udaného, v bodě 1, kde n mástejný význam j-ako- v bodě 1, a R2, R3 a R4značí totéž jako· v bodě 3.
18. Způsob podle bodu 2 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorceII z,a vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve kterém R1 má význam jako- v hodě 1 aX značí OH, NHz nebo SH a Y značí sůlkyseliny p-acetamidobenzcové s dimethyl-a-minoisopropylalkoholem, z má stejný vý-znam jako- v bodě 1 a R2 značí vodík nebomethyl.
19. Způso-b podle bodu 18 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorce II za vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve kterém R1 má význam jako v bodě 1, Xzn-aěí OH-skupinu a z má stejný význam ja-ko v bodě 1, Y zn-aěí sůl kyseliny p-aceta-mido-benzoové s aminem o-becného- vzorce III udaného v bodě 1, kde n má stejný vý- 251080 29 30 znám jako v bodě 1, a R2, R3, R4 mají stej-ný význam jako v bodě 3.
20. Způsob podle bodu 18 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzorce II za vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve kterém R1 má význam jako v bodě 1 aR2 značí atom vodíku a z má stejný významjako v bodě 1, Y značí sůl kyseliny p-acet-amidobenzoové s aminem obecného vzorce III udaného v bodě 1, kde n má stejný vý-znam jako v bodě 1, a R3, R4 a X značí to-též jato v bodě 3.
21. Způsob podle bodu 18 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného' obecného' vzorceII za vzniku sloučeniny obecného vzorceI, ve kterém R1 značí n-hexylovou skupinu,z má stejný význam jako v bodě 1, Y zna-čí sůl kyseliny p-acetamidobenzcové s a-minem obecného vzorce III udaného v bodě1, kde n má stejný význam jako v bodě 1, aR2, R3, R4 a X značí totéž jato' v bodě 3.
22. Způsob podle bodu 18, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzor-ce II za vzniku sloučeniny obecného vzor-ce I, ve které R1 značí methylovou skupinua z má stejný význam jato' v bodě 1, Y zna-čí sůl kyseliny p-acetamidobenzoové s ami-nem obecného vzorce III udaného v bodě1, kde n má stejný význam jako v bodě 1,a R2, R3 a X značí totéž jako v bodě 3.
23. Způsob podle bodu 18, vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného' obecného vzor-ce II za vzniku sloučeniny obecného vzor-ce I, ve kterém R1 má význam jako v bodě 1 a R2 značí methylovou skupinu, a z mástejný význam jako v bodě 1, Y značí sůlkyseliny p-acetamidobenzoové s aminem o-becného vzorce III udaného v bodě 1, kden má stejný význam jako v bodě 1, a R3- R4a X značí totéž jako v bodě 3.
24. Způsob podle bodu 23 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzor-ce II za vzniku sloučeniny obecného1 vzor-ce I, ve kterém R1 značí n-hexylovou skupi-nu, a z má stejný význam jako v bodě 1, Yanačí sůl kyseliny p-acetanrdobenzoovó saminem obecného vzorce ΠΙ udaného v bo-dě 1, kde n má stejný význam jako v bodě1, a R2, R3, R4 a X značí totéž jako v bodě 3.
25. Způsob podle bodu 23 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzor-ce II za vzniku sloučeniny obecného vzor-ce I, ve kterém R1 značí methylovou skupi-nu a z má stejný význam jato v bodě 1, Yznačí sůl kyseliny p-acetamidobenzoové saminem obecného vzorce III udaného v bo-dě 1, kde n má stejný význam jako· v bodě1, a Ř2, R3, R4 a X značí totéž jako v bodě 3.
26. Způsob podle bodu 2 vyznačující setím, že se používá odpovídající výchozísloučeniny výše uvedeného obecného vzor-ce II za vzniku sloučeniny obecného' vzor-ce I, ve kterém X značí skupiny OH-, NH?-nebo SH a R1 značí atom vodíku a z má stej-ný význam jako v bodě 1, Y značí sůl kyse-liny p-acetamidobenzoové s aminem obec-ného vzorce III udaného, v bodě 1, kde ;imá stejný význam jako v bodě 1, a R2, R3 aR4 značí totéž jako v bodě 3.