NL9000265A

NL9000265A - Ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-1-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat-hydrochloride-monohydraat, werkwijze voor de bereiding ervan en een farmaceutisch preparaat dat deze stof bevat, met antivirale, interferon inducerende en immunomodulatoire effecten.

Info

Publication number: NL9000265A
Application number: NL9000265A
Authority: NL
Original assignee: Vni Khim Farmatsevtichesky I I
Priority date: 1989-01-12
Filing date: 1990-02-02
Publication date: 1991-09-02
Also published as: WO1990008135A1; GB2234510A; US5198552A; BE1003341A4; CH678726A5; SE9000282L; FR2650504A1; SE9000282D0; DK15490A; SE465462B; DK15490D0; DE3891468T1; GB2234510B; FR2650504B1; DE3891468C2; GB9020370D0

Description

AANVRAAGSTERS NOEMEN ALS UITVINDERS: 1. Alexei Nikolaevich Grinev (overleden) erfgename is zijn echtgenote Galina Vasilievna Grineva 2. Fedor Alexandrovich Trofimov 3. Nina Gavrilovna Tsyshkova 4. Grigory Nikolaevich Pershin (overleden) erfgename is zijn dochter Ellina Grigorievna Pershina 5- Nadezhda Sergeevna Bogdanova 6. Irina Sergeevna Nikolaeva 7· Svetlana Alexeevna Zotova 8. Zinaida Mikhailovna Sakhaschik 9. Evgenia Alexandrovna Svirina 10. Alla Nikolaevna Fomina 11. Elena Nikolaevna Padeiskaya 12. Dmitry Mikhailovich Zlydnikov 13. Olga Iosifovna Kubar 14. Evgenia Georgievna Shvetsova 15. Elena Alexeevna Bryantseva 16. Valentina Vasilievna Peters 17. Svetlana Nikolaevna Kutchak 18. Anatoly Georgievich Konoplyannikov 19. Boris Pavlovich Surinov 20. Vera Alexandrovna Yadrovskaya 21. Elena Petrovna Savina 22. Nina Alexeevna Karpova 23. Ljudmila Sergeevna Safonova 2k. Ljudmila Alexeevna Savinova

Ethyl-6-broom-5“hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiome-thylindool-3-carboxylaat-hydrochloride-monohydraat, werkwijze voor de bereiding ervan en een farmaceutisch preparaat dat deze stof bevat, met antivirale, interferon inducerende en immunomodulatoire effecten.

De onderhavige uitvinding die op het gebied van de organische chemie ligt, heeft meer in het bijzonder betrekking op een nieuwe verbinding -ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenyl-thiomethylindool-3-carboxylaat-hydrochloride-monohydraat, op een werkwijze voor de bereiding ervan en op een farmaceutisch preparaat dat deze verbinding bevat, met antivirale, interferon inducerende en immunomodu- latoire effecten.

Heden ten dage wordt veel aandacht gegeven aan onderzoek naar en studie van antivirale, interferon inducerende en immunomodulatore middelen. Bijzondere aandacht is gericht op middelen welke in staat zijn immune reacties van een lichaam te moduleren, te versterken of te remmen, die immunomodulatoren worden genoemd.

Immunomodulatoren verhogen een algemene weerstand van het lichaam door specifieke immune reacties en niet-specifieke defensieve factoren, met inbegrip van een endogene interferon-produktie, te beïnvloeden. Ze worden toegepast voor de behandeling van ziekten in pathogene mechanismen, waarvan ziekten van een immune status van het lichaam een belangrijke rol spelen - primaire en secundaire immunodeficiëntie - omstandigheden omvatten soorten kanker alsmede chronische en recidieve virusinfecties.

Onder een klein aantal synthetische chemicaliën die toegepast worden als immunomodulatoren, is de meest efficiënte en meest toegepaste in de klinische praktijk de verbinding levamisol [(-)_2,3,5»6“tetra-hydro-6-fenylimidazo-[2.1,b]-thiazoolhydrochloride].[A.D. Mashkovskij,

Lekarstvennyya sredstva, 1987. (Moskou), "Meditsina", v. 2, bladzijden I69-I713.

Levamisol als een immunomodulator wordt toegepast in een complexe therapie van verschillende ziekten die gepaard gaan met immunodeficiën-tieomstandigheden. De toepassing van levamisol voor de behandeling van sterke retrovormen van herpesvirusinfectie wordt in de literatuur beschreven. Levamisol, alsmede enkele andere immunomodulatoren, stimuleert de produktie van seruminterferon in het lichaam. De interferon-titers, geproduceerd door de inwerking van levamisol, zijn niet groter dan 80-l60 U/ml in een celcultuur; 160-320 U/ml in het bloedserum van de muis en 40-80 U/ml in het bloedserum van de mens.

Levamisol is echter sterk toxisch en kan verschillende neveneffecten veroorzaken: hoofdpijn, slaapstoornissen, olfactorische hallucinaties (veranderingen van de reuk), overgevoeligheid van de huid, influen-za-achtige en neurologische symptomen.

De meest schadelijke bijwerking die plaats kan vinden bij de behandeling met levamisol als een immunomodulator, is agranulocytose - de afname van neutrofiel tot een waarde beneden 25#. Derhalve moet het bloed systematisch worden onderzocht tijdens de behandeling met levamisol.

Tegenwoordig zijn ook antivirale geneesmiddelpreparaten bekend, welke adamantaanderivaten als een werkzaam bestanddeel bevatten, bij voorbeeld remantadine (α-raethyl-l-adamantaanmethylamine-hydrochloride) [Mekhanizmy antivirusnogo dejstviya proizvodnykh adamantana, 1982, (Riga) "Zinatne", bladzijden 25-29, 129-141]. Deze preparaten hebben een bijwerking op het centrale zenuwstelsel.

De verbindingen volgens de onderhavige uitvinding, de werkwijze voor de bereiding ervan en een farmaceutisch preparaat, die deze bevat, zijn nieuw.

De uitvinding is gebaseerd op het probleem van het verschaffen van een nieuwe verbinding met hoge antivirale, interferon inducerende en immunomodulatore werkingen, een lage toxiciteit, geen bijwerkingen en op een werkwijze voor de bereiding daarvan.

Dit probleem wordt opgelost door het verschaffen van een nieuwe verbinding ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat-hydrochloride-monohydraat volgens de uitvinding met de formule 1.

De verbinding volgens de uitvinding is een kristallijn poeder, heeft een kleur van wit met tinten van groengeel tot lichtgeel met groene schakeringen; de verbinding heeft een bittere smaak en is geurloos. Het smeltpunt van de verbinding is niet karakteristiek. Wanneer deze drie uur bij een temperatuur van 110-120°C wordt verhit, verliest de verbinding het molecuul H2O.

De verbinding van de uitvinding is slecht oplosbaar in water, methanol, ethanol en is niet hygroscopisch. De oplossing die 1 g van de verbinding in 1450 ml water bij 25eC bevat, heeft een pH van 4,37 (po-tentiometrisch bepaald).

Het UV-spectrum van een 0,001# oplossing van de verbinding volgens de uitvinding in 95# ethanol in het gebied van 230 nm tot 350 nm heeft twee absorptiepieken bij 257 ± 2 nm (lgE 4,3) en bij 315 ± 3 nm (lgE 3,2). Het IR-spectrum heeft absorptiebanden bij 3320 cm (0H-groep) en 1673 cm (C=0-groep).

In het massaspectrum worden pieken met lage intensiteit bij m/z van 476/478, welke tot een moleculair ion behoren, waargenomen. De verhouding van de piekintensiteiten J^g : J^g komt overeen met de aanwezigheid van een broomatoom in het molecuul. Het spectrum wordt gekenmerkt door intensieve pieken van ionen [M-F SH]+ (m/z 322/324), FSH+(m/z 110), m/z 44 (CO2)· Het massaspectrum is niet stabiel, aangezien verhitting van het monster resulteert in de thermische ontleding ervan.

Volgens de uitvinding wordt een werkwijze voor de bereiding van de verbinding volgens de uitvinding ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylami-nomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat-hydrochloride- monohydraat gekenmerkt, doordat deze bestaat uit de behandeling van ethyl-5-acetoxy-l,2-dimethylindool-3-carboxylaat met een bromeringsmid-del in een inert organisch oplosmiddel onder terugvloeikoeling, omzetting van het verkregen ethyl-5-acetoxy-6-broom-2-broommethyl-l-methylin-dool-3-carboxylaat met thiofenol bij aanwezigheid van een alkalimetaal-hydroxide of -alcoholaat, omzetting van het ethyl-6-broom-5-hydroxy-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat met een aminomethylerings-middel in een organisch oplosmiddel bij een temperatuur van 65 °C tot de terugvloeikoelingstemparatuur van het reactiemengsel en vervolgens het isoleren van het eindprodukt van de verkregen base ethyl-6-broom-5-hy-droxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxy-laat.

Een bromeringsmiddel is bij voorkeur broom of N-broomsuccinimide en een inert organisch oplosmiddel is chloroform, dichloorethaan of tetrachloormethaan. In de omzetting van ethyl-5-acetoxy-6-broom-2-broom-methyl-l-methylindool-3-carboxylaat met thiofenol is het organische oplosmiddel bij voorkeur methanol, ethanol of isopropylalcohol.

Een aminomethyleringsmiddel is bij voorkeur een mengsel van dime-thylamine met formaline of bis-dimethylaminomethaan.

Indien een mengsel van dimethylamine en formaline wordt toegepast, is een organisch oplosmiddel azijnzuur en wordt de aminomethylering uitgevoerd bij een temperatuur in het traject van 65 tot 75°C.

Wanneer bis-dimethylaminomethaan wordt toegepast als aminomethyleringsmiddel, is het organische oplosmiddel bij voorkeur dioxaan en wordt de aminomethylering bij voorkeur uitgevoerd bij de terugvloeitemperatuur van het reactiemengsel.

Het isoleren van het eindprodukt wordt bij voorkeur uitgevoerd door behandeling van ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat met zoutzuur in aceton onder terugvloeikoeling.

De opbrengst van het eindprodukt, betrokken op het uitgangsmateriaal 5~acetoxy-l,2-dimethylindool-3~carboxylaat, is 44 tot 61% gew.%.

De verbinding volgens de uitvinding heeft een antiviraal, interferon inducerend en immunomodulatoir effect en volgens de uitvinding is het een werkzaam bestanddeel van een farmaceutisch preparaat met een antiviraal, interferon inducerend en immunomodulatoir effect. Het preparaat van de uitvinding kan in verschillende vormen, bij voorkeur als tabletten worden toegepast.

Volgens de uitvinding bevat het preparaat van de uitvinding in de vorm van tabletten een werkzaam bestanddeel in een hoeveelheid van 0,1 tot 0,2 g per tablet. Als farmaceutische drager bevat het preparaat volgens de uitvinding bij voorkeur als excipiens zetmeel of poedersuiker.

Het preparaat van de uitvinding werd onderzocht bij dierproeven en klinisch bij menselijke wezens. Het antivirale effect van het preparaat tegen influenza A/B virus werd getest op een fibroblast-celcultuur van een kippe-embryo.

Het preparaat van de uitvinding werd toegevoegd aan een celcultuur in een hoeveelheid van 5 g/ml in verschillende perioden voor en na het infecteren van de cultuur met influenzavirus voor het onderzoek van het effect van het preparaat op de accumulatie van een infectueus virus in een celweefselcultuur tijdens een eentrapsinfectie.

In een andere reeks proeven werd het effect van het preparaat van de uitvinding op influenzavirusreproduktie afhankelijk van de tijd van toevoeging van het preparaat voor en na infectie van een celcultuur, met andere woorden op de dynamica van influenzavirusreproduktie, getest.

De resultaten van de proeven tonen aan dat het virusremmende effect bij het verminderen van de infectiviteit-titer en het onderdrukken van de plaquevormende werking tijdens een eentrapsinfectie van cellen van het preparaat van de uitvinding werd uitgedrukt hoofdzakelijk tijdens perioden die overeenkomen met vroegere trappen van influenzavirus: reproduktie in cellenabsorptie, penetratie en waarschijnlijk deproteïni-satie.

Het antivirale effect van het preparaat volgens de uitvinding werd onderzocht in vergelijking met een bekend remantadinegeneesmiddel.

Het preparaat van de uitvinding is superieur ten opzichte van remantadine met betrekking tot een breed antiviraal spectrum, vertoont een uitgesproken chemotherapeutisch effect tegen influenza A/B virus in een celcultuur en op een experimenteel influenzaal pneumonia, geïnduceerd door A/B virus. Remantadine is alleen werkzaam tegen influenza A virus, maar het is niet werkzaam tegen influenza B virus. Bij de proefneming ontwikkelt bovendien het weerstandsvermogen van influenzavirus tegen het preparaat zich veel langzamer in vergelijking met remantadine.

Een vergelijkbare eigenschap van de antivirale werkingen van het preparaat volgens de uitvinding en remantadine is weergegeven in tabel A.

Tabel A

Het preparaat van de uitvinding Remantadine 1 2

Remt de reproduktie van influenza Remt de reproduktie van influenza A/B virus in een celcultuur en A/B virus in een celcultuur en kippe-embryo’s. kippe-embryo's. De stof is niet werkzaam tegen virus B.

Oefent een medicinaal effect uit Oefent een medicinaal effect uit op een influenzaal pneumonia bij de op een influenzaal pneumonia bij muis geïnduceerd door influenza A/B de muis geïnduceerd door influ- virus. enza A/B virus.

Bij het passiveren van het influenza Bij het passiveren van het in- A virus in een celcultuur bij aan- fluenza A virus in een celcultuur wezigheid van het preparaat geduren- bij aanwezigheid van remantadine de zes doorgangen is er geen be- treedt de weerstand tegen het standheid van het virus tegen het preparaat op beginnend van 2-3 preparaat. doorgangen.

Geen virucidale werking op influen- Geen virucidale werking op in-zavirus. fluenzavirus.

De maximaal tolereerbare concen- De maximaal tolereerbare concentratie voor een celcultuur - fibro- tratie voor een celcultuur - blasten van kippe-embryo - 20 g/ml. fibroblasten van kippe-embryo - 20 g/ml.

LD_0 voor muizen 340 mg/kg bij LD_n voor muizen 340 mg/kg bij orale toediening. orslie toediening.

Het experimentele onderzoek van de onschadelijkheid van het preparaat volgens de uitvinding toonde aan, dat het preparaat bij een enkelvoudige orale toediening weinig toxisch was (LD^q voor muizen is 340 mg/kg, voor ratten 3*000 mg/kg, voor Guinese biggetjes 4.000 mg/kg).

Een langdurige toediening per os van het preparaat van de uitvinding in een dosering van 100 tot 125 mg/kg aan ratten gedurende zes maanden en Guinese biggetjes gedurende drie maanden, in een dosis van 50 mg/kg tijdens twee maanden aan konijnen en in een dosis van 25 mg/kg gedurende zes maanden aan honden veroorzaakte geen pathologische wijzigingen in de dieren, hetgeen wordt ondersteund door klinische, hematolo-gische, biochemische en pathomorfologische onderzoekingen. Een verlengde toediening van het preparaat kan bij dieren de ontwikkeling van niet-specifieke degeneratieve veranderingen in parenchymateuze organen bewerkstelligen. Het preparaat van de uitvinding heeft geen gelocaliseerde irriterende werking bij orale toediening, hetgeen is aangetoond door hystoligische proeven.

Het allergisch makende effect van het preparaat van de uitvinding werd beproefd bij Guinese biggetjes en konijnen. Bij het uitvoeren van subcutane injecties en herhaalde toepassingen op de huid oefende het preparaat geen allergisch makende werking uit.

Het preparaat van de uitvinding heeft geen teratogene werking. In een niet-toxische dosis van 250 mg/kg voor drachtige vrouwelijke dieren (20-30 maal zo hoog als een maximale dagelijkse dosis voor mensen) veroorzaakte het preparaat geen abnormaliteiten in de embryogenese alsmede in een postnatale ontwikkeling van albinoratten. Een complexe analyse van een embryo-toestand en de afstammeling van de eerste generatie onder toepassing van microanatomische, histologische, fysiologische en ge-dragsproeven werd uitgevoerd.

Het preparaat van de uitvinding heeft geen mutagene werking. Het onderzoek werd uitgevoerd met het proefobject Salmonella tyfimurium onder toepassing van het preparaat van de uitvinding in een hoeveelheid van 50 tot 1000 pg per schijf.

Het preparaat van de uitvinding doorstond een klinisch onderzoek als een antiviraal geneesmiddel voor influenza A/B virusinfectie bij I65O patiënten.

Het preparaat van de uitvinding werd oraal toegediend in een dosis van 0,2 g vier maal per dag gedurende drie dagen. Het klinische onderzoek van het preparaat werd uitgevoerd in vergelijking met controlegroepen van patiënten, aan wie een bij die symptomen behorende behandeling werd gegeven. De therapeutische werkzaamheid van het preparaat volgens de uitvinding tegen een influenza A/B virusinfectie was manifest door het verkorten van de koortsperiode, intoxicatie en cattarale omstandigheden, alsmede door verkorting van de duur van de ziekte. Een medicinale effectiviteit van het preparaat van de uitvinding werd bewezen door gegevens van serologische proeven - een toenemende mate van antilichamen tegen influenza A/B virus nam op significante wijze af in vergelijking met controlegroepen van patiënten, aan wie een symptomatische behandeling werd gegeven. Het preparaat van de uitvinding voorkwam de ontwikkeling van postinfluenzale complicaties en verminderde aanzienlijk de frequentie van uitingen van chronische ziekte bij menselijke wezens die een influenzavirusinfectie hadden.

De klinische proeven hebben de veiligheid van het preparaat in een toepassing van doseringen van 1800 tot 3200 mg per kuur aangetoond; bijwerkingen vonden noch plaats bij influenzapatienten noch bij gezonde vrijwillige individuen.

Het onderzoek van het interferon inducerende effect van het preparaat van de uitvinding werd uitgevoerd in proeven in vitro (bij een aanvankelijk met tripsine behandelde celcultuur van fibroblasten van kippe-embryo), bij proeven in vitro bij 340 niet door inteelt voortgebrachte albinomuizen met een gewicht van 18 tot 20 g en bij 25 vrijwilligers (gezonde, jonge individuen van beide sexen in de leeftijd van 18 tot 30 jaar).

Teneinde interferon te induceren werden verschillende doses van het preparaat van de uitvinding tezamen met 2% diëthylaminoethyldextran in een verhouding van 1 : 4 toegevoegd aan een fibroblastcelcultuur van kippe-embryo in een hoeveelheid van 0,2 ml per buisje dat monolaag van celcultuur bevatte. De incubatie van behandelde cellen werd uitgevoerd bij 37°C gedurende 1 uur. De cellen werden vervolgens uit het preparaat gespoeld met het medium No. 199. en 1 ml van het medium No. 199 werd erin gegoten zonder toevoeging van het runderbloedserum. Na 8, 24 en 48 uur na de incubatie bij 37 °C werd een cultuurvloeistof verzameld en getitreerd op de aanwezigheid van interferon in een fibroblastcelcultuur van kippe-embryo, die was geïnfecteerd met Venezolaanse encefalitisvirus volgens een gebruikelijke techniek.

De resultaten van de titratie zijn in tabel B weergegeven. Bij het onderzoek van de interferon inducerende werking van arbidol was een referentiestandaard een zeer actief interferon inducerend middel - een dubbelstrengs W^faag RNA (een dubbelstrengs ribonucleïnezuur van RF2-faag).

Tabel B

Interferon inducerend effect van het preparaat volgens de uitvinding in een fibroblastcelcultuur van kippe-embryo

Preparaat Concentratie Interferon-titer (lg/ml) na 8 uur 24 uur 48 uur

Het preparaat van de uitvinding 10,0 80,0 160,0 40,0

Het preparaat van de uitvinding 20,0 640-1280 1280-2560 64-320

Een dubbelstrengs niet RF2faag RNA 100,0 0 160,0 onderzocht

Een dubbelstrengs RF2faag RNA 400,0 640-1280 1280-2560 640-320

De in tabel B gegeven resultaten maken de conclusie mogelijk, dat het preparaat van de uitvinding een zeer actief interferon inducerend middel in een fibroblastcelcultuur van kippe-embryo is. In de concentratie van 20 g/ml induceert het preparaat interferon reeds in 8 uur (de titer ervan is 640-1280 U/ml; de maximale titer van 2560 U/ml werd 24 uur later gevonden; na 48 uur nam de interferontiter af tot 320 U/ml).

Een van de dosis afhankelijk effect van interferoninductie in een fibroblastcelcultuur van kippe-embryo onder de inwerking van het preparaat werd bewezen. Een tweevoudige reductie van de concentratie van het preparaat (tot 10 pg/ml) leidt tot een achtvoudige reductie van interferoninductie, de dynamica blijft echter dezelfde.

Een vergelijkende studie van interferoninductie door de inwerking van het preparaat van de uitvinding en een dubbelstrengs Idl^faag RNA als een zeer actief interferon inducerend middel als standaard openbaarde een overeenkomstige induetiedynamica, terwijl een dubbelstrengs RF2-faag RNA 20 maal zo veel nodig was als het preparaat (400 g/ml), de concentratie van 100 g/ml bewerkstelligde een zwakke (lichte) interferoninductie .

In de volgende reeks proeven werd het vermogen van het preparaat volgens de uitvinding om interferon in testbloedserum van dieren te induceren onderzocht.

Het preparaat van de uitvinding werd per os toegediend, één maal aan muizen (3 muisgroepen, elk van 100 dieren) in de doseringen van 250, 125 en 62,5 mg/kg, en 16, 24, 48 en 72 uur later werd bloedserum verkregen, dat werd gebruikt voor interferon-titraties in een getransfereerde muis L-cellijn tegen proefvirus van vesiculaire stomatitis. Bovendien werd het preparaat van de uitvinding één maal intraperitoneaal geïnjecteerd in de groep van 20 muizen in de dosis van 10 mg/kg, en 24 uur later werd bloedserum verkregen, waarin interferon-titers eveneens werden bepaald.

De experimentele resultaten zijn weergegeven in tabel C.

Tabel C

Dynamica van interferoninductie onder de inwerking van het preparaat van de uitvinding

De resultaten weergegeven in tabel C tonen aan, dat het preparaat van de uitvinding, toegediend per os, interferoninductie in het bloed van de bloedserum van de muis bewerkstelligt. Het effect wordt gekenmerkt door afhankelijkheid van de dosis en is het meest sterk uitgesproken in een dosistraject van 250 tot 62,5 mg/1 kg van het lichaamsgewicht van een dier. Hoge interferon-titers (640 U/ml) werden gevonden in het bloedserum van de muis na 16 uur en bleven op die waarde gedurende 48 uur. Het preparaat van de uitvinding verbetert de interferon-inductie, ook in het geval van intraperitoneale injectie.

Bij herhaalde toediening van het preparaat van de uitvinding aan muizen voor interferoninductie heeft een onderdrukte weerstandstoestand plaats in de dieren, welke tot uiting komt in de verlaging van de interferon- titers in het bloedserum.

Het preparaat van de uitvinding als een interferon inducerend middel heeft een preventief effect op geïnduceerde virusinfecties. Het preventieve effect ervan werd onderzocht bij een influenza-pneumonia bij de muis, geïnduceerd door intranasale infectie van de dieren met influenza A virus (Bethesda) 63 (¾¾), A (Aichi) (H3N2) en bij een gegeneraliseerde muisherpes, geïnduceerd door intranasale infectie daarvan met Herpes Simplexvirus van antigeentype I L^stam.

De resultaten zijn weergegeven in tabel D.

Tabel D

Preventieve werking van het preparaat volgens de uitvinding bij experimentele virusinfecties

Dosis, Tijd Letaliteit Afname P

en --------------- van mg/kg toediening absoluut letaliteit, aantal dieren(*) % 125 per os, 8/40 20 50 <0,01 62,5 2*1 en 8/40 20 50 <0,01 31,2 6 uur vóór 12/40 30 40 <0,01 infectie

Controle (zonder het 28/40 70 preparaat) 30 per os, 12/20 60 *10 0,01 15 24 uur vóór 15/20 75 25 0,01 injectie

Controle (zonder het preparaat) 20/20 100 (*) in de teller het aantal dode dieren, in de noemer het aantal muizen in de groep

Het preparaat van de uitvinding bij de toediening per os als profylactisch middel 24 en 6 uur voorafgaande aan infectie in doseringen van 31*2 mg/kg tot 125 mg/kg verlaagt de letaliteit van muizen die lijden aan influenza-pneumonia met 40-50# in vergelijking met de controle. Een enkelvoudige toediening van het preparaat per os in de dosis van 30 mg/kg 24 uur voorafgaande aan de infectie voorkomt de sterfte van 40# van dieren die lijden aan een gegeneraliseerde Herpesinfectie.

Het interferon inducerend effect van het preparaat van de uitvinding werd ook bij menselijke wezens onderzocht. Het bloedserum van menselijke wezens aan wie per os tabletten van het preparaat (0,1 g) in verschillende doseringsschema's werden toegediend, werd onderzocht op seruminterferon. Serum-titratie werd uitgevoerd met gebruikelijke methoden onder toepassing van een menselijke diploïde M-22 celcultuur en testmuisvirus encefalomyocarditis. De resultaten zijn weergegeven in tabel E.

Tabel E

Studie van interferon inducerend effect van het preparaat van de uitvinding bij menselijke wezens n/n groep Aantal Interferongehalte in het menselijke bloedserum mensen --------------------——------------------------------ in een Na enkelvoudige Na toediening van Na toediening groep toediening van het preparaat van van het prepa-het preparaat de uitvinding 3 raat van de van de uitvin- keer per dag uitvinding 6 ding per dag (300 mg) keer per dag (100 mg) (600 mg) gedu rende 2 dagen

Aantal Inter- Aantal Inter- Aantal Inter- posi- feron- posi- feron- posi- feron- tieve titer, tieve titer, tieve titer, reacties U/ml reacties U/ml reacties U/ml

Groep 1 13 8 4θ-8θ -

Groep 2 12 - - 12 160-320 12 40-80

Gevonden werd dat een enkelvoudige toediening per os van het preparaat van de uitvinding in de hoeveelheid van 10 mg de interferoninduc-tie in titer bewerkstelligt, die varieert van 40 tot 80 U/ml in acht van de dertien vrijwilligers (61,5%) > Een drie maal uitgevoerde toediening van het preparaat (300 mg) in de vorm van 1 tablet per dag resulteerde in een snelle afname van de interferoninductie (interferon werd gevonden in het bloedserum bij alle twaalf vrijwilligers (100)(), in titer was dit I6O-32O U/ml). Met een verdere toename van de dosis tot 600 mg (3 tabletten per dag) gedurende twee dagen was een scherpe vermindering van interferon-titer in het bloedserum niet hoger dan 40-80 U/ml.

De verkregen resultaten tonen een uitgesproken interferon inducerend effect van het preparaat van de uitvinding bij menselijke wezens bij toediening ervan per os. Maximaal gehalte aan interferon in het menselijke bloedserum werd gevonden na toediening van 300 mg van het preparaat van de uitvinding (in 100 mg drie maal per dag). Een toename van de dosis en duur van de toediening van het preparaat resulteerde in de ontwikkeling van hyporeactiviteit bij menselijke wezens, hetgeen werd gekenmerkt door een scherpe verlaging van de seruminterferon-titers.

Het immunomodulatoire (immunoversterkende) effect van het preparaat van de uitvinding werd eveneens onderzocht.

Het effect van het preparaat van de uitvinding op de immune sys-teemfuncties werd onderzocht.

Fagocytenfunctie onder de inwerking van het preparaat van de uit

vinding werd onderzocht bij volwassen vrouwelijke hybride muizen (CBA/C

57 bl6)f.

Het preparaat van de uitvinding werd per os toegediend in de dosering van 125 mg/kg ineens en een maal per dag gedurende vijf dagen. Een referentiestandaard was levamisol, toegediend met het zelfde schema in de dosering van 50 g per muis. Tijdens verschillende perioden na de toediening van het preparaat werden peritoneale macrofagen van de muis geïsoleerd, waarin een absorberende capaciteit werd gemeten door absorptie van neutraal rood en kwantitatief bepaald uit een ijkkromme onder toepassing van spectrofotometrische technieken (bij 350 nm).

De resultaten zijn weergegeven in tabel F.

Tabel F

Absorptieve capaciteit (pg/6x 10® cellen) van peritoneale macrofagen tijdens verschillende perioden na een enkelvoudige toediening van het preparaat van de uitvinding en levamisol

Tijd na toediening Controle levamisol Preparaat van de (zetmeel) uitvinding

Dag 1 20,8 ± 3.8 24,2 ± 4,5 27,7 ± 3,5 p<0,01 (166 ± 21%) (125 ± 172)

Dag 2 22,8 ± 2,0 27,7 ± 3,2 33,6 ± 4,7 P<0,01 (121 ± 142) (147 ± 20,62)

Dag 3 24,1 ± 4,2 32,5 * 2,4 37,4 ± 3,7 P<0,05 (135 ± 9,92) (155 * 152)

Noot: tussen haakjes percentage van controle.

De toediening van het preparaat volgens de uitvinding en levamisol had geen effect op tellingen van macrofagen die uit de peritoneale holte waren gewassen, maar deze verhoogde de absorptie(activiteit)capaciteit ervan. Derhalve was na 2 - 3 dagen na een enkelvoudige toediening van het preparaat de absorptiecapaciteit van macrofagen op het zelfde niveau gebleven - 164 ± 132 (p<0,05) respectievelijk 138 ± 112 (p<0,05).

Derhalve stimuleert de toediening van het preparaat van de uitvinding in vivo de absorptiecapaciteit van macrofagen in een grotere mate dan toediening van levamisol.

Het effect van het preparaat van de uitvinding op de genese van antilichaam werd onderzocht in vergelijking met levamisol en een dubbel-strengs Itf^faag RNA. Daarbij werden hybride muizen toegepast (CBA/C 57 BLg)F, alsmede tumor bevattende dieren (borstkanker, subcutaan geënt in een poot), intact en totaal bestraald (2 Gr).

Het antilichaam producerende mechanisme werd onderzocht bij toepassing op erythrocyten bij een schaap door subperitoneale immunisatie van de dieren in een hoeveelheid van 1 x 10® cellen. Vijf dagen na de immunisatie werden de dieren opgeofferd door decapitatie en het gehalte van antilichaam producerende cellen in de milt werd bepaald volgens Canningame.

De resultaten van de proeven zijn weergegeven in tabel G.

Het preparaat van de uitvinding verhoogde het gehalte aan antilichaam producerende cellen bij verschillende dosisschema's tot 167“ 246# en levamisol en een dubbelstrengs IH^faag RNA in het traject van 143 tot 170#.

Alleen het preparaat van de uitvinding had een uitgesproken immu-nostimulerend effect op bestraalde dieren en tot een maximale graad, indien toegediend drie dagen voorafgaande aan de bestraling: een maal bestraald was de immune respons 230# tegen de controle. Levamisol had een lage werking bij deze dieren; een dubbelstrengs RF2faag RNA was niet doelmatig.

Het preparaat van de uitvinding heeft bovendien een immunoverster-kend effect op tumor dragende dieren (7 - 71 dagen van tumorontwikke-ling) na een enkelvoudige (drie dagen voorafgaande aan immunisering) of een vijf maal dagelijkse toediening. Levamisol en een dubbelstrengs RF2faag RNA waren bij deze proeven niet doelmatig.

Het preparaat van de uitvinding was alleen actief in totaal bestraalde tumor dragende dieren en had een uitgesproken immunoversterkend effect, zelfs in gevallen waarin het niveau werd verlaagd tot ongeveer 30 maal zo klein als in vergelijking met intacte dieren. Levamisol had ook een immunoversterkend effect op deze dieren; een dubbelstrengs RF2-faag RNA was niet doelmatig.

Derhalve is het preparaat van de uitvinding in staat de genese van antilichaam te stimuleren (te verhogen) bij alle onderzochte stammen van muizen, zowel intact als bestraald, en door de doelmatigheid is het preparaat superieur ten opzichte van referentiestandaards - Levamisol en een dubbelstrengs RF2faag RNA.

Tabel G

Vergelijkend onderzoek van effecten van het preparaat van de uitvinding, levamisol en een dubbelstrengs K^faag RNA op antilichaam producerend mechanisme (% van controle) bij intacte muizen, totaal bestraald (2 Gr),tumordragers en totaal bestraalde tumordragers (2 Gr).

Diergroepen Levamisol Levamisol Een dubbelstrengs (muizen) gedurende 5 x met een RF2faag RNA met inter- 3 dagen, interval val van 3 dagen dagelijks van 5 dagen

Intact 164 ± 6,1 170 ± 15,1* 143 ± 7,5*

Totaal bestraald (2 Gr) 174 ± 24,0 104 ± 6,0 88 ± 6,6

Tumordragers 14 ± 23,0 91 ± 14,0 74 ± 31,0

Bestraalde tumordragers 86,0 ± 35,0 402 ±12,5 92 ± 21,0

Tabel G (vervolg)

Preparaat van de Preparaat van de Preparaat van de Preparaat van de uitvinding; uitvinding; uitvinding; uitvinding; enkelvoudige gedurende 3 gedurende 5 5 maal in 3 dagen toepassing dagen, dagelijks dagen, dagelijks 246 ± 6,0* i4i ± 13 192 ± i4,o* 167 ± 12,3* 230 ± 12,0* 129 ± 19 181 ± 11,3 95 ± 20,0 211 ± 10,0 99 ± 19 154 ± 16,6 110 ± 11,0 175 ± 24,6 121 ± 25 128 ± 28,5 25Ο ± 21,5* *

Noot: Verschillen van controlewaarden zijn overtuigend (p<0,05)

Het effect van het preparaat van de uitvinding op met cel overgebrachte immuniteitresponsen werd onderzocht met toepassing van de ent-versus gas theertechniek.

Hybride mannelijke muizen (CBA/C 57 BLg)F^ in de leeftijd van drie maanden werden bestraald met een dosis van 5 Gr. Eén dag na de bestraling werd aan de dieren intraveneus een injectie gegeven met lymfocyten, bereid uit lymf klieren van een volwassen muis (CBA-stam) met een leeftijd van drie maanden, in de concentraties van 1,25, 2,5 en 5,0 x 10^ cariocyten. Nadat de lymfocyten intraveneus waren geïnjecteerd in de testgroepen, werd het preparaat van de uitvinding oraal toegediend in een dosis van 100 mg per 1 kg lichaamsgewicht, en levamisol in een dosis van 5 mg per kg in een 2% zetmeeloplossing. Elke groep bestond uit 15 muizen. Acht dagen na de bestraling werden de muizen gedood, de milten gefixeerd en werd een telling van kolonies met een diameter van ten minste 0,2 nm bepaald.

De verkregen gegevens zijn weergegeven in tabel H. Toediening van de allogene lymfocyten in hoge concentraties resulteert in een afname van de vorming van de miltkolonies in de controle en in de minimale toegepaste concentratie vond enige toename van de hoeveelheid van de miltkolonies plaats. De toediening van het preparaat van de uitvinding reduceert beide waargenomen afwijkingen in vergelijking met controle-waarden, indien de concentratie van de toegevoegde cellen niet de hoogste (5 x 106) is. Levamisol had een identiek maar minder uitgesproken effect. Verder vermindert, in het geval dat allogene lymfocyten niet worden toegepast, levamisol enigszins de hoeveelheid van de miltkolonies, terwijl het preparaat van de uitvinding niet een dergelijk effect bezit.

Tabel H

Effect van het preparaat van de uitvinding en van levamisol op de inactivering van de stamcellen met allogene lymfocyten.

Het preparaat Aantal gegeven Toediening van Tellingen van milt-lymfocyten 10° preparaat per os endokolonies (M ± m)

Controle 5.0 - 0,3 ± 0,1 2,5 - 0,9 ± 0,3 1.25 - 4,1 * 0,6 2,2 ± 0,5

Preparaat van de uitvinding 5.0 + 0,3 ± 0,1 -"- 2,5 + 1,6 ± 0,2 1.25 + 2,5 ± 0,4 -"- - + 2,2 ± 0,4

Levamisol 5.0 + 0,7 ± 0,2 -"- 2,5 + 1,1 ± 0,2 1.25 + 2,3 + 0,5 + 1,1 ± 0,3

Derhalve normaliseert de toediening van het preparaat van de uitvinding onder geïnduceerde ent- versus gastheerreactieomstandigheden de zich vermenigvuldigende activiteit van doelcellen en het vermogen ervan voor de produktie van een vitale kolonie, zowel in het geval van remming (met hoge lymfocytconcentraties) als in het geval van stimuleren (lage lymfocytconcentraties). Het preparaat van de uitvinding is door zijn doelmatigheid superieur ten opzichte van een bekend geneesmiddel levamisol.

De effecten van het preparaat van de uitvinding als een immunover-sterker op de ontwikkeling van een getransfereerde tumor en op thermische huidlaesies werd onderzocht.

Het effect van het preparaat van de uitvinding op de ontwikkeling van sarcoma-45 (Rous sarcoma) subcutaan geënt in de rechterpoot van volwassen vrouwelijke muizen van de Vistarstam werd onderzocht. Het preparaat van de uitvinding werd peritoneaal toegediend als een suspensie in een 1% zetmeeloplossing in de dosis van 125 mg/kg, elke dag gedurende vijf dagen, twee weken na het enten van de tumor. Aan controledie-ren werd alleen een zetmeeloplossing toegediend. De dynamische ontwikkeling van de tumor werd gecontroleerd door intravitale metingen van de massa ervan. Tijdens een periode van twee maanden van waarnemingen werd de remming van de ontwikkeling van tumor gevonden in de groep (tien dieren), waaraan het preparaat van de uitvinding was gegeven.

Het preparaat van de uitvinding heeft derhalve het remmende effect op de ontwikkeling van massieve tumor, geïnduceerd door enten, waarschijnlijk door middel van activering van immunologische reactiviteit.

De resultaten van proeven zijn weergegeven in tabel I.

Tabel I

Effect van het preparaat van de uitvinding (125 mg/kg) dagelijks gedurende vijf dagen op de ontwikkeling van Sarcoma-45 bij ratten

Tijd na enting Sarcomagroei, cm3 van de tumor -------------------------------------------

Zonder het preparaat Toediening van het van de uitvinding preparaat van de uitvinding 1 maand 11,9 ± 0,86 8,2 ±1,4 p<0,05 1 maand, 10 dagen 35 ± 3,4 21 ± 3,9 p<0,05 1 maand, 16 dagen 59,8 ± 5,0 37 ± 7,5 p<0,05 2 maanden 70,1 ± 2,6 39.9 ± 9.7 P<0,05

De studie van het effect van het preparaat volgens de uitvinding op thermische huidlaesies openbaarde het vermogen van het preparaat een thermoprotectieve werking uit te oefenen en een thermische huidlaesie te verminderen.

Het effect van het preparaat volgens de uitvinding op een immunologische menselijke status werd onderzocht.

Gezonde menselijke jonge vrijwilligers in de leeftijd van 18 tot 30 (25 individuen) werden waargenomen.

Een immunologische status werd geëvalueerd op basis van T-cellu-laire immuniteitanalyse: de toestand van lymfocyten in het bloed van de perifere vaten, een absolute en relatieve telling van T-cellen volgens Jondal, de toestand van receptorstabiliteit aan het uitwendige lymfocyt-membraan.

Onder toepassing van verschillende doseringen van het preparaat van de uitvinding werd bij gezonde, jonge, menselijke wezens zonder een voorafgaande antigene en onder vaccinale influenzaomstandigheden een immunologische status onderzocht, geproduceerd door het intranasaal immuniseren ervan met influenza A virusvaccin in verdunningen van 1 i 1 in een hoeveelheid van 1 ml.

Het experiment werd uitgevoerd door toepassing van een dubbele blanco methode, waarbij tezamen met tabletten van het preparaat van de uitvinding, elk van 100 mg, een geschikt placebo werd toegepast. De resultaten werden statistisch verwerkt.

De verkregen gegevens tonen aan, dat het preparaat van de uitvinding in een enkelvoudige toediening per os van 100 mg en een dagelijkse van 300 mg (100 mg drie maal per dag) faalt bij de verandering van de tellingen van T-populaties, maar leidt tot veranderingen in bindrecepto-ren in het uitwendige lymfocytmembraan dat persisteerde gedurende 14 dagen (de tijd van waarnemingen).

De vaccinatie die 24 uur na de toediening van het preparaat van de uitvinding werd uitgevoerd, had geen effect op de aard van veranderingen van bindreceptoren met lymfocytmembranen.

De verandering van de oppervlakte-eigenschappen van lymfocytmembraan onder de inwerking van het preparaat van de uitvinding is waarschijnlijk het resultaat in de veranderingen in functionele eigenschappen van deze cellen, hetgeen leidt tot verhoging van de functie van het immuniteitsysteem, hetgeen werd getoond door waargenomen protectief effect tegen de ontwikkeling van influenzavirusinfecties. Het preparaat volgens de uitvinding voorkomt postinfluenzale complicaties en verlaagt aanzienlijk de frequentie van chronische ziekteverslechteringen bij personen die een influenzavirusinfectie hadden.

De resultaten van de klinische proeven tonen aan, dat het preparaat van de uitvinding niet-toxisch is, goed wordt verdragen door patiënten, een therapeutisch effect op influenza A/B virusinfecties bezit, de ontwikkeling van postinfluenzale complicaties en chronische ziekteverslechteringen na influenzavirusinfecties voorkomt. Bovendien is het preparaat van de uitvinding een doelmatig interferon leverend middel en immunopotentiator met noch toxische noch bijwerkingen in het lichaam. Het preparaat van de uitvinding kan bij voorkeur worden toegepast als een immunopotentiator in secundaire immunodeficiëntieomstandigheden met inbegrip van bestraling en thermische straling bij de behandeling van oncologische (tumor) patiënten en bij chronische en recidieve virusinfecties .

Het preparaat van de uitvinding wordt bij voorkeur 1-2 maal per week toegepast tijdens het gehele verloop van een specifieke, antineo-plastische therapie. Een enkelvoudige dosis ligt in het traject van 300 tot 400 mg (ongeveer 250 mg/m2), een therapeutische dosis per kuur (een curatieve kuur van tumorpatienten duurt 1 tot 2 maanden) is 3 - 6 g van het preparaat.

14

De resultaten van een farmacokinetische studie van een C gemerkt preparaat van de uitvinding tonen aan, dat het preparaat snel uit het lichaam wordt verwijderd, hetgeen alle angsten voor de mogelijke opeenhoping ervan in het lichaam doet verwijderen.

Het actieve bestanddeel van het preparaat, -ethyl-6-broom-5-hy-droxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxy-laat-hydrochloride-monohydraat, wordt als volgt bereid.

Ethyl-5-acetoxy-l,2-dimethylindool-3-carboxylaat wordt onder te-rugvloeikoeling behandeld met een bromeringsmiddel in een inert organisch oplosmiddel.

Een bromeringsmiddel is bij voorkeur broom of N-broomsuccinimide en een organische oplosmiddel is chloroform, dichloorethaan of tetra-chloormethaan. Het verkregen ethyl-5-acetoxy-6-broom-2-broommethyl-l-methylindool-3-carboxylaat wordt omgezet met thiofenol bij aanwezigheid van een alkalimetaalhydroxide of het alcoholaat ervan in een organisch oplosmiddel.

Een alkalimetaalhydroxide is kaliumhydroxide, natriumhydroxide of de reactie wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van natriumalcoholaat. In deze trap is een organisch oplosmiddel bij voorkeur methanol, ethanol of isopropylalcohol.

Het verkregen ethyl-6-broom-5~hydroxy-l-methyl-2-fenylthiomethyl-indool-3~carboxylaat wordt omgezet met een aminomethyleringsmiddel (bis-dimethylaminomethaan of een mengsel dat dimethylamine en formaline bevat) in een organisch oplosmiddel bij een temperatuur variërend van 65eC tot de terugvloeitemperatuur van het reactiemengsel.

De aminomethyleringsreactie onder toepassing van bis-dimethylami-nomethaan wordt bij voorkeur uitgevoerd onder terugvloeikoeling in di-oxaan. De opbrengst aan ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3“carboxylaat is 70#.

Bij de toepassing van het mengsel van dimethylamine en formaline voor de aminomethylering is een organisch oplosmiddel bij voorkeur azijnzuur en wordt de reactie uitgevoerd bij een temperatuur van 65°C tot 75°C. Verlaging van de reactietemperatuur vertraagt de aminomethylering; verhoging ervan resulteert in gomvorming van de reactiemassa. In deze trap is de opbrengst aan ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylamino-methyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat 85%.

Het eindprodukt wordt geïsoleerd door toevoeging van een oplossing van waterstofchloride in ether aan een oplossing van de verkregen base in aceton. Het isoleren van het eindprodukt wordt bij voorkeur uitgevoerd door behandeling van de verkregen base met zoutzuur in aceton onder terugvloeikoeling. De werkwijze wordt uitgevoerd volgens het schema van figuur 1.

Voor een beter begrip van de onderhavige uitvinding worden de volgende voorbeelden van een werkwijze voor de bereiding van de verbinding volgens de uitvinding als toelichting gegeven.

Voorbeeld I

Aan een oplossing die ethyl-5-acetoxy-l,2-dimethylindool-3~car-boxylaat (110 g, 0,4 mol) in 1200 ml tetrachloormethaan bevat, werd broom (127,8 g, 0,8 mol) onder roeren en terugvloeikoeling toegevoegd. Het reactiemengsel werd gekoeld en het precipitaat door filtratie verwijderd.

In 150,7 g (87#) ethyl-5-acetoxy-6-broom-2-broommethyl-l-methylin-dool-3_carboxylaat werd verkregen in de vorm van een wit kristallijn poeder dat onder verhitting oplosbaar is in een kleinmoleculige alcohol, koolstofdichloride, en niet oplosbaar is water; smp. 179-l80eC.

Elementairanalyse voor : C^H^NO^

Gevonden, % C 4l,50 H 3,50 Br 36,97 Berekend, % C 4l,60 H 3,49 Br 36,90.

Aan een oplossing die kaliumhydroxide (52,1 g, 0,93 mol) in 1300 ml methanol bevatte, werd bij kamertemperatuur thiofenol (34,1 g, 0,31 mol) onder roeren en vervolgens ethyl-5-acetoxy-6-broom-2-broommethyl-l-methylindool-3-carboxylaat (135 g, 0,31 mol) tevens toegevoegd.

Men laat het mengsel drie uur staan bij kamertemperatuur, gevolgd door neutralisatie (aanzuring) met verdund azijnzuur. Het precipitaat werd af gefiltreerd en gewassen met water.

125,6 g (96,4#) ethyl-6-broom-5-hydroxy-l-methyl-2-fenylthiome-thylindool-3-carboxylaat werd verkregen als een geel kristallijn poeder dat onder verwarming oplosbaar was in een kleinmoleculige alcohol, ethylacetaat, en in water niet oplosbaar was; smp. 196eC - 197°C (uit ethylacetaat).

Elementairanalyse voor: C^H^gBrNO^S Gevonden, % C 54,14 H 4,24

Berekend, % C 54,30 H 4,32

Aan 125 ml azijnzuur werd een 33# oplossing van dimethylamine (56 ml, 0,385 mol) onder roeren en koelen toegevoegd en werd vervolgens een 37»7# oplossing van formaline (12,6 ml, 0,165 mol) toegevoegd. Aan de verkregen oplossing werd ethyl-6-broom-5“hydroxy-l-methyl-2-fenylthio-methylindool-3“carboxylaat (61,3 g, 0,l46 mol) toegevoegd. Het reactie-mengsel werd 30 minuten geroerd bij een temperatuur in het traject van 65 tot 75eC. De verkregen oplossing werd gekoeld en geneutraliseerd met een oplossing van kaliumhydroxide. Het precipitaat werd verwijderd en gewassen met water.

59»9 g (85.1#) ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3~carboxylaat werd verkregen als een witte kristallijne vaste stof die onder verwarming oplosbaar was in aceton, acetonitril, dioxaan, een kleinmoleculige alcohol, maar niet in water oplosbaar was; smp. 127 ~ 128°C (uit acetonitril).

Elementairanalyse voor: ¢22^25^^203^

Gevonden, % C 55,53 H 5,35 N 6,01

Berekend, % C 55,34 H 5,29 N 5,87

Aan een oplossing die ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminome-thyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat (47,1 g, 0,0986 mol) in 28Ο ml aceton bevatte en onder terugvloeikoeling werd gehouden, werd een geconcentreerde zoutzuuroplossing (11 ml, 0,1282 mol) onder roeren toegevoegd. Het reactiemengsel werd gekoeld, het precipitaat werd verwijderd en herkristalliseerd uit een mengsel van aceton en ethanol.

45,1 g (86#) van het eindprodukt ethyl-6-broom-5~hydroxy-4-dime-thylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3“carboxylaat-hydro-chloride-monohydraat werd verkregen.

Elementairanalyse voor: ¢22^28^^^04^

Gevonden, % C 49,57 H 5,30 Br 14,98 Cl 6,54 S 5,89 N 5,30; H20 3,28

Berekend, % C 49,67 H 5,31 Br 15,02 Cl 6,67 S 6,03 N 5,27; H20 3,38

De opbrengst van het eindprodukt, gebaseerd op het uitgangsmateriaal ethyl-acetoxy-l,2-dimethylindool-3-carboxylaat, is 61,38#.

Voorbeeld II

De werkwijze werd uitgevoerd op de in voorbeeld I beschreven wijze, maar voor de bereiding van ethyl-5_acetoxy-6-broom-2-broommethyl-l-methylindool-3-carboxylaat werd de reactie uitgevoerd in chloroform, waarbij het produkt werd geïsoleerd in een opbrengst van 79,3#» smp. I67 - 169°C.

De opbrengst aan eindprodukt is 55,95#» betrokken op ethyl-5-ace-toxy-l,2-dimethylindool-3-carboxylaat. Het produkt was identiek aan dat van voorbeeld I.

Voorbeeld III

De werkwijze werd uitgevoerd op de in voorbeeld I beschreven wijze, maar voor de bereiding van ethyl-5-acetoxy-6-broom-2-broommethyl-l-methylindool-3-carboxylaat, waarbij de reactie werd uitgevoerd in di-chloorethaan, het produkt werd geïsoleerd in een opbrengst van 63,5# 5 smp. 167 - l68eC.

De opbrengst aan eindprodukt was 46,07#, betrokken op ethyl-5-ace-toxy-1,2-dimethylindool-3_carboxylaat.

Het produkt was identiek aan dat van voorbeeld I.

Voorbeeld IV

Aan een oplossing die ethyl-5-acetoxy-l,2-dimethylindool-3_car-boxylaat (44 g, 0,16 mol) in 56Ο ml tetrachloormethaan bevatte, werd druppelsgewijze N-broomsuccinimide (64 g, 0,36 mol) toegevoegd en het reactiemengsel werd zes uur onder terugvloeikoeling gehouden. Succinimi-de werd afgefiltreerd en de hete oplossing werd gewassen met heet tetrachloormethaan. Na gedeeltelijke verdamping van het filtraat in vacuo, gevolgd door koelen werd het precipitaat verwijderd en herkristalliseerd uit isopropylalcohol en 43,4 g (62,7#) ethyl-5~acetoxy-6-broom-2-broom-methyl-l-methylindool-3-carboxylaat met een smeltpunt van 179 ~ l80°C werd verkregen.

De werkwijze werd verder uitgevoerd volgens de methode die in voorbeeld I is beschreven. De opbrengst aan eindprodukt was 44,24#, het produkt was identiek aan dat van voorbeeld I.

Voorbeeld V

De werkwijze werd uitgevoerd op de in voorbeeld I beschreven wijze, maar voor de bereiding van ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylamino-methyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3_carboxylaat werd de aminome-thyleringsreactie als volgt uitgevoerd.

Aan een oplossing die ethyl-6-broom-5-hydroxy-l-methyl-2-fenyl-thiomethylindool-3-carboxylaat (76,4 g, 0,18 mol) in 470 ml dioxaan bevatte, werd bis-dimethylaminomethaan (50 ml, 0,36 mol) toegevoegd. Het reactiemengsel werd drie uur onder terugvloeikoeling gehouden, af gekoeld, verdund met een drie- tot viervoudige hoeveelheid water. De geprecipiteerde kristallen werden verwijderd, gewassen met water en gedroogd onder vorming van 60,1 g (70#) ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dime-thylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat, smp.

125°C - 126°C.

De werkwijze werd verder uitgevoerd op overeenkomstige wijze als in voorbeeld I.

De opbrengst aan eindprodukt bedroeg 50,49#, betrokken op het als uitgangsmateriaal gebruikte ethyl-5-acetoxy-l,2-dimethylindool-3-car-boxylaat. Het produkt was overeenkomstig aan dat van voorbeeld I. Voorbeeld VI

De werkwijze werd op de in voorbeeld I beschreven wijze uitgevoerd, maar voor de bereiding van ethyl-6-broom-5“hydroxy-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat werd de reactie uitgevoerd in ethanol bij aanwezigheid van natriumethanolaat. Het produkt werd geïsoleerd, waarbij een opbrengst van 96,8% met een smeltpunt van 196 - 197°C werd verkregen.

De opbrengst van het eindprodukt, betrokken op het uitgangsmateriaal ethyl-5-acetoxy-l,2-dimethylindool-3~carboxylaat, bedroeg 59*4#. Voorbeeld VII

De werkwijze werd uitgevoerd op de in voorbeeld I beschreven wijze, maar voor de bereiding van ethyl-6-broom-5~hydroxy-l-methyl-2-fenyl-thiomethylindool-3-carboxylaat werd de reactie uitgevoerd in isopropyl-alcohol bij aanwezigheid van natriumhydroxide. Het produkt werd geïsoleerd in een opbrengst van 94,5#, smp. 196 - 197°C.

De opbrengst van het eindprodukt, betrokken op het uitgangsmateriaal ethyl-5-acetoxy-l,2-dimethylindool-3-carboxylaat was 56,7#·

Claims

1. Ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenyl-thiomethylindool-3-carboxylaat-hydrochloride-monohydraat met de formule 1.

2. Werkwijze voor de bereiding van ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dime-thylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat-hydro-chloride-monohydraat volgens conclusie 1, met het kenmerk dat men ethyl-5-acetoxy-lf2-dimethylindool~3“carboxylaat behandelt met een bromerings-middel in een inert oplosmiddel onder terugvloeikoeling, het verkregen ethyl-5-acetoxy-6-broom-2-broommethyl-l-methylindool-3-carboxylaat bij aanwezigheid van een alkalimetaalhydroxyde of het alcoholaat ervan met thiofenol omzet in een organisch oplosmiddel, het verkregen ethyl-6-broom-5-hydroxy-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat omzet met een aminomethyleringsmiddel in een organisch oplosmiddel bij een temperatuur van 65 °C tot de terugvloei temperatuur van het reactiemengsel, waarna men vervolgens het eindprodukt uit de verkregen base ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat isoleert.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat men als brome-ringsmiddel broom of N-broomsuccinimide gebruikt.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk dat men als inert organisch oplosmiddel chloroform, dichloorethaan of tetra-chloormethaan gebruikt.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat men ethyl-5“ acetoxy-6-broom-2-broommethyl-l-methylindool-3-carboxylaat omzet met thiofenol, waarbij men als organisch oplosmiddel methanol, ethanol of isopropylalcohol gebruikt.

6. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat men een aminomethyleringsmiddel gebruikt, dat een mengsel is, dat dimethylamine en formaline of bis-dimethylaminomethaan bevat.

7. Werkwijze volgens conclusies 2 en 6, met het kenmerk dat men een mengsel bestaande uit dimethylamine en formaline gebruikt, als organisch oplosmiddel azijnzuur gebruikt en de aminomethylering uitvoert bij een temperatuur in het traject van 65 tot 75°C.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 2-6, met het kenmerk dat men bis-dimethylaminomethaan gebruikt, als organisch oplosmiddel dioxaan gebruikt en de aminomethylering uitvoert bij de terugvloeitemperatuur van het reactiemengsel.

9· Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk dat men de isolering van het eindprodukt uitvoert door behandeling van ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-car-boxylaat met zoutzuur in aceton onder terugvloeikoeling.

10. Farmaceutisch preparaat met een antiviraal, interferon inducerend en immunomodulatoir effect, bestaande uit een werkzaam bestanddeel en een farmaceutisch aanvaardbare drager, met het kenmerk dat het werkzame bestanddeel ethyl-6-broom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-l-methyl-2-fenylthiomethylindool-3-carboxylaat-hydrochloride-monohydraat volgens conclusie 1 is.

11. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 10, met het kenmerk dat het een werkzaam bestanddeel in een hoeveelheid van 0,1 tot 0,2 g per tablet bevat.

12. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 11, met het kenmerk dat een farmaceutisch aanvaardbare drager een excipiens is, die bestaat uit zetmeel of poedersuiker.